KR102253304B1 - Biomarkers for predicting recurrence of gastric cancer - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 위암의 재발에 특이적인 바이오 마커들에 관한 것이다.The present invention relates to biomarkers specific for recurrence of gastric cancer.
위암(gastric cancer; GC)은 전 세계적으로 가장 많이 발생하는 악성 종양 중 하나이며 암으로 인한 사망의 세 번째 주요 원인으로 알려져 있다. 또한, 대부분의 위암 환자가 진행성 단계에 있고 대부분 예후가 매우 좋지 않은 것으로 보고되어 있다. 전이성 위암에서는 백금을 기반으로 한 병용 화학 요법이 표준 치료법으로 간주되지만 많은 환자들이 상기 치료법에 불응성을 가지며, 반응성을 나타내는 환자들의 경우에도 반응 기간이 수 개월 정도로 짧은 것으로 알려져 있다. 또한, 인간 표피성장인자수용체 2(epidermal growth factor receptor 2; EGFR2) 양성 종양 환자에서 트라스투주맙(trastuzumab) 및 2차 치료제로써 라무시루맙(ramucirumab)을 제외하고는 신규 표적약물에 대한 임상 시험을 통해 위암을 성공적으로 치료한 성과를 얻지 못하였다. 위암에서 생존율이 낮은 이유로는 위암이 치료법에 대한 공격성 및 반응성이 상당히 상이한 이질적인 질환이며, 환자 각각에서 임상적 결과 및 예후가 보고된 데이터들과 항상 일치하지 않는다는 것이다. 위암의 증상은 전혀 증상이 없는 경우에서부터 격심한 통증에 이르기까지 다양한 양상을 나타내고 있다. 또한, 위암의 증상은 어떤 특성을 가지는 것이 아니라 일반적인 소화기 증상을 나타낸다. 일반적으로 위암의 초기에는 증상이 없는 경우가 대부분이며, 있다고 하더라도 경미하여 약간의 소화불량이나 상복부 불편감을 느끼는 정도이므로 대부분의 사람들이 이를 간과하기 쉬어 위암의 사망률을 높이는 원인이 되기도 한다.Gastric cancer (GC) is one of the most common malignancies worldwide and is known to be the third leading cause of cancer death. In addition, it has been reported that most gastric cancer patients are in the advanced stage and the prognosis is very poor in most cases. In metastatic gastric cancer, platinum-based combination chemotherapy is regarded as the standard treatment, but many patients are refractory to the treatment, and the response period is known to be as short as several months even in responsive patients. In addition, in patients with human epidermal growth factor receptor 2 (EGFR2) positive tumors, clinical trials for novel target drugs were conducted except for trastuzumab and ramucirumab as a second-line treatment. Through this, the results of successfully treating stomach cancer were not obtained. The reason for the low survival rate in gastric cancer is that gastric cancer is a heterogeneous disease that differs significantly in aggression and responsiveness to therapy, and that the clinical outcome and prognosis in each patient are not always consistent with the reported data. Symptoms of gastric cancer show a variety of patterns ranging from no symptoms at all to severe pain. In addition, the symptoms of gastric cancer do not have any characteristics, but represent general digestive symptoms. In general, in the early stage of gastric cancer, most of the cases have no symptoms, and even if there is, it is mild, and it is a degree of feeling a little indigestion or discomfort in the upper abdomen, so it is easy for most people to overlook it, which increases the mortality rate of gastric cancer.
현재까지의 위암의 검사수단은 물리적인 것이 대부분이었다. 그 첫번째로는 위장 X-선 촬영으로 이중조영법, 압박촬영법, 점막촬영법 등이 있으며, 두번째로는 위내시경으로 위속을 직접 눈으로 들여다 볼 수 있게 하여, X선 검사에서 나타나지 않는 아주 작은 병변도 발견할 수 있을 뿐 아니라 위암이 의심스러운 장소에서 직접조직검사를 시행할 수도 있어, 그 진단율을 높이고 있다. 하지만, 이 방법은 위생상의 문제와 검사가 진행되는 동안 환자로 하여금 고통을 감수해야 하는 단점이 있었다. 따라서, 최근에는 위암에서 특이적으로 발현되는 유전자 마커의 발현수준을 측정함으로써 위암을 진단하려는 연구가 이루어지고 있으나, 위암 환자의 예후를 예측하기 위한 유전자 마커에 대한 연구는 상대적으로 덜 이루어지고 있다. Until now, most of the tests for gastric cancer were physical. The first is gastrointestinal x-rays, which are double-contrast, compression, and mucous membranes, and the second allows you to look directly into the stomach with a gastroscopy, so that even very small lesions that do not appear on X-rays are found. Not only can it be done, but it is also possible to conduct a biopsy directly in a place where gastric cancer is suspicious, raising the diagnosis rate. However, this method has disadvantages of hygiene problems and the patient's suffering during the examination. Therefore, in recent years, studies have been conducted to diagnose gastric cancer by measuring the expression level of a gene marker specifically expressed in gastric cancer, but research on genetic markers for predicting the prognosis of gastric cancer patients is relatively less performed.
종래에는 위암 환자의 예후를 예측하기 위하여 해부학적인 관찰방법(암세포의 침윤 정도 및 전이된 림프절의 개수)을 사용하였으나, 의사의 주관적인 판단이 개입될 수 있고, 예후를 정확하게 예측하는데 한계가 있었다. 또한, 위암 수술 후 회복 속도를 향상시키기 위하여, 백금을 이용한 보조화학요법으로 위암 환자의 생존율을 향상시키고자 하는 시도가 있어 왔으나 (Paoletti X. et al.,JAMA 303(17):1729~1737; Lim L. et al., J. Clin. Oncol. 23(25):6220~6232), 30~50%의 환자들이 치료적 절제술 후 종양 재발을 겪으며, 화학요법의 효과는 종양생물학적 관점에서 차이가 있는 것으로 나타났다 (Sasako M. et al., J. Clin. Oncol. 29(33):4387~4393). 따라서, 절제술을 받은 위암 환자들에 화학요법을 적용하기 위한 임상적 또는 생물학적 예측인자(predictor)의 개발이 요구되는 실정이다.Conventionally, an anatomical observation method (the degree of invasion of cancer cells and the number of metastasized lymph nodes) was used to predict the prognosis of gastric cancer patients, but subjective judgment of a doctor may be involved, and there is a limitation in accurately predicting the prognosis. In addition, in order to improve the recovery rate after gastric cancer surgery, there have been attempts to improve the survival rate of gastric cancer patients with adjuvant chemotherapy using platinum (Paoletti X. et al., JAMA 303(17):1729~1737; Lim L. et al., J. Clin. Oncol. 23(25):6220~6232), 30~50% of patients suffer from tumor recurrence after therapeutic resection, and the effect of chemotherapy differs from the viewpoint of tumor biology. (Sasako M. et al., J. Clin. Oncol. 29(33):4387-4393). Therefore, there is a need to develop a clinical or biological predictor for applying chemotherapy to gastric cancer patients who have undergone resection.
본 발명에서는 위암의 재발 위험성을 진단할 수 있는 특이성과 민감도가 향상된 새로운 진단 마커들을 개발하는 것을 목적으로 한다.An object of the present invention is to develop new diagnostic markers with improved specificity and sensitivity for diagnosing the risk of recurrence of gastric cancer.
상기 목적의 달성을 위해, 본 발명은 위암의 예후 예측용 마커를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a marker for predicting the prognosis of gastric cancer.
또한, 본 발명은 위암의 예후 예측용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for predicting the prognosis of gastric cancer.
또한, 본 발명은 위암의 예후 예측용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for predicting the prognosis of gastric cancer.
또한, 본 발명은 위암의 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method of providing information for predicting the prognosis of gastric cancer.
아울러, 본 발명은 위암 재발 억제 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for screening a substance that inhibits gastric cancer recurrence.
본 발명에 따르면, 본 발명의 바이오 마커인 CAPZA, gamma-enolase, PRDX4, OCT-1, c-Myc 및 c-Met 유전자는 위암의 재발 위험도에 특이적으로 발현이 변화하므로, 이들을 위암 재발에 특이적인 마커로서 이용할 수 있으며, 이들을 각각 단독으로 또는 함께 조합하면 위암의 재발 위험을 더욱 특이적이고 정확하게 진단할 수 있는 효과가 있다.According to the present invention, since the biomarkers of the present invention, CAPZA, gamma-enolase, PRDX4, OCT-1, c-Myc, and c-Met genes, have a specific change in the risk of recurrence of gastric cancer, they are specific for gastric cancer recurrence. It can be used as a specific marker, and when these are used alone or in combination, there is an effect of more specific and accurate diagnosis of the risk of recurrence of gastric cancer.
