KR102224555B1 - Apparatus for manufacturing 3D tumor model - Google Patents

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Abstract

3차원 종양모델 제조 장치가 제공된다. 본 발명의 실시예에 따른 3차원 종양모델 제조 장치는 유상용액(oil phase solution)이 유입되는 제1유입부; 제조하고자 하는 3차원 종양모델과 관련된 세포를 포함하는 수상용액(oil phase solution)이 유입되는 제2유입부; 유상용액이 분리되어 유동되며, 일단에서 유상용액이 서로 반대방향으로 유동되는 분기 유로부; 수상용액이 유동되며, 분기 유로부와 교차하게 배치되는 수액 유로부; 분기 유로부 및 수액 유로부의 교차지점으로부터 수액 유로부의 반대측으로 연장 형성되며, 수상용액과 유상용액의 혼합에 의해 세포를 포함하는 세포 액적이 형성되는 연장 유로부; 세포 액적이 유동되는 액적 유로부; 및 세포 액적이 외측으로 유출되는 유출부를 포함한다. 이 때, 상기 세포를 포함하는 세포 액적은 소정 시간 배양 후에 상기 세포가 응집되어 3차원 종양모델로 형성되고, 최종 획득되는 3차원 종양모델의 크기가 목표하는 크기를 가질 수 있도록 상기 수상용액 및 상기 유상용액의 유속 및 상기 수상용액에 포함되는 세포의 농도가 제어될 수 있다. An apparatus for manufacturing a three-dimensional tumor model is provided. An apparatus for manufacturing a 3D tumor model according to an embodiment of the present invention includes: a first inlet through which an oil phase solution is introduced; A second inlet through which an oil phase solution containing cells related to the three-dimensional tumor model to be manufactured is introduced; A branch flow path through which the oily solution is separated and flows, and the oily solution flows in opposite directions at one end; An aqueous solution flow path through which the aqueous solution flows and is disposed to intersect with the branch flow path; An extension flow path part extending from an intersection of the branch flow path part and the infusion flow path part to the opposite side of the infusion flow path part, and in which cell droplets including cells are formed by mixing the aqueous solution and the oil phase solution; A droplet flow path through which cell droplets flow; And an outlet through which the cell droplets flow out. At this time, the cell droplets containing the cells are formed into a 3D tumor model by aggregation of the cells after culturing for a predetermined time, and the aqueous solution and the aqueous solution so that the size of the finally obtained 3D tumor model has a target size. The flow rate of the oil phase solution and the concentration of cells contained in the aqueous solution may be controlled.

Description

3차원 종양모델 제조 장치{Apparatus for manufacturing 3D tumor model} 3D tumor model manufacturing apparatus {Apparatus for manufacturing 3D tumor model}

본 발명은 3차원 종양모델 제조 장치에 관한 것으로, 특히, 3차원 종양의 대량 제조 및 균일한 크기 조절을 위한 3차원 종양모델 제조 장치에 관한 것이다. The present invention relates to an apparatus for manufacturing a 3D tumor model, and in particular, to an apparatus for manufacturing a 3D tumor model for mass manufacturing and uniform size control of a 3D tumor.

신약 대상 물질에 대한 약물 효용성을 판별하기 위하여 세포 모델을 이용하는 것이 일반적이며, 특히 3차원 형태의 세포의 경우 신약 대상 물질의 전달을 방해하는 요소로 작용하여 체내의 종양과 유사한 약물의 효용성을 검증할 수 있는 장점을 가진다. It is common to use a cell model to determine the effectiveness of a drug for a new drug. In particular, in the case of a three-dimensional cell, it acts as a factor that hinders the delivery of a new drug to verify the effectiveness of a drug similar to a tumor in the body. It has the advantage of being able to.

그러나 일반적인 세포는 2차원의 형태로 자라나는 특성을 가지고, 이렇게 자라난 2차원 형태의 세포는 상기 3차원 형태의 세포와는 물리적, 생물학적 특징이 달라, 신약 대상 물질에 대한 약물 효용성을 효과적으로 검증하기 어려운 문제가 있다. However, general cells have the characteristics of growing in a two-dimensional form, and the two-dimensional cells grown in this way have different physical and biological characteristics from the three-dimensional cells, making it difficult to effectively verify the effectiveness of drugs for new drugs. there is a problem.

이에 따라, 3차원 형태의 세포를 배양하는 기술이 개발되고 있으며, 현재까지 많이 사용되는 방법으로는 현적배양법(hanging drop), 마이크로 몰딩법(micromolding) 등이 있다. 한편, 이러한 현적배양용 제품으로 SpheroFilm(iN CYTO社), Perfecta3D(3D Biomatrix社) 등이 시판되고 있으나, 361well(SpheroFilm), 96 또는 384well(Perfecta3D) 등의 한정된 개수를 수작업을 통하여 제조하는 방식이므로 3차원 종양모델을 제조하기에는 한계가 있다. Accordingly, technologies for culturing three-dimensional cells are being developed, and methods that are widely used to date include hanging drop and micromolding. On the other hand, SpheroFilm (iN CYTO), Perfecta3D (3D Biomatrix), etc. are commercially available as such products for cultivation. There is a limit to manufacturing a three-dimensional tumor model.

따라서 이러한 3차원 종양모델 제조에 있어서의 낮은 생산성 문제를 해결하여 보다 효과적으로 3차원 종양모델을 제조하기 위한 기술이 필요한 상황이다.Therefore, there is a need for a technology to more effectively manufacture a 3D tumor model by solving the problem of low productivity in manufacturing such a 3D tumor model.

대한민국 등록특허 제10-1544391호Korean Patent Registration No. 10-1544391

상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해, 본 발명의 일 실시예는 액적을 이용하여 3차원 종양모델의 제조수율을 향상시킬 수 있는 동시에 3차원 종양모델의 크기를 균일하게 조절할 수 있는 3차원 종양모델 제조 장치를 제공하고자 한다.In order to solve the problems of the prior art as described above, an embodiment of the present invention uses droplets to improve the manufacturing yield of a 3D tumor model and at the same time, a 3D model capable of uniformly adjusting the size of a 3D tumor model. It is intended to provide an apparatus for manufacturing a tumor model.

위와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 측면에 따르면, 유상용액(oil phase solution)이 유입되는 제1유입부; 제조하고자 하는 3차원 종양모델과 관련된 세포를 포함하는 수상용액(oil phase solution)이 유입되는 제2유입부; 상기 유상용액이 분리되어 유동되며, 일단에서 상기 유상용액이 서로 반대방향으로 유동되는 분기 유로부; 상기 수상용액이 유동되며, 상기 분기 유로부와 교차하게 배치되는 수액 유로부; 상기 분기 유로부 및 상기 수액 유로부의 교차지점으로부터 상기 수액 유로부의 반대측으로 연장 형성되며, 상기 수상용액과 상기 유상용액의 혼합에 의해 상기 세포를 포함하는 세포 액적이 형성되는 연장 유로부; 상기 세포 액적이 유동되는 액적 유로부; 및 상기 세포 액적이 외측으로 유출되는 유출부를 포함하며, 상기 세포를 포함하는 세포 액적은 소정 시간 배양 후에 상기 세포가 응집되어 3차원 종양모델로 형성되고, 최종 획득되는 3차원 종양모델의 크기가 목표하는 크기를 가질 수 있도록 상기 수상용액 및 상기 유상용액의 유속 및 상기 수상용액에 포함되는 세포의 농도가 제어되는 3차원 종양모델 제조 장치가 제공된다. According to an aspect of the present invention for solving the above problems, the oil phase solution (oil phase solution) is introduced into the first inlet; A second inlet through which an oil phase solution containing cells related to the three-dimensional tumor model to be manufactured is introduced; A branch flow path through which the oily solution is separated and flows, and the oily solution flows in opposite directions at one end; An infusion fluid passage portion through which the aqueous solution flows and intersecting with the branch passage portion; An extension flow path part extending from an intersection of the branch flow path part and the sap flow path part to the opposite side of the sap flow path part, and in which cell droplets containing the cells are formed by mixing the aqueous solution and the oil phase solution; A droplet flow path through which the cell droplets flow; And an outlet through which the cell droplets flow outward, and the cell droplets including the cells are formed into a three-dimensional tumor model by aggregation of the cells after culturing for a predetermined time, and the size of the finally obtained three-dimensional tumor model is targeted. There is provided an apparatus for manufacturing a 3D tumor model in which the flow rate of the aqueous solution and the oily solution and the concentration of cells contained in the aqueous solution are controlled so as to have a size such as that.

