KR102289211B1 - 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐을 포함하는 골 재생용 시멘트 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 일 실시예에 따른 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐을 포함하는 골 재생용 시멘트는, 매트릭스, 그리고 상기 매트릭스에 균일하게 분산된 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐을 포함한다. 본 발명에 따른 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐을 포함하는 골 재생용 시멘트 및 이의 제조방법을 이용하면 종래의 골 시멘트 보다 빠른 이식 흡수와 신생 골 성장을 유도 및 향상시킬 수 있는 효과가 있다. 또한, 종래의 골시멘트 대비 골 치료 효율이 향상되는 효과가 있다. 또한, 혼입된 알긴산-히알루론산 마이크로 캡슐은 공극성이 유도되어 압축 강도는 감소하고 경화 시간은 증가되어 주입용 골 대체물로 사용할 수 있는 장점이 있다.

Description

알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐을 포함하는 골 재생용 시멘트 및 이의 제조방법{Cement for bone regeneration comprising alginate-hyaluronic acid microcapsules and a method for producing the same}
본 발명은 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐을 포함하는 골 재생용 시멘트 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
종양, 외상 및 골격 질환 등으로 인해 흔히 발생하는 대형 골 결함은 임상 연구에서 중요한 문제이다. 자가 이식 및 동종 이식은 조직 결함 치료를 위한 표준 치료법이다. 그러나, 이들의 제한적인 사용으로 인한 여러 문제점은 수정된 골 대체물의 개발을 초래하였다.
인산 칼슘 시멘트(CPCs)는 우수한 생체적합성, 생체활성, 흡수성, 성형성 및 골 전도성으로 인해 유망한 골 대체물로 인식되어 왔다. 골 대체물질로는 주입이 가능하고 그 위치에서 자가 경화하여 골 공동(cavity)에 하이드록시아파타이트를 형성하는 여러 형태의 CPC가 있다. 상기 CPC는 테트라칼슘 포스페이트(TTCP), 디칼슘 포스페이트 무수물(DCPA) 또는 디칼슘 포스페이트 디하이드레이트(DCPD)의 혼합물로 구성된다. 일반적으로 CPC는 수용액과 출발 물질로서 다양한 인산 칼슘 분말에 의해 제조된다. 수용액에 CPC 분말을 혼합하면 특정 형태로 쉽게 성형되어 불규칙하게 골 결손된 부분에 충진할 수 있는 주입성 페이스트를 생성할 수 있다.
이러한 특성으로 인해 CPC는 정형외과 분야에서 중요한 주입용 충진제 재료로 부상하였다. 또한, CPC를 약물, 성장 인자 및 항생제와 혼합하면 골 재생 속도가 향상되고 시멘트에 해로운 생물학적 반응을 약화시킬 수 있다. 그러나, CPC는 낮은 강도와 느린 분해 속도로 인하여 사용이 제한된다. 또한, CPC 내부의 부적합한 공극성은 골 조직 성장에 큰 영향을 미칠 수 있다. 신속한 골전도와 재광물화(remineralization)에 최적의 공극 크기는 약 100~500 ㎛으로 설정되어야 한다. 따라서, CPC 기반의 주입용 골 대체물의 효율은 주로 신속한 골 조직 성장을 위한 표면 분해(degradation) 또는 활성 세포 상호 작용에 주로 결정된다.
생체적합성을 강화하기 위해 CPC에 여러 유용물질들을 첨가하고자 연구가 진행되었으나, 뚜렷한 효과를 가지는 물질을 찾지 못했다.
KR 10-1230704 B1(2013.02.07. 공고)
본 발명의 목적은 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐을 포함하는 골 재생용 시멘트 및 이의 제조방법을 제공하는데 있다.
또한, 신생 골 형성을 유도할 뿐만 아니라 종래의 골 시멘트 보다 주입성, 이식흡수, 골 조직 성장성 및 내세정성이 향상된 골 재생용 시멘트를 제공하는 데 목적이 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐을 포함하는 골 재생용 시멘트는, 매트릭스, 그리고 상기 매트릭스에 균일하게 분산된 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐을 포함한다.
상기 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐은 평균 공극의 크기가 100~250 ㎛일 수 있다.
상기 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐의 함량은, 상기 매트릭스 1g 당 150~160 ㎕를 포함할 수 있다.
상기 알긴산 염과 히알루론산의 중량비는 3~5:1 일 수 있다.
상기 골 재생용 시멘트는, 경화 시간은 6~9 분일 수 있다.
상기 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐은 생체적합성과 생체흡수성을 가진다.
상기 매트릭스는, 테트라칼슘 포스페이트(TTCP), 디칼슘포스페이트 무수물(DCPA), 및 모노칼슘 포스페이트 모노하이드레이트(MCPM)를 포함하는 인산칼슘 시멘트(CPC)일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐을 포함하는 골 재생용 시멘트의 제조방법은, (a) 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐(Alginate-hyaluronic acid microcapsules)를 제조하는 단계, (b) 매트릭스를 제조하는 단계, 그리고 (c) 상기 마이크로 캡슐, 매트릭스 및 평형염용액(Hank's balanced salt solution)을 혼합하는 단계를 포함한다.
상기 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐은, 알긴산 나트륨과 히알루론산 나트륨을 3~5:1 중량비로 포함할 수 있다.
상기 (b) 단계의 매트릭스는, 테트라칼슘 포스페이트(TTCP), 디칼슘 포스페이트 무수물(DCPA), 및 모노칼슘 포스페이트 모노하이드레이트(MCPM)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 매트릭스는, 테트라칼슘 포스페이트(TTCP), 디칼슘 포스페이트 무수물(DCPA), 및 모노칼슘 포스페이트 모노하이드레이트(MCPM)가 7:3:3 중량비로 혼합되어 제조될 수 있다.
상기 테트라칼슘 포스페이트(TTCP)는, 탄산칼슘과 디칼슘 포스페이트 무수물을 2:1의 Ca/P비로 혼합한 후 1,400~1,500 ℃에서 5~7 시간 동안 소성처리하여 제조될 수 있다.