도 1은 본 발명의 위암 재발에 대한 위암재발예측모델을 나타낸 도이다.
도 2는 내부 검증을 위한, 10배 교차 검증 후 위암재발예측모델의 교정 플롯(calibration plot)을 나타낸 도이다.
도 3은 트레이닝 데이터 세트 및 검증 데이터 세트 위암재발예측모델의 ROC 교정 플롯을 나타낸 도이다.
도 4는 트레이닝 데이터 세트를 사용하여 위험 분류에 따라 계층화한 후의 RFP에 대한 Kaplan-Meier 곡선을 나타낸 도이다.
도 5는 검증 데이터 세트를 사용하여 위험 분류에 따라 계층화한 후의 RFP에 대한 Kaplan-Meier 곡선을 나타낸 도이다.1 is a diagram showing a gastric cancer recurrence prediction model for gastric cancer recurrence of the present invention.
2 is a diagram showing a calibration plot of a gastric cancer recurrence prediction model after 10-fold cross-validation for internal verification.
3 is a diagram showing a ROC calibration plot of a model for predicting gastric cancer recurrence in a training data set and a verification data set.
4 is a diagram showing a Kaplan-Meier curve for RFP after stratification according to risk classification using a training data set.
5 is a diagram showing a Kaplan-Meier curve for RFP after stratification according to risk classification using a verification data set.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다. Hereinafter, the present invention will be described in detail as an embodiment of the present invention with reference to the accompanying drawings. However, the following embodiments are presented as examples of the present invention, and if it is determined that a detailed description of a technique or configuration well known to those skilled in the art may unnecessarily obscure the subject matter of the present invention, the detailed description may be omitted. However, the present invention is not limited thereby. The present invention is capable of various modifications and applications within the scope of equality interpreted from the description of the claims to be described later and therefrom.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.In addition, terms used in the present specification are terms used to properly express preferred embodiments of the present invention, which may vary depending on the intention of users or operators, or customs in the field to which the present invention belongs. Therefore, definitions of these terms should be made based on the contents throughout the present specification. Throughout the specification, when a part "includes" a certain component, it means that other components may be further included rather than excluding other components unless specifically stated to the contrary.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 테스트하기 위한 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에서 기술된다.Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in practice to test the present invention, preferred materials and methods are described herein.
본 발명에서 용어, "대상체" 또는 "환자"는 인간, 유인원, 원숭이, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다. In the present invention, the term "subject" or "patient" refers to any single individual in need of treatment, including humans, apes, monkeys, cows, dogs, guinea pigs, rabbits, chickens, insects, and the like. In addition, the subject includes any subject who participated in a clinical study trial that does not show any disease clinical findings, or who participated in an epidemiological study or a subject used as a control.
본 발명에서 용어, "시료(샘플)"는 대상 또는 환자로부터 얻은 생물학적 시료를 의미한다. 생물학적 시료의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. In the present invention, the term "sample (sample)" refers to a biological sample obtained from a subject or patient. The source of the biological sample may be a fresh, frozen and/or preserved organ or tissue sample or solid tissue from a biopsy or aspirate; Blood or any blood component; It may be a cell at any point in the subject's pregnancy or development.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.All technical terms used in the present invention, unless otherwise defined, are used in the same meaning as those of ordinary skill in the art generally understand in the related field of the present invention. In addition, although preferred methods or samples are described in the present specification, those similar or equivalent are included in the scope of the present invention. The contents of all publications referred to herein by reference are incorporated into the present invention.
일 측면에서, 본 발명은 CAPZA, gamma-enolase, PRDX4, OCT-1, c-Myc 및 c-Met 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하는 위암의 예후 예측용 마커에 관한 것이다.In one aspect, the present invention relates to a marker for predicting the prognosis of gastric cancer comprising at least one gene selected from the group consisting of CAPZA, gamma-enolase, PRDX4, OCT-1, c-Myc and c-Met genes.
일 구현예에서, 연령 및 성별의 인자를 마커로서 추가로 포함할 수 있다.In one embodiment, factors of age and sex may be further included as markers.
일 구현예에서, 마커 유전자들은 위암의 재발 가능성에 대해 특이적으로 발현이 증가 또는 감소할 수 있다.In one embodiment, the expression of the marker genes may be increased or decreased specifically for the possibility of recurrence of gastric cancer.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 위암의 예후 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 위암의 예후 예측용 조성물에 관한 것이다.In one aspect, the present invention relates to a composition for predicting the prognosis of gastric cancer comprising an agent measuring the expression level of mRNA or protein of the marker for predicting the prognosis of gastric cancer of the present invention.
일 구현예에서, 마커의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 마커의 핵산서열, 상기 핵산서열에 상보적인 핵산서열, 상기 핵산서열 및 상보적인 서열의 단편을 특이적으로 인식하는 프라미어 쌍, 프로브, 또는 프라이머 쌍 및 프로브를 포함할 수 있으며, 이의 측정은 중합효소연쇄반응, 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응(Competitive RT-PCR), Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, 핵산 마이크로어레이, 노던블랏 또는 DNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법으로 수행될 수 있다.In one embodiment, the agent for measuring the expression level of the mRNA of the marker comprises a nucleic acid sequence of the marker, a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence, a primer pair that specifically recognizes the nucleic acid sequence and a fragment of the complementary sequence, A probe, or a primer pair and a probe, may be included, and the measurement thereof is a polymerase chain reaction, a real-time RT-PCR, a reverse transcription polymerase chain reaction, and a competitive polymerase chain reaction (Competitive RT-PCR). ), Nuclease protection assay (RNase, S1 nuclease assay), in situ hybridization, nucleic acid microarray, Northern blot, or DNA chip.
일 구현예에서, 마커의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 마커의 단백질 전장 또는 그 단편을 특이적으로 인식하는 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)를 포함할 수 있으며, 이의 측정은 웨스턴블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 면역 전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 질량분석 또는 단백질 마이크로어레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법으로 수행될 수 있다.In one embodiment, the agent for measuring the expression level of a protein of a marker is an antibody, antibody fragment, aptamer, avidity multimer, or peptido that specifically recognizes the full length of the protein or a fragment thereof of the marker. It may include peptidomimetics, and its measurements include western blot, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunoassay, radioimmunodiffusion, immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunity. It may be performed by a method selected from the group consisting of a precipitation assay (Immunoprecipitation assay), a complement fixation assay (Complement Fixation Assay), FACS, mass spectrometry, or protein microarray.
본 발명에서 사용된 용어 "검출" 또는 "측정"은 검출 또는 측정된 대상의 농도를 정량하는 것을 의미한다.The term "detection" or "measurement" as used in the present invention means to quantify the concentration of a detected or measured object.
본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기 (free 3 hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍 (base pair)를 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 폴리머레이트 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. In the present invention, the term "primer" is a nucleic acid sequence having a short free 3 hydroxyl group, which can form a complementary template and a base pair, and serves as a starting point for template strand copying. It refers to a short functional nucleic acid sequence. The primers can initiate DNA synthesis in the presence of a reagent for polymerization (ie, DNA polymerate or reverse transcriptase) and four different nucleoside triphosphates at an appropriate buffer and temperature.
본 발명에서 용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 상기 CAPZA, gamma-enolase, PRDX4, OCT-1, c-Myc 및 c-Met 유전자와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 상기 유전자 발현 정도를 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 통상의 기술분야에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있으므로 본 발명에서는 이에 대해 특별히 한정하지 않는다.In the present invention, the term "probe" refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA corresponding to a few bases or hundreds of bases that can achieve specific binding to an mRNA, and is labeled to confirm the presence or absence of a specific mRNA. I can. The probe may be manufactured in the form of an oligonucleotide probe, a single stranded DNA probe, a double stranded DNA probe, an RNA probe, or the like. In the present invention, hybridization is performed using a probe complementary to the CAPZA, gamma-enolase, PRDX4, OCT-1, c-Myc, and c-Met genes, and the degree of expression of the gene can be diagnosed through hybridization. Selection and hybridization conditions for suitable probes may be modified based on those known in the art, and thus are not particularly limited in the present invention.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.The primers or probes of the present invention can be chemically synthesized using the phosphoramidite solid support method, or other well known methods. Such nucleic acid sequences can also be modified using a number of means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include methylation, encapsulation, substitution of one or more homologs of natural nucleotides, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkers (e.g., methyl phosphonate, phosphotriester, phosphoro Amidates, carbamates, etc.) or to charged linkers (eg phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.).
