KR102309437B1 - Implementation of Surface Repeating Structure Dextran Nanogels binding to Pattern Recognition Retinoic acid-Inducible Gene-I-like Receptors - Google Patents
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Abstract
본 발명은 패턴인식 RIG-1 유사 수용체와 결합하는 표면 반복구조 구현 덱스트란 나노젤에 관한 것으로, 본 발명의 덱스트란 나노입자는 독성 및 부작용이 거의 없고 장기간 안정성을 지니며, 또한, 패턴인식수용체인 RIG-1 유사 수용체 (RIG-1 like receptor, RLR)를 통해 선천성 면역 활성화를 매개하고, 이에따라 다양한 바이러스의 증식을 억제할 수 있는 효과가 있어, 선천면역 증진 또는 항바이러스용 약학적 조성물, 식품 조성물 또는 사료 조성물 등에 유용하게 이용될 수 있다.The present invention relates to a dextran nanogel implementing a surface repeating structure that binds to a pattern recognition RIG-1 like receptor, and the dextran nanoparticles of the present invention have little toxicity and side effects, have long-term stability, and also have a pattern recognition receptor It mediates innate immune activation through RIG-1 like receptor (RLR), which has the effect of inhibiting the proliferation of various viruses, thereby enhancing innate immunity or antiviral pharmaceutical composition, food It can be usefully used in a composition or a feed composition.
Description
본 발명은 패턴인식 RIG-1 유사 수용체와 결합하는 표면 반복구조 구현 덱스트란 나노젤에 관한 것이다.The present invention relates to a dextran nanogel with a surface repeating structure that binds to a pattern recognition RIG-1 like receptor.
면역은 태어날 때부터 지니고 있는 선천 면역(innate immunity)과 후천적으로 생활하면서 적응되어 얻어지는 획득 면역(acquired immunity)으로 구분된다. 선천 면역은 일명 '자연 면역'이라고도 하며, 항원에 대해 비특이적으로 반응하고, 특별한 기억작용은 없는 것을 특징으로 한다.Immunity is divided into innate immunity, which is possessed from birth, and acquired immunity, which is acquired by living adaptively. Innate immunity, also called 'natural immunity', is characterized by non-specific responses to antigens and no special memory action.
생체내 선천적 방어 면역시스템 중 최근 가장 중요시되는 연구 분야는 인터페론(interferon)에 의해 유도되는 선천성 면역분야이며, 이러한 인터페론 매개 면역의 활성화는 다양한 전염병 병원체에 대한 근본적인 예방 방법이 될 수 있다. 따라서 인터페론 활성화 기전 연구 및 인터페론을 유도시킬 수 있는 면역조절제제의 개발 연구가 활발하다. 또한, 병원체의 감염에 따른 선천 면역의 방어기작의 하나로 면역 인자(염증 사이토카인)가 분비되고, 이들 인자들에 의해 염증반응이 유발되어 병원체에 대한 방어가 이루어진다. 따라서 적정한 수준의 염증 반응 유도 역시 다양한 전염병 병원체에 대한 예방 및 치료 방법이 될 수 있으며, 이를 유도시킬 수 있는 면역증강제제의 개발 연구가 필요하다.Among the innate defense immune systems in vivo, the most important research field in recent years is the field of innate immunity induced by interferon, and the activation of interferon-mediated immunity can be a fundamental prevention method against various infectious disease pathogens. Therefore, studies on the mechanism of interferon activation and development of immunomodulatory agents capable of inducing interferon are active. In addition, immune factors (inflammatory cytokines) are secreted as one of the defense mechanisms of innate immunity following infection with pathogens, and inflammatory responses are induced by these factors, thereby providing defense against pathogens. Therefore, induction of an appropriate level of inflammatory response can also be a preventive and therapeutic method for various infectious disease pathogens, and research on the development of immune enhancing agents that can induce this is necessary.
RIG-1 유사 수용체 (Retinoic acid-Inducible Gene-I-like Receptors, RIG-1 like receptors, RLR)는 바이러스에 존재하는 DNA 또는 RNA를 인식하는 중요한 패턴인식수용체(Pattern recognition receptor)의 하나이다. 상기 RLR는 바이러스에 의해 감염된 세포 내에서 바이러스 RNA을 인식하여 MAVS(Mitochondrial antiviral signaling protein) 및 IRF3(Interferon regulatory transcription factor 3) 등에 신호를 전달하고 최종적으로 1형 인터페론 IFN- α을 생성하는 경로를 활성화시킨다. 생성된 1형 인터페론은 세포 밖으로 분비되어 모든 세포 들이 갖고 있는 인터페론 수용체에 결합하여 새로운 신호를 전달하여 바이러스가 증식하는 것을 억제하는 항-바이러스 유전자들의 생성을 유도한다. 결과적으로 RLR 신호경로에 의한 1형 인터페론 생성은 항 바이러스 기능에 핵심적인 역할을 수행한다.RIG-1 like receptors (Retinoic acid-Inducible Gene-I-like Receptors, RIG-1 like receptors, RLR) are one of the important pattern recognition receptors that recognize DNA or RNA present in viruses. The RLR recognizes viral RNA in virus-infected cells and transmits signals to mitochondrial antiviral signaling protein (MAVS) and interferon regulatory transcription factor 3 (IRF3), and finally activates a pathway to generate
나노 입자는 다양한 분야에서 이용되고 있으며, 백신 개발 연구 분야로 지카 바이러스 백신제작을 위한 맞춤형 RNA 나노 입자가, H1N1 항체 생성을 유도하는 자가 조립형 나노 입자, 면역 활성 유도 DNA 스마트 나노입자 등이 개발되었다. 또한, 약물전달시스템으로서 키토산 포함 나노 입자 등을 이용한 암 치료 분야가 활발하게 연구되고 있다. 또한, 나노 입자를 이용한 진단 분석 분야에는 바이러스 나노입자가 개발되었으며, 각 분야를 융합하여 다양한 용도로 이용되고 있다.Nanoparticles are used in various fields, and in the field of vaccine development research, customized RNA nanoparticles for Zika virus vaccine production, self-assembled nanoparticles that induce H1N1 antibody production, and immune activity-inducing DNA smart nanoparticles have been developed. . In addition, the field of cancer treatment using chitosan-containing nanoparticles as a drug delivery system is being actively studied. In addition, virus nanoparticles have been developed in the field of diagnostic analysis using nanoparticles, and are used for various purposes by fusion of each field.
이에 본 발명자들은 덱스트란을 포함하는 나노젤을 제조하고, 상기 나노젤이 독성 및 부작용이 거의 없으며, 장기간 안정성을 지니며, 또한, 패턴인식수용체인 RIG-1 유사 수용체 (RIG-1 like receptor, RLR)를 통해 선천성 면역 활성화를 매개하고, 이에 따라 다양한 바이러스의 증식을 억제할 수 있는 효과가 있는 것을 확인함에 따라 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors prepare a nanogel containing dextran, and the nanogel has almost no toxicity and side effects, has long-term stability, and is a pattern recognition receptor, RIG-1 like receptor (RIG-1 like receptor, RLR) through mediating innate immune activation, thereby completing the present invention by confirming that there is an effect that can suppress the proliferation of various viruses.
본 발명의 목적은 바이러스 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating viruses.
본 발명의 다른 목적은 바이러스 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a health functional food composition for virus prevention or improvement.
본 발명의 또 다른 목적은 바이러스 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a health food composition for virus prevention or improvement.
본 발명의 다른 목적은 선천면역 증진용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for enhancing innate immunity.