상기 (b) 단계는, 상기 매트릭스 1 g 당 마이크로 캡슐 150~160 ㎕를 투입할 수 있다.
상기 평형염용액은, 상기 매트릭스 1 g 당 평형염용액 230~270 ㎕을 투입할 수 있다.
본 발명에 따른 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐을 포함하는 골 재생용 시멘트 및 이의 제조방법을 이용하면 종래의 골 시멘트 보다 빠른 이식 흡수와 신생 골 성장을 유도 및 향상시킬 수 있는 효과가 있다.
또한, 종래의 골시멘트 대비 골 치료 효율이 향상되는 효과가 있다.
또한, 혼입된 알긴산-히알루론산 마이크로 캡슐은 공극성이 유도되어 압축 강도는 감소하고 경화 시간은 증가되어 주입용 골 대체물로 사용할 수 있는 장점이 있다.
도 1a 및 1b는 ALG-HA 마이크로캡슐, CPC, 및 CPC/ALG-HA 경화시멘트의 SEM, 및 EDX 프로파일을 나타낸 것이다.
도 2a 및 도 2b는 TTCP, DCPA, MCPM 분말의 X-선 회절 패턴을 나타낸 것이다.
도 3은 CPC 및 CPC/ALG-HA의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 4a 및 4b는 CPC 및 CPC/ALG-HA의 주입성 및 내세정성을 분석한 그래프이다.
도 5a 내지 5c는 대조군(결함), CPC, 및 CPC/ALG-HA 시멘트를 토끼 대퇴골에 이식한 후의 8 mm 결손에서의 뼈의 성장, 마이크로-CT 이미지, 및 8주 후의 골 부피비(BV/TV)를 나타낸 것이다.
도 6a 내지 6f는 대조군(결함), CPC, 및 CPC/ALG-HA를 토끼 대퇴골에 이식 후 8 주 후에 마손 트리크롬 (Masson's Trichrome)으로 염색 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 CPC/ALG-HA의 골 형성 촉진을 나타내는 계략도이다.
도 8a 및 8b는 MCPM, DCPA, TTCP 분말, CPC 및 CPC/ALG-HA의 X선 회전 패턴을 나타낸 것이다.
도 9a 및 9b는 CPC 및 CPC/ALG-HA로부터 Ca2+, PO4 3- 이온 방출을 분석한 그래프이고, 도 9c는 CPC 및 CPC/ALG-HA를 PBS 용액에 침지시킨 후 pH 변화를 나타낸 것이다.
도 10a 내지 10b는 CPC 및 CPC/ALG-HA에 대한 경화시간 및 압축 강도를 나타낸 것이다.
이하 본 발명에 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 일 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 우선, 도면들 중, 동일한 구성요소 또는 부품들은 가능한 동일한 참조부호를 나타내고 있음에 유의하여야 한다. 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명은 본 발명의 요지를 모호하지 않게 하기 위하여 생략한다.
본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 약, 실질적으로 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.
본 발명의 설명에 앞서 하기에서 표현하는 "ALG-HA"는 "알긴산 염-히알루론산"을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "시멘트"란, 분말형 고체상 및 액상의 혼합으로 얻은 페이스트의 경화체를 의미한다. 상기 시멘트의 "경화"는 실온 혹은 체온에서 인위적인 처리 없이 행해진 페이스트의 자발적 경화를 의미하며, 이때의 페이스트는 고체상과 액상을 혼합한 결과로 얻어진 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "인산칼슘 시멘트"는 분말형 고체상이 인산칼슘 화합물 혹은 칼슘 및/또는 인산염 화합물의 혼합물로 구성되는 시멘트를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "매트릭스"는 시멘를 구성하는 주요 기질(모체)을 의미한다.
종래의 인산칼슘 시멘트는 낮은 강도와 느린 분해 속도로 인하여 사용이 제한되어 왔다.그리고 인산칼슘 시멘트 내부의 미세공극은 신속한 골전도와 재광물화를 저해하는 단점이 있어 왔다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐을 포함하는 골 재생용 시멘트에 관한 것이며, 본 발명의 일 실시예에 따른 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐을 포함하는 골 재생용 시멘트는 매트릭스, 그리고, 상기 매트릭스에 균일하게 분산된 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐을 포함할 수 있다.
상기 알긴산 나트륨(ALG)은 Ca2+, Ba2+ 또는 Fe2+ 이온의 존재 하에 겔을 형성할 수 있는 음이온성 다당류 구조이고, 알긴산 염 하이드로겔은 우수한 생체적합성, 중합 및 용액 상태에서 비독성 세포 전달에 적합한 물질이다. 또한, 상기 히알루론산(HA)는 독특한 점탄성, 생체적합성, 항산화성 및 비면역성으로 인해 다양한 임상 용도의 전달에 널리 사용되고 있다.
따라서, 상기 알긴산 염과 히알루론산으로 구성된 마이크로 캡슐은 우수한 생체적합성 및 생분해성이 갖으며, 우수한 세포 및 약물 전달 물질로 사용될 수 있다.
상기 매트릭스는, 테트라칼슘 포스페이트(TTCP), 디칼슘포스페이트 무수물(DCPA), 및 모노칼슘 포스페이트 모노하이드레이트(MCPM)를 포함하는 인산칼슘 시멘트(CPC)일 수 있다.
상기 상기 인산칼슘 시멘트(calcium phosphate cement; CPC)는 인산칼슘계 입자들이 주성분인 분말과 인산염과 같은 경화를 촉진하는 물질을 함유한 수용액으로 구성되는 소재로, 시술 시 두 성분을 혼합하여 고점도의 액상 상태로 적용시키면 적용 부위에서 두 성분들의 화학 반응에 의해 인산칼슘 화합물이 침전되어 경화됨으로써, 손상된뼈, 또는 뼈 및 임플란트 사이의 빈 공간을 채워주어 둘 사이를 고정하고 안정화시켜 주는 골 대체물질의 한 형태이다.
상기 인산칼슘 시멘트는 생체활성, 흡수성, 성형성 및 골 전도성이 우수하여 약물, 성장 인자 및 항생제 등을 혼합할 경우 골 재생 속도가 향상되고 해로운 생물학적 반응을 저해할 수 있는 장점이 있다.
