KR102277057B1 - Pharmaceutical composition comprising the extraction of cattail pollen as an effective component for prevention or treatment of thrombosis and health functional food comprising the same - Google Patents

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Abstract

본 발명은 부들 화분(Pollen of Typha augustifolia L.) 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증(thrombosis)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 부들 화분의 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 하는 혈액 응고 저해 및 혈소판 응집 저해를 통한 혈전증의 예방 또는 치료/개선용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것이다. 본 발명의 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품의 유효성분으로서의 부들 화분 추출물은 혈전 생성 관련 효소 및 혈액 응고 인자의 저해와 함께 혈전 생성의 개시 역할을 수행하는 혈소판의 응집 저해 효과에 의한 강력한 항혈전 활성을 나타냄과 동시에, 인간 적혈구에 대한 용혈 활성을 전혀 나타내지 않고, 열 안정성이 우수하고, pH 2의 산성 조건 및 혈장 내에서도 혈액 응고 인자 저해 효과 및 혈전 생성 관련 효소 저해 효과의 손실이 나타나지 않으므로, 혈행 개선을 통해 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중과 같은 혈전증의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있을 것으로 기대되며, 상기 유효성분은 추출액, 분말, 환, 정 등의 다양한 형태로 가공되어 상시 복용이 가능한 형태로 조제할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 제약 산업 및 식품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating thrombosis and a health functional food containing an extract of Pollen of Typha augustifolia L. as an active ingredient, and more particularly, to an ethanol extract of Pollen of Typha augustifolia L. It relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating/improving thrombosis through inhibition of blood coagulation and inhibition of platelet aggregation, and a health functional food containing the ethyl acetate fraction of the active ingredient. As an active ingredient of the pharmaceutical composition for the prevention or treatment of thrombosis of the present invention, and as an active ingredient of a health functional food, the extract of dandelion pollen is effective in inhibiting platelet aggregation, which plays a role in initiating thrombus formation along with inhibition of thrombus formation-related enzymes and blood clotting factors At the same time, it exhibits strong antithrombotic activity and no hemolytic activity against human red blood cells, excellent thermal stability, and loss of blood coagulation factor inhibitory effect and thrombus formation-related enzyme inhibitory effect even in an acidic condition of pH 2 and plasma. Since it does not appear, it is expected that it can be used for the prevention and treatment of thrombosis such as ischemic stroke and hemorrhagic stroke through improvement of blood circulation, and the active ingredient is processed into various forms such as extracts, powders, pills, tablets, etc. It is a very useful invention in the pharmaceutical industry and the food industry because it has an excellent effect that it can be formulated in a form.

Description

부들 화분 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품{PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THE EXTRACTION OF CATTAIL POLLEN AS AN EFFECTIVE COMPONENT FOR PREVENTION OR TREATMENT OF THROMBOSIS AND HEALTH FUNCTIONAL FOOD COMPRISING THE SAME}A pharmaceutical composition and health functional food for the prevention or treatment of thrombosis containing extract of dandelion pollen as an active ingredient

본 발명은 부들 화분(Pollen of Typha augustifolia L.) 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증(thrombosis)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 부들 화분의 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 하는 혈액 응고 저해 및 혈소판 응집 저해를 통한 혈전증의 예방 또는 치료/개선용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것이다.The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating thrombosis and a health functional food containing an extract of Pollen of Typha augustifolia L. as an active ingredient, and more particularly, to an ethanol extract of Pollen of Typha augustifolia L. It relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating/improving thrombosis through inhibition of blood coagulation and inhibition of platelet aggregation, and a health functional food using the ethyl acetate fraction of

인체 구성 성분으로 혈액은 산소, 영양분, 노폐물의 운반 기능과 완충 작용, 체온 유지, 삼투압 조절 및 이온 평형 유지, 수분 일정 유지, 액성 조절 작용, 혈압의 유지 및 조절, 생체 방어 등 다양한 중요 기능들을 가지고 있다. 정상적인 혈액 순환은 체내에서의 혈액 응고 반응계와 혈전 용해 반응계가 상호 보완적으로 조절되면서 혈액 순환을 용이하게 하며, 이들 중 혈액 응고 반응계의 기작은 혈관벽에 혈소판이 점착, 응집하여 혈소판 혈전을 형성한 후, 혈액 응고계가 활성화되어 혈소판 응집괴를 중심으로 피브린 혈전이 형성되는 것으로 보고되어 있다. As a component of the human body, blood has a variety of important functions, such as transporting oxygen, nutrients, and waste products and buffering, maintaining body temperature, osmotic pressure control and ion balance maintenance, water constant maintenance, fluid control, blood pressure maintenance and control, and body defense. have. Normal blood circulation facilitates blood circulation as the blood coagulation and thrombolytic systems in the body are controlled complementary to each other, and the mechanism of the blood coagulation system among them is the adhesion and aggregation of platelets to the blood vessel wall to form a platelet thrombus. , it has been reported that the blood coagulation system is activated to form a fibrin clot centered on platelet agglomerates.

피브린 혈전의 생성은 수많은 혈액 응고 인자들의 여러 단계 반응을 거쳐 피브린 응고에 관여하는 트롬빈이 활성화되어, 최종적으로 피브리노겐으로부터 피브린 단량체를 생성하게 하며, 피브린 단량체들은 칼슘에 의해 중합되어, 혈소판과 내피세포에 결합하게 되며 XIII 인자에 의해 교차 결합된 피브린 폴리머를 형성하면서 영구적인 혈전을 생성하게 된다. 또한, 트롬빈은 혈소판, V 인자, VII 인자들을 활성화시켜 혈액 응고 반응을 촉진시키는 등 혈전 생성에 중추적 역할을 하게 된다. 따라서, 트롬빈의 활성 저해물질은 과다한 혈액 응고 이상으로 발생하는 다양한 혈전성 질환에 매우 유용한 예방 및 치료제로 사용될 수 있다. Fibrin thrombus formation is caused by the activation of thrombin, which is involved in fibrin coagulation, through a multi-step reaction of numerous blood coagulation factors, and finally produces fibrin monomers from fibrinogen. The fibrin monomers are polymerized by calcium, and are absorbed into platelets and endothelial cells. It binds and forms a fibrin polymer cross-linked by factor XIII, forming a permanent thrombus. In addition, thrombin plays a pivotal role in thrombus formation, such as activating platelets, factor V, and factor VII to promote a blood coagulation reaction. Therefore, the thrombin activity inhibitor can be used as a very useful prophylactic and therapeutic agent for various thrombotic diseases caused by excessive blood clotting.

내인성 혈전 생성 경로에는 XII 인자, XI 인자, IX 인자, X 인자의 순차적 활성화에 이은 프로트롬빈의 활성화가 최종적으로 트롬빈을 활성화하는 것으로 알려져 혈액 응고 인자의 특이적 저해 역시 중요한 혈전성 질환 치료제의 개발 타겟이 되고 있다. 현재까지 혈전성 질환의 예방과 치료에 헤파린, 쿠마린, 아스피린, 유로키네이즈 등의 다양한 항응고제, 항혈소판제, 혈전용해제 등이 사용되고 있으나, 이들은 가격이 매우 높을 뿐 아니라, 출혈성 부작용과 위장 장해 및 과민 반응 등으로 그 사용이 한정되고 있는 실정이다. In the endogenous thrombus formation pathway, it is known that the activation of prothrombin following the sequential activation of factors XII, XI, IX, and X ultimately activates thrombin, so specific inhibition of blood coagulation factors is also an important development target for thrombotic disease therapeutics. is becoming Until now, various anticoagulants such as heparin, coumarin, aspirin, urokinase, etc., antiplatelet agents, and thrombolytic agents have been used for the prevention and treatment of thrombotic diseases. As such, its use is limited.

한편, 부들(Typha augustifolia L.)은 부들과의 다년초 외떡잎식물로서, 연못이나 하천, 강, 늪지 등의 습지에 자라며 에서 볼 수 있는데, 근경이 가로로 뻗고 굵으며, 줄기는 원주형으로 곧게 서고, 잎은 선형으로서 좁고 길며 녹색이다. 국내에서는 주로 관상용, 꽃꽂이용으로 사용되고 있으며, 부들 화분(꽃가루)은 민간에서 지혈, 통증 완화, 이뇨 용도의 사용되고 있다. 한방에서는 특히 부들 화분을 포황(蒲黃)이라 하며, 맛이 달고 독성이 없어 지혈제, 자궁 출혈, 토혈, 출혈성하리, 탈항, 소염성 이뇨약, 치질, 대하증, 월경 불순, 방광염 등의 광범위한 용도의 약재로 사용하여 왔다.On the other hand, Typha augustifolia L. is a perennial monocotyledonous plant of the Cataceae family, which grows in wetlands such as ponds, rivers, rivers, and swamps and can be seen in . , the leaves are linear, narrow, long, and green. In Korea, it is mainly used for ornamental purposes and flower arranging, and pollen (pollen) is used for hemostasis, pain relief, and diuresis in the private sector. In oriental medicine, in particular, pollen of perilla is called pohwang (蒲黃), and because it has a sweet taste and is not toxic, it is used as a hemostatic agent, uterine bleeding, hematemesis, hemorrhagic haemorrhage, prolapse, anti-inflammatory diuretic, hemorrhoids, hypothyroidism, menstrual irregularity, cystitis has been used as medicine.

화분(Pollen)은 종자를 만드는 유관속 식물의 생식기관으로, 수컷 배우체를 보호하기 위해 견고한 껍질로 둘러싸여 있는 구조이며, 주로 바람이나 곤충에 의해 운반되어 암컷 배우체에 도달하여 수정한 후 종자를 형성한다. 화분은 곤충에 의해 매개되는 충매화분과 바람에 의해 매개되는 풍매화분이 있으며, 충매화분은 다래화분, 도토리 화분과 같은 단일식물 화분 및 다양한 식물 화분이 모인 잡화분으로 구분하며, 풍매화분은 대표적으로 송화분, 부들 화분을 들 수 있다.Pollen is a reproductive organ of vascular plants that make seeds. It is a structure surrounded by a strong shell to protect the male gamete, and is mainly carried by wind or insects to reach the female gamete, fertilize, and form a seed. There are two types of pollen: insect-mediated and wind-mediated pollen. The pollen is divided into single plant pollen such as Actinidia and acorn pollen, as well as miscellaneous pollen collections of various plant pollens. You can pick up a potted plant.

