KR102293426B1 - Animal model of lumbar spinal stenosis and manufacturing method thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 척추관 협착증 동물모델 및 이의 제조방법 등에 관한 것이다. The present invention relates to an animal model of spinal canal stenosis and a method for manufacturing the same.
대표적 퇴행성 척추 질환인 협착증은 오랜 시간 서서히 진행되기 때문에 초기에는 자각증상이 없으나 점차 병증이 진행됨에 따라 저린 증상이 심해지고 결국 신경 손상의 증상이 나타나게 된다. 손상된 신경은 대부분 회복되지 않은 상태로 일생 동안 지속되기 때문에 일상생활 및 보행의 장애와 신경통증, 배뇨장애 등 다양한 합병증이 지속되고 척추뿐 아니라 다양한 다른 부위에서 통증을 일으켜서 삶의 질을 현저히 떨어뜨린다.Stenosis, a typical degenerative spinal disease, has no symptoms at first because it progresses slowly for a long time, but as the disease progresses, the numbness worsens and eventually symptoms of nerve damage appear. Most of the damaged nerves persist throughout life without recovery, so various complications such as disturbances in daily life and gait, nerve pain, and urination disorders persist, and cause pain in various other parts of the body as well as the spine, significantly reducing the quality of life.
그러므로 다양한 증상을 동반하는 척추관 협착증을 효과적으로 치료하기 위한 바람직한 동물 모델을 제공하기 위한 연구가 필수적이다. 동물모델을 통해 협착증의 발병에 관여하는 인자들의 추정이나 기능에 미치는 영향, 병태생리학적 기전을 보다 직접적으로 조사할 수 있고, 기존의 협착증 치료에 사용중인 치료제의 임상적 평가나 작용기전에 대한 연구가 가능하다. 따라서 협착증의 임상적 상태와 가능한 한 유사한 행동양상과 생리적 상태를 반영하는 동물모델의 개발은 매우 중요하다. 기존에 척추관 협착증을 유도하기 위해 사용한 생체 실리콘은 우수한 내열성, 전기절연성, 발수성, 불휘발성, 내열화성의 특성이 있으며 생체에 대한 안전성이 우수하고 튜브 이외에도 인공 귀, 인공 유방 등 정형외과, 성형외과에서 쓰인다. 특히 실리콘 고무는 비이물형 생체친화성과 더불어 뛰어난 점탄성으로 의료용 재료로 오랫동안 사용되어져 왔다. 척추관 협착증 동물모델은 시트 또는 블록 형태의 실리콘을 요추의 척추와 척수 사이의 공간에 이식하여 인위적으로 척추관이 좁아진 상태를 유도하고 궁극적으로 신경의 압박을 유발한다. 그러나 정확하게 표준화되지 않은 경도의 실리콘을 이식하는 것은 불균일하고 부정확한 동물 모델을 유도할 수 있으며, 치료 후보 인자의 실험결과 또한 객관적이지 못하고 부정확 할 수 있다. 따라서 표준화되고 정확한 동물모델 확립이 매우 중요하며, 과학적인 근거를 통해 정확성이 검증되어야 한다. Therefore, research to provide a desirable animal model for effectively treating spinal stenosis accompanied by various symptoms is essential. Through animal models, it is possible to more directly investigate the factors involved in the onset of stenosis, their effects on function, and pathophysiological mechanisms. possible. Therefore, it is very important to develop an animal model that reflects the behavioral and physiological state as similar as possible to the clinical state of stenosis. Bio-silicone previously used to induce spinal canal stenosis has excellent heat resistance, electrical insulation, water repellency, non-volatile properties, and deterioration resistance. is used In particular, silicone rubber has been used for a long time as a medical material due to its excellent viscoelasticity as well as non-foreign body type biocompatibility. An animal model of spinal stenosis artificially induces a narrowed state of the spinal canal by implanting a sheet or block of silicone into the space between the vertebrae and spinal cord of the lumbar spine and ultimately causes nerve compression. However, implantation of silicone with a hardness that is not accurately standardized may lead to non-uniform and inaccurate animal models, and the experimental results of treatment candidate factors may also be non-objective and inaccurate. Therefore, it is very important to establish a standardized and accurate animal model, and the accuracy must be verified through scientific evidence.
현재 임상적으로 협착증 환자를 중증도에 따라 구분하고 대응과 치료전략을 달리한다. 이와 같이 중증도에 따라 달리하는 치료전략의 정확한 효과를 평가하기 위하여 모델의 차별화된 제작방법을 통한 임상 증상 재현 정도, 손상의 중증도, 그리고 치료 성적 평가에 체계적인 비교가 이루어져야 하며 앞으로 이를 보완하기 위한 실험적 연구가 필요한 실정이다. 현재까지 척추관 협착증의 치료를 위한 연구들은 다방면에서 이루어져 왔다. 비록 아직까지는 환자들의 완전한 회복에 이르지 못했지만 병태생리학적 연구들을 기반으로 한 다양한 치료 방법들이 제시되거나 시도되었고 지금도 많은 것들이 연구 중에 있다. 사람에서 나타나는 척추관 협착증의 다양한 증상들 및 회복 과정에서의 이상 소견들을 완벽하게 재현할 수 있는 실험동물 모델은 아직까지 없는 상태이나 각각의 방법들의 장점 및 단점들에 대한 충분한 이해와 연구의 목적에 맞는 적합한 동물 모델의 선택을 통한 지속적인 연구가 필요하다. 또한 척추관 협착증의 발생기전과 병태생리를 보다 명확하게 규명해 줄 새로운 동물 모델의 필요가 증가하고 있다.Currently, clinically, patients with stenosis are classified according to their severity, and responses and treatment strategies are different. In order to evaluate the exact effect of different treatment strategies according to the severity, systematic comparisons must be made on the degree of reproduction of clinical symptoms, the severity of damage, and the evaluation of treatment outcomes through the differentiated manufacturing method of the model. is needed. To date, studies for the treatment of spinal stenosis have been conducted in various fields. Although patients have not yet fully recovered, various treatment methods based on pathophysiological studies have been proposed or tried, and many are still under study. There is still no experimental animal model that can completely reproduce the various symptoms of spinal stenosis in humans and abnormal findings in the recovery process, but it is suitable for the purpose of the study and sufficient understanding of the advantages and disadvantages of each method. Continued research through the selection of suitable animal models is necessary. In addition, there is an increasing need for new animal models to more clearly elucidate the pathophysiology and pathogenesis of spinal canal stenosis.
