KR102265477B1 - 약물 전달 시스템 및 방법 - Google Patents

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Abstract

약물 전달 시스템 및 방법이 제공된다. 상기 약물 전달 시스템은 제1 작용기를 갖고, 약물이 로딩된 나노입자 및 제2 작용기를 갖는 항체를 포함한다. 상기 나노입자와 상기 항체는 상기 제1 작용기와 상기 제2 작용기의 반응에 의해 결합된다.

Description

약물 전달 시스템 및 방법{SYSTEM AND METHOD FOR DRUG DELIVERY}
본 발명은 약물 전달 시스템 및 방법에 관한 것이다.
나노입자는 누출된 혈관 또는 종양 특이적 리간드의 표적화된 상호 작용을 통해 종양 조직에 치료 약물을 전달하는데 광범위하게 사용되어 왔다. 그러나, 약물이 로딩된 나노입자는 종양 조직 내 침투가 제한되기 때문에 상기 나노입자의 이질적인 분포로 인해 약물이 종양에 효과적으로 전달되지 못한다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 생체 내에 약물을 효과적으로 전달할 수 있는 약물 전달 시스템을 제공한다.
본 발명은 생체 내에 약물을 효과적으로 전달할 수 있는 약물 전달 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적들은 다음의 상세한 설명과 첨부한 도면으로부터 명확해 질 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 약물 전달 시스템은, 제1 작용기를 갖고, 약물이 로딩된 나노입자 및 제2 작용기를 갖는 항체를 포함한다. 상기 나노입자와 상기 항체는 상기 제1 작용기와 상기 제2 작용기의 반응에 의해 결합된다.
상기 반응은 클릭 반응일 수 있다.
상기 반응에 의한 결합 전에 상기 나노입자는 상기 제1 작용기로 표면 기능화되고, 상기 항체는 상기 제2 작용기로 표면 기능화될 수 있다.
상기 항체는 항-CD11b 항체를 포함할 수 있고, 항원 단백질을 포함하는 캐리어 세포와 결합할 수 있다.
상기 항체는 항원 단백질을 포함하는 캐리어 세포와 결합할 수 있고, 상기 캐리어 세포는 골수 유래 억제 세포를 포함할 수 있다.
상기 항원 단백질은 CD11b를 포함할 수 있다.
상기 나노입자는 상기 캐리어 세포에 의해 생체 내 종양으로 침투할 수 있다.
상기 나노입자는 그 표면에 배치되는 폴리에틸렌글리콜을 포함할 수 있고, 상기 제1 작용기는 상기 폴리에틸렌글리콜과 결합할 수 있다.
상기 나노입자는 메조포러스 실리카 나노입자를 포함할 수 있다.
상기 제1 작용기는 테트라진을 포함할 수 있고, 상기 제2 작용기는 트랜스-사이클로옥텐을 포함할 수 있다.
상기 반응은 생체 내에서 이루어질 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 약물 전달 시스템은, 약물이 로딩된 나노입자 및 상기 나노입자에 결합되는 항체를 포함한다. 상기 나노입자와 상기 항체는 상기 나노입자에 결합된 제1 작용기와 상기 항체에 결합된 제2 작용기의 클릭 반응에 의해 결합된다.
상기 클릭 반응은 생체 내에서 이루어질 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따르면, 종양 등의 생체 내 표적 사이트에 약물을 효과적으로 전달할 수 있다. 약물이 로딩된 나노입자가 종양 심부로 침투할 수 있어 종양 치료 효능을 향상시킨다. 세포의 생체 외 조작을 필요로 하지 않으며 다양한 유형의 세포 및 나노 수송체(nanovehicles)에 적용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 약물 전달 시스템 및 방법을 설명하기 위한 도면이다.
도 2는 테트라진으로 기능화된 메조포러스 실리카 나노입자(MSN-Tz)를 나타낸다.
도 3은 도 2의 MSN-Tz의 TEM 이미지를 나타낸다.
도 4는 테트라진(Tz)의 농도에 따른 MSN-Tz의 유체역학적 직경을 나타낸다.
도 5는 독소루비신이 로딩된 MSN-Tz로부터 독소루비신의 축적된 방출 프로파일을 나타낸다.
도 6 및 도 7은 MSN과 항-CD11b 항체의 결합에 있어서 Tz 및 TCO의 영향을 설명하기 위한 도면이다.
도 8은 MSN-Tz 및 항-CD11b-TCO(TCO로 기능화된 항-CD11b 항체) 사이의 상관 관계의 변화를 시간에 따라 나타낸다.