상기 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐은 평균 공극의 크기가 100~250 ㎛있다. 상기 마이크로 캡슐의 평균 공극 크기가 100 ㎛ 미만이면 골 조직의 성장을 저해할 수 있고 250 ㎛를 초과하면 압축 강도가 저하될 수 있다.
구체적으로 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐의 평균 공극 크기가 상기 범위이고, 체내에서 생분해되어 기공을 형성할 때 골세포 또는 생체 조직들에 의해 빈 공간을 용이하게 수복하여 빠른 골 성장을 유도할 수 있다.
상기 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐의 함량은, 상기 매트릭스 1g 당 150~160 ㎕를 포함할 수 있다.
상기 마이크로 캡슐의 함량이 150 ㎕미만이면, 요구하는 생체 적합성, 골조직 생성, 공극률 및 골 치료 효과 등을 저해할 수 있고, 160 ㎕을 초과하면 압축 강도가 저하되고 체내에서 오랜시간 경화되야 하는 문제점이 있어 상기한 범위가 바람직하다.
상기 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐은 상기 알긴산 염과 히알루론산을 3~5:1 중량비로 포함할 수 있다.
상기 범위일 때 경제적으로 바람직하며 완벽하게 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐을 제조할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 ALG-HA마이크로 캡슐을 포함하는 골 재생용 시멘트은 분말대 용액비(Powder/Liguid ratio, P/L ratio) 3.71~4.3일 수 있다.
상기 P/L이 상기 범위일 때 경화시간은 6~9일 수 있으며, 압축강도는 2~4 MPa일 수 있다.
상기 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐은 생체적합성과 생체흡수성을 가진다.
상기 골 재생용 시멘트는 6~9 분 안에 경화되며, 경화 후 빠르게 흡수될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 ALG-HA마이크로 캡슐을 포함하는 골 재생용 시멘트는 마이크로 캡슐에 의하여 거대 공극이 형성되고, 상기 공극을 통해 골아세포의 이동이 원활하게 이루어져 내부에 흡수성이 향상되며, 골 형성을 촉진할 수 있다.
상기 골 재생용 시멘트는 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)를 더 포함할 수 있으며, 상기 골 재생용 시멘트의 경화시간은 HBSS의 함량이 증가할수록 경화시간이 증가할 수 있다.
이하, 본 발명의 일 실시예에 따른 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐을 포함하는 골 재생용 시멘트의 제조방법에 대하여 설명한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐을 포함하는 골 재생용 시멘트의 제조방법은 (a) 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐(Alginate-hyaluronic acid microcapsules)를 제조하는 단계, (b) 매트릭스를 제조하는 단계, 그리고 (c) 상기 마이크로 캡슐, 매트릭스 및 평형염용액(Hank's balanced salt solution)을 혼합하는 단계를 포함한다.
상기 (a) 단계는 알긴산-히알루론산 마이크로 캡슐을 제조하는 단계이다.
상기 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐은, 알긴산 나트륨과 히알루론산 나트륨을 3~5:1 중량비로 포함할 수 있다.
상기 알긴산-히알루론산 마이크로 캡슐은 염화칼슘 용액에서 분무 방법으로 제조할 수 있으며, 구체적으로는 1 wt%의 알긴산 나트륨과 0.5 wt%의 히알루론산 나트륨을 4:1의 중량비로 혼합하여 ALG-HA 혼합액을 제조하는 과정과, ALG-HA 혼합액을 이중 동심원 노즐 시스템(Model 18G-25G, NanoNC, South Korea)에 투입하는 과정과, 가교 염화칼슘(200 mM, CaCl2, Sigma-Aldrich, USA) 용탕(bath)에 분무하는 과정을 통해 제조할 수 있다.
상기 (b) 단계는 매트릭스를 제조하는 단계이다.
상기 (b) 단계의 매트릭스는, 테트라칼슘 포스페이트(TTCP), 디칼슘 포스페이트 무수물(DCPA), 및 모노칼슘 포스페이트 모노하이드레이트(MCPM)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.
구체적으로 상기 매트릭스는, 테트라칼슘 포스페이트(TTCP), 디칼슘 포스페이트 무수물(DCPA), 및 모노칼슘 포스페이트 모노하이드레이트(MCPM)가 7:3:3 중량비로 혼합되어 제조될 수 있다.
또한, 상기 테트라칼슘 포스페이트(TTCP)는, 탄산칼슘과 디칼슘 포스페이트 무수물을 2:1의 Ca/P비로 혼합한 후 1,400~1,500 ℃에서 5~7 시간 동안 소성처리하여 제조될 수 있다.
상기 (b) 단계는, 상기 매트릭스 1 g 당 마이크로 캡슐 150~160 ㎕를 투입할 수 있다.
상기 평형염용액은, 상기 매트릭스 1 g 당 평형염용액 230~270 ㎕을 투입할 수 있다.
상기 (c) 단계는 상기 마이크로 캡슐, 매트릭스 및 평형염용액(Hank's balanced salt solution)을 혼합하여 ALG-HA 마이크로 캡슐가 포함된 포함하는 골 재생용 시멘트의 제조를 완료하는 단계이다.
상기 (c) 단계는 하기의 표 1의 성분비로 혼합하여 제조될 수 있다.
구체적으로는 TTCP, DCPA, 및 MCPM가 7:3:3의 중량비로 혼합된 CPC에 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS, Gibco, Korea)을 첨가한 후 ALG-HA 마이크로 캡슐을 첨가하여 제조할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
1. 재료의 준비
알긴산 나트륨(1 wt%, Sigma-Aldrich, USA)과 히알루론산 나트륨(0.5 wt%, Sigma-Aldrich, USA), 염화칼슘(200 mM, CaCl2, Sigma-Aldrich, USA)을 준비하였다.
디칼슘 포스페이트 무수물 (DCPA, CaHO4P, Sigma, USA), 모노칼슘 포스페이트 모노하이드레이트(MCPM, H4CaO8P2·H2O, Sigma, USA), 탄산 칼슘(CaCO3, DC chemical, South Korea), 및 Hank's Balanced Salt Solution (HBSS, Gibco, Korea)을 준비하였다.
