KR102275188B1

KR102275188B1 - 비효소적으로 혈당을 측정하는 미세침 전극 센서 및 이의 제조하는 방법

Info

Publication number: KR102275188B1
Application number: KR1020190088490A
Authority: KR
Inventors: 조성보; 레디 친나이데이얄라 소마세카
Original assignee: 가천대학교 산학협력단
Priority date: 2018-07-24
Filing date: 2019-07-22
Publication date: 2021-07-08
Also published as: KR20200011369A

Abstract

본 발명은 비효소적으로 혈당을 측정하는 미세침 전극 센서, 이의 제조방법 및 이를 이용하여 비효소적으로 혈당을 측정하는 방법에 관한 것 이다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 기존의 효소기반의 미세침 전극센서와는 달리 비효소적으로 혈당을 측정할 수 있게 되고 안정성 및 내구성이 향상되어 통증이 없고 지속적으로 모니터링 할 수 있는 혈당 측정용 미세침 전극센서를 제공할 수 있는 효과가 있다.

Description

비효소적으로 혈당을 측정하는 미세침 전극 센서 및 이의 제조하는 방법 {NONENZYMATIC DETERMINATION OF GLUCOSE AT NEAR NEUTRAL PH VALUES BASED ON THE USE OF NAFION AND PLATINUM BLACK COATED MICRONEEDLE ELECTRODE ARRAY}

본 발명은 비효소적으로 혈당을 측정할 수 있는 미세침 전극 센서 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 글루코스산화효소가 아닌 금속 촉매인 Pt black을 사용하여 혈당을 비효소적으로 측정할 수 있는 미세침 전극 센서에 관한 것이다.

2018년 현재 전 세계적으로 약 4억 만 명이 당뇨병에 시달리고 있으며, 2035년까지 6억 만 명에 이를 것으로 추산된다. 이러한 당뇨병환자들에게 당뇨병의 치료 및 합병증의 예방을 위해 혈당 관리가 필수적으로 요구되고 이 경우 혈당을 측정하기 위한 가장 일반적인 방법은 환자의 손가락 끝으로부터 소량의 혈액을 채취하여 혈당을 측정하는 것이다. 그러나 이는 많은 당뇨병 환자에게 trypanophobia(선단 공포증)를 일으키는 문제가 있었는바 혈당을 측정하는 대체적인 방법에 대해 수많은 조사가 있어 왔다. 그중에서도 미세침과 같은 마이크로 전기 기계적 시스템(microelectrochemical system, MEMS) 기술은 통증 없이 혈당을 측정하기 위한 방안으로서 이상적으로 여겨져 왔다. 미세침(micro needle)은 마이크로사이즈의 장치로서 적은 통증으로 피부 외피를 침투하는 능력이 있는바 다양한 치료 내지 진단 시스템에 활용되어질 수 있다. 따라서 미세침 분야는 빠르게 성장해 왔고 이는 통증 없이 피부 내 공간으로의 전달 및 채취를 위한 가능성 때문에 상당한 관심을 불러 일으켜 왔다.

지금까지 미세침은 인슐린 주입 및 다양한 분석을 위한 센서로 사용되어져 왔다. 대부분의 미세침의 응용은 최소한으로 침습하는 통증 없는 경피성의 약의 전달에 중점을 두어왔고, 센서로 사용되는 미세침의 경우는 주로 최소한으로 침습하는 글루코스의 전기적인 측정에 중점을 두어왔다.

후자처럼 글루코스의 전기적인 측정을 위해 미세침을 사용하기 위한 여러 시도가 있어왔다. MEMS기술을 사용하여 착용 가능한 전기적으로 글루코스를 측정하는 센서가 보고되었고, 전기적으로 글루코스를 감지하는 스마트패치, 미세침 배열 아래쪽에 위치한 효소가 결합된 전기화학 전극을 사용하여 글루코스를 감지하는 장치 등 효소기반의 전기화학적인 감지방법을 사용한 많은 글루코스 센서들이 보고되었다. 그러나 이러한 효소기반의 글루코스 센서들의 경우 온도,PH,습도 등에 의해 쉽게 영향을 받아 안정성이 부족하다는 문제가 존재하였다.

