KR102285323B1

KR102285323B1 - Bone graft substitutes based on coccoliths and carbonated hydroxyapatite synthesized from coccoliths

Info

Publication number: KR102285323B1
Application number: KR1020180121035A
Authority: KR
Inventors: 차형준; 윤진영; 김효정; 반소영; 조윤기; 진언선; 남온유
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2017-10-11
Filing date: 2018-10-11
Publication date: 2021-08-03
Also published as: KR20190040919A

Abstract

본 발명은 코콜리드 및 코콜리드 기반의 탄산수산화인회석으로 제조한 골이식재에 관한 것으로, 풍부한 해양 자원인 코콜리드를 사용하여 생체적합성과 세포친화성을 가진 골이식재를 제공한다.The present invention relates to a bone graft material prepared from cocolid and cocolid-based carbonate hydroxyapatite, and provides a bone graft material having biocompatibility and cell affinity using cocoli, a rich marine resource.

Description

Bone graft substitutes based on coccoliths and carbonated hydroxyapatite synthesized from coccoliths

본 발명은 코콜리드와 코콜리드로부터 합성된 탄산수산화인회석 기반의 골이식재에 관한 것이다.The present invention relates to cocolid and a carbonate hydroxyapatite-based bone graft material synthesized from cocolid.

전 세계적으로 인구 고령화가 진행됨에 따라 골 (bone) 질환 발생 빈도가 증가하는 등, 질병 및 외상으로 인한 골 결손 사례가 꾸준히 증가하고 있다. 골 이식 (bone graft)은 골이식재를 결손 부위에 이식하는 것으로, 질병 또는 외상으로 인해 결손된 골을 보전하거나, 골의 강도가 근육에 비해 약하여 버티지 못하는 경우 이를 보강하는 데에 이용된다. 이때, 효과적인 골조직 형성을 위해서는 적절한 물질을 골 결손 부위에 이식하는 것이 필수적이다.As the global population aging progresses, the incidence of bone diseases is increasing, and the number of cases of bone defects due to diseases and trauma is steadily increasing. A bone graft is a graft of a bone graft material to a defect site, and is used to preserve bone that is lost due to disease or trauma, or to reinforce bone that is weak compared to muscle and cannot withstand it. At this time, it is essential to implant an appropriate material into the bone defect site for effective bone tissue formation.

사람의 골 재생에는 약 3~4개월 정도가 소요되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 골이식재는 체내에서 적절한 속도로 분해되어 최종적으로는 새롭게 형성된 뼈로 대체될 수 있는 것이 바람직하다. 또한, 체내에 적용되는 것이기 때문에 생체적합성이 있는 것으로 안정성이 검증되어야 하며, 면역반응을 나타내지 않으면서 임상적인 조작이 편리해야 한다. 골이식재는 그 유래에 따라 크게 자가골 (autogeneous bone), 동종골 (allogenic bone), 이종골 (heterogeneous bone) 및 합성골 (alloplastic bone)로 분류할 수 있다. 골이식재로 사용되는 물질은 골형성능, 골전도능, 골유도능을 갖추어야 한다. 자가골은 이식을 받는 대상에게서 채취한 골조직을 이용하는 것으로, 골형성능, 골전도능 및 골유도능을 모두 갖추가 있기 때문에 골이식재의 최적표준으로 꼽힌다. 그러나, 골조직 채취를 위한 추가적인 외과수술을 필요로 하며, 이에 따른 비용과 시간이 요구되고, 무엇보다 사용할 수 있는 뼈의 양이 한정되어 있다는 한계가 있다. 같은 종에서 채취한 골조직을 이용하는 동종골, 다른 종에서 채취한 골조직을 이용하는 이종골의 경우, 골형성능은 우수하지만, 질병 전이의 위험성이 있으며 면역 거부 반응을 일으킬 수도 있다는 한계가 있다. 합성골은 골대체재를 이용하는 것으로, 기존의 이식재에서 문제가 되었던 제한적인 효용성, 면역 반응 및 감염의 위험이 없지만, 기존의 이식재에 비해 골형성능이 떨어진다는 단점이 있다.It is known that human bone regeneration takes about 3 to 4 months. Therefore, it is desirable that the bone graft material be decomposed at an appropriate rate in the body and finally be replaced with newly formed bone. In addition, since it is applied to the body, stability should be verified as having biocompatibility, and clinical manipulation should be convenient without showing an immune response. Bone graft materials can be largely classified into autogeneous bone, allogenic bone, heterogeneous bone, and alloplastic bone depending on their origin. Materials used as bone graft materials must have bone-forming, osteoconductive, and osteoinductive properties. Autologous bone uses bone tissue collected from a subject to be transplanted. However, there are limitations in that an additional surgical operation is required for bone tissue harvesting, cost and time are required, and, above all, the amount of bone that can be used is limited. In the case of allogeneic bone using bone tissue collected from the same species and xenograft bone using bone tissue obtained from another species, although the bone-forming performance is excellent, there is a risk of disease metastasis and there are limitations in that it may cause immune rejection. Synthetic bone uses a bone substitute, and although it does not have the limited utility, immune response, and risk of infection, which have been problems with conventional graft materials, it has a disadvantage in that it has inferior bone formation performance compared to conventional graft materials.

최근에는 골대체재로 하나의 재료만 사용하기보다는 여러 재료를 섞은 복합체를 개발하여 보다 효과적인 골 조직 재생 및 형성능을 확보하는 연구가 이루어지고 있다. 예를 들어, 세라믹 재료는 골이식재로 많이 사용되어 왔으나 골형성능과 골유도능이 없어, 세라믹 재료를 단독으로 골이식재로 사용하는 경우 수술 부위에서의 이탈 위험이 있었다. 이에, 골 형성 능력을 가진 세포와 성장 인자, 바인더 역할을 할 물질을 섞어 골형성능, 골유도능 및 골전도능을 모두 갖춘 세라믹 골이식재가 보고된 바 있다. 또한, 골 결손 부위의 유형에 따라 요구되는 이식재의 제형도 다양할 수 있는데, 여러 물질을 섞어 블록, 시멘트, 그리고 퍼티 등의 다양한 제형의 골이식재를 구현함으로써 골형성능, 골유도능 및 골전도능의 향상을 도모하기도 하였다.Recently, rather than using only one material as a bone substitute, research has been conducted to develop a composite containing several materials to secure more effective bone tissue regeneration and formation ability. For example, ceramic materials have been widely used as bone graft materials, but they do not have bone formation and osteoinduction properties. Accordingly, there has been reported a ceramic bone graft material having all of the osteogenic, osteoinductive and osteoconductive properties by mixing cells with bone-forming ability, growth factors, and materials to act as a binder. In addition, the formulation of the graft material required may vary depending on the type of bone defect. By mixing various materials to implement a bone graft material of various formulations such as block, cement, and putty, bone forming performance, osteoinduction and osteoconductivity was also promoted to improve.

