KR102214988B1 - 신규한 옥시인돌 유도체 및 이를 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 헤테로사이클을 가지는 신규한 옥시인돌 유도체 및 이의 의학적 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인디움(Ⅲ) 촉매 반응으로 합성된 신규한 3-헤테로사이클을 가지는 옥시인돌 화합물은 다양한 포도상구균에 대한 특이적인 억제 활성을 나타내었으며, 종래 사용되고 있는 항생제와 병용처리될 경우 항생제의 항균효과를 상승시키는 것으로 확인됨에 따라, 상기 신규한 3-헤테로사이클을 가지는 옥시인돌 화합물은 포도상구균 특이적 항균조성물 및 상승적 항균효과를 위한 항생제의 병용처리제로 제공될 수 있다.
Description
본 발명은 헤테로사이클을 가지는 신규한 옥시인돌 유도체 및 이의 의학적 용도에 관한 것이다.
항균제 내성 (antimicrobial resistance; AMR)은 치료가능한 병원성 질환을 다시 치명적으로 만들어 심각한 건강 문제로 대두되고 있다. AMR에 의한 사망자는 현재 70만명에 이르며, 2050년까지 연간 1000만 명을 초과할 것으로 예상됨에 따라, 박테리아 감염 극복을 위해 AMR 병원균 제거를 위한 새로운 치료 물질과 방법에 대한 연구가 필요하다.
병원균 중 포도상구균(Staphylococcus species)은 가장 풍부한 전이증식 그람 양성균으로, 병원내감염과 공동체 피부 감염의 가장 일반적인 원인으로 치료 방법을 복잡하게 만들고 비용을 증가시킨다.
이러한 포도상구균 중 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus; S. aureus)은 세계적으로 널리 알려진 식중독균으로 황금색 색소를 형성하고 용혈성을 가지며 응고효소를 생성하는 종으로, 화농성 질환이나 창상감염 등의 피부감염, 골관절염, 폐렴, 패혈증 등을 일으키는 병원성 높은 대표적인 유해세균으로 알려져 있다.
또한, S. aureus 균 이외에 다른 포도상구균인 S. epidermidis 역시 병원내 감염의 가장 빈번한 원인 중 하나이며, S. saprophyticus는 비뇨 생식기 감염에 두 번째로 중요한 원인으로 인체 건강에 매우 해를 끼친다.
특히, S. aureus 및S. epidermidis는 메치실린 저항성 균주로 병원에서는 흔히 볼 수 있으며, 지역 사회 내에서 전염병으로 확산되어 지역 사회와 관련된 메치실린 저항성 Staphylococcus 균주를 생산한다.
이러한 균주 근절을 위해 유용한 작용 메커니즘을 가진 잠재적인 신규한 항-포도상구균 화합물의 연구가 이루어졌으며, 최근에는 치료제가 개발되었으나 여전히 박테리아 혼합물 중 항균제 내성 포도상구균을 표적으로 하는 매우 강력한 화합물에 대한 필요성이 요구되고 있다.
본 발명은 신규한 헤테로사이클을 가지는 옥시인돌 유도체를 제공하며, 상기 옥시인돌 유도체를 유효성분으로 함유하는 조성물을 항균제로 제공하고자 한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 옥시인돌 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
[화학식 1]
상기 화학식 1에 있어서,
A는
R1은 수소, C1 내지 C4의 알킬, C1 내지 C4의 알콕시 및 할로겐으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고,
상기 A에 있어서, R2는 수소, C1 내지 C4의 알콕시 및 할로겐으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고, X는 NCH3 및 S로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나임.
본 발명은 하기 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 옥시인돌 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항균조성물을 제공한다.
[화학식 2]
상기 화학식 2에 있어서,
R1은 수소, C1 내지 C4의 알킬, C1 내지 C4의 알콕시 및 할로겐으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고, R2는 수소, C1 내지 C4의 알콕시 및 할로겐으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나임.
[화학식 3]
상기 화학식 3에 있어서,
R1 은 수소, C1 내지 C4 알콕시 및 할로겐으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이고, X는 NCH3 및 S로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나임.
본 발명은 상기 화학식 2 또는 화학식 3과 같은 항균조성물을 유효성분으로 함유하는 포도상구균(Staphylococcus species) 억제용 약학조성물로 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 2 또는 화학식 3과 같은 항균조성물을 유효성분으로 함유하는 포도상구균(Staphylococcus species) 억제용 식품보존제 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 인디움(Ⅲ) 촉매 반응으로 합성된 신규한 3-헤테로사이클을 가지는 옥시인돌 화합물은 다양한 포도상구균에 대한 특이적인 억제 활성을 나타내었으며, 종래 사용되고 있는 항생제와 병용 처리될 경우 항생제의 항균효과를 상승시키는 것으로 확인됨에 따라, 상기 신규한 3-헤테로사이클을 가지는 옥시인돌 화합물은 포도상구균 특이적 항균조성물 및 상승적 항균효과를 위한 항생제의 병용처리제로 제공될 수 있다.
