KR102275276B1 - Animal model of allergic respiratory disease and use thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 알레르기성 호흡기 질환의 동물 모델의 제조 방법, 이에 의해 제조된 알레르기성 호흡기 질환의 동물 모델과 이의 다양한 용도에 관한 것이다.
본 발명에서 제공하는 동물 모델은 알레르기성 호흡기 질환의 연구에 유용한 동물 모델로 활용될 수 있을 뿐만 아니라 상기 알레르기성 호흡기 질환의 병태 생리 규명과 치료 약제 개발에도 널리 응용될 수 있다.The present invention relates to a method for producing an animal model of an allergic respiratory disease, an animal model of an allergic respiratory disease prepared thereby, and various uses thereof.
The animal model provided by the present invention can be utilized as a useful animal model for the study of allergic respiratory diseases, and can be widely applied to the pathophysiology of the allergic respiratory disease and the development of therapeutic agents.
Description
본 발명은 알레르기성 호흡기 질환의 동물 모델의 제조 방법, 이에 의해 제조된 알레르기성 호흡기 질환의 동물 모델과 이의 다양한 용도에 관한 것이다. The present invention relates to a method for producing an animal model of an allergic respiratory disease, an animal model of an allergic respiratory disease prepared thereby, and various uses thereof.
기관지 천식과 알레르기 비염으로 대표되는 호흡기 알레르기 질환은 최근 미세먼지와 대기오염 등에 의한 알레르기 유발인자들이 증가함에 따라, 유병률이 증가하고 있다. 기관지 천식은 기도의 만성적인 염증으로 호흡 곤란, 천명, 가슴답답함, 기침과 같은 증상이 기도 과민성과 함께 동반된다. 기관지 천식은 전 세계적으로 3억 3천명 이상이 이환되어 있는 주요 만성 질환으로 급성 악화될 시 생명을 위협할 수 있으며, 매년 34만 명이 천식으로 인해 사망하고 있다. 또한 만성적인 경과로 인해 일상생활에 지장을 초래하여 사회 경제적인 부담을 초래하고 있다. 천식의 증상은 개인의 항원 감작 정도에 따라 증상의 경중이 다양하게 나타나서 경증, 중등증, 중증 천식으로 나눌 수 있으며, 염증 세포의 침윤에 따라 호산구성 천식과 비호산구성 천식으로 나눌 수 있으며, 이는 병인에 다양한 면역반응이 작용함을 의미함. 따라서 천식의 병태생리에 어떠한 면역학적 기전이 작용하는지에 대한 기초 연구가 중요하다.Respiratory allergic diseases represented by bronchial asthma and allergic rhinitis have recently increased in prevalence as allergens such as fine dust and air pollution have increased. Bronchial asthma is a chronic inflammation of the airways, and symptoms such as shortness of breath, wheezing, chest tightness, and cough are accompanied by airway hypersensitivity. Bronchial asthma is a major chronic disease that affects more than 330 million people worldwide and can be life-threatening when acutely exacerbated, and 340,000 people die from asthma every year. In addition, the chronic course interferes with daily life, resulting in social and economic burdens. Asthma symptoms vary in severity depending on the degree of antigen sensitization of an individual and can be divided into mild, moderate, and severe asthma, and can be divided into eosinophilic asthma and non-eosinophilic asthma according to the infiltration of inflammatory cells. It means that various immune responses act on the etiology. Therefore, basic research on which immunological mechanisms act on the pathophysiology of asthma is important.
천식의 병태 생리를 밝히기 위한 연구를 환자를 대상으로 반복적으로 시행하는 것은 윤리적인 문제로 현실적으로 불가능하기 때문에, 대부분의 생체 내 연구는 동물 모델을 기반으로 이루어지고 있다. 기관지 천식 동물 모델은 면역계와 호흡기계에서 천식의 발병 상황을 구현함으로써 병태 생리를 이해할 수 있도록 해주며, 치료 약제의 효능을 검증하는데도 유용하게 사용되고 있다. 마우스는 가장 널리 사용되는 동물인데 그 이유는 형질 전환 (transgenic), 유사 유전자형 (congenic), 유전자 결핍 (knock out) 동물을 얻기가 용이하여 특정 유전자를 표적으로 질환의 발병에 유전자가 미치는 영향을 잘 관찰할 수 있으며 유전자 정보가 잘 밝혀져 있기 때문이다. 다양한 근교계 마우스 형질이 존재하고, 면역학적 연구에 사용가능한 단클론항체를 비롯한 특정 시약의 이용이 다른 동물에 비해 쉬우며, 사이토카인, 성정인자, 세포표면물질 등을 측정하기 용이하다는 장점이 있다. 또한 실험자 입장에서 크기가 작아 다루기에 편하고, 값이 다른 동물보다 저렴할 뿐만 아니라 키우는 데 비용이 덜 들어가서 경제적으로 유리한 장점이 있어서 천식뿐만 아니라 여러 질환의 연구에 가장 널리 사용되고 있다. Since it is practically impossible to repeatedly conduct research to elucidate the pathophysiology of asthma in patients due to ethical issues, most in vivo studies are based on animal models. The animal model of bronchial asthma helps to understand the pathophysiology by realizing the onset situation of asthma in the immune and respiratory systems, and is also usefully used to verify the efficacy of therapeutic agents. The mouse is the most widely used animal because it is easy to obtain transgenic, congenic, and knock-out animals, so that specific genes are targeted and the effects of genes on the pathogenesis of diseases are well studied. It is observable and genetic information is well known. Various inbred mouse traits exist, use of specific reagents including monoclonal antibodies that can be used for immunological research is easier than other animals, and it has the advantage of being easy to measure cytokines, sexual factors, and cell surface materials. In addition, from the point of view of the experimenter, it is the most widely used in the study of various diseases as well as asthma because it is convenient to handle because of its small size, and the price is cheaper than other animals, and it is economically advantageous because it costs less to raise.
마우스를 비롯한 동물은 천식이 저절로 발병하지는 않아서 인위적으로 항원을 투여하여 감작 반응을 유도하여 기관지에 천식 유사 상황을 만들어야 한다. 그런데 천식 마우스 모델을 제작하는 기존의 방법은 몇 가지 한계점이 있다. 호흡기로 투여한 항원이 하기도까지 도달하기 위해서는 마우스를 전신마취 시켜야 하는데, 며칠 동안 반복되는 마취와 항원 투여는 실험자 뿐만 아니라 마우스에게도 스트레스를 주는 상황으로 작용할 뿐만 아니라 마취 자체가 인위적으로 조절을 해야하는 상황으로 이에 의한 변수가 발생할 수 있다. 또한 항원의 흡입 정도가 개체간에 차이가 있어서 같은 실험군 내에서도 표현형의 차이가 발생하는 문제가 있다. Animals, including mice, do not develop asthma on their own, so the sensitization reaction must be induced by artificially administering antigens to create an asthma-like situation in the bronchial tubes. However, the existing method for producing an asthma mouse model has several limitations. In order for the antigen administered through the respiratory tract to reach the lower respiratory tract, the mouse must be under general anesthesia. Repeated anesthesia and antigen administration for several days not only stresses the experimenter but also the mouse, and the anesthesia itself must be artificially controlled. Variables may arise from this. In addition, there is a problem that there is a difference in the phenotype even within the same experimental group because the degree of antigen inhalation differs between individuals.
본 발명의 일 목적은 간단하고 용이하면서도 제작되는 개개의 동물 모델 간에 편차가 적도록 알레르기성 호흡기 질환의 동물 모델을 제조하는 방법을 제공하고자 한다.One object of the present invention is to provide a method for manufacturing an animal model of allergic respiratory disease so that there is little variation between individual animal models that are simple and easy to manufacture.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 방법에 따라 제조된 알레르기성 호흡기 질환의 동물 모델을 제공하고자 한다.Another object of the present invention is to provide an animal model of allergic respiratory disease prepared according to the method of the present invention.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 방법에 따라 제조된 알레르기성 호흡기 질환의 동물 모델의 다양한 용도에 관한 것이다. Another object of the present invention relates to the various uses of an animal model of allergic respiratory disease prepared according to the method of the present invention.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical task to be achieved by the present invention is not limited to the tasks mentioned above, and other tasks not mentioned will be clearly understood by those of ordinary skill in the art from the following description.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 수지상 세포를 동물 개체에 주입하는 단계를 포함하는, 알레르기성 호흡기 질환의 동물 모델의 제조 방법에 관한 것이다. According to one embodiment of the present invention, it relates to a method for preparing an animal model of an allergic respiratory disease, comprising injecting dendritic cells into an animal subject.
본 발명에서는 동물 개체에 알레르기성 호흡기 질환의 병태 생리에 관여하는 수지상 세포를 직접 주입함으로써 상기 질환의 면역 반응을 효과적으로 유도할 수 있다. In the present invention, an immune response of the disease can be effectively induced by directly injecting dendritic cells involved in the pathophysiology of an allergic respiratory disease into an animal subject.
