KR102263849B1

KR102263849B1 - 세포 부착 및 생장용 기판 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR102263849B1
Application number: KR1020190054616A
Authority: KR
Inventors: 이정헌; 최재영; 이진웅; 채수동; 오승배; 김시현
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2019-05-10
Filing date: 2019-05-10
Publication date: 2021-06-10
Also published as: KR20200129747A

Abstract

본 발명은 세포 부착 및 생장용 기판 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 일차원 물질이 코팅된 세포 부착 및 생장용 기판, 세포 담체, 그리고 이의 제조 방법에 관한 것이다.
일차원 물질의 크기와 물리, 화학적 특성이 세포외기질을 구성하는 생체분자들과 유사하여 일차원 물질이 존재하는 경우 세포의 부착능(adhesion)과 생존율(viability), 증식능(proliferation)에 영향을 준다.
일차원 물질을 다른 소재나 세포 담체의 표면에 손쉽게 코팅하여 사용이 가능하고, 또한 다른 물질과 섞어 세포 성장에 영향을 줄 수 있는 소재나 세포 담체로 제작이 가능하다.

Description

세포 부착 및 생장용 기판 및 이의 제조 방법 {SUBSTRATE FOR CELL ADHESION AND PROLIFERATION, AND METHOD OF FABRICATING THEREOF}

본 발명은 세포 부착 및 생장용 기판 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 일차원 물질로서 무기 SCAC가 이용되고, 특히 Mo₃Se₃ ^-, Mo_xS₆ _-xI_x, Nb₂Se₉ 중 어느 하나가 코팅된 세포 부착 및 생장용 기판, 세포 담체, 그리고 이의 제조 방법에 관한 것이다.

세포의 부착능(adhesion)과 생존율(viability), 증식능(proliferation)을 향상시키기 위해서는 세포외기질을 구성하는 분자들과 유사한 물리, 화학, 생물학적 특성을 갖는 소재가 필요하지만 지금까지 적합한 소재가 존재하지 않았다.

기존에 nanowire(carbon nanotubes (CNTs), gold nanowires, silicon nanowires, several metal oxide nanowires) 등과 같은 일차원 나노 소재가 일부 시도되어져 왔지만 소재의 크기, 표면 전하, 기계적 특성 등 많은 물성이 세포외기질을 구성하는 분자들과 다르고 많은 경우 독성이 있어 적합하지 않은 문제점이 있었다.

이러한 이유로 기존에 상용화된 세포 부착 방법은 양의 전하를 갖는 Poly-lysine을 기판 표면에 처리하는 것에 그치고 있는 실정이다. 하지만 이는 실제 세포가 Extracellular matrix(세포외기질)에 부착하는 메커니즘과 다르기 때문에 세포의 부착능(adhesion)과 생존율(viability), 증식능(proliferation)이 실제 세포외기질에 적용하는 경우에 비하여 떨어지는 문제점을 갖고 있다.

Bin Su et al., The art of aligning one-dimensional~, Chem. Soc. Rev., pp.7832-7856(2012.) 1부. Mark Allen et al, Metallic LiMo3Se3 Nanowire Film~, Langmuir, Vol24, pp7031-7037(2008) 1부.

실제 세포외기질을 구성하는 생체 분자와 유사한 크기와 물리, 화학적 특성을 갖는 일차원 물질 및 이의 번들이 적용된 소재를 활용하여 세포의 부착능(adhesion)과 생존율(viability), 증식능(proliferation)에 영향을 끼치는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 세포 부착 및 생장용 기판은, 일차원 물질이 코팅되어 있고, 상기 일차원 물질은 무기 SCAC(Single Chain Atomic Crystals)이다.

상기 일차원 물질은 스캐폴드 필름(scaffold film)을 이루고 있다.

상기 일차원 물질은 고분자 물질과 혼합되어 사용될 수 있다. 상기 고분자 물질은 PLA(poly latic acid), PC(poly carbonate), PCL(poly caprolactone), PP(poly propylene), PE(poly ethylene), 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 알지네이트(alginate) 중 어느 하나 이상을 포함한다.

상기 일차원 물질은 번들(bundle)로 사용될 수 있다.

기판은 유리(glass)일 수 있다.

상기 일차원 물질은 Mo₃Se₃ ^-, Mo_xS₆ _- _xI_x, Nb₂Se₉ 중 어느 하나이다.

본 발명의 일 실시예에 따른 세포 담체는, 일차원 물질이 코팅되어 있고, 상기 일차원 물질은 무기 SCAC(Single Chain Atomic Crystals)이다.