즉, 임상적으로 척추관 협착증 환자를 중증도에 따라 구분하고 그에 따른 대응과 치료전략을 달리하고자 하는 시도가 있으며, 중증도에 따라 달리하는 치료전략의 수립과 그 정확한 효과를 평가하기 위해서는 임상 증상 재현 정도와 손상의 중증도 조절이 가능한 동물모델의 제공이 필수적이다. 이에, 본 발명자들은 동물모델의 체계적이 중증도 조절을 위하여 차별화된 제작방법과 체계화된 평가 방법에 대해 예의 연구하여 본 발명을 완성하였다. In other words, there are attempts to clinically classify patients with spinal canal stenosis according to their severity and to change their response and treatment strategies accordingly. It is essential to provide an animal model that can control the severity of the injury. Accordingly, the present inventors have completed the present invention by intensively researching a differentiated manufacturing method and a systematic evaluation method for systematic severity control of an animal model.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 인간을 제외한 척추동물의 제4 요추부에삽입하는 실리콘 블록의 경도를 통해 신경 손상의 정도가 조절된 동물모델 제조방법과 그 방법으로 제조된 동물모델을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide an animal model manufacturing method in which the degree of nerve damage is controlled through the hardness of a silicon block inserted into the fourth lumbar vertebrae of vertebrates other than humans, and an animal model manufactured by the method.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 동물모델을 이용하여 중증도에 따라 구분되는 척추관 협착증 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. Another object of the present invention is to provide a screening method for a therapeutic agent for spinal canal stenosis, which is classified according to severity using the animal model prepared by the above method.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other problems not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 척추관 협착증 동물모델 제조방법을 제공한다:In order to solve the above problems, the present invention provides a method for producing an animal model of spinal canal stenosis comprising the following steps:
(1) 인간을 제외한 척추동물의 제5 요추부의 후궁절제술을 수행하는 단계; 및(1) performing a laminectomy of the fifth lumbar vertebrae in vertebrates other than humans; and
(2) 상기 척추동물의 제4 요추부에 실리콘 블록을 삽입하는 단계.(2) inserting a silicon block into the fourth lumbar vertebra of the vertebrate.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 (2) 단계의 실리콘 블록의 경도는 70, 80, 또는 90 kpa일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the hardness of the silicon block in step (2) may be 70, 80, or 90 kpa.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 척추동물은 랫드, 모르모트, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 소, 양, 돼지 및 염소로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 바람직하게는 랫드일 수 있다. In another embodiment of the present invention, the vertebrate may be any one selected from the group consisting of rat, guinea pig, monkey, dog, cat, rabbit, cow, sheep, pig and goat, but preferably a rat. .
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 척추동물이 랫드인 경우 상기 (2) 단계의 실리콘 블록의 형상은 원기둥 또는 6면체 일 수 있으며, 원기둥인 경우 상하부면의 면적은 2~7 mm2이고 높이는 0.5~1.5mm일 수 있고, 6면체인 경우 가로 3~5 mm, 세로 0.5~1.5 mm, 높이 0.5~1.5 mm일 수 있다. 본 발명자들은 구체적인 실험에서 가로 4mm, 세로 1mm, 높이 1mm의 육면체 실리콘 블록을 이용하여 척추관 협착증을 유도하였다. As another embodiment of the present invention, when the vertebrate is a rat, the shape of the silicon block in step (2) may be a cylinder or a hexahedron, and in the case of a cylinder, the area of the upper and lower surfaces is 2-7 mm 2 and the height is It may be 0.5 to 1.5 mm, and in the case of a hexahedron, it may be 3 to 5 mm in width, 0.5 to 1.5 mm in length, and 0.5 to 1.5 mm in height. In a specific experiment, the present inventors induced spinal canal stenosis using a hexahedral silicon block having a width of 4 mm, a length of 1 mm, and a height of 1 mm.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 척추관 협착증 동물모델을 제공한다. In addition, the present invention provides an animal model of spinal stenosis prepared by the above method.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 척추관 협착증 치료제 스크리닝 방법을 제공한다:In addition, the present invention provides a screening method for a therapeutic agent for spinal stenosis comprising the steps of:
(a) 제5 요추부의 후궁절제술을 수행하고, 제4 요추부에 70, 80, 또는 90 kpa 경도의 실리콘 블록을 삽입한 랫드를 준비하는 단계;(a) performing a laminectomy of the fifth lumbar vertebrae, preparing a rat inserting a silicon block of 70, 80, or 90 kpa hardness into the fourth lumbar vertebrae;
(b) 상기 랫드에 후보물질을 투여하는 단계;(b) administering a candidate substance to the rat;
(c) 상기 후보물질이 투여된 랫드의 운동기능 평가 또는 염증 관련 사이토카인의 발현 수준 측정하고 후보물질 투여 전과 비교하는 단계; 및(c) measuring the expression level of an inflammatory cytokine or evaluating motor function in rats to which the candidate substance is administered and comparing it with before administration of the candidate substance; and
(d) 상기 후보물질 투여 후 운동기능 회복 여부, 염증 유도 사이토카인의 발현 감소, 또는 항염증 사이토카인의 발현이 증가하는 경우 후보물질을 척추관 협착증 치료물질로 선정하는 단계.(d) selecting the candidate material as a therapeutic material for spinal canal stenosis when the motor function is restored after administration of the candidate material, the expression of inflammation-inducing cytokines is reduced, or the expression of anti-inflammatory cytokines is increased.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 (a) 단계에서 실리콘 블록의 경도가 80kpa 또는 90kpa 인 경우 선정된 치료제는 중증 척추관 협착증 치료에 이용될 수 있다. In one embodiment of the present invention, when the hardness of the silicon block in step (a) is 80 kpa or 90 kpa, the selected therapeutic agent can be used to treat severe spinal stenosis.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 (a) 단계에서 실리콘 블록의 경도가 70 kpa 인 경우 선정된 치료제는 경증 또는 중등증 척추관 협착증 치료에 이용될 수 있다.As another embodiment of the present invention, when the hardness of the silicon block in step (a) is 70 kpa, the selected therapeutic agent may be used to treat mild or moderate spinal stenosis.
본 발명은 제4 요추부에 이식되는 실리콘 블록의 경도를 신경 손상의 중증도를 조절할 수 있는 지표로 제공하여 중증도를 달리하는 척추관 협착증 동물모델을 제작할 수 있는 방법을 제공한다. 본 발명의 동물모델 제작방법은 일정하게 신경 손상의 부위, 정도, 크기를 유도할 수 있는바, 척추관 협착증의 중증도에 따른 치료방법과 치료제 연구에 유용하게 이용될 것으로 기대된다. The present invention provides a method for producing an animal model of spinal canal stenosis having different severity by providing the hardness of a silicon block implanted in the fourth lumbar vertebrae as an index capable of controlling the severity of nerve damage. The animal model production method of the present invention is expected to be usefully used in research on treatment methods and therapeutic agents according to the severity of spinal canal stenosis, since the site, degree, and size of nerve damage can be consistently induced.
도 1A는 실리콘 블록의 경도를 달리하여 척추관 협착증(lumbar spinal stenosis: LSS) 모델 확립을 위한 실험 설계의 개략도 이고, 도 1B는 요추에 삽입된 실리콘의 구성 성분이고, 도 1C는 실리콘 블록의 SEM 이미지 이다.
도 2A는 LSS 모델의 수술 절차 사진이고, 도 2B는 경도가 다른 실리콘 블록 삽입된 랫드와 대조군(sham)의 수술 4 주 후의 H&E 염색 이미지 이고, 도 2C는 요추 4번에 실리콘 블록이 삽입된 MRI 이미지이고, 도 2D는 각 그룹의 실리콘 경도에 따른 압축된 척수 영역을 정량화한 그래프이다(*P < 0.05, **P < 0.01 and ***P < 0.001).
도 3A는 척수에서 CD68+ 대식세포의 면역 형광 염색 이미지 이고(좌: 500 μm, 우: 100 μm), 도 3B-C는 CD68+ 세포의 강도와 수를 정량화한 그래프이다(*** P <0.001).