본 발명에서는 상기와 같이 수지상 세포를 상기 동물 개체에 주입하는 방법에 따라 제조되는 알레르기성 호흡기 질환의 동물 모델의 생리학적 특성이 달라질 수 있다. 본 발명에서는 상기 수지상 세포를 상기 동물 개체의 정맥을 통해 주입함으로써, 비강 내 투여로 인하여 동물 개체를 전신 마취시켜야 하는 번거로움을 줄일 수 있고, 적은 감작(challenge) 횟수로도 충분한 알레르기성 호흡기 질환, 특히는 천식의 병태 생리 환경을 구현할 수 있을 뿐만 아니라, 제작되는 각각의 동물 모델의 개체 간의 질환 정도의 편차를 줄일 수 있는 큰 장점이 있다. In the present invention, the physiological characteristics of the animal model of allergic respiratory disease prepared according to the method of injecting dendritic cells into the animal as described above may vary. In the present invention, by injecting the dendritic cells through the vein of the animal, it is possible to reduce the hassle of general anesthesia of the animal due to intranasal administration, and a small number of sensitization (challenge) is sufficient for allergic respiratory diseases, In particular, there is a great advantage of not only realizing the pathophysiological environment of asthma, but also reducing the variation in the degree of disease between individuals of each animal model produced.
본 발명에서 이용되는 동물 개체의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 인간을 제외한 동물일 수 있으나, 바람직하게는 인간을 제외한 포유 동물로, 예를 들면, 래트, 마우스, 모르모트, 햄스터, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 양 및 염소로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 보다 바람직하게는 마우스일 수 있다. The type of animal used in the present invention is not particularly limited, and may be an animal other than a human, but is preferably a mammal other than a human, for example, a rat, a mouse, a guinea pig, a hamster, a rabbit, a monkey, a dog. , may be selected from the group consisting of cat, cow, horse, pig, sheep and goat, and more preferably a mouse.
본 발명에서 상기 수지상 세포는 골수 유래 또는 비장 유래일 수 있지만, 골수 유래인 것이 질환 유도 효율이 좋고, 동물 개체로 예를 들어 마우스 한 마리의 골수에서 유래한 수지상 세포로 최대 100 마리의 알레르기성 호흡기 질환의 동물 모델을 제작할 수 있어 매우 경제적인 장점이 있다. In the present invention, the dendritic cells may be bone marrow-derived or spleen-derived, but bone marrow-derived dendritic cells have good disease inducing efficiency. It has a very economical advantage because it can produce an animal model of the disease.
본 발명에서 상기 수지상 세포는 1 X 106 내지 1 X 107 세포의 양으로 동물 개체에 주입될 수 있고, 바람직하게는 2 X 106 내지 1 X 107 세포, 또는 2 X 106 내지 5 X 106 세포의 양으로 주입될 수 있다. In the present invention, the dendritic cells may be injected into an animal subject in an amount of 1 X 10 6 to 1
본 발명에서는 상기와 같이 동물 개체에 수지상 세포를 주입할 때 알레르겐을 함께 주입함으로써, 수지상 세포를 활성화시켜 알레르기성 호흡기 질환을 보다 효과적으로 유도할 수 있다. In the present invention, when the dendritic cells are injected into the animal as described above, by injecting the allergen together, the dendritic cells can be activated to induce allergic respiratory disease more effectively.
본 발명에서 상기 "알레르겐(allergen)"은 알레르기성 질환의 원인이 되는 항원으로, 알레르겐의 섭취 또는 접촉으로 생체 내에서 항체가 만들어져 같은 물질의 재섭취 또는 재접촉이 일어날 경우에 항원 항체 반응이 일어나는 것으로, 구체적인 종류를 특별히 제한하지 않으나, 난알부민(ovalbumin; OVA), 꽃가루, 벌레 유래 알레르겐, 미생물 유래 알레르겐, 동물의 비듬 또는 동물의 털 등일 수 있다. In the present invention, the "allergen" is an antigen that causes an allergic disease, and an antigen-antibody reaction occurs when an antibody is made in vivo by ingestion or contact with the allergen and re-intake or re-contact of the same substance occurs. The specific type is not particularly limited, but may be ovalbumin (OVA), pollen, insect-derived allergens, microorganism-derived allergens, animal dander or animal hair.
본 발명에서 상기 꽃가루는 개체에 투여 시 알레르기성 질환을 유발시키는 것이라면 그 유래를 특별히 제한하지 않으나, 예를 들면, 아카시아(Acacia), 오리나무(Alder), 서양물푸레나무(Ash), 미국 너도밤나무(Beech American), 자작나무(Birch), 네군도 단풍나무(Box Elder), 연필향 나무(Cedar Red), 미루나무(Cottonwood), 노송나무(Japanese Cypress), 북미산 느릅나무(Elm American), 참느릅나무(Elm Chinese), 일본 미송나무(Japanese Douglas fir), 소합향 나무(Sweetgum), 유칼립투스(Eucalyptus), 팽나무(Hackberry), 히코리(Hickory), 린덴(Linden), 단풍 당(Maple Sugar), 메스키트(Mesquite), 뽕나무(Mulberry), 오크나무(Oak), 올리브나무(Olive), 피칸나무(Pecan), 후추나무(Pepper Tree), 소나무(Pine), 쥐똥나무(Privet), 가는잎보리수나무(Olive Russian), 양버즘나무(Sycamore American), 가죽나무(Tree of Heaven), 호두나무(Walnut), 또는 흑버드나무(Willow Black)의 나무나, 목화(Cotton plant), 버뮤다(Bermuda), 왕포아풀(Kentucky Blue), 스무스 브롬그라스(Smooth Brome), 경작된 옥수수(Cultivated Corn), 메도우 페스큐우(Meadow Fescue), 존슨(Johnson), 경작된 귀리(Cultivated Oats), 새발풀(Orchard), 외겨이삭(Red top), 다년생 호밀(Rye Perennial), 쌀(Rice), 유라시아산 벼과 목초(Sweet Vernal), 티모시(Timothy), 잡초(Careless weed), 버들잎명아주(Chenopodium), 우엉(Cocklebur), 메역취(Goldenrod), 댑싸리(Kochia), 명아주(Lambs Quarters), 천수국(Marigold), 쐐기풀(Nettle), 거친 명아주(Pigweed Rough), 창질경이(Plantain English), 돼지풀(Ragweed), 러시아 엉겅퀴(Russian Thistle), 산쑥(Sagebrush Common), 골담초(Scotch bloom), 또는 애기수영(Sheep Sorrel)의 풀 유래의 것일 수 있다. In the present invention, if the pollen causes an allergic disease when administered to an individual, the origin is not particularly limited, but, for example, acacia (Acacia), alder (Alder), ash tree (Ash), American beech (Beech American), Birch, Box Elder, Cedar Red, Cottonwood, Japanese Cypress, Elm American, True Elm Wood (Elm Chinese), Japanese Douglas fir, Sweetgum, Eucalyptus, Hackberry, Hickory, Linden, Maple Sugar, Mesquite (Mesquite), Mulberry, Oak, Olive, Pecan, Pepper Tree, Pine, Privet, Barley ( Olive Russian), Sycamore American, Tree of Heaven, Walnut, or Willow Black, Cotton plant, Bermuda, King Poagra (Kentucky Blue), Smooth Brome, Cultivated Corn, Meadow Fescue, Johnson, Cultivated Oats, Orchard, Cultivated Corn (Red top), Rye Perennial, Rice, Eurasian Sweet Vernal, Timothy, Careless weed, Chenopodium, Cocklebur, Buckwheat. (Goldenrod), Kochia, Myeongju (Lambs Q) uarters, Marigold, Nettle, Pigweed Rough, Plantain English, Ragweed, Russian Thistle, Sagebrush Common, Scotch bloom ), or may be derived from grass of Sheep Sorrel.
본 발명에서 상기 벌레 유래 알레르겐의 경우, 누에(silkworm), 진드기(mite), 꿀벌(honeybee), 말벌(wasp), 개미(ant) 및 바퀴벌레(cockroach) 유래 알레르겐일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, the insect-derived allergen may be an allergen derived from silkworm, mite, honeybee, wasp, ant, and cockroach, but is not limited thereto. .
본 발명에서 상기 미생물 유래 알레르겐은 알터나리아 테누이스(Alternaria tenuis), 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea), 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 세팔로스포리움 아크레모니움(Cephalosporium acremonium), 쿠르불라리아 스피시페라(Curvularia spicifera), 에피포쿰 니그럼(Epicoccum nigrum), 에피더모피톤 플로코섬(Epidermophyton floccosum), 푸사리움 바신펙텀(Fusarium vasinfectum), 헬민토스포리움 인테르세미나툼(Helminthosporium interseminatum), 포르모덴드럼 클라도스포리오데스(Hormodendrum cladosporioides), 뮤코 라세모서스(Mucor rasemosus), 페니실린 노타텀(Penicillium notatum), 포마 헤르바리움(Phoma herbarium), 풀루라리아 풀루란스(Pullularia pullulans), 또는 리조푸스 니그리칸스(Rhizopus nigricans) 유래 알레르겐일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, the microorganism-derived allergens are Alternaria tenuis, Aspergillus fumigatus, Botrytis cinerea, Candida albicans, Cephalo. Cephalosporium acremonium, Curvularia spicifera, Epicoccum nigrum, Epidermophyton floccosum, Fusarium vasinfectum, Fusarium vasinfectum Helminthosporium interseminatum, Formodendrum cladosporioides, Mucor rasemosus, Penicillium notatum, Phoma herbarium, Phoma herbarium It may be an allergen derived from Pullularia pullulans, or Rhizopus nigricans, but is not limited thereto.