상기 Hank's Balanced Salt Solution은 Calcium Chloride (CaCl2) (anhyd.) 1.2612612 mM, Magnesium Chloride (MgCl2-6H2O) 0.49261084 mM, Magnesium Sulfate(MgSO4-7H2O) 0.40650406 mM, Potassium Chloride (KCl) 5.3333335 mM, Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4) 0.44117647 mM, Sodium Bicarbonate (NaHCO3) 4.1666665 mM, Sodium Chloride (NaCl) 137.93103 mM, Sodium Phosphate dibasic(Na2HPO4) anhydrous 0.33802816 mM 및 D-Glucose (Dextrose) 5.5555553 mM로 포함된 것을 사용하였다.
2. ALG-HA 마이크로 캡슐의 제조
ALG-HA 마이크로 캡슐은 염화칼슘 용액에서 분무 방법으로 제조하였다.
먼저, 1 wt%의 알긴산 나트륨과 0.5 wt%의 히알루론산 나트륨을 4:1의 중량비로 혼합하여 ALG-HA 혼합액을 준비하였다.
다음으로, ALG-HA 혼합액을 내부 노즐을 이용하여 이중 동심원 노즐 시스템 (Model 18G-25G, NanoNC, South Korea)에 주입하였다.
마지막으로, 외부 노즐을 가교 염화칼슘(200 mM, CaCl2, Sigma-Aldrich, USA) 용탕(bath)에 분무하기 위해 공기 압축기(GSS Scientific Co. MA-4OTH)에 고정하여 ALG-HA 마이크로 캡슐을 제조하였다.
3. CPC 및 CPC/ALG-HA의 제조
CPC는 테트라칼슘 포스페이트(TTCP), 디칼슘 포스페이트 무수물(DCPA) 및 모노칼슘 포스페이트 모노하이드레이트(MCPM)를 포함한다.
TTCP 분말은 탄산 칼슘과 DCPA를 2:1의 Ca/P비로 혼합한 후 1,450 ℃에서 6 시간 열처리하여 합성하였으며, 반응은 하기의 화학식 1과 같이 진행된다.
[화학식 1]
2CaHPO4 ＋ 2CaCO3 → Ca4(PO4)2 ＋ 2CO2 ＋ H2O
CPC의 제조는 합성된 TTCP, 구입된 DCPA, 및 MCPM를 7:3:3의 중량비로 혼합한 후 Hank's Balanced Salt Solution (HBSS, Gibco, Korea)을 서서히 첨가하여 시멘트 반응을 개시하였다. 하기의 표 1에 표시된 조성비에 따라 CPC 페이스트를 제조하였다.
[표 1]
CPC, 마이크로 캡슐, HBSS 비율에 따른 시료의 유형
Figure 112019071831868-pat00001
제조된 CPC 페이스트를 1 분간 혼합하여 균질한 CPC 페이스트를 수득하였다.
다음으로, ALG-HA 마이크로 캡슐가 포함된 CPC/ALG-HA를 제조하기 위해 ALG-HA 마이크로 캡슐(200 ㎕)를 각 CPC 페이스트 (1.3g)에 조심스럽게 삽입하여 견고한 CPC/ALG-HA 페이스트를 제조하였다.
마지막으로, 상기 제조된 CPC 및 CPC/ALG-HA 페이스트를 모두 원통형 고무 몰드(직경 8 ㎜, 높이 15 ㎜)에 충진하여 37 ℃에서 경화하였다. 경화된 CPC 및 CPC/ALG-HA는 추후 특성 분석을 위해 실온에서 정치하였다.
[실험방법]
1. 특성분석 시험-형태, 상 및 화학구조
광학 현미경 (Olympus, BX53 광현미경)을 사용하여 ALG-HA 마이크로 캡슐의 표면 형태를 조사하였다. CPC와 CPC/ALG-HA 마이크로 캡슐의 형태학적 특징은 에너지 분산형 X선 분광법(EDS)이 장착된 주사 전자 현미경(SEM, JSM-6701F 현미경, JEOL, Japan)으로 조사하여 시료의 원소 분석을 수행하였다. SEM 검사 전 모든 시료를 백금으로 코팅하였다(Cressington 108 Auto, JEOL, Japan). TTCP, MCPM 및 DCPA와 제조된 CPC 시멘트 등 분말의 상 구조는 30 kV에서 Cu Kα 방사선을 사용하는 X선 회절(XRD, D/max-250, Rigaku, Japan)을 사용하여 조사하였다. 강도는 2θ에 대해 1°/분의 주사 속도로 기록하였다. CPC 및 CPC/ALG-HA 시료의 화학 구조를 분석하기 위해 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR, Magna-IR-550, Nicolet, USA)을 사용하였다. OMNIC 버전 7.3 소프트웨어를 사용하여 500 ~ 4000 ㎝-1의 파장 범위와 약 8 ㎝-1의 해상도로 시료의 적외선 스펙트럼을 분석하였다.
2. 경화 시간 및 압축 강도 시험
CPC 및 CPC/ALG-HA의 경화 시간과 압축 강도는 주입성 골 대체물의 요소로 경화 시간과 압축 강도 측정은 다양한 액체 함량을 기준으로 다양한 CPC 및 CPC/ALGHA에 대하여 경화 시간 및 압축 강도를 측정하였다.
여기서, CPC에 마이크로 캡슐의 도입은 충진 패턴 및 혼합 조건에서 현저한 변화를 유도하였다. 이로 인해 CPC 및 CPC/ALG-HA의 적절한 경화를 위한 액체 함량을 변화시켰다.
표 1에서 제조된 CPC 및 CPC/ALG-HA들의 경화 시간은 ISO 9917 표준 방법을 사용하여 직경 2.12 mm 및 중량 113.4 g의 길모어 바늘 시험을 이용하여 측정하였다.
인덴터 바늘이 성형 시멘트 표면에 압흔을 형성하지 못할 때 경화 시간을 기록하였으며, 전체 시험은 37 ℃ 온도, 100 % 습도에서 실시하였다.
각각의 CPC 및 CPC/ALG-HA 세트에서 5 개 시료의 평균을 측정하여 경화 시간을 결정하였다.
