KR102217407B1 - Inertia based microfluidic intracellular delivery platforms and intracellular mass transfer method using the same - Google Patents

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KR102217407B1 KR1020190134095A KR20190134095A KR102217407B1 KR 102217407 B1 KR102217407 B1 KR 102217407B1 KR 1020190134095 A KR1020190134095 A KR 1020190134095A KR 20190134095 A KR20190134095 A KR 20190134095A KR 102217407 B1 KR102217407 B1 KR 102217407B1
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Abstract

본 발명은 관성을 기반으로 한 세포 내 전달 미세 유체 플랫폼에 관한 것으로, 구체적으로는 미세유체관 내에서 발생된 관성력과 관성 유동 현상을 이용하여 세포에 물리적인 변형 가해 세포막에 나노 구멍을 만들어 다양한 세포 내로 다양한 물질을 균일, 고효율로 전달할 수 있는 관성을 기반으로 한 세포 내 전달 미세 유체 플랫폼에 관한 것이다.
본 발명은 세포 내 전달 미세 유체 플랫폼으로서, 십자(十) 형태 또는 그 변형 형태의 미세유체 구조들을 이용하여 10 내지 1000의 유속(Re)에서 일어나는 세포와 벽의 충돌 및 세포와 관성 유동 현상과의 간섭 현상을 통해 세포를 변형시켜 세포 속으로 다양한 물질을 전달하는 것을 특징으로 하는 관성을 기반으로 한 세포 내 전달 미세 유체 플랫폼을 제공한다.The present invention relates to an intracellular delivery microfluidic platform based on inertia, and specifically, by physically deforming cells by using the inertial force and inertial flow phenomenon generated in the microfluidic tube to create nanopores in the cell membrane to make various cells It relates to an intracellular delivery microfluidic platform based on inertia that can uniformly and efficiently deliver various substances into the interior.
The present invention is an intracellular delivery microfluidic platform, using cross-shaped or modified microfluidic structures, the collision between the cell and the wall and the cell-to-inertial flow phenomenon occurring at a flow rate (Re) of 10 to 1000. It provides an intracellular delivery microfluidic platform based on inertia, characterized in that a cell is transformed through an interference phenomenon to deliver various substances into the cell.

Description

관성을 기반으로 한 세포 내 전달 미세 유체 플랫폼 및 이를 이용한 세포 내 물질 전달방법 {INERTIA BASED MICROFLUIDIC INTRACELLULAR DELIVERY PLATFORMS AND INTRACELLULAR MASS TRANSFER METHOD USING THE SAME}Intracellular delivery microfluidic platform based on inertia and intracellular material delivery method using the same {INERTIA BASED MICROFLUIDIC INTRACELLULAR DELIVERY PLATFORMS AND INTRACELLULAR MASS TRANSFER METHOD USING THE SAME}

본 발명은 관성을 기반으로 한 세포 내 전달 미세 유체 플랫폼에 관한 것으로, 구체적으로는 미세유체관 내에서 발생된 관성력과 관성 유동 현상을 이용하여 세포에 물리적인 변형 가해 세포막에 나노 구멍을 만들어 다양한 세포 내로 다양한 물질을 균일, 고효율로 전달할 수 있는 관성을 기반으로 한 세포 내 전달 미세 유체 플랫폼에 관한 것이다.The present invention relates to an intracellular delivery microfluidic platform based on inertia, and specifically, by physically deforming cells by using the inertial force and inertial flow phenomenon generated in the microfluidic tube to create nanopores in the cell membrane to make various cells It relates to an intracellular delivery microfluidic platform based on inertia that can uniformly and efficiently deliver various substances into the interior.

세포 내 물질 전달은 세포공학의 가장 기본이 되는 실험 중 하나로 보통 캐리어를 이용하거나 세포막/핵막에 나노구멍(nanopore)을 만들어 물질을 전달한다.Intracellular mass transfer is one of the most basic experiments in cell engineering, and transfers materials by using carriers or by making nanopores in the cell membrane/nuclear membrane.

바이러스 또는 Lipofectamine 중심의 캐리어 기법들은 최적화 시 고효율 물질 전달이 가능하나 안전성, 느린 전달 속도, 노동/비용 집약적인 캐리어 준비 과정, 낮은 재현성 등의 문제점들이 존재한다.Virus or Lipofectamine-centered carrier techniques enable highly efficient material delivery when optimized, but there are problems such as safety, slow delivery speed, labor/cost-intensive carrier preparation process, and low reproducibility.

이에 반하여 세포막에 에너지를 가하여 나노구멍을 만드는 방법들(예: Electroporation 또는 microneedle)은 상대적으로 여러 물질을 다양한 세포주로 전달이 가능한 장점이 있다.On the other hand, methods of making nanopores by applying energy to a cell membrane (eg, electroporation or microneedle) have the advantage of being able to deliver relatively different substances to various cell lines.

그러나 방법의 침습성으로 인한 낮은 세포 생존율, 전달 물질의 변성 그리고 낮은 처리량은 큰 한계로 지적되고 있다.(도 1 참고)However, due to the invasiveness of the method, low cell viability, denaturation of the delivery material, and low throughput are pointed out as major limitations (see FIG. 1).

이러한 문제점들을 해결하고자 대량의 세포처리가 가능한 미세유체기기들의 사용이 두드러진다. 대표적으로 미세관에 병목 구간을 만들고 세포들이 병목 구간을 지날 때 세포의 물리적 변형을 통해 세포막에 나노구멍을 만드는 플랫폼이 존재한다.In order to solve these problems, the use of microfluidic devices capable of processing a large amount of cells is remarkable. Representatively, there is a platform that creates a bottleneck in the microtubule and makes nanoholes in the cell membrane through physical transformation of cells when cells pass through the bottleneck.