상기 목적을 달성하기 위하여,In order to achieve the above object,
본 발명은 매크로개시제(macro initiator), 단량체(monomer)로서 올리고(에틸렌옥사이드)메틸에테르메타크릴레이트, 및 가교제(crosslinker)로서 폴리(에틸렌 옥사이드)디메타크릴레이트로 이루어진 나노젤; 및The present invention relates to a nanogel composed of a macro initiator, oligo(ethylene oxide)methyl ether methacrylate as a monomer, and poly(ethylene oxide) dimethacrylate as a crosslinker; and
상기 나노젤 내부에 임베디드(embeded)되는 덱스트란(dextran) 또는 RITC(rhodamine-B-isothiocyanate)가 표지된 덱스트란(dextran);을 포함하는 덱스트란 함유 나노젤을 유효성분으로 함유하는 바이러스 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.Virus prevention or prevention of viruses containing dextran-containing nanogels including; A therapeutic pharmaceutical composition is provided.
또한, 본 발명은 매크로개시제(macro initiator), 단량체(monomer)로서 올리고(에틸렌옥사이드)메틸에테르메타크릴레이트, 및 가교제(crosslinker)로서 폴리(에틸렌 옥사이드)디메타크릴레이트로 이루어진 나노젤; 및In addition, the present invention is a macro initiator (macro initiator), oligo (ethylene oxide) methyl ether methacrylate as a monomer (monomer), and a nanogel consisting of poly (ethylene oxide) dimethacrylate as a crosslinker; and
상기 나노젤 내부에 임베디드(embeded)되는 덱스트란(dextran) 또는 RITC(rhodamine-B-isothiocyanate)가 표지된 덱스트란(dextran);을 포함하는 덱스트란 함유 나노젤을 유효성분으로 함유하는 바이러스 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.Virus prevention or prevention of viruses containing dextran-containing nanogels including; It provides a health functional food composition for improvement.
나아가 본 발명은 매크로개시제(macro initiator), 단량체(monomer)로서 올리고(에틸렌옥사이드)메틸에테르메타크릴레이트, 및 가교제(crosslinker)로서 폴리(에틸렌 옥사이드)디메타크릴레이트로 이루어진 나노젤; 및Further, the present invention is a macro initiator (macro initiator), oligo (ethylene oxide) methyl ether methacrylate as a monomer (monomer), and a nanogel consisting of poly (ethylene oxide) dimethacrylate as a crosslinker; and
상기 나노젤 내부에 임베디드(embeded)되는 덱스트란(dextran) 또는 RITC(rhodamine-B-isothiocyanate)가 표지된 덱스트란(dextran);을 포함하는 덱스트란 함유 나노젤을 유효성분으로 함유하는 바이러스 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.Virus prevention or prevention of viruses containing dextran-containing nanogels including; A health food composition for improvement is provided.
더 나아가 본 발명은 매크로개시제(macro initiator), 단량체(monomer)로서 올리고(에틸렌옥사이드)메틸에테르메타크릴레이트, 및 가교제(crosslinker)로서 폴리(에틸렌 옥사이드)디메타크릴레이트로 이루어진 나노젤; 및Further, the present invention is a macro initiator (macro initiator), oligo (ethylene oxide) methyl ether methacrylate as a monomer (monomer), and a nanogel consisting of poly (ethylene oxide) dimethacrylate as a crosslinker; and
상기 나노젤 내부에 임베디드(embeded)되는 덱스트란(dextran) 또는 RITC(rhodamine-B-isothiocyanate)가 표지된 덱스트란(dextran);을 포함하는 덱스트란 함유 나노젤을 유효성분으로 함유하는 선천면역 증진용 조성물을 제공한다.Enhancement of innate immunity containing dextran-containing nanogel as an active ingredient; A composition is provided.
본 발명의 덱스트란 나노젤은 독성 및 부작용이 거의 없고 장기간 안정성을 지니며, 또한, 패턴인식수용체인 RIG-1 유사 수용체 (RIG-1 like receptor, RLR)를 통해 선천성 면역 활성화를 매개하고, 이에따라 다양한 바이러스의 증식을 억제할 수 있는 효과가 있어, 선천면역 증진 또는 항바이러스용 조성물, 식품 조성물 등에 유용하게 이용될 수 있다.The dextran nanogel of the present invention has little toxicity and side effects, has long-term stability, and mediates innate immune activation through RIG-1 like receptor (RIG-1 like receptor, RLR), which is a pattern recognition receptor, and thus Since it has an effect of inhibiting the proliferation of various viruses, it can be usefully used for enhancing innate immunity or for antiviral compositions, food compositions, and the like.
도 1은 본 발명의 나노젤 제작을 나타낸 모식도이다.
도 2는 나노젤의 입자 크기 및 안정성을 확인한 결과이다.
도 3은 Poly IC-RITC-Dextran-Nanogel의 세포 독성 결과를 확인한 결과이다.
도 4는 BD-NG, D-NG 및 RD-NG의 세포 독성 결과를 확인한 도이다.
도 5는 RD-NG의 세포 내 유입(uptake)을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 RD-NG의 처리 시간과 농도에 따른 패턴인식수용체의 증가를 확인 결과이다.
도 7은 낮은 농도에서 각각 Poly IC-Nanogel, B-NG, D-NG, RD-NG이 유입된 세포의 RIG-1 발현을 확인한 결과이다.
도 8은 RD-NG과 RIG-1이 직접적인 결합을 하는지 확인한 결과이다.
도 9는 RD-NG와 RIG-1의 결합에 의해 전달되는 신호전달경로를 확인한 결과이다.
도 10은 RD-NG와 RIG-1의 결합에 의해 생성되는 사이토카인을 확인한 결과이다.
도 11은 정맥 내 및 복강 내 주사를 통한 생체 내 주요 기관에서 RD-NG의 탐식을 확인한 결과이다.
도 12는 발바닥 주입으로 림프계를 통한 림프절에서 RD-NG의 탐식을 확인한 결과이다.
도 13은 정맥 내, 복강 내 및 발바닥 주입을 통한 주요 기관에서 RIG-1의 발현을 확인한 결과이다.
도 14는 RD-NG의 생체 내 다양한 경로를 통한 주입 후 혈청 내 사이토카인성을 확인한 결과이다.
도 15는 RD-NG를 발바닥 주입 5일 후 혈청 내 IFN-α 발현을 확인한 결과이다.
도 16은 돼지 PAM 세포에서 IFN-α 발현을 확인한 결과이다.
도 17은 돼지 BAL 세포에서 IFN-α 발현을 확인한 결과이다.1 is a schematic diagram showing the preparation of the nanogel of the present invention.
2 is a result of confirming the particle size and stability of the nanogel.
3 is a result confirming the cytotoxicity of Poly IC-RITC-Dextran-Nanogel.
4 is a view confirming the cytotoxicity results of BD-NG, D-NG and RD-NG.
5 is a diagram showing the result of confirming the intracellular uptake of RD-NG.
6 is a result confirming the increase of the pattern recognition receptor according to the treatment time and concentration of RD-NG.
7 shows the results of confirming the expression of RIG-1 in cells into which Poly IC-Nanogel, B-NG, D-NG, and RD-NG were introduced at low concentrations, respectively.
8 is a result confirming whether RD-NG and RIG-1 directly bind.
9 is a result confirming the signal transduction pathway transmitted by the binding of RD-NG and RIG-1.
10 is a result of confirming the cytokine produced by the binding of RD-NG and RIG-1.
11 is a result confirming the phagocytosis of RD-NG in major organs in vivo through intravenous and intraperitoneal injection.
12 is a result of confirming the phagocytosis of RD-NG in lymph nodes through the lymphatic system by plantar injection.
13 is a result confirming the expression of RIG-1 in major organs through intravenous, intraperitoneal and plantar injection.
14 is a result of confirming the cytokine properties in serum after injection of RD-NG through various in vivo routes.
15 is a result of confirming the expression of IFN-α in
16 is a result confirming the expression of IFN-α in porcine PAM cells.