도 9는 MSN-Tz 및 항-CD11b-TCO의 결합 효율(conjugation efficiency)을 시간에 따라 나타낸다.
도 10은 MTS 분석을 이용하여 독소루비신이 로딩된 MSN-Tz의 생체외 세포 독성의 평가 결과를 나타낸다.
도 11은 MSN-Tz에 대한 트리판 블루 ??칭(Trypan blue quenching) 실험 결과를 나타낸다.
도 12는 MSN-Tz와 항-CD11b-TCO가 결합된 세포의 이동 능력에 대한 평가 결과를 나타낸다.
도 13은 골수 세포의 표면에서 항-CD11b-TCO에 대한 MSN-Tz의 표적화를 나타내는 공초점 현미경 이미지를 나타낸다.
도 14 내지 도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 약물 전달 방법을 이용하여 생체 내에서 4T1 종양으로 MSN-Tz의 전달을 설명하기 위한 도면이다.
도 22 내지 도 25는 본 발명의 일 실시예에 따른 약물 전달 방법에 의해 개선된 MSN-Tz의 치료 효능을 설명하기 위한 도면이다.
이하, 실시예들을 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 발명의 목적, 특징, 장점은 이하의 실시예들을 통해 쉽게 이해될 것이다. 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고, 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 따라서, 이하의 실시예들에 의하여 본 발명이 제한되어서는 안 된다.
본 발명의 일 실시예에 따른 약물 전달 시스템은, 제1 작용기를 갖고, 약물이 로딩된 나노입자 및 제2 작용기를 갖는 항체를 포함한다. 상기 나노입자와 상기 항체는 상기 제1 작용기와 상기 제2 작용기의 반응에 의해 결합된다.
상기 반응은 클릭 반응일 수 있다.
상기 반응에 의한 결합 전에 상기 나노입자는 상기 제1 작용기로 표면 기능화되고, 상기 항체는 상기 제2 작용기로 표면 기능화될 수 있다.
상기 항체는 항-CD11b 항체를 포함할 수 있고, 항원 단백질을 포함하는 캐리어 세포와 결합할 수 있다.
상기 항체는 항원 단백질을 포함하는 캐리어 세포와 결합할 수 있고, 상기 캐리어 세포는 골수 유래 억제 세포를 포함할 수 있다.
상기 항원 단백질은 CD11b를 포함할 수 있다.
상기 나노입자는 상기 캐리어 세포에 의해 생체 내 종양으로 침투할 수 있다.
상기 나노입자는 그 표면에 배치되는 폴리에틸렌글리콜을 포함할 수 있고, 상기 제1 작용기는 상기 폴리에틸렌글리콜과 결합할 수 있다.
상기 나노입자는 메조포러스 실리카 나노입자를 포함할 수 있다.
상기 제1 작용기는 테트라진을 포함할 수 있고, 상기 제2 작용기는 트랜스-사이클로옥텐을 포함할 수 있다.
상기 반응은 생체 내에서 이루어질 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 약물 전달 시스템은, 약물이 로딩된 나노입자 및 상기 나노입자에 결합되는 항체를 포함한다. 상기 나노입자와 상기 항체는 상기 나노입자에 결합된 제1 작용기와 상기 항체에 결합된 제2 작용기의 클릭 반응에 의해 결합된다.
상기 클릭 반응은 생체 내에서 이루어질 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따른 약물 전달 시스템은, 제1 작용기가 결합되고 약물이 로딩된 나노입자 및 상기 제1 작용기와 반응하는 제2 작용기가 결합된 항체를포함한다.
본 발명의 실시예들에 따른 약물 전달 방법은, 생체 내에 제1 작용기를 갖고 약물이 로딩된 나노입자 및 상기 제1 작용기와 반응하는 제2 작용기를 갖는 항체를 투입하는 단계 및 상기 항체와 상기 생체 내에 존재하는 캐리어 세포의 항원 단백질과 결합시키고, 상기 제1 작용기와 상기 제2 작용기의 반응에 의해 상기 나노입자와 상기 항체를 결합시키는 단계를 포함한다.
상기 제1 작용기와 상기 제2 작용기는 클릭 반응에 의해 결합될 수 있다. 상기 제1 작용기는 테트라진을 포함할 수 있고, 상기 제2 작용기는 트랜스-사이클로옥텐을 포함할 수 있다.
상기 나노입자는 그 표면에 배치되는 폴리에틸렌글리콜을 포함할 수 있고, 상기 제1 작용기는 상기 폴리에틸렌글리콜과 결합할 수 있다. 상기 나노입자는 메조포러스 실리카 나노입자를 포함할 수 있다. 상기 항체는 항-CD11b 항체를 포함할 수 있다. 상기 캐리어 세포는 골수 유래 억제 세포를 포함할 수 있다. 상기 항원 단백질은 CD11b를 포함할 수 있다.