본 발명에서, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시키는 적합한 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, NucleicAcidHybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO4, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate),1mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.In the present invention, suitable conditions for hybridizing a probe with a cDNA molecule can be determined in a series of procedures by an optimization procedure. This procedure is performed as a series of procedures by a person skilled in the art to establish a protocol for use in the laboratory. For example, conditions such as temperature, concentration of components, hybridization and washing times, buffer components, and their pH and ionic strength depend on various factors such as the length of the probe and the amount of GC and the target nucleotide sequence. Detailed conditions for hybridization include Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); And M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. It can be found in N.Y. (1999). For example, among the stringent conditions, high stringency conditions were hybridized at 65°C in 0.5 M NaHPO4, 7% sodium dodecyl sulfate (SDS), 1 mM EDTA, and 68°C in 0.1 x SSC (standard saline citrate)/0.1% SDS. It means washing conditions. Alternatively, high stringency conditions mean washing at 48°C in 6 x SSC/0.05% sodium pyrophosphate. Low stringency means, for example, washing at 42° C. in 0.2 x SSC/0.1% SDS.
본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커인 CAPZA, gamma-enolase, PRDX4, OCT-1, c-Myc 및 c-Met 유전자에서 발현되는 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 상기 항체의 제조방법은 널리 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함된다. 본발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.In the present invention, the term "antibody" is a term known in the art and refers to a specific protein molecule directed against an antigenic site. For the purposes of the present invention, an antibody refers to an antibody that specifically binds to proteins expressed in the CAPZA, gamma-enolase, PRDX4, OCT-1, c-Myc and c-Met genes, which are markers of the present invention, and the The antibody production method can be prepared using well-known methods. This includes partial peptides that can be made from the protein. The form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and if a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, or any one having antigen binding properties, a part thereof is also included in the antibody of the present invention, and all immunoglobulin antibodies are included. Furthermore, the antibody of the present invention also includes special antibodies such as humanized antibodies.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 위암의 예후 예측용 조성물을 포함하는 위암의 예후 예측용 키트에 관한 것이다.In one aspect, the present invention relates to a kit for predicting the prognosis of gastric cancer comprising the composition for predicting the prognosis of gastric cancer of the present invention.
일 구현예에서, 상기 키트는 대상체 또는 환자로부터 생체 시료를 수집하기 위한 도구 및/또는 시약 뿐 아니라 그 시료로부터 게놈 DNA, cDNA, RNA 또는 단백질을 준비하기 위한 도구 및/또는 시약을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 게놈 DNA의 관련 영역을 증폭하기 위한 PCR 프라이머를 포함할 수 있다. 상기 키트는 약리게놈학적 프로파일링에 유용한 유전 인자의 프로브를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 키트의 사용에 있어서, 표지화된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 분석 중 용이하게 동정할 수 있다.In one embodiment, the kit may further include tools and/or reagents for collecting biological samples from a subject or patient, as well as tools and/or reagents for preparing genomic DNA, cDNA, RNA or protein from the sample. have. For example, it may include PCR primers for amplifying the relevant region of genomic DNA. The kit may contain probes of genetic factors useful for pharmacogenomic profiling. In addition, in the use of such a kit, a labeled oligonucleotide can be used to easily identify it during analysis.
일 구현예에서, 상기 키트는 DNA 중합효소 및 dNTP(dGTP, dCTP, dATP 및 dTTP), 형광물질 등의 표지 물질을 추가로 더 함유할 수 있다.In one embodiment, the kit may further contain a labeling material such as DNA polymerase and dNTP (dGTP, dCTP, dATP and dTTP), and a fluorescent material.
본 발명에서 용어 “위암의 예후 예측용 키트”는 본 발명의 위암의 예후 예측용 조성물이 포함된 키트를 의미한다. 따라서, 상기 표현 “위암의 예후 예측용 키트”는 “위암의 예후 예측용 조성물”과 서로 교차 또는 혼용하여 사용이 가능하다. In the present invention, the term "a kit for predicting the prognosis of gastric cancer" means a kit including the composition for predicting the prognosis of gastric cancer of the present invention. Therefore, the expression “a kit for predicting the prognosis of gastric cancer” can be used interchangeably or interchangeably with the “composition for predicting the prognosis of gastric cancer”.
본 발명에서 용어 “예후 예측용 마커, 예후를 판단하기 위한 바이오 마커 또는 예후 진단 마커(diagnosis marker)”란 위암의 재발 위험도를 예측/진단할 수 있는 물질로, 위암의 재발 가능성과 유의미한 상관관계를 가지고 발현이 증가 또는 감소하는 양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질 , 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 상기 위암의 예후 예측용 바이오 마커는 유전자 CAPZA, gamma-enolase, PRDX4, OCT-1, c-Myc 및 c-Met로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상으로서, 위암 재발에 특이적으로 mRNA 발현 또는 단백질 발현 정도가 증가 또는 감소하는 유전자이다. 이러한 마커들은 유전자뿐만 아니라 어느 하나의 마커와 상보적인 DNA 또는 mRNA을 포함하며, 이들 마커들이 둘 이상 포함된 복합 마커인 것이 바람직하다.In the present invention, the term “prognosis predictive marker, biomarker to determine prognosis, or prognostic diagnostic marker” is a substance capable of predicting/diagnosing the risk of recurrence of gastric cancer, and has a significant correlation with the possibility of recurrence of gastric cancer. And organic biomolecules such as polypeptides or nucleic acids (eg, mRNA, etc.), lipids, glycolipids, glycoproteins, sugars (monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, etc.), and the like, showing an increase or decrease in expression. For the purposes of the present invention, the biomarker for predicting the prognosis of gastric cancer is at least one selected from the group consisting of genes CAPZA, gamma-enolase, PRDX4, OCT-1, c-Myc and c-Met, specifically for gastric cancer recurrence. It is a gene whose mRNA expression or protein expression level increases or decreases. These markers include not only genes but also DNA or mRNA that is complementary to any one marker, and it is preferable that these markers are complex markers including two or more.
일 측면에서, 본 발명은 PPASE, OCT-1 또는 PRDX4의 발현 촉진제, 또는 CAPZA, gamma-enolase 또는 c-Myc의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는, 위암의 재발 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다.In one aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for inhibiting recurrence of gastric cancer, comprising an expression promoter of PPASE, OCT-1 or PRDX4, or an expression inhibitor of CAPZA, gamma-enolase or c-Myc as an active ingredient.
본 발명에 따른 약학적 조성물에는 PPASE, OCT-1 또는 PRDX4의 발현을 촉진하거나 CAPZA, gamma-enolase 및 c-Myc의 발현을 억제할 수 있는 물질이라면 모두 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition according to the present invention may contain any substance capable of promoting the expression of PPASE, OCT-1, or PRDX4 or inhibiting the expression of CAPZA, gamma-enolase, and c-Myc.
본 발명에서 상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등 과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). In the present invention, the pharmaceutical composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier. As used herein, "pharmaceutically acceptable" refers to a composition that is physiologically acceptable and does not usually cause an allergic reaction such as gastrointestinal disorders, dizziness, or similar reactions when administered to humans. Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, a carrier for oral administration such as lactose, starch, cellulose derivatives, magnesium stearate, stearic acid, and the like, and a carrier for parenteral administration such as water, suitable oil, saline, aqueous glucose and glycol. And the like, and may further include stabilizers and preservatives. Suitable stabilizers are antioxidants such as sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite or ascorbic acid. Suitable preservatives are benzalkonium chloride, methyl- or propyl-paraben and chlorobutanol. Other pharmaceutically acceptable carriers may be referred to as those described in the following literature (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다. 상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있는데, 상기 "투여"란 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 물질의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 상기에서 "유효량"이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 환자의 질환 종류 및 중증도, 연령, 성별, 체중, 약물에 대한 민감도, 현재 치료법의 종류, 투여방법, 표적 세포 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 바람직하게는 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱 더 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg /day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다. The pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated in a suitable form according to a method known in the art together with a pharmaceutically acceptable carrier as described above. That is, the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared in various parenteral or oral administration forms according to known methods, and as a representative formulation for parenteral administration, an isotonic aqueous solution or suspension is preferable as a dosage form for injection. Formulations for injection can be prepared according to techniques known in the art using suitable dispersing or wetting agents and suspending agents. For example, each component can be formulated for injection by dissolving it in saline or buffer. In addition, formulations for oral administration include, but are not limited to, powders, granules, tablets, pills and capsules. The pharmaceutical composition formulated by the above method can be administered in an effective amount through various routes including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous, or intramuscular, and the "administration" means introducing a predetermined substance to the patient by any suitable method. It means that the administration route of the substance can be administered through any general route as long as it can reach the target tissue. In the above, "effective amount" refers to an amount showing a prophylactic or therapeutic effect when administered to a patient. The dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention may vary depending on various factors such as the type and severity of the patient's disease, age, sex, weight, sensitivity to drugs, the type of current therapy, administration method, target cells, etc. Can be easily determined by experts in In addition, the pharmaceutical composition of the present invention may be administered in combination with a conventional therapeutic agent, may be administered sequentially or simultaneously with a conventional therapeutic agent, and may be administered single or multiple. Preferably, considering all of the above factors, it is possible to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects, more preferably 1 to 10000 ㎍ / weight kg/day, even more preferably 10 to 1000 It can be repeatedly administered several times a day in an effective dose of mg/kg body weight/day.