도 4A는 LFB 염색 이미지 이고(좌: 500 μm, 우: 100 μm), 도 4B-C는 LFB 염색된 수초(myelin sheath)의 강도와 면적을 정량화한 그래프이다(*** P <0.001).
도 5는 대조군과 경도가 다른 실리콘 블록을 삽입한 랫드의 수술 1주 후 염증 및 항염증과 관련된 인자의 발현 수준을 RNA와 단백질 수준에서 비교 분석한 그래프이다(*P < 0.05, **P < 0.01 and ***P < 0.001).
도 6은 대조군과 경도가 다른 실리콘 블록을 삽입한 랫드의 운동기능 평가 결과를 비교한 도면이다(A: BBB 점수, B: 사다리 평가 점수, C: Von Frey 점수) (*P < 0.05, **P < 0.01 and ***P < 0.001). 1A is a schematic diagram of the experimental design for establishing a lumbar spinal stenosis (LSS) model by varying the hardness of the silicone block, FIG. 1B is a component of silicone inserted into the lumbar spine, and FIG. 1C is an SEM image of the silicone block am.
Figure 2A is a photograph of the surgical procedure of the LSS model, Figure 2B is an
3A is an immunofluorescence staining image of CD68 + macrophages in the spinal cord (left: 500 μm, right: 100 μm), and FIGS. 3B-C are graphs quantifying the intensity and number of CD68 + cells (*** P < 0.001).
4A is a LFB-stained image (left: 500 μm, right: 100 μm), and FIGS. 4B-C are graphs quantifying the intensity and area of LFB-stained myelin sheath (*** P <0.001).
Figure 5 is a graph comparing and analyzing the expression levels of factors related to inflammation and anti-inflammatory at the RNA and protein levels after 1 week after surgery in rats with silicone blocks of different hardness from the control group (*P < 0.05, **P < 0.01 and ***P < 0.001).
6 is a diagram comparing the motor function evaluation results of the control group and the rats inserted with silicone blocks having different hardness (A: BBB score, B: ladder evaluation score, C: Von Frey score) (*P < 0.05, ** P < 0.01 and ***P < 0.001).
동물 모델은 인간 질환 자체의 병리적 기전을 연구하거나, 기존의 치료에 사용중인 치료제의 임상적 평가 및 새로운 치료법에 대한 효과와 치료 기전을 규명하기 위해 반드시 필요하다. 한편, 일반적으로 MRI상 경막낭의 횡단면부가 100mm2 이하이거나, 중간 시상봉합의 직경이 100mm 이하이거나, 후방 디스크의 높이가 4mm 이하이거나 추간공 높이가 15mm 이하인 경우 척추관 협착증으로 진단한다. 경막공간(dural sac cross-sectional area: DSCA)이 100mm2 이하 75mm2 이상인 경우 경증(mild) 또는 중등증(moderate)로 구분하고, 75mm2 이하인 경우 중증(severe)로 구분하여 중증도에 따라 치료적 접근을 달리한다. 이에, 본 발명자들은 중증도에 따른 척추관 협착증 치료 방법 연구를 위한 표준화되고 균일한 동물 모델 제작을 위해 예의 연구하여 본 발명을 완성하였다. Animal models are essential to study the pathological mechanism of human disease itself, to evaluate the clinical evaluation of existing therapeutic agents, and to elucidate the effects and therapeutic mechanisms of new therapies. On the other hand, in general, if the transverse section of the dural sac on MRI is 100 mm 2 or less, the diameter of the middle sagittal suture is 100 mm or less, the posterior disc height is 4 mm or less, or the intervertebral foramen height is 15 mm or less, it is diagnosed as spinal canal stenosis. Epidural space: (dural sac cross-sectional area DSCA ) is not less than 100mm 2 less than 75mm 2 treated according to the severity, separated by a mild (mild) or moderate (moderate), and separated by severe (severe) If 75mm 2 or less enemy change the approach Accordingly, the present inventors have completed the present invention by intensively researching for the production of a standardized and uniform animal model for the study of a treatment method for spinal canal stenosis according to the severity.
본 발명자들은 표준화되고 균일한 척추관 협착증 모델 제작을 위하여 다양한 경도의 실리콘 블록을 이식하여 척추관 협착증 동물모델을 제작하였고, 실리콘 경도에 따른 조직학적, 분자생물학적 변화를 관찰함에 따라 병변을 비슷한 손상으로 재현할 수 있는 표준화된 방법을 제시할 수 있다. 비록 해당 질환의 만성적인 임상 경과 및 조직학적 소견과 완전히 일치하는 동물 모델을 제작하기는 쉽지 않으나, 전임상 실험은 임상시험의 정확한 평가 및 새로운 치료법을 인간 질환에 적용하기 위해 필수적이며 최적화된 치료법 개발을 위한 기본적인 원칙을 제공할 수 있다. The present inventors produced an animal model of spinal stenosis by implanting silicone blocks of various hardnesses to produce a standardized and uniform spinal canal stenosis model. A standardized method can be suggested. Although it is not easy to produce an animal model that completely matches the chronic clinical course and histological findings of the disease, preclinical experiments are essential for the accurate evaluation of clinical trials and the application of new therapies to human diseases. can provide basic principles for
기존의 척추관 협착증 동물 모델 제작을 위해 블록 및 시트 형태의 실리콘을 요추의 척추관에 이식하는 방법은 이미 많은 연구들에서 제시되어 왔으나, 정확하고 표준화된 모델 제작에 대한 평가는 이루어지지 않았다. 특히 생체재료를 이용한 만큼 재료의 정확한 물성 및 경도 평가에 대한 연구는 보고되지 않았다. 우리는 주사전자현미경 (scanning electron microscope, sem)을 통해 서로 다른 경도의 실리콘 표면의 형상 및 경도의 차이를 확인하였고. 경도가 증가할수록 척수가 보다 강한 압력을 받아 고도 (severe) 의 손상을 입을 것으로 예상하였으나, 80kpa과 90kpa 경도 사이의 행동학적 변화의 차이는 나타나지 않았다. 그러나 70kpa이 이식된 협착증 모델의 경우 80kpa 또는 90kpa이 이식된 모델과 비교하여 염증반응이 적게 나타났으며, 대조군과 비교하여 대부분의 평가지표에서 유의적인 차이를 보이지 않았다. A method of implanting block and sheet silicone into the spinal canal of the lumbar vertebrae for the production of an existing animal model of spinal stenosis has been suggested in many studies, but an accurate and standardized model production has not been evaluated. In particular, studies on accurate evaluation of physical properties and hardness of materials have not been reported since biomaterials are used. We confirmed the difference in shape and hardness of silicon surfaces of different hardnesses through a scanning electron microscope (sem). As the hardness increased, it was expected that the spinal cord would be subjected to stronger pressure and suffered severe damage. However, the 70kpa transplanted stenosis model showed less inflammatory response compared to the 80kpa or 90kpa transplanted models, and showed no significant difference in most evaluation indicators compared to the control group.
