KR102279854B1 - Negative Microparticles Separator Based on Magnetophoresis and Microparticles Separating Method Using the Same - Google Patents

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Abstract

본 발명은 자기영동을 이용한 음성수집 방식의 미세입자 분리장치 및 그 분리방법에 관한 것으로, 세포와 결합되지 않은 자성입자를 사전에 선택적으로 포획 및 제거하기 위한 미결합 자성입자 포획 디바이스와, 상기 미결합 자성입자 포획 디바이스를 통과한 시료가 빠른 유속의 미세 유체 채널을 통과하면서 자성입자가 결합된 비표적세포를 1차적으로 분리 및 제거하는 제1 미세입자 분리 디바이스와, 상기 제1 미세입자 분리 디바이스를 통과한 시료가 보다 느린 유속의 미세 유체 채널을 통과하면서 자성입자가 결합된 비표적세포를 2차적으로 분리 및 제거하는 제2 미세입자 분리 디바이스를 포함하여, 표적세포의 항원 발현 여부에 관계없이 수집이 가능하고, 우수한 효율로 신속하게 분리가 가능한 효과가 있다.The present invention relates to an apparatus for separating microparticles of a negative collection method using magnetophoresis and a separation method thereof, comprising: an unbound magnetic particle capture device for selectively capturing and removing magnetic particles not bound to cells in advance; A first microparticle separation device that primarily separates and removes non-target cells to which magnetic particles are bound while the sample passing through the binding magnetic particle trapping device passes through a microfluidic channel with a high flow rate, and the first microparticle separation device Including a second microparticle separation device that secondarily separates and removes non-target cells to which magnetic particles are bound while the sample passing through the microfluidic channel passes through a microfluidic channel with a slower flow rate, regardless of whether the target cells are expressing antigens or not. It is possible to collect, and there is an effect that can be separated quickly with excellent efficiency.

Description

자기영동을 이용한 음성수집 방식의 미세입자 분리장치 및 그 분리방법{Negative Microparticles Separator Based on Magnetophoresis and Microparticles Separating Method Using the Same}Negative Microparticles Separator Based on Magnetophoresis and Microparticles Separating Method Using the Same

본 발명은 자기영동을 이용한 음성수집 방식의 미세입자 분리장치 및 그 분리방법에 관한 것이다.The present invention relates to an apparatus for separating fine particles of a sound collection method using magnetophoresis and a method for separating the same.

혈장과 같은 생물학적 샘플로부터 특정의 표적 생체분자를 분리하는 방법으로서, 실리카, 유리섬유, 음이온교환수지 또는 자성 비드를 이용하는 방법이 알려져 있다. 이들 중에서 자성 비드를 이용하는 방법에 따르면, 표면에 표적 생체분자와 결합될 수 있는 프로브를 갖는 자성 비드를 샘플 용액에 투입하여 표적 생체분자를 포획하게 하고, 샘플 용액으로부터 다시 자성 비드를 분리함으로써 표적 생체분자를 추출한다. 이렇게 자성 비드를 이용하여 표적 생체분자를 분리하는 방법 (bead based separation) 방법은 이미 상용화 되어서, 세포, 단백질, 핵산 또는 기타의 생체분자 등을 분리하는데 널리 사용되고 있다. 예를 들면, 미국특허 US 6,893,881에서는 항체가 코팅된 상자성(paramagnetic) 비드를 사용하여 특정 표적 세포를 분리하는 방법을 제시하고 있다.As a method for isolating a specific target biomolecule from a biological sample such as plasma, a method using silica, glass fiber, anion exchange resin or magnetic beads is known. Among them, according to a method using magnetic beads, magnetic beads having a probe capable of binding to a target biomolecule on the surface are introduced into a sample solution to capture the target biomolecule, and the magnetic beads are separated from the sample solution again to separate the target biomolecule. extract molecules. This method of separating target biomolecules using magnetic beads (bead based separation) has already been commercialized and is widely used to separate cells, proteins, nucleic acids, or other biomolecules. For example, US Patent No. 6,893,881 discloses a method for isolating specific target cells using antibody-coated paramagnetic beads.

이러한 자성 비드를 분리하기 위한 고구배 자장(HGMS: high gradient magnetic separation)을 이용하는 자기영동(magnetophoresis) 분리 기술은 간단한 구조와 함께 효율이 높고, 사용이 간편하며, 유전영동(dielectrophoresis)에 비해 가수분해 특성이 없는 장점이 있어 오랫동안 꾸준히 연구되고 있는 분야이다. 이러한 자기영동의 또 다른 장점은 자성입자와 바이오 분석물 간의 생친화적 결합에 의하여 생물적 특이성이 유지되고, 자기영동 힘은 미디어에 의하여 영향받지 않는다는 것이다.Magnetophoresis separation technology using high gradient magnetic separation (HGMS) to separate these magnetic beads has a simple structure, high efficiency, easy to use, and hydrolysis compared to dielectrophoresis. It is a field that has been continuously studied for a long time due to its advantages without characteristics. Another advantage of such magnetophoresis is that the biological specificity is maintained by the biocompatible binding between the magnetic particles and the bioanalyte, and the magnetophoretic force is not affected by the media.

종래 자기 영동 방법은 분리하고자 하는 자성을 가진 시료의 자기 영동 분리를 위해 자기장을 인가하는 자기 에너지원과 상기 외부 자기 에너지원에 의해 인가된 자기장 구배를 증폭하기 위한 자성체 마이크로 구조물 영역을 두고, 분리하고자 하는 자성을 가진 시료에 대해 자기 에너지원에서 자기장을 인가하여 자기 밀도 구배에 따라 분리하는 방식을 사용하고 있다. 일 예로서 한국등록특허 10-0791036호에서는 미세 유체 채널의 옆에 강자성체 구조물을 배치하고, 탄소나노튜브 시료의 흐름에 수직방향으로 외부 자기장을 인가하여 순수한 탄소나노튜브를 분리하는 방법에 대해 개시하고 있다.The conventional magnetophoretic method includes a magnetic energy source that applies a magnetic field for magnetophoretic separation of a sample having a magnetism to be separated and a magnetic microstructure region for amplifying a magnetic field gradient applied by the external magnetic energy source, A method of separating according to a magnetic density gradient by applying a magnetic field from a magnetic energy source to a sample having a magnetic field is used. As an example, Korean Patent No. 10-0791036 discloses a method of separating pure carbon nanotubes by disposing a ferromagnetic structure next to a microfluidic channel and applying an external magnetic field in a direction perpendicular to the flow of a carbon nanotube sample, there is.

그러나, 상기 종래 자기 영동 방법에 사용되는 장치에서 발생하는 구배 자장으로는 미세 입자에 충분한 자기력을 유도하기 어렵고, 그에 따라 미세 입자를 분리하는 효율이 낮으며 시간이 오래 걸리므로, 분리하고자 하는 미세 입자를 시료로부터 분리하여 추출하는 데 사용하는 것은 어렵다는 문제점이 있었다. However, it is difficult to induce a sufficient magnetic force on the fine particles with the gradient magnetic field generated in the apparatus used in the conventional magnetophoresis method, and accordingly, the efficiency of separating the fine particles is low and it takes a long time, so the fine particles to be separated There was a problem in that it was difficult to separate and extract from the sample.