일 구현예에서, PPASE, OCT-1 또는 PRDX4의 발현 촉진제는, 바람직하게는 화학물질, 뉴클레오티드, 상기 유전자를 포함하는 벡터, 상기 유전자가 번역된 단백질 또는 이의 단편, 또는 천연물 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있다.In one embodiment, the expression promoter of PPASE, OCT-1 or PRDX4, preferably contains a chemical substance, a nucleotide, a vector containing the gene, a protein or a fragment thereof, or a natural product extract in which the gene is translated as an active ingredient. can do.
본 발명에서 사용되는 용어, "발현 촉진"이란 표적 유전자의 (mRNA로의) 발현 또는 (단백질로의) 번역 증진을 야기하는 것을 의미한다.As used herein, the term "promoting expression" means causing the enhancement of expression (to mRNA) or translation (to protein) of a target gene.
일 구현예에서, CAPZA, gamma-enolase 또는 c-Myc의 발현 억제제는, 바람직하게는 화학물질, 뉴클레오티드, 안티센스, siRNA 올리고뉴클레오타이드 또는 천연물 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 유전자의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 또는 siRNA(small interference RNA) 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함할 수 있다.In one embodiment, the expression inhibitor of CAPZA, gamma-enolase or c-Myc may preferably contain a chemical substance, nucleotide, antisense, siRNA oligonucleotide or natural product extract as an active ingredient, more preferably the gene Antisense or siRNA (small interference RNA) oligonucleotides having a sequence complementary to the nucleotide sequence of may be included as an active ingredient.
본 발명에서 사용되는 용어, "발현 억제"란 표적 유전자의 (mRNA로의) 발현 또는 (단백질로의) 번역 저하를 야기하는 것을 의미하며, 바람직하게는 이에 의해 표적 유전자 발현이 탐지 불가능해지거나 무의미한 수준으로 존재하게 되는 것을 의미한다.As used herein, the term "expression inhibition" refers to causing a decrease in the expression of a target gene (to mRNA) or translation (to a protein), and preferably, the expression of the target gene becomes undetectable or at an insignificant level. It means to exist as.
본 발명에서 사용되는 용어, "siRNA(small interfering RNA)"란 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다 (국제 공개특허 번호 00/44895, 01/36646, 99/32619, 01/29058, 99/07409 및 00/44914 참조). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knock-down) 방법으로서 또는 유전자 치료 방법으로 제공된다. 본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(CAPZA, gamma-enolase 또는 c-Myc의 mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스 가닥(CAPZA, gamma-enolase 또는 c-Myc의 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있으며, 또한, 본 발명의 siRNA 분 자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. 나아가 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 또한, siRNA 말단 구조는 CAPZA, gamma-enolase 또는 c-Myc 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하고, 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다. 또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오티드 서열이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다. siRNA를 제조하는 방법은 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤, 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유래의 siRNA 발현 카세트 등을 세포 안으로 형질전환 또는 감염(infection)시키는 방법이 있다.As used herein, the term "siRNA (small interfering RNA)" refers to a nucleic acid molecule capable of mediating RNA interference or gene silencing (International Patent Publication Nos. 00/44895, 01/36646, 99/32619, 01 /29058, 99/07409 and 00/44914). Since siRNA can inhibit the expression of a target gene, it is provided as an efficient gene knock-down method or as a gene therapy method. In the siRNA molecule of the present invention, the sense strand (sequence corresponding to the mRNA sequence of CAPZA, gamma-enolase or c-Myc) and the antisense strand (sequence complementary to the mRNA sequence of CAPZA, gamma-enolase or c-Myc) are each It may have a structure that is located on the opposite side to form a double chain, and the siRNA molecule of the present invention may have a single chain structure having self-complementary sense and antisense strands. Furthermore, siRNA is not limited to a complete pair of double-stranded RNA portions that form a pair of RNAs, and is paired by mismatch (the corresponding base is not complementary), bulge (there is no base corresponding to one chain), etc. It may contain parts that do not make up. In addition, siRNA terminal structures can be both blunt or cohesive ends as long as the expression of CAPZA, gamma-enolase or c-Myc genes can be suppressed by the RNAi effect, and the adhesive terminal structure is 3'- Both terminal protruding structures and 5'-terminal protruding structures are possible. In addition, the siRNA molecule of the present invention may have a form in which a short nucleotide sequence is inserted between the self-complementary sense and antisense strands, and in this case, the siRNA molecule formed by the expression of the nucleotide sequence is suitable for intramolecular hybridization. As a result, a hairpin structure is formed, and a stem-and-loop structure is formed as a whole. This stem-and-loop structure is processed in vitro or in vivo to produce an active siRNA molecule capable of mediating RNAi. The method of producing siRNA is a method of directly synthesizing siRNA in a test tube and then introducing it into a cell through a transformation process, and a siRNA expression vector or PCR-derived siRNA expression cassette prepared so that the siRNA is expressed in the cell is transformed into the cell. There are methods of conversion or infection.
일 구현예에서, 유전자 특이적인 siRNA를 포함하는 본 발명의 조성물은 siRNA의 세포 내 유입을 촉진시키는 제제를 포함할 수 있다. siRNA의 세포 내 유입을 촉진시키는 제제에는 일반적으로 핵산 유입을 촉진하는 제제를 사용할 수 있으 며, 이러한 예로는, 리포좀을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류 중 1 종의 친유성 담체와 함께 배합할 수 있다. 또한 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 스퍼민(spermine), 폴리실아잔 (polysilazane), 폴리에틸레민(PEI: polyethylenimine), 폴리디하이드로이미다졸레늄 (polydihydroimidazolenium), 폴리알리라민(polyallylamine), 키토산(chitosan) 등의 양이온성 고분자 (cationic polymer)를 이용할 수도 있고, 숙실화된 PLL(succinylated PLL), 숙실화된 PEI(succinylated PEI), 폴리글루타믹산(polyglutamic acid), 폴리아스파틱산(polyaspartic acid), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리메타아크릴산(polymethacylic acid), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 헤파린(heparin), 히아루릭산 (hyaluronic acid) 등의 음이온성 고분자(anionic polymer)를 이용할 수 있다. In one embodiment, the composition of the present invention comprising gene-specific siRNA may include an agent that promotes the introduction of siRNA into cells. Agents that promote the influx of siRNA into cells can generally be used as agents that promote the influx of nucleic acids, such as using liposomes or the parent of one of a number of sterols including cholesterol, cholate, and deoxycholic acid. It can be blended with an oily carrier. In addition, poly-L-lysine, spermine, polysilazane, polyethylenimine (PEI), polydihydroimidazolenium, polyallylamine ), a cationic polymer such as chitosan may be used, and succinylated PLL (succinylated PLL), succinylated PEI (succinylated PEI), polyglutamic acid, and polyaspartic acid Anionic polymers such as (polyaspartic acid), polyacrylic acid, polymethacylic acid, dextran sulfate, heparin, hyaluronic acid, etc. Can be used.
일 구현예에서, 상기 CAPZA, gamma-enolase 또는 c-Myc 단백질의 발현 및 활성을 감소시키는 물질로서 상기 단백질에 특이적인 항체를 사용할 경우, 상기 항체는 기존의 치료제와 직접 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 커플링(예를 들어, 공유결합)시킬 수 있다. In one embodiment, when using an antibody specific for the protein as a substance that decreases the expression and activity of the CAPZA, gamma-enolase or c-Myc protein, the antibody is indirectly with an existing therapeutic agent or through a linker, etc. It can be coupled (eg, covalently bonded).