상기 일차원 물질은 스캐폴드 필름을 이루고 있다.

상기 일차원 물질은 번들(bundle)로 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 세포 부착 및 생장용 기판의 제조 방법은, InMo₃Se₃와 LiI의 이온 교환법을 이용하여 LiMo₃Se₃를 합성하는 단계; 상기 LiMo₃Se₃는 물에 풀어 Mo₃Se₃ ^-로 존재하는 단계; 기판을 준비하고 세척하는 단계; 및 Mo₃Se₃ ^-를 알코올과 섞은 후 기판 상에 코팅하는 단계를 포함한다.

상기 코팅은 스프레이 코팅에 의해 진행된다.

상기 코팅에 의해 스캐폴드 필름이 형성된다.

일차원 물질의 크기와 물리, 화학적 특성이 세포외기질을 구성하는 생체분자들과 유사하여 일차원 물질이 존재하는 경우 세포의 부착능(adhesion)과 생존율(viability), 증식능(proliferation)에 영향을 준다.

일차원 물질을 다른 소재나 세포 담체의 표면에 손쉽게 코팅하여 사용이 가능하고, 또한 다른 물질과 섞어 세포 성장에 영향을 줄 수 있는 소재나 세포 담체로 제작이 가능하다.

일차원 물질을 그 자체로 활용하거나 2D film, 2D patterning, 3D printing 등을 통하여 세포의 성장에 영향을 줄 수 있는 소재로 활용이 가능하다.

생물학적 촉매 효과를 갖거나 세포의 활성을 높일 수 있는 원소로 이루어진 일차원 물질의 경우 세포의 생장에 영향을 끼칠 수 있음을 확인하였다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 부착 및 생장용 기판의 제조 방법을 도시한다.
도 2는 본 발명의 일 실시예의 모식도를 도시한다.
도 3은 Bulk LiMo₃Se₃의 합성이 성공적으로 이루어짐을 보여주며, 이를 D.I. water 에 풀어 Mo₃Se₃ ^-로 얻어낼 수 있었음을 증명하는 도이다.
도 4는 D.I. water에 박리된 Mo₃Se₃ ^- SCAC의 Zeta potential을 도시한다.
도 5는 기본적인 세포수 측정법인 MTT assay를 통해 세포수를 정량한 결과값을 도시한다.
도 6은 실험에 사용된 Li+의 농도와 세포에 미치는 영향을 비교한 표를 도시한다.
도 7은 미토콘드리아 막전위 분석 결과를 도시한다.
도 8은 L-929 세포와 MC3T3-E1 세포의 대표적인 SEM 이미지와 confocal 이미지를 도시한다.
도 9는 형성된 vinculin 양을 pixel 계산을 통해 정량한 데이터이다.
도 10은 (a) L-929 세포와 (b) MC3T3-E1 세포의 Live/Dead 형광 이미지를 도시한다.
도 11은 (a) L-929 세포와 (b) MC3T3-E1 세포의 Live/Dead 형광 이미지를 도시한다.
도 12는 제작된 Mo₆S₃I₆ 의 SEM 이미지를 도시한다.
도 13은 Mo₆S₃I₆의 물 분해 실험 결과를 도시한다.
도 14는 Mo₆S₃I₆의 세포 독성 실험 결과를 도시한다.
도 15는 Mo₆S₃I₆의 기판 독성 실험 결과를 도시한다.
도 16은 제작된 Nb₂Se₉의 SEM 이미지를 도시한다.
도 17은 Nb₂Se₉의 물 분해 실험 결과를 도시한다.
도 18은 Nb₂Se₉의 기판 독성 실험 결과를 도시한다.
다양한 실시예들이 이제 도면을 참조하여 설명되며, 전체 도면에서 걸쳐 유사한 도면번호는 유사한 엘리먼트를 나타내기 위해서 사용된다. 설명을 위해 본 명세서에서, 다양한 설명들이 본 발명의 이해를 제공하기 위해서 제시된다. 그러나 이러한 실시예들은 이러한 특정 설명 없이도 실행될 수 있음이 명백하다. 다른 예들에서, 공지된 구조 및 장치들은 실시예들의 설명을 용이하게 하기 위해서 블록 다이아그램 형태로 제시된다.

