KR102244778B1 - Measurement of cell cross-over frequency using the change of position of cells responding to dielectrophoretic force - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세포의 교차주파수(cross-over frequency) 측정방법으로, 구체적으로 (a) 세포에 인가하는 교류주파수(AC frequency)를 선정하는 단계; (b) 선정된 교류주파수에서 각 세포를 촬영하여 분석하는 단계; (c) 분석된 세포의 그레이스케일 강도(grayscale intensity)을 측정하는 단계 (d) 인가하는 교류주파수를 변화시키면서 주파수 변화에 따른 그레이스케일 강도를 측정하는 단계; 및 (e) 단계 (a)에서 선정된 교류주파수의 그레이스케일 강도와 단계 (d)에서 측정된 그레이스케일 강도를 비교하는 단계를 포함하는, 세포의 교차주파수(cross-over frequency) 측정방법에 관한 것이다.The present invention is a method for measuring a cross-over frequency of a cell, specifically (a) selecting an AC frequency to be applied to the cell; (b) photographing and analyzing each cell at the selected AC frequency; (c) measuring the grayscale intensity of the analyzed cells (d) measuring the grayscale intensity according to the frequency change while changing the applied AC frequency; And (e) comparing the grayscale intensity of the AC frequency selected in step (a) with the grayscale intensity measured in step (d). will be.
Description
본 발명은 유전영동힘에 반응하는 세포의 트랩(trap) 위치변화를 이용한 세포의 교차주파수(cross-over frequency) 측정방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for measuring a cross-over frequency of a cell using a change in the position of a cell trap in response to a dielectrophoretic force.
살아있는 세포가 전기장에 노출이 되면, 세포안에 쌍극성(dipole)이 형성된다. 형성된 쌍극성과 전기장 사이의 상호작용으로 힘이 발생하게 되고, 그러한 힘은 세포를 di-polarized하게 만든다. 지금까지 설명한 현상을 유전영동이라고 부르며, 그러한 힘을 유전영동힘(dielectrophoretic force, DEP force)이라고 한다. 유전영동 현상에서 세포를 움직이게 하는 힘의 방향을 결정하는 요소는 Clausius-Mossotti factor의 실수부이다(Re[CM]). DEP force에 영향을 받는 세포의 반응을 추정하기 위하여, 세포의 모양은 구라고 가정한다. 구형태를 가지는 입자에 대한 DEP force 식은 다음과 같다.When a living cell is exposed to an electric field, a dipole is formed in the cell. The interaction between the formed dipolar and the electric field generates a force, which makes the cell di-polarized. The phenomenon described so far is called dielectrophoresis, and such force is called dielectrophoretic force (DEP force). In the dielectrophoretic phenomenon, the factor that determines the direction of the force that moves the cell is the real part of the Clausius-Mossotti factor (Re[CM]). To estimate the cell's response to the DEP force, it is assumed that the shape of the cell is a sphere. The DEP force equation for a particle having a spherical shape is as follows.
살아있는 세포가 전기장에 노출이 되면, 세포안에 쌍극성(dipole)이 형성된다. 형성된 쌍극성과 전기장 사이의 상호작용으로 힘이 발생하게 되고, 그러한 힘은 세포를 di-polarized하게 만든다. 지금까지 설명한 현상을 유전영동이라고 부르며, 그러한 힘을 유전영동힘(dielectrophoretic force, DEP force)이라고 한다. 유전영동 현상에서 세포를 움직이게 하는 힘의 방향을 결정하는 요소는 Clausius-Mossotti factor의 실수부이다(Re[CM]). DEP force에 영향을 받는 세포의 반응을 추정하기 위하여, 세포의 모양은 구라고 가정한다. 구형태를 가지는 입자에 대한 DEP force 식은 다음과 같다.When a living cell is exposed to an electric field, a dipole is formed in the cell. The interaction between the formed dipolar and the electric field generates a force, which makes the cell di-polarized. The phenomenon described so far is called dielectrophoresis, and such force is called dielectrophoretic force (DEP force). In the dielectrophoretic phenomenon, the factor that determines the direction of the force that moves the cell is the real part of the Clausius-Mossotti factor (Re[CM]). To estimate the cell's response to the DEP force, it is assumed that the shape of the cell is a sphere. The DEP force equation for a particle having a spherical shape is as follows.
이 때, Re[CM]에서 The CM factor model에서 세포에 대한 전기모델을 single shell model이라고 가정한다. 가정했을때의 CM factor 식은 다음과 같다.At this time, in Re[CM], the electric model for cells in The CM factor model is assumed to be a single shell model. Assuming the CM factor equation is as follows.
Re[CM]의 값은 인가하고 있는 전기장에 대해 세포와 세포를 둘러싸고 있는 액체(medium)가 각각 dielectric polarization이 되는 정도의 차이에 의하여 값이 결정되며, 인가하는 전기장의 주파수 변화에 의존하여 세포와 medium이 dielectric polarization이 되는 정도가 각각 다르게 반응한다. Re[CM]값이 양의 값을 가지면 세포는 주변을 둘러싸는 medium보다 강하게 dielectirc polarization되어 주어진 공간내에서 전기장의 세기가 가장 강한 곳으로 이동하려는 경향을 보이며, 반대로 Re[CM] 값이 음수를 가지면, 세포는 medium보다 약하게 dielectirc polarization이 되어 전기장의 세기가 가장 약한 곳으로 이동하려는 경향을 가진다.The value of Re[CM] is determined by the difference in the degree of dielectric polarization between the cell and the liquid surrounding the cell with respect to the applied electric field, and depends on the frequency change of the applied electric field. The degree to which the medium becomes dielectric polarization reacts differently. If the Re[CM] value has a positive value, the cell dielectirc polarizes more strongly than the surrounding medium and tends to move to the place where the electric field strength is strongest in a given space. Conversely, the Re[CM] value is negative. If so, the cells are dielectirc polarized weaker than the medium and tend to move to the weakest electric field.
이러한 Re[CM]의 값을 결정하는 세포의 dielectric polarization은 세포를 구성하는 물질의 구성성분에 의존하기 때문에, 만약 세포가 외부환경요인에 의하여 세포를 구성하고 있는 성분의 변화가 발생한다면, 유전영동 기술을 이용하여 변화가 발생된 세포들을 구별할 수 있다. 예를 들어, 다양한 세포계(cancer cells, stem cells, bacteria 등)에서 각 세포가 가지고 있는 고유한 전기생리학적 특성 (electrophysiological properties)을 확인하였을 뿐만 아니라 apoptosis 기전물질, 세포막 이온채널의 기능 조절, medium 내 이온 농도에 따라 세포의 전기생리학적 특징 변화가 발생되었는지 여부를 확인하는 연구가 존재하였다.Since the dielectric polarization of the cell that determines the value of Re[CM] depends on the composition of the material constituting the cell, if the cell has a change in the composition of the cell due to external environmental factors, it is dielectrophoresis. Technology can be used to differentiate between cells that have undergone changes. For example, in various cell systems (cancer cells, stem cells, bacteria, etc.), not only the unique electrophysiological properties of each cell were confirmed, but also apoptosis mechanisms, control of the function of cell membrane ion channels, and Studies have existed to confirm whether changes in the electrophysiological characteristics of cells have occurred depending on the ion concentration.
위의 진행된 연구에서 세포의 전기생리학적 특징 변화를 정량적으로 관측하기 위해 반드시 거쳐야 할 과정은 세포의 Re[CM]이 0이 되는 frequency(=cross-over frequency, f co)를 찾는 것이다. 세포의 f co를 찾게 되면, 세포의 membrane conductance를 모델을 통하여 추론할 수 있으며, Re[CM] 값의 경향성을 확인하여, 주어진 외부적 자극(예를 들어, 세포이온채널 활성 억제제)에 반응하여 세포의 세포막에서 발생되는 변화에 대한 해석이 가능해진다. 따라서 세포의 cross-over frequency를 정확하게 찾기 위한 방법을 정립하는 것은 중요하다고 볼 수 있다. 지금까지 세포의 움직임 변화를 분석하여 세포의 cross-over frequency를 정확하게 찾는 방법으로 크게 2가지로 분류할 수 있다. In the above-described research, the process that must be taken to quantitatively observe changes in the electrophysiological characteristics of cells is to find the frequency (=cross-over frequency, f co ) at which Re[CM] of the cells becomes 0. When finding the f co of the cell, the membrane conductance of the cell can be inferred through the model, and by checking the trend of the Re[CM] value, in response to a given external stimulus (for example, an inhibitor of cell ion channel activity) Interpretation of changes occurring in cell membranes of cells becomes possible. Therefore, it can be seen that it is important to establish a method for accurately finding the cell's cross-over frequency. Up to now, it can be classified into two types by analyzing cell movement changes and accurately finding the cell's cross-over frequency.