본 발명에서 사용되는 용어, "안티센스 올리고뉴클레오타이드”란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유 하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 CAPZA, gamma-enolase 또는 c-Myc의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 안티센스 서열은 CAPZA, gamma-enolase 또는 c-Myc mRNA에 상보적이고 CAPZA, gamma-enolase 또는 c-Myc mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하며, CAPZA, gamma-enolase 또는 c-Myc mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙 (maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 또한, 상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다 (De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5, 3, 343-55, 1995). 핵산 골격은 포스포로티 오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당 간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-메틸피리미딘 (특히, 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아 데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한, 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다 (미국특허 제 5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 일예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부 위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.As used herein, the term "antisense oligonucleotide" refers to DNA or RNA containing a nucleic acid sequence complementary to a specific mRNA sequence, or a derivative thereof, and binds to the complementary sequence in the mRNA to form CAPZA, gamma-enolase Or it acts to inhibit the translation of c-Myc into the protein. The antisense sequence of the present invention is complementary to CAPZA, gamma-enolase or c-Myc mRNA and is capable of binding to CAPZA, gamma-enolase or c-Myc mRNA. It refers to a DNA or RNA sequence and can inhibit the translation, translocation into the cytoplasm, maturation, or any other essential activity for overall biological functions of CAPZA, gamma-enolase or c-Myc mRNA. , The antisense nucleic acid may be modified at the position of one or more bases, sugars or backbones to enhance efficacy (De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5, 3, 343-55, 1995). Nucleic acid backbone can be modified by phosphorothioate, phosphotriester, methyl phosphonate, short chain alkyl, cycloalkyl, short chain heteroatomic, heterocyclic sugar linkage, etc. In addition, antisense nucleic acids can be substituted with one or more substitutions. Antisense nucleic acids may contain modified bases, including hypoxanthine, 6-methyladenine, and 5-methylpyrimidine (especially 5-methylcytosine). ), 5-hydroxymethylcytosine (HMC), glycosyl HMC, gentobiosyl HMC, 2-amino adenine, 2-thiouracil, 2-thiothymine, 5-bromouracil, 5-hydroxymethyluracil, 8-azaguanine, 7-deazaguanine, N6 (6-aminohexyl) adenine, 2,6-diaminopurine, etc. In addition, the antisense nucleic acid of the present invention improves the activity and cell adsorption of the antisense nucleic acid. One or more moieties It can be chemically combined with (moiety) or conjugate. Cholesterol moiety, cholesteryl moiety, cholic acid, thioether, thiocholesterol, fatty chain, phospholipid, polyamine, polyethylene glycol chain, adamantane acetic acid, palmityl moiety, octadecylamine, hexylaminocarbonyl-oxychol Fat-soluble moieties such as esterol moieties, and the like, but are not limited thereto. Oligonucleotides comprising a fat-soluble moiety and methods of preparation are well known in the art (US Patent Nos. 5,138,045, 5,218,105 and 5,459,255). The modified nucleic acid can increase the stability to nucleases and increase the binding affinity between the antisense nucleic acid and the target mRNA. Antisense oligonucleotides can be synthesized in vitro by a conventional method and administered in vivo, or antisense oligonucleotides can be synthesized in vivo. One example of synthesizing antisense oligonucleotides in vitro is the use of RNA polymerase I. One example of allowing antisense RNA to be synthesized in vivo is to allow antisense RNA to be transcribed using a vector whose origin is in the opposite direction of the recognition site (MCS). It is preferable that such antisense RNA has a translation stop codon in the sequence so that it is not translated into a peptide sequence.
일 측면에서, 본 발명은 a) 검사 대상체로부터 분리된 시료로부터 제 1항에 따른 위암의 예후 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계; 및 b) 정상 대조군 시료의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계를 포함하는 위암의 예후 예측을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.In one aspect, the present invention comprises the steps of: a) checking the mRNA or protein expression level of the marker for predicting the prognosis of gastric cancer according to
일 구현예에서, 검사 대상체는 내시경 생검을 통해 위암으로 판정받은 환자일 수 있으며, 시료는 내시경 생검 조직일 수 있다.In one embodiment, the test subject may be a patient determined to have gastric cancer through an endoscopic biopsy, and the sample may be an endoscopic biopsy tissue.
일 구현예에서, 검사 대상체는 위암으로 인해 위절제 수술을 받은 환자일 수 있으며, 시료는 위암 조직 또는 위절제 수술 조직일 수 있다.In one embodiment, the test subject may be a patient who has undergone gastrectomy due to gastric cancer, and the sample may be a gastric cancer tissue or a gastric resection tissue.
일 구현예에서, 정상 대조군 시료에 비해 PPASE, OCT-1 및 PRDX4로 이루 어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 과발현되거나, CAPZA, gamma-enolase 및 c-Myc로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 감소한 경우, 검사 대상체에서 위암이 재발할 위험도가 높은 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.In one embodiment, compared to the normal control sample, the expression level of mRNA or protein of any one or more markers selected from the group consisting of PPASE, OCT-1 and PRDX4 is overexpressed, or consisting of CAPZA, gamma-enolase and c-Myc. When the expression level of the mRNA or protein of any one or more markers selected from the group is decreased, the step of determining that the risk of recurrence of gastric cancer in the test subject is high may be further included.
일 구현예에서, 재발 가능성 판단을 위한 각 유전자의 발현 수준의 컷 오프 값은 표 2 및 3의 pase 0-1/2-4, capza 0-1/2-4, gamma enolase 0/1-4, prdx4 0-1/2-4, oct-1 0-2/3-4 및 c-myc 0-1/2-4일 수 있다.In one embodiment, the cut-off value of the expression level of each gene for determining the possibility of recurrence is pase 0-1/2-4, capza 0-1/2-4,
일 구현예에서, 상기 방법에 바이오 마커 유전자의 발현 변화 수준에 따라 재발 위험도를 저-위험군, 중간-위험군, 고-위험군 및 초-고-위험군으로 구별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.In one embodiment, the method may further include the step of dividing the risk of recurrence into a low-risk group, a medium-risk group, a high-risk group, and an ultra-high-risk group according to the level of change in the expression of the biomarker gene.
일 측면에서, 본 발명은 a) 위암 조직 또는 세포에서 제 1항에 따른 위암의 예후 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; b) 상기 위암 조직 또는 세포에 후보 물질을 투여하고 상기 위암의 예후 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 c) a) 단계에서의 위암의 예후 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준과 b) 단계에서의 위암의 예후 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하는, 위암 재발 억제 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.In one aspect, the present invention a) measuring the expression level of the mRNA or protein of the marker for predicting the prognosis of gastric cancer according to
일 구현예에서, PPASE, OCT-1 및 PRDX4로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 하향 조절되거나, CAPZA, gamma-enolase 및 c-Myc로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 상향 조절된 경우 상기 후보 물질을 위암 재발 억제 물질로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.In one embodiment, the expression level of the mRNA or protein of any one or more markers selected from the group consisting of PPASE, OCT-1 and PRDX4 is down-regulated, or any selected from the group consisting of CAPZA, gamma-enolase and c-Myc When the expression level of the mRNA or protein of one or more markers is up-regulated, the step of determining the candidate substance as a substance that inhibits gastric cancer recurrence may be further included.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.The present invention will be described in more detail through the following examples. However, the following examples are only for embodiing the contents of the present invention, and the present invention is not limited thereto.
실시예 1. 조직 마이크로어레이를 위한 위 조직 시료 준비Example 1. Preparation of gastric tissue sample for tissue microarray
내부 트레이닝 데이터 세트로서 GNUH(Gyeongsang National University Hospital)에서 2004년 1월 1일부터 2007년 12월 31까지 위절제 수술을 받은 360명의 환자 및 외부 검증 데이터 세트로서 SNUH(Seoul National University Hospital)에서 2004년 1월 1일부터 2004년 12월 31일까지 위절제 수술을 받은 402명의 환자들로부터 절제된 위암(gastric cancer, GC) 조직 시료를 얻었다. 연령, 성별, 조직학적 서브타입, 병리학적 단계 및 재발과 같은 임상 병리학적 파라미터를 결정하기 위해, 의료 차트 및 병리학적 보고서를 검토하였다. 360 patients undergoing gastrectomy at Gyeongsang National University Hospital (GNUH) as an internal training data set from January 1, 2004 to December 31, 2007, and 2004 at Seoul National University Hospital (SNUH) as an external validation data set. Resected gastric cancer (GC) tissue samples were obtained from 402 patients who underwent gastrectomy from January 1 to December 31, 2004. Medical charts and pathological reports were reviewed to determine clinical pathological parameters such as age, sex, histological subtype, pathological stage and recurrence.