본 발명에서 상기 동물의 비듬 또는 동물의 털은 개, 고양이 또는 새 유래 털이나 비듬일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, the animal dander or animal hair may be dog, cat, or bird-derived hair or dandruff, but is not limited thereto.
또한, 본 발명에서는 상기 동물 개체에 상기 수지상 세포를 주입할 때에 아쥬번트(adjuvant)를 추가로 주입하여, 상기 수지상 세포의 면역 활성화 효과를 증강시킬 수 있다. Also, in the present invention, when the dendritic cells are injected into the animal subject, an adjuvant may be additionally injected to enhance the immune activation effect of the dendritic cells.
본 발명에서 상기 아쥬번트의 종류는 특별히 제한하지 않으나, 예를 들면, 프로인드 아쥬번트(Freund's adjuvant), 알럼(alum), 면역 자극 복합체(immune stimulatory complex; ISCOM), 산소 함유 금속염(oxygen-containing metal salts), 이열성 엔테로톡신(heat-labile enterotoxin; LT), 콜레라 독소(cholera toxin; CT), 콜레라 독소 B 서브유닛(cholera toxin B subunit; CTB), 고분자화된 리포좀(polymerized liposomes), LTK63, LTR72, 마이크로캡슐(microcapsules), 인터류킨(interleukins(e.g. IL-1β, IL-2, IL-7, IL-12, INFγ)), GM-CSF, MDF 유도체, CpG 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides), LPS, MPL, 포스포파젠(phosphophazenes), Adju- Phos®, 글루칸(glucan), 항원 제제, 리포좀, DDE, DHEA, DMPC, DMPG, DOC/알럼(Alum) 복합체, 프로인트 불완전 보조약(Freund's incomplete adjuvant), ISCOMs®, LT 경구 보조약, 뮤라밀 디펩티드(muramyl dipeptide), 모노포스포릴 지질 A(monophosphoryl lipid A), 뮤라밀 트리펩티드(muramyl tripeptide) 및 포스파티딜에타놀아민(phospatidylethanolamine)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.In the present invention, the type of the adjuvant is not particularly limited, but for example, Freund's adjuvant, alum, immune stimulatory complex (ISCOM), and oxygen-containing metal salt (oxygen-containing). metal salts), heat-labile enterotoxin (LT), cholera toxin (CT), cholera toxin B subunit (CTB), polymerized liposomes, LTK63 , LTR72, microcapsules, interleukins (eg IL-1β, IL-2, IL-7, IL-12, INFγ), GM-CSF, MDF derivatives, CpG oligonucleotides, LPS, MPL, phosphophazenes, Adju-Phos®, glucan, antigen preparation, liposome, DDE, DHEA, DMPC, DMPG, DOC/Alum complex, Freund's
본 발명에서 상기 수지상 세포는 동물 개체에 알레르겐을 주입한 뒤 골수 세포로부터 분화가 유도된 것이 동물 개체 내에서 면역 반응을 보다 활성화시켜 알레르기성 호흡기 질환을 보다 효과적으로 유도할 수 있어 바람직하다. 여기서, 상기 알레르겐이 주입되어 골수 세포가 분리될 동물 개체와 상기 수지상 세포가 주입될 동물 개체는 서로 동일하거나 상이할 수 있다. In the present invention, it is preferable that the dendritic cells are differentiated from bone marrow cells after injecting the allergen into the animal, because it can more effectively induce an allergic respiratory disease by activating the immune response in the animal. Here, the animal subject to which the allergen is injected and bone marrow cells are to be isolated and the animal subject to which the dendritic cells will be injected may be the same or different from each other.
본 발명에서 상기 수지상 세포를 얻기 위하여 상기 동물 개체에 주입되는 알레르겐의 종류는 특별히 제한하지 않으나, 예를 들면, 난알부민(OVA), 꽃가루, 벌레 유래 알레르겐, 미생물 유래 알레르겐, 동물의 비듬 또는 동물의 털 등일 수 있다. In the present invention, the type of allergen injected into the animal to obtain the dendritic cells is not particularly limited, but for example, egg albumin (OVA), pollen, insect-derived allergen, microorganism-derived allergen, animal dander or animal hair or the like.
또한, 본 발명에서는 상기 수지상 세포를 얻기 위하여 상기 동물 개체에 알레르겐을 주입할 때 아쥬번트(adjuvant)를 추가로 주입하여, 최종 분리될 수지상 세포의 동물 개체 내 면역 활성화 효과를 증강시킬 수 있다. In addition, in the present invention, an adjuvant may be additionally injected when injecting an allergen into the animal to obtain the dendritic cells, thereby enhancing the immune activation effect of the dendritic cells to be finally isolated in the animal.
본 발명에서는 상기 아쥬번트의 종류는 특별히 제한하지 않으나, 예를 들면, 프로인드 아쥬번트(Freund's adjuvant), 알럼(alum), 면역 자극 복합체(immune stimulatory complex; ISCOM), 산소 함유 금속염(oxygen-containing metal salts), 이열성 엔테로톡신(heat-labile enterotoxin; LT), 콜레라 독소(cholera toxin; CT), 콜레라 독소 B 서브유닛(cholera toxin B subunit; CTB), 고분자화된 리포좀(polymerized liposomes), LTK63, LTR72, 마이크로캡슐(microcapsules), 인터류킨(interleukins(e.g. IL-1β, IL-2, IL-7, IL-12, INFγ)), GM-CSF, MDF 유도체, CpG 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides), LPS, MPL, 포스포파젠(phosphophazenes), Adju- Phos®, 글루칸(glucan), 항원 제제, 리포좀, DDE, DHEA, DMPC, DMPG, DOC/알럼(Alum) 복합체, 프로인트 불완전 보조약(Freund's incomplete adjuvant), ISCOMs®, LT 경구 보조약, 뮤라밀 디펩티드(muramyl dipeptide), 모노포스포릴 지질 A(monophosphoryl lipid A), 뮤라밀 트리펩티드(muramyl tripeptide) 및 포스파티딜에타놀아민(phospatidylethanolamine)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.In the present invention, the type of the adjuvant is not particularly limited, but for example, Freund's adjuvant, alum, immune stimulatory complex (ISCOM), and oxygen-containing metal salt (oxygen-containing). metal salts), heat-labile enterotoxin (LT), cholera toxin (CT), cholera toxin B subunit (CTB), polymerized liposomes, LTK63 , LTR72, microcapsules, interleukins (eg IL-1β, IL-2, IL-7, IL-12, INFγ), GM-CSF, MDF derivatives, CpG oligonucleotides, LPS, MPL, phosphophazenes, Adju-Phos®, glucan, antigen preparation, liposome, DDE, DHEA, DMPC, DMPG, DOC/Alum complex, Freund's
또한, 본 발명에서 상기 수지상 세포를 얻기 위하여 상기 동물 개체에 상기 알레르겐 또는 아쥬번트를 주입하는 경로는 특별히 제한하지는 않지만, 예를 들면, 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 비강 내, 장관, 국소, 설하 또는 직장을 통해 주입할 수 있고, 바람직하게는 복강 내로 주입할 수 있다.In addition, although the route of injecting the allergen or adjuvant into the animal subject to obtain the dendritic cells in the present invention is not particularly limited, for example, oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intradural , intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, enteral, topical, sublingual or rectal injection, preferably intraperitoneal.
또한, 본 발명에서 상기 수지상 세포를 얻기 위하여 상기 동물 개체에 상기 알레르겐 또는 아쥬번트를 주입하는 횟수는 특별히 제한하지 않으나, 예를 들면, 1 내지 5회 주입할 수 있고, 바람직하게는 1 내지 3회 주입할 수 있다. In addition, in the present invention, the number of injections of the allergen or adjuvant into the animal subject to obtain the dendritic cells is not particularly limited, but may be injected 1 to 5 times, preferably 1 to 3 times. can be injected.
본 발명에서는 상기와 같이 동물 개체에 알레르겐 또는 아쥬번트를 주입한 뒤 골수 유래 수지상 세포를 얻을 수 있고, 바람직하게는 상기 동물 개체로부터 골수 세포를 분리하여 동물 개체의 체외에서 수지상 세포로 분화를 유도할 수 있다. In the present invention, bone marrow-derived dendritic cells can be obtained after injecting an allergen or adjuvant into an animal subject as described above, and preferably, bone marrow cells are isolated from the animal subject to induce differentiation into dendritic cells in vitro. can
본 발명의 상기 알레르기성 호흡기 질환은 호흡기를 통해 알레르겐이 유입되어 개체 내에 유발될 수 있는 염증 반응으로서, 알레르기성 천식, 기관지염, 알레르기성 비염, 부비강염, 하기도 감염증 및 상기도 감염증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있고, 바람직하게는 알레르기성 천식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. The allergic respiratory disease of the present invention is an inflammatory reaction that can be induced in an individual by introducing an allergen through the respiratory tract, and selected from the group consisting of allergic asthma, bronchitis, allergic rhinitis, sinusitis, lower respiratory tract infection and upper respiratory tract infection. It may be at least one, preferably allergic asthma, but is not limited thereto.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 제조 방법에 따라 제조된 알레르기성 호흡기 질환의 동물 모델에 관한 것이다. According to another embodiment of the present invention, it relates to an animal model of allergic respiratory disease manufactured according to the manufacturing method of the present invention.