CPC 및 CPC/ALG-HA에 대한 압축 강도는 범용 시험기 (Untech, R & B, Korea)를 사용하여 측정하였다. 각각의 CPC와 CPC/ALG-HA 세트는 20 ㎜ × 10 ㎜의 크기로 제조하였다. 시험하기 전에 시료를 100 % 상대 습도와 37 ℃에서 1일간 실온 건조시켰으며, 시료 세트는 Helio-X 소프트웨어를 사용하여 1 mm/min의 크로스헤드 속도로 100 ㎏ 로드셀을 이용하여 시험하였다. 각각의 세트로부터 4 개의 시료의 평균을 취하여 압축 강도를 결정하였다.
3. 주입성 및 내세정성 시험
CPC 주입성은 임상에서 주입용 골 재료로서 인산 칼슘 시멘트의 신뢰성을 판단할 때 중요한 역할을 하기 때문에 최적의 CPC 및 CPC/ALG-HA 시료에 대하여 주입성 시험을 수행하였다.
CPC 및 CPC/ALG-HA를 2 ㎖ 주사기(Kovax, Korea)에 로딩하고 외력을 가하였다. 범용 시험기(R&B, Unitech, Korea)를 사용하여 주변 조건에서 주사기에서 CPC 및 CPC/ALG-HA를 1 mm/min의 속도로 압출 성형하여 CPC 및 CPC/ALG-HA의 주입성을 조사하였다. 시멘트 마다 3 회 반복 시험하여 측정하였다.
최적의 CPC 및 CPC/ALG-HA의 응집도 또는 내세정성은 중량 감소법으로 평가하였다. CPC 및 CPC/ALG-HA는 제조 2 시간 후 직접 시험하였다. CPC 및 CPC/ALG-HA의 초기 중량을 기록하였다. CPC 및 CPC/ALG-HA를 50 ㎖의 PBS 용액에 침지하여 지속적으로 진탕하면서 37 ℃에서 60 분간 정치하였다. 시료를 70 ℃에서 약 1 시간 건조하고 최종 무게를 측정하였다. 세정비는 CPC 및 CPC/ALG-HA의 초기 중량에서 CPC 및 CPC/ALG-HA의 최종 중량의 차를 구하여 얻었다. CPC 및 CPC/ALG-HA 세트 마다 3 회 반복하여 평균을 얻었다.
4. 생체 내 시험
대조군, CPC 및 CPC/ALG-HA에 대한 생체 내 생물학적 시험을 수행하기 위해 상업용 뉴질랜드 흰 토끼 (체중 ~ 3 kg)를 사용하였다. 이들은 개별적으로 먹이와 물에 접근 가능한 스테인레스강 우리에 두고 한국 순천향대학교 동물 윤리위원회에서 제공한 지침서에 의거하여 관래했다. 토끼 3 마리 모두 수술 전에 1.3 ㎖ 케타민(Ketara, Yuhan, Korea)과 0.2 ㎖ 자일라진(Rompun, Bayer, Korea)의 혼합물을 이용하여 마취하였다. 대퇴골의 모발을 면도하고 70 % 에탄올로 멸균하고, 그 부위를 요오드로 세척하였다. 트레핀 드릴을 이용하여 원위 대퇴골에 결손(직경 8 ㎜, 깊이 5 ㎜)을 형성하고, 조직 건조를 방지하기 위해 식염수로 계속 세척하였다.
CPC 및 CPC/ALG-HA는 시멘트 경화 전에 즉시 결함 부위에 배치하였다. 수술 후 합병증을 예방하기 위해 항생제 베이트릴(Baytril, Bayer, Korea)을 다음날 3 일 연속 투여하였다. 수술 후 합병증을 피하기 위해 요오드로 치료 부위를 정기적으로 세척하였다. 피하 조직을 폐쇄하고 중첩 피부는 재봉합하였다. 토끼는 이식 8 주 후 희생되었고 결손 대퇴골 전체를 제거하였다. 시료를 실온 10 % 완충 포름알데히드 용액에 침지하여 고정하였다.
5. 마이크로 전산화 단층 촬영 (micro-computed tomography, Micro-CT) 및 조직학적 평가
마이크로 CT 장비(model 1172, Skyscan, Belgium)를 사용하여 회수 및 고정된 대조군, CPC 및 CPC/ALG-HG의 골 부위에 마이크로-CT 분석을 수행하였다.
Skyscan 1076 소프트웨어를 사용하여 사진 데이터(2-D)를 획득, 재구성 및 분석하였다. Skyscan에는 이미지 재구성, 데이터 시각화 및 정량 분석을 위한 Windows 기반 그래픽 인터페이스가 있다. 시료 내부의 골 재생을 조사하기 위해 원형 ROI(region of interest)를 선택하고 다중 이미지를 재구성하였다.
마이크로 CT 분석 후, 대조군, CPC 및 CPC/ALG-HG의 포르말린 고정된 골 조직을 5 % 질산으로 60 시간 탈회화(decalcification)하였다. 그 후, 시료를 탈이온수로 1 시간 세척하고 에탄올(70 %, 80 %, 90 % 및 100 %)로 탈수처리하였으며, 파라핀 왁스에 포매하기 전에 자일렌 용액을 사용하여 알코올을 제거하였다.
시료를 마이크로톰(Thermo-scientific, USA)을 사용하여 5 ± 2 ㎛ 두께의 절편으로 절단하고 파라핀을 제거한 후에 마손 트리크롬 (Masson's Trichrome)을 사용하여 염색하였다.
조직 절편을 BX53 광학 현미경 (Olympus, Japan)으로 관찰하고 Olympus DP72 카메라로 촬영한 후 Cellsens 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
[실험결과]
1. 형태분석
도 1a 및 1b는 ALG-HA 마이크로캡슐, CPC, 및 CPC/ALG-HA 경화시멘트의 SEM, 및 EDX 프로파일을 나타낸 것이다.