통상 화분은 조단백 20~25%, 조지질 7~15%, 조회분 2~5%, 조탄수화물 20~50%, 수분 10~15%를 포함하고 있어 영양적으로 우수하며, 다양한 생리 활성 물질을 포함하여 영양보조제와 전통의약품으로 사용되어 왔다. 그러나, 화분은 'sporopollenin'이라는 두꺼운 층으로 구성된 외피(extine)와 내피(intime)로 구성되어 있어 그 자체로는 소화, 분해가 되지 않아 생체이용률은 10~15%로 낮다는 문제점이 있으며(Pyeon HI, 2018, Journal of Life Science 28: 605~614), 다양한 식물로부터 기인하여 미생물학적 오염이 나타날 수 있으며, 쉽게 부패하는 단점도 있다. 또한, 서양 지치꽃 화분에서 간독성, 폐독성 및 발암성이 의심되는 독성물질(1,2-dehydro pyrollizidine alkaloids)이 확인된 바도 있다(Boppre, M 등, J. Agric. Food Chem. 53, 594-600). Usually pollen contains 20~25% of crude protein, 7~15% of crude lipid, 2~5% of crude flour, 20~50% of crude carbohydrate, and 10~15% of water, so it is nutritionally excellent and contains various physiologically active substances. It has been used as a nutritional supplement and traditional medicine. However, pollen is composed of an extine and an intime composed of a thick layer called 'sporopollenin', so it is not digested or decomposed by itself, so there is a problem that the bioavailability is low at 10~15% (Pyeon). HI, 2018, Journal of Life Science 28: 605-614), microbiological contamination may appear due to various plants, and there is also a disadvantage of easily spoiling. In addition, toxic substances (1,2-dehydro pyrollizidine alkaloids) suspected of hepatotoxicity, lung toxicity and carcinogenicity have been identified in borage pollen (Boppre, M et al., J. Agric. Food Chem. 53, 594-). 600).

따라서, 기존의 화분에 대한 연구는, 화분의 영양학적 특성과 견고한 외피를 분해하여 소화흡수를 증진시키기 위한 추출 조건, 전처리 방법 개발에 주로 집중되어 있다. 최근에는 유용 생리활성에 대한 연구가 진행되고 있으며, 혈관 및 순환계, 소화계, 신진대사계, 노화 등 다양한 질환에 효과가 있다고 알려지고 있으며, 항균 및 항산화 효능, 면역증강 효과, 전립선 비대증 및 전립선염 치료 효과 등이 보고되었다(최 등, 2007, Korean J. Food preserv. 14, 87-93; Abouda et al., 2011, J. Microbiol. 6, 376-384; Li et al., 2009, Carbohydrate Polymers 78, 80-88; 홍인표 외, 2016, Journal of Apiculture 31, 219-225; 홍인표, 2014, Journal of Apiculture 29, 137-142; 박용기 외, 2015. Journal of Apiculture 30, 299-306; 김석중 외, 2005, 한국식품과학회지 37, 833-837). Therefore, research on the existing pollen is mainly focused on the development of extraction conditions and pretreatment methods to improve digestion and absorption by decomposing the nutritional properties of pollen and the strong outer shell. Recently, research on useful physiological activity is being conducted, and it is known that it is effective in various diseases such as blood vessels and circulation, digestive system, metabolic system, aging, etc., antibacterial and antioxidant efficacy, immune enhancing effect, prostate enlargement and prostatitis treatment. effects have been reported (Choi et al., 2007, Korean J. Food preserv. 14, 87-93; Abouda et al., 2011, J. Microbiol. 6, 376-384; Li et al., 2009, Carbohydrate Polymers 78 , 80-88; Hong In-pyo et al., 2016, Journal of Apiculture 31, 219-225; Hong In-pyo, 2014, Journal of Apiculture 29, 137-142; Park Yong-gi et al., 2015. Journal of Apiculture 30, 299-306; Kim Seok-jung et al., 2005 , Journal of the Korean Society for Food Science 37, 833-837).

한편, 화분의 혈전 관련 연구는 송화분 및 부들 화분에서만 매우 제한적으로 보고된 바, 특히 송화분의 경우 항혈전 및 지혈 촉진의 상반된 활성이 동시에 알려져 있으며, 부들 화분의 경우에는 혈전 생성을 촉진하는 지혈효과가 잘 알려져 있다(Ohkura 등, 2011. Blood Coagul Fibrinolysis. 22:631-636; Yan X., 2017, J Nanobiotechnology. 15: 60 doi: 10.1186/s12951-017-0296-z.) On the other hand, studies on thrombosis of pollen have been reported very limitedly only in pine pollen and pine pollen, and in particular, in the case of pine pollen, opposite activities of antithrombotic and hemostasis promotion are known at the same time. well known (Ohkura et al., 2011. Blood Coagul Fibrinolysis. 22:631-636; Yan X., 2017, J Nanobiotechnology. 15: 60 doi: 10.1186/s12951-017-0296-z.)

실제 대부분의 화분(꽃가루)은 알러지를 유발하며, 혈소판 활성화 인자를 자극하여 혈소판 응집을 촉진하는 것으로 알려져 있다(Zhou, B 등, 2011, Journal of Huazhong University of Science and Technology. 31: 589-590). 먼저, 부들 화분의 항혈전 활성 관련 연구로는, 부들 화분의 혈전 용해 효소 특성에 관한 연구(박혜민 등, 2009, CNU Journal of agricultural science v.36 no.1 ,pp. 111-122), 부들의 항혈전, 지혈억제 효과(Zhao, G, 2011, Chinese journal of biochemical pharmaceutics 32: 222-224)가 알려져 있으며, 부들 화분의 항응고 물질은 고분자 다당류임이 보고되어 있다(Gibbs, A 등, 1983, Thrombosis research 32: 97-108). 또한, 부들 화분, 오령지, 작약, 천궁, 도인, 홍화 및 봉출을 포함하는 7종의 한약제 복방 추출물(실소산가미탕)이 혈소판 응집과 피브린 응집을 저해함이 보고된 바 있다(Park WH 등, 2004, Phytother Res. 18, 224-229). In fact, most pollen (pollen) causes allergies and is known to stimulate platelet activation factors to promote platelet aggregation (Zhou, B et al., 2011, Journal of Huazhong University of Science and Technology. 31: 589-590). . First, as a study related to the antithrombotic activity of cattail pollen, a study on the thrombolytic enzyme properties of cattail pollen (Hyemin Park et al., 2009, CNU Journal of agricultural science v.36 no.1 ,pp. 111-122), Antithrombotic and hemostatic inhibitory effects (Zhao, G, 2011, Chinese journal of biochemical pharmaceutics 32: 222-224) are known, and it has been reported that the anticoagulant of pollen pollen is a high-molecular polysaccharide (Gibbs, A et al., 1983, Thrombosis). research 32: 97-108). In addition, it has been reported that 7 kinds of herbal medicine ventral extract (Silsosangami-tang) including perilla pollen, Oryeongji, peony, cheongung, doin, safflower and bongchul inhibits platelet aggregation and fibrin aggregation (Park WH et al., 2004, Phytother Res. 18, 224-229).

또한, 소나무로부터 얻어진 송화분의 항혈전 활성 관련 연구로는, 송화분의 지질 성분이 혈소판에 작용하여 응집반응을 촉진시키거나, 그 외에 생리활성을 유도하는 인지질의 일종인 PAF(Platelet Activating Factor)를 저해하여 최종적으로 혈소판 응집을 저해함이 보고된 바 있다(Siafaka-Kapadai, A 등, 1986, Biochemistry international v.12 no.1 ,pp. 33-41). 그러나, 이러한 송화분의 지질성분은 고농도에서는 혈소판 응집을 오히려 촉진하여 농도에 따라 다른 반응을 매개함이 알려져 있다. 따라서, 송화분의 경우 [성분 조성 및 처리농도]에 따라 항혈전 활성 또는 반대의 혈전 생성 촉진활성을 나타내게 된다. 그러나, 현재까지 부들 화분의 에탄올 추출물의 저분자 활성물질에 대한 보고는 알려진 바 없다. In addition, in studies related to the antithrombotic activity of pine pollen obtained from pine, the lipid component of pine pollen acts on platelets to promote aggregation reaction, or inhibits PAF (Platelet Activating Factor), a type of phospholipid that induces physiological activity. Thus, it has been reported that ultimately inhibit platelet aggregation (Siafaka-Kapadai, A et al., 1986, Biochemistry international v.12 no.1, pp. 33-41). However, it is known that the lipid component of such pine pollen mediates different reactions depending on the concentration by promoting platelet aggregation at high concentrations. Therefore, in the case of pine pollen, depending on [ingredient composition and treatment concentration], antithrombotic activity or the opposite thrombus formation promoting activity is exhibited. However, there are no reports of low-molecular active substances in ethanol extracts of pollen pollen.