따라서, 본 발명의 방법에 의해 제조된 척추관 협착증 동물모델은 협착증 치료를 위한 약제의 스크리닝 방법에 이용될 수 있으며, 이때, 중증도에 따라 요추에 이식하는 실리콘 블록의 경도를 달리하여 제조한 동물모델을 이용할 수 있다. 예를 들어 80 또는 90 kpa 경도의 실리콘 블록이 이식된 동물모델은 중증 척추관 협착증 치료용 물질의 스크리닝에 이용될 수 있고, 70 kpa 경도의 실리콘 블록이 이식된 동물모델은 경증 또는 중등증 척추관 협착증 치료용 물질의 스크리닝을 위하여 이용할 수 있다. Therefore, the animal model of spinal canal stenosis prepared by the method of the present invention can be used in a method for screening drugs for the treatment of stenosis. Available. For example, an animal model implanted with a silicone block with a hardness of 80 or 90 kpa can be used for screening materials for the treatment of severe spinal stenosis, and an animal model implanted with a silicone block with a hardness of 70 kpa can be used to treat mild or moderate spinal stenosis. It can be used for screening of solvents.
상기 결과로부터, 표준화된 협착 모델을 제작하기 위해서는 정확한 경도의 실리콘을 주입하는 것이 중요하고, 이를 통해 제작된 동물모델을 통해 시험 물질의 치료 효과를 정확하게 평가함을 알 수 있다. From the above results, it can be seen that it is important to inject silicone of an accurate hardness in order to produce a standardized stenosis model, and the treatment effect of the test substance is accurately evaluated through the animal model produced through this.
이에, 본 발명은 제4 요추부(L4)에 삽입되는 실리콘 경도를 신경 손상의 중증도를 조절할 수 있는 지표로 제공할 수 있다. Accordingly, the present invention can provide the hardness of the silicone inserted into the fourth lumbar vertebrae (L4) as an index capable of controlling the severity of nerve damage.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.The present invention can apply various transformations and can have various embodiments. Hereinafter, specific embodiments are illustrated in the drawings and described in detail in the detailed description. However, this is not intended to limit the present invention to specific embodiments, and it should be understood to include all modifications, equivalents and substitutes included in the spirit and scope of the present invention. In describing the present invention, if it is determined that a detailed description of a related known technology may obscure the gist of the present invention, the detailed description thereof will be omitted.
[실험 방법 및 재료][Experimental methods and materials]
1. 실리콘 블록1. Silicon block
실험에 사용된 실리콘 블록(grade SH5180U)은 ㈜KCC (서울, 한국)에서 구입하였으며, 실리콘 블록은 0.11-0.15 mmol/g의 비닐 그룹(vinyl group), 약 50~60%의 첨가제와 함께 이산화규소(silicone dioxide), 실록산(siloxane), di-Me, 및 종말-하이드록시 실리콘을 포함한다. 실리콘 블록의 구체적인 혼합비는 도 1B에 나타내었다. The silicon block (grade SH5180U) used in the experiment was purchased from KCC (Seoul, Korea), and the silicon block was silicon dioxide with 0.11-0.15 mmol/g of vinyl group and about 50-60% of additives. (silicone dioxide), siloxane, di-Me, and terminal-hydroxy silicone. The specific mixing ratio of the silicon block is shown in FIG. 1B.
2. 척추관 협착증 동물 모델 제작2. Fabrication of an Animal Model of Spinal Canal Stenosis
실험에 사용할 랫드는 220~230g의 7주령 수컷 SD 랫드고 대한바이오링크(청주, 한국)에서 구입하였다. 모든 절차는 자성 동물 관리 및 사용 위원회(JSR-2019-09-002-001)의 승인을 받았다. 각 랫드는 별도의 케이지에서 사육하였으며, 사육장은 23~25℃ 온도, 45~50% 습도, 12시간 암주기/명주기 조건으로 통제하였으며, 물과 음식은 자율급식할 수 있도록 하였다. The rats to be used in the experiment were purchased from 7-week-old male SD rats weighing 220-230 g and Daehan Biolink (Cheongju, Korea). All procedures were approved by the Veterinary Animal Care and Use Committee (JSR-2019-09-002-001). Each rat was bred in a separate cage, and the kennel was controlled at 23~25℃ temperature, 45~50% humidity, and 12 hours dark/light cycle conditions, and water and food were allowed to be fed autonomously.
랫드는 2~3% 이소플루란 가스(isoflurane gas)(Forane; BK Pham, Goyang, Korea)로 마취시킨 후 L5 에서 미세한 론저(rongeur)를 이용하여 척추후궁절제술(dorsal laminectomy)을 수행하였다. 실리콘 블록(4 × 1 × 1 mm)은 5번 핀셋(forcep) (JD-S-04; Jeung Do Bio & Plant Company, 서울, 한국)을 이용하여 L4 에 삽입하였다. 대조군은 삽입 없이 L5에 척추후궁절제술만 수행하였다. 수술 이후 척추는 흡수성 지혈제(absorbable hemostat) (Surgicel® fabric, Johnson and Johnson, Arlington, TX, USA)를 이용하여 덮고, 봉합 후 40 mg/kg 세포티암염산염 (cefotiam hydrochloride) (Fontiam™, 한미약품, 서울, 한국)을 대퇴부에 근육주사하였다. 마취 이후에 모든 랫드는 10 mg/kg 아세타미노펜 시럽(Tylenol™, Janssen Pharmaceutica, Titusville, NJ, USA)을 경구투여하였다. 각 그룹(n=4)의 랫드는 수술 4주 이후에 부검하였다. Rats were anesthetized with 2-3% isoflurane gas (Forane; BK Pham, Goyang, Korea), and then a dorsal laminectomy was performed at L5 using a fine rongeur. A silicon block (4 × 1 × 1 mm) was inserted into L4 using a No. 5 forcep (JD-S-04; Jeung Do Bio & Plant Company, Seoul, Korea). The control group performed only laminectomy at L5 without implantation. After surgery, the spine was covered with absorbable hemostat (Surgicel® fabric, Johnson and Johnson, Arlington, TX, USA) and sutured with 40 mg/kg cefotiam hydrochloride (Fontiam™, Hanmi Pharmaceutical, Seoul, Korea) was intramuscularly injected into the thigh. After anesthesia, all rats were orally administered with 10 mg/kg acetaminophen syrup (Tylenol™, Janssen Pharmaceutica, Titusville, NJ, USA). Rats in each group (n=4) were necropsied 4 weeks after surgery.