그러나, 이 접근법은 실험 진행 시 병목 구간 자체가 막히고, 일정하지 못한 물질 전달 효율 등의 큰 단점들을 가진다.However, this approach has significant disadvantages such as clogging of the bottleneck itself and inconsistent mass transfer efficiency during the experiment.

따라서 상기 미체유체 기기의 높은 처리 기능을 살리면서 주요 세포 내에 다양한 물질을 균일하게 고효율로 전달할 수 있는 혁신적인 "차세대 세포 내 물질 전달 플랫폼"의 개발이 필요한 실정이다.Therefore, there is a need to develop an innovative "next-generation intracellular mass transfer platform" capable of uniformly and highly efficient delivery of various substances in major cells while utilizing the high processing function of the microfluidic device.

미국 공개번호 제2014-0287509호 (2014.09.25.)U.S. Publication No. 2014-0287509 (2014.09.25.)

본 발명은 전술한 바와 같은 종래의 여러 문제점들을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 어떠한 세포주에도 어떠한 물질을 균일하게 고효율로 전달할 수 있는 혁신적인 관성을 기반으로 한 세포 내 전달 미세 유체 플랫폼을 제공하는데 그 목적이 있다.The present invention has been devised to solve the various problems of the prior art as described above, and an object of the present invention is to provide an intracellular delivery microfluidic platform based on innovative inertia that can uniformly and efficiently deliver any material to any cell line have.

본 발명은 세포 내 물질 전달 플랫폼으로, 세포 및 전달물질을 포함하는 유체가 유동하는 제 1 채널; 상기 제 1 채널과 수직 교차하는 제 2 채널; 및 상기 제 1 채널에 일측에 구비되어 상기 제 1 채널에서의 유체 속도를 제 1 방향으로 제어하는 제1세포가속수단을 포함하며, 상기 제 1 채널에서의 유체는 상기 제 2 채널과 수직 교차하는 지점으로 대향하여 유동하며, 상기 세포가속수단은 상기 재 1 채널과 제 2 채널이 수직 교차하는 지점에 형성된 와류에 의하여 상기 세포에 나노구멍이 형성되는 수준의 세포벽 변형을 가하는 운동에너지를 상기 제 1 채널 상의 세포에 인가하는 것을 특징으로 한다.The present invention provides an intracellular mass transfer platform, comprising: a first channel through which a fluid including a cell and a transfer material flows; A second channel perpendicular to the first channel; And a first cell acceleration means provided on one side of the first channel to control a fluid velocity in the first channel in a first direction, wherein the fluid in the first channel perpendicularly crosses the second channel. It flows opposite to a point, and the cell acceleration means applies kinetic energy to the cell wall deformation at a level in which a nanopore is formed in the cell by a vortex formed at a point where the first channel and the second channel intersect vertically. It is characterized by applying to the cells on the channel.

특히, 상기 세포 내 전달 물질 전달 플랫폼은 상기 제 1 채널의 타측에 구비되어 상기 제 1 채널에서의 유체 속도를 제 2 방향으로 제어하는 제 2 세포가속수단을 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 제 1 세포가속수단과 제 2 세포가속수단은 서로 대향되는 방향으로 유체 속도를 제어하여, 제 1 채널과 제 2 체널과 수직 교차하는 지점에서 와류를 형성시킬 수 있고, 이때, 상기 유동하는 세포는 와류를 통과한 후 와류 붕괴(vortex breakdown)에 따라 또 다른 세포 변형이 일어나며, 상기 또 다른 세포 변형에 따라 상기 세포막에 형성된 나노구멍을 통하여 상기 전달물질이 세포 내로 또 다시 전달될 수 있다.In particular, the intracellular delivery material delivery platform may further include a second cell acceleration means provided on the other side of the first channel to control the fluid velocity in the first channel in a second direction. Specifically, the first cell acceleration means and the second cell acceleration means control the fluid velocity in a direction opposite to each other to form a vortex at a point perpendicular to the first channel and the second channel, and at this time, the flow After passing through the vortex, the cell undergoes another cell transformation according to the vortex breakdown, and the delivery material may be delivered into the cell again through the nanopores formed in the cell membrane according to the other cell transformation. .

한편, 세포에 형성되는 나노구멍은, 와류통과한 이후에 세포벽 변형이 일어나는 것일 수 있으며, 상기 세포 및 전달물질은 액적 형태로 상기 제 1 채널을 흐를 수 있다. 아울러, 상기 액적은 상기 전달물질 내에 상기 세포가 포함된 형태인 것일 수 있다.On the other hand, the nanopores formed in the cells may cause cell wall deformation after passing through the vortex, and the cells and the delivery material may flow through the first channel in the form of droplets. In addition, the droplet may have a form in which the cell is included in the delivery material.

상기 제 1 채널 내의 유체는 레이놀즈 계수 10~1000인 것일 수 있다.The fluid in the first channel may have a Reynolds coefficient of 10 to 1000.

나아가, 본 발명은 세포 내 물질 전달 플랫폼을 이용한 세포 내 물질 전달 방법을 제공한다.Furthermore, the present invention provides an intracellular mass transfer method using an intracellular mass transfer platform.