일 실시예에서, 상기 3차원 종양모델 제조 장치는 상기 유상용액을 상기 제1유입부로 공급하는 제1실린지 펌프; 상기 수상용액을 상기 제2유입부로 공급하는 제2실린지 펌프; 및 상기 유상용액 및 상기 수상용액의 유속을 조절하도록 상기 제1실린지 펌프 및 상기 제2실린지 펌프를 제어하는 제어부를 더 포함할 수 있다.In one embodiment, the 3D tumor model manufacturing apparatus comprises: a first syringe pump for supplying the oil-phase solution to the first inlet; A second syringe pump supplying the aqueous solution to the second inlet; And a controller for controlling the first syringe pump and the second syringe pump to adjust the flow rates of the oil phase solution and the aqueous phase solution.

일 실시예에서, 상기 유상용액의 유속은 120~300㎕/min 이고, 상기 수상용액의 유속은 40~100㎕/min 이며, 상기 유상용액과 상기 유상용액의 유속비는 1:3일 수 있다. In one embodiment, the flow rate of the oil phase solution is 120 to 300 μl/min, the flow rate of the aqueous phase solution is 40 to 100 μl/min, and the flow rate ratio of the oil phase solution and the oil phase solution may be 1:3. .

일 실시예에서, 상기 수상용액에 포함되는 세포의 농도는 1.47×106 ~ 29.4×106 개/㎖일 수 있다. In one embodiment, the concentration of cells contained in the aqueous solution may be 1.47×10 6 ~ 29.4×10 6 cells/ml.

일 실시예에서, 상기 세포 액적은 그 직경이 50㎛ 이상 450㎛ 이하일 수 있다. In one embodiment, the cell droplet may have a diameter of 50 μm or more and 450 μm or less.

일 실시예에서, 상기 3차원 종양모델은 그 직경이 50-150㎛일 수 있다. In one embodiment, the 3D tumor model may have a diameter of 50-150 μm.

일 실시예에서, 상기 연장 유로부의 폭은 상기 분기 유로부, 상기 수액 유로부, 상기 액적 유로부의 폭보다 작을 수 있다. In one embodiment, the width of the extension flow path may be smaller than the width of the branch flow path, the fluid flow path, and the droplet flow path.

일 실시예에서, 상기 액적 유로부는 그 폭이 상기 연장 유로부로부터 곡선형상으로 확장될 수 있다.In one embodiment, a width of the droplet flow path portion may extend in a curved shape from the extended flow path portion.

일 실시예에서, 상기 세포는 암세포일 수 있다. In one embodiment, the cells may be cancer cells.

일 실시예에서, 상기 세포 액적은 24시간 배양되어 상기 3차원 종양모델이 형성될 수 있다.In one embodiment, the cell droplet may be cultured for 24 hours to form the 3D tumor model.

일 실시예에서, 상기 3차원 종양모델은 원심분리에 의해 상기 세포 액적의 외부로 배출될 수 있다.In one embodiment, the 3D tumor model may be discharged to the outside of the cell droplet by centrifugation.

일 실시예에서, 상기 수상용액의 유속(X1; ㎕/min)에 따른 상기 세포 액적의 직경(Y1; ㎛)은 하기의 수학식으로 산출될 수 있다; In one embodiment, the diameter of the cell droplet (Y1; ㎛) according to the flow rate (X1; µl/min) of the aqueous solution may be calculated by the following equation;

Y1 = - 0.9695 × X1 + 471.61 (R2 = 0.9866).Y1 =-0.9695 × X1 + 471.61 (R 2 = 0.9866).

일 실시예에서, 상기 세포 농도(X2; 개/㎖)에 따른 상기 세포 액적 내의 세포의 개수(Y2)는 하기의 수학식으로 산출될 수 있다; In one embodiment, the number of cells (Y2) in the cell droplet according to the cell concentration (X2; pcs/ml) may be calculated by the following equation;

Y2 = 3 × 10-5 × X2 - 16.687 (R2 = 0.9873).Y2 = 3 × 10 -5 × X2-16.687 (R 2 = 0.9873).

본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 종양모델 제조 장치는 수상용액과 유상용액의 혼합에 의해 종양모델을 형성하기 위한 세포가 내부에 포함된 액적을 연속적으로 형성함으로써, 3차원 종양모델을 용이하게 제조하는 동시에 다량으로 제조할 수 있으므로 3차원 종양모델의 제조수율을 향상시킬 수 있다. The apparatus for manufacturing a 3D tumor model according to an embodiment of the present invention continuously forms droplets containing cells for forming a tumor model by mixing an aqueous solution and an oily solution, thereby making it easier to form a 3D tumor model. Since it can be manufactured in a large amount at the same time, it is possible to improve the manufacturing yield of a 3D tumor model.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 종양모델 제조 장치는 수상용액과 유상용액의 유속 및 수상용액에 포함되는 세포의 농도를 조절함으로써 제조되는 세포 액적의 크기 및 세포의 응집에 의해 형성되는 다양한 크기의 3차원 종양모델을 균일하게 제조할 수 있다. In addition, the apparatus for manufacturing a three-dimensional tumor model according to an embodiment of the present invention is formed by the size of the cell droplets and the aggregation of the cells produced by controlling the flow rate of the aqueous solution and the oil phase solution and the concentration of cells contained in the aqueous solution. It is possible to uniformly manufacture 3D tumor models of various sizes.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 3차원 종양모델 제조 장치를 도시한 사시도,
도 2는 도 1의 A 영역에서 액적이 형성되는 과정을 개략적으로 도시한 도면,
도 3은 도 1의 A 영역의 확대도,
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 3차원 종양모델 제조 장치의 블록도,
도 5는 수상용액 및 유상용액의 유속에 따른 액적 직경 및 수율의 관계를 나타낸 그래프,
도 6은 수상용액의 세포 농도에 따른 액적 내 세포수의 관계를 나타낸 그래프,
도 7은 본 발명의 실시예에 따른 3차원 종양모델 제조 장치에 의해 제조되는 세포액적을 촬영한 이미지,
도 8은 도 7의 세포액적을 배양하여 형성된 3차원 종양모델을 촬영한 이미지,
도 9는 수상용액의 세포 농도에 따른 3차원 종양모델의 직경의 관계를 나타낸 그래프,
도 10은 수상용액의 세포 농도에 따른 3차원 종양모델을 촬영한 이미지이다. 1 is a perspective view showing a three-dimensional tumor model manufacturing apparatus according to an embodiment of the present invention,
FIG. 2 is a diagram schematically showing a process in which droplets are formed in area A of FIG. 1;
3 is an enlarged view of area A of FIG. 1;
4 is a block diagram of an apparatus for manufacturing a 3D tumor model according to an embodiment of the present invention;
5 is a graph showing the relationship between the droplet diameter and yield according to the flow rate of the aqueous solution and the oil phase solution,
6 is a graph showing the relationship of the number of cells in the droplet according to the cell concentration of the aqueous solution,
7 is an image of a cell droplet produced by a three-dimensional tumor model manufacturing apparatus according to an embodiment of the present invention,
8 is an image photographing a three-dimensional tumor model formed by culturing the cell droplets of FIG. 7;
9 is a graph showing the relationship of the diameter of the three-dimensional tumor model according to the cell concentration of the aqueous solution,
10 is an image of a three-dimensional tumor model according to the cell concentration of the aqueous solution.

이하, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 동일 또는 유사한 구성요소에 대해서는 동일한 참조부호를 붙였다.Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings so that those of ordinary skill in the art may easily implement the present invention. The present invention may be implemented in various different forms and is not limited to the embodiments described herein. In the drawings, parts irrelevant to the description are omitted in order to clearly describe the present invention, and the same reference numerals are assigned to the same or similar components throughout the specification.

이하에서는 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 따른 3차원 종양 모델 제조 장치를 보다 상세히 설명하도록 한다. 도 1은 본 발명의 실시예에 따른 3차원 종양모델 제조 장치를 도시한 사시도이고, 도 2는 도 1의 A 영역에서 액적이 형성되는 과정을 개략적으로 도시한 도면이며, 도 3은 도 1의 A 영역의 확대도이다. Hereinafter, an apparatus for manufacturing a 3D tumor model according to an embodiment of the present invention will be described in more detail with reference to the drawings. 1 is a perspective view showing an apparatus for manufacturing a 3D tumor model according to an embodiment of the present invention, FIG. 2 is a schematic view showing a process in which droplets are formed in area A of FIG. 1, and FIG. 3 is It is an enlarged view of area A.