실시예 2. 조직 마이크로어레이를 이용한 면역조직화학 분석Example 2. Immunohistochemical analysis using tissue microarray
상기 데이터 세트들에 대한 조직 마이크로어레이(Tissue microarray, TMA) 블록 (360개의 GC 시료 및 420개의 GC 시료)을 구성하였다. 바이오 마커 후보 단백질들을 하기에 따라 선별하였다: 1) 공지된 위암 바이오 마커 유전자들 [E-cadherin, C-Myc, c-Met (tyrosine-protein kinase Met 또는 hepatocyte growth factor receptor)], 2) 장상피화생과 관련된 유전자들 [OCT-1 (octamer transcription factor-1) 및 SHH (sonic hedgehog)], 3) 위암 단백체 연구 관련 유전자들 [PPASE (inorganic pyrophosphatase), CAPZA (F-actin capping protein α1 subunit), gamma-enolase, PRDX4 (peroxiredoxin-4) 및 ERH (enhancer of rudimentary homolog)]. 360개의 GC 시료 및 420개의 GC 시료에서 10개의 바이오 마커 후보 단백질의 발현을 확인하기 위해, 상기 조직 마이크로어레이를 이용하여 면역조직화학분석을 시행하였다. 구체적으로, 조직 마이크로어레이 블록을 4um 두께로 절편한 뒤, 절편된 조직을 탈파라핀 및 재수분화를 시행하였다. 내인성 퍼옥시데이즈(peroxidase)의 비특이성 염색을 줄이기 위해 조직은 3% H2O2에 10분간 배양하였다. 항원결정인자(epitope)를 유발하기 위해 전자렌지 오븐을 이용하여 조직을 약 20분간 10 mmol/L의 시트레이트 버퍼(citrate buffer) (pH 6.0)에 침전하여 열처리하였다. 이 후, 배경 염색을 줄이기 위해 Ultra V Block (Lab Vision Corporation, Fremont, CA, USA)에 실온에서 7분간 처리하였다. 바이오 마커 발현을 위해 조직 마이크로어레이에 바이오마커 일차 항체 [항-PPASE (1:25; ATLAS Antibodies AB, Stockholm, Sweden), 항-CAPZ (1:50, ProteinTech Group, Chicago, IL, USA), 항-gamma-enolase (1:250; Abcam, Boston, MA, USA), 항-PRDX4 (ab59542, 1:100; Abcam, Cambridge, UK), 항-ERH (HPA002567 1:25; ATLAS Antibodies AB, Stockholm, Sweden), 항-SHH (1:100; Epitomics, Inc., CA, USA), 항-OCT-1 (1:200; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), 항-E-cadherin (sc-21791 1:100; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), 항-c-Myc (ab39688, 1:50, Abcam, Cambridge, UK) 및 항-c-Met (ab216574, 1:2000, Abcam, Cambridge, UK) 항체]를 1시간 동안 실온에서 처리하였다. 일차 항체의 발현을 위해 UltraVision LP detection system (Lab Vision Corporation)을 회사의 매뉴얼을 이용하여 염색하여 확인하였다. Tissue microarray (TMA) blocks (360 GC samples and 420 GC samples) were constructed for the above data sets. Biomarker candidate proteins were selected as follows: 1) Known gastric cancer biomarker genes [E-cadherin, C-Myc, c-Met (tyrosine-protein kinase Met or hepatocyte growth factor receptor)], 2) intestinal epithelialization Genes related to life [OCT-1 (octamer transcription factor-1) and SHH (sonic hedgehog)], 3) Gastric cancer protein research-related genes [PPASE (inorganic pyrophosphatase), CAPZA (F-actin capping protein α1 subunit), gamma -enolase, PRDX4 (peroxiredoxin-4) and ERH (enhancer of rudimentary homolog)]. To confirm the expression of 10 biomarker candidate proteins in 360 GC samples and 420 GC samples, immunohistochemical analysis was performed using the tissue microarray. Specifically, after sectioning the tissue microarray block to a thickness of 4 μm, the sectioned tissue was deparaffinized and rehydrated. To reduce non-specific staining of endogenous peroxidase, the tissue was incubated in 3% H 2 O 2 for 10 minutes. In order to induce epitope, the tissue was precipitated in 10 mmol/L citrate buffer (pH 6.0) for about 20 minutes using a microwave oven and then heat treated. Thereafter, to reduce background staining, Ultra V Block (Lab Vision Corporation, Fremont, CA, USA) was treated for 7 minutes at room temperature. For biomarker expression, biomarker primary antibodies [anti-PPASE (1:25; ATLAS Antibodies AB, Stockholm, Sweden), anti-CAPZ (1:50, ProteinTech Group, Chicago, IL, USA), anti -gamma-enolase (1:250; Abcam, Boston, MA, USA), anti-PRDX4 (ab59542, 1:100; Abcam, Cambridge, UK), anti-ERH (HPA002567 1:25; ATLAS Antibodies AB, Stockholm, Sweden), anti-SHH (1:100; Epitomics, Inc., CA, USA), anti-OCT-1 (1:200; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), anti-E-cadherin (sc- 21791 1:100; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), anti-c-Myc (ab39688, 1:50, Abcam, Cambridge, UK) and anti-c-Met (ab216574, 1:2000, Abcam, Cambridge , UK) antibody] was treated for 1 hour at room temperature. For the expression of the primary antibody, the UltraVision LP detection system (Lab Vision Corporation) was confirmed by staining using the company's manual.
또한, 세포질 반응은 하기와 같이 각 바이오 마커 후보에 대해 양성인 세포의 백분율에 따라 점수매겨졌다: 1+ (1-24%), 2+ (25-49%), 3+ (50-74%) 또는 4+ (75-100%)In addition, cytoplasmic responses were scored according to the percentage of cells positive for each biomarker candidate as follows: 1+ (1-24%), 2+ (25-49%), 3+ (50-74%) Or 4+ (75-100%)
실시예 3. 통계 분석Example 3. Statistical Analysis
SPSS Statistics version 24 software (IBM Corporation, Armonk, NY, USA)을 이용하여 Fisher’정확검증, 단변량-다변량 Cox proportional hazard analysis을 시행하였다. 5-년 총 재발을 예측하기 위해 multivariate Cox proportional hazards analysis 결과에 기초하여 위암재발예측모델(nomogram)을 개발하였다. 모든 분석은 'rms', 'survival' 및 ‘survminer' 패키지와 Stata 14.0 software (StataCorp. 2015, College Station, TX) 및 R 3.5.2 software (R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria). 0.05 미만의 P 값 (two-sided test)이 유의한 것으로 간주되었다. Fisher' correct verification, univariate-multivariate Cox proportional hazard analysis was performed using SPSS Statistics version 24 software (IBM Corporation, Armonk, NY, USA). To predict 5-year total recurrence, a gastric cancer recurrence prediction model (nomogram) was developed based on the results of multivariate Cox proportional hazards analysis. All analyzes were performed in the'rms','survival' and'survminer' packages and Stata 14.0 software (StataCorp. 2015, College Station, TX) and R 3.5.2 software (R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria). P values less than 0.05 (two-sided test) were considered significant.
실시예 4. 결과 분석Example 4. Analysis of results
4-1. 트레이닝 데이터 세트 및 검증 데이터 세트의 환자 인구통계4-1. Patient demographics in training and validation data sets
트레이닝 데이터 세트에서, 환자들의 평균 연령은 62.7 ± 11.1 세이며, 남성 대 여성의 비율은 1.8:1이다. 종양, 결절, 전이 (the tumor, node, metastasis, TNM) 단계의 경우 단계 I (N=206)이 가장 많았으며, 단계 Ⅲ (N= 92) 및 단계 Ⅱ (N= 62)가 그 뒤를 따랐다. 평균 60개월의 후속 조치 기간 중 총 재발률은 46.6% (82/360)로 나타났다. 검증 데이터 세트에서, 평균 연령은 58.1± 12.4 세이고, 남성 대 여성의 비율은 2.7:1였으며, TNM 단계는 단계 I (N =157), 단계 Ⅲ (N= 136) 및 단계 Ⅱ (N= 102)의 순서로 많은 것으로 나타났다. 재발률은 52.8% (94/402)로 나타났다. 트레이닝 데이터 세트와 검증 데이터 세트 간의 암 재발에 관한 유의한 차이는 없었으나 (p= 0.86), 연령, 성별, WHO 분류 및 TNM 단계에서는 유의한 차이가 있었다 (p< 0.01) (표 1).In the training data set, the average age of patients is 62.7 ± 11.1 years, and the male to female ratio is 1.8:1. In the case of the tumor, node, metastasis, TNM stage, stage I (N=206) was the most common, followed by stage III (N= 92) and stage II (N= 62). The total recurrence rate during the average 60-month follow-up period was 46.6% (82/360). In the validation data set, the mean age was 58.1±12.4 years old, the male to female ratio was 2.7:1, and the TNM stage was stage I (N=157), stage III (N=136) and stage II (N=102). It turned out to be a lot in the order of. The recurrence rate was 52.8% (94/402). There was no significant difference in cancer recurrence between the training data set and the validation data set (p=0.86), but there were significant differences in age, sex, WHO classification and TNM stage (p<0.01) (Table 1).