상기 나노입자는 상기 캐리어 세포에 의해 생체 내 종양으로 침투할 수 있다.
[실시예]
아민-기능화된 메조포러스 실리카 나노입자(MSN)의 제조예
형광 표지된 메조포러스 실리칸 나노입자(MSN)을 제조하기 위해 먼저 형광 염료-실란 유도체가 형성된다. 상기 형광 염료-실란 유도체는 (3-아미노프로필)트리에톡시실란과 형광 염료를 결합하는 것에 의해 형성될 수 있다. 상기 형광 염료는 로다민 B 이소티오시아네이트, 시아닌 5 NHS 에스테르(Cy5) 및 시아닌 5.5 NHS 에스테르(Cy5.5)를 포함할 수 있다. 각 염료는 15mM의 (3-아미노프로필)트리에톡시실란과 함께 3mM 농도의 에탄올에 용해된다. 이 혼합물을 실온에서 흔든다. MSN은 헥사데실 트리메틸 암모늄 클로라이드(세틸트리메틸암모늄 클로라이드 용액 25%, 8ml) 2g과 트리에탄올아민 80mg을 증류수 20ml에 용해시킨다. 이 혼합물을 95℃에서 1시간 동안 가열한 후 테트라에틸 오소실리케이트 1.5ml를 첨가한다. 이어서, 상기 염료-실란 유도체를 첨가한다. 50분 후, 반응을 멈추고 생성물을 원심 분리에 의해 수집하고 에탄올로 여러 번 재분산시킨다. MSN에서 잔류 계면 활성제를 추출하기 위해 생성된 MSN을 질산 암모늄(메탄올 중 60mg/ml)에서 1시간 동안 교반하고, 동일한 추출 과정을 2회 반복한다. 150μg의 (3-아미노프로필)트리에톡시실란을 첨가하고 80℃에서 3시간 동안 반응시켜 아민 기능화된 MSN을 제조한다. 아민 기능화된 MSN을 20mg/ml의 농도로 에탄올에 분산시킨다.
MSN-Tz의 제조예(MSN을 Tz으로 기능화)
Fmoc-PEG5K-SCM(Fluorenylmethyloxycarbonyl-poly(ethylene oxide) 5K-succinimidyl NHS acid ester) 및 mPEG2K-SCM(methoxy-poly(ethylene oxide) 2K-succinimidyl NHS acid ester)를 준비한다. PEG 유도체를 디메틸포름 아미드(DMF)에 100mg/ml로 용해시킨다. 25℃에서 아민 기능화된 MSN(20mg)의 현탁액에 Fmoc-PEG5K-SCM(5mg)을 첨가하고 6시간 동안 교반하여 MSN을 PEG화시킨다. 이 혼합물에 mPEG2K-SCM을 첨가하고 6시간 동안 교반한다. 상기 혼합물을 원심분리(15000rpm, 20분)에 의해 정제하고 DMF(5ml)에 재분산시킨다. 1ml의 피페리딘을 상기 혼합물에 첨가하고 25℃에서 1시간 동안 교반하여 Fmoc 보호기를 제거한다. 원심분리에 의한 여러 번의 정제 과정 후 상기 혼합물에 methyltetrazine-PEG4-NHS 에스테르(2.2mg)를 25℃에서 3시간 동안 첨가하여 MSN-Tz을 형성한다.
상기 혼합물을 탈이온수로 세척하고 5% 글루코오스 용액에 재분산시킨다. 한 개의 MSN 당 Tz 모이어티의 수를 결정하기 위해, 25℃에서 1시간 동안 MSN-Tz(4mg/ml) 1ml를 Cy5-TCO(1mg/ml) 200μl와 반응시킨다. 원심 분리에 의한 여러 정제 공정 후 나노입자의 흡수는 UV-Vis 흡수 분광학에 의해 특성화된다.