한편, 최근에는 다양한 해양 자원, 특히, 해양생물로부터 유래된 물질에 관한 연구가 활발하게 이루어지고 있는데, 해양생물의 생광물화 (biomineralizaion) 반응으로부터 형성된 다양한 미네랄이 생체 유래 소재로서 주목받고 있다. 탄산칼슘은 산호의 골격이나 전복 패각에 함유되어 있어 쉽게 얻을 수 있는데, 이를 추출하여 가공하거나, 화학 반응시켜 수산화인회석 (hydroxyapatite)을 수득할 수 있다. 골은 약 69%가 인산칼슘으로 구성되어 있는데, 수산화인회석은 인산칼슘과 유사한 비율로 칼슘과 인을 포함하고 있으며, 골전도능을 갖추고 있음이 밝혀져 바이오세라믹 골대체재로 사용되기 시작하였다. 그러나, 수산화인회석은 체내에서 연간 1-2% 정도만이 분해되는 단점이 있다. 종래에는 이러한 단점을 극복하기 위해 수산화인회석을 다공성 구조로 만들어서 표면적을 증가시키거나, 생체 내 용해도가 높은 베타인산삼석회 (beta-tricalcium phosphate)와 혼합하였으나, 상용화하기 위해서는 보다 우수한 생체적합성 및 생분해성이 요구되는 실정이다.Meanwhile, in recent years, research on various marine resources, in particular, materials derived from marine organisms has been actively conducted, and various minerals formed from biomineralizaion reactions of marine organisms are attracting attention as bio-derived materials. Calcium carbonate is easily obtained because it is contained in the skeleton of coral or abalone shell, and it can be extracted and processed or chemically reacted to obtain hydroxyapatite. Bone is composed of about 69% calcium phosphate, and hydroxyapatite contains calcium and phosphorus in a ratio similar to calcium phosphate. However, hydroxyapatite has a disadvantage that only 1-2% per year is decomposed in the body. Conventionally, in order to overcome this disadvantage, hydroxyapatite is made into a porous structure to increase the surface area or mixed with beta-tricalcium phosphate, which has high in vivo solubility, but for commercialization, better biocompatibility and biodegradability is in demand.

코콜리드 (cocolith)는 해양에 풍부하게 존재하는 석회비늘편모류 (coccolithophore)를 둘러싸고 있는 껍데기로 그 주성분은 탄산칼슘이고, 해면골 (spongy bone)과 유사한 다공성 구조를 가지는 것으로 알려져 있다. 그러나, 이러한 코콜리드를 골이식재로 사용하는 것에 관해서는 알려진 것이 없다.Cocolith is a shell surrounding the coccolithophore that is abundantly present in the ocean. The main component is calcium carbonate, and it is known to have a porous structure similar to spongy bone. However, nothing is known about the use of such cocolids as bone graft materials.

대한민국 등록특허공보 제10-1427305호Republic of Korea Patent Publication No. 10-1427305 대한민국 공개특허공보 제10-2017-0096525호Republic of Korea Patent Publication No. 10-2017-0096525

K. Fee et al, Int. J. Nano Biomater. 2012, 4, 81.K. Fee et al, Int. J. Nano Biomater. 2012, 4, 81.

본 발명의 목적은 생체적합성 및 세포친화성이 우수한 골이식재를 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a bone graft material having excellent biocompatibility and cell affinity.

또한, 본 발명의 목적은 본 발명에 따른 골이식재 제조용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for preparing a bone graft material according to the present invention.

또한, 본 발명의 목적은 본 발명에 따른 골이식재의 제조 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for manufacturing a bone graft material according to the present invention.

본 발명자들은 해면골 (spongy bone)이 다공성 구조를 가지는 것에 착안, 이와 유사한 다공성 구조의 물질이 골 재생 또는 형성을 위해 필요한 혈관 형성 유도에 유리할 것이라는 점과, 해양 생물 유래 코콜리드가 다공성 구조인 점을 바탕으로, 코콜리드를 골이식재로 활용하였다.The present inventors have focused on the fact that spongy bone has a porous structure, and that a material with a similar porous structure will be advantageous for inducing the formation of blood vessels necessary for bone regeneration or formation, and that marine life-derived cocoli has a porous structure. Based on this, cocoli was used as a bone graft material.

또한, 본 발명자들은 수산화인회석보다 탄산수산화인회석이 골과 더 유사한 조성을 가진다는 점과, 코콜리드를 이용하여 탄산수산화인회석을 합성할 수 있다는 점을 바탕으로, 코콜리드로부터 탄산수산화인회석을 합성하고, 이를 골이식재로 활용하였다.In addition, the present inventors synthesized carbonate hydroxyapatite from coccolid based on the fact that carbonate hydroxyapatite has a composition more similar to bone than hydroxyapatite and that carbonate hydroxyapatite can be synthesized using cocolid, This was used as a bone graft material.

따라서, 본 발명은 코콜리드 및 탄산수산화인회석을 포함하는 골이식재를 제공한다.Accordingly, the present invention provides a bone graft material comprising cocolid and carbonate hydroxyapatite.

또한, 본 발명은 코콜리드 및 인산이수소암모늄을 포함하는 골이식재 제조용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for preparing a bone graft material comprising cocolide and ammonium dihydrogen phosphate.

또한, 본 발명은 코콜리드 및 인산이수소암모늄 혼합물의 수용액을 가열하는 단계, 및 상기 수용액을 원심분리하여 침전물을 수득하는 단계를 포함하는 골이식재 제조 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for producing a bone graft material comprising the steps of heating an aqueous solution of a mixture of coccolid and ammonium dihydrogen phosphate, and centrifuging the aqueous solution to obtain a precipitate.

본 발명에 따른 골이식재는 세포 독성이 없어 생체적합성이 우수하다.The bone graft material according to the present invention has excellent biocompatibility without cytotoxicity.

또한, 본 발명에 따른 골이식재는 세포 부착이 가능하고, 세포 증식이 가능하여 골형성능, 골전도능 및 골유도능이 있다.In addition, the bone graft material according to the present invention is capable of cell adhesion and cell proliferation, so that it has osteogenic, osteoconductive and osteoinductive properties.

또한, 본 발명에 따른 골이식재는 풍부한 해양 자원인 석회비늘편모류에서 유래된 코콜리드를 사용하여, 동종골을 사용하는 경우에 비해 효용이 우수하고, 이종골을 사용하는 경우에 비해 간단하고 경제적이다.In addition, the bone graft material according to the present invention uses coccolid derived from calcareous scale flagellum, a rich marine resource, and has superior utility compared to the case of using allogeneic bone, and is simpler and more economical than the case of using allogeneic bone. .