17 is a result confirming the expression of IFN-α in pig BAL cells.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
바이러스 예방 또는 치료용 약학적 조성물Pharmaceutical composition for virus prevention or treatment
본 발명은 매크로개시제(macro initiator), 단량체(monomer)로서 올리고(에틸렌옥사이드)메틸에테르메타크릴레이트, 및 가교제(crosslinker)로서 폴리(에틸렌 옥사이드)디메타크릴레이트로 이루어진 나노젤; 및The present invention relates to a nanogel composed of a macro initiator, oligo(ethylene oxide)methyl ether methacrylate as a monomer, and poly(ethylene oxide) dimethacrylate as a crosslinker; and
상기 나노젤 내부에 임베디드(embeded)되는 덱스트란(dextran) 또는 RITC(rhodamine-B-isothiocyanate)가 표지된 덱스트란(dextran);을 포함하는 덱스트란 함유 나노젤을 유효성분으로 함유하는 바이러스 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.Virus prevention or prevention of viruses containing dextran-containing nanogels including; A therapeutic pharmaceutical composition is provided.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 매크로 개시제는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 한다:In one embodiment of the present invention, the macro initiator is characterized in that the compound represented by the formula (1):
[화학식 1][Formula 1]
(상기 화학식 1에서, a은 1-300의 정수이다).(In
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 올리고(에틸렌옥사이드)메틸에테르메타크릴레이트는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 한다:In one embodiment of the present invention, the oligo (ethylene oxide) methyl ether methacrylate is characterized in that the compound represented by the following formula 2:
[화학식 2][Formula 2]
(상기 화학식 2에서, b은 1-10의 정수이다).(In
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리(에틸렌 옥사이드)디메타크릴레이트는 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 한다:In one embodiment of the present invention, the poly (ethylene oxide) dimethacrylate is characterized in that the compound represented by the following formula (3):
[화학식 3][Formula 3]
(상기 화학식 3에서, c은 1-100의 정수이다).(In Formula 3, c is an integer of 1-100).
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 바이러스는 인플루엔자, 조류 인플루엔자, 뉴캐슬바이러스, 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus), 콕사키바이러스(Cossackievirus), 수족구바이러스(Enterovirus-71), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes Simplex Virus), 구제역바이러스(Foot and mouth disease, FMD), 콜로라도참진드기열바이러스, 레오바이러스, 인간면역 결핍 바이러스, 돼지열병바이러스, 소바이러스성 설사병(Bovine Viral Diarrhea Virus), 돼지생식기호흡기증후군 (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus), 돼지오제스키병, 로타바이러스, 파보바이러스 및 돼지유행성설사(Porcine epidemic diarrhea virus) 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, the virus is influenza, avian influenza, Newcastle virus, vesicular stomatitis virus, Cossackievirus, hand, foot and mouth virus (Enterovirus-71), herpes simplex virus ( Herpes Simplex Virus), Foot and Mouth Disease (FMD), Colorado tick fever virus, Reovirus, Human Immunodeficiency Virus, Swine Fever Virus, Bovine Viral Diarrhea Virus, Swine Genital Respiratory Syndrome ( Porcine reproductive and respiratory syndrome virus), Swine Ozesky's disease, rotavirus, parvovirus, and swine epidemic diarrhea virus (Porcine epidemic diarrhea virus) is characterized in that at least one selected from the group consisting of.
본 발명의 덱스트란 함유 나노젤은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.The dextran-containing nanogel of the present invention can be administered in various oral and parenteral formulations during clinical administration, and when formulated, a diluent such as a filler, extender, binder, wetting agent, disintegrant, surfactant, etc. It is prepared using excipients.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 덱스트란 함유 나노젤에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.Solid preparations for oral administration include tablets, patients, powders, granules, capsules, troches, and the like, and these solid preparations include at least one or more excipients, such as starch, in one or more dextran-containing nanogels of the present invention, It is prepared by mixing calcium carbonate, sucrose, lactose, or gelatin. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate talc are also used. Liquid formulations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, or syrups. In addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included. can
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspension solutions, emulsions, lyophilized formulations, suppositories, and the like. Non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate. As the base of the suppository, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerol, gelatin, etc. may be used.
또한, 본 발명의 덱스트란 함유 나노젤의 인체에 대한 효과적인 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 약 0.001-100 mg/kg/일이며, 바람직하게는 0.01-35 mg/kg/일이다. 몸무게가 70㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.07-7000 mg/일이며, 바람직하게는 0.7-2500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.In addition, the effective dosage for the human body of the dextran-containing nanogel of the present invention may vary depending on the patient's age, weight, sex, dosage form, health status and disease degree, and is generally about 0.001-100 mg/kg/ day, preferably 0.01-35 mg/kg/day. Based on an adult patient weighing 70 kg, it is generally 0.07-7000 mg/day, preferably 0.7-2500 mg/day, and once a day at regular time intervals according to the judgment of a doctor or pharmacist It may be administered in several divided doses.
바이러스 예방 또는 개선용 건강식품 또는 건강기능식품 조성물Health food or health functional food composition for virus prevention or improvement
본 발명은 매크로개시제(macro initiator), 단량체(monomer)로서 올리고(에틸렌옥사이드)메틸에테르메타크릴레이트, 및 가교제(crosslinker)로서 폴리(에틸렌 옥사이드)디메타크릴레이트로 이루어진 나노젤; 및The present invention relates to a nanogel composed of a macro initiator, oligo(ethylene oxide)methyl ether methacrylate as a monomer, and poly(ethylene oxide) dimethacrylate as a crosslinker; and
상기 나노젤 내부에 임베디드(embeded)되는 덱스트란(dextran) 또는 RITC(rhodamine-B-isothiocyanate)가 표지된 덱스트란(dextran);을 포함하는 덱스트란 함유 나노젤을 유효성분으로 함유하는 바이러스 예방 또는 개선용 건강식품 또는 건강기능식품 조성물을 제공한다.Virus prevention or prevention of viruses containing dextran-containing nanogels including; It provides a health food or health functional food composition for improvement.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 매크로 개시제는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 한다:In one embodiment of the present invention, the macro initiator is characterized in that the compound represented by the formula (1):
[화학식 1][Formula 1]
(상기 화학식 1에서, a은 1-300의 정수이다).(In
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 올리고(에틸렌옥사이드)메틸에테르메타크릴레이트는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 한다:In one embodiment of the present invention, the oligo (ethylene oxide) methyl ether methacrylate is characterized in that the compound represented by the following formula 2:
[화학식 2][Formula 2]
(상기 화학식 2에서, b은 1-10의 정수이다).(In
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리(에틸렌 옥사이드)디메타크릴레이트는 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 한다:In one embodiment of the present invention, the poly (ethylene oxide) dimethacrylate is characterized in that the compound represented by the following formula (3):
[화학식 3][Formula 3]
(상기 화학식 3에서, c은 1-100의 정수이다).(In
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 바이러스는 인플루엔자, 조류 인플루엔자, 뉴캐슬바이러스, 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus), 콕사키바이러스(Cossackievirus), 수족구바이러스(Enterovirus-71), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes Simplex Virus), 구제역바이러스(Foot and mouth disease, FMD), 콜로라도참진드기열바이러스, 레오바이러스, 인간면역 결핍 바이러스, 돼지열병바이러스, 소바이러스성 설사병(Bovine Viral Diarrhea Virus), 돼지생식기호흡기증후군 (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus), 돼지오제스키병, 로타바이러스, 파보바이러스 및 돼지유행성설사(Porcine epidemic diarrhea virus) 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, the virus is influenza, avian influenza, Newcastle virus, vesicular stomatitis virus, Cossackievirus, hand, foot and mouth virus (Enterovirus-71), herpes simplex virus ( Herpes Simplex Virus), Foot and Mouth Disease (FMD), Colorado tick fever virus, Reovirus, Human Immunodeficiency Virus, Swine Fever Virus, Bovine Viral Diarrhea Virus, Swine Genital Respiratory Syndrome ( Porcine reproductive and respiratory syndrome virus), Swine Ozesky's disease, rotavirus, parvovirus, and swine epidemic diarrhea virus (Porcine epidemic diarrhea virus) is characterized in that at least one selected from the group consisting of.