이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 대해 상세히 설명한다. 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로서 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 세포 부착 및 생장용 기판은, 일차원 물질이 코팅되어 있고, 상기 일차원 물질은 Mo₃Se₃ ^-, Mo_xS_6-xI_x, Nb₂Se₉ 중 어느 하나이다. 이러한 일차원 물질은 스캐폴드 필름(scaffold film)을 이루고 있을 수 있다.

일차원 물질은 무기 SCAC(Single Chain Atomic Crystals)이다. 이러한 일차원 물질은 세포외기질과 직경이 유사하여 세포외기질을 대신하여 실제 세포가 성장하는 환경과 유사한 환경을 제공할 수 있다. 세포외기질 (Extracellular matrix, ECM)은 조직을 구성하고 있으며, 세포가 생장하는 환경과 양분, 성장요소를 제공하고, 세포는 ECM에 둘러쌓여 증식 및 분화를 한다. 이렇게 다양한 ECM의 구성 및 요소들 중 공통적으로는 아래 표 1에서 보여준 바와 같이 Collagen, Laminin, Elastin, Vitronectin, Glycosaminiglycans (GAGs)로 이루어져 있다는 점을 들 수 있으며, 이들의 직경은 본 발명의 일차원 물질인 SCAC와 그 직경이 유사하다. 본 발명의 일차원 물질인 SCAC는 직경이 10nm 이하, 바람직하게는 9nm 이하, 8nm 이하, 7nm 이하, 6nm 이하, 5nm 이하, 4nm 이하, 3nm 이하, 2nm 이하, 1nm 이하일 수 있으며, 종횡비는 거의 무한대에 가까운 특징을 갖는다.

ECM 구성요소	직경
Collagen molecule	1.5nm
Laminin	2nm
Elastin	7nm
Vitronectin	6nm
Glycosaminiglycans	0.7nm
SCAC	0.6nm

한편, 일차원 물질은 그 자체로 단독으로 사용될 수 있고, 번들(bundle) 형태로 사용될 수도 있으며, 또는 일차원 물질은 고분자 물질과 혼합되어 사용될 수도 있다. 이 경우, 고분자 물질은 PLA(poly latic acid), PC(poly carbonate), PCL(poly caprolactone), PP(poly propylene), PE(poly ethylene), 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 알지네이트(alginate) 중 어느 하나 이상이 이용될 수 있다.

기판은 글라스 기판과 같은 유리 기판이 이용될 수 있으나, 이에 반드시 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 일차원 물질은 세포 담체에 코팅이 되어 이용될 수도 있다.

도 2는 본 발명의 일 실시예의 모식도를 도시한다. 도 2에서 (a)는 Mo₃Se₃ ^- SCAC로 이루어져 있는 LiMo₃Se₃ 나노막대의 결정구조; (b) D.I. water에 분산된 SCAC의 결정 구조; (c, d) 유리 위에 코팅된 Mo₃Se₃ ^- SCAC와 세포의 부착이 향상된 그림을 도시한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 세포 부착 및 생장용 기판의 제조 방법은, 도 1에서 도시되어 있다.

도 1에서 보는 것처럼, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 부착 및 생장용 기판의 제조 방법은, InMo₃Se₃와 LiI의 이온 교환법을 이용하여 LiMo₃Se₃를 합성하는 단계(S 110); 상기 LiMo₃Se₃는 물에 풀어 Mo₃Se₃ ^-로 존재하는 단계(S 120); 기판을 준비하고 세척하는 단계(S 130); 및 Mo₃Se₃ ^-를 알코올과 섞은 후 기판 상에 코팅하는 단계(S 140)를 포함한다.

이 경우 상기 코팅은 스프레이 코팅에 의해 진행될 수 있으며, 상기 코팅에 의해 스캐폴드 필름이 형성된다.

이하에서는 구체적인 실시예와 함께 본 발명의 내용을 추가적으로 설명하도록 하겠다.

* SCAC(Single Chain Atomic Crystals)의 합성

LiMo₃Se₃는 InMo₃Se₃와 LiI의 이온 교환법을 이용해서 제작하였다. 시작물질인 InMo₃Se₃는 In 덩어리와 Mo 파우더, Se 파우더를 이용한 solid-state reaction을 통해 제작하였다. 세 물질을 화학양론 비로 섞고 펠렛화하고, 제작한 펠렛은 진공 쿼츠 튜브에 넣고 밀봉하였다. 직후, 상자로(box furnace)에 넣고 1050℃, 48 h 반응하였고, 이때 100℃/h을 사용하였다. LiMo₃Se₃로 치환하기 위해, 완성된 InMo₃Se₃와 LiI을 아르곤 글로브 박스 내에서 1:1 비율로 화학양론비로 섞어 펠렛화하였다. 펠렛은 30cm 진공 쿼츠 튜브에 넣고 밀봉하였다. 쿼츠 튜브의 한쪽만을 370℃로 가열(3℃/h)한 후 96 h 유지하였다. 온도가 높은 부분에서는 In과 Li의 치환 반응을 하여 LiMo₃Se₃를 이루게 되고, 온도가 낮은 부분으로 In이 이동하게 되었고, LiMo₃Se₃는 물에 풀려 Mo₃Se₃ ^-로 존재하게 되었다.