또한, 화분의 혈전 관련 특허로는 대한민국 등록특허 제10-0913370호에 혈전분해효소를 대상으로 한 [부들 화분 추출물을 함유하는 항혈전 조성물]이 알려져 있으며, WO-4009575호에 부들 화분의 항혈전 용도 [An extract of a typhae pollen and its manufacture and use], 미국 공개특허 US-0018261호에 부들 화분의 혈액순환개선 효과가 [Method and use of extract of a member of Typhaceae's family]에 공개되어 있다. 그러나, 현재까지 부들 화분 추출물 및 이의 지용성 저분자를 활성성분으로 하는 분획물의 항혈전 활성 특허는 알려진 바 없다.In addition, as patents related to thrombus in pollen, Korean Patent Registration No. 10-0913370 [Antithrombotic Composition Containing Pollen Pollen Extract] targeting a thrombolytic enzyme is known, and WO-4009575 , Antithrombosis of Pollen Pollen Use [An extract of a typhae pollen and its manufacture and use], U.S. Patent Publication No. US-0018261 discloses the blood circulation improving effect of pollen pollen [Method and use of extract of a member of Typhaceae's family]. However, until now, there has been no known patent for antithrombotic activity of a pollen extract and a fraction containing a fat-soluble low molecular weight thereof as an active ingredient.

KRUS 10-091337010-0913370 BB

박혜민 등, 2009, CNU Journal of agricultural science v.36 no.1 ,pp. 111-122 Hyemin Park et al., 2009, CNU Journal of agricultural science v.36 no.1 ,pp. 111-122 Zhao, G, 2011, Chinese journal of biochemical pharmaceutics 32: 222-224 Zhao, G, 2011, Chinese journal of biochemical pharmaceutics 32: 222-224 Gibbs, A 등, 1983, Thrombosis research 32: 97-108 Gibbs, A et al., 1983, Thrombosis research 32: 97-108

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 부들 화분 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품을 제공하고자 하는 것이다.The present invention has been devised to solve the problems of the prior art as described above, and an object to be solved in the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of thrombosis and a health functional food containing an extract of pollen pollen of the present invention as an active ingredient. would like to

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 부들 화분(Pollen of Typha augustifolia L.) 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating thrombosis containing an extract of pollen of Typha augustifolia L. as an active ingredient.

상기 부들 화분 추출물은 부들 화분 에탄올 추출물인 것이 바람직하다.Preferably, the pollen extract is ethanol extract of pollen pollen.

상기 부들 화분 에탄올 추출물은 부들 화분 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물인 것이 바람직하다.It is preferable that the ethanolic extract of pollen pollen from Pollen is an ethyl acetate fraction of the ethanol extract of Pollen Pollen.

또한, 본 발명은 부들 화분(Pollen of Typha augustifolia L.) 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 예방 또는 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.In addition, the present invention provides a health functional food for preventing or improving thrombosis containing an extract of pollen of Typha augustifolia L. as an active ingredient.

상기 부들 화분 추출물은 부들 화분 에탄올 추출물인 것이 바람직하다.Preferably, the pollen extract is ethanol extract of pollen pollen.

상기 부들 화분 에탄올 추출물은 부들 화분 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물인 것이 바람직하다.It is preferable that the ethanolic extract of pollen pollen from Pollen is an ethyl acetate fraction of the ethanol extract of Pollen Pollen.

본 발명의 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품의 유효성분으로서의 부들 화분 추출물은 혈전 생성 관련 효소 및 혈액 응고 인자의 저해와 함께 혈전 생성의 개시 역할을 수행하는 혈소판의 응집 저해 효과에 의한 강력한 항혈전 활성을 나타냄과 동시에, 인간 적혈구에 대한 용혈 활성을 전혀 나타내지 않고, 열 안정성이 우수하고, pH 2의 산성 조건 및 혈장 내에서도 혈액 응고 인자 저해 효과 및 혈전 생성 관련 효소 저해 효과의 손실이 나타나지 않으므로, 혈행 개선을 통해 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중과 같은 혈전증의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있을 것으로 기대되며, 상기 유효성분은 추출액, 분말, 환, 정 등의 다양한 형태로 가공되어 상시 복용이 가능한 형태로 조제할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 제약 산업 및 식품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.As an active ingredient of the pharmaceutical composition for the prevention or treatment of thrombosis of the present invention, and as an active ingredient of a health functional food, the extract of pollen pollen from thrombosis is effective in inhibiting platelet aggregation, which plays a role in initiating thrombus formation along with inhibition of thrombus formation-related enzymes and blood clotting factors At the same time, it exhibits strong antithrombotic activity and no hemolytic activity against human red blood cells, excellent thermal stability, and loss of blood coagulation factor inhibitory effect and thrombus formation-related enzyme inhibitory effect even in an acidic condition of pH 2 and plasma. Therefore, it is expected that it can be used for the prevention and treatment of thrombosis such as ischemic stroke and hemorrhagic stroke through improvement of blood circulation, and the active ingredient is processed into various forms such as extracts, powders, pills, tablets, etc. It is a very useful invention in the pharmaceutical industry and food industry because it has an excellent effect that it can be formulated in a form.

도 1은 부들 화분의 사진도이다.
도 2는 부들 화분의 현미경(200배) 관찰 사진도이다.
도 3은 부들 화분 에탄올 추출물 및 이의 순차적 유기용매 분획물의 인간 혈소판 응집저해 활성을 나타낸 것이다: 1: 용매 대조구(DMSO), 2: 아스피린(0.25mg/ml), 3: 부들 화분 에탄올 추출물(0.25mg/ml), 4: 부들 화분 에탄올 추출물의 헥센 분획물(0.25mg/ml), 5: 부들 화분 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물(0.25mg/ml), 6: 부들 화분 에탄올 추출물의 부탄올 분획물(0.25mg/ml), 7: 부들 화분 에탄올 추출물의 유기용매 분획 후의 물 잔류물(0.25mg/ml).
1 is a photographic diagram of a potted plant.
Figure 2 is a microscopic (200 times) observation photograph of the pollen of Cattail.
Figure 3 shows the human platelet aggregation inhibitory activity of an ethanolic extract and sequential organic solvent fractions thereof: 1: solvent control (DMSO), 2: aspirin (0.25 mg/ml), 3: ethanolic extract of dandelion pollen (0.25 mg). /ml), 4: Hexene fraction (0.25 mg/ml) of ethanolic extract of Pollen plant asiatica, 5: Ethyl acetate fraction (0.25 mg/ml) of ethanol extract of Pollen fern pollen, 6: Butanol fraction (0.25 mg/ml) of ethanolic extract of Pollen Pollen. ml), 7: Water residue (0.25 mg/ml) after organic solvent fractionation of ethanol extract of pollen pollen.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명의 발명자들은 부들 화분을 대상으로 항혈전 효능을 검정하기 위하여, 일정 방법으로 부들 화분 추출물을 조제하고, 이의 에틸아세테이트 분획물을 항혈전 활성 성분으로 회수하였으며, 상기 에틸아세테이트 분획물은 인간 적혈구에 대해 용혈 활성을 전혀 나타내지 않으면서도, 열 안정성과 산 안정성이 우수한 특징을 가짐을 확인함으로서, 상기 추출물 및 분획물을 혈전증의 예방 또는 치료/개선용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품으로 활용하고자 하였다. In order to test the antithrombotic efficacy of pollen of the present invention, the inventors of the present invention prepared a pollen extract by a certain method, and an ethyl acetate fraction thereof was recovered as an antithrombotic active ingredient, and the ethyl acetate fraction was used for human red blood cells. By confirming that it has excellent thermal stability and acid stability without showing any hemolytic activity, the extracts and fractions were intended to be utilized as pharmaceutical compositions and health functional foods for preventing or treating/improving thrombosis.

구체적으로, 본 발명자들은 민간에서 혈관 및 순환계, 소화계, 신진대사계 등의 다양한 질환에 효과가 있다고 알려진 부들 화분을 이용하여 혈전증의 예방 또는 치료/개선용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품을 개발하기 위하여, 부들 화분을 대상으로 에탄올 추출물을 조제하고, 이들의 항혈전 활성을 인간 혈장과 인간 트롬빈에 대한 트롬빈 직접 저해(Thrombin Time), 프로트롬빈 저해(Prothrombin Time) 및 활성부분 트롬보플라스틴 타임(activated Partial Thromboplastin Time: aPTT)을 평가하여 우수한 항응고 활성이 있음을 확인하였으며, 에탄올 추출물을 순차적 유기용매 분획하여 얻은 헥센 분획과 에틸아세테이트 분획물에서 강력한 혈액응고인자 저해활성을, 부들 화분 추출물의 에틸아세테이트 분획물에서 강력한 혈소판 응집저해를 확인하였다. 또한, 상기 에틸아세테이트 분획물은 인간 적혈구에 대한 용혈활성은 나타내지 않음을 확인하여 실제적 이용이 가능함을 확인하였다. Specifically, the present inventors in the folklore to develop pharmaceutical compositions and health functional foods for the prevention or treatment/improvement of thrombosis by using pollen pollen, which is known to be effective in various diseases such as blood vessels and circulatory system, digestive system, and metabolic system. , prepared ethanol extracts from pollen of sagebrush, and tested their antithrombotic activity against human plasma and human thrombin for direct thrombin inhibition (Thrombin Time), prothrombin inhibition (Prothrombin Time) and active partial thromboplastin time (activated partial time). Thromboplastin Time: aPTT) was evaluated to confirm that it had excellent anticoagulant activity. The hexene and ethyl acetate fractions obtained by sequential organic solvent fractionation of the ethanol extract showed strong blood coagulation factor inhibitory activity, and the ethyl acetate fraction of Pollen pollen extract showed strong anticoagulant activity. A strong inhibition of platelet aggregation was confirmed. In addition, it was confirmed that the ethyl acetate fraction did not show hemolytic activity against human red blood cells, confirming that it was practically usable.

따라서, 본 발명은 부들 화분(Pollen of Typha augustifolia L.) 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.Accordingly, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating thrombosis containing an extract of pollen of Typha augustifolia L. as an active ingredient.

상기 부들 화분 추출물은 부들 화분 에탄올 추출물인 것이 바람직하다.Preferably, the pollen extract is ethanol extract of pollen pollen.

상기 부들 화분 에탄올 추출물은 부들 화분 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물인 것이 바람직하다.It is preferable that the ethanolic extract of pollen pollen from Pollen is an ethyl acetate fraction of the ethanol extract of Pollen Pollen.