3. 조직학적 분석(Histological analysis)3. Histological analysis
H&E(hematoxylin & eosin), LFB(luxol fast blue), 및 IHC(immunohistochemistry) 염색의 경우, 0.9% 식염수(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 및 4% 파라포름알데하이드 (PC2031-000-00, Biosesang, 경기도, 한국)을 포함하는 0.1 M PBS(phosphate-buffered saline)(pH 7.4)를 랫드에 관류시켰다. 실리콘 블록이 삽입된 L4 척추는 4℃에서 4% 파라포름알데하이드로 밤새 고정시킨 후 분리하였다. 분리된 L4 척추 샘플은 30% 수크로오스(sucrose)에서 3일 동안 저온에서 보관(cryopreservation)한 후 크라이오 블록(cryo-block)에 매립하여 수평면을 축방향으로 16 μm가 되도록 절단하였다. H&E 염색은 표준 프로토콜에 따라 수행되었으며, 4주 동안 실리콘 블록에 의해 야기된 척수 손상 정도를 확인하기 위하여 절편된 조직의 중앙부에서 염색을 수행하였다. 염색 부위는 도립현미경(니콘, 도쿄, 일본)을 이용하여 촬영하였고, 손상 영역은 대조군과 비교하여 잔존하는 척수를 ImageJ software (v1.37, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)을 이용하여 정량화하였다. For hematoxylin & eosin (H&E), luxol fast blue (LFB), and immunohistochemistry (IHC) staining, 0.9% saline (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) and 4% paraformaldehyde (PC2031-000-) 00, Biosesang, Gyeonggi-do, Korea) containing 0.1 M PBS (phosphate-buffered saline) (pH 7.4) was perfused to the rats. The L4 vertebrae with the silicone block inserted were fixed overnight at 4°C with 4% paraformaldehyde and then separated. The isolated L4 spinal sample was stored (cryopreservation) in 30% sucrose at low temperature for 3 days, and then embedded in a cryo-block and cut so that the horizontal plane was 16 μm in the axial direction. H&E staining was performed according to a standard protocol, and staining was performed on the central part of the sectioned tissue to determine the degree of spinal cord injury caused by the silicone block for 4 weeks. The stained area was photographed using an inverted microscope (Nikon, Tokyo, Japan), and the damaged area was compared with the control and the remaining spinal cord was imageJ software (v1.37, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) using quantified.
탈수초화(demyelination)를 측정하기 위하여 척추관 협착증 유도 4주 이후 LFB 염색을 수행하였다. 각 섹션 슬라이드를 0.1M PBS로 세척하고 95% 에탄올에 탈수시킨 후 60℃에서 밤새 LFB (Sigma) 염색 용액(1% LFB in 95% ethanol with 0.5% acetic acid)으로 염색하였다. 이어서 슬라이드를 증류수로 세척하고 리튬카보네이트(lithium carbonate: TCI)로 분화시킨 후, 회백질이 구분될 때까지 70% 에탄올에 담궜다. 상기 슬라이드를 자일렌(xylene)으로 투명화하고 현미경(Nikon)으로 관찰하였다. In order to measure demyelination, LFB staining was performed 4 weeks after induction of spinal stenosis. Each section slide was washed with 0.1M PBS, dehydrated in 95% ethanol, and stained with LFB (Sigma) staining solution (1% LFB in 95% ethanol with 0.5% acetic acid) overnight at 60°C. Then, the slides were washed with distilled water, differentiated with lithium carbonate (TCI), and immersed in 70% ethanol until gray matter was separated. The slide was made transparent with xylene and observed with a microscope (Nikon).
IHC는 실험군과 대조군의 척수 염증 반응을 평가하기 위하여 수행되었다. 토끼의 항-단핵구/대식세포 ED1(1:500, Abcam, Cambridge, MA, USA)을 1차 항체로 조직과 함께 4℃에서 밤새 반응시켰다. 이어서 조직은 PBS로 3차례 세척하고, PBS로 희석된 염소 혈청(1:200)을 이용하여 2차 항체인 염소 항-마우스(Alexa Fluor 488) (Abcam)를 조직과 함께 2시간 동안 반응시키고 PBS로 3차례 세척하였다. 염색된 조직은 공초점현미경(Eclipse C2 Plus, Nikon)을 이용하여 촬영하였고, 염증 반응은 각 그룹에서 ED1+ 세포의 수를 수동으로 계수하고 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 ED1+의 강도를 측정하여 정량화하였다. IHC was performed to evaluate the spinal cord inflammatory response of the experimental group and the control group. Rabbit anti-monocyte/macrophage ED1 (1:500, Abcam, Cambridge, MA, USA) was reacted with the tissue as a primary antibody overnight at 4°C. Then, the tissue was washed three times with PBS, and a secondary antibody, goat anti-mouse (Alexa Fluor 488) (Abcam), was reacted with the tissue for 2 hours using goat serum (1:200) diluted with PBS, followed by PBS was washed 3 times. The stained tissue was photographed using a confocal microscope (Eclipse C2 Plus, Nikon), and the inflammatory response was quantified by manually counting the number of ED1 + cells in each group and measuring the intensity of ED1 + using ImageJ software. .
4. Real time polymerase chain reaction (Real time PCR) 4. Real time polymerase chain reaction (Real time PCR)
척추관 협착증 유도 후 염증반응과 관련된 mRNA 발현 수준의 변화는 Real time PCR을 통해 측정하였다. RNeasy mini kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 각 그룹에서 실리콘이 삽입된 척수의 RNA를 분리하였다. cDNA는 random hexamer primers와 Accupower RT premix (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 합성하였다. 모든 프라이머는 UCSC Genome Bioinformatics와 NCBI 데이터베이스를 이용하여 설계하였으며, 프라이머의 구체적인 정보는 하기 표 1에 나타내었다. Real time PCR은 iCycler iQ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad)에서 SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 수행하였다. 최소 3회 반복하여 수행하고, 각 타겟 유전자의 발현은 글리세르알데히드-3-인산탈수소효소 (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)를 기준으로 정규화하였고, 대조군과 비교하여 상대적인 발현량을 조사하였다.After induction of spinal canal stenosis, changes in mRNA expression levels related to inflammation were measured by real-time PCR. The RNeasy mini kit (Qiagen, Hilden, Germany) was used to isolate RNA from the spinal cord into which silicone was inserted from each group. cDNA was synthesized using random hexamer primers and Accupower RT premix (Bioneer, Daejeon, Korea). All primers were designed using UCSC Genome Bioinformatics and NCBI database, and detailed information of primers is shown in Table 1 below. Real-time PCR was performed using SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) in the iCycler iQ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad). This was repeated at least 3 times, and the expression of each target gene was normalized based on glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, and the relative expression level compared to the control group was investigated.
5. Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs)5. Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs)
실리콘 삽입 영역을 포함한 1cm 영역의 척수에서 인터루킨-6 (interleukin-6)와 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor-alpha: TNF-α)의 그룹간 발현량의 변화를 확인하기 위하여ELISA를 수행하였다. tacoTM Prep Bead Beater (GeneReach, Taiwan Taichung, Taiwan)를 사용하여 1cm의 척수를 균질화하고 4 ℃에서 3 분 동안 1000 rpm으로 원심 분리하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 ELISA 키트 (BD Bioscience, Franklin Lakes, USA)를 사용하여 상청액을 검사하였다.ELISA was performed to confirm the change in the expression levels of interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) between groups in the spinal cord of 1 cm including the silicone insertion region. . Using a tacoTM Prep Bead Beater (GeneReach, Taichung, Taiwan), 1 cm of spinal cord was homogenized and centrifuged at 1000 rpm at 4°C for 3 minutes. Supernatants were assayed using an ELISA kit (BD Bioscience, Franklin Lakes, USA) according to the manufacturer's protocol.