도 3은 Bulk LiMo₃Se₃의 합성이 성공적으로 이루어짐을 보여주며, 이를 D.I. water 에 풀어 Mo₃Se₃ ^-로 얻어낼 수 있었음을 증명하는 도이다. 도 3에서 (a) LiMo₃Se₃ 나노 막대의 SEM 이미지, (b) LiMo₃Se₃ 나노 막대의 XRD 패턴, (c) 박리된 Mo₃Se₃ ^-　SCAC의 TEM 이미지, (d) Mica에 코팅된 Mo₃Se₃ ^- SCAC의 AFM 이미지를 각각 도시한다.

도 4는 D.I. water에 박리된 Mo₃Se₃ ^- SCAC의 Zeta potential을 도시한다. 표면전하가 음의 값을 가지며 매우 낮은 -63.6mV를 나타냄을 확인할 수 있었다.

* 스캐폴드 필름(Scaffold film)의 준비

SCAC를 film 형태로 만들어, 그 위에 세포를 키우기 위한 과정으로서, 이를 위해 유리 기판 위에 에어브러쉬를 이용하여 SCAC를 균일하게 deposition 하였다.

먼저 슬라이드 글라스를 메탄올, 에탄올, D.I. water로 워싱하고, 이어서 UV ozone으로 30분간 처리하여 클리닝하여 준비하였다. Mo₃Se₃ ^-를 D.I. water에 1 mg/mL로 준비하여, 에탄올과 섞는다. (물:에탄올=3:7) 준비한 용액을 준비한 슬라이드 글라스에 스프레이 코팅을 진행하였다. 스프레이 코팅은 에어브러쉬를 이용하며, 코팅 대상인 슬라이드 글라스는 160℃로 유지하여 코팅하였다. 50회 반복하여 코팅을 진행함으로써 scaffold film을 빈틈없이 만들었다.

* Poly-lysine이 코팅된 기판의 준비

Poly-L-lysine (Sigma-Aldrich) in H₂O 0.1% (w/v)를 이용하여 코팅을 진행하였다. 500μL의 Poly-lysine 용액을 이용하여, UV-ozone 처리된 슬라이드 글라스 위에 도포하였고, 1일간 암실에서 건조하였다.

* 분석

SEM (JEOL 7600F)과 XRD (Bruker, D8 ADVANCE)를 이용하여 LiMo₃Se₃ nanorod의 형태 및 결정 분석을 진행하였다. 나노 단위로 박리된 Mo₃Se₃ ^-는 TEM (JEOL, JEM2100F)과 AFM (Park systems, NX10)를 이용하였다. Zetasizer Nano-ZS90 (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, U.K.)를 이용하여 ζ potential을 측정하였고, High-resolution TEM (HR-TEM)은 80 kV조건으로 graphene-coated 그리드 위의 Mo₃Se₃ ^-를 분석하였다. AFM은 noncontact 모드를 이용하여 분석을 진행하였고, 샘플은 SiO₂/Si 웨이퍼 위에 Mo₃Se₃ ^-를 샘플링하여 사용하였다. Mo₃Se₃ ^-의 stability 실험은 ICP-OES를 통해 진행하였으며, 이를 위하여 LiMo₃Se₃를 0.05mg/mL로 PBS buffer, 37℃에서 4, 8, 12, 16일 동안 분산한 후 상등액을 샘플링하여 분석을 진행하였다.

* 세포주

L-929와 MC3T3-E1 cell 은 Korean Cell Line Bank (KCLB, Seoul, Republic of Korea)에서 구입하였고, L-929는 10% fetal bovine serum (JCBIO)와 1% penicillinstreptomycin (PAN biotech)를 첨가한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, PAN biotech)을 사용하여 배양하였다. MC3T3-E1은 10% fetal bovine serum (JCBIO)와 1% penicillin-streptomycin (PAN biotech)를 첨가한 α-minimum essential medium (α-MEM, Welgene)을 사용하여 배양하였으며, 배양 조건은 37℃, standard atmosphere (95% air 와 5% CO₂)이다. 그리고 배양액은 매 2일마다 교체해주며, 세대주 분리를 함께 진행하였다. 세대주 분리 시 세포는 9x10³개 세포를 75 cm² 세포 배양 플라스크 (SPL Life Science)를 이용하였으며, 실험에 사용하기 전 최소 3회의 세대주 분리를 진행하는 안정화 기간을 주었다.

