KR102316634B1 - Method for increasing female conception rate using a new seminal conservative solution - Google Patents
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Abstract
본 발명은 포유동물의 정자를 시트르산염(citrate)을 포함하는 정액보존액에 처리하는 단계를 포함하는, 암컷 수태율을 증진시키는 방법 등에 관한 것으로, 본 발명의 정액보존액에 정액을 처리하는 경우 정자의 수정능이 유지되면서 X-염색체 정자에 비해 살아있는 Y-염색체 정자의 비가 상대적으로 낮아지는 효과가 있다. 따라서, 이를 이용하여 인공수정시 암컷 수태율을 증진시킬 수 있으므로 축산 분야에서 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.The present invention relates to a method for enhancing female fertility, comprising the step of treating mammalian sperm in a semen-preserving solution containing citrate, and the like. The ratio of living Y-chromosomal sperm to that of X-chromosomal sperm is relatively lowered while fertility is maintained. Therefore, it is expected that it will be useful in the livestock field because it can increase the female fertility rate during artificial insemination using this.
Description
본 발명은 포유동물의 정자를 시트르산염(citrate)을 포함하는 정액보존액에 처리하는 단계를 포함하는, 암컷 수태율을 증진시키는 방법 등에 관한 것이다.The present invention relates to a method and the like for enhancing female fertility, comprising the step of treating mammalian sperm with a semen preservation solution containing citrate.
돼지 수컷의 경우 정소에서 생성되는 안드로스테논과 스카톨과 같은 호르몬이 지방에 축적되어 특유의 웅취라고 하는 냄새와 지방내 근육침착이 잘되지 않아 고기가 질기고 맛과 향이 떨어져 돼지고기의 경우 암컷이나 거세돈을 사용하여 축산물을 만들어 소비하고 있다. 따라서, 출산시 암컷의 비율을 높여준다면 도체가격 및 선호도가 높은 암퇘지의 출하로 경제적 이익이 높아지게 된다.In the case of male pigs, hormones such as androstenone and skatole produced in the testes are accumulated in fat, and the characteristic smell called boar odor and muscle deposition in the fat are not good. They use castration money to make and consume livestock. Therefore, if the ratio of females during childbirth is increased, economic benefits will be increased due to the carcass price and shipment of sows with high preference.
한편, 기존의 정자의 수정 전 성 선별을 하는 방법으로서 성염색체의 DNA 함량차이를 이용해 정자의 머리에 들어있는 염색체들을 형광염료로 단시간 염색하여 유세포 분석기(Flow Cytometer)라는 세포분리기를 통과시켜 발광의 차이로 인해 X-염색체를 가진 정자와 Y-염색체를 가진 정자를 분리해주는 방법이 있다. 하지만, 이러한 방법은 고가의 장비가 필요하고 분류기를 통과하는 동안 염색, 레이저에 의한 노출, 분리액의 의한 고농도의 희석, 압력 등의 다양한 정자 손상 요인이 존재하고 있어 분류기를 통과한 대부분의 정자는 세포막이나 형태에 심각한 손상을 받는다. On the other hand, as a method of sex selection before fertilization of sperm, the chromosomes in the sperm head are dyed for a short time with a fluorescent dye using the DNA content difference of the sex chromosomes and passed through a cell separator called a flow cytometer to measure luminescence. There is a way to separate sperm with an X-chromosome from a sperm with a Y-chromosome due to the difference. However, this method requires expensive equipment and there are various sperm damage factors such as dyeing, laser exposure, high concentration dilution by separation solution, and pressure while passing through the sorter. Severe damage to the cell membrane or morphology.
또한, 동물산업에서 인공수정시 경제성, 효율성, 쉬운 사용법 등이 필수 조건으로 맞춰줘야 하는데 기존 방법으로 성 선별을 할 시 돼지정자의 경우 다른 포유동물의 정자에 비해 내동성이 약해 저온 충격을 심각하게 받아 동결정액을 사용하는데 제한이 있다. 상술한 바와 같이 성 선별된 정자를 보관, 공급해주는데 어려움이 있어 성 선별된 정자를 사용하기 어려운 점, 돼지 암컷의 독특한 자궁 구조로 인해 인공수정시 많은 수의 정자가 필요하다는 점, 숙련된 전문가와 장비가 필요하다는 점 때문에 앞선 조건들을 만족하지 못하여 돼지에서는 이런 방법을 통해 성 선별을 실시하지 않아 관련된 많은 연구가 요구되고 있다.In addition, in the animal industry, economic feasibility, efficiency, and ease of use must be met as essential conditions for artificial insemination. In the case of sex selection using the existing method, pig sperm has weak frost resistance compared to sperm from other mammals, so low temperature shock is severe. There is a limit to the use of the copper crystal solution. As described above, it is difficult to store and supply sex-selected sperm, which makes it difficult to use sex-selected sperm. Due to the need for equipment, the above conditions are not satisfied, so sex selection is not performed in pigs through this method, so many related studies are required.