도 1을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 종양 모델 제조 장치(10)는 액적 기반 마이크로 유체 시스템으로서, 몸체부(100), 제1유입부(110), 제1유로부(111), 제1분기 유로부(112), 제2분기 유로부(113), 제2유입부(120), 제2유로부(121), 제3유로부(131), 연장 유로부(132) 및 유출부(130)를 포함한다. Referring to FIG. 1, the apparatus 10 for manufacturing a 3D tumor model according to an embodiment of the present invention is a droplet-based microfluidic system, comprising: a body portion 100, a first inlet portion 110, and a first passage portion ( 111), the first branch passage part 112, the second branch passage part 113, the second inflow part 120, the second passage part 121, the third passage part 131, the extension passage part 132 ) And an outlet 130.

몸체부(100)는 3차원 종양 모델 제조 장치(10)의 몸체를 형성하며 투명한 재질을 포함하고, 전체적으로는 얇은 두께의 사각 칩(chip) 형상을 가질 수 있다.The body portion 100 forms the body of the 3D tumor model manufacturing apparatus 10, includes a transparent material, and may have a shape of a square chip having a thin thickness as a whole.

제1유입부(110)는 몸체부(100)의 일단에 형성되며, 몸체부(100)의 내부로 연결되는 개구부로 형성될 수 있다. 또한, 제1유입부(110)는 유상용액(200)이 유입될 수 있다. 여기서, 유상물질(200)은, 예를 들어, 3M 社의 Novec 7500 Engineered fluid 상에 5%의 농도로 Dolomite-microfludicis 社의 Pico Surf 2를 혼합한 것일 수 있다. The first inflow part 110 is formed at one end of the body part 100 and may be formed as an opening connected to the inside of the body part 100. In addition, the oil phase solution 200 may flow into the first inlet unit 110. Here, the oily substance 200 may be, for example, a mixture of Pico Surf 2 of Dolomite-microfludicis in a concentration of 5% on Novec 7500 Engineered fluid of 3M.

제1유로부(111), 제1분기 유로부(112) 및 제2분기 유로부(113)는 제1유입부(110)로부터 유입된 유상용액(200)이 유동될 수 있다. 여기서, 제1유로부(111)는 제1유입부(110)로부터 연장되며 지그재그형태로 형성될 수 있다.The oil solution 200 introduced from the first inflow part 110 may flow through the first flow path part 111, the first branch flow path part 112, and the second branch flow path part 113. Here, the first passage part 111 extends from the first inlet part 110 and may be formed in a zigzag shape.

제1분기 유로부(112) 및 제2분기 유로부(113)는 유상용액(200)이 분리되어 유동되는 분기 유로부이다. 즉, 제1분기 유로부(112) 및 제2분기 유로부(113)는 제1유로부(111)로부터 양측으로 분기되도록 배치될 수 있다. The first branch flow path part 112 and the second branch flow path part 113 are branch flow paths through which the oil phase solution 200 is separated and flowed. That is, the first branch passage part 112 and the second branch passage part 113 may be arranged to branch from the first passage part 111 to both sides.

여기서, 제1분기 유로부(112) 및 제2분기 유로부(113)는 대략 사각형 형상으로 형성될 수 있다. 따라서 제1분기 유로부(112) 및 제2분기 유로부(113)는 제1유입부(110)의 반대측에서 다시 통합될 수 있다. 즉, 제1분기 유로부(112) 및 제2분기 유로부(113)는 제2유로부(121) 및 제3유로부(131)과 연결될 수 있다. Here, the first branch flow path part 112 and the second branch flow path part 113 may have a substantially rectangular shape. Accordingly, the first branch flow path part 112 and the second branch flow path part 113 may be re-integrated at opposite sides of the first inflow part 110. That is, the first branch passage part 112 and the second branch passage part 113 may be connected to the second passage part 121 and the third passage part 131.

이때, 유상용액(200)은 제1분기 유로부(112) 및 제2분기 유로부(113)를 따라 분기된 후 제1유입부(110)의 반대측 일단에서 서로 반대 방향으로 혼합되도록 유동될 수 있다.At this time, the oil phase solution 200 may be branched along the first branch flow path part 112 and the second branch flow path part 113 and then flow to be mixed in opposite directions at one end opposite to the first inlet part 110. have.

제2유입부(120)는 제1유입부(110)와 소정 거리 이격되게 배치되며, 제1유입부(110)와 유사하게 몸체부(100)의 내부로 연결되는 개구부로 형성될 수 있다. 여기서, 제2유입부(120)는 제1분기 유로부(112) 및 제2분기 유로부(113)의 내측에 배치될 수 있다. 이러한 제2유입부(120)는 수상용액(300)이 인입될 수 있다. The second inlet portion 120 is disposed to be spaced apart from the first inlet portion 110 by a predetermined distance, and similar to the first inlet portion 110 may be formed as an opening connected to the inside of the body portion 100. Here, the second inflow part 120 may be disposed inside the first branch flow path part 112 and the second branch flow path part 113. The aqueous solution 300 may be introduced into the second inflow part 120.

이때, 수상용액(300)은 도 2 및 도 3에 도시된 바와 같이, 제조하고자 하는 3차원 종양모델과 관련된 세포를 포함할 수 있다. 여기서, 세포는 3차원 종양모델을 형성하기 위한 암세포일 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 일례로, 수상용액(300)에 포함되는 세포는 종양과 비교 실험을 위한 정상세포일 수도 있다. In this case, the aqueous solution 300 may include cells related to the 3D tumor model to be manufactured, as shown in FIGS. 2 and 3. Here, the cell may be a cancer cell for forming a three-dimensional tumor model, but is not limited thereto. For example, the cells included in the aqueous solution 300 may be normal cells for comparison experiments with tumors.

여기서, 수상용액(300)은 암 세포주를 세포 배양액 상에 단일 세포 단위로 혼합한 것일 수 있다. 일례로, 배양한 유방암 세포주(MCF-7)를 세포 배양액(Dullecco Modified Eagle Medium, Fatal Bonine Serum, L-Glutamine, Penicillin-Streptomycin) 상에 단일 세포 단위로 혼합한 것일 수 있다. Here, the aqueous solution 300 may be a mixture of cancer cell lines in a single cell unit on a cell culture solution. For example, the cultured breast cancer cell line (MCF-7) may be mixed in a single cell unit on a cell culture solution (Dullecco Modified Eagle Medium, Fatal Bonine Serum, L-Glutamine, Penicillin-Streptomycin).

제2유로부(121)는 수상용액(300)이 유동되는 수액 유로부로서, 일단은 제2유입부(120)에 연결되고, 타단은 제1분기 유로부(112) 및 제2분기 유로부(113)와 연결될 수 있다.The second flow path part 121 is a fluid flow path part through which the aqueous solution 300 flows, and one end is connected to the second inlet part 120, and the other end is the first branch flow path part 112 and the second branch flow path part. It can be connected with (113).

이때, 제2유로부(121)는 제1분기 유로부(112) 및 제2분기 유로부(113)와 수직으로 교차하게 배치될 수 있다.In this case, the second passage part 121 may be disposed to perpendicularly cross the first branch passage part 112 and the second branch passage part 113.

제3유로부(131)은 세포 액적(400)이 유동되는 액적 유로부로서, 일단이 연장 유로부(132)와 연결되며, 타단은 유출부(130)에 연결될 수 있다. 이러한 제3유로부(131)은 제2유로부(121)의 폭(W1)보다 큰 폭으로 형성될 수 있다. The third flow path 131 is a droplet flow path through which the cell droplets 400 flow, and one end is connected to the extension flow path 132 and the other end may be connected to the outlet 130. The third passage part 131 may be formed to have a larger width than the width W1 of the second passage part 121.

연장 유로부(132)는 일단이 제2유로부(121), 제1분기 유로부(112) 및 제2분기 유로부(113)와 연결되며, 타단은 제3유로부(131)에 연결될 수 있다. 즉, 연장 유로부(132)는 분기 유로부(112, 113)와 수액 유로부(121)의 교차지점으로부터 수액 유로부(121)의 반대측으로 연장형성될 수 있다.The extension flow path part 132 has one end connected to the second flow path part 121, the first branch flow path part 112, and the second branch flow path part 113, and the other end may be connected to the third flow path part 131. have. That is, the extension flow path portion 132 may extend from the intersection of the branch flow path portions 112 and 113 and the infusion flow passage portion 121 to the opposite side of the infusion flow passage portion 121.