또한, 본 발명은 부들 화분(Pollen of Typha augustifolia L.) 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 예방 또는 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.In addition, the present invention provides a health functional food for preventing or improving thrombosis containing an extract of pollen of Typha augustifolia L. as an active ingredient.

상기 부들 화분 추출물은 부들 화분 에탄올 추출물인 것이 바람직하다.Preferably, the pollen extract is ethanol extract of pollen pollen.

상기 부들 화분 에탄올 추출물은 부들 화분 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물인 것이 바람직하다.It is preferable that the ethanolic extract of pollen pollen from Pollen is an ethyl acetate fraction of the ethanol extract of Pollen Pollen.

이하에서는, 본 발명의 부들 화분 추출물 및 각 활성 분획 물질의 제조 방법 및 효능 실험 등을 보다 구체적으로 설명한다.Hereinafter, the method for preparing the pollen extract and each active fraction of the present invention, and efficacy experiments, etc. will be described in more detail.

본 발명은 부들 화분으로부터 추출물을 조제하는 단계; 부들 화분 추출물로부터 헥센, 에틸아세테이트, 부탄올의 순차적 유기용매 분획물 조제 및 이후 얻어지는 물 잔류물의 조제 단계; 상기 추출물 및 분획물의 항혈전 활성 평가 단계 및 에틸아세테이트 분획물의 활성 물질의 안정성 조사 단계를 포함한다.The present invention comprises the steps of preparing an extract from pollen of Cattail; a step of preparing sequential organic solvent fractions of hexene, ethyl acetate, and butanol from the pollen extract, and preparing a water residue obtained thereafter; It includes a step of evaluating the antithrombotic activity of the extract and the fraction and a step of examining the stability of the active substance of the ethyl acetate fraction.

본 발명의 조성물에 포함되는 "부들 화분 추출물"은 부들 화분을 유기용매로 추출하는 단계 및 상기 추출액을 0.06mm 이하의 여과망을 사용하여 여과하고, 이를 감압농축하는 단계에 의해 수득될 수 있다.The "Pulberry pollen extract" contained in the composition of the present invention can be obtained by extracting pollen of Cattail pollen with an organic solvent, filtering the extract using a filtration network of 0.06 mm or less, and concentrating the extract under reduced pressure.

본 발명에서 사용되는 유기용매는 물(냉수, 열수), 주정, 탄소수 1~4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 주정, 프로판올, 부탄올 등), 상기 저급알코올과 물과의 혼합용매 등을 이용할 수 있으며, 열수, 또는 95% 에탄올 추출이 가장 바람직하다.The organic solvent used in the present invention is water (cold water, hot water), alcohol, anhydrous or hydrous lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms (methanol, ethanol, alcohol, propanol, butanol, etc.), a mixed solvent of the lower alcohol and water, etc. can be used, and hot water or 95% ethanol extraction is most preferred.

바람직한 구체예로서, 본 발명의 부들 화분 추출물은 부들 화분을 열수 또는 에탄올로 추출하여 사용할 수 있다. 여기에서, 상기 열수 또는 에탄올 추출물은 헥센, 에틸아세테이트 및 부탄올의 유기용매로 순차 또는 각각 분획하여 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물 및 물 잔류물을 추가적으로 수득할 수도 있다.As a preferred embodiment, the pollen extract of the present invention may be used by extracting the pollen of the cattail tree with hot water or ethanol. Here, the hot water or ethanol extract may be fractionated sequentially or separately with an organic solvent of hexene, ethyl acetate and butanol to additionally obtain a hexene fraction, an ethyl acetate fraction and a butanol fraction and a water residue.

본 발명에서는, 부들 화분 추출물을 5mg/ml의 농도로 하여 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티 타임을 측정한 결과, 열수 추출물의 경우 항혈전제로 알려진 아스피린(1.5mg/ml) 보다 미약한 항응고 활성을 나타내었으나, 에탄올 추출물은 아스피린보다 우수한 프로트롬빈 저해활성 및 혈액응고인자 저해활성을 나타내었다. In the present invention, as a result of measuring thrombin time, prothrombin time, and AP time by using a pollen extract of safflower pollen at a concentration of 5 mg/ml, the hot water extract had weaker anticoagulant activity than aspirin (1.5 mg/ml), which is known as an antithrombotic agent. However, the ethanol extract showed superior prothrombin inhibitory activity and blood coagulation factor inhibitory activity than aspirin.

그러나, 부들 화분 추출물을 0.25mg/ml의 농도로 하여 혈소판 응집저해를 확인한 결과, 무첨가 대조구에 비해 열수 추출물은 154.1% 응집율, 에탄올 추출물에서 318.8%의 응집을 나타내어 강력한 혈소판 응집촉진을 나타내었다. 이러한 결과는 기존의 부들 화분을 민간 및 한방요법에서 강력한 지혈제로 사용하여 온 근거로 이해할 수 있다. 이후, 총당, 환원당 함량이 낮아 활성물질의 정제가 상대적으로 용이하며, 항응고 활성이 우수한 에탄올 추출물을 대상으로 순차적 유기용매 분획을 실시하였다. 그 결과, 부들 화분 에탄올 추출물의 헥센 분획물 및 에틸아세테이트 분획물에서 농도 의존적으로 강력한 혈액응고 저해를 나타내었으며, 특히 에틸아세테이트 분획물은 5mg/ml 농도에서 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티 타임을 각각 무첨가구에 비해 6.51배, 2.06배, 3.1배 연장하였으며, 6mg/ml의 농도에서는 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티 타임을 각각 7.73배, 2.51배 및 15배 이상 연장시킴을 확인하였다. 또한, 분획물의 혈소판 응집저해 활성을 평가한 결과, 에틸아세테이트 분획물은 0.25mg/ml 농도에서 동일농도의 아스피린보다 강력한 인간 혈소판 응집저해를 나타냄을 확인하였다. 이러한 결과는 부들 화분 추출물의 에틸아세테이트 분획은 매우 강력한 항응고 및 혈소판 응집저해 활성을 통한 항혈전 활성이 있음을 의미하며, 기존의 부작용 우려가 높은 아스피린과 같은 항응고제, 항혈소판제를 대치할 수 있음을 제시한다. However, as a result of confirming inhibition of platelet aggregation at a concentration of 0.25 mg/ml of coriander pollen extract, the hot-water extract exhibited 154.1% aggregation rate and 318.8% aggregation rate in the ethanol extract compared to the no-addition control, indicating strong platelet aggregation promotion. These results can be understood as the basis for using the existing cattail pollen as a powerful hemostatic agent in folk and oriental medicine. Thereafter, the organic solvent fractionation was sequentially performed on the ethanol extract, which was relatively easy to purify the active material due to the low total sugar and reducing sugar content, and had excellent anticoagulant activity. As a result, strong inhibition of blood coagulation was shown in the hexene fraction and the ethyl acetate fraction of the pollen ethanol extract, and in particular, in the ethyl acetate fraction, at a concentration of 5 mg/ml, thrombin time, prothrombin time, and AP time were respectively added to the non-additive group. It was confirmed that the thrombin time, prothrombin time, and AP time were extended by 7.73 times, 2.51 times, and 15 times or more, respectively, at the concentration of 6 mg/ml. In addition, as a result of evaluating the platelet aggregation inhibitory activity of the fraction, it was confirmed that the ethyl acetate fraction exhibited a stronger inhibition of human platelet aggregation at a concentration of 0.25 mg/ml than aspirin at the same concentration. These results indicate that the ethyl acetate fraction of the pollen extract of Cat. pollen has antithrombotic activity through very strong anticoagulant and platelet aggregation inhibitory activity, and that it can replace the existing anticoagulant and antiplatelet agents such as aspirin, which have high side effects. present.

본 발명의 부들 화분 추출물 및 이의 활성 분획 물질들은 감압건조 및 동결건조, 또는 분무건조 등과 같은 통상적인 분말화 과정을 거쳐 분말로 제조될 수 있다. 이들은 혈장 내의 다양한 분해효소에 분해되지 않으며, 100℃의 열처리와 pH 2의 인체 위 내의 pH에서도 활성을 유지한다.The pollen extract of the present invention and its active fractions may be prepared into powder through a conventional powdering process such as drying under reduced pressure and freeze-drying, or spray-drying. They are not degraded by various degrading enzymes in plasma, and they maintain activity even at 100°C heat treatment and pH 2 in the human stomach.

본 발명의 유효성분은 혈전증과 관련된 다양한 질환들의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다. 상기 질환들은, 예를 들어, 동맥 혈전증으로서, 급성 심근 경색증, 가슴 통증, 호흡 곤란, 의식 소실, 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 두통, 운동 이상, 감각 이상, 성격 변화, 시력 저하, 간질 발작, 폐 혈전증, 심부정맥 혈전증, 하지 부종, 통증 및 급성 말초 동맥 폐쇄증 등을 들 수 있고, 정맥 혈전증으로서, 심부정맥 혈전증, 간문맥 혈전증, 급성 신장정맥 폐쇄증, 뇌 정맥동 혈전증 및 중심 망막정맥 폐쇄 등을 들 수 있다.The active ingredient of the present invention can be used for prevention or treatment of various diseases related to thrombosis. These diseases include, for example, arterial thrombosis, acute myocardial infarction, chest pain, shortness of breath, loss of consciousness, ischemic stroke, hemorrhagic stroke, headache, dyskinesia, paresthesia, personality changes, blurred vision, epileptic seizures, pulmonary thrombosis , deep vein thrombosis, lower extremity edema, pain and acute peripheral arterial occlusion, and the like. Examples of venous thrombosis include deep vein thrombosis, portal vein thrombosis, acute renal vein occlusion, cerebral vein sinus thrombosis, and central retinal vein occlusion.