본 출원인은 상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여, 패턴화된 자성체 미세 구조물을 포함하여 분리하고자 하는 미세 입자의 자성이 미약할 경우에도 우수한 효율로 신속하게 분리가 가능한 미세입자 분리장치 및 분리방법을 특허출원하여 등록받은 바 있다(한국등록특허 10-1622342호). In order to solve the conventional problems described above, the present applicant has proposed a fine particle separation device and a separation method capable of rapidly separating with excellent efficiency even when the magnetism of the fine particles to be separated, including the patterned magnetic microstructure, is weak. has been registered for a patent (Korean Patent No. 10-1622342).

그러나, 선행특허는 자성입자가 결합된 표적세포를 자기 영동으로 분리 및 수집하는 양성수집 방식을 적용하였고, 이는 표적세포의 표면 항원 발현 여부에 따라 결합되는 자성 입자 개수가 달라짐에 따라 자기 영동으로 수집되는 표적세포의 분리 효율이 결정되는데, 선행특허의 경우 표적세포(혈중암세포)는 암이 전이 되는 과정에서 표면 항원의 발현이 줄어들거나 없어지는 현상이 발생하여 표적세포 수집 효율에 한계가 있는 단점이 있었다.However, the prior patent applied a positive collection method that separates and collects target cells to which magnetic particles are bound by magnetophoresis, which is collected by magnetophoresis as the number of bound magnetic particles varies depending on whether the target cells express surface antigens or not. The efficiency of separation of target cells is determined. In the case of prior patents, the expression of surface antigens of target cells (blood cancer cells) decreases or disappears in the process of cancer metastasis, so there is a limitation in the efficiency of collecting target cells. there was.

예를 들면, 표적세포(혈중암세포)의 표면항원 중에서, 양성수집 과정에서 대부분 표적으로 많이 사용하는 EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule)항원의 경우에, 암이 전이되는 과정에서 EMT(Epithelial-mesenchymal transition)에 의해 EpCAM의 발현이 줄어들거나 없어진다. 또한, melanoma와 같은 피부암의 경우에는 EpCAM 발현이 없어 양성수집 방식이 한계가 있는 것이다.For example, among surface antigens of target cells (blood cancer cells), in the case of EpCAM (Epithelial cell adhesion molecule) antigens, which are mostly used as targets in the positive collection process, EMT (Epithelial-mesenchymal transition) occurs during cancer metastasis. EpCAM expression is reduced or eliminated by In addition, in the case of skin cancers such as melanoma, there is no EpCAM expression, so the positive collection method is limited.

따라서, EpCAM와 같이 암이 전이 되는 과정에서 표면항원의 발현이 줄어들거나 없어지는 현상으로 인해 수집 효율이 떨어지는 문제점을 해결하고자, 본 출원인은 이에 대한 연구를 거듭하여 본 발명을 완성하게 되었다. Therefore, in order to solve the problem of decreased collection efficiency due to the phenomenon that the expression of surface antigen is reduced or disappeared during cancer metastasis, such as EpCAM, the present applicant has completed the present invention by repeating research on this.

한국등록특허 10-1622342호Korean Patent No. 10-1622342

이에 본 발명은 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 자성입자가 결합된 비표적세포를 자기 영동으로 분리 및 제거하는 음성수집 방식을 이용함으로써, 표적세포의 항원 발현 여부에 관계없이 수집이 가능하고, 우수한 효율로 신속하게 분리가 가능한 자기영동을 이용한 음성수집 방식의 미세입자 분리장치 및 그 분리방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. Therefore, in order to solve this problem, the present invention uses a negative collection method that separates and removes non-target cells to which magnetic particles are bound by magnetic migration, so that collection is possible regardless of antigen expression of target cells, and excellent efficiency An object of the present invention is to provide an apparatus for separating fine particles of a sound collection method using magnetophoresis, which can be quickly separated by a furnace, and a separation method thereof.

상기와 같은 목적들을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 미세 유체 채널이 형성되는 상부 기판과, 패턴화된 자성체 미세 구조물을 포함하는 하부 기판과, 상기 패턴화된 자성체 미세 구조물 주위에 자기장을 발생시키는 외부 자기장원을 갖는 미세입자 분리 디바이스를 적어도 한 개 이상 포함하고, 상기 미세 유체 채널은 자성입자가 결합된 비표적세포를 포함하는 시료가 주입되는 시료 주입부와, 버퍼가 주입되는 버퍼 주입부와, 상기 미세 유체 채널을 통과하면서 자기영동에 의해 분리된 비표적세포를 배출하는 비표적세포 배출부와, 상기 미세 유체 채널을 통과한 나머지 표적세포를 포획하여 수집하는 표적세포 수집부를 포함하여 상기 미세 유체 채널을 통해 자성입자가 결합된 비표적세포를 분리 및 제거하는 것을 특징으로 하는 자기영동을 이용한 음성수집 방식의 미세입자 분리장치가 제공된다.In order to achieve the above objects, in the present invention, an upper substrate on which a microfluidic channel is formed, a lower substrate including a patterned magnetic microstructure, and an external magnetic field generating a magnetic field around the patterned magnetic microstructure are provided. at least one microparticle separation device having a circle, wherein the microfluidic channel includes a sample injection unit into which a sample containing non-target cells to which magnetic particles are bound is injected, a buffer injection unit into which a buffer is injected, and the microfluidic channel includes: The microfluidic channel, including a non-target cell discharge unit for discharging non-target cells separated by magnetophoresis while passing through the microfluidic channel, and a target cell collection unit for capturing and collecting the remaining target cells that have passed through the microfluidic channel There is provided an apparatus for separating fine particles of a negative collection method using magnetophoresis, characterized in that it separates and removes non-target cells to which magnetic particles are bound.

본 발명에 있어서, 상기 미세 유체 채널을 통과하기 전 세포와 결합되지 않은 자성입자를 선택적으로 포획 및 제거하기 위한 미결합 자성입자 포획 디바이스가 더 포함될 수 있다. In the present invention, an unbound magnetic particle trapping device for selectively capturing and removing magnetic particles that are not bound to cells before passing through the microfluidic channel may be further included.

상기 미결합 자성입자 포획 디바이스는 폭 또는 높이가 점차 넓어지거나 깊어지는 형태의 채널이 형성되어 주입부에서 배출부로 갈수록 유속이 점차 느려지는 형태의 상부 기판과, 하부 기판과, 상기 하부 기판의 저면에 구비되어 상기 채널 주위에 자기장을 발생시키는 외부 자기장원을 포함한다. The uncoupled magnetic particle trapping device includes an upper substrate, a lower substrate, and a lower surface of the lower substrate in which a channel is formed in a form in which the width or height is gradually widened or deepened so that the flow rate gradually becomes slower from the injection part to the discharge part. and an external magnetic field source for generating a magnetic field around the channel.

여기서, 상기 채널은 주입구에서 배출구로 갈수록 유속이 느려지는 형태라면 다양한 구조가 적용가능하며, 본 발명에서는 채널의 폭 또는 높이가 점차 넓어지거나 깊어지는 형태를 가지면서도 평면 상에서 굴곡진 지그재그 구조로 형성됨으로써, 채널 전반에 걸쳐 자성입자가 균등하게 포획될 수 있도록 한다. Here, various structures are applicable as long as the channel has a form in which the flow rate becomes slower from the inlet to the outlet, and in the present invention, the width or height of the channel is gradually widened or deepened while being formed in a curved zigzag structure on a plane, It allows the magnetic particles to be captured evenly throughout the channel.

여기서, 상기 외부 자기장원은 다중 겹으로 이루어지는 영구자석인 것을 특징으로 한다. Here, the external magnetic field source is characterized in that the permanent magnet consisting of multiple layers.