6. 운동기능 평가(Locomotor function assays)6. Locomotor function assays
척추관 협착증 유도 후 Von Frey test, BBB (the Basso, Beattie) 이동평가척도 (locomotor rating scale)와 함께 수평 사다리 검사를 통해 감각 및 운동기능의 회복정도를 평가하였다. Von Frey test는 통증에 대한 반응을 측정하는 것으로, 측정 전 랫드를 실험틀에 넣어 15분 이상 적응시켰다. 랫드의 발바닥 중앙을 5g/sec의 속도와 힘으로 최대 10초동안 자극하여 회피하는 시점을 Von Frey filament (Ugo Basile, Varese, Italy)를 이용하여 그 시간과 역치를 기록하였다. 회피반응은 자극을 가하는 동안 발을 들어올리거나, 휘젓거나, ?q거나, 발을 빼어내는 행동으로 정의하고 3번 이상의 반복 결과의 평균값으로 나타내었다. After induction of spinal stenosis, the degree of recovery of sensory and motor functions was evaluated through the horizontal ladder test along with the Von Frey test and the BBB (the Basso, Beattie) locomotor rating scale. The Von Frey test is to measure the response to pain, and before the measurement, the rats were put into the experimental frame and acclimatized for at least 15 minutes. The time and threshold were recorded using Von Frey filament (Ugo Basile, Varese, Italy) at the time of avoidance by stimulating the center of the foot of the rat at a speed and force of 5 g/sec for up to 10 seconds. Avoidance response was defined as the behavior of lifting, stirring, q, or withdrawing the foot while applying the stimulus, and it was expressed as the average value of the results of three or more repetitions.
BBB 이동평가척도는 직경 90cm, 높이 15cm의 원통형 아크릴판 위에서 척추관 협착증 동물모델의 움직인을 4분간 관찰한 후 0점에서 21점까지 점수를 산정하도록 정해져 있다. (뒷다리 움직임이 관찰되지 않는 경우 0, 정상적인 뒷다리 움직임이 있는 경우 21). 실험대상의 그룹에 대한 정보 없이 서로 다른 두명의 관찰자가 측정도록 하여 앞다리와 뒷다리의 움직임의 형태를 분석한 후 평균값을 최종 점수로 결정하였다. 이때 비디오 녹화를 시행하여 추후 이 녹화 자료를 보지 못한 장면을 확인하기 위한 도구로 사용하였다. The BBB movement evaluation scale is set to calculate the score from 0 to 21 after observing the movement of the animal model of spinal canal stenosis for 4 minutes on a cylindrical acrylic plate with a diameter of 90 cm and a height of 15 cm. (0 if no hindlimb movement is observed, 21 if there is normal hindlimb movement). After analyzing the movements of the forelimbs and hindlimbs by allowing two different observers to measure them without information on the group of subjects, the average value was determined as the final score. At this time, video was recorded and used as a tool to confirm the scenes that were not seen in the future.
수평 사다리 실험은 랫드의 균형 감각을 측정하기 위하여 수행하였다. 모든 랫드는 금속 격자판 (격자간격 2.5cm)의 왼쪽에서 오른쪽으로 3회 이동하였으며, 그 움직임은 디지털 캠코더로 영상화하여 그 점수(ladder score)를 하기 수학식 1로 계산하였다. The horizontal ladder experiment was performed to measure the sense of balance in rats. All rats moved from the left to the right three times on a metal grid plate (lattice spacing 2.5 cm), and the movement was imaged with a digital camcorder, and the ladder score was calculated by
[수학식 1][Equation 1]
ladder score (%) = erroneous steps of hind limb/total steps of hind limb Х 100ladder score (%) = erroneous steps of hind limb/total steps of
대조군과 실험군 모두 척추관 협착증 유도 후 매주 1회씩 시행하여 4주까지 기능적인 회복 정도를 평가하였고, 모든 운동시험은 디지털 카메라를 사용하여 210초 이상 영상으로 기록하였다. 운동기능의 평가는 랫드의 수술내용을 알지 못하는 2명의 관찰자에 의해 수행되었다. After induction of spinal canal stenosis in both control and experimental groups, the degree of functional recovery was evaluated up to 4 weeks after induction of spinal canal stenosis. The evaluation of motor function was performed by two observers who did not know the details of the operation of the rat.
7. 통계7. Statistics
모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시하였다. 분석은 SPSS v24 (IBM, Chicago, IL, USA)을 이용하였다. Mann-Whitney U test는 대조군과 실험군 간의 조직학적, 면역조직화학적, 및 유전자 발현 수준 차이를 정량화하기 위하여 이용되었다(p<0.05). BBB 및 수평 사다리 평가에서 대조군과 실험군의 비교를 위한 반복 실험은 one-way ANOVA를 통해 분석하였다. All data are expressed as mean ± standard deviation. Analysis was performed using SPSS v24 (IBM, Chicago, IL, USA). The Mann-Whitney U test was used to quantify the difference in histological, immunohistochemical, and gene expression levels between control and experimental groups (p<0.05). In the evaluation of BBB and horizontal ladder, repeated experiments for comparison of control and experimental groups were analyzed through one-way ANOVA.
[실험 결과 및 고찰][Experimental results and consideration]
실시예 1. 실리콘 블록의 특성 Example 1. Characteristics of silicon blocks
척추관 협착증 실험 디자인은 도 1A에 나타난 다이어그램과 같다. 협착증 유도를 위해 삽입된 실리콘 블록의 경도는 각각 70, 80, 90 kpa이고, 대조군은 실리콘 블록을 삽입하지 않았다. 실리콘 블록의 성분은 도 1B와 같다. 도 1C는 SEM으로 찍은 실리콘 블록 표면의 2D 이미지 이다. 실리콘 블록의 경도는 나노 압입시험 방법 (nanoindentation measurement)을 통해 탄성률을 측정하여 확인하였다. The design of the spinal canal stenosis experiment is the same as the diagram shown in FIG. 1A. The hardness of the silicone block inserted for inducing stenosis was 70, 80, and 90 kpa, respectively, and the control group did not insert the silicone block. The components of the silicon block are as shown in FIG. 1B. Figure 1C is a 2D image of the silicon block surface taken by SEM. The hardness of the silicon block was confirmed by measuring the elastic modulus through a nanoindentation measurement.
실시예 2. 수술 절차와 실리콘 블록 경도에 따른 조직학적 분석 Example 2. Histological analysis according to surgical procedure and silicone block hardness
도 2A는 LSS 모델 유도를 위한 절차를 도식화한 것이다. 구체적으로, 요추 4번부터 6번 부위의 피부, 피하 및 근육 층을 순서대로 절개한 후, 견인기를 이용하여 절개 부위를 벌려 수술부위의 시야를 확보한다. L5 위치의 추궁절제술을 수행하고 L4에 경도를 달리하여 실리콘 블록을 척수 중앙에 삽입하였다. H&E 염색을 통해 실리콘 블록을 이식한 척추의 상태를 확인하였다. 대조군의 경우 척수의 모양이 그대로 유지되는 반면 실리콘 블록이 이식된 LSS 모델 랫드는 척수가 기계적 압력에 의해 압축됨을 알 수 있었다(도 2B). 또한, T2 MRI로 촬영된 척추의 시상단면에서 요추 4번에 이식된실리콘 블록을 확인하였다(도 2C). 한편, 압축 척수 공간은 실리콘 블록의 이식 후 현저한 감소를 나타내었으며, 압박 척수 면적은 실리콘 경도가 증가함에 따라 점차 감소됨을 알 수 있었다(도 2D). 상기 결과로부터 삽입되는 실리콘 블록의 경도가 유도되는 협착증의 정도에 영향을 미치며, 실리콘 블록 경도와 경막 외 공간과 LSS 모델의 척수 압박간의 관계가 있음을 알 수 있다. 2A schematically illustrates the procedure for deriving the LSS model. Specifically, the skin, subcutaneous and muscle layers of the 4th to 6th lumbar vertebrae are incised in order, and then the incision is spread using a retractor to secure the field of view of the surgical site. A laminectomy was performed at the L5 position, and a silicone block was inserted in the center of the spinal cord by varying the hardness at L4. The state of the spine implanted with the silicon block was confirmed through H&E staining. In the control group, the shape of the spinal cord was maintained as it is, while in the LSS model rat implanted with a silicon block, the spinal cord was compressed by mechanical pressure (Fig. 2B). In addition, in the sagittal section of the spine taken by T2 MRI, a silicon block implanted in the 4th lumbar vertebra was confirmed (FIG. 2C). On the other hand, the compressed spinal cord space showed a significant decrease after implantation of the silicon block, and it was found that the compressed spinal cord area gradually decreased as the silicone hardness increased (Fig. 2D). From the above results, it can be seen that the hardness of the inserted silicon block affects the degree of induced stenosis, and there is a relationship between the silicon block hardness, the epidural space and the spinal cord compression of the LSS model.