WHO: World Health Organization; WHO: World Health Organization;
Pap: papillary; Pap: papillary;
WD: Well differentiated; WD: Well differentiated;
MD: moderately differentiated; MD: moderately differentiated;
PD: poorly differentiated; PD: poorly differentiated;
Muc: mucinous; Muc: mucinous;
SRC: signet ring cell carcinoma; 및SRC: signet ring cell carcinoma; And
Undiff: undifferentiated.Undiff: undifferentiated.
4-2. 위암재발예측모델(Nomogram) 개발4-2. Gastric cancer recurrence prediction model (Nomogram) development
상기 트레이닝 데이터 세트 환자들에서 비-재발군 및 재발군에 따른 일반적인 변수 (연령 및 성별) 및 10개의 바이오마커 후보 유전자 (PASE, CAPZA, gamma-enolase, PRDX4, ERH, SHH, OCT-1, E-cadherin, c-Myc 및 c-Met)의 발현 수준을 분석하였다. SPSS Statistics version 24 software (IBM Corporation, Armonk, NY, USA)의 Fisher's 정확 검정(Fisher's exact test)에 기초하여, 10개의 유전자 중에 6개의 유전자 (CAPZA, gamma-enolase, PRDX4, OCT-1, c-Myc 및 c-Met)의 발현이 상기 두 군 사이에서 유의적으로 상이한 것으로 나타났다 (p<0.05) (표 2).또한, 일변량 및 다변량 Cox proportional hazards로 분석한 결과, 두 개의 일반 변수 (연령 및 성별) 및 상기 6개의 유전자의 발현 수준이 비-재발군 및 재발군 사이에서 유의적으로 차이가 있는 것으로 나타났다 (표 3). 또한, 다변량 분석을 통해, 하기와 같이 8개의 고-위험 변수들을 발견하였다: 60세 이상 (HR(위험 비율)= 1.02), 남성 (HR= 1.7), PPASE 과발현 (overexpression, OE) (score=2-4, HR=2), CAPZA 발현 감소 (under expression, UE) (score =0-1, HR= 1.6), OCT-1 OE (score =3-4, HR=2), gamma-enolase UE (score=0, HR=1.6), PRDX4 OE (score =2-4, HR= 2.46) 및 c-Myc UE (score =0, HR=1.9) (표 3 및 도 1). 위암재발예측모델은 다변량 Cox proportional hazards 분석 결과에 기초하여 개발하여 각 환자에 대한 재발 위험을 8가지 위험 인자 (연령, 성별, CAPZA, PPASE, OCT-1, gamma-enolase, PRDX4 및 c-Myc)와 관련된 점수로 계산하였다. 총 점수는 0-400이었으며, 각 변수가 계산되고 병합되었다. 높은 점수는 재발의 위험이 높고 재발하지 않을 확률(recurrence-free probability, RFP)이 낮은 것을 나타낸다 (도 2).In the training data set patients, general variables (age and sex) and 10 biomarker candidate genes (PASE, CAPZA, gamma-enolase, PRDX4, ERH, SHH, OCT-1, E) according to non-recurrence and recurrence group. -cadherin, c-Myc and c-Met) expression levels were analyzed. Based on Fisher's exact test of SPSS Statistics version 24 software (IBM Corporation, Armonk, NY, USA), 6 genes out of 10 genes (CAPZA, gamma-enolase, PRDX4, OCT-1, c- Myc and c-Met) were found to be significantly different between the two groups (p<0.05) (Table 2). In addition, as a result of analysis with univariate and multivariate Cox proportional hazards, two general variables (age And sex) and the expression levels of the six genes were found to be significantly different between the non-recurrence group and the recurrence group (Table 3). In addition, through multivariate analysis, eight high-risk variables were found as follows: over 60 years old (HR (risk ratio) = 1.02), male (HR = 1.7), PPASE overexpression (OE) (score = 2-4, HR=2), CAPZA expression decrease (under expression, UE) (score =0-1, HR= 1.6), OCT-1 OE (score =3-4, HR=2), gamma-enolase UE (score=0, HR=1.6), PRDX4 OE (score=2-4, HR= 2.46) and c-Myc UE (score=0, HR=1.9) (Table 3 and FIG. 1). The gastric cancer recurrence prediction model was developed based on the results of multivariate Cox proportional hazards analysis, and the risk of recurrence for each patient was evaluated by 8 risk factors (age, sex, CAPZA, PPASE, OCT-1, gamma-enolase, PRDX4 and c-Myc). It was calculated as a score related to. The total score was 0-400, and each variable was calculated and merged. A high score indicates a high risk of recurrence and a low recurrence-free probability (RFP) (FIG. 2).
4-3. bootstrap 교정(correction)을 이용한 내부 검증4-3. Internal verification using bootstrap correction
구성된 위암재발예측모델에 대한 내부 유효성을 평가하기 위해, 트레이닝 데이터 세트에서 bootstrap 시료의 1000회 반복을 이용하여 보정 플롯(calibration plot) 분석이 수행되었다 (도 3). X 축은 bootstrap 시료를 이용하여 예측된 5-년 재발 확률을 나타내며, Y 축은 Cox proportional hazards 분석을 이용하여 관찰된 5-년 RFP를 나타낸다. 파선 대각선은 예측된 확률과 관찰된 확률이 일치할 경우의 이상적인 기준선을 나타낸다. 10개의 점은 각 10위 군에 대해 내부 검증 결과 예측된 및 관찰된 확률을 나타낸다. 이를 통해 교차-점 선이 파선 기준선과 유사하기 때문에, 예측된 RFP가 실제 관찰과 잘 연관되어 있는 것을 알 수 있다.In order to evaluate the internal effectiveness of the constructed gastric cancer recurrence prediction model, a calibration plot analysis was performed using 1000 repetitions of bootstrap samples in the training data set (FIG. 3). The X axis represents the predicted 5-year recurrence probability using the bootstrap sample, and the Y axis represents the 5-year RFP observed using the Cox proportional hazards analysis. The dashed diagonal line represents the ideal baseline when the predicted and observed probabilities coincide. Ten points represent the predicted and observed probabilities as a result of the internal verification for each 10th place group. This shows that the predicted RFP correlates well with the actual observation, since the cross-dot line is similar to the dashed baseline.
4-4. 위험 계층화에 따른 RFP 및 재발 상태 평가4-4. RFP and recurrence status assessment according to risk stratification
위암재발예측모델의 정확도를 평가하기 위해, 낮은 위험도, 중간 위험도, 높은 위험도 및 매우 높은 위험도로 예측된 RFP에 따라 환자들을 4 개의 군으로 분류하였다. 예상 RFP는 저-위험군에서 >0.8 (score 0-205), 중간-위험군에서 0.8-0.6 (score 205-259), 고-위험군에서 0.6-0.4 (score 259-297) 및 초-고-위험군에서 <0.4 (score >297)로 나차났다. 트레이닝 데이터 세트에서, RFP는 상기 저-위험군, 중간-위험군, 고-위험군 및 초-고-위험군이 각각 89%, 75%, 54% 및 32%인 것으로 나타났으며, 검증 데이터 세트에서, RFP는 각각 89%, 75%, 63% 및 60%로 나타났다 (표 4).To evaluate the accuracy of the gastric cancer recurrence prediction model, patients were classified into 4 groups according to RFP predicted as low risk, medium risk, high risk, and very high risk. The predicted RFP was >0.8 in the low-risk group (score 0-205), 0.8-0.6 in the medium-risk group (score 205-259), 0.6-0.4 in the high-risk group (score 259-297), and in the ultra-high-risk group. <0.4 (score >297). In the training data set, RFP was found to be 89%, 75%, 54% and 32% in the low-risk group, medium-risk group, high-risk group, and ultra-high-risk group, respectively, and in the validation data set, RFP Was found to be 89%, 75%, 63% and 60%, respectively (Table 4).