항-CD11b-TCO의 제조예(항-CD11b 항체를 TCO로 기능화)
단클론 항체(항-CD11b)를 0.1M NaHCO3 완충액(pH 8.5)에 최종 농도 2mg/ml로 용해시킨다. 이 용액을 3당량의 형광 숙신이미딜 에스테르와 함께 25℃에서 3시간 동안 항온 유지한다. 항체를 원심 분리 여과로 정제하고 인산 완충 식염수(PBS)에 저장한다. 항체의 농도 및 항체 당 형광 염료의 수는 분광 광도계 분석(spectrophotometric analysis)에 의해 확인된다. 항체와 형광 염료의 비율을 1로 조정한다. 형광 항체에 트랜스-사이클로옥텐(TCO)을 표지하기 위해 항체를 0.1M NaHCO3 완충액에 녹여 4℃에서 13시간 동안 TCO-PEG4-NHS(9당량)와 함께 항온 유지한다. 아민 반응성 TCO-PEG4-NHS를 무수 DMF에 녹여 원액(5mg/ml)을 만든다. 반응 후 PBS로 원심 분리 여과하여 항체를 정제하고 4℃에서 보관한다.
항체 당 TCO 모이어티의 수를 결정하기 위해, 항-CD11b-TCO를 PBS(1mg/ml)로 희석시키고 DMF에 미리 용해시킨 Cy3-Tz(2당량)와 반응시킨다(1mg/ml). 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후, 생성된 항체를 PBS로 원심 분리 여과하여 정제한다. 표지된 항체의 흡수는 UV-Vis 흡수 분광법으로 측정한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 약물 전달 시스템 및 방법을 설명하기 위한 도면이다.
도 1을 참조하면, 골수 유래 억제 세포(myeloid-derived suppressor cells, MDSC)는 T 세포 기능을 억제함으로써 종양 세포를 면역 파괴로부터 보호하기 위해 다양한 종양 유형의 초기 단계에서 전형적으로 빠르게 모집되기 때문에 캐리어 세포로 기능할 수 있다. 또, 골수 유래 억제 세포는 저산소증이 빈발하는 혈관에서 멀리 떨어진 종양 안쪽 깊숙이 침투할 수 있고 종양과 연관된 대식세포(tumour-associated macrophages, TAM)로 분화될 수 있다. 따라서 나노입자가 EPR(enhanced permeability and retention) 효과에 의해 접근하지 못한 종양 내부에 자가조직의 골수 유래 억제 세포가 독소루비신(doxorubicin, DOX)이 로딩된 나노입자를 전달하는 수송체로 사용될 수 있고, 항암제인 독소루비신의 치료 효능이 증가될 수 있다. 나노입자로 장식된 이러한 골수 유래 억제 세포는 인접한 종양 세포에 로딩된 독소루비신을 방출하는 국소 약물 저장소 역할을 할 수 있다.
그러나, 순환 및 종양 미세 환경에서 골수 유래 억제 세포에 나노입자의 생체 내 결합을 달성하기 위해서는 높은 결합 선택성 및 특이성이 요구된다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 클릭 화학(Click chemistry)이 나노입자의 선택성과 특이성을 높이기 위해 표면 기능화에 사용된다. 또, 생물 시스템에서 신속하고 선택적인 고수율 클릭 반응이 사용된다. 생체 적합성 클릭 반응을 위해 아지드-알킨(azide-alkyne), 티올-엔(thiol-ene) 및 디엘스-알더(Diels-Alder)를 포함하는 화학 조합이 사용될 수 있다. 특히 1,2,4,5-테트라진(tetrazine, Tz)과 트랜스-사이클로옥텐(trans-cyclooctene, TCO) 사이의 인버스 디엘스-알더 고리첨가(cycloaddition) 반응은 다른 클릭 반응보다 더 빠르게 진행한다.
생체 내 빠른 무촉매 반응을 위해, Tz/TCO 고리첨가를 이용하여 순환과 종양 미세 환경에서 약물이 로딩된 나노입자의 골수 유래 억제 세포로의 선택적인 표적화를 할 수 있다.
TCO로 기능화된 CD11b 항체(항-CD11b-TCO)의 일차 투여는 Tz-기능화된 메조포러스 실리카 나노입자(MSN-Tz)가 CD11b+ 골수 세포에 결합되도록 한다. 표지된 CD11b+ 세포는 MSN에 로딩된 독소루비신 분자의 영향을 받지 않으며, 체내에서 4T1 암세포에 대한 이동성을 유지한다.
4T1 종양 보유 마우스의 실시간 생존 중 이미징(intravital imaging)은 MSN-Tz로 표적화된 CD11b+ 세포가 매우 운동성이 높고 종양 혈관계에서 이동하는 것을 보여준다. CD11b+ 세포 매개 전달은 MSN-Tz의 균일한 분포와 깊은 종양 침투를 보인다.
종양 내부에서 상기 약물 전달 시스템 및 방법에 따라 전달된 MSN-Tz는 EPR 효과에 의해 전달된 나노입자와 비교하여 2.5mm까지 훨씬 더 깊은 침투력을 보인다. 또한, 독소루비신 전달은 전신성 독성 없이 종양을 급속히 감소시킨다.