구체적으로, 상기 세포 내 물질 전달 플랫폼을 이용한 세포 내 물질 전달 방법은 상기 제 1 세포가속수단을 이용하여 세포 및 전달물질을 제 1 채널에서 제1방향으로 유동시키는 단계; 상기 제 1 채널과 제 2 채널이 수직 교차하는 지점에서 와류가 형성되어, 상기 제 1 채널에서 유동된 세포 및 전달물질은 제 2 채널로 유동시키는 단계; 및 상기 제 1 채널과 제 2 채널이 수직 교차하는 지점 이후 발생하는 세포 변형에 따라 세포막에 형성된 나노구멍을 통하여 상기 전달물질이 전달되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.Specifically, the intracellular mass transfer method using the intracellular mass transfer platform comprises: flowing the cells and the transfer material in a first direction in a first channel using the first cell acceleration means; A vortex is formed at a point where the first channel and the second channel vertically intersect, so that the cells and the delivery material flowing in the first channel flow to the second channel; And delivering the delivery material through the nanopores formed in the cell membrane according to cell deformation occurring after the point at which the first channel and the second channel vertically intersect.

보다 구체적으로, 상기 제 1 채널에서 유동된 세포 및 전달물질은 제 2 채널로 유동시키는 단계는, 제 1 채널의 타측에 설치되는 제 2 세포가속수단을 이용하여 상기 제 1 채널과 제 2 채널이 수직 교차하는 지점에서 와류가 형성되는 것을 특징으로 한다.More specifically, in the step of flowing the cells and the delivery material flowing in the first channel to the second channel, the first channel and the second channel are connected by using a second cell acceleration means installed on the other side of the first channel. It is characterized in that a vortex is formed at the point of vertical intersection.

아울러, 제1 세포가속수단 및 제 2 세포가속수단은 제 2 채널에서 와류(vortex)를 형성시키는 수준의 상기 세포에 인가하며, 상기 제 2 채널에 형성된 와류를 통과한 세포는 와류 붕괴(vortex breakdown)에 따라 또 다른 세포 변형이 일어나며, 상기 또 다른 세포 변형에 따라 형성된 세포막의 나노구멍을 통하여 상기 전달물질이 상기 세포 내로 전달시킬 수 있다.In addition, the first cell acceleration means and the second cell acceleration means are applied to the cells at the level of forming a vortex in the second channel, and the cells passing through the vortex formed in the second channel are vortex breakdown. ), another cell transformation occurs, and the delivery material may be delivered into the cell through the nanopores of the cell membrane formed according to the other cell transformation.

한편, 상기 세포 및 전달물질은 액적 형태일 수 있다.Meanwhile, the cells and delivery materials may be in the form of droplets.

본 발명에 따르면, 십자형('十'자형)의 미세채널에서의 유체 거동에 따라 관성력만을 이용하여 채널 내에서 와류를 형성하고, 상기 외류에 의해서 세포의 세포막/핵막에 균일한 나노 구멍(nanopore)들을 만들 수 있다. 이에 따라, 나노 구멍들을 통해 다양한 물질(예:유전자 가위 물질, 플라스미드, 나노 입자 등)을 바이러스와 같은 벡터 또는 능동 세포 전달 수단(예를 들어 전기장 등)을 사용하지 않음에도 불구하고 대량으로(분당 수백만 개 이상) 세포 속으로 전달할 수 있는 효과가 있다.According to the present invention, a vortex is formed in the channel using only inertial force according to the fluid behavior in a cross-shaped ('十'-shaped) microchannel, and a uniform nanopore in the cell membrane/nuclear membrane of the cell by the external flow. Can make them. Accordingly, various materials (eg, genetic scissors material, plasmids, nanoparticles, etc.) through the nano holes are transferred in large quantities (per minute) despite not using a virus-like vector or an active cell delivery means (eg, electric field, etc.) Millions or more) has the effect of being able to deliver into cells.