첫 번째 방법은 인가하는 AC 전기 주파수 변화에 따른 세포들의 전체적인 움직임 변화를 통해 관측하는 방법이 있다.The first method is to observe the changes in the overall movement of cells according to the change in the applied AC electric frequency.
상기 그림 a와 같이 전극구조 안에 있는 세포들은 상대적으로 낮은 주파수(예를 들어 10 kHz) 에서는 negative 유전영동힘에 영향을 받아 전극의 중앙부분에 모이게 되는데, 이때 전극구조를 투과하고 있는 빛의 세기는 세포들이 중앙에서 가리기 때문에, 약해진다. 반대로 상대적으로 높은 주파수 (예를들어 1 MHz) 에서는 세포는 positive 유전영동 힘의 영향을 받아 전극의 가장자리 부분에 모이게 되며, 이때 전극 구조를 투과하고 있는 빛의 세기는 중앙부분을 차지고 하고 있던 세포들이 전극 가장자리로 이동하면서 훨씬 빛이 잘 투과되기 때문에 빛의 세기는 증가하게 된다. 이러한 세포의 움직임에 비례하는 빛의 세기 변화를 정량화하면 상기 그림 b와 같은 곡선을 얻어낼 수 있으며, 이론적인 모델에 근거하여 세포의 cross-over frequency를 찾을 수 있다. 상기 방법의 장점으로는 한번의 실험으로 유전영동힘에 대한 약 20,000개 세포반응을 알 수 있다고 주장하고 있고, 현재 상용화된 제품으로 출시되고 있다. 하지만, 유전영동힘에 대해 세포반응을 각각을 관측을 하지 못하며, 한 well 내에 존재하는 수백, 수천개의 세포들의 반응에 대하여 대표값으로 확인할 수 밖에 없다는 한계점이 있다. As shown in Figure a, cells in the electrode structure are affected by the negative dielectrophoretic force at a relatively low frequency (for example, 10 kHz) and gather at the center of the electrode. At this time, the intensity of light passing through the electrode structure is Because the cells are hidden in the center, they become weak. Conversely, at a relatively high frequency (for example, 1 MHz), cells gather at the edge of the electrode under the influence of the positive dielectrophoretic force, and the intensity of light passing through the electrode structure is the cells occupying the center. As it moves to the edge of the electrode, light is transmitted much better, so the intensity of light increases. By quantifying the change in light intensity proportional to the movement of the cell, a curve as shown in Fig. b can be obtained, and the cross-over frequency of the cell can be found based on the theoretical model. As an advantage of the method, it is claimed that about 20,000 cell responses to the dielectrophoretic force can be known in one experiment, and it is currently being released as a commercially available product. However, there is a limitation in that each cell response to the dielectrophoretic force cannot be observed, and the response of hundreds or thousands of cells existing in one well can only be confirmed as a representative value.
두번째 방법으로는 각 세포 하나하나의 이동하는 좌표를 추적하는 방법이 있다. 이러한 방법은 DEP force에 반응하는 세포의 이동방향이 다르다는 것에 착안한다. 구체적으로 DEP force가 양의 방향일 때는 전기장의 세기가 가장 강한곳으로 가며, DEP force가 음의 방향일 는 전기장의 세기가 가장 약한 곳으로 가기 때문에 세포가 유전영동 힘에 반응하여 움직이는 궤적을 분석하여 속도를 추정하면, DEP force와 hydrodynamic drag force 식에 근거하여 AC 주파수 변화에 대한 Re[CM] 파라미터값을 가정할 수 있다(하기 그림 참조).The second method is to track the moving coordinates of each cell. This method focuses on the fact that the direction of movement of cells in response to DEP force is different. Specifically, when the DEP force is in the positive direction, the electric field goes to the strongest place, and when the DEP force is in the negative direction, the electric field goes to the weakest place, the trajectory that the cell moves in response to the dielectrophoretic force. If the velocity is estimated by analyzing the DEP force and the hydrodynamic drag force equation, the Re[CM] parameter value for the AC frequency change can be assumed (refer to the figure below).
하지만, 이러한 세포의 위치 추적 방식으로 구하는 방법의 경우, 상용화된 이미지 분석 프로그램(대표적으로 Image J)를 이용하여 분석하기 때문에, 일반적으로 입자의 궤적을 정확하게 분석하기 위해서는 세포 주변의 배경이 일정한 밝기를 유지해야 한다는 점, 전극모양이 주변에 있을 경우, 촬영한 모든 사진에서 각 세포의 위치를 정확하게 판별하기 위해서는 매우 많은 전처리 과정이 필요하다는 점에서 궤적 분석에 최적화된 환경을 제공하지 못하며, 분석하는 세포 수는 첫 번째 방법에 비해 적게 분석이 된다. 하지만, 유전영동힘에 대하여 각각의 세포에 대한 반응을 직접 관측하고 이를 통계적으로 분석하여 경향성을 확인하기 때문에, 적어도 관측한 세포군에 대한 대표값을 설명하기에는 부족함이 없다고 판단할 수 있다.However, in the case of such a method of obtaining the location of the cell, since it is analyzed using a commercially available image analysis program (typically Image J), in general, in order to accurately analyze the trajectory of the particle, the background around the cell has a constant brightness. It does not provide an optimized environment for trajectory analysis because it requires a lot of pre-processing to accurately determine the location of each cell in all the photographed photos when the electrode shape is around it. The number is less analyzed compared to the first method. However, since the response to each cell is directly observed and statistically analyzed to confirm the trend, it can be judged that there is no insufficient to explain at least a representative value for the observed cell group.
다만, 첫 번째 방법에 의할 경우, 유전영동힘에 대한 세포 각각의 반응을 관측할 수 없다는 문제점이 있고, 두 번째 방법에 의할 경우, 분석하는 세포의 수가 적으며, 매우 많은 전처리과정이 필요하다는 문제점이 있다.However, in the case of the first method, there is a problem that the reaction of each cell to the dielectrophoretic force cannot be observed. In the case of the second method, the number of cells to be analyzed is small, and a very large number of pretreatment steps are required. There is a problem that it is.
본 발명의 목적은 (a) 세포에 인가하는 교류주파수(AC frequency)를 선정하는 단계; (b) 선정된 교류주파수에서 각 세포를 촬영하여 분석하는 단계; (c) 분석된 세포의 그레이스케일 강도(grayscale intensity)을 측정하는 단계 (d) 인가하는 교류주파수를 변화시키면서 주파수 변화에 따른 그레이스케일 강도를 측정하는 단계; 및 (e) 단계 (a)에서 선정된 교류주파수의 그레이스케일 강도와 단계 (d)에서 측정된 그레이스케일 강도를 비교하는 단계를 포함하는, 세포의 교차주파수(cross-over frequency) 측정방법을 제공하는 것이다.An object of the present invention is (a) selecting an AC frequency to be applied to the cell (AC frequency); (b) photographing and analyzing each cell at the selected AC frequency; (c) measuring the grayscale intensity of the analyzed cells (d) measuring the grayscale intensity according to the frequency change while changing the applied AC frequency; And (e) comparing the grayscale intensity of the AC frequency selected in step (a) with the grayscale intensity measured in step (d). It is to do.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여 (a) 세포에 인가하는 교류주파수(AC frequency)를 선정하는 단계; (b) 선정된 교류주파수에서 각 세포를 촬영하여 분석하는 단계; (c) 분석된 세포의 그레이스케일 강도(grayscale intensity)을 측정하는 단계; (d) 인가하는 교류주파수를 변화시키면서 주파수 변화에 따른 그레이스케일 강도를 측정하는 단계; 및 (e) 단계 (a)에서 선정된 교류주파수의 그레이스케일 강도와 단계 (d)에서 측정된 그레이스케일 강도를 비교하는 단계를 포함하는, 세포의 교차주파수(cross-over frequency) 측정방법을 제공함에 의해 달성된다. The present invention comprises the steps of: (a) selecting an AC frequency to be applied to the cells; (b) photographing and analyzing each cell at the selected AC frequency; (c) measuring grayscale intensity of the analyzed cells; (d) measuring the grayscale intensity according to the frequency change while changing the applied AC frequency; And (e) comparing the grayscale intensity of the AC frequency selected in step (a) with the grayscale intensity measured in step (d). Is achieved by
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (a)는 하기 식 (1)을 이용해 클로시우스-모소티 인자(Clausius-Mossotti factor, CM factor)의 값을 -1 내지 0으로 하는 교류주파수를 선정하는 단계이다.In one aspect of the present invention, the step (a) is a step of selecting an AC frequency in which the value of the Closius-Mossotti factor (CM factor) is -1 to 0 using the following equation (1). to be.