본 명세서에서 사용되는 용어, "동물 모델"은 질환 동물 모델을 의미한다. 구체적으로, 동물 모델은 인간의 질병과 유사한 상태의 질병에 걸리거나 선천적으로 그 질병에 걸리도록 만들어낸 동물 모델일 수 있다. 본 명세서에서 동물 모델은 알레르기성 호흡기 질환의 동물 모델일 수 있다. 또한, 본 발명의 알레르기성 호흡기 질환의 동물 모델로 이용될 수 있는 동물은 인간을 제외한 포유 동물로, 예를 들면, 래트, 마우스, 모르모트, 햄스터, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 양 및 염소로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 보다 바람직하게는 마우스일 수 있다. As used herein, the term “animal model” refers to an animal model of a disease. Specifically, the animal model may be an animal model that is afflicted with a disease similar to a human disease or is congenitally afflicted with the disease. In the present specification, the animal model may be an animal model of an allergic respiratory disease. In addition, animals that can be used as animal models for allergic respiratory diseases of the present invention are mammals other than humans, for example, rats, mice, guinea pigs, hamsters, rabbits, monkeys, dogs, cats, cattle, horses, It may be selected from the group consisting of pig, sheep and goat, and more preferably a mouse.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 동물 모델을 이용하여 알레르기성 호흡기 질환의 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. According to another embodiment of the present invention, it relates to a method for screening a therapeutic agent for an allergic respiratory disease using the animal model provided by the present invention.
본 발명에서 상기 "스크리닝"이란, 여러 물질로 이루어진 후보군으로부터 목적으로 하는 어떤 특정한 성질을 갖는 물질을 특정한 조작 또는 평가 방법으로 선별하는 것이다. In the present invention, the "screening" refers to selecting a substance having a specific target property from a candidate group consisting of several substances by a specific manipulation or evaluation method.
본 발명에서 제공하는 스크리닝 방법은 우선, 본 발명에서 제공하는 동물 모델에 알레르기성 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 후보 물질을 처리하는 단계를 포함할 수 있다. The screening method provided by the present invention may include, first, treating the animal model provided by the present invention with a candidate substance for the prevention or treatment of allergic respiratory disease.
여기서, 상기 후보 물질은 천연 화합물, 합성 화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사 산물 및 생활성 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.Here, the candidate material is preferably any one selected from the group consisting of natural compounds, synthetic compounds, RNA, DNA, polypeptides, enzymes, proteins, ligands, antibodies, antigens, bacterial or fungal metabolites and bioactive molecules , but not limited thereto.
본 발명에서는 상기 후보 물질을 처리한 동물 모델을 사육하면서 예후를 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 즉, 상기 후보 물질에 의하여 알레르기성 호흡기 질환이 예방되거나, 치료되거나, 대조군 물질에 비하여 예후가 증진된 경우에 상기 후보 물질을 알레르기성 호흡기 질환의 예방제 또는 치료제로 결정하는 것이다.The present invention may include confirming the prognosis while breeding the animal model treated with the candidate substance. That is, when the candidate substance prevents, treats, or improves the prognosis compared to the control substance, the candidate substance is determined as a preventive or therapeutic agent for allergic respiratory disease.
본 발명의 상기 알레르기성 호흡기 질환은 호흡기를 통해 알레르겐이 유입되어 개체 내에 유발될 수 있는 염증 반응으로서, 알레르기성 천식, 기관지염, 알레르기성 비염, 부비강염, 하기도 감염증 및 상기도 감염증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있고, 바람직하게는 알레르기성 천식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The allergic respiratory disease of the present invention is an inflammatory reaction that can be induced in an individual by introducing an allergen through the respiratory tract, and selected from the group consisting of allergic asthma, bronchitis, allergic rhinitis, sinusitis, lower respiratory tract infection and upper respiratory tract infection. It may be at least one, preferably allergic asthma, but is not limited thereto.
본 발명에서 제공하는 동물 모델은 알레르기성 호흡기 질환의 연구에 유용한 동물 모델로 활용될 수 있을 뿐만 아니라 상기 알레르기성 호흡기 질환의 병태 생리 규명과 치료 약제 개발에도 널리 응용될 수 있다.The animal model provided in the present invention can be utilized as an animal model useful for the study of allergic respiratory diseases, and can be widely applied to the pathophysiology of allergic respiratory diseases and development of therapeutic agents.
더욱이, 본 발명에서 제공하는 알레르기성 호흡기 질환의 동물 모델의 제조 방법은 간단하고 용이하면서도 제조되는 각각의 질환의 동물 개체 간에 편차가 적고 재현성이 우수하여 이를 이용한 실험에 있어서 신뢰도가 높은 장점이 있다.Moreover, the method for manufacturing an animal model of allergic respiratory disease provided by the present invention is simple and easy, and has a high reliability in experiments using the same because there is little variation between the animals of each disease manufactured and excellent reproducibility.
또한, 본 발명에서 제공하는 알레르기성 호흡기 질환의 동물 모델의 제조 방법은 동물 모델을 제작하기 위해 마취를 하지 않아도 되어, 번복되는 마취로 인해 동물 개체에게 가해지는 스트레스를 줄일 수 있고, 인위적으로 조절되는 상황인 마취에 의한 변수의 발생 가능성을 줄일 수 있다. In addition, the method for manufacturing an animal model of allergic respiratory disease provided in the present invention does not require anesthesia to produce the animal model, so it is possible to reduce the stress applied to the animal subject due to the reversed anesthesia, and to be artificially controlled. It is possible to reduce the possibility of occurrence of variables due to anesthesia, which is the situation.
도 1은 실시예 1에서 천식 마우스 모델의 제작을 위한 실험 설계도이다.
도 2는 실시예 2에서 천식 마우스 모델의 제작을 위한 실험 설계도이다.
도 3은 비교예 1에서 천식 마우스 모델의 제작을 위한 실험 설계도이다.
도 4는 실험예 1에서 마우스의 비강으로 인산화 완충 수용액(PBS)를 투여한 정상 대조군(i.p.+i.n. PBS)과, 상기 실시예 1에서 수지상 세포를 마우스의 정맥 내로 투여하여 유도한 천식 마우스 모델(i.p.+i.v. OVA-BMDC)과, 상기 비교예 1에서 기존 방법을 이용하여 유도한 천식 마우스 모델(i.p.+i.n. OVA)의 세 그룹에서 폐 조직을 헤마톡실린-에오신(hematoxylin and eosin) 염색 방법으로 염색한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 실험예 1에서 마우스의 비강으로 인산화 완충 수용액(PBS)를 투여한 정상 대조군(i.p.+i.n. PBS)과, 상기 실시예 1에서 수지상 세포를 마우스의 정맥 내로 투여하여 유도한 천식 마우스 모델(i.p.+i.v. OVA-BMDC)에서 각 마우스의 폐 조직에서 염증 지수를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 실험예 2에서 마우스의 비강으로 인산화 완충 수용액(PBS)를 투여한 정상 대조군(i.p.+i.n. PBS)과, 상기 실시예 1에서 수지상 세포를 마우스의 정맥 내로 투여하여 유도한 천식 마우스 모델(i.p.+i.v. OVA-BMDC)과, 상기 비교예 1에서 기존 방법을 이용하여 유도한 천식 마우스 모델(i.p.+i.n. OVA)의 세 그룹에서 각 마우스의 폐 조직을 과요오드산-쉬프(periodic acid-Schiff) 염색 방법으로 염색한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 실험예 2에서 마우스의 비강으로 인산화 완충 수용액(PBS)를 투여한 정상 대조군(i.p.+i.n. PBS)과, 상기 실시예 1에서 수지상 세포를 마우스의 정맥 내로 투여하여 유도한 천식 마우스 모델(i.p.+i.v. OVA-BMDC)에서 각 마우스의 폐 조직에 대하여 PAS(periodic acid-Schiff) 지수를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 실험예 3에서 마우스의 비강으로 인산화 완충 수용액(PBS)를 투여한 정상 대조군(i.p.+i.n. PBS)과, 상기 실시예 1에서 수지상 세포를 마우스의 정맥 내로 투여하여 유도한 천식 마우스 모델(i.p.+i.v. OVA-BMDC)에서 각 마우스의 폐 조직을 부검하여 조혈모세포(hematopoietic cell)인 CD45 양성인 세포 중에 호산구(eosinophil)의 비율을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 실험예 4에서 마우스의 비강으로 인산화 완충 수용액(PBS)를 투여한 정상 대조군(i.p.+i.n. PBS)과, 상기 실시예 1에서 수지상 세포를 마우스의 정맥 내로 투여하여 유도한 천식 마우스 모델(i.p.+i.v. OVA-BMDC)과, 상기 비교예 1에서 기존 방법을 이용하여 유도한 천식 마우스 모델(i.p.+i.n. OVA)의 세 그룹에서 기관지 폐포 세척액을 통해 IL-4 및 IL-5의 발현 수준을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 실험예 5에서 마우스의 비강으로 인산화 완충 수용액(PBS)를 투여한 정상 대조군(i.p.+i.n. PBS)과, 상기 실시예 1에서 수지상 세포를 마우스의 정맥 내로 투여하여 유도한 천식 마우스 모델(i.p.+i.v. OVA-BMDC)과, 상기 비교예 1에서 기존 방법을 이용하여 유도한 천식 마우스 모델(i.p.+i.n. OVA)의 세 그룹에서 혈액을 채취하여 항원 (OVA) 특이적인 면역글로뷸린(immunoglobulin) E와 G1의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 실험예 6에서 마우스의 비강으로 인산화 완충 수용액(PBS)를 투여한 정상 대조군(i.p.+i.n. PBS)과, 상기 실시예 1에서 수지상 세포를 마우스의 정맥 내로 투여하여 유도한 천식 마우스 모델(i.p.+i.v. OVA-BMDC), 상기 실시예 2에서 수지상 세포를 마우스의 정맥 내로 투여하여 유도한 천식 마우스 모델(i.v. OVA-BMDC)과, 상기 비교예 1에서 기존 방법을 이용하여 유도한 천식 마우스 모델(i.p.+i.n. OVA)의 네 그룹에서 폐 조직을 채취하여 난알부민(OVA) 항원으로 재자극을 주었을 때 IL-5 및 IL-13의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 실험예 7에서 마우스의 비강으로 인산화 완충 수용액(PBS)를 투여한 정상 대조군(i.p.+i.n. PBS)과, 상기 실시예 1에서 수지상 세포를 마우스의 정맥 내로 투여하여 유도한 천식 마우스 모델(i.p.+i.v. OVA-BMDC), 상기 실시예 2에서 수지상 세포를 마우스의 정맥 내로 투여하여 유도한 천식 마우스 모델(i.v. OVA-BMDC)과, 상기 비교예 1에서 기존 방법을 이용하여 유도한 천식 마우스 모델(i.p.+i.n. OVA)의 네 그룹에서 비장 조직을 채취하여 난알부민(OVA) 항원으로 재자극을 주었을 때 IL-5 및 IL-13의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 실험예 8에서 마우스의 비강으로 인산화 완충 수용액(PBS)를 투여한 정상 대조군(i.p.+i.n. PBS)과, 상기 실시예 1에서 수지상 세포를 마우스의 정맥 내로 투여하여 유도한 천식 마우스 모델(i.p.+i.v. OVA-BMDC), 상기 실시예 2에서 수지상 세포를 마우스의 정맥 내로 투여하여 유도한 천식 마우스 모델(i.v. OVA-BMDC)과, 상기 비교예 1에서 기존 방법을 이용하여 유도한 천식 마우스 모델(i.p.+i.n. OVA)의 네 그룹에서 종격동 림프절 조직을 채취하여 난알부민(OVA) 항원으로 재자극을 주었을 때 IL-5 및 IL-13의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다. 1 is an experimental design for the construction of the asthma mouse model in Example 1.