도 5는 기본적인 세포수 측정법인 MTT assay를 통해 세포수를 정량한 결과값을 도시한다. SCAC를 세포 위에 일정 량 뿌려줬을 시, 그렇지 않은 세포보다 잘 자랐음을 보여준다. 1일, 2일이 지날수록 세포는 대조군에 비해 잘 자라는 것을 보여주고 있다. 이때 사용한 세포는 섬유아세포(L-929)와 골아세포(MC3T3-E1)이다.

* 세포 독성 평가

평가에 앞서, 96 well plate (SPL life Science)에 well 당 5x10³ 개의 세포를 24 시간 전 seeding 해 놓았다. 평가에 사용하기 위한 Mo₃Se₃ ^-를 D.I. water에 8 mg/mL로 풀어 준비하였다. Mo₃Se₃ ^-를 2X PBS (Gibco) 와 1:1 부피비로 섞어 준비한 후, 최종 농도가 25, 50, 75, 100, 150, 200 μg/mL이 되도록 계산하여 세포 배양액과 섞었다(Mo₃Se₃ ^- 용액 : 배양액 = 1 : 19). 준비되어있던 96 well plate에 Mo₃Se₃ ^-포함한 세포 배양액으로 교체해준 후 24, 48 시간이 지난 후 세포 독성 평가를 확인하였다. 세포 독성 평가는 thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT, Sigma-Aldrich)를 이용하였다. D.I. water에 5 mg/mL로 녹여 준비한 후 syringe filter 0.45 μm를 사용하여 정제하였다. MTT 용액을 혈청을 넣지 않은 배양액에 1:9 부피비로 섞어 준비하였다. 이때, 최종 MTT는 0.5 mg/mL이 됨. 이를 이용하여 평가 시간에 맞춰, 평가하고자하는 실험군의 배양액을 교체해 주었고, 4시간 동안 세포 배양기에서 대기한 실험군은 DMSO 용액을 이용하여 세포와 formazan을 녹여내었다. 녹여낸 formazan은 spectrophotometer (Varioskan LUX)를 이용하여 정량 측정하였다(570 nm의 흡광도를 정량 측정).

도 6은 실험에 사용된 Li+의 농도와 세포에 미치는 영향을 비교한 표를 도시한다. 실험에 사용된 LiMo₃Se₃가 물에 녹을 시 Li+를 내놓게 되는데, 이것이 세포에 영향을 주지 않는다는 것을 증명하였다. 즉, 세포에는 SCAC만 영향을 준 것으로 볼 수 있었다.

* 미토콘드리아 막전위 측정

MTT assay에서, 미토콘드리아의 활성도가 높게 측정됨에 따라, 미토콘드리아가 손상을 입었는지를 측정하였다. 인위적으로 세포 사멸을 유도한 변수와, 그렇지 않은 변수를 기점으로, SCAC를 처리한 세포의 손상값을 측정하였으며, 측정 결과 손상이 유의수준 이상으로 손상없음을 확인하였다.

Mitochondrial membrane potential kit JC-10 assay for microplate readers (Sigma-Aldrich)를 사용하여 측정하였다. 먼저 2X10⁴ 개의 세포를 96 well black plate (SPL life science)에 seeding 하여 1일간 배양하였다. Mo₃Se₃ ^-를 혈청을 넣지 않은 배양액에 앞선 방법으로 동일하게 준비하였다. 1일이 지난 후 JC-10 dye-loading solution 50 μL를 30분간 처리하였다. 추가적으로, negative control (vehicle only) 변수와, positive control (carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone, 98% (CCCP, Alfa Aesar))를 같이 준비하여 처리하였다. 알맞은 세포 사멸 변수인 positive control을 유도하기 위해, 10 μM CCCP를 30분간 해당 변수에 처리하였으며, 이어서 50 μL of the assay buffer B를 세포에 추가하였다. 붉은색(λex = 540/λem = 590 nm)과 녹색(λex = 490/λem = 525 nm)의 형광 비율을 측정함으로써 ΔΨm를 계산하였다.