도 1은 최첨단 세포 내 전달 기술을 나열한 비교표이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼을 설명하는 도면이다.
도 3 내지 5는 본 발명의 일 실시예에 따란 상기 세포 내 물질 전달 플랫폼을 이용한 세포 내 물질 전달 방법을 설명하는 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 전달 플랫폼을 이용한 세포 전달 방법을 설명하는 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 십('+')자형 세포 내 물질 전달 플랫폼의 사진이다.
도 8은 본 발명의 일 실시에에 따라 제조된 십자형 세포 내 물질 전달 플랫폼의 세포 변형 메커니즘과 원리를 나타내는 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 실시에에 따라 제조된 십자형 세포 내 물질 전달 플랫폼의 정체점 근방에서의 관성 유동 분석을 나타낸 도면이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 십자형 세포 내 물질 전달 플랫폼에서의 와류 붕괴(Vortex breakdonw)에 의한 세포의 추가적 변형 유도와 그 분석 결과를 보여주는 도면이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 세포 내 물질 전달 플랫폼에서의 다양한 Dextran-FITC 크기의 전달 결과 유속에 따른 전달율 비교, 생존율 및 본 기법과 전기 천공법과의 비교한 결과를 보여주는 도면이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 세포 내 물질 전달 플랫폼에서의 200 nm 금 나노입자 전달과 전기천공법과의 비교한 결과를 보여주는 도면이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 세포 내 물질 전달 플랫폼에서의 다초점 현미경을 이용하여 200 nm 금 나노입자 전달 위치 확인 결과를 보여주는 사진이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 세포 내 물질 전달 플랫폼에서의 Doxorubicin이 로딩된 mesoporous silica nanoparticle 나노입자의 세포 내 전달과 그 효과 분석 그리고 보고하는 기법과 전기천공법과 비교한 결과를 보여주는 도면이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 세포 내 물질 전달 플랫폼에서의 K562 세포를 이용한 mRNA 전달 결과를 보여주는 그래프이다.1 is a comparison table listing state-of-the-art intracellular delivery technologies.
2 is a diagram illustrating an intracellular mass transfer platform according to an embodiment of the present invention.
3 to 5 are diagrams for explaining a method for delivering intracellular substances using the intracellular substance delivery platform according to an embodiment of the present invention.
6 is a diagram illustrating a cell delivery method using a cell delivery platform according to an embodiment of the present invention.
7 is a photograph of a mass transfer platform in a deca ('+') cell manufactured according to an embodiment of the present invention.
8 is a diagram showing a mechanism and principle of cell transformation of a cross-shaped intracellular mass transfer platform manufactured according to an embodiment of the present invention.
9 is a diagram showing an analysis of inertial flow in the vicinity of a stagnation point of a cruciform intracellular mass transfer platform manufactured according to an embodiment of the present invention.
FIG. 10 is a diagram showing the induction of additional transformation of cells due to Vortex breakdonw in the cruciform intracellular mass transfer platform prepared according to an embodiment of the present invention, and analysis results thereof.
FIG. 11 is a diagram showing a comparison of a delivery rate according to a flow rate, a survival rate, and a comparison result between the present technique and the electroporation method as a result of delivery of various Dextran-FITC sizes in the intracellular mass transfer platform prepared according to an embodiment of the present invention. .
FIG. 12 is a diagram showing a result of comparison between 200 nm gold nanoparticle delivery and electroporation in an intracellular mass transfer platform prepared according to an embodiment of the present invention.
13 is a photograph showing a result of confirming the delivery position of 200 nm gold nanoparticles using a multifocal microscope in the intracellular mass transfer platform prepared according to an embodiment of the present invention.
FIG. 14 is a diagram showing intracellular delivery of mesoporous silica nanoparticle nanoparticles loaded with Doxorubicin in the intracellular mass transfer platform prepared according to an embodiment of the present invention, an analysis and reporting of its effects, and a comparison result with the electroporation method It is a drawing.
15 is a graph showing the results of mRNA delivery using K562 cells in the intracellular mass transfer platform prepared according to an embodiment of the present invention.

이하, 본 발명에 따른 관성을 기반으로 한 세포 내 전달 미세 유체 플랫폼의 바람직한 실시예를 첨부한 도면들에 의거하여 상세히 설명한다. 참고로, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어와 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석해야만 한다. 또한, 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.Hereinafter, a preferred embodiment of an intracellular delivery microfluidic platform based on inertia according to the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings. For reference, terms and words used in the specification and claims should not be construed as being limited to their usual or dictionary meanings, and the inventors appropriately explain the concept of terms in order to describe their own invention in the best way. Based on the principle that it can be defined, it should be interpreted as a meaning and concept consistent with the technical idea of the present invention. In addition, the embodiments described in the present specification and the configurations shown in the drawings are only the most preferred embodiments of the present invention, and do not represent all the technical spirit of the present invention, so various alternatives that can be substituted for them at the time of application It should be understood that there may be equivalents and variations.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼을 설명하는 도면이다. 2 is a diagram illustrating an intracellular mass transfer platform according to an embodiment of the present invention.

도 2를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼은, 세포 및 전달물질을 포함하는 유체가 유동하는 제 1 채널(100); 상기 제 1 채널(100)과 수직 교차하는 제 2 채널(200); 및 상기 제 1 채널(100)에 일측에 구비되어 상기 제 1 채널(100)에서의 유체 속도를 제 1 방향으로 제어하는 제1세포가속수단(300)을 포함한다.2, the intracellular mass transfer platform according to an embodiment of the present invention includes a first channel 100 through which a fluid including cells and a transfer material flows; A second channel 200 perpendicular to the first channel 100; And a first cell acceleration means 300 provided at one side of the first channel 100 to control a fluid velocity in the first channel 100 in a first direction.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 제 1 채널(100)에서의 유체는 상기 제 2 채널(200)과 수직 교차하는 지점으로 대향하여 유동하며, 상기 제 1 세포가속수단(300)은 상기 재 1 채널(100)과 제 2 채널(200)이 수직 교차하는 지점에 형성된 와류에 의하여 상기 세포에 나노구멍이 형성되는 수준의 세포벽 변형을 가하는 운동에너지를 상기 제 1 채널(100) 상의 세포에 인가하는 것을 특징으로 한다.According to an embodiment of the present invention, the fluid in the first channel 100 flows oppositely to a point perpendicular to the second channel 200, and the first cell acceleration means 300 The kinetic energy applied to the cells on the first channel 100 to modify the cell wall at a level at which nanopores are formed in the cells by the vortex formed at the point where the first channel 100 and the second channel 200 intersect vertically Characterized in that.

이에 더하여, 상기 제 1 채널(100)의 타측에는 제 1 채널(100) 에서의 유체 속도를 제 2 방향으로 제어하는 제 2 세포가속수단(300') 을 더 포함할 수 있다.In addition, the other side of the first channel 100 may further include a second cell acceleration means 300 ′ for controlling the fluid velocity in the first channel 100 in a second direction.