이때, 제2유로부(121)와 연장 유로부(132)는 실질적으로 일직선 상에 배치되고, 제1분기 유로부(112) 및 제2분기 유로부(113)가 실질적으로 일직선 상에 배치될 수 있다. 또한, 제1분기 유로부(112) 및 제2분기 유로부(113)와 제2유로부(121) 및 연장 유로부(132)는 서로 수직인 방향으로 연결될 수 있다. 따라서 제1분기 유로부(112), 제2분기 유로부(113), 제2유로부(121) 및 연장 유로부(132)는 십자형 교차로 형태로 연결될 수 있다.At this time, the second flow path part 121 and the extended flow path part 132 are disposed on a substantially straight line, and the first branch flow path part 112 and the second branch flow path part 113 are disposed on a substantially straight line. I can. In addition, the first branch passage part 112 and the second branch passage part 113, the second passage part 121 and the extension passage part 132 may be connected in a direction perpendicular to each other. Accordingly, the first branch flow path part 112, the second branch flow path part 113, the second flow path part 121, and the extended flow path part 132 may be connected in the form of a cross-shaped intersection.

도 2 및 도 3에 도시된 바와 같이, 수상용액(300)과 유상용액(200)의 혼합에 의해 세포(301)를 포함하는 세포 액적(400)이 형성될 수 있다. As shown in FIGS. 2 and 3, a cell droplet 400 including cells 301 may be formed by mixing the aqueous solution 300 and the oily solution 200.

유출부(130)는 제3유로부(131)와 연결되어 세포 액적(400)이 외부로 유출될 수 있다. 여기서, 유출부(130)는 몸체부(100)의 내부로부터 외부로 개구된 개구부로 형성될 수 있다.The outflow part 130 is connected to the third passage part 131 so that the cell droplet 400 may be discharged to the outside. Here, the outlet portion 130 may be formed as an opening opening from the inside of the body portion 100 to the outside.

여기서, 상기 유로부들(111, 112, 121, 131, 132)은 폴리디메틸실록산(PDMS; polydimethylsiloxane) 폴리머로 형성될 수 있다. 이때, 세포 액적(400)의 형성을 보다 용이하게 하기 위하여, 3차원 종양 모델 제조 장치(10)의 유로부들에 대하여 소수성 처리를 수행할 수 있다.Here, the flow path portions 111, 112, 121, 131, and 132 may be formed of a polydimethylsiloxane (PDMS) polymer. In this case, in order to facilitate the formation of the cell droplet 400, hydrophobic treatment may be performed on the flow path portions of the 3D tumor model manufacturing apparatus 10.

일례로, 3차원 종양 모델 제조 장치(10)의 유로부들에 대하여 유리 발수 코팅제인 Pittsburgh Glass Works 社의 아쿠아펠(Aquapel)을 이용하여 소수성 처리를 수행하며, 유로부들의 재료인 PDMS 폴리머와 세포의 비정상적인 접착을 방지하기 위하여 BSA(Bovine Serum Albumin)을 처리할 수 있다. As an example, hydrophobic treatment is performed on the flow path parts of the 3D tumor model manufacturing apparatus 10 using Aquapel of Pittsburgh Glass Works, a glass water-repellent coating agent, To prevent abnormal adhesion, BSA (Bovine Serum Albumin) can be treated.

도 2에 도시된 바와 같이, 연장 유로부(132)의 폭(W3)은 제2유로부(121)의 폭(W1) 및 제1분기 유로부(112)와 제2분기 유로부(113)의 폭(W2)보다 작을 수 있다. 또한, 제3유로부(131)는 그 폭이 연장 유로부(132)로부터 곡선형상으로 확장되도록 형성될 수 있다.As shown in FIG. 2, the width W3 of the extension flow path part 132 is the width W1 of the second flow path part 121 and the first branch flow path part 112 and the second branch flow path part 113 It may be smaller than the width (W2) of. In addition, the third channel portion 131 may be formed such that its width extends from the extension channel portion 132 in a curved shape.

이에 의해, 수상용액(300)과 유상용액(200)이 교차하여 세포 액적(400)을 형성할 때, 제3유로부(131)로 유동하는 수상용액(300)의 흐름을 유상용액(200)에 의해 용이하게 끊음으로써 액적을 효과적으로 형성할 수 있다.Thereby, when the aqueous solution 300 and the oily solution 200 cross to form the cell droplet 400, the flow of the aqueous solution 300 flowing to the third flow path part 131 is controlled by the oily solution 200. Droplets can be effectively formed by being easily cut off by.

도 4는 본 발명의 실시예에 따른 3차원 종양모델 제조 장치의 블록도이다. 4 is a block diagram of an apparatus for manufacturing a 3D tumor model according to an embodiment of the present invention.

본 발명의 실시예에 따른 3차원 종양 모델 제조 장치(10)는 제어부(11), 제1실린지 펌프(12) 및 제2실린지 펌프(13)를 더 포함할 수 있다. The apparatus 10 for manufacturing a 3D tumor model according to an embodiment of the present invention may further include a control unit 11, a first syringe pump 12, and a second syringe pump 13.

제어부(11)는 유상용액(200) 및 수상용액(300)의 유속을 조절하도록 제1실린지 펌프(12) 및 제2실린지 펌프(13)의 펌프를 제어할 수 있다.The controller 11 may control the pumps of the first syringe pump 12 and the second syringe pump 13 to adjust the flow rates of the oil phase solution 200 and the aqueous phase solution 300.

제1실린지 펌프(12)는 유상용액(200)을 제1유입부(110)로 공급할 수 있다. 여기서, 제1실린지 펌프(12)는 튜브를 통하여 제1유입부(110) 및 유상용액(200)이 저장된 용기와 연결될 수 있다. 이러한 제1실린지 펌프(12)는 유상용액(200)의 절대 유속을 조절할 수 있다. The first syringe pump 12 may supply the oily solution 200 to the first inlet 110. Here, the first syringe pump 12 may be connected to a container in which the first inlet 110 and the oil phase solution 200 are stored through a tube. The first syringe pump 12 may adjust the absolute flow rate of the oil phase solution 200.

제2실린지 펌프(13)는 수상용액(300)을 제2유입부(120)로 공급할 수 있다. 여기서, 제2실린지 펌프(13)는 튜브를 통하여 제2유입부(120) 및 수상용액(300)이 저장된 용기와 연결될 수 있다. 이러한 제2실린지 펌프(13)는 수상용액(300)의 절대 유속을 조절할 수 있다.The second syringe pump 13 may supply the aqueous solution 300 to the second inlet 120. Here, the second syringe pump 13 may be connected to a container in which the second inlet 120 and the aqueous solution 300 are stored through a tube. The second syringe pump 13 may adjust the absolute flow rate of the aqueous solution 300.

상술한 바와 같은 3차원 종양 모델 제조 장치(10)에 세포(301)는 포함된 수상용액(300)과 유상용액(200)을 주입함으로써, 세포 액적(400)을 형성할 수 있다.The cell droplet 400 may be formed by injecting the aqueous solution 300 and the oil phase solution 200 included in the cells 301 into the 3D tumor model manufacturing apparatus 10 as described above.

즉, 제1유입부(110)를 통하여 유상용액(200)이 주입되면, 유상용액(200)은 제1유로부(111)로 유동된 후, 제1분기 유로부(112) 및 제2분기 유로부(113)를 통하여 분기된다. That is, when the oily solution 200 is injected through the first inflow part 110, the oily solution 200 flows to the first flow channel 111, and then the first branch flow path part 112 and the second branch It is branched through the flow path part 113.

이때, 제2유입부(120)를 통하여 세포(301)가 포함된 수상용액(300)이 주입되면, 수상용액(300)은 제2유로부(121)로 유동된다. At this time, when the aqueous solution 300 containing the cells 301 is injected through the second inlet 120, the aqueous solution 300 flows into the second flow passage 121.

도 2에 도시된 바와 같이, 제1분기 유로부(112) 및 제2분기 유로부(113)를 통해 유동된 유상용액(200)은 제2유로부(121)를 통해 유동된 수상용액(300)과 혼합된다. As shown in FIG. 2, the oil phase solution 200 flowed through the first branch flow path part 112 and the second branch flow path part 113 is the aqueous solution 300 flowed through the second flow path part 121. ) And mixed.

이때, 유상용액(200)은 수상용액(300)의 흐름과 수직한 방향으로 혼합되어 수상용액(300)의 흐름을 끊음으로써 세포 액적(400)이 형성될 수 있다. 형성된 세포 액적(400)은 제3유로부(131)를 통해 유출부(130)로 유동될 수 있다.At this time, the oil phase solution 200 is mixed in a direction perpendicular to the flow of the aqueous solution 300 to stop the flow of the aqueous solution 300, thereby forming a cell droplet 400. The formed cell droplet 400 may flow to the outlet portion 130 through the third passage portion 131.