한편 이와 대조적으로 효소를 사용하지 않는 글루코스센서의 경우 상기 효소기반의 글루코스센서와는 달리 안정성이 높고 제작이 단순하며 혈당측정결과의 재현성 높고 산소제한으로부터 자유롭다는 몇 가지 장점을 갖는다. 그리고 또한 지난 수십 년 동안 글루코스 측정의 민감도도 효소기반 센서에 못지않을 정도로 상당히 증가하였다. 따라서 비효소적인 글루코스 측정 센서가 글루코스수준을 감지하기 위한 대체적인 방법으로 제시되고 있다.

Mo R, Jiang T, Di J, Tai W, Gu Z, (2014)Emerging micro- and nanotechnology based synthetic approaches for insulin delivery. Chem Soc Rev 43(10):3595-3629 Yoon Y, Lee GS, Yoo K, Lee J-B, (2013)Fabrication of a microneedle/CNT hierarchical micro/nano surface electrochemical sensors and its in-vitro glucose sensing characterization. Sensors 13(12):16672-16681

본 발명의 목적은, 비효소적으로 혈당을 측정할 수 있는 미세침 전극 센서, 이의 제조방법 및 이를 비효소적으로 혈당을 측정하는 방법을 제공함에 있다.

상기 목적 달성을 위하여, 본 발명은 비효소적으로 혈당을 측정하는 미세침 전극 센서를 제조하는 방법을 제공한다.

상기 비효소적으로 혈당을 측정하는 미세침 전극 센서를 제조하는 방법은(a) 기판에 복수의 미세침 형상을 형성하는 단계; (b) 상기 기판에 대하여 미세침 형상을 수직으로 구부려서 미세침을 형성하는 단계; (c) 상기 형성된 미세침의 첨단(尖端)부분에 위치하는 미세침의 반응부와 상기 기판의 전극이 형성되는 기판의 접촉패드를 방어제로 보호하고 상기 기판 전체를 보호제로 코팅하는 단계; (d) 상기 (c) 단계 후 상기 미세침의 반응부와 상기 기판의 접촉패드의 방어제를 제거하는 단계; 및 (e) 상기 보호제가 제거된 미세침의 반응부에 글루코스산화촉매를 코팅하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 (b)단계는 상기 미세침의 표면에 금(Au), 백금(Pt), 또는 은(Ag)을 도금하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 미세침의 반응부를 보호하는 방어제는 PDMS(Polydimethylsiloxane)일 수 있고, 상기 기판의 접촉패드를 보호하는 방어제는 Parafilm일 수 있다.

상기 보호제는 Parylene일 수 있고, 상기 보호제는 1μm 이상의 두께로 코팅할 수 있다.

상기 (e)단계의 글루코스산화촉매는 Pt black 일 수 있으며, 상기 글루코스 산화촉매를 코팅하는 단계는 2.5 % 염화 백금산(chloroplatinic acid) 및 0.05 % 아세트산납(lead acetate) 및 나머지는 0.1M염산(HCl)으로 구성된 전착용액을 사용할 수 있다.

더불어 상기 (e)단계 글루코스산화촉매 대신 염화은을 코팅하여 기준전극이 되는 미세침 전극 센서를 제조할 수 있다.

상기 (e)단계 후, 상기 글루코스 산화촉매의 상부에 나피온을 코팅하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 다른 목적 달성을 위하여, 본 발명은 비효소적으로 혈당을 감지하는 미세침 전극 센서를 제공한다.

상기 비효소적으로 혈당을 감지하는 미세침 전극 센서는 전도성 있는 금속으로 된 기판; 상기 기판에 대하여 수직으로 서있는 다수의 미세침; 상기 미세침의 첨단(尖端)부분에 형성되는 반응부; 상기 미세침의 반응부와 상기 기판을 연결하는 지지부; 를 포함하고, 상기 반응부는 글루코스 산화촉매가 코팅되고, 상기 지지부 및 기판은 보호제로 코팅된 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 미세침은 표면이 금(Au), 백금(Pt), 또는 은(Ag)으로 도금될 수 있다.

상기 글루코스산화촉매는 Pt black일 수 있다.

상기 보호제는 parylene일 수 있으며, 상기 보호제는 1μm 이상의 두께로 코팅될 수 있다.

상기 글루코스산화촉매 대신 염화은을 코팅하여 기준전극으로 사용할 수 있다.