도 1은 실시예 2에 따른 코콜리드로 기반의 탄산수산화인회석을 포함하는 골이식재 및 그 활용에 관한 개념도이다.
도 2의 (a)는 실시예 1에 따라 석회비늘편모류의 일종인 에밀리아니아 훅슬레이아이 (Emiliania huxleyi)로부터 정제한 코콜리드의 전자현미경 사진 (x2000)이고, (b)는 XRD 패턴이다.
도 3은 실시예 2에 따라 코콜리드와 인산이수소암묘늄을 혼합하고 100°C에서 각각 (a) 1시간, (b) 3시간, (c) 5시간 및 (d) 6시간 동안 반응시킨 후의 전자현미경 사진 (x2000)이다.
도 4는 도 3의 (b)를 더 높은 배율(x5000)에서 관찰한 전자현미경 사진이다. 노란색 원은 코콜리드 사이에 나노 단위의 얇은 판들이 모여 있는 형태의 탄산수산화 인회석이 생성된 것을 표시한 것이다.
도 5의 (a)는 도 3의 (d)를 x5000배로 관찰한 전자현미경 사진이고, (b)는 이를 x50000배로 관찰한 전자현미경 사진이며, (c)는 XRD 패턴이고, (d)는 FTIR 패턴이다.
도 6은 PBS 용액과 실시예 2에 따라 제조한 코콜리드 기반의 탄산수산화인회석 (CHAp)가 포함된 PBS 용액의 DLS (Dynamic Light Scattering) 분석을 통해 탄산수산화인회석 입자 크기가 약 100 내지 200 nm임을 확인한 것이다.
도 7의 (a)는 실험예 1에 따라 코콜리드 (Coccolith)와 실시예 2에 따라 제조한 코콜리드 기반의 탄산수산화인회석 (CHAp)의 농도에 따른 세포독성 실험 결과이고, (b)는 100μg/mL 농도의 음성 대조군 (NC), 코콜리드 (Coccolith), 실시예 2에 따라 제조한 코콜리드 기반의 탄산수산화인회석 (CHAp) 및 양성 대조군 (PC)을 이용하여 세포독성을 비교 실험한 결과이다. 그래프 내의 점선은 100%의 세포 생존률을 표시한 것이고, 각각의 막대 그래프는 4회 실시한 평균값이며, 막대 가운데 실선은 표준편차를 나타낸다.
도 8은 실험예 2에 따라 실시예 1에 따른 코콜리드 (Coccolith), 실시예 2에 따라 제조한 코콜리드 기반의 탄산수산화인회석 (CHAp)의 세포 부착능력을 450 nm에서의 광학 밀도로 나타낸 것이다. 막대 그래프는 4회 실시한 평균값이며, 막대 가운데 실선은 표준편차를 나타낸다.
도 9는 실험예 3에 따라 실시예 1에 따른 코콜리드 (Coccolith), 실시예 2에 따라 제조한 코콜리드 기반의 탄산수산화인회석 (CHAp)의 세포 증식 능력을 450 nm에서의 광학 밀도로 나타낸 것이다. 막대 그래프는 4회 실시한 평균값이며, 막대 가운데 실선은 표준편차를 나타낸다.
도 10의 (a)는 실시예 2에 따라 제조한 코콜리드 기반의 탄산수산화인회석 (CHAp)과 10wt% 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC)를 섞은 직후와 5분이 지난 후의 모습이고, (b)는 실시예 3에 따른 골이식재를 쥐 두개골 결손 모델에 적용하기 전후의 모습이다.1 is a conceptual diagram of a bone graft material including coccolidro-based hydroxyapatite carbonate according to Example 2 and its utilization.
2 (a) is an electron micrograph (x2000) of cocolid purified from Emiliania huxleyi , a kind of limescale flagella, according to Example 1, (b) is an XRD pattern.
3 is a mixture of cocolide and ammonium dihydrogen phosphate according to Example 2 and reacted at 100 ° C for (a) 1 hour, (b) 3 hours, (c) 5 hours and (d) 6 hours, respectively. It is a later electron micrograph (x2000).
4 is an electron microscope photograph of FIG. 3 (b) observed at a higher magnification (x5000). The yellow circle indicates the formation of hydroxyapatite in the form of nano-scale thin plates gathered between cocolids.
(a) of FIG. 5 is an electron micrograph of FIG. 3 (d) observed at x5000 times, (b) is an electron micrograph observed at x50000 times, (c) is an XRD pattern, (d) is FTIR It's a pattern.
6 shows that the carbonic hydroxyapatite particle size is about 100 to 200 nm through DLS (Dynamic Light Scattering) analysis of the PBS solution and the PBS solution containing the cocolid-based carbonic hydroxyapatite (CHAp) prepared according to Example 2. it has been confirmed
Figure 7 (a) is a cytotoxicity test results according to the concentration of cocolith (Coccolith) according to Experimental Example 1 and the cocolid-based carbonic hydroxyapatite (CHAp) prepared according to Example 2, (b) is 100 μg This is the result of a comparative experiment for cytotoxicity using a negative control (NC), coccolith, cocolid-based carbonic hydroxyapatite (CHAp) prepared according to Example 2, and a positive control (PC) at a concentration of /mL . A dotted line in the graph indicates 100% cell viability, each bar graph is an average value performed 4 times, and a solid line in the middle of the bar indicates the standard deviation.
8 is a graph showing the cell adhesion ability of cocolith according to Example 1 according to Experimental Example 2 and the cocolid-based carbonic hydroxyapatite (CHAp) prepared according to Example 2 as an optical density at 450 nm. . The bar graph is the average value performed 4 times, and the solid line in the middle of the bar indicates the standard deviation.
9 is a graph showing the cell proliferation ability of cocolith according to Example 1 according to Experimental Example 3 and the cocolid-based carbonic hydroxyapatite (CHAp) prepared according to Example 2 as an optical density at 450 nm. . The bar graph is the average value performed 4 times, and the solid line in the middle of the bar indicates the standard deviation.
Figure 10 (a) is a view immediately after mixing the cocolid-based hydroxyapatite (CHAp) and 10 wt% carboxymethyl cellulose (CMC) prepared according to Example 2 and after 5 minutes, (b) is an Example Figures before and after applying the bone graft material according to 3 to the rat skull defect model.

본 발명은 코콜리드 및 탄산수산화인회석을 포함하여 골형성능, 골전도능 및 골유도능이 있는 골이식재에 관한 것이다.The present invention relates to a bone graft material having bone-forming, osteoconductive and osteoinductive properties, including cocolid and carbonate hydroxyapatite.

본 발명에서 사용되는 용어 "골이식재 (bone graft)"는 골 결손의 보전, 골형성의 자극, 관절 유합, 관절의 제동 및 탈구 방지에 사용될 수 있는 재료로서, 골이식술 (bone grafting)에 사용될 수 있는 것을 의미한다.The term "bone graft" used in the present invention is a material that can be used for the preservation of bone defects, stimulation of bone formation, joint fusion, joint braking, and prevention of dislocation, and can be used for bone grafting. means there is

본 발명에 있어서, 골 이식재는 예를 들어, 사골 (ethmoid), 전두골 (frontal), 비골 (nasal), 후두골 (occipital), 두정골(parietal), 측두골 (temporal), 하악골 (mandible), 상악골 (maxilla), 관골 (zygomatic), 자궁경부의 척추골 (cervical vertebra), 흉부의 척추골 (thoracic vertebra), 요추 척추골 (lumbar vertebra), 천골 (sacrum), 늑골 (rib), 흉골 (sternum), 쇄골 (clavicle), 견갑골 (scapula), 상박골 (humerus), 요골 (radius), 척골 (ulna), 손목뼈 (carpal bones), 중수골 (metacarpal bones), 지골 (phalanges), 장골 (ilium), 좌골 (ischium), 치골 (pubis), 대퇴골 (femur), 경골 (tibia), 비골 (fibula), 슬개골 (patella), 종골 (calcaneus), 족근골 (tarsal) 및 척골 (metatarsal bones)에 적용할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.In the present invention, the bone graft material is, for example, ethmoid, frontal bone, fibula, occipital, parietal, temporal bone, mandible, maxilla. ), zygomatic, cervical vertebra, thoracic vertebra, lumbar vertebra, sacrum, rib, sternum, clavicle , scapula, humerus, radius, ulna, carpal bones, metacarpal bones, phalanges, ilium, ischium, pubis (pubis), femur, tibia, fibula, patella, calcaneus, tarsal and metatarsal bones. .

본 발명에서 사용되는 용어 "골형성능"은 골아세포 (osteoblast)에 의한 골 기질 형성 및 골재생 (osteoanagensis)을 유도하거나 촉진하는 기능을 의미하며, 연골성 골형성, 결합 조직성 골형성 및 전조식 골형성을 모두 포함하는 것이다.As used in the present invention, the term "osteogenesis ability" refers to a function of inducing or promoting bone matrix formation and bone regeneration (osteoanagensis) by osteoblasts, and includes cartilaginous bone formation, connective tissue bone formation and prognostic expression. It includes all bone formations.