식 (1) : 
또한, 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (a)는 상기 식 (1)을 이용해 클로시우스-모소티 인자(Clausius-Mossotti factor, CM factor) 실수부의 값을 가장 낮게 하는 교류주파수를 선정하는 단계이다.In addition, in an aspect of the present invention, the step (a) is a step of selecting an AC frequency that lowers the value of the real part of the Closius-Mossotti factor (CM factor) using Equation (1). to be.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (b)는 각 세포를 촬영하여 세포의 위치를 분석하는 단계이다.In one aspect of the present invention, the step (b) is a step of analyzing the location of the cells by photographing each cell.
또한, 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (b)는 각 세포를 촬영하여 세포의 위치를 분석하여 각 세포의 구심점과 세포의 반지름을 사용하여 인위 윈도우 마스크(artificial window mask)를 정의하는 단계를 포함할 수 있다.In addition, in one aspect of the present invention, the step (b) includes the step of defining an artificial window mask using a centripetal point of each cell and a radius of the cell by photographing each cell and analyzing the location of the cell. Can include.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (c)는 인위 윈도우(artificial window)을 통해 그레이스케일 강도를 구하는 단계이다.In one aspect of the present invention, step (c) is a step of obtaining grayscale intensity through an artificial window.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (d)는 인가하는 교류주파수를 증가시키면서 그레이스케일 강도를 측정하는 단계이다.In one aspect of the present invention, the step (d) is a step of measuring the grayscale intensity while increasing the applied AC frequency.
또한, 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (e)는 단계 (d)에서 교류주파수를 증가시키며 측정되는 그레이스케일 강도가 단계 (a)에서 선정된 인가 교류주파수에서의 그레이스케일의 평균값에 표준편차 3배를 더한 값보다 커지는 주파수(effective f co_NP)을 측정하는 단계이다.In addition, in one aspect of the present invention, the step (e) increases the AC frequency in step (d), and the measured grayscale intensity is the standard deviation of the average value of the grayscale at the applied AC frequency selected in step (a). This is a step of measuring a frequency (effective f co_NP ) that is greater than the value of 3 times added.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (a)는 상기 식 (1)을 이용해 클로시우스-모소티 인자(Clausius-Mossotti factor, CM factor)의 값을 0.5 내지 1.5로 하는 교류주파수를 선정하는 단계이다.In one aspect of the present invention, step (a) is a step of selecting an AC frequency having a value of the Closius-Mossotti factor (CM factor) of 0.5 to 1.5 using Equation (1). .
또한, 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (a)는 상기 식 (1)을 이용해 클로시우스-모소티 인자(Clausius-Mossotti factor, CM factor) 실수부의 값이 가장 큰 값에서 교류주파수를 선정하는 단계이다.In addition, in one aspect of the present invention, the step (a) is to select the AC frequency from the value of the real part of the Closius-Mossotti factor (CM factor) having the largest value using Equation (1). Step.
또한, 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (d)는 인가하는 교류주파수를 감소시키면서 그레이스케일 강도를 측정하는 단계이다.In addition, in one aspect of the present invention, the step (d) is a step of measuring the grayscale intensity while reducing the applied AC frequency.
또한, 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (e)는 단계 (d)에서 교류주파수를 감소시키며 측정되는 그레이스케일 강도가 단계 (a)에서 선정된 인가 교류주파수에서의 그레이스케일의 평균값에 표준편차 3배를 더한 값보다 커지는 주파수(effective f co_PN)을 측정하는 단계이다.In addition, in one aspect of the present invention, the step (e) reduces the AC frequency in step (d), and the measured grayscale intensity is the standard deviation of the average value of the grayscale at the applied AC frequency selected in step (a). This is a step of measuring the frequency (effective f co_PN ) that is greater than the value of 3 times added.
또한, 본 발명의 일 양태에서, effective f co_NP를 측정 직후 연속하여 effective f co_PN를 측정하는 단계를 실행할 수 있다.Furthermore, in one aspect of the invention, immediately after continuously measuring the effective f co_NP can execute the step of measuring the effective f co_PN.
본 발명의 일 양태에서, 측정된 교차주파수를 분석하는 단계를 더 포함하여 세포의 고유전기생리학적 특성을 분석할 수 있다.In one aspect of the present invention, it is possible to analyze the intrinsic electrophysiological characteristics of the cell further comprising the step of analyzing the measured crossover frequency.
또한, 본 발명의 일 양태에서, 측정된 교차주파수를 이용한 바이오센서, 바이오칩, 랩온어칩(lab-on-a-chip)을 제공할 수 있다.In addition, in one aspect of the present invention, it is possible to provide a biosensor, a biochip, and a lab-on-a-chip using the measured crossover frequency.
또한, 본 발명의 일 양태에서, 측정된 교차주파수를 이용한 세포의 흡착·분리 및 자기조립(self-assembly) 방법을 제공할 수 있다.In addition, in one aspect of the present invention, it is possible to provide a method of adsorption/separation and self-assembly of cells using the measured crossover frequency.
본 발명에 따른 (a) 세포에 인가하는 교류주파수(AC frequency)를 선정하는 단계; (b) 선정된 교류주파수에서 각 세포를 촬영하여 분석하는 단계; (c) 분석된 세포의 그레이스케일 강도(grayscale intensity)을 측정하는 단계; (d) 인가하는 교류주파수를 변화시키면서 주파수 변화에 따른 그레이스케일 강도를 측정하는 단계; 및 (e) 단계 (a)에서 선정된 교류주파수의 그레이스케일 강도와 단계 (d)에서 측정된 그레이스케일 강도를 비교하는 단계를 포함하는 세포의 교차주파수(cross-over frequency) 측정방법은 한 번의 시행을 통해 수백개의 세포에 대하여 유전영동힘 반응을 관찰할 수 있으며, 복잡한 전극위에서 촬영한 사진에 대해 세포궤적을 분석할 필요가 없으므로 분석과정이 단순화된다는 현저한 효과를 나타낸다. 또한, 측정된 세포의 교차주파수를 통해 세포의 전기생리학적 특성을 관측할 수 있다는 유용한 효과가 있다.(A) selecting an AC frequency to be applied to the cells according to the present invention; (b) photographing and analyzing each cell at the selected AC frequency; (c) measuring grayscale intensity of the analyzed cells; (d) measuring the grayscale intensity according to the frequency change while changing the applied AC frequency; And (e) comparing the grayscale intensity of the AC frequency selected in step (a) with the grayscale intensity measured in step (d). Through the implementation, it is possible to observe the dielectrophoretic response for hundreds of cells, and it has a remarkable effect that the analysis process is simplified since there is no need to analyze the cell trajectory for a picture taken on a complex electrode. In addition, there is a useful effect of being able to observe the electrophysiological properties of cells through the measured cross-frequency of cells.
도 1은 세포의 f co를 찾기 위한 유전영동힘 인가방법을 나타낸 도이다.
도 2는 f co_NP를 정의하기 위한 분석방법을 나타낸 도이다.
도 3은 f co_PN을 정의하기 위한 분석방법을 나타낸 도이다.
도 4는 CM(Clausius-Mossotti) 식에 근거하여 얻은 f co와 본 발명의 방법으로 얻은 f co_NP, f co_PN이 유사한 값을 얻을 수 있음을 확인한 도이다.
도 5는 전극 위 높이 9.8㎛에서의 전기장 세기 분포 및 MCF-7 세포의 DEP force vector 분포를 나타낸 도이다
도 6은 MCF-7 세포의 dielectric property를 기입하여 Clausius-Mossotti factor의 실수값(Re[CM])을 주파수에 따라 나타낸 도이다.
도 7은 인가하는 DEP force에 따른 세포의 위치를 나타낸 도이다.
도 8은 f co를 분석하기 위한 유전영동 실험 전 후 살아있는 세포의 비율을 나타낸 도이다.
도 9는 f co_NP 또는 f co_PN의 추정 실험 반복 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 세포의 trap 위치변화를 이용한 세포의 교차주파수 분석결과를 나타낸 도이다.
A : 인가하는 교류주파수의 변화에 따른 인위 윈도우 내 이미지의 grayscale intensity 평균값 분포
B : 인가교류주파수 변화에 따른 원형 모양의 전극 내 이미지의 grayscale intensity 평균값 분포
C : 도 10A에서 분석된 effective cross-over frequency의 히스토그램, 가우시안분포 평균 및 표준편차
D : 도 10B에서 분석된 effective cross-over frequency의 히스토그램, 가우시안분포 평균 및 표준편차1 is a diagram showing a method of applying a dielectrophoretic force to find f co of a cell.
2 is a diagram showing an analysis method for defining f co_NP.
3 is a diagram showing an analysis method for defining f co_PN.
4 is a diagram confirming that similar values can be obtained between f co obtained based on the CM (Clausius-Mossotti) equation and f co_NP and f co_PN obtained by the method of the present invention.
5 is a diagram showing the distribution of electric field strength and DEP force vector of MCF-7 cells at a height of 9.8 μm above the electrode.
6 is a diagram showing the real value (Re[CM]) of the Clausius-Mossotti factor according to frequency by writing dielectric properties of MCF-7 cells.