특히, 제 1 채널(100) 에서 서로 반대방향에서 제어되는 제 1, 2 세포가속수단(300, 300') 제 1 채널(100)과 제 2 채널(200)이 서로 수직 교차하는 지점에서 와류가 형성될 수 있고, 이에 따라 발생되는 관성력과 관성 유동 현상에 의해서 세포에 물리적인 변형이 가해져 세포막이 변형될 수 있다.In particular, the first and second cell acceleration means (300, 300') controlled in opposite directions in the first channel (100) at the point where the first channel (100) and the second channel (200) cross each other vertically. It may be formed, and physical deformation is applied to the cell by the inertial force and the inertial flow phenomenon generated accordingly, so that the cell membrane may be deformed.

한편, 본 발명에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼은 핵산, 단백질, 전사인자, 벡터, 　프라스미드, 유전자 가위 물질, 나노입자 등을 전달할 수 있다. 다만, 이에 한정하는 것은 아니다.On the other hand, the intracellular material delivery platform according to the present invention may deliver nucleic acids, proteins, transcription factors, vectors, plasmids, genetic scissors material, nanoparticles, and the like. However, it is not limited thereto.

나아가, 상기 세포 내 물질 전달 플랫폼은 재생의학, 암면역치료, 유전자 편집이나 다른 분야로의 적용에 제한을 받지 않는다. Furthermore, the intracellular substance delivery platform is not limited to regenerative medicine, cancer immunotherapy, gene editing, or application to other fields.

도 3 내지 5는 본 발명의 일 실시예에 따란 상기 세포 내 물질 전달 플랫폼을 이용한 세포 내 물질 전달 방법을 설명하는 도면이다. 3 to 5 are diagrams for explaining a method for delivering intracellular substances using the intracellular substance delivery platform according to an embodiment of the present invention.

도 3을 참조하면, 상기 제 1 채널(100)에 상기 세포 및 전달물질을 포함하는 유체가 제 1 세포가속수단(300)에 의하여 유동된다. 이때, 상기 제 1 채널(100)의 타측에 형성된 제 2 세포가속수단(300') 또한 작동하여, 제 1 세포가속수단(300)에서 제어되는 유체와 마주보는 방향으로 전달물질을 유동시킬 수 있다.Referring to FIG. 3, the fluid containing the cells and the delivery material flows through the first channel 100 by the first cell acceleration means 300. At this time, the second cell acceleration means 300 ′ formed on the other side of the first channel 100 also operates, so that the delivery material can flow in a direction facing the fluid controlled by the first cell acceleration means 300. .

본 발명의 일 실시예에서 상기 전달 물질은 세포 내로 전달될 수 있는 모든 물질을 포함하며, 구체적으로, 유전자 가위 물질, 플라스미드, 핵산, 단백질, 나노입자 등이 이에 모두 해당될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the delivery material includes all materials that can be delivered into cells, and specifically, a genetic scissors material, a plasmid, a nucleic acid, a protein, a nanoparticle, etc. may all correspond to this.

도 4를 참조하면, 상기 제 1 세포가속수단(300)에 의하여 가속된 제 1 채널(100)의 세포는 상기 제 1 채널(100)의 타측에 연결된 제 2 세포가속수단(300)에 의해서 유동되는 유체와 충돌하게 된다. 이때 상기 세포에는 나노구멍이 형성되는데. 이때 상기 나노구멍을 통하여 상기 전달물질이 상기 세포 내로 전달된다. 따라서, 제 1, 2 세포가속수단(300, 300')은 상기 제 1 채널(100)의 세포에 나노구멍이 형성될 수준의 운동에너지를 인가하는 것이 바람직하다. 4, the cells of the first channel 100 accelerated by the first cell acceleration means 300 flow by the second cell acceleration means 300 connected to the other side of the first channel 100. It collides with the fluid to be used. At this time, nano holes are formed in the cells. At this time, the delivery material is delivered into the cell through the nanopores. Therefore, it is preferable that the first and second cell acceleration means 300 and 300 ′ apply kinetic energy to the cells of the first channel 100 at a level at which nanopores are formed.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 유체에 형성되는 와류를 지난 후 형성되는 와류붕괴(vortex breakdown)에 따른 와류붕괴에 따라 또 다른 세포 변형을 유도하게 된다. According to another embodiment of the present invention, another cell deformation is induced according to the vortex breakdown formed after passing through the vortex formed in the fluid.

도 5를 참조하면, 상기 제 1 채널(100)을 지나 제 2 채널(200)을 지나는 유체에는 와류가 형성되며, 세포가 정체점을 떠나면서 발생하는 와류붕괴에 따라 다시 한번 세포 변형이 일어난다. 이때 발생하는 또 다른 세포 변형에 따라 상기 세포막에 형성된 나노구멍을 통하여 상기 전달물질이 세포 내로 또 다시 전달되며, 이에 따라 세포 내 물질 전달 효율이 크게 향상된다. Referring to FIG. 5, a vortex is formed in the fluid passing through the first channel 100 and the second channel 200, and cell deformation occurs once again according to the eddy current collapse that occurs when the cells leave the stagnation point. In accordance with another cell transformation occurring at this time, the delivery material is delivered into the cell again through the nanopores formed in the cell membrane, thereby greatly improving the intracellular mass transfer efficiency.

한편, 제 1 채널(100) 과 제 2 채널(200)이 수직을 이루는 교차 지점에서는 와류에 의해서 정체가 이루어질 수 있으며, 이후 제 2 채널(200)로 빠져 나감에 따라 와류 붕괴 현상을 통해 추가적으로 세포를 변형시켜 더 높은 효율을 갖게 된다. On the other hand, at the intersection point where the first channel 100 and the second channel 200 are perpendicular to each other, stagnation may occur due to the eddy current, and as it exits the second channel 200, additional cells through the vortex collapse phenomenon Is transformed to have higher efficiency.