본 발명에서 사용되는 용어 "골전도능"은 골아세포를 끌어당겨 골아세포의 골 기질 형성을 유도하거나 촉진하는 기능을 의미한다.As used herein, the term “osteoconductive capacity” refers to a function of attracting osteoblasts to induce or promote the formation of bone matrix of osteoblasts.

본 발명에서 사용되는 용어 "골유도능"은 골 조직 재생에 유용한 세포 및 물질만을 결손부에 접근시켜 원하는 골 조직으로의 재생을 유도하는 기능을 의미한다.As used herein, the term “osteoinducibility” refers to a function of inducing regeneration of desired bone tissue by accessing only cells and materials useful for bone tissue regeneration to the defect.

본 발명은 코콜리드를 포함하는 골이식재에 관한 것이다. 본 발명에 있어서 "코콜리드 (coccolith)"는 석회비늘편모류 (coccolithophore)의 표면을 덮고 있는 미세한 비늘 또는 판 형태의 껍데기로서, 주성분은 탄산칼슘이다. 본 발명에서 석회비늘편모류는 착편모강 (haptophyceae)에 속하는 해양 식물성 플랑크톤으로서, 햇빛이 비치는 해양 전역에서 쉽게 발견할 수 있으며, 대표적인 예로는 에밀리아니아 훅슬레이아이 (Emiliania huxleyi)가 있다. 코콜리드는 석회비늘편모류의 골지체에서 형성되고, 바깥으로 분비되어 껍데기를 형성하는데, 이러한 껍데기는 외부 바이러스로부터 보호를 제공하고, 다공성 구조로 인해 부력을 유지하고, 이산화탄소 배출하는 통로를 제공할 수 있는 것으로 알려져 있다. 코콜리드는 그 구체적인 형태에 따라 구별할 수 있는데, 본 발명에서 코콜리드는 예를 들어, 칼립트롤리드 (calyptrolith), 카네올리드 (caneolith), 케라토리드 (ceratolith), 크리브릴리드 (cribilith), 크리토리드 (crytolith), 디스코리드 (discolith), 헬리코리드 (helicolith), 로파도리드 (lopadolith), 펜탈리드 (pentalith), 플라코리드 (placolith), 프리스마토리드 (prismatolith), 랍돌리드 (rhabdolith) 또는 스캐폴리드 (scapholith)일 수 있으나, 다공성 구조를 갖는 것이면 종류에 한정되지는 않는다. 본 발명에 따른 코콜리드를 포함하는 골이식재는 종래 합성골에 비해 생체 적합하고, 코콜리드의 다공성 구조를 통한 체내 물질 이동이 용이하여 혈관 형성이 원활하게 이루어질 수 있고, 이를 통해 효율적인 골 재생이 가능하다.The present invention relates to a bone graft material comprising cocoli. In the present invention, "coccolith" is a shell in the form of fine scales or plates covering the surface of coccolithophore, and the main component is calcium carbonate. In the present invention, limescale flagellates are marine phytoplankton belonging to the haptophyceae, and can be easily found throughout the ocean where sunlight shines, and a representative example is Emiliania huxleyi . Coccoli is formed in the Golgi apparatus of calcareous flagellates, and is secreted outward to form a shell, which can provide protection from external viruses, maintain buoyancy due to its porous structure, and provide a pathway for carbon dioxide excretion. It is known that there is Cocoli can be distinguished according to its specific form. In the present invention, cocoli is, for example, calyptrolith, caneolith, ceratolith, cribilith, Crytolith, discolith, helicolith, lopadolith, pentalith, placolith, prismatolith, rhabdolith ) or a scaffold (scapholith), but the type is not limited as long as it has a porous structure. The bone graft material containing cocolid according to the present invention is biocompatible compared to conventional synthetic bone, and the porous structure of coccoli can facilitate movement of substances in the body, so that blood vessels can be formed smoothly, and through this, efficient bone regeneration is possible. do.

본 발명에 따른 골이식재에서, 탄산수산화인회석은 코콜리드를 가공하거나 화학적으로 반응시켜 수득할 수 있다. 바람직하게는, 탄산수산화인회석은 코콜리드와 인산이수소암모늄 (ammonium dihydrogen phosphate, NH₄H₂PO₄)을 수열 합성하여 수득할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "수열 합성 (hydrothermal synthesis)"은 수열 반응이라고도 하며, 고온의 물 또는 고온, 고압의 물의 존재 하에서 이루어지는 물질의 합성 반응을 의미한다. 본 발명에 따른 골이식재에서 수산화인회석은 코콜리드와 인산이수소암모늄의 혼합물의 pH를 10이상으로 유지하면서 100℃ 이상의 온도에서 수열 반응시켜 수득할 수 있으며, 코콜리드와 인산이수소암모늄을 수열 합성하여 수득한 탄산수산화인회석은 코콜리드와 유사한 다공성 구조를 가질 수 있다. 본 발명에 있어서 "탄산수산화인회석 (carbonated hydroxyapatite)"은 수산화인회석 (Ca₅(OH)(PO₄)₃)의 히드록시기, 인산기 또는 이들 두 가지 작용기의 일부가 탄산기로 치환된 것을 의미한다. 골을 구성하는 골광질 (bone mineral)은 인산칼슘과 수산화칼슘의 복합체를 포함하며, 약 4 내지 8 중량%의 탄산기를 포함하는데, 탄산수산화인회석은 탄산기를 더 포함하여 수산화인회석에 비해 골과 화학적으로 더 유사하고, 히드록시기, 인산기 또는 두 가지 모두의 일부가 탄산기로 치환되면서 결정도 (crystallinity)가 감소하여 수산화인회석에 비해 높은 용해도를 나타낼 수 있다.In the bone graft material according to the present invention, hydroxyapatite carbonate can be obtained by processing or chemically reacting cocoli. Preferably, carbonate hydroxyapatite can be obtained by hydrothermal synthesis of cocolide and ammonium dihydrogen phosphate (NH ₄ H ₂ PO _{4 ).} As used herein, the term “hydrothermal synthesis” is also referred to as a hydrothermal reaction, and refers to a synthesis reaction of a substance in the presence of high-temperature water or high-temperature, high-pressure water. In the bone graft material according to the present invention, hydroxyapatite can be obtained by hydrothermal reaction at a temperature of 100° C. or higher while maintaining the pH of a mixture of cocolide and ammonium dihydrogen phosphate at 10 or higher, and hydrothermal synthesis of cocolide and ammonium dihydrogen phosphate The obtained carbonate hydroxyapatite may have a porous structure similar to that of cocoli. In the present invention, "carbonated hydroxyapatite" means hydroxyapatite (Ca ₅ (OH)(PO ₄ ) ₃ ) in which a hydroxy group, a phosphate group, or a part of these two functional groups is substituted with a carbonic acid group. Bone mineral constituting bone contains a complex of calcium phosphate and calcium hydroxide, and contains about 4 to 8% by weight of carbonic acid groups. More similarly, as a part of a hydroxyl group, a phosphoric acid group, or both are substituted with a carbonic acid group, the crystallinity may decrease, indicating a higher solubility than hydroxyapatite.

본 발명에 따라 코콜리드 및 탄산수산화인회석을 포함하는 골이식재의 경우, 코콜리드 및 탄산수산화인회석의 다공성 구조로 인해 필요한 혈관 형성 유도 능력이 우수하고, 코콜리드의 우수한 생체 적합성과 탄산수산화인회석의 높은 용해도로 인해 골 형성 및 재생되는 골에 의한 대체에 관한 시너지 효과를 발휘할 수 있다.According to the present invention, in the case of a bone graft material containing cocolid and carbonate hydroxyapatite, the porous structure of cocolide and carbonate hydroxyapatite has excellent ability to induce blood vessel formation. Its solubility may exert a synergistic effect on bone formation and replacement by regenerated bone.