도 1a 및 1b를 참조하면, ALG-HA 마이크로 캡슐의 평균 공극 크기는 100 내지 250 ㎛이고 구형인 것을 확인할 수 있으며, CaCl2 용액에 분무 방법으로 ALG-HA 마이크로 캡슐을 합성하면 표면이 거칠고 공극 구조가 형성되는 것을 확인할 수 있다.
CPC의 경우 저배율 SEM 사진을 통해 전체적으로 미세공극을 갖고 표면이 불규칙한 것을 확인할 수 있으며, 상기 미세공극은 CPC 분말을 액상과 혼합한 결과인 용해/석출 경화 메커니즘으로 인해 생성된 것이다.
ALG-HA의 경우 마이크로 캡슐의 혼입으로 거대공극(macropores)을 갖는 거치 표면(rough surface)을 확인할 수 있다. 또한, 상기 거대공극은 CPC에 마이크로 캡슐의 빠른 용해에 의한 것이다. 더불어, 침상 구조(Acicular structure)는 CPC의 표면에서 확인할 수 있으며, 이것은 브루샤이트 결정화와 관련된 것일 수 있다.
CPC/ALG-HA의 경우 CPC와 마이크로비즈 사이의 활발한 상호 작용으로 인해 CPC 보다 현저한 침상 구조를 나타낸다.
CPC와 CPC/ALG-HA 세트의 표면은 모두 균열이나, 결함이 확인되지는 않았으며, EDX를 이용한 CPC 및 CPC/ALG-HA의 성분 분석 결과 Ca, P 및 O 원소가 존재하는 것이 확인되었다.
CPC/ALG-HA에 추가 피크가 없으면서 더 높은 농도의 Ca, P 및 O가 존재하는 것은 경화 후 CPC에 마이크로 캡슐가 빠르게 용해되었음을 의미한다.
2. XRD 및 FT-IR 분석
제조된 CPC와 CPC의 제조에 사용된 TTCP, DCPA, MCPM 분말의 X-선 회절 패턴을 도 2a 및 도 2b에 나타낸 것이고, 도 3은 CPC 및 CPC/ALG-HA의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 2a 및 도 3를 참조하면, CPC는, MCPM(ICDD No: 01-070-0090), DCPA(ICDD No: 01-070-0359), 및 TTCP(ICDD No: 00-025-1137)로 구성되는 것을 확인할 수 있다(도 2a). CPC는 경화되어 브루샤이트상으로 전환되는 것을 확인할 수 있으며(ICDD No : 01-075-4374), 하이드록시아파타이트(HAP (ICDD No : 01-072-1243))의 작은 피크도 확인되었다(도 2b).
CPC/ALG-HA의 XRD 패턴은 경화 후 마이크로 캡슐의 신속한 함침을 의미하는 하이드록시 아파타이트(HAP)를 포함한 브루샤이트를 나타내었으며, 결정성이 다소 증가한 것은 마이크로 캡슐의 혼입 후 표면에 형성된 침상 구조를 보여주는 SEM 이미지(도 1)와 일치한다.
CPC 및 CPC/ALG-HA의 모든 특징적인 피크는 4,000 내지 500 cm-1의 범위에서 확인되었다. CPC 및 CPC/ALG-HA 모두 브루샤이트의 HPO2 4-기에 해당하는 약 837 cm-1 및 1,225 cm-1에서 특징적인 밴드를 나타내었으며, 1,134 cm-1 에서 나타난 피크는 브루샤이트 내부 HPO2 4- 이온의 υ' 6 및 υ" 6에 때문이다. 비대칭 (v3) 및 대칭 (v1) P-O 신축 진동으로부터 하이드록시아파타이트 내부 PO4 3-기의 특징적인 진동은 550 cm-1 및 600 cm-1에서의 O-P-O 굽힘 진동 (v4)과 함께 각각 1,050 cm-1 및 950 cm-1에서 나타났다. 추가적으로 CO3 2-기도 870 cm-1에서 관찰되었으며 이는 PO4 3- 대신 CO3 2-가 치환된 탄산 하이드록시아파타이트에 대응된다. ALG-HA 마이크로 캡슐의 성공적인 도입은 각각 -OH, C-H 및 C = O기에 대응하는 3,500, 2,995 및 1,759 cm-1에서 흡수 피크로 나타났다(도 3).
도 8a 및 8b는 MCPM, DCPA, TTCP 분말, CPC 및 CPC/ALG-HA의 X선 회전 패턴을 나타낸 것이다.
도 8a는 MCPM과 DCPA의 XRD 패턴이다.
도 8b에 도시된 바와 같이 TTCP 분말은 브루샤이트를 구성했고 미반응된 TTCP가 확인되었으며, CPC는 TTCP, MCPM 및 DCPA로 구성되어 있으며, HAP 및 브루샤이트 혼합물이 확인되었고, CPC와 CPC/ALG-HA 샘플은 브루샤이트로 전화되었다.
3. 경화 시간 및 압축 강도 분석
표 1을 참조하면, 경화 시간의 증가는 모든 CPC에 공극성 ALG-HA 마이크로 캡슐가 포함될 때 관찰되었으며, HBSS의 함량이 증가할수록 경화 시간 역시 증가하는 것을 확인할 수 있다. 또한, 마이크로 캡슐을 도입하더라도 모든 시험 중에 CPC의 농도(consistency)는 변화하지 않는 것을 확인할 수 있다.
이것은 CPC에 비해 마이크로 캡슐와 미세환경의 상호 작용이 적기 때문일 수 있다. 한편, CPC에 ALG-HA 마이크로 캡슐을 혼입하면 압축 강도가 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있다. 이에 따라 주입 후 경화될 수 있게 된다. 압축 강도의 감소는 CPC 내부의 마이크로 캡슐에 의해 유도된 공극성 구조와 관련된다.
또한, 마이크로 캡슐을 포함한 시멘트 물질의 이동도가 증가되면 CPC/ALG-HA 시멘트의 압축 강도를 감소시킬 수 있는 이들의 결합(interlocking)에 영향을 미칠 수 있다. 골 시멘트에 공극이 존재하는 것이 골 조직 성장을 발달시키는데 바람직하지만 압축 강도를 감소시킬 수 있다. CPC 또는 CPC/ALG-HA의 압축 강도는 액체 함량이 증가함에 따라 상승하였고, 식염수 환경과 유사한 습윤 조건에서 시멘트 반응이 더욱 활발하였다. 결과적으로 경화 시간과 압축 강도를 통해 CPC 및 CPC/ALG-HA는 주입형 골 시멘트로 적합하다는 것을 확인할 수 있다.