본 발명자들은 인간과 쥐의 정자가 스트레스를 받는 환경에 노출되었을 때 Y-염색체를 함유한 정자가 X-염색체를 함유한 정자에 비해 더 취약하다는 사실을 기초로 하여 다른 포유동물에서도 환경적인 변화에 노출되었을 때 Y-염색체를 함유한 정자가 더 취약하다는 가설을 세운 후 이를 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.Based on the fact that sperm containing the Y-chromosome are more vulnerable than sperm containing the X-chromosome when the sperm of humans and mice are exposed to a stressful environment, they are also susceptible to environmental changes in other mammals The present invention was completed by experimentally confirming the hypothesis that sperm containing the Y-chromosome are more vulnerable when exposed.
이에 본 발명의 목적은, 인간을 제외한 포유동물의 수컷 종으로부터 수집된 정자를 시트르산염(citrate)을 포함하는 정액보존액에 처리하는 단계를 포함하는, 암컷 수태율을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for enhancing female fertility, comprising treating sperm collected from male species of mammals other than humans with a semen preservation solution containing citrate.
본 발명의 다른 목적은, 인간을 제외한 포유동물의 수컷 종으로부터 수집된 정자를 시트르산염(citrate)을 포함하는 정액보존액에 처리하는 단계를 포함하는, Y-염색체를 함유하는 정자에 비해 X-염색체를 함유하는 정자의 상대적 비율을 증대시키는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is the X-chromosome compared to sperm containing the Y-chromosome, comprising the step of treating sperm collected from male species of mammals other than humans with a semen-preserving solution containing citrate. To provide a method for increasing the relative proportion of sperm containing
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other problems not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 (a) 인간을 제외한 포유동물의 수컷 종으로부터 수집된 정자를 시트르산염(citrate)을 포함하는 정액보존액에 처리하는 단계; 및In order to achieve the object of the present invention, the present invention comprises the steps of: (a) treating sperm collected from male species of mammals other than humans with a semen preservation solution containing citrate; and
(b) 상기 (a) 단계에서 처리된 정자를 이용하여 인간을 제외한 포유동물의 암컷 종에 인공수정 시키는 단계를 포함하는, 암컷 수태율 증진방법을 제공한다.(b) providing a method for enhancing female fertility, comprising the step of artificially fertilizing female species of mammals other than humans using the sperm treated in step (a).
또한, 본 발명은 인간을 제외한 포유동물의 수컷 종으로부터 수집된 정자를 시트르산염(citrate)을 포함하는 정액보존액에 처리하는 단계를 포함하는, Y-염색체를 함유하는 정자에 비해 X-염색체를 함유하는 정자의 상대적 비율을 증대시키는 방법을 제공한다.In addition, the present invention contains an X-chromosome compared to sperm containing a Y-chromosome, comprising the step of treating sperm collected from male species of mammals other than humans with a semen-preserving solution containing citrate. It provides a method of increasing the relative proportion of spermatozoa.
본 발명의 일 구현예로, 상기 시트르산염은 1 내지 30mM일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the citrate may be 1 to 30 mM.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 시트르산염을 포함하는 정액보존액의 pH는 5.9 내지 6.4일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the pH of the semen preservation solution containing the citrate may be 5.9 to 6.4.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 인간을 제외한 포유동물은 돼지, 소, 말, 면양, 산양, 개 및 닭으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.In another embodiment of the present invention, the mammal other than humans may be selected from the group consisting of pigs, cattle, horses, sheep, goats, dogs and chickens.
본 발명은 제한이 많은 고가의 장비와 동결정액을 이용해야 하는 기존의 성 선별 방법을 탈피한 농장에서 쉽게 이용할 수 있는 방법으로, 본 발명의 정액보존액에 정액을 처리하는 경우 정자의 수정능이 유지되면서 X-염색체 정자에 비해 살아있는 Y-염색체 정자의 비가 상대적으로 낮아지는 효과가 있다. 따라서, 이를 이용하여 인공수정시 암컷 수태율을 증진시킬 수 있으므로 축산 분야에서 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.The present invention is a method that can be easily used in farms that break away from the existing sex screening method that requires the use of expensive equipment and copper crystal solution. Compared to X-chromosome sperm, the ratio of living Y-chromosome sperm is relatively low. Therefore, it is expected that it will be useful in the livestock field because it can increase the female fertility rate during artificial insemination using this.
도 1은 pH에 따른 정자의 운동성 차이를 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 정액보존액 및 일반 BTS가 돼지 정자 운동성에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 3a 내지 3c는 본 발명의 정액보존액 및 일반 BTS에서 정자 상태와 관련된 AR 패턴(도 3a), B 패턴(도 3b) 및 F 패턴(도 3c)을 분석한 결과이다.
도 4a 및 4b는 본 발명의 정액보존액 및 일반 BTS에서 정자의 포스포티로신의 발현량을 비교한 결과로, 도 4a의 좌측상단 그래프는 ~48kDa 밴드의 발현량을, 우측상단 그래프는 ~40 kDa 밴드의 발현량을, 좌측하단 그래프는 ~34kDa 밴드의 발현량을, 우측하단 그래프는 ~28kDa 밴드의 발현량을 나타낸다.