본 발명에서, 상기 미세입자 분리 디바이스는 제1 미세입자 분리 디바이스 내지 제n 미세입자 분리 디바이스를 포함하며, 상기 제1 미세입자 분리 디바이스는 상기 미세 유체 채널이 좁게 이루어지어 빠른 유속으로 통과하고, 상기 제n 미세입자 분리 디바이스는 제n-1 미세입자 분리 디바이스 보다 상기 미세 유체 채널이 넓게 이루어지어 제n-1 미세입자 분리 디바이스의 채널 보다 느린 유속으로 통과하도록 구성될 수 있다. 여기서, n은 2 이상의 정수이다. In the present invention, the fine particle separation device includes a first fine particle separation device to an nth fine particle separation device, and the first fine particle separation device has a narrow microfluidic channel to pass through at a high flow rate, The n-th fine particle separation device may be configured such that the microfluidic channel is wider than that of the n-1th fine particle separation device, so that it passes at a slower flow rate than the channel of the n-1 th fine particle separation device. Here, n is an integer of 2 or more.

이 경우, 상기 미세입자 분리 디바이스의 채널은 폭 뿐 아니라 높이의 장단(長短)을 통해 빠른 유속 또는 느린 유속을 갖도록 형성될 수 있다. In this case, the channel of the fine particle separation device may be formed to have a fast flow rate or a slow flow rate through long and short lengths as well as width.

또한, 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 세포와 결합되지 않은 자성입자를 사전에 선택적으로 포획 및 제거하기 위한 미결합 자성입자 포획 디바이스와, 상기 미결합 자성입자 포획 디바이스를 통과한 시료가 빠른 유속의 미세 유체 채널을 통과하면서 자성입자가 결합된 비표적세포를 1차적으로 분리 및 제거하는 제1 미세입자 분리 디바이스와, 상기 제1 미세입자 분리 디바이스를 통과한 시료가 보다 느린 유속의 미세 유체 채널을 통과하면서 자성입자가 결합된 비표적세포를 2차적으로 분리 및 제거하는 제2 미세입자 분리 디바이스를 포함할 수 있다. In addition, in order to achieve the above object, in the present invention, an unbound magnetic particle trapping device for selectively capturing and removing magnetic particles not bound to cells in advance, and a sample passing through the unbound magnetic particle trapping device A first microparticle separation device that primarily separates and removes non-target cells to which magnetic particles are bound while passing through a microfluidic channel having a high flow rate, and the sample passing through the first microparticle separation device is subjected to a slower flow rate. It may include a second microparticle separation device for secondarily separating and removing non-target cells to which magnetic particles are bound while passing through the microfluidic channel.

상기 제1 미세입자 분리 디바이스의 표적세포 수집부와 제2 미세입자 분리 디바이스의 시료 주입부가 관으로 연결되어, 빠른 유속의 제1 미세입자 분리 디바이스의 자기 영동 구간에서 자성입자가 많이 결합된 대부분의 비표적세포를 분리 및 제거시키고, 느린 유속의 제2 미세입자 분리 디바이스의 자기 영동 구간에서 자성입자가 적게 붙은 세포에 강자성 패턴의 자기력을 더 강하게 작용하여 분리 및 제거시킴으로써, 높은 순도의 표적세포를 유체 흐름을 따라 수집할 수 있게 된다. The target cell collection unit of the first fine particle separation device and the sample injection unit of the second fine particle separation device are connected by a tube, so that most of the magnetic particles in the magnetophoresis section of the high flow rate first fine particle separation device are mostly bound. By separating and removing non-target cells, and separating and removing the magnetic force of the ferromagnetic pattern on cells with fewer magnetic particles in the magnetophoresis section of the second microparticle separation device at a slow flow rate, high-purity target cells are obtained. It becomes possible to collect along the fluid flow.

또한, 상기 미결합 자성입자 포획 디바이스는 폭 또는 높이가 점차 넓어지거나 깊어지는 형태의 채널이 형성되어 주입부에서 배출부로 갈수록 유속이 점차 느려지는 형태의 상부 기판과, 하부 기판과, 상기 하부 기판의 저면에 구비되어 상기 채널 주위에 자기장을 발생시키는 외부 자기장원을 포함하며, 상기 채널은 평면 상에서 굴곡진 지그재그 구조를 가지며, 주입부에서 배출부로 갈수록 유속이 점차 느려지는 형태로 이루어짐으로써 채널 전반에 걸쳐 자성입자가 균등하게 포획될 수 있다. In addition, the uncoupled magnetic particle trapping device includes an upper substrate, a lower substrate, and a bottom surface of the lower substrate in which a channel is formed in which the width or height is gradually widened or deepened so that the flow rate is gradually decreased from the injection part to the discharge part. and an external magnetic field source provided in the channel to generate a magnetic field around the channel, the channel has a curved zigzag structure on a plane, and the flow rate gradually decreases from the injection part to the exhaust part, so that the magnetic field is formed throughout the channel. Particles can be entrapped evenly.

한편, 상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 세포와 결합되지 않은 자성입자를 사전에 선택적으로 포획 및 제거하기 위해 미결합 자성입자 포획 디바이스를 통과하는 제1 단계와, 상기 미결합 자성입자 포획 디바이스를 통과한 시료가 제1 미세입자 분리 디바이스의 폭이 좁은 미세 유체 채널을 통과하면서 자성입자가 결합된 비표적세포를 1차적으로 분리 및 제거하는 제2 단계와, 상기 제1 미세입자 분리 디바이스를 통과한 시료가 제2 미세입자 분리 디바이스의 폭이 넓은 미세 유체 채널을 통과하면서 자성입자가 결합된 비표적세포를 2차적으로 분리 및 제거하는 제3 단계를 포함하는 자기영동을 이용한 음성수집 방식의 미세입자 분리방법이 제공된다.On the other hand, in order to achieve the object of the present invention as described above, a first step of passing through an unbound magnetic particle trapping device in order to selectively capture and remove magnetic particles not bound to cells in advance, and the unbound magnetic particles A second step of primarily separating and removing non-target cells to which magnetic particles are bound while the sample passing through the capture device passes through the narrow microfluidic channel of the first microparticle separation device; Speech collection using magnetophoresis, comprising a third step of secondary separation and removal of non-target cells to which magnetic particles are bound while the sample that has passed through the device passes through the wide microfluidic channel of the second microparticle separation device A method for separating fine particles is provided.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 자성입자가 결합된 비표적세포를 자기 영동으로 분리 및 제거하는 음성수집 방식을 이용함으로써, 표적세포의 항원 발현 여부에 관계없이 수집이 가능하고, 우수한 효율로 신속하게 분리가 가능한 효과가 있다.As described above, in the present invention, by using a negative collection method that separates and removes non-target cells to which magnetic particles are bound by magnetophoresis, collection is possible regardless of whether the target cells are expressing antigens, and it is possible to collect them quickly with excellent efficiency. It has a separable effect.