식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 본 발명의 덱스트란 함유 나노젤을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품 및 건강기능성식품을 모두 포함한다.There are no special restrictions on the type of food. Examples of foods to which the dextran-containing nanogel of the present invention can be added include drinks, meat, sausage, bread, biscuits, rice cakes, chocolate, candies, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, and ice cream. There are dairy products, various soups, beverages, alcoholic beverages and vitamin complexes, dairy products and dairy products, and includes both health food and health functional food in the ordinary sense.
본 발명에 따른 덱스트란 함유 나노젤을 함유하는 건강식품 및 건강기능성식품 조성물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 덱스트란 함유 나노젤의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 및 건강기능성식품 중의 상기 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 유지를 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 덱스트란 함유 나노젤은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.The health food and health functional food composition containing the dextran-containing nanogel according to the present invention may be added to food as it is or used together with other food or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method. The mixing amount of the dextran-containing nanogel may be appropriately determined according to the purpose of its use (for prevention or improvement). In general, the amount of the composition in health food and health functional food may be added in an amount of 0.1 to 90 parts by weight based on the total weight of the food. However, in the case of long-term intake for health maintenance or health control, the above amount may be less than the above range, and since there is no problem in terms of safety, the dextran-containing nanogel can be used in an amount above the above range. have.
본 발명의 건강식품 및 건강기능성식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명 덱스트란 함유 나노젤을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트라이톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강기능성 식품 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.The health food and health functional food composition of the present invention is not particularly limited in other ingredients except for containing the dextran-containing nanogel of the present invention as an essential ingredient in the indicated ratio, and contains various flavoring agents or natural carbohydrates, such as conventional beverages. It may be contained as an additional ingredient. Examples of the above-mentioned natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; disaccharides such as maltose, sucrose and the like; and polysaccharides such as conventional sugars such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol. As flavoring agents other than those described above, natural flavoring agents (taumatine, stevia extract (for example, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used. The proportion of the natural carbohydrate is generally about 1 to 20 g, preferably about 5 to 12 g, per 100 of the nutraceutical composition of the present invention.
상기 외에 본 발명의 덱스트란 함유 나노젤을 함유하는 건강식품 및 건강기능성식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강식품 및 건강기능성식품 조성물은 천연 과일쥬스 및 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.In addition to the above, the health food and health functional food composition containing the dextran-containing nanogel of the present invention are various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavoring agents such as synthetic flavoring agents and natural flavoring agents, coloring agents and thickening agents (cheese) , chocolate, etc.), pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated beverages, and the like. In addition, the health food and health functional food composition of the present invention may contain fruit for the production of natural fruit juice, fruit juice beverage, and vegetable beverage.
이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 덱스트란 함유 나노젤을 함유하는 건강식품 및 건강기능성식품 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.These components may be used independently or in combination. The proportion of these additives is not so important, but is generally selected in the range of 0.1 to about 20 parts by weight per 100 parts by weight of the health food and health functional food composition containing the dextran-containing nanogel of the present invention.
선천면역 증진용 조성물Composition for enhancing innate immunity
본 발명은 매크로개시제(macro initiator), 단량체(monomer)로서 올리고(에틸렌옥사이드)메틸에테르메타크릴레이트, 및 가교제(crosslinker)로서 폴리(에틸렌 옥사이드)디메타크릴레이트로 이루어진 나노젤; 및The present invention relates to a nanogel composed of a macro initiator, oligo(ethylene oxide)methyl ether methacrylate as a monomer, and poly(ethylene oxide) dimethacrylate as a crosslinker; and
상기 나노젤 내부에 임베디드(embeded)되는 덱스트란(dextran) 또는 RITC(rhodamine-B-isothiocyanate)가 표지된 덱스트란(dextran);을 포함하는 덱스트란 함유 나노젤을 유효성분으로 함유하는 선천면역 증진용 조성물을 제공한다.Enhancement of innate immunity containing dextran-containing nanogel as an active ingredient; A composition is provided.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 매크로 개시제는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 한다:In one embodiment of the present invention, the macro initiator is characterized in that the compound represented by the formula (1):
[화학식 1][Formula 1]
(상기 화학식 1에서, a은 1-300의 정수이다).(In
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 올리고(에틸렌옥사이드)메틸에테르메타크릴레이트는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 한다:In one embodiment of the present invention, the oligo (ethylene oxide) methyl ether methacrylate is characterized in that the compound represented by the following formula 2:
[화학식 2][Formula 2]
(상기 화학식 2에서, b은 1-10의 정수이다).(In
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리(에틸렌 옥사이드)디메타크릴레이트는 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 한다:In one embodiment of the present invention, the poly (ethylene oxide) dimethacrylate is characterized in that the compound represented by the following formula (3):
[화학식 3][Formula 3]
(상기 화학식 3에서, c은 1-100의 정수이다).(In
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 RIG-1 유사 수용체 (RIG-1 like receptor, RLR)와 결합하여 인터페론 알파(IFN-α)의 발현 증가를 통해 선천성 면역 활성화를 매개하는 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, the composition mediates innate immune activation through increased expression of interferon alpha (IFN-α) by binding to RIG-1 like receptor (RLR). do.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are merely illustrative of the present invention, and the content of the present invention is not limited by the following examples.
<제조예 1> RITC-DEXTRAN-Nanogel(RD-NG)의 제작<Preparation Example 1> Preparation of RITC-DEXTRAN-Nanogel (RD-NG)
물층에는 생체적합성을 가지는 에틸렌 옥사이드 계열의 단량체(monomer)인 OEOMA 300(oligo(ethylene oxide)methyl ether methacrylate), 가교제인 PEOEMA(poly(ethylene oxide)dimethacrylate)와 촉매인 CuBr2, 리간드인 TPMA(Tris(2-pyridylmethyl)amine) 및 담지 물질인 RITC-Dx(RITC-DEXTRAN)을 넣고, 유기층에 계면활성제로 이용될 Span80을 포함하는 싸이클로헥산(Cyclohexane)을 준비한다. 또한, 환원제로 사용될 아스코르빅 산(ascorbic acid) 수용액을 하기 표 1의 비율대로 준비한다. In the water layer, OEOMA 300 (oligo(ethylene oxide)methyl ether methacrylate), an ethylene oxide-based monomer having biocompatibility, PEOEMA (poly(ethylene oxide)dimethacrylate) as a crosslinking agent, CuBr2 as a catalyst, and TPMA (Tris(Tris) as a ligand) 2-pyridylmethyl)amine) and RITC-Dx (RITC-DEXTRAN) as a supporting material are added, and cyclohexane containing Span80 to be used as a surfactant in the organic layer is prepared. In addition, an aqueous solution of ascorbic acid to be used as a reducing agent was prepared according to the ratio of Table 1 below.