골수 유래 억제 세포는 다른 수준의 표면 단백질을 갖는 단핵 (CD11b+ Ly6+ Ly6G-) 또는 다형핵 모폴로지 (CD11b+ Ly6Clow Ly6G+)를 가질 수 있다. 종양에서 골수 유래 억제 세포 표면을 가장 효과적으로 표적화하는 항체를 확인하기 위해 NIR 형광 염료(Alexa Fluor 680)로 항-CD11b 항체, 항-Ly6G 항체 및 항-Ly6C 항체를 기능화하고 4T1 유방 종양을 보유한 마우스에 정맥 주사하였다. 그 중 항-CD11b 항체는 24시간 후에 전체 종양 영역에서 가장 큰 축적을 보였다. 생체 외 면역 조직 화학 염색을 시행한 종양 절편에서 CD11b+ 세포가 종양의 주변과 내부에 균일하게 분포하여 골수 유래 억제 세포 표면의 CD11b 인테그린이 4T1 유방 종양 미세 환경의 좋은 표적임을 알 수 있다.
도 2 및 도 9는 MSN-Tz의 제조 방법과 특성을 설명하기 위한 도면이다.
도 2를 참조하면, 이미징을 위한 형광 염료는 메조포러스 실리카 나노입자(MSN)의 실리카 매트릭스 내에 캡슐화되고 독소루비신은 메조포어 내에 로딩된다. 단핵 식세포 시스템에 의한 나노입자 흡수를 막기 위해, MSN 표면은 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 기능화되고, PEG 말단에 Tz 분자를 결합시켜 TCO-기능화된 항체에 신속하게 접근할 수 있다.
도 3 및 도 4를 참조하면, TEM 이미지는 MSN-Tz가 구형 메조포러스 나노 구조를 가지고 있음을 보여준다. 동적 광산란에 의해 결정된 MSN-Tz의 수 평균 유체역학 직경이 약 66nm로 나타난다. 표면을 장식하는 많은 수의 Tz 분자가 MSN-Tz의 유체역학적 직경을 증가시킬 수 있기 때문에, Tz 기능화 정도는 전체 크기를 100nm 미만으로 유지하도록 최적화된다. 생물학적 매체에서의 MSN-Tz의 콜로이드 안정성은 형광 상관 분광법 (fluorescence correlation spectroscopy, FCS)에 의해 조사된다. 10% 태아 소혈청(fetal bovine serum, FBS) 세포 배지 또는 PBS에서 24시간 배양 한 MSN-Tz는 거의 동일한 FCS 곡선을 나타내어 MSN-Tz의 탁월한 콜로이드 안정성을 보인다. UV-Vis 흡수 분광법에 따르면 TCO 분자가 쉽게 반응할 수 있도록 하는 MSN 표면의 Tz 최적 수는 MSN 입자 당 77개의 분자로 나타난다.
형광 MSN-Tz는 메조포러스 실리카 나노입자의 실리카 매트릭스에 로다민 B 이소티오시아네이트를 캡슐화함으로써 제조될 수 있고, 형광 MSN-Tz는 각각 561nm 및 587nm에서 전형적인 흡수 및 방출 피크를 보인다.
도 5를 참조하면, 독소루비신은 물리적 흡착에 의해 MSN-Tz에 로딩되며, 로딩된 독소루비신은 12시간 동안 천천히 그리고 점차적으로 방출된다.
항-CD11b 항체는 TCO 및 형광 염료(Alexa Fluor 488)로 기능화될 수 있다. 각 항체는 3개의 TCO 기로 기능화될 수 있다. UV-Vis 흡수 분광법은 항-CD11b-TCO가 과량의 Tz-Cy3 분자와 함께 항온처리될 때 Tz와 TCO 사이에서 빠르고 선택적인 클릭 반응이 발생함을 보여준다. 포토루미네선스 분광법(photoluminescence spectroscopy)에 따르면 MSN 내 로다민 B의 방출이 그 표면에 Tz 분자에 의해 부분적으로 ??칭되기(quenched) 때문에 클릭 반응 이전의 MSN-Tz의 방출 강도는 낮다. 항-CD11b-TCO와의 클릭 반응 후, 생성된 환형 알켄은 로다민 B 염료의 방출을 흡수하지 않기 때문에 방출 강도는 1.7배 증가한다.