7 is a diagram showing the location of cells according to the applied DEP force.
8 is a diagram showing the percentage of living cells before and after a dielectrophoresis experiment for analyzing f co.
9 is a diagram showing a result of repeating an estimation experiment of f co_NP or f co_PN.
10 is a diagram showing the results of cross-frequency analysis of cells using a change in the trap position of the cells.
A: Distribution of the average grayscale intensity of the image in the artificial window according to the change of the applied AC frequency
B: Distribution of average grayscale intensity values of the image within the circular electrode according to the applied AC frequency change
C: Histogram of effective cross-over frequency analyzed in FIG. 10A, mean and standard deviation of Gaussian distribution
D: Histogram of effective cross-over frequency analyzed in FIG. 10B, mean and standard deviation of Gaussian distribution
이하에는, 본 발명의 실시예와 각 단계를 상세하게 설명하되, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 발명을 용이하게 실시할 수 있을 정도로 상세하게 설명하기 위한 것이지, 이로 인해 본 발명의 기술적인 사상 및 범주가 제한되지 않는다.Hereinafter, the embodiments of the present invention and each step will be described in detail, but this is for explaining in detail enough that one of ordinary skill in the art can easily carry out the invention. The technical spirit and scope of the invention are not limited.
본 발명에서, 하기 용어가 의미하는 바에 대해서 설명한다. 이는 발명을 이해하기 위한 것으로, 용어의 의미는 설명되는 바에 의해 제한되지 않고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하는 용어의 의미를 포함한다.In the present invention, the meaning of the following terms will be described. This is for understanding the invention, and the meaning of the term is not limited by what is described, and includes the meaning of the term commonly understood by one of ordinary skill in the art to which the present invention belongs.
“유전영동(Dielectrophoresis, DEP)”은 극성이 없는 입자가 불균일한 교류 전기장에 노출되었을 때 쌍극성(dipole)이 입자에 유도되며, 유도된 입자와 전기장 사이의 상호작용으로 인해 힘이 발생하며, 발생된 힘을 통해 세포가 분극화(polarization)되는 것을 말한다. 분극성(polarizability)이 입자 주위를 둘러싼 용액의 분극성보다 클 경우 입자는 전기장이 강한 곳으로 이동하고(양의 유전영동, positive DEP). 반대로 입자의 분극성이 용액의 분극성보다 작을 경우에 입자는 전기장의 세기가 약한 방향으로 이동한다(음의 유전영동, negative DEP).“Dielectrophoresis (DEP)” refers to dipoles being induced in the particles when non-polar particles are exposed to a non-uniform alternating current electric field, and forces are generated due to the interaction between the induced particles and the electric field. It refers to the polarization of cells through the generated force. If the polarizability is greater than that of the solution surrounding the particle, the particle moves to a strong electric field (positive dielectrophoresis, positive DEP). Conversely, when the polarization of the particles is less than that of the solution, the particles move in the direction of weak electric field strength (negative dielectrophoresis, negative DEP).
“CM factor”는 클로시우스-모소티 인자(Clausius-Mossotti factor)를 나타내는 것이다. 클로시우스-모소티 인자 모델(The CM factor model)에서 세포에 대한 전기모델을 단일 쉘 모델(single shell model)이라고 가정했을 때의 CM factor 식은 다음과 같다.“CM factor” refers to the Closius-Mossotti factor. In the Closius-Mossotti factor model, assuming that the electrical model for cells is a single shell model, the CM factor equation is as follows.
식 (1) : 
식 (2) : 
여기에서, 
“Re[CM]”은 클로시우스-모소티 인자(Clausius-Mossotti factor)의 실수부를 의미하고, 유전영동현상에서 세포를 움직이게 하는 힘의 방향을 결정하는 요소이다.“Re[CM]” means the real part of the Closius-Mossotti factor, and is an element that determines the direction of the force that moves the cell in the dielectrophoresis phenomenon.
DEP force에 영향을 받는 세포의 반응을 추정하기 위하여, 세포의 모양은 구라고 가정하고, 구형태를 가지는 입자에 대한 DEP force 식은 다음과 같다.In order to estimate the response of cells affected by DEP force, it is assumed that the shape of the cell is a sphere, and the DEP force equation for a particle having a sphere shape is as follows.
식 (3) : 
여기에서, FDEP는 유전영동힘(DEP force), εmedi는 미디움(medium)유전율, Re[CM]은 클로시우스-모소티 인자의 실수부, ERMS는 전기장의 제곱평균제곱근(root mean square, rms)을 나타낸다.Where F DEP is the DEP force, ε medi is the medium dielectric constant, Re[CM] is the real part of the Closius-Mossotti factor, and E RMS is the root mean square of the electric field. , rms).
본 발명은 (a) 세포에 인가하는 교류주파수(AC frequency)를 선정하는 단계; (b) 선정된 교류주파수에서 각 세포를 촬영하여 분석하는 단계; (c) 분석된 세포의 그레이스케일 강도(grayscale intensity)을 측정하는 단계; (d) 인가하는 교류주파수를 변화시키면서 주파수 변화에 따른 그레이스케일 강도를 측정하는 단계; 및 (e) 단계 (a)에서 선정된 교류주파수의 그레이스케일 강도와 단계 (d)에서 측정된 그레이스케일 강도를 비교하는 단계를 포함하는 세포의 교차주파수(cross-over frequency) 측정방법을 제공한다.The present invention comprises the steps of: (a) selecting an AC frequency to be applied to the cell; (b) photographing and analyzing each cell at the selected AC frequency; (c) measuring grayscale intensity of the analyzed cells; (d) measuring the grayscale intensity according to the frequency change while changing the applied AC frequency; And (e) comparing the grayscale intensity of the AC frequency selected in step (a) with the grayscale intensity measured in step (d). .
이어서, 상기에서 언급된 각 단계의 공정에 대하여 보다 상세하게 설명한다.Next, the process of each step mentioned above will be described in more detail.
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 단계 (a)에서 세포에 인가하는 교류주파수를 선정하는 단계는, 교류 주파수를 선정하기 위하여 유전영동 칩 위에 저수조를 올려둔 뒤, 세포를 포함하는 용액을 넣은 후 CCD 카메라를 이용하여 유전영동 칩 위에 올려진 세포를 관찰하는 단계를 포함한다. 또한, 상기 저수조는 폴리디메틸실록산(Polymethylsiloxane, PDMS)으로 만들어진 것일 수 있다.In one aspect according to the present invention, the step of selecting the AC frequency applied to the cells in step (a) includes placing a reservoir on the dielectrophoretic chip in order to select the AC frequency, and then adding a solution containing the cells. And observing the cells placed on the dielectrophoresis chip using a CCD camera. In addition, the water storage tank may be made of polymethylsiloxane (PDMS).
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 단계 (a)에서 교류주파수는 하기 식 (1)을 이용해 클로시우스-모소티 인자(Clausius-Mossotti factor, CM factor)의 값을 -1 내지 0으로 하는 교류주파수일 수 있다.In one aspect according to the present invention, the AC frequency in the step (a) is an AC frequency in which the value of the Closius-Mossotti factor (CM factor) is -1 to 0 using the following equation (1). Can be
식 (1) : 
식 (1)에서 
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 단계 (a)에서 교류주파수는 상기 식 (1)에서 클로시우스-모소티 인자의 실수부(Re[CM]) 값을 가장 낮게 하는 교류주파수일 수 있다. 세포의 CM factor의 값이 -0.5에 근접하는 경우 또는 가장 낮은 경우의 교류주파수에서 Negative 유전영동힘을 효과적으로 세포에 전달할 수 있어 세포의 교차주파수를 측정하는데 효율적이다. 보다 구체적으로, MCF-7 세포가 주어진 환경(세포를 둘러싼 버퍼의 전도도, 세포의 건강상태)에서 MCF-7세포의 전도도가 60μS/cm이고, 교류주파수가 1 kHz 일 때 가장 낮은 음의 Re[CM]을 나타낸다.In an aspect of the present invention, the AC frequency in step (a) may be an AC frequency that lowers the real part (Re[CM]) value of the Closius-Mossotti factor in Equation (1). When the value of the cell's CM factor is close to -0.5 or the lowest AC frequency, the negative dielectrophoretic force can be effectively transmitted to the cell, which is effective in measuring the cell's crossover frequency. More specifically, when MCF-7 cells are given the environment (conductivity of the buffer surrounding the cells, the healthy state of the cells), the conductivity of the MCF-7 cells is 60 μS/cm, and when the AC frequency is 1 kHz, the lowest negative Re[ CM].