도 5a 및 5b는 본 발명의 정액보존액 및 일반 BTS에서 X염색체를 함유한 정자와 Y염색체를 함유한 정자의 상대적 생존비(도 5a) 및 생존율(도 5b)의 차이를 비교한 결과이다.
도 5c는 본 발명의 정액보존액 및 일반 BTS에서 정자의 생존율을 평가한 결과이다.
도 6a 내지 6c는 본 발명의 정액보존액 및 일반 BTS에 보관한 정자의 UQCRC1 발현량(도 6a, 6b) 및 SLC9A3R1 발현량(도 6c)을 비교한 결과이다.1 is a result of confirming the difference in sperm motility according to pH.
2 is a result of evaluating the effect of the semen preservation solution of the present invention and general BTS on porcine sperm motility.
3A to 3C are results of analyzing the AR pattern (FIG. 3A), B pattern (FIG. 3B), and F pattern (FIG. 3C) related to the sperm state in the semen retention solution of the present invention and normal BTS.
Figures 4a and 4b are results of comparing the expression level of phosphotyrosine in sperm in the semen storage solution of the present invention and normal BTS. The expression level of the band, the lower left graph shows the expression level of the ~34kDa band, and the lower right graph shows the expression level of the ~28kDa band.
5A and 5B are results of comparing the relative survival ratio (FIG. 5A) and the survival rate (FIG. 5B) of the sperm containing the X chromosome and the sperm containing the Y chromosome in the semen storage solution of the present invention and the normal BTS.
Figure 5c is a result of evaluating the survival rate of sperm in the semen storage solution of the present invention and normal BTS.
6A to 6C are results of comparing the UQCRC1 expression level ( FIGS. 6A and 6B ) and SLC9A3R1 expression level ( FIG. 6C ) of sperm stored in the semen storage solution of the present invention and normal BTS.
본 발명자들은 포유동물의 경우 Y염색체를 함유한 정자가 환경적인 변화에 더 취약하다는 가설을 세운 후 이를 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.The present inventors have established the hypothesis that sperm containing the Y chromosome is more susceptible to environmental changes in mammals, and confirmed this experimentally, thereby completing the present invention.
본 발명의 일 실시예에서는, pH5.9 내지 pH6.4 의 범위에서 3일간 정자의 운동성이 유지되는것을 확인하여 수정능력이 유지됨을 파악하였다(실시예 2 참조).In one embodiment of the present invention, it was confirmed that sperm motility was maintained in the range of pH5.9 to pH6.4 for 3 days, thereby confirming that fertility was maintained (see Example 2).
본 발명의 다른 실시예에서는, 본 발명의 정액보존액에서 정자는 처리후 3일까지 일반 BTS와 마찬가지로 운동성이 유지됨을 확인하였다(실시예 3 참조).In another embodiment of the present invention, it was confirmed that, in the semen retention solution of the present invention, sperm motility was maintained as in general BTS until 3 days after treatment (see Example 3).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 본 발명의 정액보존액 및 일반 BTS에서 정자의 수정능 획득 능력 평가 결과 큰 차이가 없음을 확인하였다(실시예 4 참조).In another embodiment of the present invention, it was confirmed that there was no significant difference in the results of evaluation of sperm fertility acquisition ability in the semen preservation solution of the present invention and the general BTS (see Example 4).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 본 발명의 정액보존액의 경우 정자 처리 2일째부터 살아있는 X-염색체를 함유한 정자에 비해 Y-염색체를 함유한 정자의 수가 유의적으로 떨어지는 것을 확인하였다(실시예 5 참조).In another embodiment of the present invention, it was confirmed that, in the case of the semen preservation solution of the present invention, the number of sperm containing the Y-chromosome significantly decreased from the second day of sperm treatment compared to the sperm containing the living X-chromosome (Example) 5).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 본 발명의 정액보존액 및 일반 BTS에 보관한 정자의 경우 수정능력 지표인 UQCRC1 및 산자수 지표인 SLC9A3R1 모두 유의한 발현량의 차이가 없는 것을 확인하였다(실시예 6 참조).In another embodiment of the present invention, it was confirmed that there was no significant difference in the expression levels of both UQCRC1, an index of fertility, and SLC9A3R1, which is an index of fertility, in the case of sperm stored in the semen storage solution of the present invention and general BTS (Example 6) Reference).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 (a) 인간을 제외한 포유동물의 수컷 종으로부터 수집된 정자를 시트르산염(citrate)을 포함하는 정액보존액에 처리하는 단계; 및The present invention comprises the steps of (a) treating sperm collected from male species of mammals other than humans with a semen preservation solution containing citrate; and
(b) 상기 (a) 단계에서 처리된 정자를 이용하여 인간을 제외한 포유동물의 암컷 종에 인공수정 시키는 단계를 포함하는, 암컷 수태율 증진방법을 제공한다.(b) providing a method for enhancing female fertility, comprising the step of artificially fertilizing female species of mammals other than humans using the sperm treated in step (a).