도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 전달 플랫폼을 이용한 세포 전달 방법을 설명하는 도면이다.6 is a diagram illustrating a cell delivery method using a cell delivery platform according to an embodiment of the present invention.

도 6을 참조하면, 세포 주입- 세포 정렬- 충돌- 세포 변형- 물질 전달을 관성과 관성 유동현상만을 이용하여 유도하며, 이로써 별도의 능동 세포 전달 수단을 사용하지 않고서도, 나노구멍들을 통해 다양한 물질(예:유전자 가위 물질, 플라스미드 등)을 바이러스와 같은 벡터의 사용하지 않음에도 불구하고 대량으로(분당 수백만 개 이상) 세포 속으로 전달한다. Referring to Figure 6, cell injection-cell sorting-collision-cell transformation-mass transfer is induced using only inertial and inertial flow phenomena, whereby various materials through nanopores without using a separate active cell transfer means. (E.g., genetic scissors material, plasmids, etc.) are delivered into cells in large quantities (more than millions per minute) despite the absence of vectors such as viruses.

도 7은 실제 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 十자형 세포 내 물질 전달 플랫폼의 사진이다. 7 is a photograph of a mass transfer platform in a cross-shaped cell manufactured according to an embodiment of the present invention.

본 발명의 일 실시예에서 상기 플랫폼 기기는 보통 포토리소그래피(photolithography) 공정을 통해서 SU-8 몰드 또는 실리콘 웨이퍼를 식각(etching)하여 본 발명에 따른 채널이 형성된 몰드를 먼저 만들었다. 이후 그리고 폴리디메틸실록산(PDMS)을 통해서 PDMS 기반 칩을 만들었으며, 이 때 만들어진 칩에 입구(inlet)와 출구(outlet)를 만들고, 일반 슬라이드 글래스와 플라즈마 처리를 이용하여(Cute, Femto Science, South Korea) 결합하여 플랫폼 기기를 제조하였다. 이후 만들어진 칩에 부유 상태의 세포들과 전달하고자 하는 물질을 혼합 후, 시린지 펌프를 사용하여 주입하게 된다. 이때 시린지 펌프의 유량 조절을 통해서 세포내 물질 전달을 컨트롤 할 수 있고, 전달 후, 원심분리기를 이용하여 세포만을 분리 후 다시 배양하거나 분석하거나 목적에 맞게 이용하게 하였다. In one embodiment of the present invention, the platform device first made a mold having a channel according to the present invention by etching an SU-8 mold or a silicon wafer through a photolithography process. After that, a PDMS-based chip was made through polydimethylsiloxane (PDMS), and an inlet and an outlet were made on the chip, and by using a general slide glass and plasma treatment (Cute, Femto Science, South Korea) to manufacture a platform device. After mixing the cells in the suspended state and the material to be delivered to the chip made, they are injected using a syringe pump. At this time, intracellular material delivery can be controlled by controlling the flow rate of the syringe pump, and after delivery, only the cells are separated using a centrifuge and then cultured again or analyzed or used according to the purpose.

도 8은 본 발명의 일 실시에에 따라 제조된 십자형 세포 내 물질 전달 플랫폼의 세포 변형 메커니즘과 원리를 나타내는 도면이다.8 is a diagram showing a mechanism and principle of cell transformation of a cross-shaped intracellular mass transfer platform manufactured according to an embodiment of the present invention.

도 8을 참조하면, 십자 형태의 채널에서 유속이 높을 경우 (Re> 37.9) 특이적인 spinal 유동 현상을 발견하였다. 특히, 세포는 채널 내에서 와륙 발생하여 소용돌이(spinal vertex) 속으로 빨려들어가는데, 이에 따라 도 8에 나타난 바와 같이, 제 2 채널(200)로 당겨지게된다.Referring to FIG. 8, when the flow velocity is high in the cross-shaped channel (Re> 37.9), a specific spinal flow phenomenon was found. In particular, the cells are vortexed in the channel and sucked into a vortex (spinal vertex), and accordingly, as shown in FIG. 8, the cells are pulled into the second channel 200.

도 9는 본 발명의 일 실시에에 따라 제조된 십자형 세포 내 물질 전달 플랫폼의 정체점 근방에서의 관성 유동 분석을 나타낸 도면이다. 도 9를 참조하면, 세포가 정체점을 떠나면서 와류붕괴(vortex breakdown) 때문에 다시 한번 큰 변형이 일어남을 발견하였다.9 is a diagram showing an analysis of inertial flow in the vicinity of a stagnation point of a cross-shaped intracellular mass transfer platform manufactured according to an embodiment of the present invention. Referring to FIG. 9, it was found that a large deformation occurs once again due to vortex breakdown as the cells leave the stagnation point.

도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 십자형의 세포 내 물질 전달 플랫폼에서의 와류 붕괴(Vortex breakdonw)에 의한 세포의 추가적 변형 유도와 그 분석 결과를 보여주는 도면이다.FIG. 10 is a diagram showing the induction of additional transformation of cells due to Vortex breakdonw in the cross-shaped intracellular mass transfer platform prepared according to an embodiment of the present invention and analysis results thereof.