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 단계 (a)에 이어서 인가하는 교류주파수의 조건을 계속 유지하여 세포의 움직임을 촬영 및 분석하는 단계를 통해 인가전압을 정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 인가하는 교류주파수의 조건을 유지하는 시간은 1분 내지 3분일 수 있으며, 인가하는 전압은 1 내지 3 Vp-p일 수 있으며, 하기 기준에 의해 변경될 수 있다. 보다 더 구체적으로, MCF-7 세포에 대하여 교류주파수를 2분동안 2 Vp-p 인가하여 세포의 움직임을 촬영 및 분석할 수 있다. 상기 세포의 움직임을 촬영 및 분석하여 세포가 원형모양의 전극 사이에 위치하며, 도 7에서와 같이 구심점을 중심으로 움직이는 것을 확인할 수 있다. 이 때 세포의 예상방향을 유한요소해법을 적용하여 Negative DEP 벡터를 나타낼 수 있다.In one aspect according to the present invention, it may further include the step of determining the applied voltage through the step of photographing and analyzing the motion of the cell by continuously maintaining the condition of the AC frequency applied subsequent to the step (a). More specifically, the time to maintain the condition of the applied AC frequency may be 1 minute to 3 minutes, and the applied voltage may be 1 to 3 V pp , and may be changed according to the following criteria. More specifically, the movement of the cells can be photographed and analyzed by applying an AC frequency of 2 V pp for 2 minutes to the MCF-7 cells. By photographing and analyzing the movement of the cells, it can be seen that the cells are located between the circular electrodes, and move around the centripetal point as shown in FIG. 7. At this time, a negative DEP vector can be expressed by applying the finite element solution to the predicted direction of the cell.
상기 인가 전압을 정하는 기준은 1) 세포가 전압에 약 2시간동안 노출된 이후 살아있는 세포들의 수가 약 90% 이상인지 여부, 2) 세포의 모양이 눈에 띄게 변화하지 않는지 여부, 3) 유전영동힘의 방향과 크기에 따라 세포가 잘 이동하는지 여부에 따라 인가 전압을 정할 수 있다. 또한, 인가전압은 세포가 포함된 용액의 구성성분에 따라 변화될 수 있다.The criteria for determining the applied voltage are 1) whether the number of living cells is greater than about 90% after being exposed to the voltage for about 2 hours, 2) whether the shape of the cell does not change noticeably, 3) dielectrophoresis The applied voltage can be determined depending on whether the cell moves well according to the direction and size of. In addition, the applied voltage may vary depending on the composition of the solution containing cells.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (b)는 유체 내에서 움직이는 세포의 위치를 상용화된 영상처리프로그램을 사용하여 세포의 위치를 분석하는 것을 의미하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 움직이는 세포의 위치좌표(x, y) 각각을 히스토그램으로 표현하고 가우시안분포(Gaussian distribution) 여부를 확인하는 것을 의미하는 것일 수 있다. 이 때, x, y 좌표에 대한 가우시안분포의 중앙값을 구심점으로 한다.In one aspect of the present invention, the step (b) may mean analyzing the location of the cell using a commercialized image processing program for the location of the cell moving in the fluid. More specifically, it may mean expressing each of the position coordinates (x, y) of a moving cell as a histogram and confirming whether a Gaussian distribution is present. At this time, the median of the Gaussian distribution with respect to the x and y coordinates is taken as the centripetal point.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (b)는 인위 윈도우 마스크(artificial window mask)를 정의하는 단계를 포함할 수 있다. 인위 윈도우 마스크는 각 세포의 구심점과 세포의 반지름을 사용하여 정의되고. ‘1’, ‘0’으로 구성되며, 구심점으로부터 세포의 반지름 안에 해당하는 영역을 ‘1’, 그 외의 영역을 ‘0’으로 하는 것을 말한다.In one aspect of the present invention, step (b) may include defining an artificial window mask. The artificial window mask is defined using the centripetal point of each cell and the radius of the cell. It is composed of ‘1’ and ‘0’, and refers to the area that falls within the radius of the cell from the centripetal point as ‘1’, and the other areas as ‘0’.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (c)의 그레이스케일 강도(grayscale intensity)는 분석된 세포를 이용한 인위 윈도우 마스크(artificial window mask)를 통해 그레이스케일 강도를 측정하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 인위 윈도우 마스크를 원본 세포촬영이미지와 합성하여 각 인위 윈도우 안에서 그레이스케일 강도의 평균과 표준편차를 측정하는 것일 수 있다. 그레이스케일 강도는 그레이스케일(grayscale)을 통해서 측정하며, 인가 교류주파수에서 세포는 인위 윈도우 내에 위치하므로 윈도우 내의 그레이스케일 강도는 가우시안분포를 따르게 된다. In one aspect of the present invention, the grayscale intensity in step (c) may be measuring the grayscale intensity through an artificial window mask using the analyzed cells. More specifically, the artificial window mask may be synthesized with the original cell photographed image to measure the average and standard deviation of grayscale intensities within each artificial window. Grayscale intensity is measured through grayscale, and since the cell is located in an artificial window at the applied AC frequency, the grayscale intensity within the window follows a Gaussian distribution.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (d)에서 인가하는 교류주파수를 증가시키면서 그레이스케일 강도를 측정하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 인가하는 교류주파수를 증가시키면서 세포의 움직임을 촬영하고 인위 윈도우 마스크와 합성하여, 그레이스케일 강도의 변화를 측정하는 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 인가하는 교류주파수의 시작 주파수는 버퍼의 조성이 바뀌어 미디움(medium)의 전도도가 변하는 경우 또는 약물에 의하여 세포의 전도도가 변하는 경우 변경될 수 있다. 시작 주파수는 시작주파수로 정하고자 하는 조건에서 대부분의 세포가 주어진 칩에서 가장 전기장의 세기가 가장 낮은 곳을 중심으로 고정되어 있는지 여부를 통해서 정할 수 있다. In one aspect of the present invention, it may be to measure the grayscale intensity while increasing the AC frequency applied in the step (d). More specifically, it may be to measure the change in grayscale intensity by photographing the movement of the cell while increasing the applied AC frequency and synthesizing it with an artificial window mask. In addition, the starting frequency of the applied AC frequency of the present invention may be changed when the composition of the buffer changes and the conductivity of the medium is changed, or when the conductivity of the cell is changed by the drug. The starting frequency can be determined by whether most of the cells are fixed around the lowest electric field strength in a given chip under the condition to be determined as the starting frequency.
단계 (e)는 추가로 주파수 변화에 따라 측정한 그레이스케일 강도를 상기 단계 (a)에서 인가하는 교류주파수에서의 그레이스케일 강도와 평균 및 표준편차를 각각 비교하는 것을 말한다. 보다 구체적으로 상기 단계 (a)에서의 그레이스케일 평균값에 표준편차를 3배를 더한 값보다 커지는 주파수 선정하는 것을 포함할 수 있다. Step (e) refers to comparing the grayscale intensity measured according to the frequency change with the grayscale intensity at the AC frequency applied in step (a), and the average and standard deviation, respectively. More specifically, it may include selecting a frequency that is greater than a value obtained by adding 3 times the standard deviation to the grayscale average value in step (a).
본 발명에서 “effective f co_NP” 는 상기 단계를 통해 측정되는 그레이스케일 강도의 비교를 통해서 측정되는 값으로, 단계 (d)에서 교류주파수를 증가시키며 측정되는 그레이스케일 강도가 단계 (a)에서 선정된 인가 교류주파수에서의 그레이스케일의 평균값에 표준편차 3배를 더한 값보다 커지는 주파수를 의미한다.In the present invention, “effective f co_NP ” is a value measured through comparison of the grayscale intensity measured through the above step, and the grayscale intensity measured by increasing the AC frequency in step (d) is selected in step (a). It means a frequency that is greater than the value obtained by adding 3 times the standard deviation to the average value of the gray scale at the applied AC frequency.
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 단계 (a)에서 교류주파수는 상기 식 (1)을 이용해 클로시우스-모소티 인자의 값을 0.5 내지 1.5로 하는 교류주파수일 수 있다.In one aspect according to the present invention, the AC frequency in step (a) may be an AC frequency in which the value of the Closius-Mossotti factor is 0.5 to 1.5 using Equation (1).
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 단계 (a)에서 교류주파수는 상기 식 (1)에서 클로시우스-모소티 인자의 실수부(Re[CM]) 값이 가장 큰 교류주파수일 수 있다. 세포의 CM factor의 값이 최소 0.5 이상인 경우 또는 가장 큰 교류주파수인 경우 Positive 유전영동힘을 효과적으로 세포에 전달할 수 있어 세포의 교차주파수를 측정하는데 효율적이다. 보다 구체적으로, MCF-7 세포가 주어진 환경(세포를 둘러싼 버퍼의 전도도, 세포의 건강상태)에서 MCF-7 세포의 전도도가 60μS/cm이고, 교류주파수가 41 kHz 일 때 비교적 큰 양의 Re[CM]을 나타낸다.In an aspect of the present invention, the AC frequency in step (a) may be an AC frequency having the largest value of the real part (Re[CM]) of the Closius-Mossotti factor in Equation (1). When the value of the cell's CM factor is at least 0.5 or the largest AC frequency, positive dielectrophoretic force can be effectively transmitted to the cell, which is effective in measuring the cell's crossover frequency. More specifically, when MCF-7 cells have a conductivity of 60 μS/cm and an AC frequency of 41 kHz in a given environment (conductivity of the buffer surrounding the cell, the healthy state of the cell), a relatively large amount of Re[ CM].