상기 반응부는 상기 글루코스산화촉매 코팅의 상부에 나피온을 더 코팅할 수 있다.

상기 또 다른 목적 달성을 위하여, 본 발명은 상기 비효소적으로 혈당을 감지하는 미세침 전극 센서를 3전극으로 구성하여 글루코스의 전기 신호를 측정하는 비효소적으로 혈당을 감지하는 방법을 제공할 수 있다.

상기와 같은 본 발명에 따르면, 미세침 첨단부분에 Pt black 및 나피온을 순차적으로 코팅하고 parylene으로 나머지부분을 코팅하여 미세침 전극센서를 제조함으로써 기존의 효소기반의 미세침 전극센서와는 달리 비효소적으로 혈당을 측정할 수 있게 되고 안정성 및 내구성이 향상되어, 통증이 없고 지속적으로 모니터링 할 수 있는 효과가 있다.

도 1 은 본 발명의 미세침 전극 센서의 제작과정을 도시한 것이다.
도 2는 측정예 1에 따른 SEM(Scanning electron microscopy)이미지이다.
도 3은 측정예 2에 따른 순환 전압-전류 그래프(cyclic voltammograms, CVs)이다.
도 4는 측정예 3에 따른 선형 전압-전류 그래프 (linear sweep voltammetry, LSV)이다
도 5는 측정예 4에 따른 전류-시간 그래프이다.
도 6은 측정예 5에 따른 재현성 그래프이다.
도 7은 측정예 5에 따른 안정성 그래프이다.
도 8은 측정예 6에 따른 전류-시간 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

더불어 상기 (e)단계 글루코스산화촉매 대신 염화은을 코팅하여 미세침 전극 센서를 제조할 수 있으며, 이렇게 제조된 미세침 전극은 3전극 측정법을 구성할 때 Ag/AgCl 기준전극으로 사용 할 수 있다.

상기 (e)단계의 글루코스산화촉매는 백금흑(Platinum black, Pt black) 일 수 있으며, 상기 글루코스 산화촉매를 코팅하는 단계는 2.5 % 염화 백금산(chloroplatinic acid) 및 0.05 % 아세트산납(lead acetate) 및 나머지는 0.1M염산(HCl)으로 구성된 전착용액을 사용할 수 있다.

상기의 단계들을 수행하면 Pt black 미세침 전극 센서를 제조할 수 있다.

상기 단계들을 수행하면 Pt black/nafion 미세침 전극 센서를 제조할 수 있다.

상기 본 발명을 보다 구체적으로 설명하면, 상기 (a)단계에서 본 발명에 의해 제조된 비효소적으로 혈당을 측정할 수 있는 미세침 전극 센서는 미세침이 작동 전극으로 작용하므로, 복수의 미세침이 형성되어 있는 기판은 전도성 있는 금속 재질이며 바람직하게는 스테인레스스틸(stainless steel)로 할 수 있다. 또한 상기 복수의 미세침이 형성되어 있는 기판에 전도성이 뛰어난 금속을 도금하여 사용할 수 있고 바람직하게는 금(Au), 백금(Pt), 또는 은(Ag) 도금할 수 있다. 그리고 미세침을 기판에 형성함에 있어 미세침을 기판 표면에 대해 수직(90°)으로 세워지도록 형성할 수 있다. 기판에 형성되어있는 복수의 미세침의 경우 그 개수는 바람직하게는 3×5배열로 기판 상에 형성된 여러 개의 미세침일 수 있다.

상기(c)단계는 미세침의 반응부를 겔(gel)타입의 PDMS(Polydimethylsiloxane)로 보호하고 복수의 미세침이 형성된 기판의 일측에 돌출된 접촉패드부분을 Parafilm으로 코팅한 후 보호 및 코팅한 부분을 제외한 나머지 부분에 보호제로 parylene을 코팅할 수 있다.