실시예 3. 실리콘 블록의 경도에 따른 LSS 모델에서의 염증반응 확인Example 3. Confirmation of inflammatory response in the LSS model according to the hardness of the silicon block
실리콘 블록 삽입에 따른 염증 반응 정도를 확인하기 위하여, 실리콘 블록이 이식된 주변부에 염증 세포의 수 및 강도를 IHC를 이용하여 확인하였다. 대조군은 염증 세포가 관찰되지 않은 반면, 실험군은 이식된 실리콘 블록 주위에 많은 수의 염증 세포를 확인할 수 있었다(도 3A). 이어서, 실리콘 블록의 경도에 따라 염증 반응 정도를 확인하기 위하여, ED1+ 세포의 수와 강도를 확인하였다. 그 결과, 대조군과 비교하여 실험군의 ED1+ 세포의 수와 강도가 크게 증가하였으며(도 3 B 및 C), 특히 실리콘 블록 경도가 높을수록 염증세포의 수가 점진적으로 증가함을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터 대조군과 비교하여 제조된 척추관 협착증 모델에서 유의한 염증반응 증가를 확인할 수 있었고, 유도되는 염증의 정도와 실리콘 경도와 상관관계가 있음을 알 수 있다.In order to confirm the degree of inflammatory response according to the insertion of the silicon block, the number and intensity of inflammatory cells in the periphery where the silicon block was implanted were confirmed using IHC. In the control group, inflammatory cells were not observed, whereas in the experimental group, a large number of inflammatory cells were identified around the implanted silicon block (FIG. 3A). Then, in order to determine the degree of inflammatory response according to the hardness of the silicon block, the number and intensity of ED1 + cells were checked. As a result, compared to the control group, the number and strength of ED1 + cells in the experimental group were significantly increased ( FIGS. 3 B and C), and in particular, it was confirmed that the number of inflammatory cells increased gradually as the silicon block hardness increased. From the above results, it was possible to confirm a significant increase in the inflammatory response in the spinal canal stenosis model prepared as compared to the control group, and it can be seen that there is a correlation between the degree of induced inflammation and silicone hardness.
실시예 4. 실리콘 블록의 경도에 따른 LSS 모델에서의 탈수초화(demyelination) 확인Example 4. Confirmation of demyelination in the LSS model according to the hardness of the silicon block
실리콘 이식 후 수초(myelin sheath) 손상을 확인하기 위하여 LFB를 이용하여 탈수초화 정도를 측정하였다. 그 결과, 도 4A에서 확인할 수 있는 바와 같이, 실리콘 이식은 탈수초화 현상을 유도하였으며, 구체적으로 척수 내의 LFB의 면적과 강도를 측정하여 정량화한 결과 실리콘 블록이 삽입된 실험군에서 크게 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 4 B 및 C).After silicone implantation, the degree of demyelination was measured using LFB in order to confirm damage to the myelin sheath. As a result, as can be seen in FIG. 4A, silicon implantation induced demyelination. Specifically, as a result of measuring and quantifying the area and strength of LFB in the spinal cord, it was confirmed that the silicon block was significantly reduced in the experimental group. were present (Figs. 4 B and C).
실시예 5. LSS 모델에서 염증 관련 유전자 및 단백질의 발현 확인 Example 5. Confirmation of expression of inflammation-related genes and proteins in LSS model
삽입된 실리콘 블록의 경도에 따른 염증관련 인자(IL-1β, IL-6, 및 TNF-α)와 항염증관련 인자 (IL-10)의 발현량 변화를 확인하기 위하여 Real time PCR 및 ELISA를 수행하였다. 그 결과, 대조군과 비교하여 실험군에서 염증 유도 사이토카인인 iNOS, Cox2, IL-1β, IL-6, 및 TNF- α의 발현량이 현저하게 증가하였다(도 5A-E). 특히 실리콘 경도 증가에 의존적으로 염증유발 인자의 발현량이 대조군과 대비하여 유의적으로 증가하였다, 반면, 항염증 관련 사이토카인인 IL-10의 발현량은 그룹간의 발현량의 차이를 확인할 수 없었다. Real-time PCR and ELISA were performed to confirm changes in the expression levels of inflammation-related factors (IL-1β, IL-6, and TNF-α) and anti-inflammatory factors (IL-10) according to the hardness of the inserted silicon block. did. As a result, the expression levels of inflammation-inducing cytokines iNOS, Cox2, IL-1β, IL-6, and TNF-α were significantly increased in the experimental group compared to the control group ( FIGS. 5A-E ). In particular, the expression level of the inflammation-inducing factor was significantly increased compared to the control group depending on the increase in silicone hardness.