본 발명에 따른 골이식재는 코콜리드 및 탄산수산화인회석을 7:3 내지 9:1의 중량비로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 8:2의 중량비로 포함할 수 있다.The bone graft material according to the present invention may include coccolid and carbonate hydroxyapatite in a weight ratio of 7:3 to 9:1, preferably, in a weight ratio of 8:2.

본 발명에 따른 골이식재에서, 코콜리드의 크기는 2 내지 3 μm 이고, 탄산수산화인회석 입자의 크기는 50 내지 250nm일 수 있고, 바람직하게는 100 내지 200 nm일 수 있다.In the bone graft material according to the present invention, the size of the cocolids may be 2 to 3 μm, and the size of the carbonate hydroxyapatite particles may be 50 to 250 nm, preferably 100 to 200 nm.

본 발명에 따른 골이식재는 줄기세포를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 골이식재에 있어서, 줄기세포는 여러 종류의 신체 조직으로 분화할 수 있는 미분화 세포로서, 골수 (bone marrow), 말초신경 혈액, 제대혈 (cord blood), 골막 (periosteum), 진피 (dermis) 또는 중배엽 기원의 조직으로부터 분리되고 정제된 것일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게는, 줄기세포는 골수로부터 분리된 것일 수 있다. 골수 유래 줄기세포는 골수의 공급원에 따라 다수의 상이한 기계적 분리 방법에 의해 분리될 수 있으며, 이러한 분리 방법들은 당업계에 공지된 것을 이용할 수 있다. 예를 들어, 골수에 소량 존재하는 줄기세포의 선택적인 부착을 가능하게 하는 배지를 사용함으로써, 골수에 존재하는 적혈구, 백혈구와 같은 기타 세포로부터 줄기세포를 분리해 내는 것이 가능하다. 본 발명에 있어서 줄기세포는 골아세포 (osteoblast)로 분화될 수 있다.The bone graft material according to the present invention may further include stem cells. In the bone graft material according to the present invention, stem cells are undifferentiated cells capable of differentiating into various types of body tissues, and include bone marrow, peripheral nerve blood, cord blood, periosteum, and dermis. ) or may be isolated and purified from tissues of mesodermal origin, but is not limited thereto. Preferably, the stem cells may be isolated from bone marrow. Bone marrow-derived stem cells may be isolated by a number of different mechanical separation methods depending on the source of bone marrow, and those separation methods known in the art may be used. For example, it is possible to isolate stem cells from other cells, such as red blood cells and white blood cells, present in the bone marrow by using a medium that enables the selective attachment of stem cells present in small amounts in the bone marrow. In the present invention, the stem cells may be differentiated into osteoblasts.

본 발명에 따른 골이식재는 결합제 (binding agent)를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서 결합제는 코콜리드, 탄산수산화인회석 또는 이들의 혼합물을 물리적으로 고정, 결합 또는 응집시킴으로써, 골이식재를 골 결손부에 적용시 골이식재가 골 결손부에서 곧바로 이탈하지 않게 할 수 있는 재료를 의미한다. 결합제의 예로는, 덴탈 레진 시멘트 (dental resin cement); 글라스 이오노머 시멘트(glass ionomer cement); 콜라겐 접착제 (collagen based glues); 인산 아연 (zinc phosphate), 인산 마그네슘 (magnesium phosphate)과 같은 인산 시멘트 (phosphate-based cements); 카르복실 아연 (zinc carboxylate); 피브린 글루 (fibrin glues), 접착 단백질 (mussel-derived adhesive proteins)과 같은 단백질 결합제 (protein-based binders);와 같은 공지된 생체적합성 물질을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.The bone graft material according to the present invention may further include a binding agent. In the present invention, the binder is a material that can prevent the bone graft material from immediately leaving the bone defect when the bone graft material is applied to the bone defect by physically fixing, bonding, or coagulating cocoli, carbonate hydroxyapatite, or a mixture thereof. means Examples of the binder include dental resin cement; glass ionomer cement; collagen based glues; phosphate-based cements such as zinc phosphate, magnesium phosphate; carboxyl zinc (zinc carboxylate); known biocompatible materials such as, but not limited to, fibrin glues, protein-based binders such as mussel-derived adhesive proteins.

본 발명에 따른 골이식재는 첨가제를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 골이식재에 있어서, 첨가제는 골 결손부의 감염을 방지하거나, 골이식재의 골형성능, 골전도능 또는 골유도능을 보다 향상시키기 위해 첨가되는 의학적으로 허용되는 추가 성분일 수 있다. 첨가제의 예로는, 항바이러스제, 항균제, 항생제, 항암제, 혈관생성제 (angiogenic drugs)와 같은 약물; 다당류 수용액; 아미노산; 펩타이드; 비타민; 단백질 합성에 대한 보조 인자; 소마토트로핀 (somatotropin)과 같은 성장 호르몬 호르몬; 내분비 조직 단편; 콜라게나제 (collagenase), 펩티다제 (peptidases), 옥시다제 (oxidases)와 같은 효소; 연골 단편 (cartilage fragments), 연골세포 (chondrocytes), 골수 세포(bone marrow cells)와 같은 살아있는 세포; 면역억제제; 지방산 에스테르; 및 핵산;을 포함하지만, 이에 한정되지는 않으며, 당업자는 골 결손 부위 및 적용 대상의 상태에 따라 적합한 첨가제를 1종 이상 선택할 수 있다.The bone graft material according to the present invention may further include an additive. In the bone graft material according to the present invention, the additive may be a medically acceptable additional component added to prevent infection of the bone defect or to further improve the bone-forming performance, osteoconductivity or osteoinduction ability of the bone graft material. Examples of the additive include drugs such as antiviral agents, antibacterial agents, antibiotics, anticancer agents, and angiogenic drugs; polysaccharide aqueous solution; amino acid; peptide; vitamin; cofactors for protein synthesis; growth hormone hormones such as somatotropin; endocrine tissue fragments; enzymes such as collagenase, peptidases, and oxidases; living cells such as cartilage fragments, chondrocytes, bone marrow cells; immunosuppressants; fatty acid esters; and nucleic acids; but is not limited thereto, and those skilled in the art may select one or more suitable additives according to the bone defect site and the condition of the subject.

본 발명에 따른 골이식재는 통상의 방법에 따라 산제, 현탁액, 에멀전, 연고제 또는 주사제의 형태로 제형화되어 골 결손 부위 또는 주변 부위에 적용될 수 있다. 본 발명에 있어서 "투여량"은 이를 필요로 하는 대상 부위에 적용됨으로써 골 형성 또는 재생을 유도하거나, 촉진하기에 충분한 양을 의미한다. 본 발명에 따른 골이식재의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태 및 골 결손 정도에 따라 달라질 수 있으며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.The bone graft material according to the present invention may be formulated in the form of a powder, suspension, emulsion, ointment or injection according to a conventional method and applied to the bone defect site or surrounding area. In the present invention, "dosage" means an amount sufficient to induce or promote bone formation or regeneration by being applied to a target site in need thereof. The dose of the bone graft material according to the present invention may vary depending on the patient's weight, age, sex, health status, and degree of bone defect, and may be appropriately selected by those skilled in the art.