본 발명의 유효 성분을 포함하는 약학적 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.The pharmaceutical composition comprising the active ingredient of the present invention can be prepared according to a conventional method for each purpose of use, oral formulations such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., and injections of sterile injection solutions. It can be formulated and used in various forms, such as oral administration, or administered through various routes including intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, rectal, topical administration, and the like.

이러한 약학적 조성물에는 추가적으로 담체, 부형제 또는 희석제 등이 더 포함될 수 있으며, 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 비정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 더 포함할 수도 있다.The pharmaceutical composition may further include a carrier, excipient, or diluent, and examples of suitable carriers, excipients or diluents that may be included include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, Starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, amorphous cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. and the like. In addition, the pharmaceutical composition of the present invention may further include a filler, an anti-agglomeration agent, a lubricant, a wetting agent, a fragrance, an emulsifier, a preservative, and the like.

바람직한 구체예로서, 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등과 같은 윤활제가 사용될 수도 있다.In a preferred embodiment, solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations include at least one excipient in the pharmaceutical composition, for example, starch, calcium carbonate, It is formulated by mixing sucrose, lactose, gelatin, and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate, talc and the like may be used.

바람직한 구체예로서, 경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.As a preferred embodiment, the oral liquid formulation may be exemplified by a suspension, an internal solution, an emulsion, a syrup, etc., and various excipients, for example, a wetting agent, a sweetening agent, in addition to water and liquid paraffin, which are commonly used simple diluents, Perfumes, preservatives, and the like may be included.

바람직한 구체예로서, 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제 등을 예시할 수 있다. 비수성용제, 현탁제에는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 포함될 수 있다. 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.As a preferred embodiment, sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-drying agents, suppositories, etc. can be exemplified as preparations for parenteral administration. Non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate. Injections may contain conventional additives such as solubilizing agents, isotonic agents, suspending agents, emulsifying agents, stabilizing agents, and preservatives.

본 발명의 유효 성분은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.The active ingredient of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount. In the present invention, "pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is determined by the type, severity, activity of the drug, and the type of disease in the patient; Sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and rate of excretion, duration of treatment, factors including concomitant drugs, and other factors well known in the medical field. The pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or may be administered in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered singly or multiple times. In consideration of all of the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with a minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.

바람직한 구체예로서, 본 발명의 약학적 조성물에서 유효성분의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 ㎏ 당 1 내지 5,000mg, 바람직하게는 100 내지 3,000mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.In a preferred embodiment, the effective amount of the active ingredient in the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the age, sex, and weight of the patient, and generally 1 to 5,000 mg, preferably 100 to 3,000 mg per kg of body weight daily Alternatively, it may be administered every other day or divided into 1 to 3 times a day. However, since it may increase or decrease depending on the route of administration, disease severity, sex, weight, age, etc., the dosage is not intended to limit the scope of the present invention in any way.

본 발명의 약학적 조성물은 다양한 경로를 통하여 대상에 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be administered to a subject through various routes. Any mode of administration can be envisaged, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or intracerebroventricular injection.

본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있다.In the present invention, "administration" means providing a predetermined substance to a patient by any suitable method, and the administration route of the pharmaceutical composition of the present invention is oral or parenteral through all general routes as long as it can reach the target tissue. It can be administered orally. In addition, the composition of the present invention may be administered using any device capable of delivering an active ingredient to a target cell.

본 발명에서 "대상"은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하고, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다.In the present invention, "subject" is not particularly limited, but includes, for example, humans, monkeys, cattle, horses, sheep, pigs, chickens, turkeys, quails, cats, dogs, mice, rats, rabbits or guinea pigs. and preferably a mammal, more preferably a human.

또한, 본 발명의 건강 기능 식품은 혈전증의 예방 또는 개선에 효과적인 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 유효성분을 포함하는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.In addition, the health functional food of the present invention can be used in various ways, such as food and beverage effective for preventing or improving thrombosis. Foods containing the active ingredient of the present invention include, for example, various foods, beverages, gum, tea, vitamin complexes, health supplements, and the like, and may be used in powder, granule, tablet, capsule or beverage form. .

본 발명의 유효성분은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 15중량%로 가할 수 있으며, 건강음료 조성물은 100ml를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.In general, the active ingredient of the present invention may be added in an amount of 0.01 to 15% by weight of the total food weight, and the health beverage composition may be added in a ratio of 0.02 to 10g, preferably 0.3 to 1g, based on 100ml.

본 발명의 건강 기능 식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제, 예컨대, 천연 탄수화물 및 다양한 향미제 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. In addition to containing the above compound as an essential ingredient in the proportion indicated, the health functional food of the present invention may contain food pharmaceutically acceptable food supplement additives, such as natural carbohydrates and various flavoring agents, as additional ingredients.

상기 천연 탄수화물의 예로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토오스, 수크로오스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알코올이 있다. Examples of the natural carbohydrate include monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, and conventional sugars such as polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.

상기 향미제로는 타우마틴; 레바우디오시드 A 또는 글리시르히진과 같은 스테비아 등의 천연 향미제 및 사카린, 아스파르탐 등의 합성 향미제를 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강 기능 식품 100ml당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g을 사용한다. 상기 외에 본 발명의 건강 기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강 기능 식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수도 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 유효성분 100중량부 당 0.01 내지 약 20중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.The flavoring agent includes: thaumatin; A natural flavoring agent such as stevia, such as rebaudioside A or glycyrrhizin, and a synthetic flavoring agent such as saccharin or aspartame may be used. The ratio of the natural carbohydrate is generally about 1 to 20 g, preferably about 5 to 12 g per 100 ml of the health functional food of the present invention. In addition to the above, the health functional food of the present invention includes various nutrients, vitamins, minerals, flavoring agents such as synthetic and natural flavoring agents, colorants and thickeners, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloids It may contain thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonation agents used in carbonated beverages, and the like. In addition, the health functional food of the present invention may contain natural fruit juice, fruit juice for the production of fruit juice drinks, vegetable drinks, and the like. These components may be used independently or in combination. The ratio of these additives is generally selected in the range of 0.01 to about 20 parts by weight per 100 parts by weight of the active ingredient of the present invention.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 일 구체예일 뿐이며, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예의 범위로 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. The following examples are only preferred embodiments of the present invention, and the scope of the present invention is not limited to the scope of the following examples.

[실시예][Example]

실시예 1: 부들 화분 추출물 제조 및 이들의 유용성분 분석 Example 1: Preparation of pollen extract and analysis of useful components thereof

2018년 경북 안동에서 수확한 부들 화분을 구입하여, 열수 및 에탄올 추출물 제조에 사용하였다. 구체적으로는, 부들 화분 시료에 대해 10배의 에탄올을 가하고, 상온에서 2회 반복 추출한 후 추출액을 모아 필터링한 후, 감압 농축하여 분말로 제조하여 에탄올 추출물을 제조하였으며, 이를 대상으로 헥센, 에틸아세테이트, 부탄올로 순차적 유기용매 분획하였으며, 최종적으로 물 잔류물을 회수하였다. 부들 화분 열수 추출물의 경우에는 부들 화분 시료에 대해 10배의 멸균 증류수를 가하고 100℃에서 1시간 2회 반복 추출한 후 상기와 동일하게 여과, 농축하였다. Potted plants harvested in Andong, Gyeongsangbuk-do in 2018 were purchased and used to prepare hot water and ethanol extracts. Specifically, 10 times of ethanol was added to the pollen pollen sample, extracted twice at room temperature, the extract was collected, filtered, and concentrated under reduced pressure to prepare a powder to prepare an ethanol extract, which was subjected to hexene and ethyl acetate. , organic solvent fractionation was sequentially with butanol, and finally the water residue was recovered. In the case of the hot water extract of dandelion pollen, 10 times of sterile distilled water was added to the pollen pollen sample, and the extraction was repeated twice for 1 hour at 100°C, followed by filtration and concentration in the same manner as above.

실험에 사용한 부들 화분은 진노랑의 미세 과립으로 명도 59.44, 적색도 0.35, 황색도는 30.49를 나타내었으며, pH 5.6, brix 20.0, 산도 0.51을 나타내어 약간 시큼한 단맛을 나타내었다. 수분함량은 12.5%로 건조된 상태로 장시간 실온에 방치시 수분을 다시 흡습할 수 있는 상태였다(도 1, 표 1). 현미경(200배) 관찰 결과, 부들 화분은 단립의 구형으로, 표면은 과립상으로 도토리 화분과 유사하였으며, 그물무늬 날개구조가 없어 대표적인 풍매화분인 송화분과도 차별화되었다(도 2). The pollen pollen used in the experiment was dark yellow fine granules, and had a brightness of 59.44, a redness of 0.35, and a yellowness of 30.49, and had a pH of 5.6, brix 20.0, and acidity of 0.51, indicating a slightly sour sweetness. The moisture content was 12.5%, which was a state in which moisture could be absorbed again when left at room temperature for a long time in a dried state (FIG. 1, Table 1). As a result of observation under a microscope (200 times), the pollen was similar to an acorn pollen with a spherical shape and a granular surface, and was differentiated from the pine pollen, which is a representative wind plum pollen, because it did not have a reticulated wing structure (FIG. 2).

[표 1] 부들 화분의 이화학적 특성 및 색차 분석[Table 1] Physicochemical properties and color difference analysis of pollen

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영양성분 분석 결과, 조단백 18.2%, 조지방 1.0%, 조탄수화물 64.1%를 나타내어 338 kcal/100g으로 우수하였으며, 회분 함량도 4.2%를 나타내어 다양한 미네랄을 대량으로 포함하고 있었다(표 2). As a result of nutrient analysis, 18.2% of crude protein, 1.0% of crude fat, and 64.1% of crude carbohydrate were excellent at 338 kcal/100g, and ash content was also 4.2%, which included a large amount of various minerals (Table 2).