실시예 6. LSS 모델 랫드의 운동기능 평가 확인Example 6. Confirmation of motor function evaluation of LSS model rats
운동 및 감각기능의 회복정도는 BBB, 사다리, 및 Von Frey test를 통해 평가하였다. 그 결과, BBB 점수는 실리콘 삽입1주 후 실험군은 대조군과 비교하여 현저하게 낮았으며, 70kpa 경도의 실리콘 블록을 삽입한 동물에서 16점을 나타내어 80 및 90 kpa 경도의 실리콘 블록을 삽입한 동물보다 2점 더 높은 점수를 보였다. 80 및 90 kpa 경도의 실리콘 블록 삽입군은 평균 14점으로 두 그룹간의 유의한 차이를 보이지 않았다. 자발적 행동 회복(Spontaneous behavioral recovery)은 70 kpa 실리콘이 이식된 그룹에서 가장 빠르게 나타났으며, 이식 2주까지 점수가 증가하는 경향을 보였으나 이후 모든 그룹이 더 이상 회복되지 않고 3 주차부터는 점수가 유지되었다(도 6A). 또한, 사다리 실험 결과 실험군은 대조군과 비교하여 뒷다리를 딛는 빈도수가 낮았으며(forelimb-hindlimb coordination), 대조군은 1 주차에 발 빠짐 비율이 약 15 % 였지만 주별 평가에서 적응력을 보였으며 4 주차 최종 평가에서 그 비율이 약 5 %로 나타났다. 반면, 70kpa 실리콘 블록 삽입한 실험군과 달리, 80 및 90 kpa 실리콘 블록을 삽입한 실험군은 2주차까지 대조군과 비교하여 현저하게 높은 발 빠짐을 나타내었다. 그러나, 3주차부터 모든 실험군은 삽입된 실리콘의 경도와 관계없이 대조군과 유사한 자발적 회복을 나타내었다(도 6B). Von Frey test에서 일반적인 랫드는 6-7초대에서 발 회피를 나타내고, 대조군 정상 랫드와 유의한 통계적 차이가 없었다. 한편, 실험군의 랫드는 다리의 신경 민감성이 증가하여 침의 자극에 반응하는 시간이 감소하였다. 특히, 80 및 90 kpa 실리콘블록이 삽입된 랫드에서 더 빠른 회피를 보였다(도 6C-D). The degree of recovery of motor and sensory functions was evaluated through the BBB, ladder, and Von Frey test. As a result, the BBB score of the experimental group was significantly lower than that of the control group after 1 week of silicone insertion, and the animals with the silicone blocks of 70 kpa hardness showed 16 points, 2 more than the animals with the silicone blocks of 80 and 90 kpa hardness. showed higher scores. The silicon block insertion group of 80 and 90 kpa hardness showed no significant difference between the two groups with an average of 14 points. Spontaneous behavioral recovery was the fastest in the 70 kpa silicone implanted group, and the scores tended to increase up to 2 weeks after implantation, but after that, all groups did not recover any more and the scores were maintained from
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As described above in detail a specific part of the present invention, for those of ordinary skill in the art, it is clear that this specific description is only a preferred embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereby. something to do. Accordingly, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
Claims (9)
상기 랫드의 제4 요추부에 실리콘 블록을 삽입하는 단계;를 포함하되,
상기 실리콘 블록의 크기는 가로 3~5 mm, 세로 0.5~1.5 mm, 높이 0.5~1.5 mm이고,
상기 실리콘 블록의 경도는 80, 또는 90 kpa 인 것을 특징으로 하는, 중증 척추관 협착증 랫드모델 제조방법. performing a laminectomy of the fifth lumbar vertebrae of a rat; and
Including; inserting a silicon block into the fourth lumbar part of the rat
The size of the silicon block is 3 to 5 mm in width, 0.5 to 1.5 mm in length, and 0.5 to 1.5 mm in height,
The hardness of the silicon block is 80, or 90 kpa, characterized in that, severe spinal stenosis rat model manufacturing method.
상기 랫드에 후보물질을 투여하는 단계;
상기 후보물질이 투여된 랫드의 운동기능 평가 또는 염증 관련 사이토카인의 발현 수준 측정하고 후보물질 투여 전과 비교하는 단계; 및
상기 후보물질 투여 후 운동기능 증가, 염증 유도 사이토카인의 발현 감소, 또는 항염증 사이토카인의 발현이 증가하는 경우 후보물질을 척추관 협착증 치료물질로 선정하는 단계;를 포함하는 척추관 협착증 치료제 스크리닝 방법으로서,
상기 실리콘 블록의 크기는 가로 3~5 mm, 세로 0.5~1.5 mm, 높이 0.5~1.5 mm이고,
상기 방법에 의해 선정된 치료물질은 중증 척추관 협착증 치료제인 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법. Performing laminectomy of the fifth lumbar vertebrae, preparing a rat inserting a silicon block of 80 kpa or 90 kpa hardness in the fourth lumbar vertebrae;
administering a candidate substance to the rat;
Measuring the expression level of the motor function evaluation or inflammation-related cytokines in rats to which the candidate substance is administered, and comparing with before administration of the candidate substance; and
Selecting a candidate material as a treatment material for spinal canal stenosis when the increase in motor function, reduction in the expression of inflammation-inducing cytokines, or the expression of anti-inflammatory cytokines increases after administration of the candidate material;
The size of the silicon block is 3 to 5 mm in width, 0.5 to 1.5 mm in length, and 0.5 to 1.5 mm in height,
The screening method, characterized in that the therapeutic substance selected by the method is a therapeutic agent for severe spinal stenosis.
운동기능 평가는 BBB, 사다리, 또는 아질통 (Von Frey) 평가를 통해 수행되는 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법. 5. The method of claim 4,
A screening method, characterized in that motor function evaluation is performed through BBB, ladder, or allodynia (Von Frey) evaluation.
염증 유도 사이토카인은 iNOS, Cox-2, IL-1β, IL-6, 및 TNF- α로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법. 5. The method of claim 4,
Inflammation-inducing cytokines are characterized in that at least one selected from the group consisting of iNOS, Cox-2, IL-1β, IL-6, and TNF-α, the screening method.
항염증 사이토카인은 IL-10인 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.5. The method of claim 4,
The screening method, characterized in that the anti-inflammatory cytokine is IL-10.
상기 랫드의 제4 요추부에 실리콘 블록을 삽입하는 단계;를 포함하되,
상기 실리콘 블록의 크기는 가로 3~5 mm, 세로 0.5~1.5 mm, 높이 0.5~1.5 mm이고,
상기 실리콘 블록의 경도는 70 kpa 인 것을 특징으로 하는, 경증 또는 중등증 척추관 협착증 랫드모델 제조방법.performing a laminectomy of the fifth lumbar vertebrae of a rat; and
Including; inserting a silicon block into the fourth lumbar part of the rat
The size of the silicon block is 3 to 5 mm in width, 0.5 to 1.5 mm in length, and 0.5 to 1.5 mm in height,
The hardness of the silicon block is, characterized in that 70 kpa, mild or moderate spinal stenosis rat model manufacturing method.
상기 랫드에 후보물질을 투여하는 단계;
상기 후보물질이 투여된 랫드의 운동기능 평가 또는 염증 관련 사이토카인의 발현 수준 측정하고 후보물질 투여 전과 비교하는 단계; 및
상기 후보물질 투여 후 운동기능 증가, 염증 유도 사이토카인의 발현 감소, 또는 항염증 사이토카인의 발현이 증가하는 경우 후보물질을 척추관 협착증 치료물질로 선정하는 단계;를 포함하는 경증 또는 중등증 척추관 협착증 치료제 스크리닝 방법으로서,
상기 실리콘 블록의 크기는 가로 3~5 mm, 세로 0.5~1.5 mm, 높이 0.5~1.5 mm인 것을 특징으로 하는, 방법.Performing a laminectomy of the fifth lumbar vertebrae, preparing a rat inserting a silicon block with a hardness of 70 kpa in the fourth lumbar vertebrae;
administering a candidate substance to the rat;
Measuring the expression level of the motor function evaluation or inflammation-related cytokines in rats to which the candidate substance is administered, and comparing with before administration of the candidate substance; and
Selecting a candidate material as a treatment material for spinal canal stenosis when the increase in motor function, reduction in expression of inflammation-inducing cytokines, or expression of anti-inflammatory cytokines increases after administration of the candidate material; A screening method comprising:
The silicon block has a size of 3 to 5 mm in width, 0.5 to 1.5 mm in length, and 0.5 to 1.5 mm in height, the method.
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