도 1은 본 발명의 음성수집 방식으로 미세입자를 분리하는 개념을 도시한 도면이다.
도 2 내지 도 3은 음성수집 방식의 필요성을 설명하기 위한 것으로, 도 2는 표적세포의 표면 항원 발현 여부에 따른 양성수집 방식을 나타내며, 도 3은 본 발명의 비표적세포 표면에 일정하게 발현되는 항원에 자성입자를 결합시키는 음성수집 방식을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 미세입자 분리 디바이스의 일실시예를 도시한 평면도이다.
도 5는 본 발명의 미세입자 분리 디바이스의 일실시예를 도시한 분해 사시도이다.
도 6은 본 발명의 음성수집 방식의 미세입자 분리장치의 일실시예를 도시한 분해사시도이다.
도 7은 본 발명에서 미결합 자성입자 포획 디바이스의 상부 기판을 도시한 평면도이다.
도 8은 본 발명의 미결합 자성입자 포획 디바이스의 실제 제품을 나타낸 사진이다.
도 9는 본 발명의 자기영동을 이용한 음성수집 방식의 미세입자 분리방법을 나타내는 순서도이다.
도 10 내지 도 11은 본 발명의 자기영동을 이용한 음성수집 방식의 미세입자 분리장치의 성능 평가를 나타내는 그래프로서, 도 10은 암세포 종류별 항원 발현율을 나타내는 그래프이고, 도 11은 혈중암세포가 수집된 회수율을 평가하는 그래프이다. 1 is a view showing the concept of separating fine particles by the sound collection method of the present invention.
2 to 3 are for explaining the need for a negative collection method, Figure 2 shows a positive collection method according to whether the surface antigen expression of the target cell, Figure 3 is a constant expression on the surface of the non-target cell of the present invention It represents a negative collection method that binds magnetic particles to an antigen.
4 is a plan view showing an embodiment of the device for separating fine particles of the present invention.
5 is an exploded perspective view showing an embodiment of the device for separating fine particles of the present invention.
6 is an exploded perspective view showing an embodiment of the apparatus for separating fine particles of the sound collection method of the present invention.
7 is a plan view showing an upper substrate of an unbound magnetic particle trapping device in the present invention.
8 is a photograph showing an actual product of the unbound magnetic particle trapping device of the present invention.
9 is a flowchart illustrating a method for separating fine particles of a voice collection method using magnetophoresis according to the present invention.
10 to 11 are graphs showing the performance evaluation of the apparatus for separating microparticles of a negative collection method using magnetophoresis of the present invention. FIG. 10 is a graph showing the antigen expression rate for each type of cancer cell, and FIG. is a graph that evaluates

이하에서는 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예에 대해 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다. Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings. However, the present invention is not limited to the embodiments disclosed below, but will be implemented in various different forms, only this embodiment allows the disclosure of the present invention to be complete, and the scope of the invention to those of ordinary skill in the art completely It is provided to inform you.

도 1은 본 발명의 음성수집 방식으로 미세입자를 분리하는 개념을 도시한 도면이고, 도 2 내지 도 3은 음성수집 방식의 필요성을 설명하기 위한 것으로, 도 2는 표적세포의 표면 항원 발현 여부에 따른 양성수집 방식을 나타내며, 도 3은 본 발명의 비표적세포 표면에 일정하게 발현되는 항원에 자성입자를 결합시키는 음성수집 방식을 나타낸다. 1 is a diagram illustrating the concept of separating microparticles by the negative collection method of the present invention, and FIGS. 2 to 3 are for explaining the necessity of the negative collection method, and FIG. 2 is a view showing the surface antigen expression of the target cells. Figure 3 shows a negative collection method in which magnetic particles are bound to antigens constantly expressed on the surface of non-target cells of the present invention.

본 발명의 미세입자 분리장치는 자기 영동을 이용한다는 점에서는 같으나, 자성입자가 결합된 표적세포(예를 들어, 혈중암세포)를 자기 영동으로 분리 및 수집하는 양성수집 방식이 아니라, 자성입자가 결합된 비표적세포(예를 들어, 백혈구)를 자기 영동으로 분리 및 제거하는 음성수집 방식이라는 것이 가장 큰 특징이다. The apparatus for separating fine particles of the present invention is the same in that it uses magnetophoresis, but it is not a positive collection method that separates and collects target cells (eg, blood cancer cells) to which magnetic particles are bound, but magnetic particles are bound. The biggest feature is that it is a negative collection method that separates and removes non-target cells (eg, leukocytes) by magnetophoresis.

구체적으로, 본 발명에서는 시료 내 비표적세포에 자성입자를 결합하여 자기 영동 구간을 시료가 통과하면서 강자성 패턴에 의해 자성입자가 결합된 비표적세포가 분리되고, 나머지 표적세포를 수집하는 방식을 취한다. Specifically, in the present invention, the non-target cells to which the magnetic particles are bound are separated by a ferromagnetic pattern while the sample passes through the magnetophoresis section by binding the magnetic particles to the non-target cells in the sample, and the remaining target cells are collected. do.

도 2에 도시한 바와 같이, 양성수집 방식은 표적세포의 표면 항원 발현 여부에 따라 결합되는 자성 입자 개수가 달라지는데, 이에 따라 자기 영동으로 수집되는 표적세포의 분리 효율이 결정되는 단점이 있다. 즉, 표적세포의 표면 항원 발현 여부에 따라 자기영동이 잘 되는 표적세포(왼편)와 자기 영동이 안되는 표적세포(오른편)으로 나뉘게 된다. As shown in FIG. 2 , the positive collection method has a disadvantage in that the number of magnetic particles to be bound varies depending on whether or not the surface antigen is expressed on the target cells, and thus the separation efficiency of the target cells collected by magnetophoresis is determined. That is, depending on the expression of the surface antigen of the target cell, it is divided into a target cell with good magnetic migration (left side) and a target cell with poor magnetic migration (right side).

본 출원인의 연구분야에서의 표적세포는 혈중암세포로서, 암이 전이되는 과정에서 표면 항원의 발현이 줄어들거나 없어져 기존에 특허등록된 양성수집 방식으로는 표적세포 수집 효율에 한계가 있었다.The target cells in the present applicant's research field are blood cancer cells, and the expression of surface antigens is reduced or eliminated during cancer metastasis, so the previously patented positive collection method has a limitation in the efficiency of target cell collection.

그러나, 본 발명의 음성수집 방식은 도 3에서 보는 바와 같이, 표적세포가 아닌 비표적세포 표면에 일정하게 발현되는 항원에 자성입자를 결합시키고, 이를 자기 영동으로 분리 및 제거 시킴으로써, 표적세포(혈중암세포)는 항원의 발현 여부에 의존하지 않고 모두 수집될 수 있는 효과가 발생한다. However, as shown in FIG. 3, the negative collection method of the present invention binds magnetic particles to antigens constantly expressed on the surface of non-target cells rather than target cells, and separates and removes them by magnetic migration, thereby allowing target cells (blood in the blood). Cancer cells) have the effect that they can all be collected regardless of whether the antigen is expressed or not.

통상, 암이 발병하면 암이 발병된 부위에서 떨어져 나온 암세포가 혈관을 타고 돌아다니다가 다른 부위에 정착하여 전이를 일으키는데, 이때, 혈액속에 존재하는 암세포(혈중암세포)가 암의 진단 및 예후에 중요한 바이오 마커로 각광 받고 있다. In general, when cancer develops, cancer cells separated from the site of cancer travel through blood vessels and settle in other areas to cause metastasis. At this time, cancer cells in the blood (blood cancer cells) are important for diagnosis and prognosis of cancer. It is in the spotlight as a biomarker.