상기 보호제는 Parylene을 코팅함으로써 전기절연 및 방수효과를 낼 수 있으며, 미세침 전극 센서의 사용 중 체내물질에 의한 부식이나 생물부착 등을 방지할 수 있게 하기 위함이다. 상기 parylene은 화학기상증착법(chemical vapor deposition, CVD)으로 코팅될 수 있다. 일반적으로 parylene의 경우 식각이 어렵다는 단점이 있으나, 본원발명은 PDMS(Polydimethylsiloxane)과 parafilm을 parylene 코팅 제외부분에 적용함으로써 추가적인 식각 공정 없이도 parylene 코팅이 가능하다. 또한 parylene의 코팅두께는 1 μm 이상일 경우 물과 같은 액체상태 물질에 넣었을 때에 수일동안 안정하였으나 1 μm 미만에서는 액체에 넣자마자 불안정한 특성을 보이므로 1 μm 이상으로 코팅해야 한다. 가장 효과적으로는 5 μm 이상 하는 것이 좋으나, 박막이 너무 두꺼우면 피부 침투 시 물리적으로 방해가 될 수 있으므로 10 μm 이내로 하는 것이 바람직하다.

상기 (e)단계에서 미세침의 반응부에 코팅되는 글루코스산화촉매는 Pt black 일수 있다. 상기 글루코스의 산화 및 환원 촉매로 이용되는 Pt black의 코팅은 미세침의 반응부를 보호하고 있는 PDMS를 제거한 후에 이루어진다. 구체적으로, Pt black 코팅은 3전극 시스템(Ag / AgCl 기준 전극, Pt 상대 전극 및 미세침 작동 전극)을 사용하고 전류밀도 2.5 mA/m²로 하여 2.5 % 염화 백금산(chloroplatinic acid), 0.05 % 아세트산납(lead acetate)과 0.1 M 염산(HCl)으로 이루어진 3 mL의 용액을 사용하여 이루어진다. Pt black은 전기도금에 사용하기 용이한 백금 분말의 형태로서, 이용 가능한 전극물질 중 과잉으로 존재하는 대표적인 물질이다. 그리고 높은 생체적합성을 가지며 글루코스 산화반응에 대해 높은 촉매활성을 가진다.

따라서 Pt black 사용 시, 글루코스와 공존하는 전기활성을 갖는 다른 방해물의 접근을 최소화하면서 글루코스옥시다아제와 같은 효소 없이도 글루코스산화반응이 일어나게 한다. 또한 과잉으로 존재하므로 미세침 전극 센서의 생산 비용 절감을 위해서도 사용될 수 있다.

그리고 상기 (e)단계 이후 상기 글루코스산화촉매 코팅된 미세침 반응부 표면을 나피온을 추가로 코팅하는 단계를 더 포함할 수 있다. 나피온은 생체 적합성 있는 물질로서 정전기적 반발에 의해 글루코스 및 혈당에 관여하는 성분이 아닌 여러 생체 내 신호간섭물질들에 대한 전극표면(Pt black)으로의 접근을 제한하는 방어막으로 작용한다. 이 경우 미세침의 반응부에 Pt black과 같은 글루코스산화촉매가 코팅된 상태이므로 나피온 코팅은 미세침 반응부를 나피온 용액에 담지 함으로써 코팅되는 간단한 방법에 의해 이루어질 수 있다. 구체적으로, 나피온과 에탄올을 1 : 6 의 부피비로 혼합한 용액에 60초 동안 담지한 후 50℃의 hot plate에서 40초 동안 건조하고, 상온(24℃)에서 1시간 동안 신선한 공기로 건조하여 이루어진다.

상기의 구성들을 포함하면 Ag/AgCl 미세침 기준전극의 구성일 수 있다.

상기 글루코스산화촉매는 Pt black일 수 있다.

상기의 구성들을 포함하면 Pt 미세침 전극 센서의 구성일 수 있다.

상기 구성들을 포함하면 Pt black/nafion 미세침 전극 센서의 구성일 수 있다.

상기 3전극은 작동전극(working electrode), 상대전극(counter electrode), 기준전극(reference electrode)으로 구성되며, 이때 상기 작동전극(working electrode)은 Pt black/nafion 미세침 전극 센서를, 상대전극(counter electrode)은 Pt 미세침 전극 센서를, 기준전극(reference electrode)은 Ag/AgCl 미세침 전극 센서를 이용할 수 있다.