도 10을 참조하면, 본 발명에 따라 제조된 십자형의 세포 내 물질 전달 플랫폼에 의해서 세포는 와류 붕괴에 의하여 세포가 변형된 것을 보여주며, 특히, 레이놀수에 따라 세포가 변형되는 정도를 보여준다. 이는, 레이놀수가 높을 수록 세포의 변형이 많이 일어나는 것을 보여준다.Referring to FIG. 10, it is shown that the cells are deformed by vortex collapse by the cross-shaped intracellular mass transfer platform prepared according to the present invention, and in particular, the degree of cell deformation according to the Reynol number is shown. This shows that the higher the Reynol number, the more cell deformation occurs.

도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 세포 내 물질 전달 플랫폼에서의 다양한 Dextran-FITC 크기의 전달 결과 유속에 따른 전달율 비교, 생존율 및 본 기법과 전기 천공법과의 비교한 결과를 보여주는 도면이다.FIG. 11 is a diagram showing a comparison of a delivery rate according to a flow rate, a survival rate, and a comparison result between the present technique and the electroporation method as a result of delivery of various Dextran-FITC sizes in the intracellular mass transfer platform prepared according to an embodiment of the present invention. .

도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼에서의 와류 붕괴를 이용하여 FITC-Dextran, Plasmid DNA, mRNA, siRNA, q-dot, gold nanopartice, functional nanoparticle (MSN), CRISPR-Cas9, shRNA 등의 다양한 물질들을 효과적으로 전달할 수 있는 것을 보여준다.11 is FITC-Dextran, Plasmid DNA, mRNA, siRNA, q-dot, gold nanopartice, functional nanoparticle (MSN), CRISPR-Cas9 using vortex collapse in the intracellular mass transfer platform according to an embodiment of the present invention. It shows that it can effectively deliver various substances such as, shRNA.

도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 세포 내 물질 전달 플랫폼에서의 200 nm 금 나노입자 전달과 전기천공법과의 비교한 결과를 보여주는 도면이다.FIG. 12 is a diagram showing a result of comparison between 200 nm gold nanoparticle delivery and electroporation in an intracellular mass transfer platform prepared according to an embodiment of the present invention.

도 13은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 세포 내 물질 전달 플랫폼에서의 다초점 현미경을 이용하여 200 nm 금 나노입자 전달 위치 확인 결과를 보여주는 사진이다.13 is a photograph showing a result of confirming the delivery position of 200 nm gold nanoparticles using a multifocal microscope in the intracellular mass transfer platform prepared according to an embodiment of the present invention.

도 12와 도 13을 참조하면, 일 실시예에 따라 제조된 세포 내 물질 전달 플랫폼은 전기천공법과 대비하여 금 나노입자를 용이하게 전달한 결과를 보여주며, 특히, 최대 200 nm 크기의 금 금속 나노입자를 성공적으로 전달한 것을 알 수 있다.12 and 13, the intracellular mass transfer platform prepared according to an embodiment shows the result of easily delivering gold nanoparticles compared to the electroporation method. In particular, gold metal nanoparticles having a size of up to 200 nm. You can see that it was delivered successfully.

도 14는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 세포 내 물질 전달 플랫폼에서의 Doxorubicin이 로딩된 mesoporous silica nanoparticle 나노입자의 세포 내 전달과 그 효과 분석 그리고 보고하는 기법과 전기천공법과 비교한 결과를 보여주는 도면이다.FIG. 14 is a diagram showing intracellular delivery of mesoporous silica nanoparticle nanoparticles loaded with Doxorubicin in the intracellular mass transfer platform prepared according to an embodiment of the present invention, an analysis and reporting of its effects, and a comparison result with the electroporation method It is a drawing.

도 14를 참조하면, Mesoporous silica nanoparticle의 경우, 입자 속에 Doxorubicin이라는 암 치료제를 로딩하여 drug delivery로의 사용 가능성을 볼 수 있다. 특히, 매우 다양한 세포를 이용하였으며, 그 중 K562 세포 결과는 추후 암 면역 치료에 쓰일 수 있음도 보인다.Referring to FIG. 14, in the case of mesoporous silica nanoparticles, the possibility of use as drug delivery by loading a cancer treatment called Doxorubicin into the particles can be seen. In particular, a wide variety of cells were used, and the results of K562 cells were shown to be useful for future cancer immunotherapy.

도 15는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 세포 내 물질 전달 플랫폼에서의 K562 세포를 이용한 mRNA 전달 결과를 보여주는 그래프로, 상기 K562 세포를 이용하여 mRNA 를 효과적으로 전달할 수 있음을 보여준다.15 is a graph showing the result of mRNA delivery using K562 cells in the intracellular mass transfer platform prepared according to an embodiment of the present invention, and shows that mRNA can be effectively delivered using the K562 cells.

이상에서 설명한 본 발명은 전술한 실시예 및 첨부된 도면들에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형, 및 변경이 가능함은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.The present invention described above is not limited by the above-described embodiments and the accompanying drawings, and various substitutions, modifications, and changes are possible within the scope of the technical spirit of the present invention. It will be obvious to those of ordinary skill in

Claims (10)