본 발명에서 "정액보존액"이란 정액희석액 이라고도 하며 정액의 양을 늘리고, 냉각감작을 방지하며, pH 완충능을 부여하고, 정액에 영양물질을 제공하여 정자의 생존력을 연장시켜 주기 위하여 사용되는 용액이다. 본 발명의 정액보존액은 BTS(Beltsville thawing solution)에 시트르산염을 추가하였으며 조성은 하기 표 1에 기재된 바와 같으나 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, "semen-preserving solution" is also called semen diluent, and is a solution used to increase the amount of semen, prevent cooling sensitization, provide pH buffering ability, and provide nutrients to semen to prolong the viability of sperm. . The semen preservation solution of the present invention has citrate added to BTS (Beltsville thawing solution), and the composition is as shown in Table 1 below, but is not limited thereto.
일반 BTS reference (Pursel and Johnson, 1975) General BTS reference (Pursel and Johnson, 1975)
본 발명에서 상기 시트르산염은 1 내지 30mM일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the citrate may be 1 to 30 mM, but is not limited thereto.
본 발명에서 "시트르산염(citrate)"이란 레몬이나 밀감에 함유되어있는 염기성산의 화합물로 구연산염 이라고도 하며 시트르산의 짝염기 (C3H5O(COO)3 3 -) 또는 시트르산의 에스터를 의미한다. 전자의 경우 염은 시트르산 삼나트륨을, 에스터는 시트르산 트리에틸을 가리키며, 시트르산염은 약한 유기산 물질로 염산(hydrochloric acid)과 같은 다른 강한 산성물질을 사용했을때에 비하여, 약산성 환경에서 정자에 미칠 수 있는 물리적, 화학적 영향을 최소화하는데 적합하다.In the present invention, "citrate" is a compound of basic acid contained in lemon or citric acid, also called citrate, and refers to a conjugate base of citric acid (C 3 H 5 O(COO) 3 3 - ) or an ester of citric acid. In the former case, salt refers to trisodium citrate and ester refers to triethyl citrate, and citrate is a weak organic acid. It is suitable to minimize the physical and chemical influences.
본 발명에서 상기 시트르산염을 포함하는 정액보존액의 pH는 5.9 내지 6.4 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the pH of the semen preservation solution containing the citrate may be in the range of 5.9 to 6.4, but is not limited thereto.
본 발명에서 상기 인간을 제외한 포유동물은 돼지, 소, 말, 면양, 산양, 개 및 닭으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the mammals other than humans may be selected from the group consisting of pigs, cattle, horses, sheep, goats, dogs, and chickens, but is not limited thereto.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 인간을 제외한 포유동물의 수컷 종으로부터 수집된 정자를 시트르산염(citrate)을 포함하는 정액보존액에 처리하는 단계를 포함하는, Y-염색체를 함유하는 정자에 비해 X-염색체를 함유하는 정자의 상대적 비율을 증대시키는 방법을 제공한다.In another aspect of the present invention, the present invention relates to sperm containing a Y-chromosome, comprising the step of treating sperm collected from a male species of a mammal other than a human with a semen retention solution containing citrate. A method of increasing the relative proportion of sperm containing an X-chromosome is provided.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred examples are presented to help the understanding of the present invention. However, the following examples are only provided for easier understanding of the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following examples.
[실시예][Example]
실시예 1. 재료 및 방법Example 1. Materials and Methods
실시예 1-1. 실험동물 및 정액 채취Example 1-1. Collection of laboratory animals and semen
돼지 정액은 수압법을 이용해 채취하였으며 동물윤리는 중앙대학교 실험 동물사용 윤리 위원회의 승인을 받고 시행되었다.Pig semen was collected using the hydraulic method, and animal ethics were implemented with the approval of the Ethics Committee for Laboratory Animal Use at Chung-Ang University.
실시예 1-2. 정액보존액에 돼지 정액 처리Example 1-2. Pig Semen Treatment in Semen Preservation Solution
그룹당 돼지 3개체의 정액을 각각 채취하고 섞어준 후, 일반적인 boar semen extender BTS을 사용하여 채취된 정액량의 3 내지 4배 정도로 희석하였다. 정액의 최종농도는 30 x 106 cells/ml 이었고, 이때 중성 pH 를 나타냈다 (대조군). 또한, 본 발명의 정액보존액(표 1 참조)도 3 내지 4배로 희석하였으며 이때 약산성의 pH 를 나타냈다. 각 샘플을 모두 17℃ 에서 4일간 보관하며 실험을 진행하였다. Semen from 3 pigs per group was collected and mixed, and then diluted to 3 to 4 times the amount of semen collected using a general boar semen extender BTS. The final concentration of semen was 30 x 10 6 cells/ml, which showed a neutral pH (control group). In addition, the semen preservation solution of the present invention (see Table 1) was also diluted 3 to 4 times, and at this time, the pH was slightly acidic. Each sample was stored at 17°C for 4 days and the experiment was performed.