상기 물층 및 유기층을 비커에 섞은 후 0℃ ice bath에서 5-10분간 초음파 처리(ultrasonication) 하여 우유빛의 역미니에멀전(Inverse Miniemulsion) 상태의 유화액을 만들어 준다. 상기 유화액과 환원제인 아스코르빅 산 수용액을 각각 질소를 이용하여 30분간 버블링(bubbling)을 통해 산소를 제거한다. 질소로 치환된 바이알에 버블링이 끝난 유화액을 질소로 치환된 주사기를 이용하여 주입하고 30℃로 설정된 oli bath에서 700rpm 이상으로 교반한다. 아스코르빅 산 수용액을 같은 방법으로 유화액이 들어있는 바이알에 투입하고 반응을 시작한다. 4시간 뒤 중합 종결된 용액을 15000rpm, 4oC 조건에서 30분동안 원심분리하여 상층액을 제거하고 가라앉은 나노젤을 취한다. After mixing the water layer and the organic layer in a beaker, ultrasonication is performed in an ice bath at 0° C. for 5-10 minutes to make a milky inverse miniemulsion emulsion. Oxygen is removed by bubbling the emulsion and ascorbic acid aqueous solution as a reducing agent for 30 minutes using nitrogen, respectively. The emulsion after bubbling is injected into a vial substituted with nitrogen using a syringe substituted with nitrogen, and stirred at 700 rpm or higher in an oli bath set at 30°C. The aqueous solution of ascorbic acid is put into the vial containing the emulsion in the same way and the reaction is started. After 4 hours, the polymerization solution was centrifuged at 15000 rpm and 4 o C for 30 minutes to remove the supernatant, and the settled nanogel was taken.
상층액을 제거 후 얻은 나노젤에 테트라하이드로퓨란(THF)을 채우고 3시간 경과 후 나노젤이 충분히 팽윤 되면 다시 같은 조건으로 총 3회 원심 분리하여 상층액을 제거한다(미반응 모노머 및 반응물, 유기용매가 상층액에 녹아서 제거된다). 또한, 잔류 테트라하이드로퓨란을 제거하기 위해 같은 조건으로 원심분리 후 PBS용액을 채워주는 작업을 3회 실시한다. 정제가 끝난 PBS에 분산된 나노젤을 분석한다. 400~600nm의 사이즈 이상의 나노젤 또는 마이크로 사이즈의 젤이 존재할 경우 에는 4000rpm, 4oC에서 15분 원심분리하여 상층 용액은 회수하고 가라앉은 젤들만 제거한다.After removing the supernatant, tetrahydrofuran (THF) is filled in the nanogel obtained, and after 3 hours, when the nanogel is sufficiently swollen, centrifuge again under the same conditions a total of 3 times to remove the supernatant (unreacted monomers and reactants, organic The solvent is dissolved in the supernatant and removed). In addition, after centrifugation under the same conditions to remove residual tetrahydrofuran, the operation of filling with PBS solution is performed three times. Analyze the nanogel dispersed in PBS after purification. If nanogels or micro-sized gels with a size of 400-600 nm or more exist, centrifuge at 4000 rpm and 4 o C for 15 minutes to recover the supernatant solution and remove only the settled gels.
<비교예 1><Comparative Example 1>
상기 제조예 1의 방법과 유사한 방법으로, 담지물질을 넣지 않고 제조하여 Basic-Nanogel(B-NG)를 제조하였으며, 담지물질로 덱스트란(Dextran)을 사용하여 Dextran-Nanogel(D-NG)을 제조하였다. 담지물질로 Polyinosinic:polycytidylic acid (Poly IC)를 전체 물층의 10mg/ml 농도로 넣은 후, 유기층과 섞은 후 초음파 처리 하여 Poly IC-Nanogel을 제조하였으며, 또한, Poly IC)를 전체 물층의 10mg/ml 농도로 넣은 후, RITC-Dextran 모노머를 1-1.5wt% 비율로 넣고,유기층과 섞은 후 초음파 처리 하여 Poly IC-RITC-Dextran-Nanogel을 제조하였다.In a method similar to the method of Preparation Example 1, Basic-Nanogel (B-NG) was prepared without adding a support material, and Dextran-Nanogel (D-NG) was prepared using dextran as a support material. prepared. Polyinosinic:polycytidylic acid (Poly IC) as a support material was added at a concentration of 10 mg/ml of the entire water layer, mixed with the organic layer, and subjected to ultrasonic treatment to prepare Poly IC-Nanogel, and Poly IC) was added to 10 mg/ml of the entire water layer After the concentration, RITC-Dextran monomer was added at a ratio of 1-1.5 wt%, mixed with an organic layer, and then sonicated to prepare Poly IC-RITC-Dextran-Nanogel.
<실험예 1> 나노젤의 크기 및 안정성 확인<Experimental Example 1> Confirmation of size and stability of nanogel
상기 제조예 1에서 제조한 나노젤의 입자 안정성을 확인하기 위하여, 하기 표 2 및 도 2에 나타낸 바와 같이 1일 내지 8일 후의 입자 크기 및 개수를 확인한 결과 8일 동안 4℃에서 냉장보관한 경우 그 크기와 개수에는 변화가 없었다(도 2참조).In order to confirm the particle stability of the nanogel prepared in Preparation Example 1, as shown in Table 2 and FIG. 2, the particle size and number after 1 day to 8 days were checked. When stored refrigerated at 4° C. for 8 days There was no change in size and number (see FIG. 2).
<실험예 2> 세포 독성 확인<Experimental Example 2> Confirmation of cytotoxicity
상기 제조예 1에서 제조한 D-NG, RD-NG, B-NG, 및 Poly IC-RITC-Dextran-Nanogel의 세포 독성 여부를 확인하기 위하여, MTT 실험을 진행하였다.In order to check whether the cytotoxicity of D-NG, RD-NG, B-NG, and Poly IC-RITC-Dextran-Nanogel prepared in Preparation Example 1, MTT experiment was performed.
구체적으로, Mouse Raw264.7 세포에 200ug의 Poly IC-Nanogel 및 Poly IC-RITC-Dextran-Nanogel을 처리하였다. 또한, 각 1, 10, 100 및 200ug의 B-NG, RITC-RD-NG을 처리하여 세포 독성을 확인하였다. Specifically, 200ug of Poly IC-Nanogel and Poly IC-RITC-Dextran-Nanogel were treated in Mouse Raw264.7 cells. In addition, cytotoxicity was confirmed by treating each of 1, 10, 100 and 200 ug of B-NG and RITC-RD-NG.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, poly IC를 포함하는 Poly IC-RITC-Dextran-Nanogel은 세포가 24시간을 넘기지 못하고 사멸하여, 세포에 높은 독성을 나타냄을 확인하였다. 반면, 도 4에 나타낸 바와 같이, B-NG, D-NG 및 RD-NG는 200ug까지 처리하여도 독성이 없음을 확인 할 수 있다. 또한 RITC-Dextran은 형광물질이기 때문에 세포 탐식 및 생체 내 Nanogel의 분포를 관찰하기 위해 유리한 점을 가지고 있다.As a result, as shown in FIG. 3 , Poly IC-RITC-Dextran-Nanogel containing poly IC resulted in cell death within 24 hours, confirming high toxicity to cells. On the other hand, as shown in FIG. 4 , it can be confirmed that B-NG, D-NG and RD-NG have no toxicity even when treated up to 200 μg. In addition, since RITC-Dextran is a fluorescent substance, it has advantages for observing cell phagocytosis and distribution of Nanogel in vivo.