Figure 2 is an experimental design for the production of the asthma mouse model in Example 2.
Figure 3 is an experimental design for the production of the asthma mouse model in Comparative Example 1.
4 shows a normal control group (ip+in PBS) administered with an aqueous phosphorylation buffer solution (PBS) intranasally in Experimental Example 1, and a mouse model of asthma induced by intravenous administration of dendritic cells in Example 1 ( ip + iv OVA-BMDC) and the lung tissue from three groups of the asthma mouse model (ip + in OVA) induced using the conventional method in Comparative Example 1 were stained with hematoxylin and eosin. The staining results are shown.
5 shows a normal control group (ip + in PBS) administered with an aqueous phosphorylation buffer solution (PBS) intranasally in Experimental Example 1, and a mouse model of asthma induced by intravenous administration of dendritic cells in Example 1 ( ip+iv OVA-BMDC) shows the results of measuring the inflammatory index in the lung tissue of each mouse.
6 shows a normal control group (ip+in PBS) administered with an aqueous phosphorylation buffer solution (PBS) intranasally in Experimental Example 2, and a mouse model of asthma induced by intravenous administration of dendritic cells in Example 1 ( ip + iv OVA-BMDC) and the lung tissue of each mouse in the three groups of the asthma mouse model (ip + in OVA) induced using the existing method in Comparative Example 1 were periodically acid-Schiff (periodic acid-Schiff). ) shows the results of staining by the dyeing method.
7 shows a normal control group (ip+in PBS) administered with an aqueous phosphorylation buffer solution (PBS) intranasally in Experimental Example 2, and a mouse model of asthma induced by intravenous administration of dendritic cells in Example 1 ( ip + iv OVA-BMDC) shows the results of measuring the PAS (periodic acid-Schiff) index for the lung tissue of each mouse.
8 shows a normal control group (ip+in PBS) administered with an aqueous phosphorylation buffer solution (PBS) nasally of a mouse in Experimental Example 3, and a mouse model of asthma induced by intravenous administration of dendritic cells in Example 1 ( ip+iv OVA-BMDC) shows the results of analyzing the ratio of eosinophils among CD45-positive cells, which are hematopoietic cells, by autopsy of the lung tissue of each mouse.
9 shows a normal control group (ip+in PBS) administered with an aqueous phosphorylation buffer solution (PBS) intranasally in Experimental Example 4, and a mouse model of asthma induced by intravenous administration of dendritic cells in Example 1 ( ip + iv OVA-BMDC) and the expression level of IL-4 and IL-5 through bronchoalveolar lavage fluid in three groups of the asthma mouse model (ip + in OVA) induced using the existing method in Comparative Example 1. The measurement results are shown.
10 shows a normal control group (ip+in PBS) administered with an aqueous phosphorylation buffer solution (PBS) intranasally in Experimental Example 5, and a mouse model of asthma induced by intravenous administration of dendritic cells in Example 1 ( ip+iv OVA-BMDC) and antigen (OVA)-specific immunoglobulin (OVA)-specific immunoglobulin by collecting blood from three groups of the asthma mouse model (ip+in OVA) induced using the existing method in Comparative Example 1. ) shows the results of analyzing the expression levels of E and G1.
11 shows a normal control group (ip+in PBS) administered intranasally with an aqueous phosphorylation buffer solution (PBS) in Experimental Example 6, and a mouse model of asthma induced by intravenous administration of dendritic cells in Example 1 ( ip+iv OVA-BMDC), the asthma mouse model induced by intravenous administration of dendritic cells in Example 2 (iv OVA-BMDC), and the asthma mouse model induced using the conventional method in Comparative Example 1 Shows the results of analyzing the expression levels of IL-5 and IL-13 when lung tissue was collected from four groups of (ip+in OVA) and restimulated with ovalbumin (OVA) antigen.
12 shows a normal control group (ip+in PBS) administered with an aqueous phosphorylation buffer solution (PBS) intranasally in Experimental Example 7, and a mouse model of asthma induced by intravenous administration of dendritic cells in Example 1 ( ip+iv OVA-BMDC), the asthma mouse model induced by intravenous administration of dendritic cells in Example 2 (iv OVA-BMDC), and the asthma mouse model induced using the conventional method in Comparative Example 1 The results of analyzing the expression levels of IL-5 and IL-13 when spleen tissues were collected from four groups of (ip+in OVA) and restimulated with ovalbumin (OVA) antigen are shown.
13 shows a normal control group (ip+in PBS) administered with an aqueous phosphorylation buffer solution (PBS) nasally of a mouse in Experimental Example 8, and a mouse model of asthma induced by intravenous administration of dendritic cells in Example 1 ( ip+iv OVA-BMDC), the asthma mouse model induced by intravenous administration of dendritic cells in Example 2 (iv OVA-BMDC), and the asthma mouse model induced using the conventional method in Comparative Example 1 The results of analysis of the expression levels of IL-5 and IL-13 when mediastinal lymph node tissues were collected from four groups of (ip+in OVA) and restimulated with ovalbumin (OVA) antigen are shown.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. .
실시예Example
[실시예 1] 천식 마우스 모델의 제작[Example 1] Preparation of asthma mouse model
도 1에 나타낸 실험 설계도에 따라 본 발명에 따른 천식 마우스 모델을 제작하였다. 구체적으로, 난알부민(OVA) 50㎍을 항원보강제(adjuvant)인 알럼(Alum) 1.32mg과 함께 2주 간격으로 2회 마우스의 복강 내로 투여하였다. 이후 상기 마우스의 골수 유래 수지상 세포를 분리하여, 상기 수지상 세포 2 x 106세포(cells)(200 μl)를 난알부민(OVA) 150 ㎍과 함께 천식을 유도할 마우스의 정맥을 통해 21일, 23일, 25일에 투여하였다. An asthma mouse model according to the present invention was prepared according to the experimental design shown in FIG. 1 . Specifically, 50 μg of ovalbumin (OVA) was intraperitoneally administered to mice twice at intervals of 2 weeks along with 1.32 mg of Alum, an adjuvant. Thereafter, the bone marrow-derived dendritic cells of the mice were isolated, and the dendritic cells 2 x 10 6 cells (200 μl) were administered through the vein of a mouse to induce asthma with 150 μg of ovalbumin (OVA) on
[실시예 2] 천식 마우스 모델의 제작[Example 2] Preparation of asthma mouse model
도 2에 나타낸 실험 설계도에 따라 본 발명에 따른 천식 마우스 모델을 제작하였다. 마우스의 골수 유래 수지상 세포 2 x 106세포(cells)(200 μl)를 난알부민(OVA) 500 ㎍과 함께 천식을 유도할 마우스의 정맥을 통해 21일, 23일, 25일에 투여하였다. According to the experimental design shown in FIG. 2, an asthma mouse model according to the present invention was prepared. Mice bone marrow-derived dendritic cells 2 x 10 6 cells (cells) (200 μl) were administered together with 500 μg of ovalbumin (OVA) through the vein of mice to induce asthma on
[비교예 1] 천식 마우스 모델의 제작[Comparative Example 1] Preparation of asthma mouse model
도 3에 나타낸 실험 설계도에 따라 종래의 방법에 의해 천식 마우스 모델을 제작하였다. 난알부민(OVA) 50㎍을 항원보강제(adjuvant)인 알럼(Alum) 1.32mg과 함께 2주 간격으로 2회 마우스의 복강 내로 투여하였다. 이후 21일째부터 5일동안 마우스를 전신 마취시킨 뒤 난알부민(OVA)를 마우스의 비강 내로 투여하였다. An asthma mouse model was prepared by a conventional method according to the experimental design shown in FIG. 3 . 50 μg of ovalbumin (OVA) was intraperitoneally administered to mice twice at an interval of 2 weeks along with 1.32 mg of Alum, an adjuvant. After that, the mice were general anesthetized for 5 days from the 21st day, and ovalbumin (OVA) was intranasally administered to the mice.