또한, 본 발명은 코콜리드 및 인산이수소암모늄을 포함하는 골이식재 제조용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 골이식재 제조용 조성물은 물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 칼슘카보네이트, 덱스트린, 프로필렌글리콜 및 리퀴드 파라핀으로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상을 더 포함할 수 있다.In addition, the present invention relates to a composition for preparing a bone graft material comprising cocolide and ammonium dihydrogen phosphate. The composition for preparing a bone graft material according to the present invention includes water, saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, cyclodextrin, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, liposome, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol. , mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methylcellulose, polyvinylpyrrolidone, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium It may further include one or more selected from the group consisting of stearate, mineral oil, calcium carbonate, dextrin, propylene glycol, and liquid paraffin.

또한, 본 발명은 (1) 코콜리드 및 인산이수소암모늄 혼합물의 수용액을 가열하는 단계, 및 (2) 상기 수용액을 원심분리하여 침전물을 수득하는 단계를 포함하는 골이식재 제조 방법에 관한 것이다.In addition, the present invention relates to a method for producing a bone graft material comprising the steps of (1) heating an aqueous solution of a mixture of cocolid and ammonium dihydrogen phosphate, and (2) centrifuging the aqueous solution to obtain a precipitate.

본 발명에 따른 골이식재 제조 방법은 (1) 코콜리드 및 인산이수소암모늄 혼합물의 수용액을 가열하는 단계를 포함할 수 있다. 코콜리드는 정제된 것을 사용할 수 있으며, 상기 정제는 석회비늘편모류 배양액에 하이포아염소산나트륨, 탄산수소나트륨 또는 이들의 조합을 첨가하여 원심분리하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 코콜리드 및 인산이수소암모늄의 혼합물에서 코콜리드와 인산이수소암모늄은 1.3:1 내지 1.6:1의 중량비로 혼합된 것일 수 있으며, 바람직하게는 1.4:1 내지 1.5:1의 중량비로 혼합된 것일 수 있다. 상기 혼합물의 수용액은 상기 혼합물과 물이 1:30 내지 1:50으로 혼합된 것일 수 있다. 상기 가열은 상기 수용액의 pH를 9 내지 14로 유지하면서 수행될 수 있다. 또한, 상기 가열은 대기압, 80 내지 120℃ 조건에서 1 내지 8시간 동안 수행될 수 있다. (1) 단계를 통해 코콜리드 구조가 붕괴되면서, 탄산수산화인회석이 생성될 수 있다.The method for manufacturing a bone graft material according to the present invention may include the step of (1) heating an aqueous solution of a mixture of cocolide and ammonium dihydrogen phosphate. The purified cocoli may be used, and the purification may include centrifuging by adding sodium hypochlorite, sodium hydrogen carbonate, or a combination thereof to the limescale flagellum culture solution. In the mixture of cocolide and ammonium dihydrogen phosphate, cocolide and ammonium dihydrogen phosphate may be mixed in a weight ratio of 1.3:1 to 1.6:1, preferably mixed in a weight ratio of 1.4:1 to 1.5:1. it could be The aqueous solution of the mixture may be a mixture of the mixture and water in a ratio of 1:30 to 1:50. The heating may be performed while maintaining the pH of the aqueous solution at 9 to 14. In addition, the heating may be performed for 1 to 8 hours at atmospheric pressure and 80 to 120 °C conditions. As the cocolid structure collapses through step (1), carbonate hydroxyapatite can be produced.

본 발명에 따른 골이식재 제조 방법은 (2) 단계 (1)에 따른 수용액을 원심분리하여 침전물을 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 원심분리는 6000 내지 12000 rpm으로 수행될 수 있다. (2) 단계는 침전물을 세척하는 것을 더 포함할 수 있으며, 상기 세척은 물 또는 아세트산으로 세척하는 것일 수 있다.The method for manufacturing a bone graft material according to the present invention may include (2) centrifuging the aqueous solution according to step (1) to obtain a precipitate. The centrifugation may be performed at 6000 to 12000 rpm. Step (2) may further include washing the precipitate, and the washing may be washing with water or acetic acid.

실시예 및 실험예Examples and Experimental Examples

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 제시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of Examples. However, the following examples only present the present invention, and the scope of the present invention is not limited by these examples.

실시예 1. 코콜리드의 정제Example 1. Purification of cocoli

석회비늘편모류의 일종인 에밀리아니아 훅슬레이아이로부터 코콜리드를 정제하기 위해 다음 과정을 수행하였다. 에밀리아니아 훅실레이 세포를 65℃에서 48시간 이상 배양한 후 상등액을 따내어 코니컬 튜브에 옮겼다. 이를 1500 rpm으로 5분 동안 원심분리 시킨 후, 상등액의 3/4을 제거하고 볼텍스 (vortex)하였다. 전체의 1/3용량의 12% NaOCl를 첨가하여, 혼합한 후 상온에서 15분 동안 배양하였다. 6 mM NaHCO₃를 2배 분량으로 첨가하고, 1500 rpm으로 5분 동안 원심분리시키는 과정을 5번 반복하였다. 상등액을 제거하고, 메탄올 5 mL를 첨가하여 볼텍스하였다. 2170 rpm으로 10분 동안 원심분리시키고, 상등액을 제거한 다음 메탄올에 재부유 (resuspension)시켰다. 이를 통해 수득한 코콜리드의 전자현미경 사진과 XRD 패턴을 확인하였다 (도 2).The following procedure was performed to purify cocoli from Emiliania hooksleyeye, a kind of limescale flagellate. After culturing Emiliania hooksylei cells at 65° C. for more than 48 hours, the supernatant was removed and transferred to a conical tube. After centrifugation at 1500 rpm for 5 minutes, 3/4 of the supernatant was removed and vortexed. 12% NaOCl of 1/3 of the total volume was added, mixed, and incubated for 15 minutes at room temperature. 6 mM NaHCO ₃ was added in double portions, and the process of centrifugation at 1500 rpm for 5 minutes was repeated 5 times. The supernatant was removed, and 5 mL of methanol was added and vortexed. After centrifugation at 2170 rpm for 10 minutes, the supernatant was removed and resuspended in methanol. The electron micrograph and XRD pattern of the cocoli obtained through this were confirmed (FIG. 2).

실시예 2. 코콜리드 기반의 탄산수산화인회석의 제조 및 물성 확인Example 2. Preparation of cocolid-based hydroxyapatite carbonate and confirmation of physical properties

실시예 1에 따라 수득한 코콜리드와 인산이수소암모늄 (NH₄H₂PO₄)을 1.45:1의 중량비로 혼합하고, 혼합물과 증류수를 1:40의 중량비로 혼합하였다. 수산화암모늄을 이용하여 상기 수용액의 pH를 10 이상으로 유지하면서, 대기압, 100℃ 조건에서 각각 1시간, 3시간, 5시간 및 6시간 동안 반응시킨 샘플을 준비하고, 상온에서 24시간 동안 냉각시켰다. 그 후 각 샘플을 9000 rpm으로 5분 동안 원심분리하고, 상등액을 제거하고 침전물은 증류수로 세척하였다. 2% 아세트산으로 2회 세척하고, 증류수를 이용해 2번 세척한 후 37°C 오븐에서 건조하여 탄산수산화인회석을 수득하였고, 완성된 샘플의 전자현미경 사진을 확인하였다 (도 3).Cocolide obtained according to Example 1 and ammonium dihydrogen phosphate (NH ₄ H ₂ PO ₄ ) were mixed in a weight ratio of 1.45:1, and the mixture and distilled water were mixed in a weight ratio of 1:40. While maintaining the pH of the aqueous solution at 10 or more using ammonium hydroxide, samples were reacted for 1 hour, 3 hours, 5 hours and 6 hours, respectively, at atmospheric pressure and 100° C. conditions, and cooled at room temperature for 24 hours. After that, each sample was centrifuged at 9000 rpm for 5 minutes, the supernatant was removed, and the precipitate was washed with distilled water. It was washed twice with 2% acetic acid, washed twice with distilled water, and dried in an oven at 37 °C to obtain hydroxyapatite carbonate, and the electron micrograph of the finished sample was confirmed (FIG. 3).