도 1은 신규한 헤테로사이클을 가지는 옥시인돌 합성과정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 20 화합물의 항-포도상구균 활성을 스크리닝하기 위해, 디스크 확산 분석방법으로 S. aureus (ATCC 25923)에 대하여 신규하게 합성된 화합물 (20 μg) 각각의 활성을 확인한 결과로, 상기 결과는 3번 반복 실험하여 대표적인 이미지를 나타내었으며, DMSO 및 Disc를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 3은 항-S. aureus 활성의 발현에 있어 효과적인 화합물과 이들의 합성 모이어티들을 비교한 결과로, 도 3A는 5개의 매우 활성화된 화합물 (KS15, KS16, KS17, KS19 및 KS20)의 항-S. aureus 활성을 확인한 결과이며, 도 3B 내지 3E는 S활성 화합물의 합성에 사용하였던 모체 모이어티의 항-S. aureus 활성을 확인한 결과로, 도 3A 및 3B의 합성 화합물들은 20 μg농도로 사용하여 활성을 확인한 반면, 도 3C 내지 3E는 20에서 1,000 μg 농도의 기질 활성을 확인한 결과이다.
도 4는 S. aureus에 대한 항-박테리아 활성을 MIC로 확인하기 위해 S. aureus에 대한 신규한 합성 화합물과 스트렙토마이신의 항-박테리아 활성을 확인한 결과로, 도 4A는 ATCC 25923 균주의 세포 성장을 확인한 결과로, 0, 2.5, 5, 10 및 20 μg/mL 농도로 각 화합물과 스트렙토마이신이 포함된 96-웰 플레이트에서 세포의 성장을 확인한 결과이며, 도 4B는 평가된 화합물의 평균 MIC 값을 나타낸 결과이다 (n=5).
도 5는 그람 양성 및 그람 음성 균주에 대한 활성 화합물의 특이성을 확인한 결과로, 도 5A는 그람 양성 S. epidermidis (ATCC 12228) (left)와 S. saprophyticus (ATCC 15305) (right)에 0, 2.5, 5, 10 및 20 μg/mL 농도의 KS15, KS16, KS17, KS19, KS20 및 스트렙토마이신을 처리하여 항-박테리아 활성을 확인한 결과이며, 도 5B는 상기 도 5A에서 확인된 화합물의 MIC를 나타낸 결과이며, 도 5C는 그람 음성 종에 대한 항-박테리아 활성을 확인한 결과로, 0, 2.5, 5, 10 및 20 μg/mL 농도의 화합물과 스트렙토마이신을 처리하고 E. coli (ATCC 25922) 및 P. aeruginosa (ATCC 27853)의 성장을 확인한 결과이다.
도 6은 메치실린 저항성 포도상구균 (MRSA)균주에 대한 화합물의 활성을 확인한 결과로, 도 6A는 MRSA 균주를 확인하기 위해 LB-agar 플레이트에서 E-test를 이용하여 농도 확산법을 수행하여 MSSA (ATCC 25923)와 6개의 MRSA 균주의 MIC 값을 확인한 결과로, 화살표는 각 균주에 대한 옥사실린(oxacillin)의 MIC를 나타내며, 도 6B는 mecA 유전자 분석을 위해 MSSA (ATCC 25923, Lane 1)와 6개의 MRSA 균주 (Lanes 2-7)에서 mecA 특이적 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭한 결과로, 별표(*)는 비특이적 PCR 생성물을 나타낸다. 도 6C는 화합물과 스트렙토마이신에 대한 MRSA 균주의 성장을 확인하기 위해, 다양한 농도의 화합물을 MSSA (ATCC 25923) 균주에 첨가하고 24시간 배양한 후 균주 생장을 확인한 결과이며, 도 8D는 8C와 같이 배양된 세포에서 화합물의 MIC를 확인한 결과이다.