이와 같이 생성된 세포 액적(400)은 24시간 배양될 수 있다. 여기서, 세포의 배양액은 세포 액적(400) 내에 포함될 수 있다. 일례로, 생성된 세포 액적(400)을 37.5℃, 5% CO2 농도 환경에서 24시간 배양할 수 있다. The cell droplet 400 generated as described above may be cultured for 24 hours. Here, the culture medium of cells may be included in the cell droplet 400. For example, the generated cell droplet 400 may be cultured for 24 hours in an environment of 37.5° C. and 5% CO 2.

이때, 세포 액적(400) 내의 세포(301)는 응집되어 3차원 종양모델이 생성될 수 있다. 이후에, 원심분리에 의해 세포 액적(400)으로부터 3차원 종양모델을 분리할 수 있다.At this time, the cells 301 in the cell droplet 400 may be aggregated to generate a three-dimensional tumor model. Thereafter, the three-dimensional tumor model can be separated from the cell droplet 400 by centrifugation.

한편, 수상용액(300) 및 유상용액(200)의 유속 및 수상용액(300)에 포함되는 세포(301)의 농도를 변화시키면서, 세포 액적의 제조수율 및 세포 액적(400)과 3차원 종양모델의 크기를 실험을 통해 관찰하였다. On the other hand, while changing the flow rate of the aqueous solution 300 and the oil phase solution 200 and the concentration of the cells 301 contained in the aqueous solution 300, the production yield of the cell droplet and the cell droplet 400 and the three-dimensional tumor model The size of was observed through the experiment.

먼저, 도 1 및 도 2에 도시된 바와 같은 3차원 종양 모델 제조 장치(10)를 제작하였다. 여기서, 몸체부(100)의 두께(t)는 150㎛이고, 액적 접합 부분인 연장 유로부(132)의 폭(W3)은 300㎛이며, 제1유로부(111)의 폭(W1)은 600㎛, 제1분기 유로부(112) 및 제2분기 유로부(113)의 폭(W2)은 400㎛로 하였다. First, an apparatus 10 for manufacturing a 3D tumor model as shown in FIGS. 1 and 2 was manufactured. Here, the thickness (t) of the body portion 100 is 150 μm, the width W3 of the extension passage portion 132 that is a droplet bonding portion is 300 μm, and the width W1 of the first passage portion 111 is The width W2 of the first branch flow path part 112 and the second branch flow path part 113 was set to 600 µm and 400 µm.

여기서 세포는 유방암 세포주(MCF-7)를 사용하였다. 이와 같은 세포를 10% v/v 태아 혈청, 100 U/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토 마이신 및 2 mM L-글루타민이 추가된 고급 DMEM/F12 기본 배지에서 배양하였다. 세포를 트립신(trypsin)-EDTA를 이용하여 분리하였다(모든 세포 시약은 Invitrogen 社(USA)에서 구입). Here, a breast cancer cell line (MCF-7) was used as the cells. These cells were cultured in high-grade DMEM/F12 basal medium supplemented with 10% v/v fetal serum, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin and 2 mM L-glutamine. Cells were isolated using trypsin-EDTA (all cell reagents are purchased from Invitrogen (USA)).

또한, 3차원 종양모델의 최종 직경을 결정하기 위해 MCF-7의 5가지 농도(1×, 2.5×, 5×, 10×, 20× 106 개/㎖)를 사용하였다. 세포-캡슐화 마이크로-액적을 형성하기 위해, 세포 현탁액을 수상용액으로 사용하였다. 세포 현탁액은 세포 배양 배지 및 현탁 암세포를 함유하였다. In addition, 5 concentrations of MCF-7 (1×, 2.5×, 5×, 10×, 20×10 6 cells/ml) were used to determine the final diameter of the 3D tumor model. To form cell-encapsulated micro-droplets, the cell suspension was used as an aqueous solution. The cell suspension contained cell culture medium and suspended cancer cells.

이때, 안정하고 균일한 마이크로 액적을 형성하기 위해 5% 희석된 계면 활성제(Pico-Surf™, Dolomite Microfluidics, Royston, UK)를 불소화 오일(Novec™ 7500, 3M, Maplewood, MN, USA)에 사용하였다. 계면 활성제는 플루오로 카본 캐리어 오일을 포함하는 화학 용액이다. At this time, 5% diluted surfactant (Pico-Surf™, Dolomite Microfluidics, Royston, UK) was used in fluorinated oil (Novec™ 7500, 3M, Maplewood, MN, USA) to form stable and uniform microdroplets. . The surfactant is a chemical solution containing a fluorocarbon carrier oil.

또한, 1H, 1H, 2H, 2H,-퍼플루오로(perfluoro)-1-옥타놀(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 사용하여 액적을 분열하여 24시간 배양 후 액적 내에 위치한 3D 종양 회전 타원체를 회수하였다. In addition, 1H, 1H, 2H, 2H, -perfluoro-1-octanol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) was used to divide the droplets and incubate for 24 hours, and then 3D located within the droplets. The tumor spheroid was recovered.

이때, 1H, 1H, 2H, 2H,-퍼플루오로-1-옥타놀을 액적 용액에 첨가하고 오일 상 용액과 부드럽게 혼합하였다. 배양 배지를 포함하는 상청액(supernatant) 및 방출된 회전 타원체를 원심 분리에 의해 혼합물 용액으로부터 분리하였다. 2차원 세포 단층의 형성을 방지할 뿐만 아니라 회전 타원체 사이의 예기치 않은 결합을 최소화하기 위해, 회전 타원체 및 배양 배지를 자기 교반(magnetic stirring)하에 통상적인 세포 배양 시스템(MCO-18 AC, Panasonic Healthcare Co., Ltd., Tokyo, Japan)에 옮겨 배양하였다. At this time, 1H, 1H, 2H, 2H,-perfluoro-1-octanol was added to the droplet solution and gently mixed with the oil phase solution. The supernatant containing the culture medium and the released spheroid were separated from the mixture solution by centrifugation. In order to prevent the formation of a two-dimensional cell monolayer as well as to minimize unexpected bonding between spheroids, spheroids and culture medium are subjected to a conventional cell culture system (MCO-18 AC, Panasonic Healthcare Co., Ltd.) under magnetic stirring. ., Ltd., Tokyo, Japan).

한편, 액적 내에 캡슐화된 MCF-7 세포를 생성하기 위해, 배양 배지에 현탁된 세포를 도 3에 도시된 바와 같은 수상용액으로 사용하였다. 이때, 유상용액(200) 및 수상용액(300)에 대한 다양한 유속하에서 세포를 액적으로 캡슐화하였다. Meanwhile, in order to generate MCF-7 cells encapsulated in droplets, cells suspended in the culture medium were used as an aqueous solution as shown in FIG. 3. At this time, the cells were encapsulated into droplets under various flow rates for the oily solution 200 and the aqueous solution 300.

여기서, 유상용액(200)의 유속은 20~100 ㎕/min이고, 수상용액(300)과 유상용액(200) 사이의 유속비는 1:3으로 고정하였다. Here, the flow rate of the oil phase solution 200 was 20-100 μl/min, and the flow rate ratio between the aqueous phase solution 300 and the oil phase solution 200 was fixed at 1:3.

도 5는 수상용액 및 유상용액의 유속에 따른 액적 직경 및 수율의 관계를 나타낸 그래프이다. 5 is a graph showing the relationship between the droplet diameter and yield according to the flow rate of the aqueous solution and the oil phase solution.

도 5에 도시된 바와 같이, 수상용액(300)에 대해 가장 느린 조건(20 ㎕/min)에서 액적 직경 및 생성 수율은 각각 451.5 ± 5.3㎛ 및 7㎐(초당 7개 생성)로 나타났다. 반면, 가장 빠른 조건(100 ㎕/min)에서, 액적 직경 및 생성 수율은 각각 370.5 ± 4.6㎛ 및 57㎐로 나타났다. As shown in FIG. 5, in the slowest condition (20 μl/min) for the aqueous solution 300, the droplet diameter and production yield were 451.5 ± 5.3 μm and 7 Hz, respectively (7 generations per second). On the other hand, in the fastest condition (100 μl/min), the droplet diameter and production yield were 370.5 ± 4.6 μm and 57 Hz, respectively.