[표 2] 부들 화분의 영양성분 분석[Table 2] Nutrient analysis of pollen pollen

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부들 화분 추출물의 성분 분석으로 총 폴리페놀, 총 플라보노이드, 총당 및 환원당 함량을 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 추출 검액 400μl에 50μl의 Folin-ciocalteau, 100μl의 Na2CO3 포화용액을 넣고, 실온에서 1시간 방치한 후 725nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 tannic acid를 사용하였다. 총 플라보노이드 함량은 각각의 시료를 18시간 메탄올 교반 추출하고, 여과한 추출 검액 400μl에 90% diethylene glycol 4ml를 첨가하고 다시 1 N NaOH 40μl를 넣고 37℃에서 1시간 반응 후 420nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 rutin을 사용하였다. 환원당은 DNS법으로, 총당은 phenol-sulfuric acid법을 이용하여 정량하였다. The content of total polyphenols, total flavonoids, total sugars and reducing sugars was measured by analysis of the components of the pollen extract. For the total polyphenol content, 50 μl of Folin-ciocalteau and 100 μl of Na 2 CO 3 saturated solution were added to 400 μl of the extraction sample solution, and the absorbance was measured at 725 nm after standing at room temperature for 1 hour. As a standard reagent, tannic acid was used. For the total flavonoid content, each sample was extracted with methanol for 18 hours, and 4 ml of 90% diethylene glycol was added to 400 μl of the filtered extraction sample, 40 μl of 1 N NaOH was added, and the absorbance was measured at 420 nm after reaction at 37° C. for 1 hour. As a standard reagent, rutin was used. Reducing sugar was quantified by DNS method and total sugar was quantified by phenol-sulfuric acid method.

[표 3] 부들 화분 에탄올 및 열수 추출물의 추출효율과 유용성분 분석[Table 3] Extraction efficiency and useful components analysis of ethanol and hot water extract

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표 3에 나타낸 바와 같이, 부들 화분 에탄올 추출 효율은 12.5%로 열수 추출효율(29.8%)보다 낮았다. 또한, 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 함량은 열수 추출물에 비해 57.4% 수준으로 낮았으며, 총 플라보노이드 함량은 열수 추출물 및 에탄올 추출물에서 유사하게 나타났다. 또한, 총당 및 환원당 함량은 열수 추출물이 에탄올 추출물보다 2.7배 및 2.65배 높게 나타나, 열수 추출물은 대부분이 당으로 구성되어 있음을 알 수 있었다. As shown in Table 3, the ethanol extraction efficiency of pollen pollen was 12.5%, which was lower than that of hot water extraction (29.8%). In addition, the total polyphenol content of the ethanol extract was lower at 57.4% than that of the hot water extract, and the total flavonoid content was similar in the hot water extract and the ethanol extract. In addition, the total sugar and reducing sugar contents were 2.7 times and 2.65 times higher in the hot water extract than in the ethanol extract, indicating that most of the hot water extract was composed of sugar.

실시예 2: 부들 화분 추출물의 혈액응고 저해활성 평가 Example 2: Evaluation of blood clotting inhibitory activity of pollen extract

실시예 1의 에탄올 추출물 및 열수 추출물의 혈액응고 저해활성을 평가하여 그 결과를 표 4에 나타내었다. 이때, 부들 화분 추출물의 혈액응고 저해활성 평가방법은 기존에 보고된 방법에 준해 평가하였으며(Sohn et al., 2004. Kor. J. Pharmacogn 35. 52-61; Kwon et al., 2004. J. Life Science, 14. 509-513; 류 등 2010. J. Life Science, 20. 922-928), 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임과 에이피티티 타임을 측정하였다. 혈장은 시판 control plasma(MD Pacific Technology Co., Ltd, Huayuan Industrial Area, China)를 사용하였으며 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임과 에이피티티 측정법은 다음과 같은 과정으로 수행되었다.The blood coagulation inhibitory activity of the ethanol extract and hot water extract of Example 1 was evaluated, and the results are shown in Table 4. In this case, the blood coagulation inhibitory activity of the pollen extract was evaluated according to the previously reported method (Sohn et al., 2004. Kor. J. Pharmacogn 35. 52-61; Kwon et al., 2004. J. Life Science, 14. 509-513; Ryu et al. 2010. J. Life Science, 20. 922-928), thrombin time, prothrombin time, and AP time were measured. For plasma, commercially available control plasma (MD Pacific Technology Co., Ltd, Huayuan Industrial Area, China) was used, and thrombin time, prothrombin time and AP were performed as follows.

트롬빈 타임(Thrombin Time)Thrombin Time

37℃에서 0.5U 트롬빈(Sigma Co., USA) 50μl와 20 mM CaCl2 50μl, 다양한 농도의 시료 추출액 10μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 혼합하여 2분간 반응시킨 후, 혈장 100μl를 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 대조로는 아스피린(Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 32.1초의 응고시간을 나타내었다. 트롬빈 저해 효과는 3회 이상 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 트롬빈 저해활성은 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조구의 응고시간으로 나눈 값으로 나타내었다.At 37°C, 50 μl of 0.5U thrombin (Sigma Co., USA), 50 μl of 20 mM CaCl 2 , and 10 μl of sample extracts of various concentrations were mixed in a tube of Amelung coagulometer KC-1A (Japan) and reacted for 2 minutes, and then 100 μl of plasma was collected. After the addition, the time until plasma coagulation was measured. Aspirin (Sigma Co., USA) was used as a control, and DMSO was used instead of the sample as a solvent control. DMSO showed a coagulation time of 32.1 seconds. The thrombin inhibitory effect was expressed as an average of three or more repeated experiments.

프로트롬빈 타임(prothrombin time)prothrombin time

표준혈장(MD Pacific Co., China) 70μl와 다양한 농도의 시료액 10μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 첨가하여 37℃에서 3분간 가온 후, 130μl의 PT reagent를 첨가하고 혈장이 응고될 때까지의 시간을 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었다. 대조로는 아스피린(Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 18.1초의 응고시간을 나타내었다. 프로트롬빈 저해활성은 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조구의 응고시간으로 나눈 값으로 나타내었다.70 μl of standard plasma (MD Pacific Co., China) and 10 μl of sample solutions of various concentrations were added to the tube of Amelung coagulometer KC-1A (Japan), heated at 37° C. for 3 minutes, 130 μl of PT reagent was added, and plasma was coagulated. The time until completion was expressed as the average value of the experiment repeated three times. Aspirin (Sigma Co., USA) was used as a control, and DMSO was used instead of the sample as a solvent control. In the case of DMSO, the clotting time was 18.1 seconds. The prothrombin inhibitory activity was expressed as a value obtained by dividing the coagulation time at the time of sample addition by the coagulation time of the solvent control.

aPTT(activated Partial Thromboplastin Time) Activated Partial Thromboplastin Time (aPTT)

혈장 100μl와 다양한 농도의 시료 추출액 10μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 첨가하여 37℃에서 3분간 가온한 후, 50μl의 aPTT reagent(Sigma, ALEXINTM)를 첨가하고 다시 37℃에서 3분간 배양하였다. 이후, 50μl CaCl2(35mM)을 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였으며, 이 경우 55.1초의 응고시간을 나타내었다. aPTT의 결과는 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 혈액응고인자 저해활성은 시료 첨가시의 aPTT시간을 용매 대조구의 aPTT시간으로 나눈 값으로 나타내었다.100 μl of plasma and 10 μl of sample extracts of various concentrations were added to the tube of Amelung coagulometer KC-1A (Japan) and heated at 37° C. for 3 minutes. Then, 50 μl of aPTT reagent (Sigma, ALEXIN TM ) was added, followed by 3 at 37° C. Incubated for minutes. Then, after adding 50 μl CaCl 2 (35 mM), the time until plasma coagulation was measured. As a solvent control, DMSO was used instead of the sample, and in this case, the coagulation time was 55.1 seconds. The aPTT result was expressed as the average value of the experiment repeated three times, and the blood coagulation factor inhibitory activity was expressed as the aPTT time at the time of sample addition divided by the aPTT time of the solvent control.

[표 4] 부들 화분 에탄올 추출물 및 열수 추출물의 혈액응고 저해활성[Table 4] Blood clotting inhibitory activity of ethanol extract and hot water extract

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그 결과, 표 4에 나타낸 바와 같이 열수 추출물은 5mg/ml 농도에서 미약한 혈액응고 저해활성을 나타낸 반면, 에탄올 추출물은 5mg/ml 농도에서 항혈전제로 사용되고 있는 아스피린(1.5mg/ml)보다 우수한 프로트롬빈 및 혈액응고인자 저해활성(에이피티 타임)을 나타내었다. As a result, as shown in Table 4, the hot water extract showed weak blood coagulation inhibitory activity at the concentration of 5 mg/ml, whereas the ethanol extract showed better prothrombin than aspirin (1.5 mg/ml), which is used as an antithrombotic agent at the concentration of 5 mg/ml. and blood coagulation factor inhibitory activity (APT time).

실시예 3: 부들 화분 추출물의 혈소판 응집저해 활성 Example 3: Platelet aggregation inhibitory activity of Pollen Pollen Extract

실시예 1의 에탄올 추출물 및 열수 추출물의 인간 혈소판 응집저해 활성을 평가하여 그 결과를 표 5에 나타내었다. 혈소판은 다양한 혈구세포와 함께 혈관을 순환하는 원반형의 작은 세포로서, 핵이 없는 대신 혈관손상보호 및 혈소판 응집과 관련된 다양한 물질을 고농도로 포함하는 cytoplasmic granule을 가지고 있으며, 혈관내벽의 손상이 나타나는 경우 응집인자들을 분비하고, 내피세포의 손상으로 노출된 collagen 등과 결합하여 1차 지혈 플러그(primary hemostatic plug)를 형성하여 혈전생성을 개시하는 중요한 세포이다, 따라서 혈소판 응집저해는 혈전 생성을 방지하는 매우 중요한 활성이다. 혈소판 응집저해 활성은 다음의 방법에 준해 평가하였다. The human platelet aggregation inhibitory activity of the ethanol extract and hot water extract of Example 1 was evaluated, and the results are shown in Table 5. Platelets are disk-shaped small cells that circulate in blood vessels together with various blood cells. Instead of having a nucleus, they have cytoplasmic granules containing various substances related to vascular damage protection and platelet aggregation in high concentrations. It is an important cell that secretes factors and initiates thrombus formation by forming a primary hemostatic plug by binding to collagen exposed due to endothelial cell damage. Therefore, platelet aggregation inhibition is a very important activity to prevent thrombus formation to be. The platelet aggregation inhibitory activity was evaluated according to the following method.