도 7은 항생제에 대한 KS16의 상승 효과를 확인한 결과로, 도 7A는 항생제와 활성 농도에 대한 정보로 SensititreTM Gram-positive MIC plate (Cat. No. EUST)와 각 항생제의 최종 농도를 나타낸 것으로 CHL, Chloramphenicol; CIP, Ciprofloxacin; CLI, Clindamycin; ERY, Erythromycin; FOX, Cefoxitin; FUS, Fusidate; GEN, Gentamicin; KAN, Kanamycin; LZD, Linezolid; MUP, Mupirocin; PEN, Penicillin; RIF, Rifampin; SMX, Sulfamethoxazole; STR, Streptomycin; SYN, Quinupristin/Dalfopristin; TET, Tetracycline; TIA, Tiamulin; TMP, Trimethoprim; VAN, Vancomycin; NEG 및 POS은 각각 음성 및 양성 대조군이다. 도 7B 내지 7C는 항생제의 감수성에 미치는 KS16의 영향을 확인한 결과로, KS16에 의해 유도된 항생제는 노란색으로 표시하였다. 도 7B는 SensititreTM Gram positive MIC plate (Cat. No. EUST)에서 KS16 (2.5 μg/mL)와 함께 배양된 ATCC 25923 세포이며, 도 7C는 KS16 없이 배양된 ATCC 25923 세포를 확인한 결과로, 노란색 원 표시는 각 항생제에 대한 MIC를 나타낸 것이다. 도 7D는 겐타마이신과 카나마이신에 대한 Checkerboard assays 결과로, 다양한 농도의 KS16 및 항생제를 사용하여 ATCC 25923 세포에 대한 감수성을 확인한 결과로, 노란색 원은 FICI=0.5이 나타난 농도를 표시한 것이다.
도 2는 20 화합물의 항-포도상구균 활성을 스크리닝하기 위해, 디스크 확산 분석방법으로 S. aureus (ATCC 25923)에 대하여 신규하게 합성된 화합물 (20 μg) 각각의 활성을 확인한 결과로, 상기 결과는 3번 반복 실험하여 대표적인 이미지를 나타내었으며, DMSO 및 Disc를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 3은 항-S. aureus 활성의 발현에 있어 효과적인 화합물과 이들의 합성 모이어티들을 비교한 결과로, 도 3A는 5개의 매우 활성화된 화합물 (KS15, KS16, KS17, KS19 및 KS20)의 항-S. aureus 활성을 확인한 결과이며, 도 3B 내지 3E는 S활성 화합물의 합성에 사용하였던 모체 모이어티의 항-S. aureus 활성을 확인한 결과로, 도 3A 및 3B의 합성 화합물들은 20 μg농도로 사용하여 활성을 확인한 반면, 도 3C 내지 3E는 20에서 1,000 μg 농도의 기질 활성을 확인한 결과이다.
도 4는 S. aureus에 대한 항-박테리아 활성을 MIC로 확인하기 위해 S. aureus에 대한 신규한 합성 화합물과 스트렙토마이신의 항-박테리아 활성을 확인한 결과로, 도 4A는 ATCC 25923 균주의 세포 성장을 확인한 결과로, 0, 2.5, 5, 10 및 20 μg/mL 농도로 각 화합물과 스트렙토마이신이 포함된 96-웰 플레이트에서 세포의 성장을 확인한 결과이며, 도 4B는 평가된 화합물의 평균 MIC 값을 나타낸 결과이다 (n=5).
도 5는 그람 양성 및 그람 음성 균주에 대한 활성 화합물의 특이성을 확인한 결과로, 도 5A는 그람 양성 S. epidermidis (ATCC 12228) (left)와 S. saprophyticus (ATCC 15305) (right)에 0, 2.5, 5, 10 및 20 μg/mL 농도의 KS15, KS16, KS17, KS19, KS20 및 스트렙토마이신을 처리하여 항-박테리아 활성을 확인한 결과이며, 도 5B는 상기 도 5A에서 확인된 화합물의 MIC를 나타낸 결과이며, 도 5C는 그람 음성 종에 대한 항-박테리아 활성을 확인한 결과로, 0, 2.5, 5, 10 및 20 μg/mL 농도의 화합물과 스트렙토마이신을 처리하고 E. coli (ATCC 25922) 및 P. aeruginosa (ATCC 27853)의 성장을 확인한 결과이다.
도 6은 메치실린 저항성 포도상구균 (MRSA)균주에 대한 화합물의 활성을 확인한 결과로, 도 6A는 MRSA 균주를 확인하기 위해 LB-agar 플레이트에서 E-test를 이용하여 농도 확산법을 수행하여 MSSA (ATCC 25923)와 6개의 MRSA 균주의 MIC 값을 확인한 결과로, 화살표는 각 균주에 대한 옥사실린(oxacillin)의 MIC를 나타내며, 도 6B는 mecA 유전자 분석을 위해 MSSA (ATCC 25923, Lane 1)와 6개의 MRSA 균주 (Lanes 2-7)에서 mecA 특이적 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭한 결과로, 별표(*)는 비특이적 PCR 생성물을 나타낸다. 도 6C는 화합물과 스트렙토마이신에 대한 MRSA 균주의 성장을 확인하기 위해, 다양한 농도의 화합물을 MSSA (ATCC 25923) 균주에 첨가하고 24시간 배양한 후 균주 생장을 확인한 결과이며, 도 8D는 8C와 같이 배양된 세포에서 화합물의 MIC를 확인한 결과이다.