이때, 액적 직경과 생성 수율은 반비례 관계로 나타났다. 즉, 액적 직경과 수상용액(300) 및 유상용액(200)의 유속은 반비례 관계이고, 생성 수율과 수상용액(300) 및 유상용액(200)의 유속은 비례 관계이다. At this time, the droplet diameter and the production yield appeared in an inverse relationship. That is, the droplet diameter and the flow rates of the aqueous phase solution 300 and the oil phase solution 200 are inversely proportional to each other, and the production yield and the flow rates of the aqueous phase solution 300 and the oil phase solution 200 are in a proportional relationship.

여기서, 액적의 직경이 450㎛를 초과하는 경우, 그 모양이 불규칙하게 형성되었다. 이는 액적의 크기가 크고 시린지 펌프에서 안정된 가장 느린 유속과 같은 실험 장비의 기계적 제한 때문이다. Here, when the diameter of the droplet exceeds 450 μm, the shape is irregularly formed. This is due to the mechanical limitations of the experimental equipment, such as the large droplet size and the slowest flow rate that is stable in the syringe pump.

더욱이, 액적 직경이 500㎛를 초과하는 경우, 액적들이 형태를 유지하지 못하고 합쳐지는 현상이 발생한다. Moreover, when the droplet diameter exceeds 500 μm, a phenomenon in which the droplets cannot maintain the shape and merge occurs occurs.

따라서 3차원 종양 모델 제조 장치(10)에 의해 생성되는 액적 직경은 50㎛ 이상 450㎛ 이하인 것이 바람직하다. 이때, 유상용액(200)의 유속은 120~300㎕/min 이고, 수상용액(300)의 유속은 40~100㎕/min인 것이 바람직하다. 여기서, 유상용액(200)과 수상용액(300)의 유속비는 1:3일 수 있다. Therefore, it is preferable that the droplet diameter generated by the 3D tumor model manufacturing apparatus 10 is 50 µm or more and 450 µm or less. At this time, the flow rate of the oil phase solution 200 is 120 to 300 μl/min, and the flow rate of the aqueous solution 300 is preferably 40 to 100 μl/min. Here, the flow rate ratio of the oil phase solution 200 and the aqueous phase solution 300 may be 1:3.

다음으로, 캡슐화된 세포의 수를 최대화하도록 설정된 가장 큰 액적 직경으로 분당 최소 1000개의 액적(16.7㎐)을 제조했다. 이때, 수상용액(300) 및 유상용액(200)의 유속은 각각 40 및 120 ㎕/min로 고정했다.Next, at least 1000 droplets (16.7 Hz) per minute were prepared with the largest droplet diameter set to maximize the number of encapsulated cells. At this time, the flow rates of the aqueous solution 300 and the oil phase solution 200 were fixed at 40 and 120 μl/min, respectively.

상기의 유속 조건에서, 세포 캡슐화된 마이크로-액적을 생성시켰다. Under the above flow conditions, cell encapsulated micro-droplets were produced.

이때, 각 마이크로-액적 내에 캡슐화된 세포의 평균 수를 결정하기 위해 MCF-7 샘플을 5가지 농도(1x, 2.5x, 5x, 10x 및 20x 106 개/㎖)로 준비하였다. At this time, in order to determine the average number of cells encapsulated in each micro-droplet, MCF-7 samples were prepared at five concentrations (1x, 2.5x, 5x, 10x and 20x 10 6 cells/ml).

각각의 경우, 액정 당 MCF-7 세포는 도 6에 도시된 바와 같이, 측정되었다. 도 6은 수상용액의 세포 농도에 따른 액적 내 세포수의 관계를 나타낸 그래프이다. In each case, MCF-7 cells per liquid crystal were measured, as shown in FIG. 6. 6 is a graph showing the relationship of the number of cells in a droplet according to the cell concentration of an aqueous solution.

도 6에 도시된 바와 같이, 세포의 농도에 따른 액적 당 MCF-7 세포수는 평균 500.3±39.9(20×106 개/㎖), 282.2±14.3(10×106 개/㎖), 89.4±15.0(5×106 개/㎖), 42.9±6.24(2.5×106 개/㎖), 17.5±3.81(1×106 개/㎖)개로 측정되었다. As shown in FIG. 6, the number of MCF-7 cells per droplet according to the concentration of cells was 500.3±39.9 (20×10 6 cells/ml), 282.2±14.3 (10×10 6 cells/ml), 89.4± Measurements were 15.0 (5×10 6 pieces/ml), 42.9±6.24 (2.5×10 6 pieces/ml), and 17.5±3.81 (1×10 6 pieces/ml).

이론적으로, 세포 농도에 따른 액적 당 예상 세포 수는 단일 액적의 세포 용액 부피에 기초하여 계산될 수 있다. 세포 농도 20×106 개/㎖ 및 액적 직경 400㎛인 경우, 각 액적에 대략 670개의 세포(약 33.5 nl/액적)가 캡슐화되는 것으로 예상했다. 모든 경우에 캡슐화된 세포의 수는 30-35% 감소했다. 이는 균질하지 않은 세포 현탁액을 초래하는 중력에 의한 세포 침강(sinking)과 세포가 일회용 주사기뿐 아니라 튜브 표면에 달라붙는 것에 기인한다. 본 실험에서, 손실된 세포는 평균 32.3%로 관찰되었다.In theory, the expected number of cells per droplet depending on the cell concentration can be calculated based on the cell solution volume of a single droplet. For a cell concentration of 20×10 6 cells/ml and a droplet diameter of 400 μm, it was expected that approximately 670 cells (about 33.5 nl/droplet) would be encapsulated in each drop. In all cases the number of encapsulated cells decreased by 30-35%. This is due to gravitational cell sinking and cell sticking to the tube surface as well as the disposable syringe resulting in an inhomogeneous cell suspension. In this experiment, the lost cells were observed with an average of 32.3%.

따라서 수상용액(300)에 포함되는 세포의 농도는 손실되는 세포수를 보상하여 1.47×106 ~ 29.4×106 개/㎖인 것이 바람직하다. 이때, 3차원 종양모델의 직경은 50~150㎛인 것이 바람직하다. Therefore, the concentration of cells contained in the aqueous solution 300 is preferably 1.47×10 6 ~ 29.4×10 6 cells/ml to compensate for the number of cells lost. At this time, the diameter of the three-dimensional tumor model is preferably 50 ~ 150㎛.

세포 응집은 지지 물질(supporting material)(SMovieclip1)에 나타난 바와 같이 처음 1시간 동안 관찰되었다. 콤팩트한 회전 타원체 형성은 액적 배양으로부터 3시간 후에 관찰되었다. 콤팩트한 회전 타원체의 회전 운동은 24시간의 배양 동안 관찰되었다.Cell aggregation was observed during the first hour as shown in the supporting material (SMovieclip1). Compact spheroid formation was observed after 3 hours from droplet culture. The rotational motion of the compact spheroid was observed during 24 hours of incubation.

도 7은 본 발명의 실시예에 따른 3차원 종양모델 제조 장치에 의해 제조되는 세포액적을 촬영한 이미지이고, 도 8은 도 7의 세포액적을 배양하여 형성된 3차원 종양모델을 촬영한 이미지이며, 도 9는 수상용액의 세포 농도에 따른 3차원 종양모델의 직경의 관계를 나타낸 그래프이고, 도 10은 수상용액의 세포 농도에 따른 3차원 종양모델을 촬영한 이미지이다. FIG. 7 is an image photographing a cell droplet manufactured by a three-dimensional tumor model manufacturing apparatus according to an embodiment of the present invention, and FIG. 8 is an image photographing a three-dimensional tumor model formed by culturing the cell droplet of FIG. 7, and FIG. 9 Is a graph showing the relationship of the diameter of the 3D tumor model according to the cell concentration of the aqueous solution, and FIG. 10 is an image photographed of the 3D tumor model according to the cell concentration of the aqueous solution.

액적에서 MCF-7의 형태 변화는 도 7 및 도 8에 도시된다. 도 7에서, 초기 농도를 갖는 세포를 포함하는 세포 액적은 배양에 의해 서로 응집된다. 도 8에서, 세포 응집에 의해 3차원 종양모델이 액적 내에 형성된다. The change in shape of MCF-7 in droplets is shown in FIGS. 7 and 8. In Fig. 7, cell droplets containing cells having an initial concentration are aggregated with each other by culture. In Fig. 8, a three-dimensional tumor model is formed in droplets by cell aggregation.