하지만, 혈중암세포는 1mL 혈액 속에 1-10개 정도 밖에 존재하지 않는 희귀세포로서, 혈중암세포 분리 기술이 중요하며, 혈중암세포가 1mL 혈액 속에 1-10개 존재하는 것에 비해, 백혈구는 1mL 혈액 속에 5000000개 존재한다.(1-10개 혈중암세포/mL, 5000000개 백혈구/mL)However, blood cancer cells are rare cells with only 1-10 cells in 1 mL of blood, and the technology for separating blood cancer cells is important. Compared to 1-10 blood cancer cells in 1 mL of blood, leukocytes have 5,000,000 cells in 1 mL of blood. (1-10 blood cancer cells/mL, 5000000 leukocytes/mL)

이에 따라, 본 발명은 혈액 속에 존재하는 백혈구를 자기영동으로 분리 및 제거하고 나머지 표적세포인 혈중암세포를 수집하는 방식을 채택하였다. Accordingly, the present invention adopts a method of separating and removing leukocytes present in the blood by magnetophoresis, and collecting the remaining target cells, blood cancer cells.

<실시예><Example>

도 4는 본 발명의 미세입자 분리 디바이스의 일실시예를 도시한 평면도이고, 도 5는 본 발명의 미세입자 분리 디바이스의 일실시예를 도시한 분해 사시도이다. Figure 4 is a plan view showing an embodiment of the fine particle separation device of the present invention, Figure 5 is an exploded perspective view showing an embodiment of the fine particle separation device of the present invention.

본 발명의 일실시예로 제시한 미세입자 분리 디바이스를 도 4 내지 도 5를 참조로 설명한다. A device for separating fine particles according to an embodiment of the present invention will be described with reference to FIGS. 4 to 5 .

상기 미세입자 분리 디바이스(100)는 미세 유체 채널(122)이 형성되는 상부 기판(120)과, 패턴화된 자성체 미세 구조물(112)을 포함하는 하부 기판(110)과, 상기 패턴화된 자성체 미세 구조물(112) 주위에 자기장을 발생시키는 외부 자기장원(130)을 갖는다. The microparticle separation device 100 includes an upper substrate 120 on which a microfluidic channel 122 is formed, a lower substrate 110 including a patterned magnetic microstructure 112 , and the patterned magnetic microstructure. It has an external magnetic field source 130 that generates a magnetic field around the structure 112 .

상기 미세 유체 채널(122)은 자성입자가 결합된 비표적세포를 포함하는 시료가 주입되는 시료 주입부(124)와, 버퍼가 주입되는 버퍼 주입부(125)와, 상기 미세 유체 채널(122)을 통과하면서 자기영동에 의해 분리된 비표적세포를 배출하는 비표적세포 배출부(127)와, 상기 미세 유체 채널(122)을 통과한 나머지 표적세포를 포획하여 수집하는 표적세포 수집부(126)를 포함하여, 상기 미세 유체 채널(122)을 통해 자성입자가 결합된 비표적세포를 분리 및 제거한다. The microfluidic channel 122 includes a sample injection unit 124 into which a sample containing non-target cells to which magnetic particles are bound, a buffer injection unit 125 into which a buffer is injected, and the microfluidic channel 122 . A non-target cell discharge unit 127 for discharging non-target cells separated by magnetophoresis while passing through, and a target cell collection unit 126 for capturing and collecting the remaining target cells that have passed through the microfluidic channel 122. Including, separating and removing non-target cells to which magnetic particles are bound through the microfluidic channel 122 .

본 발명에 있어서, 상기 자성체 미세 구조물(112)은 복수개의 선형 구조물이고, 상기 미세 유체 채널(122) 영역에서 시료의 흐름 방향에 대한 소정의 경사각을 갖도록 상기 하부 기판(110)에 패턴 형성되어 포함된다.In the present invention, the magnetic microstructure 112 is a plurality of linear structures, and a pattern is formed on the lower substrate 110 to have a predetermined inclination angle with respect to the flow direction of the sample in the microfluidic channel 122 region. do.

본 발명에 있어서는 상기 자성체 미세 구조물(112)이 몰딩 방식에 의해 패턴 형성되어 하부 기판(110) 내부에 포함되므로, 상기 자성체 미세 구조물(112)이 시료와 직접 접촉하지 않으면서도 상기 자성체 미세 구조물 주위에 형성된 자기력이 미세 입자에 직접적으로 전달될 수 있게 된다.In the present invention, since the magnetic microstructure 112 is patterned by a molding method and included in the lower substrate 110, the magnetic microstructure 112 is placed around the magnetic microstructure without directly contacting the sample. The formed magnetic force can be directly transmitted to the fine particles.

이와 같은 구성을 갖는 미세입자 분리 디바이스(100)는 시료 내 자성입자가 결합된 비표적세포가 상기 미세 유체 채널(122)을 통과하면서 자기영동에 의해 분리되어 비표적세포 배출부(127)를 통해 배출되고, 상기 미세 유체 채널(122)을 통과한 나머지 표적세포는 표적세포 수집부(126)를 통해 수집되어 표적세포를 모두 수집할 수 있게 된다. In the microparticle separation device 100 having such a configuration, the non-target cells to which the magnetic particles in the sample are bound pass through the microfluidic channel 122 and are separated by magnetic migration through the non-target cell discharge unit 127 . The remaining target cells that are discharged and passed through the microfluidic channel 122 are collected through the target cell collecting unit 126 to collect all of the target cells.

한편, 본 발명의 음성수집 방식의 미세입자 분리장치는 상기 미세입자 분리 디바이스(100)가 복수개 연결될 수 있으며, 상기 미세 유체 채널(122)을 통과하기 전 세포와 결합되지 않은 자성입자를 먼저 선택적으로 포획 및 제거할 수 있는 구성을 더 포함할 수 있다. On the other hand, in the apparatus for separating microparticles of the negative collection method of the present invention, a plurality of the microparticle separation devices 100 may be connected, and the magnetic particles that are not bound to cells are first selectively separated before passing through the microfluidic channel 122 . Capturing and removable features may be further included.

도 6은 본 발명의 음성수집 방식의 미세입자 분리장치의 일실시예를 도시한 분해사시도이고, 도 7은 본 발명에서 미결합 자성입자 포획 디바이스의 상부 기판을 도시한 평면도이다.6 is an exploded perspective view showing an embodiment of the apparatus for separating fine particles of a voice collecting method of the present invention, and FIG. 7 is a plan view showing an upper substrate of the unbound magnetic particle trapping device in the present invention.

본 발명의 음성수집 방식의 미세입자 분리장치는 도 6에 도시한 바와 같이, 세포와 결합되지 않은 자성입자를 사전에 선택적으로 포획 및 제거하기 위한 미결합 자성입자 포획 디바이스(10)와, 상기 미결합 자성입자 포획 디바이스(10)를 통과한 시료가 빠른 유속의 미세 유체 채널(122)을 통과하면서 자성입자가 결합된 비표적세포를 1차적으로 분리 및 제거하는 제1 미세입자 분리 디바이스(100)와, 상기 제1 미세입자 분리 디바이스(100)를 통과한 시료가 보다 느린 유속의 미세 유체 채널(222)을 통과하면서 자성입자가 결합된 비표적세포를 2차적으로 분리 및 제거하는 제2 미세입자 분리 디바이스(200)를 포함할 수 있다. As shown in FIG. 6, the apparatus for separating fine particles of the negative collection method of the present invention includes an unbound magnetic particle capture device 10 for selectively capturing and removing magnetic particles not bound to cells in advance; A first microparticle separation device 100 that primarily separates and removes non-target cells to which magnetic particles are bound while the sample passing through the binding magnetic particle trapping device 10 passes through the microfluidic channel 122 with a high flow rate and second microparticles for secondary separation and removal of non-target cells to which magnetic particles are bound while the sample passing through the first microparticle separation device 100 passes through the microfluidic channel 222 with a slower flow rate A separation device 200 may be included.