도 7은 항생제에 대한 KS16의 상승 효과를 확인한 결과로, 도 7A는 항생제와 활성 농도에 대한 정보로 SensititreTM Gram-positive MIC plate (Cat. No. EUST)와 각 항생제의 최종 농도를 나타낸 것으로 CHL, Chloramphenicol; CIP, Ciprofloxacin; CLI, Clindamycin; ERY, Erythromycin; FOX, Cefoxitin; FUS, Fusidate; GEN, Gentamicin; KAN, Kanamycin; LZD, Linezolid; MUP, Mupirocin; PEN, Penicillin; RIF, Rifampin; SMX, Sulfamethoxazole; STR, Streptomycin; SYN, Quinupristin/Dalfopristin; TET, Tetracycline; TIA, Tiamulin; TMP, Trimethoprim; VAN, Vancomycin; NEG 및 POS은 각각 음성 및 양성 대조군이다. 도 7B 내지 7C는 항생제의 감수성에 미치는 KS16의 영향을 확인한 결과로, KS16에 의해 유도된 항생제는 노란색으로 표시하였다. 도 7B는 SensititreTM Gram positive MIC plate (Cat. No. EUST)에서 KS16 (2.5 μg/mL)와 함께 배양된 ATCC 25923 세포이며, 도 7C는 KS16 없이 배양된 ATCC 25923 세포를 확인한 결과로, 노란색 원 표시는 각 항생제에 대한 MIC를 나타낸 것이다. 도 7D는 겐타마이신과 카나마이신에 대한 Checkerboard assays 결과로, 다양한 농도의 KS16 및 항생제를 사용하여 ATCC 25923 세포에 대한 감수성을 확인한 결과로, 노란색 원은 FICI=0.5이 나타난 농도를 표시한 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 3-디아조인돌-2-온(3-diazoindolin-2-ones)과 인돌 (indoles), 1-메틸피롤 (1-methylpyrrole), 또는 티오펜 (thiophene)을 인디움 (III) 촉매 반응 [indium (III)-catalysed reaction]하에서 3-헤테로사이클을 갖는 신규한 옥시인돌 유도로 합성하였으며, 상기 신규한 옥시인돌 유도체가 포도상구균의 특이적 항균 활성을 나타내는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 옥시인돌 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공할 수 있다.
[화학식 1]
상기 화학식 1에 있어서,
A는
R1은 수소, C1 내지 C4의 알킬, C1 내지 C4의 알콕시 및 할로겐으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고,
상기 A에 있어서, R2는 수소, C1 내지 C4의 알콕시 및 할로겐으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고, X는 NCH3 및 S로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나임.
보다 상세하게는 상기 옥시인돌 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 하기 화학식 2로 표시되는 것일 수 있다.
[화학식 2]
상기 화학식 2에 있어서,
R1은 수소, C1 내지 C4의 알킬, C1 내지 C4의 알콕시 및 할로겐으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고, R2는 수소, C1 내지 C4의 알콕시 및 할로겐으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나임.
보다 바람직하게는 상기 옥시인돌 유도체는 3-(1H-인돌-3-일)인돌린-2-온, 3-(1H-인돌-3-일)-5-메틸인돌린-2-온 , 3-(1H-인돌-3-일)-5-메톡시인돌린-2-온, 5-플루오로-3-(1H-인돌-3-일)인돌린-2-온, 5-클로로-3-(1H-인돌-3-일)인돌린-2-온, 7-클로로-3-(1H-인돌-3-일)인돌린-2-온, 4-브로모-3-(1H-인돌-3-일)인돌린-2-온, 5-브로모-3-(1H-인돌-3-일)인돌린-2-온, 3-(5-메톡시-1H-인돌-3-일)인돌린-2-온, 3-(5-플루오로-1H-인돌-3-일)인돌린-2-온, 5-메톡시-3-(5-메톡시-1H-인돌-3-일)인돌린-2-온 및 3-(5-플루오로-1H-인돌-3-일)-5-메톡시인돌린-2-온으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
또한 상기 옥시인돌 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 하기 화학식 3으로 표시되는 것일 수 있다.