<실험예 3> 나노젤의 세포 내 유입(uptake) 확인<Experimental Example 3> Confirmation of intracellular uptake of nanogel
본 발명의 나노젤의 세포 내 유입(uptake) 정도를 확인하기 위하여, Mouse macropage인 Raw264.7 세포에 제조예 1의 RD-NG를 처리하였다. 구체적으로, 60Φ의 페트리 디쉬에 커버 글라스를 깔고 Raw cell을 2.5X105로 접종한 후, 200ug의 본 발명의 RITC-Dextran-Nanogel(RD-NG)를 더하였다. 이 후, 0hr, 2hr, 7hr, 23hr, 48hr, 72hr 처리해 준 후 아세톤을 이용하여 fix하고 핵을 DAPI 염색한 후 형광현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 24hr 부터 명확하게 Raw264.7이 RITC-Dextran-Nanogel을 uptake 하였음을 Red signal로 확인할 수 있었으며, 점점 시간이 지나갈수록 Raw264.7에서 더 많은 RD-NG이 세포내로 유입(uptake)된다는 것을 확인할 수 있었다(도 5참조).In order to confirm the degree of intracellular uptake of the nanogel of the present invention, Raw264.7 cells, which are mouse macropages, were treated with RD-NG of Preparation Example 1. Specifically, a cover glass was laid on a Petri dish of 60Φ and raw cells were inoculated at 2.5X10 5 , and then 200ug of RITC-Dextran-Nanogel (RD-NG) of the present invention was added. Thereafter, after treatment for 0hr, 2hr, 7hr, 23hr, 48hr, and 72hr, acetone was used to fix the nucleus, and the nucleus was DAPI-stained and observed with a fluorescence microscope. As a result, it was confirmed by the red signal that Raw264.7 clearly uptaked RITC-Dextran-Nanogel from 24 hr, and as time passed, more RD-NG from Raw264.7 was uptaked into the cell. was confirmed (see FIG. 5).
<실험예 4> 나노젤이 유입된 세포 내의 패턴인식 수용체의 증가 확인<Experimental Example 4> Confirmation of increase in pattern recognition receptors in cells into which nanogels are introduced
Raw264.7에 RD-NG (1ug/ul)를 10, 50, 100, 200ug 농도 별로 처리하고 24hr 후 western blot으로 선천성면역반응에 1차적으로 중요한 패턴인식 수용체들 중 RIG-1, TLR-3와 TLR-4의 증가를 확인(Poly IC(polyinosinic-polycytidylic acid, PI:C), Adenovirus는 양성대조군으로 사용)한 결과 50ug, 100ug, 200 ug에서 RIG-1만이 특이적으로 증가하였음을 알 수 있었다(도 6A참조). 또한, Raw264.7에 RD-NG 200ug 처리 후 0, 2, 8, 24, 48, 72hr 시간 별로 확인한 결과 8 hr 부터 RIG-1이 증가하기 시작하여 24 hr에서 최고의 RIG-1의 발현이 증가됨을 확인할 수 있었다(도 6B 참조). Raw264.7 was treated with RD-NG (1ug/ul) at different concentrations of 10, 50, 100, and 200ug, and after 24 hr, western blot was performed with RIG-1, TLR-3 and As a result of confirming the increase in TLR-4 (Poly IC (polyinosinic-polycytidylic acid, PI:C) and Adenovirus used as a positive control), it was found that only RIG-1 was specifically increased in 50 ug, 100 ug, and 200 ug. (See Figure 6A). In addition, as a result of checking for 0, 2, 8, 24, 48, and 72 hrs after 200ug of RD-NG treatment on Raw264.7, RIG-1 started to increase from 8 hr, indicating that the highest expression of RIG-1 was increased at 24 hr. was confirmed (see FIG. 6B).
또한, RD-NG에 의한 RIG-1의 활성화가 소량의 처리에도 발생되는지 확인하기 위해 B-NG, D-NG와 RD-NG를 0.01, 0.1, 1 그리고 10 ug를 Raw264.7에 처리하고 RIG-1과 TLR-3의 반응을 확인하였다. RD-NG는 1 ug에서부터 RIG-1의 증가가 관찰되었으며 B-NG, D-NG 보다 RIG-1의 증가를 명확하게 유도함이 확인되었다(도 7참조).In addition, in order to check whether the activation of RIG-1 by RD-NG occurs even with a small amount of treatment, 0.01, 0.1, 1 and 10 ug of B-NG, D-NG and RD-NG were treated in Raw264.7 and RIG The reaction between -1 and TLR-3 was confirmed. An increase in RIG-1 was observed from 1 ug of RD-NG, and it was confirmed that it clearly induced an increase in RIG-1 than B-NG and D-NG (see FIG. 7 ).
<실험예 5> 나노젤과 RIG-1의 직접적인 결합 및 관련 신호전달 확인<Experimental Example 5> Confirmation of direct binding of nanogel and RIG-1 and related signaling
RD-NG와 RIG-1의 직접적인 결합과 관련된 신호전달을 확인하기 위해, Raw264.7에 B-NG, D-NG와 RD-NG를 처리해 주고 세포를 융해시킨 후 탐식된 모든 NG들을 원심분리하여 분리한 후 PBS로 세척 후 RIG-1에 대한 면역침강법 (Immunoprecipitation)을 수행하였다. 그 결과 RD-NG가 RIG-1과 가장 많이 결합됨을 확인하였다. RD-NG과 RIG-1의 결합을 재확인하고자 나노젤을 트립신 처리해 주고 동일한 실험을 수행한 결과 RIG-1 신호가 사라짐을 관찰하였다(도 8 참조).In order to confirm the signal transduction related to direct binding of RD-NG and RIG-1, Raw264.7 was treated with B-NG, D-NG, and RD-NG, cells were lysed, and all phagocytosed NGs were centrifuged by centrifugation. After separation, after washing with PBS, immunoprecipitation for RIG-1 (Immunoprecipitation) was performed. As a result, it was confirmed that RD-NG binds to RIG-1 the most. In order to reconfirm the binding of RD-NG and RIG-1, the nanogel was trypsinized, and as a result of performing the same experiment, it was observed that the RIG-1 signal disappeared (see FIG. 8).
또한, RD-NG와 RIG-1의 결합에 의해 전달되는 신호전달경로를 확인하기 위해 Raw264.7에 RD-NG를 10, 50, 100 및 200ug를 1시간 처리하고 상위 신호전달경로 중 ERK와 AKT, 하위 신호전달경로로서는 NFkB의 인산화를 western blot으로 확인하였다. 그 결과, 상위 신호전달경로에서는 ERK의 인산화가 하위 신호전달경로인 NFkB의 인산화가 50ug부터 명확하게 나타나는 것을 확인하였다(도 9 참조).In addition, 10, 50, 100 and 200ug of RD-NG was treated in Raw264.7 for 1 hour to confirm the signaling pathway transmitted by the binding of RD-NG and RIG-1, and ERK and AKT among the upper signaling pathways , As a lower signaling pathway, phosphorylation of NFkB was confirmed by western blot. As a result, it was confirmed that phosphorylation of ERK and phosphorylation of NFkB, which is a lower signaling pathway, clearly appeared from 50 μg in the upper signaling pathway (see FIG. 9 ).
<실험예 6> 나노젤과 RIG-1의 결합에 의한 사이토카인 분비 확인<Experimental Example 6> Confirmation of cytokine secretion by binding of nanogel and RIG-1
RD-NG와 RIG-I의 결합에 의해 생성되는 사이토카인을 확인하기 위해 Raw264.7에 RD-NG를 0.01, 0.1, 1 ug을 처리한 후 항구제역바이러스 사이토카인 중 하나인 IFN-α와 염증성 사이토카인 중 하나인 TNF-α에 대한 ELISA를 수행하였다. RD-NG 0.1과 1 ug에서 IFN-α의 분비가 뚜렷하게 증가하였으나 TNF-α의 경우 변화가 관찰되지 않았다(도 10참조).In order to check the cytokines generated by the combination of RD-NG and RIG-I, 0.01, 0.1, 1 ug of RD-NG was treated with Raw264.7, and then IFN-α, one of anti-dissection virus cytokines, and inflammatory ELISA for TNF-α, one of the cytokines, was performed. The secretion of IFN-α was significantly increased in RD-NG 0.1 and 1 ug, but no change was observed in the case of TNF-α (see FIG. 10).