도 3에 따르면 반응 시간이 길어질수록 코콜리드의 구조가 붕괴되면서 다른 물질들이 생성되는 것을 확인할 수 있었다. 도 4는 상기 반응을 3시간 동안 수행한 샘플의 전자현미경 사진을 나타낸 것으로, 코콜리드 사이에 나노 단위의 얇은 판들이 모여 있는 형태의 구조를 가지는 탄산수산화인회석이 생성된 것을 확인할 수 있다. 도 5는 상기 반응을 6시간 동안 수행한 샘플을 전자현미경, XRD 및 FTIR로 분석한 결과로, 코콜리드로부터 탄산수산화인회석 (CHAp)이 충분히 합성된 것으로 판단, 아래 실험예서는 상기 반응을 6시간 동안 수행한 샘플을 사용하였다. 이 샘플에서 탄산수산화인회석 입자의 크기는 약 100 내지 200 nm인 것으로 나타났다 (도 6).According to FIG. 3 , it was confirmed that as the reaction time increased, the structure of cocolide collapsed and other materials were generated. 4 shows an electron micrograph of a sample in which the reaction was performed for 3 hours, and it can be confirmed that hydroxyapatite carbonate having a structure in which nano-scale thin plates are gathered between cocolids is generated. 5 is a result of analysis by electron microscope, XRD and FTIR of a sample in which the reaction was performed for 6 hours, it was determined that carbonic hydroxyapatite (CHAp) was sufficiently synthesized from cocolid. In the experimental example below, the reaction was performed for 6 hours. Samples performed during the period were used. The size of the carbonic hydroxyapatite particles in this sample was found to be about 100 to 200 nm (FIG. 6).

실험예 1. 코콜리드 및 코콜리드 기반의 탄산수산화인회석의 생체적합성 확인Experimental Example 1. Confirmation of biocompatibility of cocolid and cocolid-based carbonic hydroxyapatite

실시예 1에 따른 코콜리드와 실시예 2에 따라 제조한 코콜리드 기반의 탄산수산화인회석 (CHAp)을 둘베코 인산완충액 (DPBS)에 담그고, 자외선으로 30분씩 4번 멸균하였다. 상기 샘플들을 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함한 α-최소 필수 배지 (α-MEM)에 각각 10, 50, 100, 300 μg/mL의 농도로 넣어 각 샘플을 준비하였다 (ISO 10993-12). 음성 대조군 (Negative control, NC)으로는 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 α-MEM (무혈청배양액), 양성 대조군 (Positive control, PC)으로는 무혈청배양액에 15% DMSO가 사용되었다.The cocoli according to Example 1 and the cocolide-based carbonic hydroxyapatite (CHAp) prepared according to Example 2 were immersed in Dulbecco's phosphate buffer (DPBS) and sterilized 4 times for 30 minutes each with ultraviolet light. Each sample was prepared by putting the samples in α-minimum essential medium (α-MEM) containing 1% penicillin/streptomycin at concentrations of 10, 50, 100, and 300 μg/mL, respectively (ISO 10993-12). As a negative control (Negative control, NC), α-MEM (serum-free culture medium) containing 1% penicillin/streptomycin was used, and as a positive control (positive control, PC), 15% DMSO was used in a serum-free culture medium.

쥐 유래의 pre-osteoblast MC3T3-E1 cells (RIKEN Cell Bank)을 바닥이 평평한, 48-웰 플레이트의 각 웰에 세포를 2x10⁴ cells/well로 시딩(seeding)한 후 10% (v/v) 소 태아 혈청 (FBS) 과 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함한 α-MEM로 37°C, 5% CO₂ 및 95% 공기의 습한 분위기에서 24시간동안 배양하였다.Rat-derived pre-osteoblast MC3T3-E1 cells (RIKEN Cell Bank) were seeded at 2x10 ⁴ cells/well in each well of a flat-bottomed, 48-well plate, followed by 10% (v/v) bovine Incubated with α-MEM containing fetal serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin for 24 h in a humidified atmosphere at _{37 °C, 5% CO 2 and 95% air.}

독성 평가를 위해, 준비한 샘플을 세포에 처리하고 24시간 배양한 후 세포 생존율을 측정하였다. 세포 생존율은 세포 배양 배지에 cell counting kit-8 (CCK-8; Dojindo Laboratories) 시약을 처리하고 3시간 동안 배양한 다음, 각 배지를 분취하여 450 nm 파장대에서의 흡광도를 측정함으로써 확인하였다 (도 7).For toxicity evaluation, the prepared sample was treated with cells and cultured for 24 hours, and then cell viability was measured. Cell viability was confirmed by treating the cell culture medium with a cell counting kit-8 (CCK-8; Dojindo Laboratories) reagent and culturing for 3 hours, then aliquoting each medium and measuring the absorbance in the 450 nm wavelength band (FIG. 7) ).

도 7 (a)에서 실시예 1에 따른 코콜리드와 실시예 2에 따른 코콜리드 기반의 탄산수산화인회석 샘플 농도가 증가함에 따라 세포 생존율은 증가하는 경향을 나타내었으나, 300 μg/mL에서는 실시예 2에 따른 코콜리드 기반의 탄산수산화인회석 샘플을 처리한 배지의 세포 생존율이 감소하는 것을 확인하여, 이후 실험은 모두 100 μg/Ml 농도로 진행하였다. 도 7 (b)는 각 샘플로 배지를 처리하고 24시간 후의 세포 생존율을 나타낸 것이다. 실시예 1에 따른 코콜리드의 경우 세포 생존율은 양성 대조군의 약 1.31배, 음성 대조군의 약 5.15배 높았으며, 실시예 2에 따른 코콜리드 기반의 탄산수산화인회석의 경우 세포 생존율은 양성 대조군의 약 1.46배, 음성 대조군의 약 5.73배 가량 높은 것으로 나타났다. 이러한 결과를 통해 코콜리드와 코콜리드 기반의 탄산수산화인회석은 세포 독성이 거의 없는 것을 확인하여, 생체적합함을 확인하였다.In FIG. 7 (a), the cell viability showed a tendency to increase as the concentration of the cocolid according to Example 1 and the cocolid-based hydroxyapatite sample according to Example 2 increased, but at 300 μg/mL, Example 2 It was confirmed that the cell viability of the medium treated with the cocolid-based hydroxyapatite sample according to Figure 7 (b) shows the cell viability after 24 hours of treating the medium with each sample. In the case of cocolid according to Example 1, the cell viability was about 1.31 times higher than that of the positive control and about 5.15 times higher than that of the negative control, and in the case of the cocolid-based carbonate hydroxyapatite according to Example 2, the cell viability was about 1.46 of the positive control. It was found to be about 5.73 times higher than that of the double and negative control group. Through these results, it was confirmed that cocolid and cocolid-based carbonate hydroxyapatite had almost no cytotoxicity, confirming their biocompatibility.