MSN-Tz와 항-CD11b-TCO 사이의 클릭 반응의 동역학은 이중 색상 형광 교차 상관 분광법(dual color fluorescence cross-correlation spectroscopy, FCCS)을 사용하여 조사하였다. FCCS는 두 개의 스펙트럼적으로 구분되는 형광체 사이의 상호 작용을 민감하게 정량화할 수 있고, 실시간으로 화학 결합이 형성되는 첨가 반응의 동력학을 분석할 수 있다. 혈청 단백질의 존재 하에서 바이오오소고널 반응을 조사하기 위해 형광 MSN-Tz와 항-CD11b-TCO를 실온에서 100% FBS에서 반응시켜 생체 내 조건을 시뮬레이션한 다음 10분마다 FCCS 측정을 수행하였다. 도 6 및 도 7을 참조하면, Tz가 없는 MSN(Tz-omitting MSN) 및 TCO가 없는 항-CD11b(TCO-omitting)과의 대조 반응은 MSN과 anti-CD11b 사이의 특정 반응이 없기 때문에 매우 약한 상호 상관 관계를 보였다. 반대로, MSN-Tz와 항-CD11b-TCO 사이에는 강한 상호 상관 관계가 관찰된다. 항체-MSN 결합(conjugates)은 MSN-Tz(D=1.24μm2s-1)와 유사한 확산 계수(D=1.42μm2s-1)를 나타내어 응집이 발생하지 않았다.
도 8을 참조하면, 클릭 반응 동안 상대적인 상호 상관 진폭은 1시간 이내에 연속적으로 증가하고, 이후 일정하게 유지된다.
도 9를 참조하면, 클릭 반응의 초기 반응 속도는 항-CD11b-TCO가 첨가됨에 따라 증가하였으며, 40분 후에 상대적 상호 상관 진폭은 정체 값에 접근하였고, 이는 40분 내에 클릭 반응이 완료되었음을 나타낸다. 이러한 결과는 CD11b+ 골수 세포 표면에 결합된 항-CD11b-TCO가 바이오오소고널 클릭 반응을 통해 빠르게 MSN-Tz와 결합될 수 있음을 나타낸다.
독소루비신 분자는 정상 세포에 독성을 나타낼 수 있기 때문에 독소루비신이 로딩된 MSN-Tz로 표지된 CD11b+ 골수 세포가 종양 미세 환경에 도달하기 전에 방출될 수 있는 독소루비신 분자로부터 생존하고 보호되는지 여부를 조사하였다. 로(RAW) 264.7 세포를 항-CD11b-TCO로 표지하고 독소루비신이 로딩된 MSN-Tz와 결합시켰다. 도 10을 참조하면, 독소루비신이 로딩된 MSN-Tz는 독소루비신 농도가 2μg/ml인 로(RAW) 세포에 비해 독성을 무시할 수 있다. CD11b+ 골수 세포는 세포 사멸을 일으키지 않고 치료 용량의 독소루비신을 운반할 수 있다.
도 11을 참조하면, 트리판 블루 ??칭(Trypan blue quenching) 실험은 MSN-Tz의 약 80%가 6시간 배양 후에도 세포 표면에 국한된 로(RAW) 세포에 결합함을 보여준다.
체외 트랜스웰 공동 배양 시스템을 사용하여 4T1 종양 세포에서 유래한 화학 유인 물질에 대한 응답으로 MSN-Tz와 결합된 로(RAW) 세포의 이동을 평가하였다. 도 12를 참조하면, 결합된 세포는 변형되지 않은 세포와 유사한 이동 능력을 나타내었는데, 이는 MSN-Tz와의 결합이 세포 이동에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다.
도 13을 참조하면, 4T1 종양 보유 마우스의 내인성 골수 세포에 대하여 공초점 현미경 검사를 수행한 결과, 항-CD11b-TCO 및 MSN-Tz로부터의 형광 신호의 공존이 골수 세포의 표면에서 검출되었다. TCO가 없는 항체 또는 Tz가 없는 MSN을 사용한 대조군 실험에서는 세포 표면의 항체로부터 형광 신호만 나타냈으며 골수 세포에 MSN-Tz의 비특이적 결합을 거의 나타내지 않았다.
MSN-Tz는 혈관에서 최대 40μm의 침투 깊이로 종양간 공간으로 분출된다. 이러한 공초점 및 생체 내 이미징 데이터는 항-CD11b 항체의 사전 표적화(pretargeting) 및 클릭 반응에 의한 MSNs-Tz의 결합이 체외 및 생체 내에서 순환 CD11b+ 세포를 선택적으로 표적화할 수 있다는 것을 보여준다. 또한, MSN-Tz는 EPR 효과 및 표지된 CD11b+ 세포를 통해 종양 부위로 전달될 수 있다.