[화학식 3]
상기 화학식 3에 있어서,
R1 은 수소, C1 내지 C4 알콕시 및 할로겐으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이고, X는 NCH3 및 S로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나임.
보다 바람직하게는 상기 화학식 3으로 표시되는 옥시인돌 유도체는 3-(1-메틸-1H-피롤-2-일)인돌린-2-온, 5-메톡시-3-(1-메틸-1H-피롤-2-일)인돌린-2-온, 4-클로로-3-(1-메틸-1H-피롤-2-일)인돌린-2-온, 4-브로모-3-(1-메틸-1H-피롤-2-일)인돌린-2-온, 5-브로로-3-(1-메틸-1H-피롤-2-일)인돌린-2-온, 3-(티오펜-2-일)인돌린-2-온, 5-클로로-3-(티오펜-2-일)인돌린-2-온 및 5-브로모-3-(티오펜-2-일)인돌린-2-온으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명은 하기 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 옥시인돌 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항균조성물을 제공할 수 있다.
[화학식 2]
상기 화학식 2에 있어서,
R1은 수소, C1 내지 C4의 알킬, C1 내지 C4의 알콕시 및 할로겐으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고, R2는 수소, C1 내지 C4의 알콕시 및 할로겐으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나임.
[화학식 3]
상기 화학식 3에 있어서,
R1 은 수소, C1 내지 C4 알콕시 및 할로겐으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이고, X는 NCH3 및 S로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나임.
상기 화학식 2로 표시되는 옥시인돌 유도체는 3-(1H-인돌-3-일)인돌린-2-온, 3-(1H-인돌-3-일)-5-메틸인돌린-2-온 , 3-(1H-인돌-3-일)-5-메톡시인돌린-2-온, 5-플루오로-3-(1H-인돌-3-일)인돌린-2-온, 5-클로로-3-(1H-인돌-3-일)인돌린-2-온, 7-클로로-3-(1H-인돌-3-일)인돌린-2-온, 4-브로모-3-(1H-인돌-3-일)인돌린-2-온, 5-브로모-3-(1H-인돌-3-일)인돌린-2-온, 3-(5-메톡시-1H-인돌-3-일)인돌린-2-온, 3-(5-플루오로-1H-인돌-3-일)인돌린-2-온, 5-메톡시-3-(5-메톡시-1H-인돌-3-일)인돌린-2-온 및 3-(5-플루오로-1H-인돌-3-일)-5-메톡시인돌린-2-온으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 화학식 3으로 표시되는 옥시인돌 유도체는 3-(1-메틸-1H-피롤-2-일)인돌린-2-온, 5-메톡시-3-(1-메틸-1H-피롤-2-일)인돌린-2-온, 4-클로로-3-(1-메틸-1H-피롤-2-일)인돌린-2-온, 4-브로모-3-(1-메틸-1H-피롤-2-일)인돌린-2-온, 5-브로로-3-(1-메틸-1H-피롤-2-일)인돌린-2-온, 3-(티오펜-2-일)인돌린-2-온, 5-클로로-3-(티오펜-2-일)인돌린-2-온 및 5-브로모-3-(티오펜-2-일)인돌린-2-온으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 항균조성물은 포도상구균(Staphylococcus species)에 대하여 특이적인 항균활성을 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 옥시인돌 유도체 화합물이 S. aureus의 생장을 선택적으로 억제할 수 있는 지를 확인하기 위해, 포도상구균의 다른 변종인 S. epidermidis (ATCC 12228) 및 S. saprophyticus (ATCC 15305)에 대한 화합물들의 MIC를 확인하였으며, 스트렙토마이신과 비교한 결과, 도 5A 및 5B와 같이 5개의 화합물 (KS15, KS16, KS17, KS19, 및 KS20) 모두 실험 균에 활성을 나타내었으며, S. epidermidis 및 S. saprophyticus에 대하여 S. aureus와 비교하여 동일하거나 매우 높은 효과를 나타내었다.
한편, 스트렙토마이신은 S. saprophyticus에 대한 활성은 확인되었으나 S. epidermidis에 대해서는 상당히 적은 활성(MIC>20 μg/mL)을 나타내었다.
상기 결과로부터 헤테로사이클릭 옥시인돌 유도체는 대조군 항생제인 스트렙토마이신보다 S. aureus의 일반적인 점유종 구성에 대하여 광범위하면서 선택적인 항-박테리아 활성을 나타낼 수 있음이 확인되었다.
또한, 추가적인 확인을 통하여 화합물이 그람 음성 박테리아에 효과를 나타낼 수 있는 지 확인하기 위해, E. coli 균주에서 화합물들의 박테리아 생장 억제 효과를 확인한 결과, 도 5C와 같이 모든 화합물들은 E. coli 세포에 대하여 불활성화(MIC >20 μg/mL)된 반면, 스트렙토마이신은 억제 효과를 나타내는 것이 확인되었다.