[실험예 1] 천식 마우스 모델의 폐 조직 병리 소견 분석(1)[Experimental Example 1] Analysis of lung tissue pathological findings in a mouse model of asthma (1)
마우스의 비강으로 인산화 완충 수용액(phosphate buffer saline, PBS)을 투여한 정상 대조군과, 상기 실시예 1에서 수지상 세포를 마우스의 정맥 내로 투여하여 유도한 천식 마우스 모델과, 상기 비교예 1에서 기존 방법을 이용하여 유도한 천식 마우스 모델의 세 그룹에서 폐 조직의 병리 조직 소견을 분석하였다. 각 마우스의 폐 조직을 헤마톡실린-에오신(hematoxylin and eosin) 염색 방법으로 염색하여 그 결과를 도 4에 나타내었다. 또한, 상기 정상 대조군과, 상기 실시예 1에서 수지상 세포를 마우스의 정맥 내로 투여하여 유도한 천식 마우스 모델 마우스의 폐 조직에서 염증 지수를 측정하여 그 결과를 도 5에 나타내었다. 이때 염증 지수는 기관지 주변의 염증 세포 침윤 정도를 5단계로 점수화 한 수치로 평가 기준은 아래의 평가 기준에 따라 평가하였다(Sci Rep. 2015 Oct 20;5:15396. doi: 10.1038/srep15396). 이때 마우스 마다 각 조직 슬라이드에서 동일한 해부학적 부위 8곳을 찾아서 광학현미경 x100배율에서 염증 정도 수치를 구하고, 그 수치의 평균 값을 마우스의 염증 지수로 간주하였으며, 한 실험군당 6마리 마우스의 염증 지수를 평균 값으로 하여 도 5에 나타내었다.A normal control group administered with phosphate buffer saline (PBS) into the nasal cavity of a mouse, a mouse model of asthma induced by intravenous administration of dendritic cells in Example 1, and the conventional method in Comparative Example 1 Pathological findings of lung tissue were analyzed in three groups of mouse models of asthma induced using the The lung tissue of each mouse was stained with hematoxylin and eosin staining method, and the results are shown in FIG. 4 . In addition, the inflammatory index was measured in the lung tissue of the mouse model mouse induced by intravenous administration of dendritic cells in Example 1 and the normal control group, and the results are shown in FIG. 5 . In this case, the inflammatory index was a value grading the degree of inflammatory cell infiltration around the bronchus into five levels, and the evaluation criteria were evaluated according to the following evaluation criteria (Sci Rep. 2015
<염증 지수 평가 기준><Inflammation index evaluation criteria>
0: 정상 0: normal
1: 적은 세포 1: Fewer cells
2: 염증세포가 한층 두께로 침윤 2: Inflammatory cells infiltrate into a layer
3: 염증세포가 2~4층 두께로 침윤 3: Inflammatory cells infiltrate 2 to 4 layers thick
4: 염증세포가 4층 이상의 두께로 침윤.4: Inflammatory cells infiltrate with a thickness of 4 or more layers.
도 4에서 보는 바와 같이, 실시예 1에서 제작한 마우스 모델에서는 정상 대조군이나 비교예 1에서 제작한 마우스 모델에 비하여 기관지와 폐 실질 조직에서 염증 세포의 침윤이 관찰되어 천식이 유도된 것을 확인할 수 있었다. As shown in FIG. 4 , in the mouse model prepared in Example 1, infiltration of inflammatory cells was observed in the bronchi and lung parenchyma compared to the normal control group or the mouse model prepared in Comparative Example 1, confirming that asthma was induced. .
또한, 도 5에서 염증 정도를 정량화 하여 비교한 결과, 정상 대조군에 비하여 실시예 1에서 제작한 마우스 모델에서 염증 지수가 더욱 높게 나타났으며, 개체간의 변이도 더욱 적은 것을 확인할 수 있었다.In addition, as a result of quantifying and comparing the degree of inflammation in FIG. 5 , the inflammation index was higher in the mouse model prepared in Example 1 compared to the normal control group, and it was confirmed that there was less variation between individuals.
[실험예 2] 천식 마우스 모델의 폐 조직 병리 소견 분석(2)[Experimental Example 2] Analysis of lung tissue pathological findings in a mouse model of asthma (2)
마우스의 비강으로 인산화 완충 수용액(PBS)을 투여한 정상 대조군과, 상기 실시예 1에서 수지상 세포를 마우스의 정맥 내로 투여하여 유도한 천식 마우스 모델과, 상기 비교예 1에서 기존 방법을 이용하여 유도한 천식 마우스 모델의 세 그룹에서 폐 조직을 과요오드산-쉬프(periodic acid-Schiff) 염색 방법으로 염색한 결과를 도 6에 나타내었다. 또한, 정상 대조군과 상기 실시예 1에서 수지상 세포를 마우스의 정맥 내로 투여하여 유도한 천식 마우스 모델의 폐 조직에서 PAS(periodic acid-Schiff) 지수를 측정하여 그 결과를 도 7에 나타내었다. PAS 지수는 술잔 세포(goblet cell)의 침윤 정도를 5단계로 점수화한 수치로, PAS+인 술잔 세포(goblet cell)의 비율에 따라 아래의 기준으로 평가하였다(Sci Rep. 2015 Oct 20;5:15396. doi: 10.1038/srep15396). 이 때 마우스 마다 각 조직 슬라이드에서 동일한 해부학적 부위 8곳을 찾아서 광학현미경 x200배율에서 침윤 정도 수치를 구하고, 그 수치의 평균 값을 마우스의 PAS 수치로 간주하였으며, 한 실험군당 6마리 마우스의 PAS 수치를 평균 값으로 하여 도 7에 나타내었다.A normal control group administered with an aqueous phosphorylation buffer solution (PBS) into the nasal cavity of a mouse, a mouse model of asthma induced by intravenous administration of dendritic cells in Example 1, and a conventional method in Comparative Example 1 were induced. The results of staining the lung tissues in the three groups of the asthma mouse model by the periodic acid-Schiff staining method are shown in FIG. 6 . In addition, the PAS (periodic acid-Schiff) index was measured in the lung tissue of the mouse model of asthma induced by intravenous administration of dendritic cells in the normal control group and Example 1, and the results are shown in FIG. 7 . The PAS index is a value that scores the degree of invasion of goblet cells in five steps, and was evaluated according to the following criteria according to the ratio of goblet cells that are PAS+ (Sci Rep. 2015
<PAS 수치 평가 기준><PAS numerical evaluation criteria>
0: <0.5%0: <0.5%
1: 0.5~25%1: 0.5~25%
2: 25~50%2: 25-50%
3: 50~75% 3: 50-75%
4: >75%4: >75%
도 6에서 보는 바와 같이, 실시예 1에서 제작한 마우스 모델에서는 정상 대조군과는 달리 술잔 세포(goblet cell)의 발현이 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었다. As shown in FIG. 6 , it was confirmed that the expression of goblet cells was significantly increased in the mouse model prepared in Example 1, unlike the normal control.
또한, 도 7에서 PAS 지수로 정량화한 결과, 정상 대조군에 비하여 실시예 1에서 제작한 마우스 모델에서 배상 세포의 증식이 더욱 높게 나타났으며, 개체간의 변이도 적은 것을 확인할 수 있었다.In addition, as a result of quantification by the PAS index in FIG. 7 , it was confirmed that the goblet cell proliferation was higher in the mouse model prepared in Example 1 compared to the normal control group, and there was less variation between individuals.
[실험예 3] 천식 마우스 모델의 폐에서 세포의 발현 양상 분석[Experimental Example 3] Analysis of the expression pattern of cells in the lung of the asthma mouse model
마우스의 비강으로 인산화 완충 수용액(PBS)을 투여한 정상 대조군과, 상기 실시예 1에서 수지상 세포를 마우스의 정맥 내로 투여하여 유도한 천식 마우스 모델과, 상기 비교예 1에서 기존 방법을 이용하여 유도한 천식 마우스 모델의 세 그룹의 폐에서 면역 세포의 발현 양상을 분석하였다. 각 마우스 모델의 폐 조직을 부검하여 조혈모세포(hematopoietic cell)인 CD45 양성인 세포 중에 호산구(eosinophil)의 비율을 분석하여 그 결과를 도 8에 나타내었다. A normal control group administered with an aqueous phosphorylation buffer solution (PBS) into the nasal cavity of a mouse, a mouse model of asthma induced by intravenous administration of dendritic cells in Example 1, and a conventional method in Comparative Example 1 were induced. The expression patterns of immune cells in the lungs of three groups of asthma mouse models were analyzed. The lung tissue of each mouse model was autopsied to analyze the ratio of eosinophils among CD45-positive cells, which are hematopoietic cells, and the results are shown in FIG. 8 .