이하, 실시예 및 측정예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예 및 측정예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1

Pt black/nafion 미세침 전극 센서는 60초 동안 2 kgf/cm²의 압력 하에서 습식 염화제2철(FeCl₃) 화학적 에칭액 제트(jet)를 사용하여 스테인레스스틸(stainless steel) 재질로 미세침 형상을 형성하였다. 그리고 미세침 표면에 얇은 금(Au)층을 전기 도금(electroplating)하고 지그(jig)를 사용해 90°로 구부렸다. 그 후 미세침의 첨단(tip) 부분은 겔(Gel)타입의 PDMS로, 미세침 전극이 형성되어 있는 기판의 접촉패드는 파라필름(parafilmn)으로 보호하였다. 이후 상기 보호된 부분을 제외한 나머지 영역에 5 μm로 parylene 코팅을 하고 상기 PDMS와 파라필름(parafilmn)을 제거한 후 미세침 첨단 부분에 Pt black을 전착(electrodeposition)시켰다. 이때 Pt black의 전착을 위해 3전극 시스템(Ag/AgCl 기준 전극, Pt 상대전극 및 미세침 작동 전극)이 사용되었다. 그리고 Pt black은 -2.5 mA/cm²의 전류 밀도로 200초 동안 2.5 % 염화 백금산(chloroplatinic acid) 및 0.05 % 아세트산납(lead acetate), 0.1M염산(HCl)으로 구성된 3 mL의 용액을 사용해 전착되었다. 그리고 상기 Pt black이 전착된 미세침의 첨단부분을 나피온과 에탄올을 1 : 6 의 부피비로 혼합한 용액에 60초 동안 담지 하였다. 이후 50℃의 hot plate에서 40초 동안 건조하고, 상온(24℃)에서 1시간 동안 신선한 공기로 건조시켜 Pt black/nafion 미세침 전극 센서를 제조하였다.

실시예 2

Pt 미세침 전극 센서는 60초 동안 2 kgf/cm²의 압력 하에서 습식 염화제2철(FeCl₃) 화학적 에칭액 제트(jet)를 사용하여 스테인레스스틸(stainless steel) 재질로 형성하였다. 그리고 미세침 표면에 얇은 백금(Pt)층을 전기 도금(electroplating)하고 지그(jig)를 사용해 90°로 구부렸다. 그 후 미세침의 첨단(tip) 부분은 겔(Gel)타입의 PDMS로, 미세침 전극이 형성되어 있는 기판의 접촉패드는 파라필름(parafilmn)으로 보호하였다. 이후 상기 보호된 부분을 제외한 나머지 영역에 5 μm로 parylene 코팅을 하였다.

실시예 3

Ag/AgCl 미세침 전극 센서는 60초 동안 2 kgf/cm2의 압력 하에서 습식 염화제2철(FeCl3) 화학적 에칭액 제트(jet)를 사용하여 스테인레스스틸(stainless steel) 재질로 형성하였다. 그리고 미세침 표면에 얇은 은(Ag)층을 전기 도금(electroplating)하고 지그(jig)를 사용해 90°로 구부렸다. 그 후 미세침의 첨단(tip) 부분은 겔(Gel)타입의 PDMS로, 미세침 전극이 형성되어 있는 기판의 접촉패드는 파라필름(parafilmn)으로 보호하였다. 이후 상기 보호된 부분을 제외한 나머지 영역에 5 μm로 parylene 코팅을 하고 상기 PDMS와 파라필름(parafilmn)을 제거한 후 미세침 첨단 부분에 AgCl(염화은) 코팅을 시켜 Ag/AgCl 미세침 전극 센서를 제조하였다.

측정예 1.

SEM(Scanning electron microscopy)이미지를 관찰해보면, 표면이 금으로 도금되지 않은 미세침의 표면은 평평한 형태이나 이에 금(Au)과 Pt black을 순차적으로 도금한 후에는 거칠고 다공성인 편평하지 않은 형태로 바뀌게 된다.(도 2a) 최종적으로 실시예 1에 의해 제조된 미세침 전극 센서와 같이 나피온을 Pt black이 도금된 미세침에 코팅하면 얇은 필름이 형성되어있는 미세침 반응부의 표면을 관찰할 수 있다.(도 2b)

측정예 2.