또한, 만성 상처와 다른 유형의 감염에서 S. aureus와 공통적으로 작용하는 P. aeruginosa에 대한 MIC를 확인한 결과, 도 5C와 같이 P. aeruginosa (ATCC 27853)에 대한 모든 화합물들의 MIC 값은 E. coli 결과와 같이 20 μg/mL 이상으로 나타난 반면, 스트렙토마이신은 오직 20 μg/mL에서만 억제 활성이 나타났다. 그러나 도 4B 및 도 5B와 같이 10 μg/mL 미만의 화합물이 포도상구균 종에 효과적인 것을 고려할 때, 상기 농도는 비효과적인 것으로 간주될 수 있다.
상기 모든 결과로부터 화합물 KS15, KS16, KS17, KS19 및 KS20은 포도상구균 종에 대한 특이성을 나타내며, P. aeruginosa 또는 다른 그람 음성 박테리아와의 동시 감염에 있어서 좁은 범위 항생제로서 포도상구균 종의 제거를 위해 사용될 수 있음이 확인되었다.
또한, 상기 항균조성물은 항생제와 병용 처리될 수 있다.
상기 항생제는 시프로플록사신(ciprofloxacin), 겐타마이신 (gentamicin), 카나마이신 (kanamycin) 및 스트렙토마이신 (streptomycin)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 옥시인돌 유도체 화합물들이 항생제와 화합물이 동일한 경로로 S. aureus를 사멸시킬 것으로 가정하고 신규한 활성 화합물에 의해 활성이 증가될 수 있는 항생제를 확인하였다.
활성이 우수한 화합물 중 하나인 KS16을 선택하고 도 7A와 같이 사전에 제작한 항생제 감수성 검사용 SensititreTM Gram-positive MIC plate에 배양용 배지를 주입하여 결합 활성을 확인하였으며, 도 4과 같이 S. aureus의 사멸이 나타나지 않은 농도인 2.5 μg/mL로 KS16를 처리하거나 처리하지 않는 조건에서 MIC 값을 확인한 결과, 도 7B, 7C 및 표 2와 같이 KS16가 추가된 시프로플록사신(ciprofloxacin), 겐타마이신 (gentamicin), 카나마이신 (kanamycin) 및 스트렙토마이신 (streptomycin) 항생제는 대조군과 비교하여 S. aureus에 대한 감수성이 증가된 것을 확인할 수 있었다. 특히 겐타마이신과 카나마이신의 S. aureus의 감수성이 4배 이상 증가하였다.
본 발명은 상기 항균조성물을 유효성분으로 함유하는 포도상구균(Staphylococcus species) 억제용 약학조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 항균조성물을 유효성분으로 함유하는 포도상구균(Staphylococcus species) 억제용 식품보존제 조성물을 제공할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<합성예> 3-헤테로사이클 (3-heterocycles)을 갖는 옥시인돌 (oxindoles) 유도체 합성
모든 물질은 상업적 공급업체에서 구입하였으며, 추가 정제 없이 사용하였다.
1. 합성 방법
1-1. 3-(1H-인돌-3-일)인돌린-2-온 [3-(1H-indol-3-yl)indolin-2-ones (KS1 to KS12)] 합성
[반응식 1]
상기 반응식 1과 같은 과정으로 해당하는 3-디아조인돌린-2-온 (3-diazoindolin-2-ones, 1 및 0.5 mmol) 및 인돌 (indoles, 2 및 0.55 mmol)을 1,2-디클로로메탄 (dichloroethane)에 용해시킨 반응 혼합물을 10 mol% In(OTf)3 존재하에서 50℃, 6 시간 동안 교반하였다.
반응 완료 후 TLC와 같이 반응 혼합물을 회전 증발기에서 증발시키고 잔류물을 헥산/에틸 아세테이트를 이용한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적 생성물 KS1 내지 KS12를 수득하였다.
1-2. 3-(1-메틸-1H-피롤-2-일)인돌린-2-온 [3-(1-methyl-1H-pyrrol-2-yl)indolin-2-ones (KS13 to KS17)] 및 3-(티오펜-2-일)인돌린-2-온 [3-(thiophen-2-yl)indolin-2-ones (KS18 to KS20)] 합성
[반응식 2]
상기 반응식 2와 같은 과정으로 해당하는 3-디아졸인돌린-2-온 (3-diazoindolin-2-ones, 1 및 0.5 mmol) 및 1-메틸피롤 (1-methylpyrrole, 3 및 0.55 mmol) 또는 티오펜 (thiophene, 4 및 0.55 mmol)을 디클로로메탄 (dichloroethane)에 용해시킨 반응 혼합물을 10 mol% In(OTf)3 존재하에서 실온에서 4시간 동안 교반하였다.