실시예 1-3. 정자의 운동성 평가Examples 1-3. Evaluation of sperm motility
정자의 운동성을 평가하기 위해 CASA(Computer-assisted sperm analysis)(SAIS Plus version 10.1, Medical Supply, Seoul, Korea)를 사용하여 분석하였다.To evaluate sperm motility, computer-assisted sperm analysis (CASA) (SAIS Plus version 10.1, Medical Supply, Seoul, Korea) was used for analysis.
실시예 1-4. 정자의 수정능 획득 및 첨체반응 평가 Examples 1-4. Acquisition of sperm fertility and evaluation of acrosome response
상기 정액보존액들이 정자의 수정능 획득 및 첨체반응에 미치는 영향을 분석하기 위해 정자의 수정능 획득상태를 Hoechst 33258 (H33258)/chlortetracycline fluorescence (CTC)의 이중 염색법을 통해 평가하였다. To analyze the effects of the semen preservatives on sperm fertility acquisition and acrosome response, the status of sperm fertility acquisition was evaluated by double staining with Hoechst 33258 (H33258)/chlortetracycline fluorescence (CTC).
우선, 적절한 농도의 정자에 15 μL의 H33258을 첨가하고 상온에서 10분동안 배양시킨 다음, 정자핵의 추가적인 염색을 방지하기 위해 2% 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone) 250μl를 첨가하여 400 X g에서 10분 동안 원심분리 하고 상층액을 제거하였다. 그 다음, 750mM의 CTC 용액을 첨가하여 정자의 칼슘이온을 염색하였으며, 염색된 정자는 형광현미경을 통해 판독하여 첨체반응이 일어난 정자 상태인 acrosome reaction (AR) 패턴, 수정능획득이 아직 일어나지 않은 상태인 live non-capacitated (F) 패턴, 수정능획득이 일어났으나, 첨체반응은 일어나지 않은 상태인 live capacitated (B) 패턴으로 구분하였다. 또한, anti-phosphotyrosine antibody(pY20)를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행한 다음, 각 실험군에서 발현된 단백질밴드를 imaging densitometer로 스캔하여, Quantity one program(v. 4.6. Bio-Rad)을 통해 각 실험군의 포스포티로신 단백질의 발현량의 차이를 측정하였다.First, 15 μL of H33258 was added to sperm at an appropriate concentration and incubated for 10 minutes at room temperature, and then 250 μl of 2% polyvinylpyrrolidone was added to prevent further staining of sperm nuclei at 400 X g. After centrifugation for 10 minutes, the supernatant was removed. Then, 750 mM CTC solution was added to stain the sperm with calcium ions, and the stained sperm were read through a fluorescence microscope. It was divided into live non-capacitated (F) pattern and live capacitated (B) pattern in which fertilization occurred but acrosome reaction did not occur. In addition, Western blot was performed using an anti-phosphotyrosine antibody (pY20), and then, the protein bands expressed in each experimental group were scanned with an imaging densitometer, and each experimental group was subjected to Quantity one program (v. 4.6. Bio-Rad). The difference in the expression level of phosphotyrosine protein was measured.
실시예Example 1-5. 형광면역접합법을 이용한 생존 X염색체 함유정자와 Y염색체 함유정자의 평가 1-5. Evaluation of Sperm Containing X Chromosome and Sperm Containing Y Chromosome Using Fluorescence Immunoconjugation
정자의 성염색체 따른 각각의 생존성을 평가하기 위해 정자세포에 HOS(Hypo-osmotic swelling)용액 (distilled water: 0.9 % NaCI [1:1], 150 mOsm/kg)을 첨가하여 37℃에서 30분간 배양시킨 후 배양액을 슬라이드에 도말 및 건조하고 고정액(메탄올:아세트산 [3:1, v/v])을 통해 고정시켰다. 고정된 슬라이드는 37℃에서 30분간 5 mmol/l 디티오트레이톨 (dithiothreitol, DTT) 안에서 배양시킨 후 상온에서 건조시켰다. 그 다음, 슬라이드를 37℃ 에서 12 내지 16시간 동안 배양시킨 후 37℃의 펩신 용액에서 15분간 배양시키고 1x tris-buffered saline(TBS) 에서 5분, 1% 포름알데히드 용액에서 5분, 1x TBS에서 5분 배양시킨 후 차례로 70%, 90% 및 100%의 에탄올에서 각 1분씩 배양시켰다.To evaluate the viability of each sperm according to sex chromosomes, HOS (hypo-osmotic swelling) solution (distilled water: 0.9 % NaCI [1:1], 150 mOsm/kg) was added to the sperm cells at 37°C for 30 minutes. After incubation, the culture medium was smeared on slides, dried, and fixed through a fixative (methanol:acetic acid [3:1, v/v]). The fixed slides were incubated in 5 mmol/l dithiothreitol (DTT) at 37° C. for 30 minutes and then dried at room temperature. Then, the slides were incubated at 37°C for 12 to 16 hours, then incubated in pepsin solution at 37°C for 15 minutes, in 1x tris-buffered saline (TBS) for 5 minutes, in 1% formaldehyde solution for 5 minutes, in 1x TBS. After incubation for 5 minutes, they were incubated for 1 minute each in 70%, 90% and 100% ethanol in turn.