또한, 상기 단계 (a)에 이어서 인가하는 교류주파수의 조건을 계속 유지하여 세포의 움직임을 촬영 및 분석하는 단계를 통해 인가전압을 정하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 상기 세포의 움직임을 촬영 및 분석하여 세포가 원형모양의 전극 사이에 위치하며, 도 7에서와 같이 구심점을 중심으로 움직이는 것을 확인할 수 있다. 이 때 세포의 예상방향을 유한요소해법을 적용하여 Positive DEP 벡터를 나타낼 수 있다.In addition, it may further include the step of determining the applied voltage through the step of continuously maintaining the condition of the AC frequency applied subsequent to the step (a) to photograph and analyze the motion of the cell, and photograph the motion of the cell and By analysis, it can be seen that the cells are located between the circular-shaped electrodes, and move around the centripetal point as shown in FIG. 7. At this time, a positive DEP vector can be expressed by applying the finite element solution to the predicted direction of the cell.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (d)에서 인가하는 교류주파수를 감소시키면서 그레이스케일 강도를 측정하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 인가하는 교류주파수를 감소시키면서 세포의 움직임을 촬영하고 인위 윈도우 마스크와 합성하여, 그레이스케일 강도의 변화를 측정하는 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 인가하는 교류주파수의 시작 주파수는 버퍼의 조성이 바뀌어 미디움(medium)의 전도도가 변하는 경우 또는 약물에 의하여 세포의 전도도가 변하는 경우 변경될 수 있다. 시작 주파수는 시작주파수로 정하고자 하는 조건에서 대부분의 세포가 주어진 칩에서 가장 전기장의 세기가 가장 높은 곳을 중심으로 고정되어 있는지 여부를 통해서 정할 수 있다.In one aspect of the present invention, it may be to measure the grayscale intensity while reducing the AC frequency applied in the step (d). More specifically, it may be to measure the change in grayscale intensity by photographing the motion of the cell while reducing the applied AC frequency and synthesizing it with an artificial window mask. In addition, the starting frequency of the applied AC frequency of the present invention may be changed when the composition of the buffer changes and the conductivity of the medium is changed, or when the conductivity of the cell is changed by the drug. The starting frequency can be determined through whether most of the cells are fixed around the highest electric field strength in a given chip under the condition to be determined as the starting frequency.
단계 (e)는 추가로 주파수 변화에 따라 측정한 그레이스케일 강도를 상기 단계 (a)에서 인가하는 교류주파수에서의 그레이스케일 강도와 평균 및 표준편차를 각각 비교하는 것을 말한다. 보다 구체적으로 상기 단계 (a)에서의 그레이스케일 평균값에 표준편차를 3배를 더한 값보다 커지는 주파수 선정하는 것을 포함할 수 있다.Step (e) refers to comparing the grayscale intensity measured according to the frequency change with the grayscale intensity at the AC frequency applied in step (a), and the average and standard deviation, respectively. More specifically, it may include selecting a frequency that is greater than a value obtained by adding 3 times the standard deviation to the grayscale average value in step (a).
본 발명에서 “effective f co_PN” 은 상기 단계를 통해 측정되는 그레이스케일 강도의 비교를 통해서 측정되는 값으로, 단계 (d)에서 교류주파수를 감소시키며 측정되는 그레이스케일 강도가 단계 (a)에서 선정된 인가 교류주파수에서의 그레이스케일의 평균값에 표준편차 3배를 더한 값보다 커지는 주파수를 의미한다.In the present invention, “effective f co_PN ” is a value measured through comparison of the grayscale intensity measured through the above step, and the grayscale intensity measured by reducing the AC frequency in step (d) is selected in step (a). It means a frequency that is greater than the value obtained by adding 3 times the standard deviation to the average value of the gray scale at the applied AC frequency.
또한, 본 발명의 일 양태에서, effective f co_NP를 측정하는 단계 직후 연속하여 effective f co_PN를 측정하는 단계를 실행하는 교차주파수 측정방법일 수 있다.Furthermore, in one aspect of the invention, immediately after continuously measuring the effective f co_NP may be a cross-frequency measurement method for executing the step of measuring the effective f co_PN.
본 발명의 일 양태에서, 상기 측정방법으로 측정된 주파수를 분석하여 경향성을 파악하며, 이롤 통해 세포의 고유 전기생리학적 특성(electrophysiological properties)을 분석할 수 있다. 주어진 외부적 자극에 반응하여 세포의 세포막에서 발생되는 변화에 대한 해석이 가능하다. 세포계는 암 세포(cancer cell), 줄기세포(stem cell), 박테리아(bacteria), 바이러스(virus) 등 제한이 없으며, 고유 전기생리학적 특성을 밝힘으로써, 외부환경요인에 의한 세포의 변화를 구별할 수 있다. In one aspect of the present invention, a trend is identified by analyzing the frequency measured by the measurement method, and through this, the intrinsic electrophysiological properties of the cell can be analyzed. It is possible to interpret the changes that occur in the cell membrane of cells in response to a given external stimulus. The cell system is not limited, such as cancer cells, stem cells, bacteria, viruses, etc., and by revealing intrinsic electrophysiological characteristics, it is possible to distinguish changes in cells caused by external environmental factors. I can.
또한, 상기 측정방법에 의해 측정된 주파수 및 세포 고유전기생리학적 특성을 이용하여, 미세 유체 공학, 바이오 센서, 바이오칩, 랩온어칩(lab-on-a-chip)에 이용될 수 있다. 또한, 세포의 흡착 및 분리, 자기조립(self-assembly)에 이용될 수 있다.In addition, it can be used for microfluidic engineering, biosensors, biochips, and lab-on-a-chip by using the frequency and cell-specific electrophysiological characteristics measured by the above measurement method. In addition, it can be used for adsorption and separation of cells and for self-assembly.
이하에서는, 본 발명에 따른 교차주파수의 측정방법을 실시예를 들어 설명하기로 한다. 다만, 본 발명이 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, a method of measuring a crossover frequency according to the present invention will be described by way of example. However, the present invention is not limited by the following examples.
<실시예 1> <Example 1> ff co_NPco_NP 값의 측정 Measure of value
<실시예 1-1> 인가하는 교류주파수 선정<Example 1-1> Selection of applied AC frequency
실험을 위하여 유전영동 칩 위에 PDMS(Polydimethylsiloxane) 저수조를 올려둔 뒤, 세포가 포함된 용액을 넣고 커버글라스로 밀폐시켰다. 이후 Top view 방향에서 CCD(Charge Coupled Device) 카메라를 이용하여 칩 표면에 현미경 대물렌즈의 초점이 맞도록 조정하며, 세포가 칩 표면 위에 위치할 때까지 기다렸다.For the experiment, a PDMS (Polydimethylsiloxane) reservoir was placed on the dielectrophoresis chip, and then a solution containing cells was added and sealed with a cover glass. Afterwards, using a CCD (Charge Coupled Device) camera from the top view direction, the microscope objective lens was adjusted so that the focus of the microscope objective was aligned on the chip surface, and the cells waited until they were placed on the chip surface.
상기 식(1)에 근거하여 관측하고자 하는 세포의 CM factor 음의값이 -0.5 에 근접하거나 CM factor 값을 가장 낮게 하는 교류주파수를 선정하였다. MCF-7 세포는 주어진 환경(세포를 둘러싼 buffer의 conductivity, 세포의 건강상태)에서 AC 1 kHz 일때 가장 낮은 음의 Re[CM] 값을 가진다. (식(1)에서 MCF-7 cell, conductivity 60 μS/cm, Re[CM] 값 약 -0.5로 추정하였음)Based on Equation (1) above, the AC frequency at which the negative CM factor value of the cell to be observed approaches -0.5 or lowers the CM factor value was selected. MCF-7 cells have the lowest negative Re[CM] value at
해당 주파수(1 kHz)에서의 약 2분동안 2 Vp-p 인가 이후 인가주파수 조건을 계속 유지하고 약 100초동안의 움직임을 촬영 및 분석한 결과, 세포들은 원형모양의 전극 사이에 위치하며 도 2b와 같이 구심점을 중심으로 움직이는 것을 확인할 수 있었다(도7 Negative DEP 촬영사진). 세포가 negative 유전영동힘의 영향력을 받고 있으며, 이때의 세포의 예상방향을 유한요소해법을 적용하여 도 5 Negative DEP 벡터(초록색)으로 나타내었다. 이번 실험에서는 가장 살아있는 세포의 수가 많고, 인가 이후 세포의 모양의 변화가 적으며, 유전영동힘의 방향과 크기에 세포가 잘 반응하는 2.0 Vp-p를 설정하였다. After applying 2 V pp for about 2 minutes at the corresponding frequency (1 kHz), the condition of the applied frequency was maintained and the motion for about 100 seconds was photographed and analyzed. As a result, the cells are located between the circular electrodes and shown in Fig. 2b. Likewise, it could be confirmed that it moves around the centripetal point (Fig. 7 Negative DEP photograph). The cells are under the influence of the negative dielectrophoretic force, and the predicted direction of the cells at this time is shown as a negative DEP vector (green) in FIG. 5 by applying a finite element solution. In this experiment, the number of living cells is large, the shape of the cells is small after application, and 2.0 V pp was set to respond well to the direction and magnitude of the dielectrophoretic force.