도 14 내지 도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 약물 전달 방법을 이용하여 생체 내에서 4T1 종양으로 MSN-Tz의 전달을 설명하기 위한 도면이다. CD11b+ 골수 세포가 생체 내에서 독소루비신이 로딩된 MSN-Tz를 종양으로 옮길 수 있는지 여부를 시험하였고, NIR 범위에서보다 민감한 생체 내 형광 이미징을 위해 항-CD11b-TCO 및 MSN-Tz를 각각 형광 염료(Alexa Fluor 750 및 Cy5)로 기능화하였다.
유방 패드에 4T1 종양을 갖는 마우스의 꼬리 정맥을 통해 (1) PBS/MSN-Tz(비표적화된 대조 그룹), (2) TCO::Tz 복합체(사전 결합된(preconjugated) 대조 그룹), (3) αCD11b/MSN-Tz(TCO가 제외된 대조 그룹), 및 (4) αCD11b-TCO/MSN-Tz(실시예 그룹)을 주입하였다.
도 14 및 도 15를 참조하면, 주입 후 항-CD11b-TCO 및 MSN-Tz의 생체 내 분포를 시간-게이팅 형광 이미징에 의해 모니터링한 결과에 따르면, 항-CD11b 및 항-CD11b-TCO에 대한 생체 분포 연구는 24 시간 후에 종양, 비장 및 간에서 유사한 축적을 나타내며, TCO 기능화가 항체의 표적화 능력에 영향을 미치지 않는다.
도 16을 참조하면, 실시예 그룹의 MSN-Tz는 사전 결합된 대조 그룹과 TCO가 제외된 대조 그룹보다 더 높은 수준에서 종양에 축적되고, 비표적화된 대조 그룹과 비슷한 종양 내 축적을 보였다. 그러나, 비표적화된 대조 그룹에서 EPR 효과에 의해 전달된 대부분의 MSN-Tz는 종양 주변부에 위치하는데, 이는 종양 혈관이 내부 영역보다 종양-숙주 계면에서 풍부하기 때문이다.
실시예 그룹의 경우 클릭 화학을 통한 항-CD11b 항체와 MSN-Tz 간의 향상된 결합으로 인해 부작용이 감소될 수 있다. 표지된 항-CD11b 항체 스캐폴드는 이후의 클릭 화학 반응에 대해 평균 3개의 고정 부위를 가지고 있기 때문에 하나의 항체에 여러 MSN-Tz를 부착하여 종양에서 나노입자의 적재량을 증폭시킬 수 있다.
도 17을 참조하면, 종양 절편에서 얻은 생체 내 형광 현미경 이미지는 실시예 그룹의 MSN-Tz가 항-CD11b-TCO와 공존하는 것을 보여주지만 TCO 제외 대조 그룹에서는 공존이 관찰되지 않는다.
도 18 및 도 19를 참조하면, MSN-Tz의 종양 침투 및 분포를 평가하기 위해 24시간 후에 종양을 절제하고 체외 조직학적 표본에 대해 축적 프로파일 분석을 수행하였다. 대표적인 종양 절편에서 실시예 그룹의 MSN-Tz는 비표적화된 대조 그룹보다 더 균일한 분포와 더 깊은 침투를 보였다. 실시예 그룹에서는 전달된 MSN-Tz가 종양의 말초 및 내부 영역 모두에서 발견되지만, 비표적화된 대조 그룹에서는 전달된 MSN-Tz가 주로 종양 말초에 국한된다.
도 20을 참조하면, 실시예 그룹은 종양 표면에서 중심 영역까지의 형광 강도가 나타난다. 비표적화된 대조 그룹의 경우, 전체 형광 강도의 약 55%가 종양 표면과 종양 표면으로부터 1mm 사이에서 검출된다. 종양 표면에서 2mm와 3mm 사이에서 14%만 관찰되는데, 이는 종양 주변으로 침투가 제한된다는 것을 의미한다. 대조적으로, 실시예 그룹의 경우 전체 형광 강도의 약 35%가 종양 표면으로부터 2mm와 3mm 사이에서 관찰된다. 종양의 직경이 거의 5mm인 것을 고려할 때, 실시예 그룹에서 전달된 MSN-Tz는 종양 표면에서 약 2.5mm까지 종양 내부로 침투할 수 있다. 종양 내부 영역에서, 실시예 그룹이 비표적화된 대조 그룹보다 약 5배 높은 형광 강도를 나타낸다. 실시예 그룹에서 MSN-Tz의 종양 심부 침투는 저산소 종양 세포가 CD11b+ 골수 양 세포를 모집하기 위해 라이신 산화 효소를 분비하는 종양 내부로의 표지화된 CD11b+ 세포의 침투에 기인할 수 있다. 이러한 깊은 침투는 본 발명의 실시예에 따른 약물 전달 방법이 종래의 방법으로 전달할 수 없는 저산소 영역으로 약물을 전달할 수 있음을 의미한다.