염색체 변성을 위해 Xp2.1-p2.2 의 ZFX 유전자 자리를 직접적으로 타켓하는 orange fluochrome 및 Yp1.2-p1.3의 SRY 유전자 자리를 타켓하는 green fluochrome으로 구성된 X/Y 듀얼 컬러 프로브를 사용해 72°C에서 5분동안 처리 후 즉시 37℃의 혼성(hybridization) 오븐에서 12 내지 16시간 동안 배양시켰다. 그 다음, 70℃의 70% (v/v) 포름아마이드 / 2x saline-sodium citrate (SSC) 용액에서 2분동안 씻고 상온의 2x SSC 버퍼에서 1분동안 씻어준 후 DAPI 염색법을 통해 핵을 염색하였다. 형광현미경을 통해 한 슬라이드 당 500개의 정자를 세었으며, 주관성을 피하기 위해 한 반복당 각기 다른 사람이 평가하였다. For chromosomal degeneration, an X/Y dual-color probe consisting of orange fluochrome directly targeting the ZFX locus of Xp2.1-p2.2 and green fluochrome targeting the SRY locus of Yp1.2-p1.3 was used for 72 After treatment at °C for 5 min, immediately incubated in a hybridization oven at 37 °C for 12 to 16 h. Then, after washing in 70% (v/v) formamide / 2x saline-sodium citrate (SSC) solution at 70°C for 2 minutes, and in 2x SSC buffer at room temperature for 1 minute, the nucleus was stained by DAPI staining. . 500 sperm per slide were counted by fluorescence microscopy and evaluated by different persons per replicate to avoid subjectivity.
실시예 1-6. 정액보존액이 수정률에 미치는 영향 평가Example 1-6. Evaluating the effect of semen retention on fertilization rate
수정능력 예측을 위한 생체마커 중 하나인 UQCRC1의 발현량을 확인하기 위해 웨스턴블롯을 수행하였다. 1차 항체(Primary antibody)로는 anti-cytochrome b-c1 complex subunit 1 (UQCRC1) antibody를 사용하였으며, 각각의 1차 항체에 상응하는 2차 항체(secondary antibody)를 사용하였다.Western blot was performed to confirm the expression level of UQCRC1, which is one of the biomarkers for predicting fertility. As the primary antibody, an anti-cytochrome b-c1 complex subunit 1 (UQCRC1) antibody was used, and a secondary antibody corresponding to each primary antibody was used.
또한, 산자수 예측 마커인 SLC9A3R1 전사체의 발현량을 측정하기 위해 실시간 PCR를 사용하여 발현량을 측정하였다. 프라이머는 Sus scrofa SLC9A3R1 mRNA (SLC9A3R1, accession no. NM_001143724.1)를 위해 설계되었다(Forward primer(서열번호 1): 5′-GACAGCCCCAAGAAAGAGGAC-3′, Reverse primer(서열번호 2): 5′-CGGCCAGGGAGATGTTGA-3′).In addition, in order to measure the expression level of SLC9A3R1 transcript, which is a fertility prediction marker, the expression level was measured using real-time PCR. The primer was designed for Sus scrofa SLC9A3R1 mRNA (SLC9A3R1, accession no. NM_001143724.1) (Forward primer (SEQ ID NO: 1): 5′-GACAGCCCCAAGAAAGAGGAC-3′, Reverse primer (SEQ ID NO: 2): 5′-CGGCCAGGGAGATGTTGA- 3').
실시예 1-7. 통계 분석Example 1-7. statistical analysis
모든 데이터는 SPSS 프로그램 (v. 21.0; Chicago, IL, USA) 의 one-way ANOVA를 통해 분석되었다. P <0.05 와 P <0.001는 통계적으로 유의한 결과라고 판단되었으며 데이터는 mean ± SEM 으로 표시하였다.All data were analyzed via one-way ANOVA of the SPSS program (v. 21.0; Chicago, IL, USA). P <0.05 and P <0.001 were judged to be statistically significant results, and the data were expressed as mean ± SEM.