도 10a 내지 10b는 CPC 및 CPC/ALG-HA에 대한 경화시간 및 압축 강도를 나타낸 것이다.
도 10a 내지 10b을 참조하면 P/L(P: 분말, L: 액상) 비율이 감소함에 따라 경화시간이 증가하는 것을 확인할 수 있다.
CPC와 CPC/ALG-HA에서 P/L 비는 각각 2와 3.7로 최적의 경화 시간과 압축 강도가 관찰되었다. CPC-1, CPC-2 및 CPC-3에 대한 경화 시간은 각각 7, 6, 4이고 압축 강도는 각각 9 ± 0.4580, 7.5 ± 0.2350 및 6.40 ± 0.4250이었다.
그러나, ALG-HA 마이크로 캡슐을 CPC에 혼합하면 CPC 다공성 구조가 생성됨에 따라 경화시간이 증가하고 압축강도가 감소했다.
본 발명의 일 실시예에 따른 CPC/ALG-HA-1, CPC/ALG-HA-2 및 CPC/ALG-HA-3에 대한 경화시간은 각각 9, 7 및 6이었다.
[표 2]
경화 시간 및 압축 강도에 따른 CPC 및 CPC/ALG-HA 시멘트의 최적화
Figure 112019071831868-pat00002
4. 주입성 및 내세정성 분석
도 4a 및 4b는 CPC 및 CPC/ALG-HA의 주입성 및 내세정성을 분석한 그래프이다.
인산칼슘 시멘트의 주입성을 임상에서 주입성 골 시멘트의 신뢰도를 판단할 때 중요한 인자이다.
도 4a를 참조하면, 12 mm의 변위로부터 CPC와 CPC/ALG-HA를 비교하였을 때 CPC/ALG-HA가 더 낮은 주입력이 필요한 것으로 확인할 수 있다.
CPC/ALG-HA의 주입력 감소는 시료가 장기간 액상으로 유지되는 긴 경화 시간에 의한 것이다(표 1 참조). 또한, 주입성 시험 후 균열이 없는 CPC 및 CPC/ALG-HA 시멘트의 사진을 도 4a의 삽도에 나타내었다.
CPC 및 CPC/ALG-HA에 대한 내세정성은 각각 95.78 ± 0.10 및 91.90 ± 0.40으로 계산되었다(도 4b). 도 4b의 삽도는 시멘트를 PBS에 1 시간 침지한 후 촬영한 이미지이다. CPC의 분해는 CPC/ALG-HA 보다 높은 것으로 확인되었으며, 이것은 CPC/ALG-HA의 침상 구조를 CPC와 비교하였을 때 CPC가 미세환경과 효과적으로 상호 작용하기 때문일 수 있다. 더불어 CPC에 히알루론산 나트륨을 첨가하면 내세정성이 향상된다.
5. 생체 내 골 형성 분석
도 5a 내지 5c는 대조군(결함), CPC, 및 CPC/ALG-HA를 토끼 대퇴골에 이식한 후의 8 mm 결손에서의 뼈의 성장, 마이크로-CT 이미지, 및 8주 후의 골 부피비(BV/TV)를 나타낸 것이다.
도 5a 내지 5c를 참조하면, 마이크로-CT 사진에서 CPC와 대조군(결손 부위)에 비해서 CPC/ALG-HA의 결손 부위(적색 원)의 골 조직 형성이 우수한 것이 확인되었다(도 5a 및 도 5b). 또한, 이식 8주 후, CPC/ALG-HA, CPC 및 대조군의 골부피비(BV/TV)는 각각 26.6 ± 0.55, 21.4 ± 0.49 및 8.5 ± 0.48로 계산되었다.
그 결과로서 CPC 시멘트에 ALG-HA 마이크로 캡슐을 혼입시킬 경우 골 형성이 증가하는 것이 확인되었다. CPC/ALG-HA이 우수한 골 형성을 나타내는 것은 생분해성 ALG-HA를 CPC에 로딩하여 유도된 거대공극으로 인한 골아세포 이동의 용이성과 관련된 것이며, 공극성은 형성중인 골 조직에 바람직한 특성으로서 공극 내부에 조직 성장을 가능하게 한다.
도 6a 내지 6f는 대조군(결함), CPC, 및 CPC/ALG-HA를 토끼 대퇴골에 이식 후 8 주 후에 마손 트리크롬 (Masson's Trichrome)으로 염색 결과를 나타낸 것이다. (NB: 신생 골, CF: 콜라겐 섬유질 조직 및 CPC: 시멘트)
숙주 골과 신생 골의 계면은 점선으로 표시하였으며, 도 6a 내지 6f를 참조하면, 콜라겐이 풍부한 조직은 청색으로 염색되었으며, 석화(calcification)된 신생 골은 적색으로 염색되었다.
대조군(결함)의 경우 계면에서 거의 뼈가 형성되지 않아 콜라겐 조직으로 확인되나(도 6a, 도 6b), CPC와 CPC/ALG-HA가 이식된 결함 부위는 적색 영역에서 알 수 있는 바와 같이 대조군에 비해 다량의 신생 골(NB)이 형성된 것을 확인할 수 있다(도 6c, 도 6f)
더불어, 숙주 골과 이식된 CPC와 CPC/ALG-HA 시멘트 계면에서 염증의 징후는 관찰되지 않았다. 또한, CPC/ALG-HA 이식물은 결함 부위에서 CPC 보다 우수한 신생 골 형성을 확인할 수 있다(도 6e, 도 6f).
결과적으로, 본 발명에 따른 ALG-HA 마이크로 캡슐을 포함하는 골 재생용 시멘트는 공극성 구조로 인해 내부에서 보다 높은 골모세포 활성을 촉진하는 것을 확인하였다.