도 21을 참조하면, 3차원 공초점 이미지에서 MSN-Tz가 균등하게 분산되어 있는데 이는 침투 동안 MSN-Tz 변위가 발생하지 않았음을 나타낸다.
도 22 내지 도 25는 본 발명의 일 실시예에 따른 약물 전달 방법에 의해 개선된 MSN-Tz의 치료 효능을 설명하기 위한 도면이다. 4T1 종양을 보유한 마우스를 (1) PBS, (2) 독소루비신(free drug), (3) 독소루비신이 로딩되지 않은 MSN-Tz/항 CD11b-TCO, (4) 독소루비신이 로딩된 비표적화된 MSN-Tz(PBS/MSN-Tz(DOX)), (5) 독소루비신이 로딩된 MSN-Tz(DOX)/항-CD11b-TCO로 각각 치료하였다.
도 22 및 도 23을 참조하면, 네 그룹의 독소루비신 양은 5mg/kg으로 동일하고, 모든 마우스는 3일에 한 번 총 4회의 치료를 받았다. 독소루비신이 로딩되지 않은 MSN-Tz/항 CD11b-TCO로 치료한 마우스도 종양 진행에 영향을 미치지 않았다. EPR 효력에 의해 주로 전달되는 독소루비신이 로딩된 비표적화된 MSN-Tz는 제한된 침투로 종양 주변에 이질적으로 분포하기 때문에 치료 동안 종양 성장을 억제하지 못했다. 대조적으로, 독소루비신이 로딩된 MSN-Tz(DOX)/항-CD11b-TCO로 치료하면 종양이 약 2배 감소하였다. 이러한 결과는 본 발명의 실시예들에 따른 약물 전달 방법이 독소루비신의 치료 효능을 향상시킨다는 것을 나타낸다. 약물 운반체 역할을 하는 CD11b+ 세포는 종양 내부 깊숙이 독소루비신 분자를 전달하여 수많은 종양 세포를 독소루비신 분자에 노출시킨다.
도 24 및 도 25를 참조하면, 본 발명의 실시예들에 따른 약물 전달 방법(CRAIT)은 생체 내 독성을 나타내지 않는다. PBS 또는 CRAIT 프로브(항-CD11b-TCO 및 MSN-Tz)를 주사한 건강한 마우스는 주요 기관 중 어느 곳에서도 염증 부위 또는 독성 손상을 보이지 않았다. 또, 간 및 신장 독성을 나타내는 혈청 측정치는 건강한 동물의 범위 내로 떨어지며, 모든 시점에서 독성의 결핍을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 실시예들에 따른 약물 전달 방법은 독성 부작용 없이 독소루비신의 효능을 향상시킨다.
이제까지 본 발명에 대한 구체적인 실시예들을 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (13)

  1. 제1 작용기가 결합되고 약물이 로딩된 나노입자; 및
    상기 제1 작용기와 반응하는 제2 작용기가 결합된 항체를 포함하고,
    상기 항체는 항원 단백질을 포함하는 캐리어 세포와 결합하고,
    상기 캐리어 세포는 골수 유래 억제 세포를 포함하며,
    상기 제1 작용기와 상기 제2 작용기는 생체 내에서 클릭 반응에 의해 결합되는 것을 특징으로 하는 약물 전달 시스템.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 클릭 반응에 의한 결합 전에 상기 나노입자는 상기 제1 작용기로 표면 기능화되고, 상기 항체는 상기 제2 작용기로 표면 기능화되는 것을 특징으로 하는 약물 전달 시스템.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 항원 단백질은 CD11b를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 전달 시스템.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 나노입자는 상기 캐리어 세포에 의해 생체 내 종양으로 침투하는 것을 특징으로 하는 약물 전달 시스템.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 나노입자는 그 표면에 배치되는 폴리에틸렌글리콜을 포함하고,
    상기 제1 작용기는 상기 폴리에틸렌글리콜과 결합하는 것을 특징으로 하는 약물 전달 시스템.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 나노입자는 메조포러스 실리카 나노입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 전달 시스템.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 제1 작용기는 테트라진을 포함하고,
    상기 제2 작용기는 트랜스-사이클로옥텐을 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 전달 시스템.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
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