여기서, 본 발명의 미세입자 분리장치는 2개 이상의 디바이스를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 제1 미세입자 분리 디바이스(100) 내지 제n 미세입자 분리 디바이스를 포함할 수 있으며, 이 경우, 상기 제n 미세입자 분리 디바이스는 제n-1 미세입자 분리 디바이스 보다 상기 미세 유체 채널이 넓게 이루어지어 제n-1 미세입자 분리 디바이스의 채널 보다 느린 유속으로 통과하도록 구성될 수 있다. 여기서, n은 2 이상의 정수이다. Here, the apparatus for separating fine particles of the present invention may further include two or more devices. For example, it may include a first fine particle separation device 100 to an nth fine particle separation device, in which case, the nth fine particle separation device is the microfluidic channel rather than the n-1th fine particle separation device. This is made wide and can be configured to pass at a flow rate slower than the channel of the n-1 th fine particle separation device. Here, n is an integer of 2 or more.

상기 미결합 자성입자 포획 디바이스(10)는 채널(22)이 형성된 상부 기판(20)과, 하부 기판(12)과, 상기 하부 기판(12)의 저면에 구비되어 상기 채널(22) 주위에 자기장을 발생시키는 외부 자기장원(30)을 포함한다. The uncoupled magnetic particle trapping device 10 includes an upper substrate 20 having a channel 22 formed thereon, a lower substrate 12 , and a bottom surface of the lower substrate 12 to surround the channel 22 with a magnetic field. and an external magnetic field source 30 for generating

상기 미결합 자성입자 포획 디바이스(10)는 결합되지 않은 자성입자를 사전에 포획하는 구조를 갖도록, 상기 채널(22)은 폭 또는 높이가 점차 넓어지거나 깊어지는 형태로 이루어진다. 즉, 주입부(23)에서 배출부(24)로 갈수록 채널(22)이 넓거나 깊게 형성되어 시료의 유속이 점차 느려지는 형태인 것이다. The uncoupled magnetic particle trapping device 10 has a structure to trap unbound magnetic particles in advance, and the channel 22 has a shape in which the width or height is gradually widened or deepened. That is, the channel 22 is formed wider or deeper as it goes from the injection unit 23 to the discharge unit 24 so that the flow rate of the sample is gradually slowed down.

이러한 상기 채널(22)은 평면 상에서 굴곡진 지그재그 구조를 가지는 것이 바람직하며, 주입부(23)에서 배출부(24)로 갈수록 유속이 점차 느려지는 형태로 이루어짐으로써 채널 전반에 걸쳐 자성입자가 균등하게 포획될 수 있는 것을 특징으로 한다.The channel 22 preferably has a curved zigzag structure on a plane, and the flow rate gradually decreases from the inlet 23 to the outlet 24 so that the magnetic particles are evenly distributed throughout the channel. It is characterized in that it can be captured.

만약, 세포와 결합되지 않은 자성입자가 자기 영동 구간의 강자성 패턴에 포획되면 자성입자가 붙은 세포의 분리 효율을 저하 시킬 수 있으므로, 사전에 선택적으로 포획 및 제거함으로 인해 강자성 패턴의 자기 영동 효율이 증대된다. If magnetic particles not bound to cells are captured by the ferromagnetic pattern in the magnetophoresis section, the separation efficiency of the cells to which the magnetic particles are attached can be reduced. Therefore, by selectively capturing and removing them in advance, the magnetophoretic efficiency of the ferromagnetic pattern is increased. do.

상기 외부 자기장원(30)은 다중 겹으로 이루어지는 영구자석으로 될 수 있으며, 상기 미결합 자성입자 포획 디바이스(10)를 시료가 통과하면서 크기가 작은 자성입자는 시료 흐름 방향 힘을 약하게 받고, 영구자석(30)에 의한 자기력을 더 크게 받아 선택적으로 포획될 수 있다. The external magnetic field source 30 may be a permanent magnet consisting of multiple layers, and as the sample passes through the uncoupled magnetic particle trapping device 10 , the small magnetic particles receive weak sample flow direction force, and a permanent magnet (30) can be selectively captured by receiving a larger magnetic force.

이때, 이 구간은 강자성 패턴 구조물이 없으므로 자기장이 미세입자 분리 디바이스(100)의 자기 영동 구간보다 약해 자성 입자가 결합된 세포는 포획되지 않는다. In this case, since there is no ferromagnetic pattern structure in this section, the magnetic field is weaker than the magnetophoretic section of the microparticle separation device 100 , so that the cells to which the magnetic particles are bound are not captured.

또한, 채널(22)의 초반, 좁은 구간(w)에서는 강한 자성을 가지거나 시료가 흐를 때 바닥 부근을 지나가며 영구 자석(30)과 가까운 일부 자성입자가 포획되며, 뒤로 갈수록 넓어지는 구간(W)에서는 약한 자성을 가지거나 처음에 포획되지 않은 자성입자가 느린 유속에서 자기력을 더 크게 받아 포획된다. In addition, in the early, narrow section (w) of the channel (22), some magnetic particles having strong magnetism or passing near the bottom when the sample flows and close to the permanent magnet (30) are captured, and the section (W) that becomes wider toward the rear ), magnetic particles that have weak magnetism or are not initially captured are captured by receiving a greater magnetic force at a slow flow rate.

이로 인해, 채널(22) 전반에 걸쳐 자성입자가 균등하게 포획될 수 있다. 만약 채널(22)의 폭이 일정(w=W)하다면, 자기력을 받는 첫 위치에 자성입자가 쌓여 채널(22)을 막히게 할 염려가 있으며, 본 발명의 채널(22)은 유속을 조절할 수 있는 구조로 설계하여 채널(22) 전반에 걸쳐 자성입자가 균등하게 포획될 수 있다. Due to this, the magnetic particles may be uniformly captured throughout the channel 22 . If the width of the channel 22 is constant (w = W), there is a fear that magnetic particles are accumulated at the first position receiving the magnetic force and clog the channel 22, and the channel 22 of the present invention can control the flow rate. By designing the structure, magnetic particles can be uniformly captured throughout the channel 22 .

도 8은 본 발명의 미결합 자성입자 포획 디바이스의 실제 제품을 나타낸 사진으로, 미결합 자성입자 포획 디바이스(10)를 통과한 시료에서 균등하게 자성입자가 포획되는 것을 확인할 수 있다. 8 is a photograph showing an actual product of the unbound magnetic particle trapping device of the present invention, and it can be confirmed that the magnetic particles are equally captured in the sample that has passed through the unbound magnetic particle trapping device 10 .

한편, 상기 제1 미세입자 분리 디바이스(100)의 미세 유체 채널(122)은 미결합 자성입자 포획 디바이스(10)를 통과한 시료가 빠른 유속으로 흐르도록 좁은 폭의 채널(122)로 형성되고, 상기 제2 미세입자 분리 디바이스(200)의 미세 유체 채널(222)은 상기 제1 미세입자 분리 디바이스(100)를 통과한 시료가 보다 느린 유속으로 흐르도록 보다 넓은 폭의 채널로 형성된다. On the other hand, the microfluidic channel 122 of the first microparticle separation device 100 is formed as a narrow channel 122 so that the sample passing through the uncoupled magnetic particle trapping device 10 flows at a high flow rate, The microfluidic channel 222 of the second fine particle separation device 200 is formed as a channel having a wider width so that the sample passing through the first fine particle separation device 100 flows at a slower flow rate.