여기서, 골 시멘트의 빠른 재흡수는 임상 적용을 위해 성공적인 CPC 기반 골 이식재에 제조에 사용될 수 있으나, CPC의 경우 고밀도 구조로 인해 결함 부위에 이식한 후 재흡수가 제한적인 단점이 있다(도 6d).
본 발명에 따른 ALG-HA 마이크로 캡슐을 포함하는 골 재생용 시멘트 구조에 거대공극이 형성되어 공극성이 향상됨으로써, 공극성 구조를 통해 골아세포의 이동이 원활하게 이루어져 내부 영역에서 흡수가 향상됨과 동시에 골 형성이 촉진된다(도 6f). 따라서, 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐을 CPC 시멘트에 도입하는 것은 재흡수를 유도하는 효율적인 방법이고, 신생 골 형성을 유도하는 효과와 신호전달을 촉진하는 효과가 있다.
6. PBS에서 시료의 ICP 분석
도 9a 및 9b는 CPC 및 CPC/ALG-HA로부터 Ca2+, PO4 3- 이온 방출을 분석한 그래프이고, 도 9c는 CPC 및 CPC/ALG-HA를 PBS 용액에 침지시킨 후 pH 변화를 나타낸 것이다.
PBS에 침지 한 후의 시료의 이온 농도를 ICP 분석으로 조사 하였다.
CPC/ALG-HA는 CPC 보다 침지 초기에 Ca2+을 빠르게 방출하였으며, PO4 3-가 급속히 방출되는 동안에도 Ca2+ 이온은 지속적으로 방출되는 것을 확인할 수 있다.
그리고 CPC와 CPC/ALG-HA는 PO4 3 이온에 있어 비슷한 경향을 보였으나, CPC/ALG-HA의 Ca2+ 이온 방출량은 CPC 방출 보다 현저히 높은 것을 확인할 수 있다.
CPC/ALG-HA가 CPC 보다 Ca 이온 방출량이 월등히 높은 것은 ALG-HA와 Ca 이온 성분의 칼슘 클로라이드 가교가 일어나는 Ca 공급원과 관련이 있다.
또한, CPC/ALG-HA에 비해 CPC에서 더 많은 PO4 3- 이온을 방출하였다.
CPC에서 ALG-HA의 존재가 pH에 미치는 영향을 조사하였다. 앞서 설명하였듯이 경화시간은 주변 액상에 크게 의존한다.
도 9c를 참조하면, CPC 및 CPC/ALG-HA 두 경우 모두 pH는 처음에는 7.34이었고 시간이 지남에 따라 감소했다. 그러나, CPC/ALG-HA는 3 일 전까지 CPC 보다 더 낮은 pH를 나타내었으며, CPC 및 CPC/ALG-HA는 두 시료 모두 3 일부터 6 일 사이에서는 6.8에서 7.03으로 변화하는 것을 확인할 수 있다.
이상, 본 발명을 바람직한 실시예를 사용하여 상세히 설명하였으나, 본 발명의 범위는 특정 실시예에 한정되는 것은 아니며, 첨부된 청구범위에 의하여 해석되어야 할 것이다. 또한, 이 기술분야에서 통상의 지식을 습득한 자라면, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않으면서도 많은 수정과 변형이 가능함을 이해하여야 할 것이다.

Claims (14)

  1. 매트릭스, 그리고
    상기 매트릭스에 균일하게 분산된 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐을 포함하며,
    상기 매트릭스는,
    테트라칼슘 포스페이트(TTCP), 디칼슘포스페이트 무수물(DCPA) 및 모노칼슘 포스페이트 모노하이드레이트(MCPM)를 7:3:3 중량비로 포함하고,
    상기 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐의 함량은,
    상기 매트릭스 1g 당 150~160 ㎕를 포함하는 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐을 포함하는 골 재생용 시멘트.
  2. 제1항에서,
    상기 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐은 평균 공극의 크기가 100~250 ㎛인 것을 특징으로 하는 골 재생용 시멘트.
  3. 삭제
  4. 제1항에서,
    상기 알긴산 염과 히알루론산의 중량비는 3~5:1 인 것을 특징으로 하는 골 재생용 시멘트.
  5. 제1항에서,
    상기 골 재생용 시멘트는,
    경화 시간은 6~9 분인 것을 특징으로 하는 골 재생용 시멘트.
  6. 제1항에서,
    상기 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐은 생체적합성과 생체흡수성을 가지는 것을 특징으로 하는 골 재생용 시멘트.
  7. 삭제
  8. (a) 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐(Alginate-hyaluronic acid microcapsules)를 제조하는 단계,
    (b) 매트릭스를 제조하는 단계, 그리고
    (c) 상기 마이크로 캡슐, 매트릭스 및 평형염용액(Hank's balanced salt solution)을 혼합하는 단계를 포함하며,
    상기 (b) 단계는,
    테트라칼슘 포스페이트(TTCP), 디칼슘포스페이트 무수물(DCPA) 및 모노칼슘 포스페이트 모노하이드레이트(MCPM)를 7:3:3 중량비로 혼합하여 제조하고,
    상기 (c) 단계는,
    상기 매트릭스 1 g 당 마이크로 캡슐 150~160 ㎕를 투입하는 것인, 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐을 포함하는 골 재생용 시멘트의 제조방법.
  9. 제8항에서,
    상기 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐은,
    알긴산 나트륨과 히알루론산 나트륨을 3~5:1 중량비로 포함하는 것을 특징으로 하는 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐을 포함하는 골 재생용 시멘트의 제조방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제8항에서,
    상기 테트라칼슘 포스페이트(TTCP)는,
    탄산칼슘과 디칼슘 포스페이트 무수물을 2:1의 Ca/P비로 혼합한 후 1,400~1,500 ℃에서 5~7 시간 동안 소성처리하여 제조되는 것을 특징으로 하는 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐을 포함하는 골 재생용 시멘트의 제조방법.
  13. 삭제
  14. 제8항에서,
    상기 평형염용액은,
    상기 매트릭스 1 g 당 평형염용액 230~270 ㎕을 투입하는 것을 특징으로 하는 알긴산 염-히알루론산 마이크로 캡슐을 포함하는 골 재생용 시멘트의 제조방법.
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