도 7은 미토콘드리아 막전위 분석 결과를 도시한다. 세포 수가 늘어났지만, 미토콘드리아에는 큰 영향이 없었음을 증명하는 데이터이며, 세포사멸 변수(CCCP)에 비해 유의미하게 차이나는 값을 보여줌으로써 SCAC가 세포에 스트레스를 유의미하게 가하지 않았음을 확인하였다.

* 세포 고정과 항체 염색법, SEM과 Confocal 이미징

세포의 형태를 확인하기 위해 SEM을 이용하기 전, 세포를 e-beam에 견딜 수 있도록 물질화하는 과정을 설명한다. Fixative 용액을 이용하는 방법이고, Confocal 이미징은 세포막에 존재하는 vinculin을 보여주는 방법을 채택하였다. Vinculin은 세포와 scaffold film 간의 상호작용이 일어난다는 것을 보여주며, 이를 위해 vinculin 단일 항체-형광염색을 진행하였다.

세포의 형태를 확인하기 위해 슬라이드 글라스와 Mo₃Se₃ ^-가 코팅된 유리를 two-chamber cell culture slide (SPL life science)를 이용하여 준비하였다. 7x10⁴ 개의 세포를 6시간 동안 배양한 조건을 사용하였다. 세포 고정을 위해 paraformaldehyde (Sigma-Aldrich)를 PBS에 녹여 4% 용액으로 제작하여 준비하였으며, 해당 용액을 처리한 세포를 8시간 동안 4℃로 유지하여 세포 고정을 하였다. 수분을 제거하기 위해 50, 60, 70, 80, 90, 95 % 에탄올을 각 10분간 처리하였다. SEM 측정 전까지 건조기에서 샘플을 보관하여 여분의 수분을 완전히 제거하였다. 항체 염색법은 actin cytoskeleton/focal adhesion staining kit (FAK100, EMD Millipore)를 사용하였다. 세포 배양 조건은 상기 SEM 이미지를 얻기 위한 조건과 동일하게 하였다. 해당 세포를 먼저 PBS 용액에 준비된 4% paraformaldehyde 용액을 세포에 15분간 처리하고, 고정된 세포는 wash buffer (0.05% TWEEN 20 in PBS)를 이용하여 2회 세척하였다. 그리고 투과성 용액 (0.1% Triton X-100 in PBS)을 준비하여 5분간 처리하고, 그 후 PBS 용액으로 2회 세척한 후 blocking solution (1% BSA in PBS)을 30분간 처리하였다. 이어서, 1 μL의 vinculin monoclonal antibody와 99 μL의 blocking solution을 섞은 용액으로 교체해주고 1시간 동안 유지하였다. 그 후 wash buffer에 5분간 담구어 세척하는 것을 3회 반복한 후 10 μL의 secondary antibody (goat antimouse IgG, (H+L) FITC conjugated, EMD Millipore)와 2.5 μL의 TRITC-conjugated phalloidin (0.06 μg/μL)을 87.5 μL의 PBS에 넣고, 이 용액을 샘플에 1시간동안 처리하였다. 그 후 wash buffer를 이용하여 5분간 세척하기를 3회 반복하였다. 그 후 샘플을 1 μL의 DAPI와 99 μL의 PBS를 섞은 용액에 5분간 담궈놓고, wash buffer로 5분간 세척하기를 3회 반복하였다. 마지막으로 PBS를 몇 방울 이용하여 coverslip으로 덮음. Confocal laser scanning microscope (FV3000, Olympus)을 이용하여 actin filament와 focal adhesion을 측정하였다.

도 8은 L-929 세포와 MC3T3-E1 세포의 대표적인 SEM 이미지와 confocal 이미지를 도시한다. Confocal 이미지는 항체 염색법을 통해 actin filament와 focal adhesion, nuldeus의 형광 이미지를 얻었다. 슬라이드 글라스 위에 세포를 배양한 것과 scaffold film 위에서 세포를 배양한 것의 비교를 진행하였다. Mo₃Se₃ ^- SCAC Scaffold film과 세포의 6시간 interaction을 보여주고 있다. SEM을 통해 세포 크기가 유리판에 비해, scaffold film위에서 크기가 매우 커짐을 보여준다. Confocal 이미지를 통해, vinculin이라는 세포막에 존재하는 부착 단백질이 유리판에 비해 유의미한 양으로 형성됨을 보여주며, 세포가 scaffold film위에서 부착능이 좋아진 후, 잘 자람을 증명하였다.