반응 완료 후 TLC와 같이 반응 혼합물을 회전 증발기에서 증발시키고 잔류물을 헥산/에틸 아세테이트를 이용한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적 생성물 KS13 내지 KS17 및 KS18 내지 KS20을 수득하였다.
2. 화합물 확인
상기 반응식 1과 같이 원-팟 반응을 통하여 해당되는 3-디아조인돌린-2-온 1과 인돌 2의 인디움(III) 촉매 반응으로 3-인돌릴인돌린-2-온 (3-indolylindolin-2-ones) KS1 내지 KS12를 합성하였다.
10 mol%의 In(OTf)3 촉매를 사용하여 1,2-dichloroethane에 화합물 1a와 2a를 처리하고 50℃에서 6시간 동안 반응시켜 화합물 KS1를 80% 수율로 얻었다.
전자주게와 전자끌기를 가지는 기질도 잘 반응이 진행되었으며, 목적 생성물이 수득되었다.
실예로 전자주게인 5-Me 및 5-OMe을 가지는 1b 또는 1c와 2a의 반응은 화합물 KS2 및 KS3을 각각 72 및 74% 수율로 생성한 반면, 5-F, 5-Cl, 7-Cl, 4-Br 및 5-Br와 같은 전자끌기를 가진 다이아조 화합물 1d-1h와 2a의 반응을 통하여 목적 생성물 KS4-KS8이 60-77% 수율로 생성되었다.
상기 결과로부터 합성법 접근에 있어 치환된 인돌의 사용 가능성을 확인하였다.
1a와 전자주게 그룹을 가진 5-메톡시-1H-인돌 (2b)을 1,2-DCE에 처리하고 50 ℃에서 6시간 동안 반응시켜 생성물 KS9을 76% 수율로 얻었으며, 전자끌기를 가진 5-플루오로-1H-인돌 (2c)와 결합시켜 KS10를 62% 수율로 얻었다. 또한, 1c와 2b 또는 2c의 반응은 목적 생성물 KS11 및 KS12를 각각 75 및 70% 수율로 생산하였다.
한편, 상기 결과를 통하여 1-메틸피롤-2-일 및 티오펜-2-일기를 가진 인돌린-2-온 KS13-KS20을 상기 반응식 2와 같이 3 위치에서 3-디아조인돌린-2-온 1과 1-메틸피롤 (3) 또는 티오펜 (4)로부터 합성하였다.
1a와 3을 10 mol% In(OTf)3 존재하에서 1,2-DCE에 처리하고 실온에서 4시간 동안 반응시켜 예상 생성물 KS13을 71% 수율로 얻었다.
전자주게 그룹을 가진 1b와 3의 추가적인 반응을 통하여 KS14를 91% 수율로 얻었으며, 1g-1i를 3과 결합시켜 이에 상응하는 생성물 KS15-KS17를 64-82% 수율로 얻었다.
한편, 1a, 1e 또는 1h와 티오펜 (4)의 추가 커플링 반응을 통하여 목적 생성물 KS18-KS20를 75-80% 수율로 얻었다. 모든 합성 화합물 KS1에서 KS20은 이들의 스펙트럼 데이터의 분석을 통하여 특징화되었다.
모든 녹는점(melting point, MP)은 Buchi Melting Point B-540 장비 (Buchi Labortechnik, Flawil, Switzerland)에서 확인하였다.
질량 스펙트럼(Mass spectra, MS)은 Agilent 1100 LC-MS (Agilent, Palo Alto, CA, USA)의 ESI 모드에서 얻었으며, 1H NMR 및 13C NMR 스펙트럼은 Bruker ARX-400, 400 MHz 또는 Bruker ARX-600, 600 MHz spectrometers (Bruker Bioscience, Billerica, MA, USA)에서 내부 표준인 TMS와 함께 기록되었다.
생성물의 반응시간은 FLUKA silica gel aluminium cards (0.2 mm thickness)상의 TLC에 의해 254 nm 형광 지표로 모니터링하였으며, 컬럼 크로마토그래피는 실리카겔 상에서 수행되었다.