초기 세포-시드 액적 및 초기 세포 농도를 변화시키면서 이를 24시간 동안 배양하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, 직경이 각각 54.2, 73.4, 94.6, 123.2 및 148.3㎛인 3D 종양 회전 타원체 모델 내에 17.5, 42.9, 89.4, 282.2 및 500.3개의 세포가 각각 존재하였다(선형 곡선 피팅, R2 = 0.9936). It was incubated for 24 hours while changing the initial cell-seed droplet and the initial cell concentration. 9, 17.5, 42.9, 89.4, 282.2 and 500.3 cells were each present in the 3D tumor spheroid model with diameters of 54.2, 73.4, 94.6, 123.2 and 148.3 μm, respectively (linear curve fitting, R 2 = 0.9936).

도 10의 (a)~(e)에서, 초기 농도(1x, 2.5x, 5x, 10x 및 20x 106 개/㎖)의 세포를 포함하는 액적은 24시간 배양 후에 세포가 응집되어 3차원 종양모델이 형성된다. 도 9 및 도 10에 도시된 바와 같이, 세포 농도와 3차원 종양모델의 크기는 비례 관계를 나타낸다. In Figures 10 (a) to (e), droplets containing cells of initial concentration (1x, 2.5x, 5x, 10x and 20x 10 6 cells/ml) are agglomerated after 24 hours incubation, resulting in a three-dimensional tumor model. Is formed. 9 and 10, the cell concentration and the size of the 3D tumor model show a proportional relationship.

세포 캡슐화된 액적은 3일 후에 3D 회전 타원체 모델의 직경을 증가시켰다. 10×106 개/㎖의 경우, 3D 종양 회전 타원체 모델의 단일 세포가 제한된 공간에서 영양분과 가스 교환 또는 대사성 폐기물의 축적이 없기 때문에 36시간 후에 분리되기 시작했다. Cell encapsulated droplets increased the diameter of the 3D spheroid model after 3 days. In the case of 10×10 6 cells/ml, single cells of the 3D tumor spheroid model began to separate after 36 hours because there was no accumulation of nutrients and gas exchanges or metabolic waste products in a confined space.

또한, 동일한 이유로 20×106 개/㎖의 회전 타원체 형성 수율은 약 50%였다. 따라서 액적 배양의 시간 제한은 10×6 개/㎖ 세포의 경우에 24 시간이라는 것을 발견했다. 이러한 결과를 바탕으로, 하나의 단일 MCF-7 세포는 액적 내부에서 생존하기 위해 3.7 pL/h의 배양 배지가 요구된다. 이론적으로, 20×106 개/㎖는 450㎛ 직경의 마이크로-액적과 관련하여 44.7 nl의 배양 배지가 필요하다. Further, for the same reason, the yield of forming spheroids of 20×10 6 pieces/ml was about 50%. Therefore, it was found that the time limit for droplet culture was 24 hours in the case of 10×6 cells/ml cells. Based on these results, one single MCF-7 cell requires 3.7 pL/h of culture medium to survive inside the droplet. In theory, 20×10 6 cells/ml would require 44.7 nl of culture medium for 450 μm diameter micro-droplets.

도 6 및 도 9에 도시된 바와 같이, 3D 종양모델의 최종 직경은 단일 마이크로-액적에서 캡슐화된 세포의 수에 의해 결정될 수 있음을 알 수 있다. 6 and 9, it can be seen that the final diameter of the 3D tumor model can be determined by the number of cells encapsulated in a single micro-droplet.

결과적으로, 세포 액적(400)의 크기 및 세포(301)의 응집에 의해 형성되는 3차원 종양모델의 크기가 수상용액(300) 및 유상용액(200)의 유속 및 수상용액(300)에 포함되는 세포(301)의 농도에 따라 효과적으로 조절될 수 있다는 사실을 지득하였다. As a result, the size of the cell droplet 400 and the size of the three-dimensional tumor model formed by the aggregation of the cells 301 are included in the flow rate of the aqueous solution 300 and the oily solution 200 and the aqueous solution 300. It has been learned that it can be effectively controlled according to the concentration of the cells 301.

여기서, 도 5의 실험결과를 기초로, 수상용액(300)의 유속(X1)에 따른 세포 액적(400)의 직경(Y1)은 하기의 수학식으로 산출될 수 있다.Here, based on the experimental result of FIG. 5, the diameter Y1 of the cell droplet 400 according to the flow velocity X1 of the aqueous solution 300 may be calculated by the following equation.

Y1 = - 0.9695 × X1 + 471.61 (R2 = 0.9866)Y1 =-0.9695 × X1 + 471.61 (R 2 = 0.9866)

여기서, 세포 액적(400)의 직경(Y1)의 단위는 ㎛이고, 수상용액(300)의 유속(X1)의 단위는 ㎕/min이다.
상기 수학식부터 세포 액적(400)의 직경(Y1)이 수상용액(300)의 유속(X1)에 대하여 기울기가 음인 1차 함수 관계를 가짐을 알 수 있다. 이를 통해, 수상용액(300)의 유속(X1)이 클수록 최종 획득되는 3차원 종양 모델의 크기가 작아지도록 제어할 수 있다.Here, the unit of the diameter (Y1) of the cell droplet 400 is µm, and the unit of the flow rate (X1) of the aqueous solution 300 is µl/min.
From the above equation, it can be seen that the diameter Y1 of the cell droplet 400 has a linear function relationship in which the slope is negative with respect to the flow velocity X1 of the aqueous solution 300. Through this, the larger the flow rate X1 of the aqueous solution 300 is, the smaller the size of the finally obtained 3D tumor model can be controlled.

또한, 도 9의 실험결과를 기초로, 초기 세포의 농도(X2)에 따른 세포 액적(400) 내의 세포의 개수(Y2)는 하기의 수학식으로 산출될 수 있다. In addition, based on the experimental results of FIG. 9, the number of cells Y2 in the cell droplet 400 according to the initial cell concentration X2 may be calculated by the following equation.

Y2 = 3 × 10-5 × X2 - 16.687 (R2 = 0.9873)Y2 = 3 × 10 -5 × X2-16.687 (R 2 = 0.9873)

여기서, 세포의 농도(X2)의 단위는 개/㎖이다.
상기 수학식부터 세포 액적(400) 내의 세포의 개수(Y2)가 세포 농도(X2)에 대하여 기울기가 양인 1차 함수 관계를 가짐을 알 수 있다. 이를 통해, 액적에 포함되는 세포의 농도(X2)가 높을수록 3차원 종양모델의 크기가 커지도록 제어할 수 있다.Here, the unit of the concentration of cells (X2) is pcs/ml.
From the above equation, it can be seen that the number of cells (Y2) in the cell droplet 400 has a linear function relationship in which the slope is positive with respect to the cell concentration (X2). Through this, it is possible to control the size of the 3D tumor model to increase as the concentration (X2) of the cells contained in the droplet increases.

이와 같은 구성에 의해 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 종양모델 제조 장치는 3차원 종양모델을 용이하게 제조하는 동시에 다량으로 제조할 수 있으므로 3차원 종양모델의 제조수율을 향상시킬 수 있다. With such a configuration, the apparatus for manufacturing a 3D tumor model according to an embodiment of the present invention can easily manufacture a 3D tumor model and simultaneously manufacture in a large amount, thereby improving a manufacturing yield of a 3D tumor model.

또한, 본 발명은 제조되는 세포 액적의 크기 및 세포의 응집에 의해 형성되는 다양한 크기의 3차원 종양모델을 균일하게 제조할 수 있다. In addition, the present invention can uniformly manufacture a three-dimensional tumor model of various sizes formed by the size of the cell droplets to be produced and the aggregation of cells.

이상에서 본 발명의 일 실시예에 대하여 설명하였으나, 본 발명의 사상은 본 명세서에 제시되는 실시예에 제한되지 아니하며, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서, 구성요소의 부가, 변경, 삭제, 추가 등에 의해서 다른 실시예를 용이하게 제안할 수 있을 것이나, 이 또한 본 발명의 사상범위 내에 든다고 할 것이다.Although an embodiment of the present invention has been described above, the spirit of the present invention is not limited to the embodiments presented in the present specification, and those skilled in the art who understand the spirit of the present invention can add components within the scope of the same idea. Other embodiments may be easily proposed by changes, deletions, additions, etc., but it will be said that this is also within the scope of the present invention.