도 8에서 보는 바와 같이, 알레르기 천식의 병태 생리에 가장 핵심적인 역할을 하는 세포는 호산구에 해당하는데, 정상 대조군에 비하여 실시예 1에서 제작한 마우스 모델에서 그 발현이 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었다. As shown in FIG. 8 , the cells that play the most key role in the pathophysiology of allergic asthma correspond to eosinophils, and it was confirmed that their expression was significantly increased in the mouse model prepared in Example 1 compared to the normal control group.
[실험예 4] 천식 마우스 모델의 기관지 폐포 세척액 분석(1)[Experimental Example 4] Analysis of bronchoalveolar lavage fluid in a mouse model of asthma (1)
마우스의 비강으로 인산화 완충 수용액(PBS)을 투여한 정상 대조군과, 상기 실시예 1에서 수지상 세포를 마우스의 정맥 내로 투여하여 유도한 천식 마우스 모델과, 상기 비교예 1에서 기존 방법을 이용하여 유도한 천식 마우스 모델의 세 그룹에서 기관지 폐포 세척액을 통해 사이토카인의 발현 양상을 분석하였다. 각 마우스 모델의 기관지를 통해 얻은 기관지 폐포 세척액을 원심 분리하여 상층액을 얻은 뒤 ELISA를 Th2 면역반응에 관여하는 IL-4 및 IL-5의 발현 수준을 측정하여 그 결과를 도 9에 나타내었다. A normal control group administered with an aqueous phosphorylation buffer solution (PBS) into the nasal cavity of a mouse, a mouse model of asthma induced by intravenous administration of dendritic cells in Example 1, and a conventional method in Comparative Example 1 were induced. The expression patterns of cytokines were analyzed through bronchoalveolar lavage fluid in three groups of asthma mouse models. After centrifuging the bronchoalveolar lavage fluid obtained through the bronchi of each mouse model to obtain a supernatant, ELISA was performed to measure the expression levels of IL-4 and IL-5 involved in the Th2 immune response, and the results are shown in FIG. 9 .
도 9에서 보는 바와 같이, 정상 대조군이나 기존 방법을 이용하여 유도된 비교예 1의 마우스 모델에 비하여 수지상 세포를 정맥 내로 투여하여 유도된 실시예 1의 마우스 모델에서 IL-4 및 IL-5의 발현 수준이 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었고, 특히 IL-5의 경우 정상 대조군이나 기존 방법을 이용하여 유도된 비교예 1의 마우스 모델에서는 거의 발현되지 않는 것을 확인할 수 있었다. As shown in Figure 9, the expression of IL-4 and IL-5 in the mouse model of Example 1 induced by intravenous administration of dendritic cells compared to the mouse model of Comparative Example 1 induced using the normal control or the existing method. It was confirmed that the level was significantly increased, and in particular, in the case of IL-5, it was confirmed that it was hardly expressed in the mouse model of Comparative Example 1 induced using the normal control or the existing method.
[실험예 5] 천식 마우스 모델의 항원 특이 면역글로뷸린(Immunoglobulin) 발현 양상의 분석[Experimental Example 5] Analysis of antigen-specific immunoglobulin expression patterns in a mouse model of asthma
마우스의 비강으로 인산화 완충 수용액(PBS)을 투여한 정상 대조군과, 상기 실시예 1에서 수지상 세포를 마우스의 정맥 내로 투여하여 유도한 천식 마우스 모델과, 상기 비교예 1에서 기존 방법을 이용하여 유도한 천식 마우스 모델의 세 그룹에서 혈액을 채취하여 항원 (OVA) 특이적인 면역글로뷸린(immunoglobulin) E와 G1의 발현을 분석하여 그 결과를 도 10에 나타내었다. A normal control group administered with an aqueous phosphorylation buffer solution (PBS) into the nasal cavity of a mouse, a mouse model of asthma induced by intravenous administration of dendritic cells in Example 1, and a conventional method in Comparative Example 1 were induced. Blood was collected from three groups of the asthma mouse model and the expression of antigen (OVA)-specific immunoglobulin E and G1 was analyzed, and the results are shown in FIG. 10 .
도 10에서 보는 바와 같이, 난알부민으로 활성화된 수지상 세포를 정맥 내로 투여하여 유도된 실시예 1의 마우스 모델에서 난알부민 특이적인 IgE 및 IgG1의 발현이 가장 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이는 실시예 1에서 유도된 마우스 모델에서 천식으로 인한 전신적인 면역 반응이 잘 활성화 되었음을 의미하는 것이다. As shown in FIG. 10 , it was confirmed that the expression of ovalbumin-specific IgE and IgG1 was most significantly increased in the mouse model of Example 1 induced by intravenous administration of dendritic cells activated with egg albumin. This means that the systemic immune response due to asthma was well activated in the mouse model induced in Example 1.
이상의 결과는 난알부민 항원이 천식 반응의 유도에 중요한 역할을 하는 것으로, 상기 난알부민으로 활성화된 수지상 세포가 마우스 체내에서 전신적인 면역 반응을 활발히 일으키는 것임을 알 수 있었다.The above results indicate that the ovalbumin antigen plays an important role in the induction of the asthmatic response, and that the dendritic cells activated with the ovalbumin actively induce a systemic immune response in the mouse body.
[실험예 6] 천식 마우스 모델의 폐에서 항원에 대한 사이토카인 발현 양상 분석[Experimental Example 6] Analysis of cytokine expression pattern for antigen in lung of asthma mouse model
마우스의 비강으로 인산화 완충 수용액(PBS)을 투여한 정상 대조군과, 상기 실시예 1 및 2에서 수지상 세포를 마우스의 정맥 내로 투여하여 유도한 천식 마우스 모델, 상기 비교예 1에서 기존 방법을 이용하여 유도한 천식 마우스 모델의 네 그룹에서 폐 조직을 채취하여 난알부민(OVA) 항원으로 재자극을 주었을 때 IL-5 및 IL-13의 사이토카인의 발현을 조사해 T 세포 면역 반응을 분석하였다. 각 사이토카인 별 결과는 도 11에 나타내었다. A normal control group administered with an aqueous phosphorylation buffer solution (PBS) into the nasal cavity of a mouse, a mouse model of asthma induced by intravenous administration of dendritic cells in Examples 1 and 2, and a conventional method in Comparative Example 1 induced T-cell immune responses were analyzed by examining the expression of IL-5 and IL-13 cytokines when lung tissue was harvested from four groups of one asthma mouse model and restimulated with ovalbumin (OVA) antigen. The results for each cytokine are shown in FIG. 11 .
도 11에서 보는 바와 같이, 정상 대조군이나 기존 방법을 이용하여 유도된 비교예 1의 마우스 모델에 비하여, 수지상 세포를 정맥 내로 투여하여 유도된 실시예 1 및 2의 마우스 모델의 폐에서 IL-5 및 IL-13의 발현 수준이 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있었다. 특히는 난알부민 및 알럼을 마우스의 복강 내로 주입하여 얻어진 골수 유래 수지상 세포를 주입한 실시예 1의 마우스 모델의 폐에서 상기 IL-5 및 IL-13의 발현 수준이 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었다. As shown in FIG. 11, IL-5 and IL-5 in the lungs of the mouse models of Examples 1 and 2 induced by intravenous administration of dendritic cells compared to the mouse model of Comparative Example 1 induced using the normal control or the existing method. It was confirmed that the expression level of IL-13 was significantly increased. In particular, it was confirmed that the expression levels of IL-5 and IL-13 were significantly increased in the lungs of the mouse model of Example 1 in which bone marrow-derived dendritic cells obtained by intraperitoneal injection of egg albumin and alum were injected.
이를 통하여 천식의 면역 반응에 핵심적인 Th2 면역반응을 나타내는 사이토카인인 IL-5 및 IL-13의 발현이 수지상 세포를 이용하여 유도된 천식 마우스 모델에서 유의하게 증가하였으며, 폐에서 천식이 잘 유도되었음을 알 수 있었다. Through this, the expression of IL-5 and IL-13, cytokines representing the Th2 immune response, which are key to the immune response of asthma, was significantly increased in the mouse model of asthma induced using dendritic cells, and it was confirmed that asthma was well induced in the lung. Could know.
[실험예 7] 천식 마우스 모델의 비장에서 항원에 대한 사이토카인 발현 양상 분석[Experimental Example 7] Analysis of cytokine expression patterns for antigens in the spleen of a mouse model of asthma
마우스의 비강으로 인산화 완충 수용액(PBS)을 투여한 정상 대조군과, 상기 실시예 1 및 2에서 수지상 세포를 마우스의 정맥 내로 투여하여 유도한 천식 마우스 모델, 상기 비교예 1에서 기존 방법을 이용하여 유도한 천식 마우스 모델의 네 그룹에서 비장 조직을 채취하여 난알부민(OVA) 항원으로 재자극을 주었을 때 IL-5 및 IL-13의 발현을 조사하여 그 결과를 도 12에 나타내었다. A normal control group administered with an aqueous phosphorylation buffer solution (PBS) into the nasal cavity of a mouse, a mouse model of asthma induced by intravenous administration of dendritic cells in Examples 1 and 2, and a conventional method in Comparative Example 1 induced When spleen tissues were collected from four groups of one asthma mouse model and restimulated with ovalbumin (OVA) antigen, the expression of IL-5 and IL-13 was investigated, and the results are shown in FIG. 12 .