이 경우, 상기 미세입자 분리 디바이스(100)(200)의 채널(122)(222)은 폭 뿐 아니라 높이의 장단(長短)을 통해 빠른 유속 또는 느린 유속을 갖도록 형성될 수도 있다. In this case, the channels 122 and 222 of the microparticle separation devices 100 and 200 may be formed to have a high flow rate or a slow flow velocity through long and short lengths as well as width.

한편, 상기 미결합 자성입자 포획 디바이스(10), 제1 미세입자 분리 디바이스(100), 제2 미세입자 분리 디바이스(200)는 시료가 순차적으로 통과할 수 있도록 각 채널이 연결되어야 한다. On the other hand, each channel of the unbound magnetic particle trapping device 10 , the first fine particle separation device 100 , and the second fine particle separation device 200 must be connected so that the sample can pass therein sequentially.

이를 위해, 상기 미결합 자성입자 포획 디바이스(10)의 배출부(24)와 제1 미세입자 분리 디바이스(100)의 시료 주입부(124)가 관(310)으로 연결되고, 상기 제1 미세입자 분리 디바이스(100)의 표적세포 수집부(126)와 제2 미세입자 분리 디바이스(200)의 시료 주입부(224)가 관(320)으로 연결되어, 세포와 결합되지 않은 자성입자를 제거한 후, 빠른 유속의 제1 미세입자 분리 디바이스(100)의 자기 영동 구간에서 자성입자가 많이 결합된 대부분의 비표적세포를 분리 및 제거시키고, 느린 유속의 제2 미세입자 분리 디바이스(200)의 자기 영동 구간에서 자성입자가 적게 붙은 세포에 강자성 패턴의 자기력을 더 강하게 작용하여 분리 및 제거시킴으로써, 높은 순도의 표적세포를 유체 흐름을 따라 수집할 수 있게 된다. To this end, the discharge part 24 of the unbound magnetic particle trapping device 10 and the sample injection part 124 of the first fine particle separation device 100 are connected by a tube 310, and the first fine particles After the target cell collection unit 126 of the separation device 100 and the sample injection unit 224 of the second fine particle separation device 200 are connected to the tube 320 to remove the magnetic particles that are not bound to the cells, Most of the non-target cells to which magnetic particles are bound are separated and removed in the magnetophoresis section of the first microparticle separation device 100 with a high flow rate, and the magnetophoresis section of the second microparticle separation device 200 with a slow flow rate By applying the magnetic force of the ferromagnetic pattern to the cells with fewer magnetic particles in the cell, separating and removing them, high-purity target cells can be collected along the fluid flow.

만약, 느린 유속 구간의 채널(222)이 먼저 위치하면 자성입자가 붙은 수많은 세포들이 강자성 패턴을 지나갈 때 시간당 자기 영동 처리량이 많아져 세포로 인해 채널이 막히거나, 분리 효율이 떨어지는 문제가 발생할 수 있다. If the channel 222 of the slow flow rate section is located first, when a large number of cells to which magnetic particles are attached pass through the ferromagnetic pattern, the amount of magnetophoresis per hour increases, which may cause a problem that the channel is clogged by the cells or the separation efficiency is lowered. .

자성 입자가 결합된 비표적세포(백혈구)는 1mL당 5백만개로서, 본 발명의 구성과 같이 빠른 유속의 자기 영동 구간에서 자성입자가 많이 결합된 대부분의 비표적세포를 분리 및 제거시키고, 느린 유속의 자기 영동 구간에서 자성입자가 적게 붙은 세포에 강자성 패턴의 자기력을 더 강하게 작용하여 분리 및 제거시킴으로써, 높은 순도의 표적세포(혈중암세포)를 유체 흐름을 따라 수집할 수 있다. The number of non-target cells (leukocytes) bound to magnetic particles is 5 million per 1 mL, which separates and removes most of the non-target cells to which magnetic particles are bound a lot in the magnetophoresis section at a high flow rate as in the configuration of the present invention, and a slow flow rate High purity target cells (blood cancer cells) can be collected along the fluid flow by separating and removing the magnetic force of the ferromagnetic pattern by applying a stronger magnetic force of the ferromagnetic pattern to the cells with few magnetic particles in the magnetophoresis section.

이와 같은 본 발명의 음성수집 방식의 미세입자 분리장치를 이용한 분리방법은 다음과 같다. The separation method using the fine particle separation apparatus of the present invention as described above is as follows.

도 9는 본 발명의 자기영동을 이용한 음성수집 방식의 미세입자 분리방법을 나타내는 순서도로서, 세포와 결합되지 않은 자성입자를 사전에 선택적으로 포획 및 제거하기 위해 미결합 자성입자 포획 디바이스(10)를 통과하는 제1 단계(S100)와, 상기 미결합 자성입자 포획 디바이스(10)를 통과한 시료가 제1 미세입자 분리 디바이스(100)의 폭이 좁은 미세 유체 채널(122)을 통과하면서 자성입자가 결합된 비표적세포를 1차적으로 분리 및 제거하는 제2 단계(S110)와, 상기 제1 미세입자 분리 디바이스(100)를 통과한 시료가 제2 미세입자 분리 디바이스(200)의 폭이 넓은 미세 유체 채널(222)을 통과하면서 자성입자가 결합된 비표적세포를 2차적으로 분리 및 제거하는 제3 단계(S120)를 포함한다. 9 is a flow chart showing a method for separating microparticles of a negative collection method using magnetophoresis of the present invention. In order to selectively capture and remove magnetic particles not bound to cells in advance, an unbound magnetic particle trapping device 10 is installed. In the first step (S100) of passing, and the sample passing through the unbound magnetic particle trapping device 10 passes through the narrow microfluidic channel 122 of the first microparticle separation device 100, magnetic particles In the second step (S110) of primarily separating and removing the bound non-target cells, and the sample passing through the first microparticle separation device 100 is a microparticle with a wide width of the second microparticle separation device 200 . and a third step (S120) of secondarily separating and removing non-target cells to which magnetic particles are bound while passing through the fluid channel 222.

물론, 제n 미세입자 분리 디바이스를 더 포함하며, 상기 제n 미세입자 분리 디바이스는 제n-1 미세입자 분리 디바이스 보다 상기 미세 유체 채널이 넓게 이루어지어 제n-1 미세입자 분리 디바이스의 채널 보다 느린 유속으로 통과하도록 더 구성하는 것도 가능하다. Of course, it further includes an n-th fine particle separation device, wherein the microfluidic channel is wider than that of the n-1 th fine particle separation device, so that it is slower than the channel of the n-1 th fine particle separation device. It is also possible to further configure it to pass through at a flow rate.