<실시예 1-2> 선정한 교류주파수에서 각 세포의 구심점과 반지름 분석<Example 1-2> Analysis of the centripetal point and radius of each cell at the selected AC frequency
유체내에서 움직이는 세포의 위치를 상용화된 영상처리프로그램을 사용하여 세포의 위치를 분석하고, 움직이는 세포의 위치좌표(x, y) 각각을 히스토그램으로 표현하고 가우시안분포여부를 확인하였다 (도 2b). 이때의 x, y 좌표에 대한 가우시안분포도의 중앙값을 구심점이라고 정의하였다.The location of the moving cells in the fluid was analyzed using a commercialized image processing program, and each of the location coordinates (x, y) of the moving cells was expressed as a histogram, and the Gaussian distribution was confirmed (Fig. 2b). At this time, the median value of the Gaussian distribution plot for x and y coordinates was defined as the centripetal point.
<실시예 1-3> 세포의 그레이스케일 강도를 측정하여 <Example 1-3> By measuring the grayscale intensity of cells ff co_NPco_NP 측정 Measure
각 세포의 구심점과 세포의 반지름을 사용하여 artificial window mask 를 정의하였다. 정의한 window mask 는 ‘1’, ‘0‘ 으로 구성되며, 구심점으로부터 세포의 반지름 안에 해당하는 영역은 ‘1’, 그외는 ‘0’ 으로 하였다. 정의한 artificial window mask 를 원본 세포촬영이미지와 합성하여 각 artificial window 안에서 그레이스케일 강도 (grayscale intensity)의 평균과 표준편차를 기록하였다. The artificial window mask was defined using the centripetal point of each cell and the radius of the cell. The defined window mask is composed of ‘1’ and ‘0’, and the area within the radius of the cell from the centripetal point was set as ‘1’, and for others, ‘0’. The defined artificial window mask was synthesized with the original cellular image, and the average and standard deviation of grayscale intensity within each artificial window were recorded.
인가교류주파수를 증가시키면서(1 kHz → 41 kHz) 세포의 움직임을 촬영하고, 정의한 artificial window mask와 합성하여, 주파수 변화에 대한 각각의 artificial window 안에서의 그레이스케일 강도의 변화를 측정 및 비교하였다. 주파수변화에 따라 측정한 그레이스케일 강도들을 1 kHz 인가주파수에서의 평균 및 표준편차 그레이스케일 강도와 각각 비교하였다. 구체적으로 1 kHz 인가주파수에서의 그레이스케일의 평균값에 표준편차 3배를 더한 값보다 커지는 인가주파수를 해당 세포가 가지는 effective f co_NP로 하였다.While increasing the applied AC frequency (1 kHz → 41 kHz), the movement of the cells was photographed, synthesized with the defined artificial window mask, and measured and compared the change in grayscale intensity within each artificial window according to the frequency change. The grayscale intensities measured according to the frequency change were compared with the average and standard deviation grayscale intensities at the applied frequency of 1 kHz. Specifically, the applied frequency greater than the value obtained by adding 3 times the standard deviation to the average value of the grayscale at the applied frequency of 1 kHz was taken as the effective f co_NP of the cell.
<실시예 2> <Example 2> ff co_PNco_PN 값의 측정 Measure of value
<실험예 2-1> 인가하는 교류주파수 선정<Experimental Example 2-1> Selection of applied AC frequency
Negative 유전영동힘에 의한 effective f co_NP 측정 실험을 끝낸 직후에 이어서 effective f co_PN 을 정의하기 위한 실험을 진행하였다. Effective f co_NP measurement by negative dielectrophoretic force Immediately after completion of the experiment, effective f co_PN An experiment was conducted to define
식(1)에 근거하여 관측하고자하는 세포의 CM factor 의 양의값이 최소 +0.5 이상 또는 그 값이 가장 큰 교류주파수를 선정하였다. AC 41 kHz는 주어진 환경(세포를 둘러싼 buffer의 conductivity, 세포의 건강상태)에서 MCF-7의 양의 Re[CM] 값이 비교적 큰 주파수에 해당하였다(MCF-7 cell, conductivity 60 μS/cm, Re[CM] 값 약 0.8 으로 추정함). 해당 주파수(41 kHz)에서 움직임을 촬영 및 분석한 결과, 도 3b 와 같이 세포들은 원형모양의 전극안에 위치 및 움직이는것을 확인할 수 있었다. 이는 세포가 positive 유전영동힘의 영향력을 받고 있으며, 이때의 세포의 예상방향을 유한요소해법을 적용하여 도 5 Positive DEP 벡터(파랑색)으로 나타내었다.Based on Equation (1), the AC frequency where the positive value of the CM factor of the cell to be observed is at least +0.5 or higher was selected.
<실시예 2-2> 선정한 교류주파수에서 각 세포의 구심점과 반지름 분석<Example 2-2> Analysis of the centripetal point and radius of each cell at the selected AC frequency
유체내에서 움직이는 세포의 위치를 상용화된 영상처리프로그램을 사용하여 세포의 위치를 분석하고, 움직이는 세포의 위치좌표(x, y) 각각을 히스토그램으로 표현하고 가우시안분포여부를 확인하였다 (도 2b). 이때의 x, y 좌표에 대한 가우시안분포도의 중앙값을 구심점이라고 정의하였다.The location of the moving cells in the fluid was analyzed using a commercialized image processing program, and each of the location coordinates (x, y) of the moving cells was expressed as a histogram, and the Gaussian distribution was confirmed (Fig. 2b). At this time, the median value of the Gaussian distribution plot for x and y coordinates was defined as the centripetal point.
<실시예 2-3> 세포의 그레이스케일 강도를 측정하여 <Example 2-3> By measuring the grayscale intensity of cells ff co_PNco_PN 측정 Measure
선정한 교류 주파수(41 kHz) 에서 각 원형모양의 전극안에 위치한 그레이스케일 강도의 변화를 측정하였다. 해당 주파수(41 kHz)에서의 약 2분동안 인가 이후 인가주파수 조건을 계속 유지하고 약 100초동안 각 원형모양의 전극안에 위치한 그레이스케일 강도의 평균값을 관측한 결과는 도 3d와 같다. 각각의 평균 그레이스케일 강도의 분포는 가우시안분포를 따라 평균값과 표준편차를 가졌다.At the selected AC frequency (41 kHz), the change in grayscale intensity located in each circular electrode was measured. After application at the corresponding frequency (41 kHz) for about 2 minutes, the applied frequency condition is maintained and the average value of the grayscale intensity located in each circular electrode for about 100 seconds is observed as shown in FIG. 3D. Each distribution of average grayscale intensity had an average value and a standard deviation according to a Gaussian distribution.
인가교류주파수를 감소시키며(41 kHz → 1 kHz) 세포의 움직임을 촬영하고, 교류주파수 변화에 대한 각 원형모양의 전극안에 위치한 그레이스케일 강도의 변화를 측정 및 비교하였다. 주파수변화에 따라 측정한 그레이스케일 강도를 41 kHz 인가주파수에서의 그레이스케일 강도들과 각각 비교하였다. 구체적으로 41 kHz 인가주파수에서의 그레이스케일의 평균값에 표준편차 3배를 더한 값보다 커지는 인가주파수를 해당 세포가 가지는 effective f co_PN로 하였다.The motion of the cells was photographed while reducing the applied AC frequency (41 kHz → 1 kHz), and the change in grayscale intensity placed in each circular electrode against the change in AC frequency was measured and compared. The grayscale intensity measured according to the frequency change was compared with the grayscale intensity at 41 kHz applied frequency, respectively. Specifically, the applied frequency greater than the value obtained by adding 3 times the standard deviation to the average value of the grayscale at the applied frequency of 41 kHz was taken as the effective f co_PN of the cell.