실시예 1에서 제조된 Pt black/nafion 미세침 전극은 작동전극(working electrode)으로, 실시예 2에서 제조된 Pt 미세침 전극은 상대전극(counter electrode)으로, 실시예 3에서 제조된 Ag/AgCl 미세침 전극은 기준전극(reference electrode)으로 사용하여 전압전류를 측정 하였다. 구체적으로 작동전극(working electrode), 상대전극(counter electrode), 기준전극(reference electrode)로 구성되는 3 전극 시스템(도 3a) 및 작동전극(working electrode), 기준전극(reference electrode)로만 구성되는 2 전극 시스템(도 3b) 하에서, 0.7 내지 0.4 V 전압 범위에서 50 mV/s의 스캔 속도로 완충 식염수(pH 7.4)를 사용하여 순환 전압-전류 그래프(cyclic voltammograms, CVs)를 기록하였다. 도 3a와 도 3b에서, Pt black 미세침 전극은 전형적인 Pt의 순환 전압-전류 그래프를 나타내었고, 백금흑(Pt black)이 도금되지 않은 미세침 전극에 비해 더 높은 산화환원 피크(peak)를 나타내었다. 이는 Pt black으로 인해 전극의 반응 가능한 면적이 증가함에 따라 전극의 임피던스가 감소했기 때문이다. 나피온이 코팅된 경우에는(Pt black/nafion 미세침 전극), 0.12 V에서 양극 피크(anodic peak) 전류는 약간 증가(도 3a, 도 3b 각각 12 % 및 40 %)하였으나, -0.37 V에서는 상당히 감소(도 3a, 도 3b 각각 143 % 및 49 %)하였다. 그러나 양극 피크(anodic peak) 전압의 변화는 발견되지 않았다. 이는 나피온 막을 형성한 이후에도 산화환원전류를 측정하는 미세침 전극 센서의 특성을 잃지 않았다는 것을 의미한다.

측정예 3.

실시예 1에서 제조된 Pt black/nafion 미세침 전극은 작동전극(Working electrode)으로, 실시예 2에서 제조된 Pt 미세침 전극은 상대전극(counter electrode)으로, 실시예 3에서 제조된 Ag/AgCl 미세침 전극은 기준전극(reference electrode)으로 사용하여 3 전극 시스템(도 4a) 및 2전극 시스템(도 4b) 하에서 pH 7.4인 완충식염수에 존재하는 다양한 농도의 글루코스(0 내지 30 mM)를 50 mV/s의 스캔속도로 전압전류를 측정하였고 이에 대한 선형 전압-전류 그래프(linear sweep voltammetry, LSV)를 도 4에 도시하였다. -0.37 V에서의 전류 피크는 글루코스의 전기 흡착을 위해 형성된 흡착되는 중간체에 기인한다.(수소의 흡착-탈착 영역: -1.0 V 내지 -0.6 V) -0.12 V에 있는 두 번째 피크와 +0.12 V에 있는 세 번째 피크는 전극 표면에서의 글루코스의 직접적인 산화에 대응한다.(글루코스 산화 영역: -0.4 V 내지 +0.6 V)

글루코스 농도가 증가함에 따라 글루코스산화로 인해 생기는 전류피크는 앞서 언급한 전압들에서 증가하였다. 글루코스산화를 위한 최적의 전압으로 +0.12 V가 선택되었고 이와 같은 낮은 과전압으로 인해 방해물이 없는 측정이 가능하게 되었다.

글루코스 측정 전압의 경우 기존의 비효소적인 전기화학적 글루코스센서들은 높은 전압 (약 +0.6 V)이 요구되는 반면 본 발명 센서는 측정 전압이 +0.12 V로 낮은 전압을 요하였다. 이러한 전압의 감소는 생체 내 분석을 안전하게 수행할 수 있게 하고 휴대용 센서의 전력 소모를 감소시키는 효과가 있다.

측정예 4.

+0.12 V를 걸어 100초 간격으로 연속적으로 글루코스를 첨가한 후 실시예 1에서 제조된 Pt black/nafion 미세침 전극은 작동전극(Working electrode)으로, 실시예 2에서 제조된 Pt 미세침 전극은 상대전극(counter electrode)으로, 실시예 3에서 제조된 Ag/AgCl 미세침 전극은 기준전극(reference electrode)으로 사용하여 전류-시간을 측정하였다. 3전극 시스템(도 5a)에서 양극(anodic)전류는 글루코스농도의 증가에 따라 선형적으로 증가하다가 40 mM에서 포화에 이르렀다. 2전극 시스템(도 5b)에서는 20 mM에서 포화에 이르렀다.