혈소판 응집저해 활성(Platelet aggregation inhibition activity)Platelet aggregation inhibition activity

혈소판은 인간 농축혈소판을 사용하였으며, 이를 washing buffer(138mM NaCl, 2.7mM KCl, 12mM NaHCO3, 0.36mM NaH2PO4, 5.5mM Glucose, 1mM EDTA, pH 6.5)로 1회 세척하였다. 이후, suspending buffer(138mM NaCl, 2.7mM KCl, 12mM NaHCO3, 0.36mM NaH2PO4, 5.5mM Glucose, 0.49mM MgCl2, 0.25% gelatin, pH 7.4)에 재 현탁한 후, 3,000rpm에서 10분간 원심분리한 후 다시 suspending buffer에 재 현탁하였으며, 이때, 혈소판 수는 4x109/ml이 되도록 조정하였다. 이후, 1ml 현탁액에 2.5μl collagen을 가해 5분간 반응시키고, whole-blood aggregometer(Chrono-log, USA)를 사용하여 37℃에서 혈소판 응집을 측정하였다.Platelets were human concentrated platelets, which were washed once with washing buffer (138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 12 mM NaHCO 3 , 0.36 mM NaH 2 PO 4 , 5.5 mM Glucose, 1 mM EDTA, pH 6.5). Then, re-suspended in suspending buffer (138mM NaCl, 2.7mM KCl, 12mM NaHCO 3 , 0.36mM NaH 2 PO 4 , 5.5mM Glucose, 0.49mM MgCl 2 , 0.25% gelatin, pH 7.4), and then at 3,000 rpm for 10 minutes After centrifugation, it was resuspended in suspending buffer, and the platelet count was adjusted to be 4x10 9 /ml. Then, 2.5 μl collagen was added to the 1 ml suspension, reacted for 5 minutes, and platelet aggregation was measured at 37° C. using a whole-blood aggregometer (Chrono-log, USA).

[표 5] 부들 화분 열수 추출물 및 에탄올 추출물의 혈소판 응집저해 활성[Table 5] Platelet aggregation inhibitory activity of hot water extract and ethanol extract

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표 5에 나타낸 바와 같이, 먼저, 아스피린은 0.25mg/ml 농도에서 42.3%의 응집을 나타내어 우수한 혈소판 응집저해를 나타내어 임상에서 항혈전제로 사용되는 근거를 알 수 있었다. 한편, 부들 화분 열수 추출물은 0.25mg/ml에서 154.1%, 에탄올 추출물은 0.25mg/ml 농도에서 318.8%의 인간 혈소판 응집을 촉진하여 부들 화분 추출물은 강력한 혈소판 응집활성을 나타내어 민간 및 한방에서 지혈제로 사용하는 근거를 알 수 있었다. 또한, 부들 화분의 에탄올 추출물은 항응고 활성과 혈소판 응집촉진 활성을 통해, 혈전 생성 억제 및 혈전 생성 촉진 활성의 상반된 활성을 동시에 가짐을 알 수 있었다. 실제 부들 화분은 한방에서 지혈제 및 어혈 제거의 상반된 효능에 사용되고 있다. As shown in Table 5, first, aspirin exhibited an aggregation of 42.3% at a concentration of 0.25 mg/ml, indicating an excellent inhibition of platelet aggregation, thereby confirming the rationale for its use as an antithrombotic agent in clinical practice. On the other hand, the hot water extract of dandelion pollen promotes 154.1% of human platelet aggregation at 0.25 mg/ml and the ethanol extract at a concentration of 0.25 mg/ml of 318.8%, and the pollen extract shows strong platelet aggregation activity, so it is used as a hemostatic agent in folk and oriental medicine. could understand the rationale for In addition, it was found that the ethanol extract of pollen pollen had anticoagulant activity and platelet aggregation promoting activity, and simultaneously had opposite activities of thrombus formation inhibition and thrombus formation promoting activity. In fact, pollen pollen is used in oriental medicine for the opposing efficacy of a hemostatic agent and removal of blood stasis.

실시예 4: 부들 화분 에탄올 추출물의 순차적 유기용매 분획물의 제조 및 이들의 유용성분 분석 Example 4: Preparation of Sequential Organic Solvent Fractions of Ethanol Extract of Pollen Pollen and Their Useful Component Analysis

실시예 1에서 조제된 부들 화분 에탄올 추출물을 대상으로 헥센, 에틸아세테이트, 부탄올로 순차적 유기용매 분획하였으며, 최종적으로 물 잔류물을 회수하였다. 이들의 분획 효율과 성분 분석 결과는 표 6에 나타내었다. The ethanol extract prepared in Example 1 was subjected to sequential organic solvent fractionation with hexene, ethyl acetate, and butanol, and finally the water residue was recovered. Their fractionation efficiency and component analysis results are shown in Table 6.

[표 6] 부들 화분 에탄올 추출물의 분획물의 수율 및 유용성분 분석[Table 6] Analysis of yield and useful components of fractions of ethanol extract of pollen pollen

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표 6에 나타낸 바와 같이, 부들 화분 추출물 중 가장 많은 부분은 헥센 분획물(70.3%)로 부들 화분의 에탄올 추출물이 상당량의 지용성 성분을 포함함을 알 수 있었으며, 부탄올 분획물 및 물 잔류물은 각각 추출물의 12.8% 및 12.1%를 차지하였다. 가장 낮은 수율을 나타낸 에틸아세테이트 분획물은 부들 화분 추출물의 9.5%를 나타내어, 부들 화분 100g당 1.18g을 회수할 수 있었다. As shown in Table 6, it was found that the largest portion of the pollen extracts of Cat. pollen was the hexene fraction (70.3%), and it was found that the ethanol extract of the pollen of Cat. pollen contained a significant amount of fat-soluble components, and the butanol fraction and the water residue were respectively the fraction of the extract. 12.8% and 12.1%. The ethyl acetate fraction exhibiting the lowest yield represented 9.5% of the pollen extract, 1.18 g per 100 g of cattail pollen could be recovered.

한편, 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량 분석 결과, 에틸아세테이트 분획물에서 가장 높은 함량의 폴리페놀 함량(89.0mg/g) 및 플라보노이드 함량(101.6mg/g)을 나타내었다. 이는 가장 낮은 함량을 나타낸 물 잔류물에 비해 9.1배의 높은 폴리페놀 함량 및 5.95배의 높은 플라보노이드 함량이었다. 따라서, 부들 화분 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 다양한 생리활성을 나타내리라 예상되었으며, 실제 분석 결과, 상기 분획물은 강력한 항산화 활성 및 nitrite 소거능을 나타내었다. 따라서, 부들 화분의 에틸아세테이트 분획물은 우수한 항산화 활성, 발암억제 활성을 나타내어 혈행개선 및 항혈전 활성에 부가적으로 기여하리라 예상된다.On the other hand, as a result of analysis of the total polyphenol and total flavonoid content, the ethyl acetate fraction showed the highest polyphenol content (89.0 mg/g) and flavonoid content (101.6 mg/g). This was 9.1 times higher polyphenol content and 5.95 times higher flavonoid content compared to the water residue with the lowest content. Therefore, it was expected that the ethyl acetate fraction of the pollen pollen extract would exhibit various physiological activities, and as a result of actual analysis, the fraction exhibited strong antioxidant activity and nitrite scavenging ability. Therefore, it is expected that the ethyl acetate fraction of the pollen pollen will additionally contribute to the improvement of blood circulation and antithrombotic activity by exhibiting excellent antioxidant and carcinogenic activity.

실시예 5: 부들 화분 에탄올 추출물의 순차적 유기용매 분획물의 항응고 활성 Example 5: Anticoagulant activity of sequential organic solvent fractions of ethanol extract of pollen pollen

실시예 4에서 조제된 부들 화분 에탄올 추출물의 순차적 유기용매 분획물의 항응고 활성을 실시예 2의 방법과 동일하게 평가하였으며, 그 결과는 표 7에 나타내었다. The anticoagulant activity of the sequential organic solvent fractions of the ethanol extract prepared in Example 4 was evaluated in the same manner as in Example 2, and the results are shown in Table 7.

[표 7] 부들 화분 에탄올 추출물의 순차적 유기용매 분획물의 항응고 활성[Table 7] Anticoagulant activity of sequential organic solvent fractions of Ethanol extract of pollen pollen

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부들 화분 추출물의 분획물 중, 부탄올 분획물 및 물 잔류물은 항응고 활성이 인정되지 않았지만, 헥센 분획물 및 에틸아세테이트 분획물은 강력한 트롬빈 및 혈액응고인자 저해를 나타내었다. 특히, 에틸아세테이트 분획물의 경우, 내인성 혈전 생성에 기여하는 혈액 응고 인자를 우수하게 저해하여 강력한 항응고 활성을 나타냄을 확인하였다. Among the fractions of the pollen extract, the butanol fraction and the water residue showed no anticoagulant activity, but the hexene fraction and the ethyl acetate fraction showed strong inhibition of thrombin and blood coagulation factors. In particular, it was confirmed that the ethyl acetate fraction exhibited strong anticoagulant activity by excellently inhibiting blood coagulation factors contributing to endogenous thrombus formation.