세포 내 물질 전달 플랫폼으로,
세포 및 전달물질을 포함하는 유체가 유동하는 제 1 채널;
상기 제 1 채널과 수직 교차하는 제 2 채널; 및
상기 제 1 채널에 일측에 구비되어 상기 제 1 채널에서의 유체 속도를 제 1 방향으로 제어하는 제1세포가속수단을 포함하며,
상기 제 1 채널에서의 유체는 상기 제 2 채널과 수직 교차하는 지점으로 대향하여 유동하며,
상기 제 1 세포가속수단은 상기 제 1 채널과 제 2 채널이 수직 교차하는 지점에 형성된 와류에 의하여 상기 세포에 나노구멍이 형성되는 수준의 세포벽 변형을 가하는 운동에너지를 상기 제 1 채널 상의 세포에 인가하는 것을 특징으로 하는 세포 내 물질 전달 플랫폼.
As an intracellular mass transfer platform,
A first channel through which a fluid including cells and a delivery material flows;
A second channel perpendicular to the first channel; And
And a first cell acceleration means provided on one side of the first channel to control the fluid velocity in the first channel in a first direction,
The fluid in the first channel flows oppositely to a point perpendicular to the second channel,
The first cell acceleration means applies kinetic energy to the cells on the first channel by applying a cell wall deformation at the level of forming a nano hole in the cell by a vortex formed at a point where the first channel and the second channel intersect vertically. Intracellular mass transfer platform, characterized in that.
 제 1 항에 있어서,
상기 제 1 채널의 타측에 구비되어 상기 제 1 채널에서의 유체 속도를 제 2 방향으로 제어하는 제 2 세포가속수단을 더 포함하는 것을 특징으로 하는세포 내 물질 전달 플랫폼.
The method of claim 1,
And a second cell acceleration means provided on the other side of the first channel to control the fluid velocity in the first channel in a second direction.
 제1항에 있어서,
세포에 형성되는 나노구멍은, 와류통과한 이후에 세포벽 변형이 일어나는 것을 특징으로 하는 세포 내 물질 전달 플랫폼.
The method of claim 1,
The intracellular mass transfer platform, characterized in that cell wall deformation occurs after the nanopores formed in the cells pass through the vortex.
 제1항에 있어서,
상기 세포 및 전달물질은 액적 형태로 상기 제 1 채널을 흐르는 것을 특징으로 하는 세포 내 물질 전달 플랫폼.
The method of claim 1,
The intracellular mass transfer platform, characterized in that the cells and the transfer material flow through the first channel in the form of droplets.
 제4항에 있어서,
상기 액적은 상기 전달물질 내에 상기 세포가 포함된 형태인 것을 특징으로 하는 세포 내 물질 전달 플랫폼.
The method of claim 4,
The intracellular mass transfer platform, characterized in that the droplet is in a form in which the cells are contained in the transfer material.
 제1항에 있어서,
상기 제 1 채널 내의 유체는 레이놀즈 계수 10~1000인 것을 특징으로 하는 세포 내 물질 전달 플랫폼.
The method of claim 1,
Intracellular mass transfer platform, characterized in that the fluid in the first channel has a Reynolds coefficient of 10 to 1000.
 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼을 이용한 세포 내 물질 전달 방법으로,
상기 제 1 세포가속수단을 이용하여 세포 및 전달물질을 제 1 채널에서 제1방향으로 유동시키는 단계;
상기 제 1 채널과 제 2 채널이 수직 교차하는 지점에서 와류가 형성되어, 상기 제 1 채널에서 유동된 세포 및 전달물질은 제 2 채널로 유동시키는 단계; 및
상기 제 1 채널과 제 2 채널이 수직 교차하는 지점 이후 발생하는 세포 변형에 따라 세포막에 형성된 나노구멍을 통하여 상기 전달물질이 전달되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 내 물질 전달 방법.
In the intracellular mass transfer method using the intracellular mass transfer platform according to any one of claims 1 to 6,
Flowing the cells and the delivery material in a first direction in a first channel using the first cell acceleration means;
A vortex is formed at a point where the first channel and the second channel vertically intersect, so that the cells and the delivery material flowing in the first channel flow to the second channel; And
And delivering the delivery material through the nanopores formed in the cell membrane according to cell deformation occurring after the point at which the first channel and the second channel vertically intersect.
 제7항에 있어서,
제 1 채널에서 유동된 세포 및 전달물질은 제 2 채널로 유동시키는 단계는, 제 1 채널의 타측에 설치되는 제 2 세포가속수단을 이용하여 상기 제 1 채널과 제 2 채널이 수직 교차하는 지점에서 와류가 형성되는 것을 특징으로 하는 세포 내 물질 전달 방법.
The method of claim 7,
The step of flowing the cells and the delivery material flowing in the first channel to the second channel may be performed at a point where the first channel and the second channel vertically intersect using a second cell acceleration means installed on the other side of the first channel. Intracellular mass transfer method, characterized in that the vortex is formed.
 제8항에 있어서,
제1 세포가속수단 및 제 2 세포가속수단은 제 2 채널에서 와류(vortex)를 형성시키는 수준의 상기 세포에 인가하며,
상기 제 2 채널에 형성된 와류를 통과한 세포는 와류 붕괴(vortex breakdown)에 따라 또 다른 세포 변형이 일어나며, 상기 또 다른 세포 변형에 따라 형성된 세포막의 나노구멍을 통하여 상기 전달물질이 상기 세포 내로 전달되는 것을 특징으로 하는 세포 내 물질 전달 방법.
The method of claim 8,
The first cell acceleration means and the second cell acceleration means are applied to the cells at a level of forming a vortex in the second channel,
Cells passing through the vortex formed in the second channel undergo another cell transformation according to vortex breakdown, and the delivery material is delivered into the cell through the nanopores of the cell membrane formed according to the other cell transformation. Intracellular material delivery method, characterized in that.
 제7항에 있어서,
상기 세포 및 전달물질은 액적 형태인 것을 특징으로 하는 세포 내 물질 전달 방법.
The method of claim 7,
The intracellular mass transfer method, characterized in that the cell and the transfer material are in the form of droplets.
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