전극은 3전극시스템에서는 1 내지 40 mM, 2전극 시스템에서는 4 내지 20 mM의 넓은 동적 범위에서 각각 175±0.84 μA/mM·cm², 205.57±0.84 μA/mM·cm² 의 측정 민감도를 나타낸다. 센서의 반응 시간은 2초이고, 글루코스의 탐지 한계( limits of detection ,DL)는 3전극 및 2전극 시스템에서 각각 23±2.0 μm, 6.0±1.0 μm 에 해당한다. DL 값은 측정 민감도와 동일하게 취급된다. 이는 실제 기존의 비효소적인 전기화학적 글루코스센서들의 측정농도 상한 및 측정 민감도 보다 더 높은 값이다.

넓은 농도 범위에 걸쳐서 관찰된 높은 선형 결과는 측정하는 글루코스에 대해 제작된 센서의 높은 재현성있는 전기화학적 작동을 증명하였다.(도 5c, 도 5d) 그리고 이 경우 측정된 글루코스농도 범위는 생리학적 및 병리학적인 글루코스농도를 포함하는 범위이고 이는 본 미세침 센서가 앞으로 글루코스센서로 이용되는데 대한 진단적 가치를 나타내었다. 그리고 센서 성능에 대한 상대적인 분석은 3전극 시스템(도 5c)이 2전극시스템(도 5d)보다 더 좋은 선형 범위와 적당한 민감도 및 DL을 나타내었다.

측정예 5.

실시예 1 내지 3의 제조방법으로 제조된 미세침 전극의 재현성을 다양한 글루코스 농도에 대한 반응으로부터 평가하였다. 실시예 1에서 제조된 Pt black/nafion 미세침 전극은 작동전극(Working electrode)으로, 실시예 2에서 제조된 Pt 미세침 전극은 상대전극(counter electrode)으로, 실시예 3에서 제조된 Ag/AgCl 미세침 전극은 기준전극(reference electrode)으로 사용하여 수행한 3전극 시스템에서 0.1 M PBS 완충용액(pH7.4)에 글루코스를 연속적으로 첨가한 경우 3.2 %의 상대편차를 가지며 수용할만한 적당한 재현성을 보였다.(도 6)

안정성은 5시간동안 +0.12 V의 일정 전압 하에서, 0.1 M PBS 완충용액(pH 7.4)에 4 내지 8 mM 농도 범위의 글루코스를 연속적으로 첨가 및 측정함으로써 이루어졌다. 그 결과 12번의 연속적인 측정의 마지막에도 여전히 센서의 초기 활성의 60 %가 유지됨이 증명되었다.(도 7 A,B)

한편 기존의 비효소적인 전기화학적 글루코스센서들의 경우 NaOH용액에서와 같은 염기성 환경에서 측정 가능하였고 이러한 이유로 실제 샘플 분석에서 비효소적인 센서들을 사용하는 것이 용이하지 않았다. 그러나 본 발명과 같이 Pt black/nafion에 기반 한 센서의 경우 중성 환경에서의 분석을 가능하게 하므로 실제 샘플 분석에도 용이하다.

측정예 6.

실시예 1 내지 3의 제조방법으로 제조된 미세침 전극 센서의 글루코스에 대한 선택도를 확인하기 위해 실제 혈액 샘플들에 있는 방해물질들 즉 AA, DP, AP, LA 그리고 UA( AA: ascorbic acid, LA: lactic acid, UA: uric acid, DP: dopamine, and AP: acetaminophen )의 효과를 연구하였다. 조사에 사용된 방해물들의 농도는 보통의 생리학적인 수준 보다 10배 높았다. 도 8은 3 전극 시스템(도 8a) 및 2 전극 시스템(도 8b)의 0.12 V 하에서 Pt black/nafion 미세침 전극센서를 사용해 방해물이 존재하는 경우(글루코스 농도는 2 mM, 방해물 농도는 0.1 mM)에 나타는 실험결과를 제시하고 있다. 그 결과 어떠한 방해물을 첨가하든 글루코스의 감지에 무시할만한 영향을 주고 있음이 명백하였다. 방해물들의 이러한 무시할만한 영향은 나피온에 의해 발생되는 정전기적 반발로 인해 방해물들의 미세침 전극표면으로의 접근이 제한되었기 때문이다. 그리고 이러한 방해물로부터 자유로운 글루코스의 감지는 Pt의 글루코스 감지에 대한 강하고 선택적인 전기 촉매적 활성을 반영하고 있다.