실시예 6: 부들 화분 에탄올 추출물의 순차적 유기용매 분획물의 인간 혈소판 응집저해 활성 Example 6: Human platelet aggregation inhibitory activity of sequential organic solvent fractions of ethanol extract of pollen pollen

실시예 4에서 조제된 부들 화분 에탄올 추출물의 순차적 유기용매 분획물의 인간 혈소판 응집저해 활성을 실시예 3의 방법과 동일하게 평가하였으며, 그 결과는 표 8에 나타내었다. The human platelet aggregation inhibitory activity of the sequential organic solvent fractions of the ethanol extract prepared in Example 4 was evaluated in the same manner as in Example 3, and the results are shown in Table 8.

[표 8] 부들 화분 에탄올 추출물의 순차적 유기용매 분획물의 혈소판 응집저해 활성[Table 8] Platelet aggregation inhibitory activity of sequential organic solvent fractions of Ethanol extract of pollen pollen

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그 결과, 부들 화분 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물에서만 인간 혈소판 응집이 강력하게 나타났으며, 0.25mg/ml 농도에서 8%의 혈소판 응집활성을 나타내었다. 이는 동일농도의 아스피린보다 우수한 응집저해로서 부들 화분의 에틸아세테이트 분획물이 출혈성 부작용과 위장 장해 및 과민 반응 등으로 그 사용이 제한되고 있는 아스피린과 같은 기존 항혈전제를 보완, 대체할 수 있음을 제시하고 있다. 부들 화분 분획물 중 가장 많은 양을 차지하는 헥센 분획물은 170% 이상의 응집도를 나타내어 오히려 혈소판 응집촉진 활성에 의한 지혈효과를 나타낼 것으로 예상되었다. As a result, human platelet aggregation was strongly observed only in the ethylacetate fraction of the ethanol extract of pollen pollen, and showed a platelet aggregation activity of 8% at a concentration of 0.25 mg/ml. This is a better inhibition of aggregation than aspirin at the same concentration, suggesting that the ethyl acetate fraction of pollen pollen can supplement and replace existing antithrombotic agents, such as aspirin, whose use is limited due to bleeding side effects, gastrointestinal disorders, and hypersensitivity reactions. have. The hexene fraction, which occupies the largest amount of pollen fractions, exhibited a degree of aggregation of 170% or more, which was expected to show a hemostatic effect by promoting platelet aggregation.

실시예 7: 부들 화분 추출물 및 이의 분획물의 인간 적혈구 용혈 활성Example 7: Human Erythrocyte Hemolytic Activity of Cattail Pollen Extract and Fractions Thereof

부들 화분은 식품원료로 등록되어 안전성이 확보되어 있으며, 그 자체로도 식용하며, 다양한 식품가공의 부재료 및 첨가물로도 사용되고 있다. 부들 화분 추출물 및 이의 분획물의 급성독성 가능성을 평가하기 위해 인간 적혈구 용혈 활성을 평가하였으며, 그 결과는 표 9에 나타내었다. Pollen pollen is registered as a food raw material, so safety is secured, and it is edible by itself, and is also used as an auxiliary material and additive for various food processing. Human red blood cell hemolytic activity was evaluated in order to evaluate the acute toxicity potential of Cat. pollen extract and its fractions, and the results are shown in Table 9.

이때 용혈 활성은 기존의 보고(손호용, 2014년 ㆍKorean J. Microbiol. Biotechnol. 42: 285-292)에 준해 평가하였으며, 간단하게는 PBS로 3회 수세한 인간 적혈구 100μl를 96-well microplate에 가하고 다양한 농도의 시료용액 100μl를 가한 다음 37℃에서 30분간 반응시켰으며, 이후, 반응액을 10분간 원심분리(1,500rpm)하여 상등액 100μl를 새로운 microtiter plate로 옮긴 후 용혈에 따른 헤모글로빈 유출 정도를 414nm에서 측정하였다. 시료의 용매 대조구로는 DMSO(2%)를 사용하였으며, 적혈구 용혈을 위한 실험 대조구로는 Triton X-100(1mg/ml)를 사용하였다. 용혈 활성은 다음의 수식을 이용하여 계산하였다.At this time, the hemolytic activity was evaluated according to the previous report (Ho-Yong Son, 2014 ㆍKorean J. Microbiol. Biotechnol. 42: 285-292), and 100 μl of human red blood cells washed three times with PBS was simply added to a 96-well microplate. 100 μl of sample solutions of various concentrations were added, followed by reaction at 37° C. for 30 minutes. After that, the reaction solution was centrifuged (1,500 rpm) for 10 minutes, and 100 μl of the supernatant was transferred to a new microtiter plate, and the degree of hemoglobin leakage due to hemolysis was measured at 414 nm. measured. DMSO (2%) was used as a solvent control of the sample, and Triton X-100 (1 mg/ml) was used as an experimental control for hemolysis of red blood cells. Hemolytic activity was calculated using the following formula.

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[표 9] 부들 화분 추출물 및 이의 분획물의 인간 적혈구 용혈 활성[Table 9] Human erythrocyte hemolytic activity of Cat. pollen extract and fractions thereof

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먼저, 대조구로 사용된 DMSO와 물은 용혈 활성이 없었으며, triton X-100은 1mg/ml 농도에서 적혈구를 100% 용혈시킴을 확인하였다. 또한, 항암제, 항진균제로 사용되고 있는 amphotericin B의 경우 0.025mg/ml 농도에서 50% 이상 적혈구를 용혈시킴을 확인하였다. 본 발명의 부들 화분의 에탄올 추출물 및 헥센 분획물을 제외한 분획물들은 1mg/ml 농도까지 전혀 적혈구 용혈현상이 나타나지 않아 급성독성 및 적혈구 용혈 활성은 없음을 확인하였다. 헥센 분획물은 1mg/ml 농도에서 73.9%, 0.5mg/ml에서 67.8%, 0.25mg/ml에서 30.5%의 적혈구 용혈 활성을 나타내어 급성독성 가능성이 있을 것으로 판단되었으며, 에탄올 추출물 역시 1mg/ml 농도에서 82.7%, 0.5mg/ml에서 93.2%, 0.25mg/ml에서 41.6%의 적혈구 용혈 활성을 나타내어 실제적 사용에 제한이 있을 것으로 판단되었다. First, DMSO and water used as controls had no hemolytic activity, and it was confirmed that triton X-100 hemolyzed red blood cells 100% at a concentration of 1 mg/ml. In addition, in the case of amphotericin B, which is used as an anticancer and antifungal agent, it was confirmed that more than 50% of red blood cells were hemolyzed at a concentration of 0.025 mg/ml. Fractions other than the ethanol extract and hexene fraction of the pollen of the present invention did not show any red blood cell hemolysis at a concentration of 1 mg/ml, confirming that there was no acute toxicity and no red blood cell hemolytic activity. The hexene fraction showed a hemolytic activity of 73.9% at 1mg/ml, 67.8% at 0.5mg/ml, and 30.5% at 0.25mg/ml, so it was judged to have acute toxicity potential, and the ethanol extract was also 82.7 at 1mg/ml. %, 93.2% at 0.5mg/ml, and 41.6% at 0.25mg/ml, it was judged that there would be restrictions on practical use.

실시예 8: 부들 화분 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물의 혈장, 산 및 열 안정성 평가 Example 8: Evaluation of Plasma, Acid and Thermal Stability of Ethyl Acetate Fraction of Ethanol Extract of Cattail Pollen Pollen

상기 실시예 4에서 얻은 에틸아세테이트 분획물을 대상으로 항혈전 활성에 대한 혈장 안정성, 열 안정성 및 산 안정성을 확인하였다. 부들 화분의 상기 활성 분획물은 100℃에서 1시간 열 처리, pH 2(0.01M HCl)에서의 1시간 처리, 혈장에서 1시간 처리시에도 혈액 응고 저해 및 혈소판 응집 저해 활성의 감소가 나타나지 않았다. 따라서, 부들 화분의 에틸아세테이트 분획물은 내산성, 내열성을 가진 다양한 성분의 항혈전 활성물질을 포함하고 있음을 확인하였다. Plasma stability, thermal stability and acid stability for antithrombotic activity were confirmed for the ethyl acetate fraction obtained in Example 4. The active fraction of the pollen of dandelion did not show any decrease in blood coagulation inhibitory and platelet aggregation inhibitory activity even after 1 hour heat treatment at 100° C., 1 hour treatment at pH 2 (0.01 M HCl), and 1 hour treatment in plasma. Therefore, it was confirmed that the ethyl acetate fraction of pollen pollen contains antithrombotic active substances of various components having acid resistance and heat resistance.

상기와 같은 결과에서와 같이, 부들 화분 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 우수한 항응고, 혈소판 응집저해 활성을 나타내면서도 인간 적혈구에 대한 용혈활성이 없어 실제적인 항혈전제로 사용 가능함을 제시하였다. As shown in the above results, it was suggested that the ethyl acetate fraction of the pollen extract of Cat. pollen exhibited excellent anticoagulant and platelet aggregation inhibitory activity, but did not have hemolytic activity against human red blood cells, suggesting that it could be used as a practical antithrombotic agent.

Claims (4)

부들 화분(Pollen of Typha augustifolia L.) 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.A pharmaceutical composition for preventing or treating thrombosis, comprising an ethyl acetate fraction of Pollen of Typha augustifolia L. ethanol extract as an active ingredient. 부들 화분(Pollen of Typha augustifolia L.) 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 항혈액응고제.An anticoagulant containing the ethyl acetate fraction of Pollen of Typha augustifolia L. ethanol extract as an active ingredient. 부들 화분(Pollen of Typha augustifolia L.) 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 항혈소판제.An antiplatelet agent comprising the ethyl acetate fraction of Pollen of Typha augustifolia L. ethanol extract as an active ingredient. 부들 화분(Pollen of Typha augustifolia L.) 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 포함하는 혈전증의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품.A health functional food for preventing or improving thrombosis, comprising the ethyl acetate fraction of Pollen of Typha augustifolia L. ethanol extract.
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