<실험예 7> 생체에서 나노젤의 탐식 확인<Experimental Example 7> Confirmation of phagocytosis of nanogels in vivo
생체 내의 면역 기관에서 RD-NG의 탐식을 조사하기 위해 200㎍의 RD-NG를 C57BL/6에 정맥 내 또는 복강 내 주사하였다. 72 시간 후, 비장, 림프절, 흉선, 간 및 폐에서 형광 현미경에 의해 RD-NG 흡수를 관찰하였다. 그러나 정맥 주사 및 복강 내 RD-NG를 주사한 경우 관찰된 모든 조직에서 RD-NG의 신호가 관찰되지 않았다(도 11참조). To investigate the phagocytosis of RD-NG in immune organs in vivo, 200 μg of RD-NG was injected intravenously or intraperitoneally into C57BL/6. After 72 hours, RD-NG uptake was observed by fluorescence microscopy in the spleen, lymph nodes, thymus, liver and lungs. However, when RD-NG was injected intravenously and intraperitoneally, no signal of RD-NG was observed in all tissues observed (see Fig. 11).
나노입자의 림프 순환을 확인하기 위해, 마우스 발바닥 주사를 하였다. 두 마리의 C57BL/B6 마우스에 주사하였고; 한 마리는 20 μl의 PBS와 다른 한 마리는 왼쪽 발바닥에 150 μg/20 μl의 RD-NG를 주입하였다. 24 시간 후, 오금 림프절 (popliteal lymph node, pLN)을 얻었다. 도 12A에 나타난 바와 같이, RD-NG를 주사한 마우스의 왼쪽 pLN에서 RD-NG (적색)가 관찰되었다(도 12A참조). 그리고 림프계를 사용하여 나노입자가 다른 림프절들과 관련하여 이동하는지 여부를 결정하기 위해 몇 가지 유형의 림프절을 얻어 면역 형광 염색법으로 분석했다. 두 마리의 C57BL/B6 마우스를 주사하였고 한 마리는 왼쪽 발바닥에 20 μl의 PBS주입 하였고, 다른 마우스는 왼쪽 발바닥에 150 μg/20 μl의 RD-NG를 주입했고 오른쪽 발바닥에는 PBS 20 μl를 주입했다. 24시간 후, pLN, 장간막 림프절(mesenteric lymph node, mLN) 및 서혜부 림프절(inguinal lymph node, iLN)을 얻었다. 도 12B에 나타난 바와 같이, RD-NG를 주입한 마우스로부터 얻은 pLN, iLN 및 mLN에서 RD-NG (적색)가 관찰되었다. 특히 RD-NG은 좌측의 LNs 및 mLN에서 강하게 검출되는 반면, 우측의 pLN의 RD-NG는 약하게 검출되었다. To confirm the lymphatic circulation of nanoparticles, mouse footpad injections were performed. Two C57BL/B6 mice were injected; One animal was injected with 20 μl of PBS and the other with 150 μg/20 μl of RD-NG into the left paw. After 24 h, popliteal lymph nodes (pLNs) were obtained. As shown in Fig. 12A, RD-NG (red) was observed in the left pLN of mice injected with RD-NG (see Fig. 12A). Then, using the lymphatic system, several types of lymph nodes were obtained and analyzed by immunofluorescence staining to determine whether the nanoparticles migrate relative to other lymph nodes. Two C57BL/B6 mice were injected, one was injected with 20 μl of PBS into the left paw, and the other mouse was injected with 150 μg/20 μl of RD-NG into the left paw and 20 μl of PBS was injected into the right paw. . After 24 hours, pLN, mesenteric lymph node (mLN) and inguinal lymph node (iLN) were obtained. As shown in Fig. 12B, RD-NG (red) was observed in pLN, iLN and mLN obtained from mice injected with RD-NG. In particular, RD-NG was strongly detected in LNs and mLN on the left, whereas RD-NG of pLN on the right was weakly detected.
<실험예 8> 생체에서 나노젤에 의한 RIG-1의 활성화 및 활성 사이토카인 확인<Experimental Example 8> Confirmation of RIG-1 activation and active cytokines by nanogel in vivo
RD-NG의 정맥 주사 및 복강 내 주사 주사 후 비장, 림프절, 간, 폐 및 흉선으로부터의 조직 용해물을 만들어 RIG-I의 발현 양을 분석하였으나 모든 기관에서 RIG-I의 변화는 없었다(도 13A참조). 그러나 Footpad 경로로 RD-NG 주입 24 시간 후 pLN, mLN 및 비장을 얻어 전체 용해물을 만들어 분석한 결과, RD-NG 주사 된 pLN에서 RIG-I 발현을 관찰하였다(도 13B참조). 또한, RD-NG 순환에 의한 RIG-I 발현을 확인하기 위해, 3 마리의 RD-NG 마우스를 주사하였고; 하나는 20 μl의 PBS를, 하나는 150 μg/20 μl의 RD-NG를, 다른 하나는 주사를 하지 않았다. 24 시간 후, 왼쪽 및 오른쪽 림프절들에 대한 western blotting 분석을 수행한 결과 RIG-I 발현은 오른쪽 림프절들보다 RD-NG가 주입된 왼쪽 림프절들에서 더 많이 증가하였다(도 13C참조).After intravenous and intraperitoneal injection of RD-NG, tissue lysates from the spleen, lymph node, liver, lung and thymus were prepared and the expression level of RIG-I was analyzed, but there was no change in RIG-I in all organs (Fig. 13A). Reference). However, 24 hours after RD-NG injection through the footpad route, pLN, mLN and spleen were obtained and whole lysates were prepared and analyzed. As a result, RIG-I expression was observed in pLN injected with RD-NG (see Fig. 13B). In addition, to confirm RIG-I expression by RD-NG circulation, three RD-NG mice were injected; One with 20 μl of PBS, one with 150 μg/20 μl of RD-NG, and the other with no injection. After 24 hours, western blotting analysis was performed on the left and right lymph nodes. As a result, RIG-I expression was more increased in the left lymph nodes injected with RD-NG than in the right lymph nodes (see FIG. 13C ).
또한, RD-NG 자극에 의한 림프절 내 RIG-I 발현 증가가 다른 사이토 카인 생성에 어떤 영향을 미치는지를 확인하기 위해 다양한 경로로 RD-NG를 24 시간 주입한 후 혈청을 채취하고 IFN-α, IL-10, TNF-α를 ELISA로 측정하였다. 200 ㎍의 RD-NG를 정맥 또는 복강 내 경로로 주입할 경우 모든 사이토 카인의 변화가 관찰되지 않았다(도 14A참조). 그러나 발바닥 경로로 주사한 마우스의 혈청에서는 도 14B에 나타낸 바와 같이 RD-NG가 주입된 마우스의 24시간째 혈청에서 IFN-α만 특이적으로 증가하였다(도 14B참조).In addition, to determine how the increase in RIG-I expression in lymph nodes by RD-NG stimulation affects the production of other cytokines, serum was collected after 24 hours of RD-NG injection by various routes, and IFN-α, IL -10 and TNF-α were measured by ELISA. When 200 μg of RD-NG was injected intravenously or intraperitoneally, no cytokine changes were observed (see Fig. 14A). However, in the serum of mice injected by the plantar route, as shown in FIG. 14B, only IFN-α was specifically increased in the serum of mice injected with RD-NG at 24 hours (see FIG. 14B).
또한, RD-NG를 C57BL/B6의 발바닥에 주입한 0, 1, 3, 5일 간격으로 혈청을 채집하고 혈청을 이용해 IFN-α에 대한 ELISA 분석을 수행하였다. 그 결과, 1일에서 미약하게 증가되었으나 5일째 급격한 증가를 확인하였다(도 15참조).In addition, serum was collected at intervals of 0, 1, 3, and 5 days when RD-NG was injected into the footpad of C57BL/B6, and ELISA analysis for IFN-α was performed using the serum. As a result, it was slightly increased on the 1st day, but a sharp increase was confirmed on the 5th day (see FIG. 15).