도 10 내지 도 11은 본 발명의 자기영동을 이용한 음성수집 방식의 미세입자 분리장치의 성능 평가를 나타내는 그래프로서, 도 10은 암세포 종류별 항원 발현율을 나타내는 그래프이고, 도 11은 혈중암세포가 수집된 회수율을 평가하는 그래프이다. 10 to 11 are graphs showing the performance evaluation of the apparatus for separating microparticles of a negative collection method using magnetophoresis of the present invention. FIG. 10 is a graph showing the antigen expression rate for each type of cancer cell, and FIG. 11 is the recovery rate at which blood cancer cells are collected. is a graph that evaluates

본 출원인이 음성수집 방식을 이용한 자기 영동 디바이스의 성능을 평가한 결과, 도 10에서 나타낸 바와 같이, 암세포 종류별로 표면 항원의 발현 정도가 다르며, 암세포 종류별로 음성수집 방식과 양성수집 방식으로 각각 자기 영동을 시켜 혈중암세포가 수집된 회수율을 평가한 결과, 음성수집 방식은 암세포 별 항원 발현 여부에 상관없이 평균 83.2%의 회수율 가지고, 양성수집 방식은 항원 발현율이 높은 SKBR-3, MCF-3 암세포에서는 회수율이 높으나, 항원 발현율이 낮은 MB231, PC-3 암세포에서는 분리되지 못하는 한계를 가짐을 확인하였다. As a result of the applicant's evaluation of the performance of the magnetophoretic device using the negative collection method, as shown in FIG. 10 , the expression level of the surface antigen is different for each type of cancer cell, and the negative collection method and the positive collection method for each type of cancer cell type are used for magnetophoresis, respectively. As a result of evaluating the recovery rate at which blood cancer cells were collected, the negative collection method had an average recovery rate of 83.2% regardless of whether antigen was expressed by each cancer cell, and the positive collection method had a recovery rate in SKBR-3 and MCF-3 cancer cells with high antigen expression rates. It was confirmed that this had a limitation in that it could not be isolated from MB231 and PC-3 cancer cells with high antigen expression rates but low antigen expression rates.

따라서, 본 발명에 의한 음성수집 방식이 암세포 종류와 관계없이 높은 회수율을 가지는 우수한 효과가 있음이 입증되었다. Therefore, it was proved that the negative collection method according to the present invention has an excellent effect of having a high recovery rate regardless of the type of cancer cell.

본 발명의 권리는 위에서 설명된 실시예에 한정되지 않고 청구범위에 기재된 바에 의해 정의되며, 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 청구범위에 기재된 권리범위 내에서 다양한 변형과 개작을 할 수 있다는 것은 자명하다.The right of the present invention is not limited to the embodiments described above, but is defined by what is described in the claims, and a person of ordinary skill in the art can make various modifications and adaptations within the scope of the claims. it is self-evident

10: 미결합 자성입자 포획 디바이스 12: 하부 기판
20: 상부 기판 22: 채널
30: 영구자석 100: 제1 미세입자 분리 디바이스
110: 하부 기판 112: 자성체 미세 구조물
120: 상부 기판 122: 미세 유체 채널
124: 시료 주입부 125: 버퍼 주입부
126: 표적세포 수집부 127: 비표적세포 배출부
130: 외부 자기장원 200: 제2 미세입자 분리 디바이스10: Unbound magnetic particle trapping device 12: Lower substrate
20: upper substrate 22: channel
30: permanent magnet 100: first fine particle separation device
110: lower substrate 112: magnetic microstructure
120: upper substrate 122: microfluidic channel
124: sample injection unit 125: buffer injection unit
126: target cell collection unit 127: non-target cell discharge unit
130: external magnetic field source 200: second fine particle separation device

Claims (15)

미세 유체 채널이 형성되는 상부 기판과, 패턴화된 자성체 미세 구조물을 포함하는 하부 기판과, 상기 패턴화된 자성체 미세 구조물 주위에 자기장을 발생시키는 외부 자기장원을 갖는 미세입자 분리 디바이스를 적어도 한 개 이상 포함하고,
상기 미세 유체 채널은 자성입자가 결합된 비표적세포를 포함하는 시료가 주입되는 시료 주입부; 버퍼가 주입되는 버퍼 주입부; 상기 미세 유체 채널을 통과하면서 자기영동에 의해 분리된 비표적세포를 배출하는 비표적세포 배출부; 및 상기 미세 유체 채널을 통과한 나머지 표적세포를 포획하여 수집하는 표적세포 수집부; 를 포함하여 상기 미세 유체 채널을 통해 자성입자가 결합된 비표적세포를 분리 및 제거하는 것을 특징으로 하고, 상기 미세 유체 채널을 통과하기 전 세포와 결합되지 않은 자성입자를 선택적으로 포획 및 제거하기 위한 미결합 자성입자 포획 디바이스가 더 포함되는 것을 특징으로 하며, 상기 미결합 자성입자 포획 디바이스는 폭 또는 높이가 점차 넓어지거나 깊어지는 형태의 채널이 형성되어 주입부에서 배출부로 갈수록 유속이 점차 느려지는 형태의 상부 기판; 하부 기판; 및 상기 하부 기판의 저면에 구비되어 상기 채널 주위에 자기장을 발생시키는 외부 자기장원; 을 포함하며, 상기 채널은 평면 상에서 굴곡진 지그재그 구조를 가지며, 주입부에서 배출부로 갈수록 유속이 점차 느려지는 형태로 이루어짐으로써 채널 전반에 걸쳐 자성입자가 균등하게 포획될 수 있는 것을 특징으로 하는 자기영동을 이용한 음성수집 방식의 미세입자 분리장치.At least one microparticle separation device having an upper substrate on which a microfluidic channel is formed, a lower substrate including a patterned magnetic microstructure, and an external magnetic field source for generating a magnetic field around the patterned magnetic microstructure. including,
The microfluidic channel may include a sample injection unit into which a sample containing non-target cells to which magnetic particles are bound is injected; a buffer injection unit into which a buffer is injected; a non-target cell discharge unit for discharging non-target cells separated by magnetophoresis while passing through the microfluidic channel; and a target cell collecting unit for capturing and collecting the remaining target cells that have passed through the microfluidic channel. characterized in that it separates and removes non-target cells to which magnetic particles are bound through the microfluidic channel, including a method for selectively capturing and removing magnetic particles not bound to cells before passing through the microfluidic channel An uncoupled magnetic particle trapping device is further included, wherein the uncoupled magnetic particle trapping device has a channel in which the width or height is gradually widened or deepened, so that the flow rate gradually slows from the injection part to the discharge part. upper substrate; lower substrate; and an external magnetic field source provided on a bottom surface of the lower substrate to generate a magnetic field around the channel. Including, wherein the channel has a curved zigzag structure on a plane, and the flow rate gradually becomes slower from the injection part to the discharge part, so that magnetic particles can be uniformly captured throughout the channel. A device for separating fine particles using a voice collection method. 삭제delete 삭제delete 청구항 1에 있어서,
상기 외부 자기장원은 다중 겹으로 이루어지는 영구자석인 것을 특징으로 하는 자기영동을 이용한 음성수집 방식의 미세입자 분리장치.The method according to claim 1,
The external magnetic field source is a voice-collecting method of separating fine particles using magnetophoresis, characterized in that the permanent magnet is made of multiple layers. 청구항 1에 있어서,
상기 미세입자 분리 디바이스는 제1 미세입자 분리 디바이스 내지 제n 미세입자 분리 디바이스를 포함하며,
상기 제1 미세입자 분리 디바이스는 상기 미세 유체 채널이 좁게 이루어지어 빠른 유속으로 통과하고,
상기 제n 미세입자 분리 디바이스는 제n-1 미세입자 분리 디바이스 보다 상기 미세 유체 채널이 넓게 이루어지어 제n-1 미세입자 분리 디바이스의 채널 보다 느린 유속으로 통과하는 것을 특징으로 하는 자기영동을 이용한 음성수집 방식의 미세입자 분리장치.
여기서, n은 2 이상의 정수이다. The method according to claim 1,
The fine particle separation device comprises a first fine particle separation device to an nth fine particle separation device,
In the first microparticle separation device, the microfluidic channel is made narrow and passes at a high flow rate,
The nth fine particle separation device has a wider microfluidic channel than the n-1th fine particle separation device, so that it passes at a slower flow rate than the channel of the n-1th fine particle separation device. A collection-type fine particle separation device.
Here, n is an integer of 2 or more. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete
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