실시예 2. pH에 따른 정자 운동성 평가Example 2. Evaluation of sperm motility according to pH
돼지 3개체의 정액을 각각 채취하고 섞어준 후, 여러농도의 시트르산염이 함유된 본 발명의 정액보존액 (표 1 참조)으로 정액을 3 내지 4 배로 희석하여 pH 5.5 내지 pH 6.6 범위에서 정자 운동성을 평가하였다.After semen from three pigs was collected and mixed, the semen was diluted 3 to 4 times with the semen preservation solution of the present invention (see Table 1) containing various concentrations of citrate to increase sperm motility in the pH 5.5 to pH 6.6 range. evaluated.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 pH 5.8부터 day3 이후에 정자의 운동성이 유의적으로 감소하였으며, pH 5.9 내지 pH 6.4의 범위에서 day3 정자의 운동성이 유지되는것을 확인하여 상기 pH 범위에서 정자의 수정능력이 유지됨을 파악하였다.As a result, as shown in FIG. 1 , it was confirmed that sperm motility significantly decreased after
실시예 3. 본 발명의 정액보존액 및 일반 BTS에서 정자의 운동성 평가Example 3. Evaluation of sperm motility in the semen retention solution of the present invention and normal BTS
상기 실시예 1-3에 기재된 방법에 따라 본 발명의 정액보존액이 돼지정자의 운동성에 미치는 영향을 평가하였다. 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 본 발명의 정액보존액에서 3일까지는 일반 BTS와 마찬가지로 우수한 운동성을 나타냈고, 4일째부터 운동성이 유의적으로 떨어지는 것을 확인하였다(p <0.05).According to the method described in Examples 1-3, the effect of the semen preservation solution of the present invention on motility of pig sperm was evaluated. As a result, as shown in FIG. 2, it was confirmed that the semen retention solution of the present invention exhibited excellent motility as in the general BTS until
실시예Example 4. 본 발명의 정액보존액 및 일반 BTS에서 정자의 수정능 획득 능력 평가 4. Evaluation of the ability of sperm to acquire fertility in the semen preservation solution of the present invention and general BTS
상기 실시예 1-4에 기재된 방법에 따라, 본 발명의 정액보존액이 돼지정자의 수정능 획득 능력에 미치는 영향을 평가하였다. According to the method described in Examples 1-4 above, the effect of the semen preservation solution of the present invention on the ability of pig sperm to acquire fertility was evaluated.
그 결과, 도 3a에 나타난 바와 같이 정자를 본 발명의 정액보존액에서 4일 보관하였을 경우, 첨체반응이 이루어진 정자 비율이 유의적으로 떨어지는 것을 볼 수 있었으며, 일반 BTS에서는 3일 보관하였을 경우부터 유의적으로 떨어지는 것을 확인하였다(p <0.05). 다만, 도 3b 및 3c에 나타난 바와 같이 수정능을 획득한 정자 및 수정능을 획득하지 않은 정자의 결과에서는 큰 차이가 없었다. As a result, as shown in Fig. 3a, when the sperm were stored in the semen storage solution of the present invention for 4 days, it was found that the ratio of the sperm with acrosome reaction was significantly decreased, and in general BTS, it was significant from the case of storage for 3 days. was confirmed to fall to (p <0.05). However, as shown in FIGS. 3B and 3C , there was no significant difference in the results of sperms that acquired fertility and sperms that did not acquire fertility.
한편, 수정능 획득이 일어나면 발현량이 증가하는 포스포티로신(phosphotyrosine)의 발현량을 확인해 본 결과, 도 4a 및 4b에 나타난 바와 같이 본 발명의 정액보존액 및 일반 BTS에서 큰 차이가 없었다.On the other hand, as a result of confirming the expression level of phosphotyrosine, which increases when fertilization occurs, there was no significant difference between the semen storage solution of the present invention and general BTS as shown in FIGS. 4A and 4B.
실시예Example 5. 본 발명의 정액보존액 및 일반 BTS에서 X-염색체를 가진 정자와 Y-염색체를 가진 정자의 생존율의 차이 평가 5. Evaluation of the difference in survival rate between sperm with X-chromosome and sperm with Y-chromosome in the semen storage solution of the present invention and general BTS
상기 실시에 1-5에 기재된 방법에 따라 본 발명의 정액보존액과 일반 BTS 에서 X-염색체를 함유한 정자와 Y염색체를 함유한 정자의 생존율 차이를 평가 하였다. According to the method described in Examples 1-5, the difference in survival rates between sperm containing X-chromosome and sperm containing Y-chromosome was evaluated in the semen storage solution of the present invention and normal BTS.
그 결과, 도 5a 및 5b에 나타난 바와 같이 실험 2일 및 4일에 확인 하였을 때 일반 BTS의 경우 4일까지 거의 1:1의 Y:X 정자비가 유지되었지만, 본 발명의 정액보존액은 2일부터 Y:X 정자의 비율, 즉 살아있는 X-염색체를 함유한 정자에 비해 Y-염색체를 함유한 정자의 수가 유의적으로 떨어지는 것을 확인하였다 (p <0.05). 이때, 전체 정자 생존율은 도 5c에 나타난 바와 같이 실험 1일째에 비해 점차 떨어졌지만 본 발명의 정액보존액의 경우 일반 BTS와 비교했을때 유의적으로 생존율이 떨어지지는 않는 것을 확인하였다(p <0.05).As a result, as shown in Figures 5a and 5b, when confirmed on the 2nd and 4th days of the experiment, in the case of general BTS, a Y:X sperm ratio of almost 1:1 was maintained until the 4th day, but the semen preservation solution of the present invention was It was confirmed that the ratio of Y:X sperm, that is, the number of sperm containing the Y-chromosome compared to the sperm containing the living X-chromosome, was significantly decreased (p <0.05). At this time, as shown in FIG. 5c , the overall sperm survival rate gradually decreased compared to the first day of the experiment, but it was confirmed that the semen preservation solution of the present invention did not significantly decrease the survival rate compared to the general BTS (p <0.05).