10 : 3차원 종양모델 제조 장치 100 : 몸체부
110 : 제1유입부 111 : 제1유로부
112 : 제1분기 유로부 113 : 제2분기 유로부
120 : 제2유입부 121 : 제2유로부
130 : 유출부 131 : 제3유로부
132 : 연장 유로부 200 : 유상용액
300 : 수상용액 301 : 세포
400 : 세포 액적 11 : 제어부
12 : 제1실린지 펌프 13 : 제2실린지 펌프10: 3D tumor model manufacturing device 100: body
110: first inflow part 111: first passage part
112: 1st quarter euro part 113: 2nd quarter euro part
120: second inflow part 121: second passage part
130: outflow part 131: 3rd passage part
132: extension flow path 200: oil phase solution
300: aqueous solution 301: cells
400: cell droplet 11: control unit
12: first syringe pump 13: second syringe pump

Claims (13)

3차원 종양모델 제조 장치로서,
유상용액(oil phase solution)이 유입되는 제1유입부;
제조하고자 하는 3차원 종양모델과 관련된 세포를 포함하는 수상용액(oil phase solution)이 유입되는 제2유입부;
상기 유상용액이 분리되어 유동되며, 일단에서 상기 유상용액이 서로 반대방향으로 유동되는 분기 유로부;
상기 수상용액이 유동되며, 상기 분기 유로부와 교차하게 배치되는 수액 유로부;
상기 분기 유로부 및 상기 수액 유로부의 교차지점으로부터 상기 수액 유로부의 반대측으로 연장 형성되며, 상기 수상용액과 상기 유상용액의 혼합에 의해 상기 세포를 포함하는 세포 액적이 형성되는 연장 유로부;
상기 세포 액적이 유동되는 액적 유로부; 및
상기 세포 액적이 외측으로 유출되는 유출부를 포함하며,
상기 세포를 포함하는 세포 액적은 소정 시간 배양 후에 상기 세포가 응집되어 3차원 종양모델이 상기 액적 내 형성되고,
최종 획득되는 3차원 종양모델의 크기가 목표하는 크기를 가질 수 있도록 상기 수상용액 및 상기 유상용액의 유속 및 상기 수상용액에 포함되는 세포의 농도 및 개수가 제어되되,
상기 세포 액적의 직경이 상기 수상 용액의 유속에 대하여 기울기가 음인 1차 함수 관계를 가져 상기 수상용액의 유속이 클수록 상기 최종 획득되는 3차원 종양 모델의 크기가 작아지도록 하고,
상기 세포 액적 내의 상기 세포의 개수가 상기 세포 농도에 대하여 기울기가 양인 1차 함수 관계를 가져 상기 액적에 포함되는 세포의 농도가 높을수록 상기 3차원 종양모델의 크기가 커지도록 하는 3차원 종양모델 제조 장치. As a three-dimensional tumor model manufacturing device,
A first inlet through which an oil phase solution is introduced;
A second inlet through which an oil phase solution containing cells related to the three-dimensional tumor model to be manufactured is introduced;
A branch flow path through which the oily solution is separated and flows, and the oily solution flows in opposite directions at one end;
An infusion fluid passage portion through which the aqueous solution flows and intersecting the branch passage portion;
An extended passage portion extending from an intersection of the branch passage portion and the infusion passage portion to the opposite side of the infusion passage portion, and forming a cell droplet containing the cells by mixing the aqueous phase solution and the oil phase solution;
A droplet flow path through which the cell droplets flow; And
And an outlet through which the cell droplets flow outward,
In the cell droplet containing the cells, the cells are aggregated after culturing for a predetermined time to form a three-dimensional tumor model in the droplet,
The flow rate of the aqueous phase solution and the oil phase solution, and the concentration and number of cells contained in the aqueous phase solution are controlled so that the size of the finally obtained 3D tumor model has a target size,
The diameter of the cell droplet has a negative slope with respect to the flow rate of the aqueous solution, so that the larger the flow rate of the aqueous solution, the smaller the size of the final 3D tumor model,
Preparation of a three-dimensional tumor model in which the number of cells in the cell droplet has a positive slope with respect to the cell concentration, so that the size of the three-dimensional tumor model increases as the concentration of cells contained in the droplet increases Device. 제1항에 있어서,
상기 유상용액을 상기 제1유입부로 공급하는 제1실린지 펌프;
상기 수상용액을 상기 제2유입부로 공급하는 제2실린지 펌프; 및
상기 유상용액 및 상기 수상용액의 유속을 조절하도록 상기 제1실린지 펌프 및 상기 제2실린지 펌프를 제어하는 제어부를 더 포함하는 3차원 종양모델 제조 장치. The method of claim 1,
A first syringe pump supplying the oil phase solution to the first inlet;
A second syringe pump supplying the aqueous solution to the second inlet; And
3D tumor model manufacturing apparatus further comprising a control unit for controlling the first syringe pump and the second syringe pump to adjust the flow rate of the oil phase solution and the aqueous solution. 제1항에 있어서,
상기 유상용액의 유속은 120~300㎕/min 이고,
상기 수상용액의 유속은 40~100㎕/min 이며,
상기 유상용액과 상기 유상용액의 유속비는 1:3인 3차원 종양모델 제조 장치. The method of claim 1,
The flow rate of the oil phase solution is 120 to 300 µl/min,
The flow rate of the aqueous solution is 40-100 µl/min,
The flow rate ratio of the oil phase solution and the oil phase solution is 1:3 3D tumor model manufacturing apparatus. 제1항에 있어서,
상기 수상용액에 포함되는 세포의 농도는 1.47×106 ~ 29.4×106 개/ml인 3차원 종양모델 제조 장치. The method of claim 1,
The concentration of cells contained in the aqueous solution is 1.47 × 10 6 ~ 29.4 × 10 6 /ml 3D tumor model manufacturing apparatus. 제1항에 있어서,
상기 세포 액적은 그 직경이 50㎛ 이상 450㎛ 이하인 3차원 종양모델 제조 장치. The method of claim 1,
The cell droplet is a three-dimensional tumor model manufacturing apparatus having a diameter of 50㎛ or more and 450㎛ or less. 제1항에 있어서,
상기 3차원 종양모델은 그 직경이 50~150㎛인 3차원 종양모델 제조 장치. The method of claim 1,
The three-dimensional tumor model is a three-dimensional tumor model manufacturing apparatus having a diameter of 50 ~ 150㎛. 제1항에 있어서,
상기 연장 유로부의 폭은 상기 분기 유로부, 상기 수액 유로부, 상기 액적 유로부의 폭보다 작은 3차원 종양모델 제조 장치. The method of claim 1,
The width of the extended flow path portion is smaller than the width of the branch flow path portion, the fluid flow path portion, and the droplet flow path portion. 제1항에 있어서,
상기 액적 유로부는 그 폭이 상기 연장 유로부로부터 곡선형상으로 확장되는 3차원 종양모델 제조 장치. The method of claim 1,
The droplet flow path portion is a three-dimensional tumor model manufacturing apparatus whose width is extended in a curved shape from the extending flow path portion. 제1항에 있어서,
상기 세포는 암세포인 3차원 종양모델 제조 장치. The method of claim 1,
The cell is a cancer cell 3D tumor model manufacturing apparatus. 제1항에 있어서,
상기 세포 액적은 24시간 배양되어 상기 3차원 종양모델이 형성되는 3차원 종양모델 제조 장치. The method of claim 1,
The cell droplets are cultured for 24 hours to form the three-dimensional tumor model. 제1항에 있어서,
상기 3차원 종양모델은 원심분리에 의해 상기 세포 액적의 외부로 배출되는 3차원 종양모델 제조 장치.The method of claim 1,
The 3D tumor model manufacturing apparatus is discharged to the outside of the cell droplet by centrifugation. 제1항에 있어서,
상기 수상용액의 유속(X1; ㎕/min)에 따른 상기 세포 액적의 직경(Y1; ㎛)은 하기의 수학식으로 산출되는 3차원 종양모델 제조 장치.
Y1 = - 0.9695 × X1 + 471.61 (R2 = 0.9866)The method of claim 1,
A three-dimensional tumor model manufacturing apparatus wherein the diameter (Y1; µm) of the cell droplet according to the flow rate (X1; µl/min) of the aqueous solution is calculated by the following equation.
Y1 =-0.9695 × X1 + 471.61 (R 2 = 0.9866) 제1항에 있어서,
상기 세포 농도(X2; 개/㎖)에 따른 상기 세포 액적 내의 세포의 개수(Y2)는 하기의 수학식으로 산출되는 3차원 종양모델 제조 장치.
Y2 = 3 × 10-5 × X2 - 16.687 (R2 = 0.9873)The method of claim 1,
The number of cells (Y2) in the cell droplet according to the cell concentration (X2; pcs/ml) is calculated by the following equation.
Y2 = 3 × 10 -5 × X2-16.687 (R 2 = 0.9873)
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