<실시예 3> <Example 3> ff co_NPco_NP 및 And ff co_PNco_PN 값 측정결과 Value measurement result
약 150개 이상의 MCF-7 세포의 effective f co_NP는 10.97 kHz 에서 분포하며, effective f co_PN 는 7.05 kHz 에서 분포하였다. 해당 실험을 서로 다른 chip 에서 3번 반복하고 분석한 결과 역시 같은 값을 가지는 것으로 확인하여 반복되는 결과임을 확인하였다. 또한, 이 결과는 수식(1)에 근거한 f co 값과 유사함을 확인할 수 있다. The effective f co_NP of more than 150 MCF-7 cells was distributed at 10.97 kHz, and the effective f co_PN was distributed at 7.05 kHz. The experiment was repeated 3 times on different chips, and the result of analysis was also confirmed to have the same value, confirming that the result was repeated. In addition, it can be seen that this result is similar to the value of f co based on Equation (1).
해당 실험 및 분석방법을 적용하여 다른 세포(Hela, A549)의 effective f co_NP 및 f co_NP 의 결과는 도 4와 같으며 결과는 식(1)에 근거한 f co 값과 유사한 것을 확인하였다.By applying the corresponding experiment and analysis method, the results of effective f co_NP and f co_NP of other cells (Hela, A549) are as shown in FIG. 4, and the results were confirmed to be similar to the values of f co based on Equation (1).
따라서, 본 발명에 따라 측정된 MCF-7, Hela, A549 세포의 effective f co_NP, effective f co_PN 값은 수식을 통해 이론적으로 계산된 f co 값과 유사한 것을 확인하였다. Therefore, it was confirmed that the effective f co_NP and effective f co_PN values of the MCF-7, Hela, and A549 cells measured according to the present invention were similar to the theoretically calculated f co values through the equation.
Claims (16)
(b) 선정된 교류주파수에서 각 세포를 촬영하여 분석하는 단계;
(c) 분석된 세포의 그레이스케일 강도(grayscale intensity)을 측정하는 단계;
(d) 인가하는 교류주파수를 변화시키면서 주파수 변화에 따른 그레이스케일 강도를 측정하는 단계; 및
(e) 단계 (a)에서 선정된 교류주파수의 그레이스케일 강도와 단계 (d)에서 측정된 그레이스케일 강도를 비교하는 단계를 포함하는, 세포의 교차주파수(cross-over frequency) 측정방법.
(a) selecting an AC frequency applied to the cell;
(b) photographing and analyzing each cell at the selected AC frequency;
(c) measuring grayscale intensity of the analyzed cells;
(d) measuring the grayscale intensity according to the frequency change while changing the applied AC frequency; And
(e) Comprising the step of comparing the grayscale intensity of the AC frequency selected in step (a) with the grayscale intensity measured in step (d), a cross-over frequency measurement method of cells.
상기 단계 (a)는 하기 식 (1)을 이용해 클로시우스-모소티 인자(Clausius-Mossotti factor, CM factor)의 값을 -1 내지 0으로 하는 교류주파수를 선정하는 것을 특징으로 하는 세포의 교차주파수 측정방법:
식 (1) :
The method of claim 1,
The step (a) is a crossover frequency of cells, characterized in that an AC frequency having a value of -1 to 0 for a Closius-Mossotti factor (CM factor) is selected using Equation (1) below. How to measure:
Equation (1):
상기 단계 (a)는 상기 식 (1)을 이용해 클로시우스-모소티 인자(Clausius-Mossotti factor, CM factor) 실수부의 값을 가장 낮게 하는 교류주파수를 선정하는 것을 특징으로 하는 세포의 교차주파수 측정방법.
The method of claim 2,
The step (a) is a method for measuring the crossover frequency of cells, characterized in that the AC frequency that lowers the value of the real part of the Closius-Mossotti factor (CM factor) is selected using Equation (1). .
상기 단계 (b)는 각 세포를 촬영하여 세포의 위치를 분석하는 것을 특징으로 하는 세포의 교차주파수 측정방법.
The method of claim 1,
The step (b) is a method for measuring the cross-frequency of cells, characterized in that analyzing the location of the cells by photographing each cell.
상기 단계 (b)는 각 세포를 촬영하여 세포의 위치를 분석하여 각 세포의 구심점과 세포의 반지름을 사용하여 인위 윈도우 마스크(artificial window mask)를 정의하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포의 교차주파수 측정방법.
The method of claim 1,
The step (b) comprises the step of defining an artificial window mask using the centripetal point of each cell and the radius of the cell by analyzing the location of the cell by photographing each cell. How to measure frequency.
상기 단계 (b)는 각 세포를 촬영하여 세포의 위치를 분석하여 칩 표면 위에 식각 과정으로 제작한 원형구조물 내로 진입하는 특정 공정윈도우(fabricated window)를 정의하는 단계를 포함하는 것을 특징으로하는 세포의 교차주파수 측정방법.
The method of claim 1,
The step (b) comprises the step of defining a fabricated window that enters the circular structure produced by the etching process on the chip surface by photographing each cell and analyzing the location of the cell. Cross frequency measurement method.
상기 단계 (d)는 인가하는 교류주파수를 증가시키는 것을 특징으로 하는 세포의 교차주파수 측정방법.
The method of claim 1,
The step (d) is a cell cross-frequency measurement method, characterized in that increasing the applied AC frequency.
상기 단계 (e)는 단계 (d)에서 교류주파수를 증가시키며 측정되는 그레이스케일 강도가 단계 (a)에서 선정된 인가 교류주파수에서의 그레이스케일의 평균값에 표준편차 3배를 더한 값보다 커지는 주파수(effective f co_NP)를 측정하는 단계인 세포의 교차주파수 측정방법.
The method of claim 1,
In step (e), the AC frequency is increased in step (d), and the measured grayscale intensity is greater than the average value of the grayscale at the applied AC frequency selected in step (a) plus 3 times the standard deviation. Effective f co_NP) The method of measuring the cross-frequency of cells, which is the step of measuring.
상기 단계 (a)는 상기 식 (1)을 이용해 클로시우스-모소티 인자(Clausius-Mossotti factor, CM factor)의 값을 0.5 내지 1.5로 하는 교류주파수를 선정하는 것을 특징으로 하는 세포의 교차주파수 측정방법.
The method of claim 2,
The step (a) is the measurement of the crossover frequency of cells, characterized in that the AC frequency having a value of the Closius-Mossotti factor (CM factor) of 0.5 to 1.5 is selected using Equation (1). Way.
상기 단계 (a)는 상기 식 (1)을 이용해 클로시우스-모소티 인자(Clausius-Mossotti factor, CM factor) 실수부의 값이 가장 큰 값에서 교류주파수를 선정하는 것을 특징으로 하는 세포의 교차주파수 측정방법.
The method of claim 2,
In the step (a), the AC frequency is selected from the value of the real part of the Closius-Mossotti factor (CM factor) using Equation (1). Way.
상기 단계 (d)는 인가하는 교류주파수를 감소시키는 것을 특징으로 하는 세포의 교차주파수 측정방법.
The method of claim 1,
The step (d) is a cell cross-frequency measurement method, characterized in that reducing the applied AC frequency.
상기 단계 (e)는 단계 (d)에서 교류주파수를 감소시키며 측정되는 그레이스케일 강도가 단계 (a)에서 선정된 인가 교류주파수에서의 그레이스케일의 평균값에 표준편차 3배를 더한 값보다 커지는 주파수(effective f co_PN)을 측정하는 단계인 세포의 교차주파수 측정방법.
The method of claim 1,
In step (e), the AC frequency is reduced in step (d), and the measured grayscale intensity is greater than the average value of the grayscale at the applied AC frequency selected in step (a) plus 3 times the standard deviation. Effective f co_PN) is a method of measuring the cross-frequency of cells, which is the step of measuring.
여기에서, effective f co_PN는 단계 (d)에서 교류주파수를 감소시키며 측정되는 그레이스 케일 강도가 단계 (a)에서 선정된 인가 교류주파수에서의 그레이스케일의 평균값에 표준편차 3배를 더한 값보다 커지는 주파수인, 교차주파수 측정방법.
10. The method of claim 8, wherein the continuous measurement just after the effective f co_NP by executing the step of measuring the effective f co_PN,
Here, effective f co_PN is the frequency at which the measured grayscale intensity is greater than the average value of the grayscale at the applied AC frequency selected in step (a) plus 3 times the standard deviation by reducing the AC frequency in step (d). Phosphorus, cross-frequency measurement method.
A method of analyzing the electrophysiological properties of cells, further comprising the step of analyzing the measured crossover frequency according to the method of measuring the crossover frequency of claim 1.
측정된 교차주파수를 초과하거나 또는 그 미만의 주파수를 인가하는 단계를 포함하는 세포의 흡착·분리 방법.
Cross-frequency measurement step according to any one of claims 1 to 13; And
Cell adsorption/separation method comprising the step of applying a frequency greater than or less than the measured crossover frequency.
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