<실험예 9> 돼지 세포에서 IFN-α의 발현 측정<Experimental Example 9> Measurement of IFN-α expression in pig cells
돼지 세포로써, PAM, BAL 세포를 이용하였고, primary cell로는 spleen, tonsil, blood PBMC를 이용하였다. 그리고 돼지 RIG-1을 인식하는 항체가 없어 IFN-α ELISA로 분석을 하였다.As pig cells, PAM and BAL cells were used, and spleen, tonsil, and blood PBMCs were used as primary cells. And there was no antibody recognizing porcine RIG-1, so the analysis was performed by IFN-α ELISA.
그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이, PAM 세포에서 RD-NG 200μg에서 IFN-α가 증가하였다. 또한, BAL cell로 돼지 폐에서 분리한 세포로서 무균 적으로 부검하여 얻은 돼지의 폐에 PBS를 넣고 마사지해준 후 PBS를 다시 회수하여 BAL cell만 분리하였고, 3-4일 계대 후 분석하였다. 그 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이, RD-NG 200μg에서 IFN-α가 증가하였다.As a result, as shown in FIG. 16 , IFN-α was increased at 200 μg of RD-NG in PAM cells. In addition, as cells isolated from pig lungs with BAL cells, PBS was put into the lungs of pigs obtained aseptically after autopsy and massaged. As a result, as shown in FIG. 17 , IFN-α was increased at 200 μg of RD-NG.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특히 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.So far, with respect to the present invention, the preferred embodiments have been looked at. Those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains will understand that the present invention can be implemented in a modified form without departing from the essential characteristics of the present invention. Therefore, the disclosed embodiments are to be considered in an illustrative rather than a restrictive sense. The scope of the present invention is not shown in the foregoing description, but particularly in the claims, and all differences within an equivalent scope should be construed as being included in the present invention.
Claims (9)
상기 나노젤 내부에 임베디드(embeded)되는 RITC(rhodamine-B-isothiocyanate)가 표지된 덱스트란(dextran);을 포함하는 RITC가 표지된 덱스트란 함유 나노젤을 유효성분으로 함유하는 바이러스 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
nanogels composed of a macro initiator, oligo(ethylene oxide)methylethermethacrylate as a monomer, and poly(ethylene oxide)dimethacrylate as a crosslinker; and
RITC (rhodamine-B-isothiocyanate)-labeled dextran embedded in the nanogel; for virus prevention or treatment containing RITC-labeled dextran-containing nanogel as an active ingredient pharmaceutical composition.
상기 나노젤 내부에 임베디드(embeded)되는 RITC(rhodamine-B-isothiocyanate)가 표지된 덱스트란(dextran);을 포함하는 RITC가 표지된 덱스트란 함유 나노젤을 유효성분으로 함유하는 바이러스 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
nanogels composed of a macro initiator, oligo(ethylene oxide)methylethermethacrylate as a monomer, and poly(ethylene oxide)dimethacrylate as a crosslinker; and
RITC (rhodamine-B-isothiocyanate)-labeled dextran embedded in the nanogel; for preventing or improving a virus containing RITC-labeled dextran-containing nanogel as an active ingredient Health functional food composition.
상기 나노젤 내부에 임베디드(embeded)되는 RITC(rhodamine-B-isothiocyanate)가 표지된 덱스트란(dextran);을 포함하는 RITC가 표지된 덱스트란 함유 나노젤을 유효성분으로 함유하는 바이러스 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.
nanogels composed of a macro initiator, oligo(ethylene oxide)methylethermethacrylate as a monomer, and poly(ethylene oxide)dimethacrylate as a crosslinker; and
RITC (rhodamine-B-isothiocyanate)-labeled dextran embedded in the nanogel; for preventing or improving a virus containing RITC-labeled dextran-containing nanogel as an active ingredient health food composition.
상기 나노젤 내부에 임베디드(embeded)되는 RITC(rhodamine-B-isothiocyanate)가 표지된 덱스트란(dextran);을 포함하는 RITC가 표지된 덱스트란 함유 나노젤을 유효성분으로 함유하는 선천면역 증진용 조성물.
nanogels composed of a macro initiator, oligo(ethylene oxide)methylethermethacrylate as a monomer, and poly(ethylene oxide)dimethacrylate as a crosslinker; and
A composition for enhancing innate immunity containing, as an active ingredient, RITC-labeled dextran-containing nanogel containing; RITC (rhodamine-B-isothiocyanate)-labeled dextran embedded in the nanogel .
상기 매크로 개시제는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 조성물:
[화학식 1]
(상기 화학식 1에서, a은 1-300의 정수이다).
5. The method according to any one of claims 1 to 4,
The macro initiator is a composition, characterized in that the compound represented by the formula (1):
[Formula 1]
(In Formula 1, a is an integer of 1-300).
상기 올리고(에틸렌옥사이드)메틸에테르메타크릴레이트는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 조성물:
[화학식 2]
(상기 화학식 2에서, b은 1-10의 정수이다).5. The method according to any one of claims 1 to 4,
The oligo (ethylene oxide) methyl ether methacrylate is a composition characterized in that the compound represented by the following formula 2:
[Formula 2]
(In Formula 2, b is an integer of 1-10).
상기 폴리(에틸렌 옥사이드)디메타크릴레이트는 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 조성물:
[화학식 3]
(상기 화학식 3에서, c은 1-100의 정수이다).5. The method according to any one of claims 1 to 4,
The poly (ethylene oxide) dimethacrylate is a composition characterized in that the compound represented by the following formula 3:
[Formula 3]
(In Formula 3, c is an integer of 1-100).
상기 바이러스는 인플루엔자, 조류 인플루엔자, 뉴캐슬바이러스, 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus), 콕사키바이러스(Cossackievirus), 수족구바이러스(Enterovirus-71), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes Simplex Virus), 구제역바이러스(Foot and mouth disease, FMD), 콜로라도참진드기열바이러스, 레오바이러스, 인간면역 결핍 바이러스, 돼지열병바이러스, 소바이러스성 설사병(Bovine Viral Diarrhea Virus), 돼지생식기호흡기증후군 (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus), 돼지오제스키병, 로타바이러스, 파보바이러스 및 돼지유행성설사(Porcine epidemic diarrhea virus) 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
4. The method according to any one of claims 1 to 3,
The viruses include influenza, avian influenza, Newcastle virus, Vesicular stomatitis virus, Cossackievirus, Enterovirus-71, Herpes Simplex Virus, Foot-and-mouth disease virus (Foot). and mouth disease (FMD), Colorado tick fever virus, reovirus, human immunodeficiency virus, swine fever virus, Bovine Viral Diarrhea Virus, Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, swine Ozesky's disease, rotavirus, parvovirus and swine epidemic diarrhea (Porcine epidemic diarrhea virus) composition, characterized in that at least one selected from the group consisting of.
상기 조성물은 RIG-1 유사 수용체 (RIG-1 like receptor, RLR)와 결합하여 인터페론 알파(IFN-α)의 발현 증가를 통해 선천성 면역 활성화를 매개하는 것을 특징으로 하는 조성물.5. The method of claim 4,
The composition is a RIG-1 like receptor (RIG-1 like receptor, RLR) binding to the composition characterized in that it mediates innate immune activation through increased expression of interferon alpha (IFN-α).
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Biomacromolecules, Vol. 10(8), pp2300-2309.(2009년) |
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WO2024006362A1 (en) * | 2022-06-28 | 2024-01-04 | Transcode Therapeutics, Inc. | Nanoparticles and template directed rig-i agonist precursor compositions and uses thereof for cancer therapy |
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