실시예Example 6. 본 발명의 정액보존액 및 일반 BTS가 정자의 수정능력에 미치는 영향 평가 6. Evaluation of the effect of the semen preservation solution of the present invention and general BTS on the fertility of sperm
상기 실시예 1-6에 기재된 방법에 따라, 수정능력 및 산자수를 예측할 수 있는 단백질 마커인 UQCRC1와 전사체 마커인 SLC9A3R1을 이용하여 본 발명의 정액보존액과 일반 BTS에서 정자의 단백질 및 전사체 발현량을 확인하였다. According to the method described in Example 1-6, sperm protein and transcript expression in the semen storage solution of the present invention and general BTS using UQCRC1, a protein marker capable of predicting fertility and number of litters, and SLC9A3R1, a transcript marker amount was confirmed.
그 결과, 도 6a 내지 6c에 나타난 바와 같이 본 발명의 정액보존액과 일반 BTS에 보관한 정자의 UQCRC1 및 SLC9A3R1 발현량은 모두 유의한 차이가 없는 것을 확인하였다.As a result, as shown in FIGS. 6A to 6C , it was confirmed that there was no significant difference in the expression levels of UQCRC1 and SLC9A3R1 in the semen storage solution of the present invention and the sperm stored in normal BTS.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.The above description of the present invention is for illustration, and those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains can understand that it can be easily modified into other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention. will be. Therefore, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not restrictive.
<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Method for increasing female conception rate using a new seminal conservative solution <130> MP18-326 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC9A3R1 Forward primer <400> 1 gacagcccca agaaagagga c 21 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC9A3R1 Reverse primer <400> 2 cggccaggga gatgttga 18 <110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Method for increasing female conception rate using a new seminal conservative solution <130> MP18-326 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC9A3R1 Forward primer <400> 1 gacagcccca agaaagagga c 21 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC9A3R1 Reverse primer <400> 2 cggccaggga gatgttga 18
Claims (5)
(b) 상기 (a) 단계에서 처리된 정자를 이용하여 인간을 제외한 포유동물의 암컷 종에 인공수정시키는 단계를 포함하는, 암컷 수태율 증진방법으로서,
정자 세포의 성염색체를 염색한 후 정자 세포 내의 염료의 정도의 비교를 통해 정자 세포의 성별 특징을 결정하는 단계는 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 암컷 수태율 증진방법.
(a) treating sperm collected from male species of mammals other than humans with a semen preservation solution containing citrate to reduce the number of sperm containing the Y-chromosome; and
(b) using the sperm treated in step (a) to artificially inseminate female species of mammals other than humans, as a method for enhancing female fertility,
A method for enhancing female fertility, characterized in that it does not include the step of determining the sex characteristics of sperm cells by comparing the degree of dye in the sperm cells after staining the sex chromosomes of the sperm cells.
상기 시트르산염은 1 내지 30mM인 것을 특징으로 하는, 암컷 수태율 증진방법.
According to claim 1,
The method for enhancing female fertility, characterized in that the citrate is 1 to 30 mM.
상기 시트르산염을 포함하는 정액보존액의 pH는 5.9 내지 6.4인 것을 특징으로 하는, 암컷 수태율 증진방법.
According to claim 1,
The method for enhancing female fertility, characterized in that the pH of the semen preservation solution containing the citrate is 5.9 to 6.4.
상기 인간을 제외한 포유동물은 돼지, 소, 말, 면양, 산양, 개 및 닭으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 암컷 수태율 증진방법.
According to claim 1,
The mammals other than humans are pigs, cows, horses, sheep, goats, dogs and chickens, characterized in that selected from the group consisting of, female fertility enhancement method.
정자 세포의 성염색체를 염색한 후 정자 세포 내의 염료의 정도의 비교를 통해 정자 세포의 성별 특징을 결정하는 단계는 포함하지 않고,
상기 정자 중 Y-염색체를 함유하는 정자의 상대적 비율은 시트르산염을 포함하는 정액보존액에 의해 감소하는 것을 특징으로 하는, 방법.Relative proportion of sperm containing an X-chromosome compared to sperm containing a Y-chromosome comprising the step of treating sperm collected from a male species of mammal other than a human in a semen-preserving solution comprising citrate. As a method of increasing
It does not include the step of determining the sex characteristics of sperm cells by comparing the degree of dye in the sperm cells after staining the sex chromosomes of the sperm cells,
The method, characterized in that the relative proportion of the sperm containing the Y-chromosome among the sperm is reduced by the semen preservation solution containing citrate.
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