도 9는 형성된 vinculin 양을 pixel 계산을 통해 정량한 데이터이다. 서로 다른 6개 세포에서 pixel 값을 불러와 비교하였다. Confocal 이미지에서 RGB 값을 추출하는 방법을 사용하였으며, 6개의 세포 이미지를 이용하였으며, 이미지는 동일한 노광도(60 μs)에서 얻었다.

* Live/Dead Assay와 형광 이미징

슬라이드 글라스와 Mo₃Se₃ ^-를 코팅한 글라스를 two-chamber cell culture slide를 이용하여 세포를 배양하였다. 세포는 7X10⁴개를 seeding 하여 24, 48 시간 후 측정함. LIVE/DEAD viability / cytotoxicity kit for mammalian cells (Thermo Fisher)을 이용하였다. 20 μL의 EthD-1 용액을 10 mL의 PBS 용액과 잘 섞은 다음, 5 μL의 calcein AM을 넣고 다시 잘 섞어 준비하고, 세포 배양액을 샘플로부터 제거한 후 PBS로 2회 세척하였다. 그리고 준비한 형광 염색용 용액을 처리하고 암실에서 30분간 유지하였다. Inverted microscope (X71, Olympus)을 이용하여 생존한 세포와 죽은 세포를 측정하였다. 녹색 형광 (calcein, λex/λem = ∼494/517 nm)를 이용하여 생존한 세포를 측정하며, 적색 형광 (ethidium homodimer-1, λex/λem = ∼528/617 nm)을 이용하여 죽은 세포를 측정하였다.

살아있는 세포는 calcein-AM을 분해하여 calcein으로 변환할 수 있어, 녹색 형광을 보여주고, 죽은 세포는 EthD-1이 핵으로 들어오는 것을 막지 못해, 적색 형광을 보여준다.

도 10은 (a) L-929 세포와 (b) MC3T3-E1 세포의 Live/Dead 형광 이미지를 도시한다. 각 이미지는 슬라이드 글라스, poly-lysine 가 코팅된 유리, scaffold film에서 24, 48, 96 시간동안 세포를 배양한 후 얻었다. 살아있는 세포는 Calcein으로 인해 녹색의 형광, 죽은 세포는 EthD-1으로 인해 적색의 형광을 보여주고 있다.

도 11은 (a) L-929 세포와 (b) MC3T3-E1 세포의 Live/Dead 형광 이미지를 도시한다. SPL cell culture slide glass 위에서 24, 48, 96 시간동안 세포를 배양한 후 측정하였다.

* Mo₆S₃I₆를 SCAC로 이용하는 경우

Mo₆S₃I₆는 Mo_xS₆ _- _xI_x로 표현되는 나노와이어로, 총괄적으로는 Mo_xS₆ _- _xI_x로 표시될 수 있다. 제작된 Mo₆S₃I₆ 의 SEM은 도 12에서 도시된다. 두께는 수 nm부터 최대 15nm 정도이고, nm 단위의 얇은 형상을 갖고 있다.

도 13은 Mo₆S₃I₆의 물 분해 실험 결과를 도시한다. 물에 4 mg/mL로 준비한 후 4일마다 상층액에 존재하는 Mo와 S의 양을 조사해본 결과, 유의미한 이온의 양이 발견되지 않았다. 이를 통해 물에서 분해되지 않고 상기 상태로 계속 존재하는 것을 확인할 수 있었다.

도 14는 Mo₆S₃I₆의 세포 독성 실험 결과를 도시한다. 세포에 처리할 경우, 독성이 나타나는지를 확인하는 실험을 진행하였으며, 세포는 섬유아세포(L929)와 근아세포(C2C12)를 사용하였다. 3일간의 배양 결과 값이 70% 이하로 내려가지 않아, 세포 독성이 없음을 알 수 있었다.

도 15는 Mo₆S₃I₆의 기판 독성 실험 결과를 도시한다. 앞서 제작한 SEM 이미지를 가진 기판 위에 세포에 처리할 경우, 독성이 나타나는지를 확인하는 실험을 진행하였다. 세포는 혈관내피세포(HUVEC), 근아세포(C2C12)와 골아세포(MC3T3-E1)를 사용하였다. 1일차 시, 근아세포를 제외한 세포들이 70% 이하 값을 가지지만, 2일차가 되면서 무독성 범위값이 됨을 확인하였다. 기판으로 만든 Mo₆S₃I₆이 2일차부터 세포독성이 없음을 확인하였습니다.