도 12에서 보는 바와 같이, 정상 대조군이나 기존 방법을 이용하여 유도된 비교예 1의 마우스 모델에 비하여 수지상 세포를 정맥 내로 투여하여 유도된 실시예 1 및 2의 마우스 모델의 비장에서도 IL-5 및 IL-13의 발현 수준이 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있었고, 특히는 난알부민 및 알럼을 마우스의 복강 내로 주입하여 얻어진 골수 유래 수지상 세포를 주입한 실시예 1의 마우스 모델의 비장에서 상기 IL-5 및 IL-13의 발현 수준이 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었다. As shown in FIG. 12, IL-5 and IL also in the spleen of the mouse models of Examples 1 and 2 induced by intravenous administration of dendritic cells compared to the mouse model of Comparative Example 1 induced using the normal control or the existing method. It was confirmed that the expression level of -13 was significantly increased, and in particular, the IL-5 and IL in the spleen of the mouse model of Example 1 in which bone marrow-derived dendritic cells obtained by intraperitoneal injection of egg albumin and alum were injected. It was confirmed that the expression level of -13 was significantly increased.
이를 통하여 천식의 면역 반응에 핵심적인 Th2 면역반응을 나타내는 사이토카인인 IL-5 및 IL-13의 발현이 수지상 세포를 이용하여 유도된 천식 마우스 모델에서 유의하게 증가하였으며, 비장에서도 천식이 잘 유도되었음을 알 수 있었다.Through this, the expression of IL-5 and IL-13, cytokines representing the Th2 immune response, which are key to the immune response of asthma, was significantly increased in the mouse model of asthma induced using dendritic cells, and it was confirmed that asthma was well induced in the spleen. Could know.
[실험예 8] 천식 마우스 모델의 종격동 림프절에서 항원에 대한 사이토카인 발현 양상 분석[Experimental Example 8] Analysis of cytokine expression patterns for antigens in mediastinal lymph nodes in a mouse model of asthma
마우스의 비강으로 인산화 완충 수용액(PBS)을 투여한 정상 대조군과, 상기 실시예 1 및 2에서 수지상 세포를 마우스의 정맥 내로 투여하여 유도한 천식 마우스 모델과, 상기 비교예 1에서 기존 방법을 이용하여 유도한 천식 마우스 모델의 네 그룹에서 종격동 림프절 조직을 채취하여 난알부민(OVA) 항원으로 재자극을 주었을 때 IL-5 및 IL-13의 발현을 조사하여 그 결과를 도 13에 나타내었다. A normal control group administered with an aqueous phosphorylation buffer solution (PBS) into the nasal cavity of a mouse, a mouse model of asthma induced by intravenous administration of dendritic cells in Examples 1 and 2, and a conventional method in Comparative Example 1 were used. When mediastinal lymph node tissues were collected from four groups of the induced asthma mouse model and restimulated with ovalbumin (OVA) antigen, the expression of IL-5 and IL-13 was investigated, and the results are shown in FIG. 13 .
도 13에서 보는 바와 같이, 정상 대조군이나 기존 방법을 이용하여 유도된 비교예 1의 마우스 모델에 비하여 수지상 세포를 정맥 내로 투여하여 유도된 실시예 1 및 2의 마우스 모델의 종격동 림프절에서 IL-5 및 IL-13의 발현 수준이 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있었다. As shown in FIG. 13 , compared to the mouse model of Comparative Example 1 induced using a normal control or a conventional method, IL-5 and IL-5 and It was confirmed that the expression level of IL-13 was significantly increased.
이를 통하여 종격동 림프절은 수지상 세포가 이동하여 T 세포를 활성화시켜서 면역 반응을 개시하는 곳으로, 수지상 세포를 이용한 천식 마우스에서 천식이 잘 유도되었음을 시사한다.Through this, the mediastinal lymph node is a place where dendritic cells migrate and activate T cells to initiate an immune response, suggesting that asthma was well induced in asthmatic mice using dendritic cells.
[실험예 9] 알러지성 비염 마우스 모델의 제작[Experimental Example 9] Preparation of allergic rhinitis mouse model
상기 실시예 1 및 2에서 제작한 마우스 모델을 케이지에 가둔 후 3일간 행태를 관찰한 결과, 실시예 1 및 2의 마우스 모델에 있어서 10분간 코를 대략 50회 이상 반복적으로 긁는 행태를 보였고, 재채기 횟수는 대략 30회 이상인 것으로 볼 때 알러지성 비염 또한 유도되었음을 알 수 있었다(단, 도면으로 그 결과를 도시하지는 않았다). As a result of observing the behavior of the mouse model prepared in Examples 1 and 2 for 3 days after being confined in a cage, the mouse model of Examples 1 and 2 showed a behavior of repeatedly scratching the nose 50 times or more for 10 minutes It was found that allergic rhinitis was also induced when the number of times was approximately 30 or more (however, the results were not shown in the drawings).
Claims (17)
상기 동물 개체는 래트, 마우스, 모르모트, 햄스터, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 양 및 염소로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 제조 방법. According to claim 1,
Wherein the animal subject is selected from the group consisting of rat, mouse, guinea pig, hamster, rabbit, monkey, dog, cat, cow, horse, pig, sheep and goat.
상기 동물 개체의 복강 내에 난알부민의 주입 시 아쥬번트(adjuvant)를 추가로 주입하는, 제조 방법. According to claim 1,
A manufacturing method of additionally injecting an adjuvant upon injection of egg albumin into the abdominal cavity of the animal subject.
상기 아쥬번트는 프로인드 아쥬번트(Freund's adjuvant), 알럼(alum), 면역 자극 복합체(immune stimulatory complex; ISCOM), 산소 함유 금속염(oxygen-containing metal salts), 이열성 엔테로톡신(heat-labile enterotoxin; LT), 콜레라 독소(cholera toxin; CT), 콜레라 독소 B 서브유닛(cholera toxin B subunit; CTB), 고분자화된 리포좀(polymerized liposomes), LTK63, LTR72, 마이크로캡슐(microcapsules), 인터류킨(interleukins), GM-CSF, MDF 유도체, CpG 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides), LPS, MPL, 포스포파젠(phosphophazenes), 글루칸(glucan), 항원 제제, 리포좀, DDE, DHEA, DMPC, DMPG, DOC/알럼(Alum) 복합체, 프로인트 불완전 보조약(Freund's incomplete adjuvant), LT 경구 보조약, 뮤라밀 디펩티드(muramyl dipeptide), 모노포스포릴 지질 A(monophosphoryl lipid A), 뮤라밀 트리펩티드(muramyl tripeptide) 및 포스파티딜에타놀아민(phospatidylethanolamine)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 제조 방법. 9. The method of claim 8,
The adjuvants include Freund's adjuvant, alum, immune stimulatory complex (ISCOM), oxygen-containing metal salts, heat-labile enterotoxin; LT), cholera toxin (CT), cholera toxin B subunit (CTB), polymerized liposomes, LTK63, LTR72, microcapsules, interleukins, GM-CSF, MDF derivatives, CpG oligonucleotides, LPS, MPL, phosphophazenes, glucan, antigen preparation, liposome, DDE, DHEA, DMPC, DMPG, DOC/Alum complex , Freund's incomplete adjuvant, LT oral adjuvant, muramyl dipeptide, monophosphoryl lipid A, muramyl tripeptide and phosphatidylethanolamine ( phospatidylethanolamine) at least one selected from the group consisting of, a manufacturing method.
상기 난알부민을 상기 동물 개체의 복강 내에 주입하는 횟수는 1 내지 5회인, 제조 방법. According to claim 1,
The number of injections of the egg albumin into the abdominal cavity of the animal subject is 1 to 5 times.
상기 수지상 세포는 골수 유래인 것인, 제조 방법. According to claim 1,
The dendritic cells are bone marrow-derived, the manufacturing method.
상기 수지상 세포는 1 X 106 내지 1 X 107 세포의 양으로 주입되는, 제조 방법. According to claim 1,
The dendritic cells are injected in an amount of 1 X 10 6 to 1 X 10 7 cells, the manufacturing method.
상기 스크리닝하는 방법은, 상기 동물 모델에 알레르기성 천식의 예방 또는 치료용 후보 물질을 처리하는 단계; 및
상기 후보 물질을 처리한 동물 모델을 사육하면서 예후를 확인하는 단계를 포함하는, 스크리닝하는 방법. 16. The method of claim 15,
The screening method may include treating the animal model with a candidate substance for the prevention or treatment of allergic asthma; and
A screening method comprising the step of confirming a prognosis while breeding an animal model treated with the candidate substance.
상기 후보 물질에 의하여 상기 동물 모델의 알레르기성 천식이 예방되거나, 치료되거나, 대조군 물질에 비하여 예후가 증진된 경우에 상기 후보 물질을 알레르기성 천식의 예방제 또는 치료제로 결정하는 것인, 스크리닝하는 방법.17. The method of claim 16,
A method of screening, wherein the candidate substance is determined as a preventive or therapeutic agent for allergic asthma when the candidate substance prevents, treats, or improves the prognosis compared to a control substance in the animal model.
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