실험예 2. 코콜리드 및 코콜리드 기반의 탄산수산화인회석에 대한 세포 부착능 확인Experimental Example 2. Confirmation of cell adhesion to cocolid and cocolid-based carbonic hydroxyapatite

실시예 1에 따른 코콜리드와 실시예 2에 따라 제조한 코콜리드 기반의 탄산수산화인회석을 실험예 1과 동일한 방법으로 멸균하고, 각각을 무혈청배양액에 100 μg/mL 농도로 첨가하여 샘플을 준비하였다.The cocolide according to Example 1 and the cocolid-based hydroxyapatite carbonate prepared according to Example 2 were sterilized in the same manner as in Experimental Example 1, and each was added to a serum-free culture solution at a concentration of 100 μg/mL to prepare a sample. did.

바닥이 평평한, 48-웰 플레이트의 각 웰에 MC3T3-E1 세포를 2x10⁴cells/well로 시딩(seeding)한 후 각 샘플을 세포에 처리한 후 37°C, 5% CO₂ 및 95% 공기의 습한 분위기에서 1시간동안 배양했다. ^{After seeding MC3T3-E1 cells at 2x10 4} cells/well in each well of a flat-bottomed, 48-well plate, each sample was treated with cells at 37 °C, 5% CO ₂ and 95% air. Incubated for 1 hour in a humid atmosphere.

세포 부착 능력 평가를 위해 DPBS로 부착되지 않은 세포들을 모두 씻어냈다. 세포 배양 배지에 CCK-8 시약을 처리한 후 3시간 동안 배양하고, 각 배지를 분취하여 450 nm 파장대에서의 흡광도를 측정하였다 (도 8).All non-adherent cells were washed with DPBS for evaluation of cell adhesion ability. Cell culture medium was treated with CCK-8 reagent and cultured for 3 hours, and each medium was aliquoted to measure absorbance in a 450 nm wavelength band (FIG. 8).

도 8에 나타난 바와 같이, 실시예 1에 따른 코콜리드 및 실시예 2에 따른 코콜리드 기반의 탄산수산화인회석 샘플 모두 정상적인 세포 부착이 가능하여 골이식재로 적합하다는 것을 확인하였다.As shown in FIG. 8 , it was confirmed that both the cocolid according to Example 1 and the cocolid-based carbonic hydroxyapatite samples according to Example 2 were suitable as a bone graft material because normal cell adhesion was possible.

실험예 3. 코콜리드 및 코콜리드 기반의 탄산수산화인회석에 대한 세포 증식 능력 확인Experimental Example 3. Confirmation of cell proliferation ability for cocolid and cocolid-based carbonic hydroxyapatite

실험예 2와 동일한 방법으로 각 샘플 및 MC3T3-E1 세포를 준비하되, 각 샘플에 혈청을 더 포함시켜 세포 증식 능력을 평가하였다. 실험예 2와 동일한 방법으로 세포에 각 샘플을 처리하고, 24, 48, 72시간 후에 CCK-8 시약을 처리하여 흡광도를 측정하였다 (도 9).Each sample and MC3T3-E1 cells were prepared in the same manner as in Experimental Example 2, but the cell proliferation ability was evaluated by further including serum in each sample. Cells were treated with each sample in the same manner as in Experimental Example 2, and absorbance was measured by treatment with CCK-8 reagent after 24, 48, and 72 hours (FIG. 9).

그 결과, 실시예 1에 따른 코콜리드와 실시예 2에 따른 코콜리드 기반의 탄산수산화인회석 샘플의 경우 세포 증식 초기에 세포 증식 능력이 있음을 확인하여 우수한 골전도능이 있음을 확인하였다.As a result, in the case of the cocolid according to Example 1 and the cocolid-based hydroxyapatite sample according to Example 2, it was confirmed that they had the cell proliferation ability at the initial stage of cell proliferation, thereby confirming that they had excellent osteoconductivity.

실시예 3. 골이식재의 제조Example 3. Preparation of bone graft material

실시예 2에 따라 제조한 코콜리드 기반의 탄산수산화인회석을 실험예 1과 동일한 방법으로 멸균시키고, 코콜리드 (coccolith): 탄산수산화인회석 (CHAp)을 7:3의 중량비로 혼합한 혼합물과 10 중량% 농도의 카르복시메틸 셀룰로오스 수용액을 혼합하여 지름8mm 크기의 쥐 두개골 결손모델 (Rat calvarial defect model)에 적용하였다 (도 10).The cocolide-based hydroxyapatite carbonate prepared according to Example 2 was sterilized in the same manner as in Experimental Example 1, and a mixture of coccolith:carbonate hydroxyapatite (CHAp) in a weight ratio of 7:3 and 10 wt. % concentration of carboxymethyl cellulose aqueous solution was mixed and applied to a rat calvarial defect model having a diameter of 8 mm (Fig. 10).

8주 후 두개골을 재개봉한 결과, 골이식재가 재생된 골로 대체되었음을 확인하였다. As a result of reopening the skull after 8 weeks, it was confirmed that the bone graft material was replaced with regenerated bone.

이상과 같이 실시예를 통하여 본 발명을 설명하였다. 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 상술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로서 이해되어야 한다. 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 등가 개념으로 도출되는 모든 변경 또는 변환된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.As described above, the present invention has been described through examples. Those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains will understand that the present invention may be embodied in other specific forms without changing the technical spirit or essential characteristics thereof. Therefore, the above-described embodiments are to be understood in all respects as illustrative and not restrictive. The scope of the present invention is indicated by the following claims rather than the detailed description, and all changes or converted forms derived from the meaning and scope of the claims and equivalent concepts should be construed as being included in the scope of the present invention.

Claims

cocoli; and
It contains carbonic hydroxyapatite in the form of nano-thick plates, which are located between the cochlids,
Hydroxyapatite carbonate is derived from the hydrothermal reaction of cocolide and ammonium dihydrogen phosphate,
Cocolide and carbonate hydroxyapatite are included in a weight ratio of 7:3 to 9:1,
The carbonate hydroxyapatite has a porous structure and the particle size of the carbonate hydroxyapatite is 100 to 200 nm,
The particle size of the cochlear is 2 to 3 μm, bone graft material.

delete

According to claim 1,
A bone graft material further comprising at least one binder selected from the group consisting of dental resin cement, glass ionomer cement, collagen adhesive, phosphate cement, carboxyl zinc, and protein binder.

According to claim 1,
Antiviral agent, antibacterial agent, antibiotic, anticancer agent, angiogenesis agent, polysaccharide aqueous solution, somatotropin, collagenase, peptidase, oxidase, chondrocytes, bone marrow cells, immunosuppressants, fatty acid esters and selected from the group consisting of nucleic acids A bone graft material further comprising one or more additives.

According to claim 1,
Bone graft material in powder, suspension, emulsion, ointment or injection formulation.

delete

(1) a step of heating an aqueous solution of a mixture of cocolide and ammonium dihydrogen phosphate in which cocolide and ammonium dihydrogen phosphate are mixed in a weight ratio of 1.3:1 to 1.6:1, and heating while maintaining the pH of the aqueous solution at 10 to 14 to do; and
(2) centrifuging the aqueous solution to obtain a precipitate; as a method for producing a bone graft material comprising:
The bone graft material is cocoli; and carbonic hydroxyapatite in the form of nano-thick plates gathered between the cocolids,
The carbonate hydroxyapatite has a porous structure and the particle size of the carbonate hydroxyapatite is 100 to 200 nm,
A method of producing a bone graft material, wherein the particle size of the cocoli is 2 to 3 μm.

delete

11. The method of claim 10,
In step (1), the heating is performed at 80 to 120° C. for 1 to 8 hours, a method for producing a bone graft material.