* Nb₂Se₉를 SCAC로 이용하는 경우

도 16은 제작된 Nb₂Se₉의 SEM 이미지를 도시한다. 두께는 수 nm부터 최대 15nm 정도이고, nm 단위의 얇은 형상을 갖고 있다.

도 17은 Nb₂Se₉의 물 분해 실험 결과를 도시한다. 물에 4 mg/mL로 준비한 후 4일마다 상층액에 존재하는 Nb와 Se의 양을 조사해본 결과, 유의미한 이온의 양이 발견되지 않았다. 이를 통해 물에서 분해되지 않고 상기 상태로 계속 존재하는 것을 확인할 수 있었다.

도 18은 Nb₂Se₉의 기판 독성 실험 결과를 도시한다. 앞서 제작한 SEM 이미지를 가진 기판 위에 세포에 처리할 경우, 독성이 나타나는지를 확인하는 실험을 진행하였다. 세포는 혈관내피세포(HUVEC), 근아세포(C2C12)와 골아세포(MC3T3-E1)를 사용하였다. 1일차시, 골아세포(MC3T3-E1) 세포가 70% 이하 값을 가지지만, 2일차가 되면서 무독성 범위값이 됨을 확인하였습니다. 기판으로 만든 Nb₂Se₉이 2일차부터 모든 세포에 대해 독성이 없음을 확인하였습니다.

제시된 실시예들에 대한 설명은 임의의 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 이용하거나 또는 실시할 수 있도록 제공된다. 이러한 실시예들에 대한 다양한 변형들은 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이며, 여기에 정의된 일반적인 원리들은 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 다른 실시예들에 적용될 수 있다. 그리하여, 본 발명은 여기에 제시된 실시예들로 한정되는 것이 아니라, 여기에 제시된 원리들 및 신규한 특징들과 일관되는 최광의의 범위에서 해석되어야 할 것이다.

Claims

일차원 물질이 코팅되어 있고,
상기 일차원 물질은 무기 SCAC(Single Chain Atomic Crystals)이며,
상기 일차원 물질은 스캐폴드 필름(scaffold film)을 이루고 있는,
세포 부착 및 생장용 기판.
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 일차원 물질은 고분자 물질과 혼합되어 사용되는,
세포 부착 및 생장용 기판.
제 3 항에 있어서,
상기 고분자 물질은 PLA(poly latic acid), PC(poly carbonate), PCL(poly caprolactone), PP(poly propylene), PE(poly ethylene), 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 알지네이트(alginate) 중 어느 하나 이상을 포함하는,
세포 부착 및 생장용 기판.
제 1 항에 있어서,
상기 일차원 물질은 번들(bundle)로 사용되는,
세포 부착 및 생장용 기판.
제 1 항에 있어서,
기판은 유리(glass)인,
세포 부착 및 생장용 기판.
제 1 항에 있어서,
상기 일차원 물질은 Mo₆S₃I₆인,
세포 부착 및 생장용 기판.
일차원 물질이 코팅되어 있고,
상기 일차원 물질은 무기 SCAC(Single Chain Atomic Crystals)이며,
상기 일차원 물질은 스캐폴드 필름을 이루고 있는,
세포 담체.
삭제
제 8 항에 있어서,
상기 일차원 물질은 고분자 물질과 혼합되어 사용되는,
세포 담체.
제 10 항에 있어서,
상기 고분자 물질은 PLA(poly latic acid), PC(poly carbonate), PCL(poly caprolactone), PP(poly propylene), PE(poly ethylene), 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 알지네이트(alginate) 중 어느 하나 이상을 포함하는,
세포 담체.
제 8 항에 있어서,
상기 일차원 물질은 번들(bundle)로 사용되는,
세포 담체.
제 8 항에 있어서,
상기 일차원 물질은 Mo₆S₃I₆인,
세포 담체.
InMo₃Se₃와 LiI의 이온 교환법을 이용하여 LiMo₃Se₃를 합성하는 단계;
상기 LiMo₃Se₃는 물에 풀어 Mo₃Se₃ ^-로 존재하는 단계;
기판을 준비하고 세척하는 단계; 및
Mo₃Se₃ ^-를 알코올과 섞은 후 기판 상에 코팅하는 단계를 포함하고,
상기 코팅은 스프레이 코팅에 의해 진행되며,
상기 코팅에 의해 스캐폴드 필름이 형성되는,
세포 부착 및 생장용 기판의 제조 방법.
삭제
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