4-5. 위암재발예측모델의 ROC 보정 플롯 분석 수행4-5. ROC correction plot analysis of gastric cancer recurrence prediction model
트레이닝 데이터 세트에서 모델의 예측 정확도에 대한 외부 유효성을 평가하기 위해, 트레이닝 데이터 세트 및 검증 데이터 세트에 대해 ROC 커브 분석을 수행하였다. 트레이닝 데이터 세트의 커브 하부 영역 (AUC, 95% CI)은 0.718 (0.652-0.784)로, 검증 데이터 세트의 AUC (95% CI)는 0.640 (0.579e0.701)로 나타났다. 트레이닝 데이터 세트 및 외부 검증 데이터 세트 간의 AUC는 유의적으로 차이나지 않았다 (P= 0.092) (도 3).In order to evaluate the external validity of the prediction accuracy of the model in the training data set, ROC curve analysis was performed on the training data set and the validation data set. The area under the curve (AUC, 95% CI) of the training data set was 0.718 (0.652-0.784), and the AUC (95% CI) of the validation data set was 0.640 (0.579e0.701). The AUC between the training data set and the external validation data set was not significantly different (P=0.092) (FIG. 3 ).
4-6. 위험 분류에 따른 계층화 후 RFP에 대한 Kaplan-Meier 커브4-6. Kaplan-Meier curve for RFP after stratification according to risk classification
훈련 데이터 세트에서, RFP에 대한 Kaplan-Meier 커브가 저-위험군, 중간-위험군, 고-위험군 및 초-고-위험군의 4 군에서 유의적으로 상이하였다 (p < 0.0001) (도 4). 구체적으로, 초-고-위험군에서, 0 내지 1년에서의 RFP는 0.92 (95% CI 0.71-0.98)로 나타났고, 재발한 환자는 25명 중 2명이었다. 1-3년 동안 3년 RFP는 0.44 (95% CI 0.23-0.62)이고, 재발한 환자는 21명 중 11명이었다. 3-5년 동안, 5년 RFP는 026 (95% CI 0.11-0.45)고, 10명의 환자 중 4명이 재발하였다. 또한, 고-위험군에서 (n=50), 0-1년 간의 1년 RFP는 0.96이고 50명 중 2명이 재발하였으며, 1-3년 간에 RFP는 0.69이고 47명 중 13명이 재발하였다. 3-5년 사이에, RFP는 0.59이고 34명 환자 중 5명이 재발하였다. 또한, 중간-위험군에서, 0-1 년 사이에 RFP는 0.95이고 89명 중 4명이 재발하였다. 1-3년 동안 RFP는 0.83이고 88명 중 10명이 재발하였다. 3-5년 동안 RFP는 0.77이고 67명 중 5명이 재발하였다. 아울러, 저-위험군에서 0-1 년 간의 RFP는 0.99이고 151명 중 1명이 재발하였다. 1-3년 동안 RFP는 0.94이고 145명 중 3명이 재발하였다. 3-5년 동안 RFP는 0.91이고, 134명 중 4명이 재발하였다 (표 5).In the training data set, the Kaplan-Meier curve for RFP was significantly different in
검증 데이터 세트에서, RFP에 대한 Kaplan-Meier 커브 또한 저-위험군, 중간-위험군, 고-위험군 및 초-고-위험군의 4 군에서 유의적으로 상이하였다 (p <0.0001) (도 5). 구체적으로, 초-고-위험군에서, 0 내지 1년, 1-3년 및 3-5년에서의 RFP는 각각 0.88, 0.63 및 0.53으로 나타났다. 또한, 고-위험군에서, 0 내지 1년, 1-3년 및 3-5년에서의 RFP는 각각 0.94, 0.74 및 0.47로 나타났다. 또한, 중간-위험군에서, 0 내지 1년, 1-3년 및 3-5년에서의 RFP는 각각 0.96, 0.79 및 0.74로 나타났다. 아울러, 저-위험군에서 0 내지 1년, 1-3년 및 3-5년에서의 RFP는 각각 0.99, 0.94 및 0.83로 나타났다 (표 6).In the validation data set, the Kaplan-Meier curve for RFP was also significantly different in the 4 groups of the low-risk group, the middle-risk group, the high-risk group and the ultra-high-risk group (p <0.0001) (FIG. 5 ). Specifically, in the ultra-high-risk group, RFPs at 0 to 1, 1-3 and 3-5 years were 0.88, 0.63 and 0.53, respectively. In addition, in the high-risk group, RFPs at 0 to 1, 1-3 and 3-5 years were 0.94, 0.74 and 0.47, respectively. In addition, in the middle-risk group, RFPs at 0 to 1, 1-3 and 3-5 years were 0.96, 0.79 and 0.74, respectively. In addition, in the low-risk group, the RFPs at 0 to 1, 1-3 and 3-5 years were 0.99, 0.94 and 0.83, respectively (Table 6).
실시예 5. 6 개의 바이오 마커를 이용한 위암 재발 관련성 분석Example 5. Analysis of association of gastric cancer recurrence using 6 biomarkers
모든 6개의 유전체를 포함시킨 모델 (연령 및 성별 인자 포함)에서 60개월에서의 무재발(Recurrence free) 여부에 대한 판별력 (즉, 진단의 정확성) (AUC 값)이 가장 높게 나타났다 (표 7).In the model including all six genomes (including age and gender factors), the discriminant ability (ie, accuracy of diagnosis) (AUC value) for recurrence free at 60 months was the highest (Table 7).
Claims (14)
b) 정상 대조군 시료의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계; 및
c) 정상 대조군 시료에 비해 PPASE, OCT-1 및 PRDX4로 이루어진 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 과발현되고, CAPZA, gamma-enolase 및 c-Myc로 이루어진 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 감소한 경우, 검사 대상체에서 위암이 재발할 위험도가 높은 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 위암의 예후 예측을 위한 정보제공방법에서,
상기 검사 대상체는 위암 환자 또는 위암으로 인해 위절제 수술을 받은 환자이고,
상기 시료는 위 내시경 생검 조직, 위암 조직 또는 위절제 수술 조직인, 위암의 예후 예측을 위한 정보제공방법.a) checking the expression level of the mRNA or protein of the marker for predicting the prognosis of gastric cancer according to claim 1 from the sample isolated from the test subject;
b) comparing the corresponding result of the corresponding marker of the normal control sample with the corresponding result; And
c) When the expression level of the mRNA or protein of the marker consisting of PPASE, OCT-1 and PRDX4 is overexpressed and the expression level of the mRNA or protein of the marker consisting of CAPZA, gamma-enolase and c-Myc is decreased compared to the normal control sample. In the information providing method for predicting the prognosis of gastric cancer, comprising the step of determining that the risk of recurrence of gastric cancer in the test subject is high,
The test subject is a gastric cancer patient or a patient who has undergone gastrectomy due to gastric cancer,
The sample is a gastric endoscopic biopsy tissue, a gastric cancer tissue or a gastric resection surgical tissue, an information providing method for predicting the prognosis of gastric cancer.
b) 상기 위암 조직 또는 세포에 후보 물질을 투여하고 상기 위암의 예후 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;
c) a) 단계에서의 위암의 예후 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준과 b) 단계에서의 위암의 예후 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 비교하는 단계; 및
d) PPASE, OCT-1 및 PRDX4로 이루어진 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 하향 조절되고, CAPZA, gamma-enolase 및 c-Myc로 이루어진 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 상향 조절된 경우 상기 후보 물질을 위암 재발 억제 물질로 판단하는 단계를 포함하는, 위암 재발 억제 물질의 스크리닝 방법.
a) measuring the expression level of the mRNA or protein of the marker for predicting the prognosis of gastric cancer according to claim 1 in gastric cancer tissues or cells;
b) administering a candidate substance to the gastric cancer tissues or cells and measuring the expression level of mRNA or protein of a marker for predicting the prognosis of gastric cancer;
c) comparing the mRNA or protein expression level of a marker for predicting the prognosis of gastric cancer in step a) and the mRNA or protein expression level of the marker for predicting the prognosis of gastric cancer in step b); And
d) When the expression level of the mRNA or protein of the marker consisting of PPASE, OCT-1 and PRDX4 is down-regulated, and the expression level of the mRNA or protein of the marker consisting of CAPZA, gamma-enolase and c-Myc is up-regulated, the candidate A method for screening a substance for inhibiting recurrence of gastric cancer, comprising the step of determining the substance as a substance for inhibiting recurrence of gastric cancer.
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