측정예 7

세 개의 서로 다른 혈액 샘플들(A, B, and C)에 존재하는 글루코스의 농도를 0.12V하에서 표준적인 첨가 방법을 사용하여, 실시예 1 내지 3의 제조방법으로 제조된 미세침을 3전극 방식으로 측정하고, 대조군으로 상업적인 글루코미터(glucometer)를 이용해 측정해 보았다. 그 결과는 아래 표와 같다.

	실시예 1 내지 3의 미세침 전극센서	상업적인 글루코미터
A	3.8±0.14 mM	4.0±0.016 mM
B	5.1±0.21 mM	5.2±0.012 mM
C	4.7±0.17 mM	4.5±0.031 mM

이에 의하면 양 측정값 사이에 큰 차이가 없는 것을 알 수 있다. 이러한 양 측정 결과 사이의 호환은 실제 혈액 샘플에 본 발명 센서를 사용하여 글루코스를 측정하는 것에 대한 신뢰도를 증명한다. 이러한 연구는 본 발명 센서가 실제 샘플에서의 민감하고 양적인 글루코스의 분석에 사용될 수 있음을 나타내고 있다.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims

혈당을 측정하는 미세침 전극 센서를 제조하는데 있어서,
(a) 전도성 있는 금속으로 된 기판에 복수의 미세침 형상을 형성하는 단계;
(b) 상기 미세침 형상을 수직으로 구부려서 미세침을 형성하는 단계;
(c) 상기 미세침의 첨단(尖端)부분에 위치하는 미세침의 반응부를 방어제인 PDMS(Polydimethylsiloxane)로 보호하고 상기 기판의 전극이 형성되는 기판의 접촉패드를 방어제인 Parafilm으로 보호하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계에서 보호된 부분을 제외한 미세침의 나머지 부분 및 상기 기판을 parylene으로 5~10μm 두께로 코팅하는 단계;
(e) 상기 미세침의 첨단(尖端)부분에 위치하는 미세침의 반응부에 글루코스산화촉매인 백금흑(Platinum black, Pt black)을 코팅하는 단계; 및
(f) 상기 글루코스 산화촉매인 백금흑(Pt black)의 상부에 나피온을 코팅하는 단계를 포함하며,
상기 (a)단계는 상기 기판을 전도성 금속으로 도금하는 단계를 더 포함하고,
상기 (d)단계에서 parylene 코팅 후 미세침의 반응부와 상기 기판의 접촉패드의 방어제를 제거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 비효소적으로 혈당을 측정하는 미세침 전극 센서를 제조하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 전도성 금속은 금(Au), 백금(Pt), 또는 은(Ag)인 것을 특징으로 하는 비효소적으로 혈당을 측정하는 미세침 전극 센서를 제조하는 방법.
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전도성 있는 금속으로 된 기판; 및 상기 기판에 대하여 수직으로 서있는 복수의 미세침을 포함하고,
상기 미세침은 첨단(尖端) 부분의 반응부; 및 상기 반응부와 상기 기판을 연결하는 지지부로 구성되며,
상기 기판 및 미세침의 표면은 전도성 금속으로 도금되어 있고,
상기 반응부는 글루코스 산화촉매인 백금흑(Pt black)이 코팅되고, 상기 코팅된 백금흑(Pt black)의 상부에 나피온이 더 코팅되어 있으며,
상기 지지부 및 기판은 parylene로 5~10μm 두께로 코팅된 것을 특징으로 하는 비효소적으로 혈당을 측정하는 미세침 전극 센서.
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제12항에 있어서,
상기 전도성 금속은 금(Au), 백금(Pt), 또는 은(Ag)인 것을 특징으로 하는 비효소적으로 혈당을 측정하는 미세침 전극 센서.
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제12항에 따른 미세침 전극 센서를 3전극 또는 2전극 측정법으로 구성하여 글루코스의 전기 신호를 측정하는 비효소적으로 혈당을 측정하는 방법.