2-1. 3-(1H-인돌-3-일)인돌린-2-온 [3-(1H-Indol-3-yl)indolin-2-one; KS1]
80% (99 mg) 수율로 적색 고체 화합물을 얻었다: MP 140-142℃; IR (attenuated total reflectance (ATR))νmax/cm-1 3271, 1700, 1616, 1465, 1329, 1246, 1095, 1042, 805, 740, 600, and 550; 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 11.02 (1H, s), 10.56 (1H, s), 7.37 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.28-7.27 (1H, m), 7.22-7.19 (1H, m), 7.06-7.02 (3H, m), 6.95 (1H, d, J = 7.2 Hz), 6.91-6.84 (2H, m), 5.01 (1H, s); 13C NMR (150 MHz, DMSO-d6) δ 177.7, 142.5, 136.5, 130.4, 127.8, 126.7, 126.0, 124.4, 121.4, 121.1, 118.5, 111.6, 110.0, 109.3, 109.2, 44.4; HRMS m/z (M+) calculated for C16H12N2O: 248.0950. Found: 248.0951.
2-2. 3-(1H-인돌-3-일)-5-메틸인돌린-2-온 [3-(1H-Indol-3-yl)-5-methylindolin-2-one; KS2]
72% (94 mg) 수율로 희색 고체 화합물을 얻었다: MP 195-197℃; IR (ATR)νmax/cm-1 3400, 3165, 1691, 1600, 1488, 1450, 1266, 1106, 1020, and 745; 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 11.00 (1H, s), 10.44 (1H, s), 7.36 (1H, d, J = 7.8 Hz), 7.28 (1H, d, J = 2.4 Hz), 7.04-7.02 (2H, m), 7.00 (1H, d, J = 8.4 Hz), 6.87-6.85 (1H, m), 6.84-6.82 (2H, m), 4.86 (1H, s), 2.16 (3H, s); 13C NMR (150 MHz, DMSO-d6) δ 177.7, 140.0, 136.5, 130.5, 130.2, 128.0, 126.0, 125.0, 124.5, 121.1, 118.6, 118.5, 111.5, 110.1, 109.0, 44.4, 20.6; HRMS m/z (M+) calculated for C17H14N2O: 262.1106. Found: 262.1108.
2-3. 3-(1H-인돌-3-일)-5-메톡시인돌린-2-온 [3-(1H-Indol-3-yl)-5-methoxyindolin-2-one; KS3]
74% (103 mg) 수율로 노란색 고체 화합물을 수득하였다.: MP 205-207℃; IR (ATR)νmax/cm-1 3402, 3169, 2959, 1689, 1605, 1486, 1454, 1306, 1263, 1206, 1100, 1024, 747, 614, 585, and 518; 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 11.01 (1H, s), 10.37 (1H, s), 7.36 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.28 (1H, d, J = 1.8 Hz), 7.05-7.03 (2H, m), 6.87-6.85 (2H, m), 6.78 (1H, dd, J = 8.4, 1.8 Hz), 6.62 (1H, s), 4.88 (1H, s), 3.61 (3H, s); 13C NMR (150 MHz, DMSO-d6) δ 177.5, 154.7, 136.5, 136.0, 131.7, 126.0, 124.5, 124.4, 121.1, 118.5, 112.5, 111.4, 111.3, 110.0, 109.5, 55.3, 45.0; HRMS m/z (M+) calculated for C17H14N2O2: 278.1055. Found: 278.1054.
2-4. 5-플루오로-3-(1H-인돌-3-일)인돌린-2-온 [5-Fluoro-3-(1H-indol-3-yl)indolin-2-one; KS4]
60% (80 mg) 수율로 흰색 고체 화합물을 얻었다: MP 158-160℃; IR (ATR) νmax/cm-1 3318, 2954, 1708, 1612, 1482, 1394, 1258, 1179, 1101, 1015, 743, 692, and 590; 1H NMR (600 MHz, acetone-d6) δ 10.22 (1H, s), 9.55 (1H, s), 7.39 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.29 (1H, d, J = 2.4 Hz), 7.24 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.07 (1H, t, J = 7.8 Hz), 7.00-6.99 (2H, m), 6.93-6.90 (2H, m), 5.00 (1H, s); 13C NMR (150 MHz, acetone-d6) δ 178.0, 159.5 (d, J = 235.8 Hz), 139.6, 138.0, 133.3 (d, J = 8.1 Hz), 127.2, 125.0, 122.4, 119.7 (d, J = 5.7 Hz), 114.8 (d, J = 23.1 Hz), 113.1 (d, J = 25.2 Hz), 112.4, 112.3, 111.1, 110.7 (d, J = 8.1 Hz), 45.8; HRMS m/z (M+) calculated for C16H11FN2O: 266.0855. Found: 266.0854.
2-5. 5-클로로-3-(1H-인돌-3-일)인돌린-2-온 [5-Chloro-3-(1H-indol-3-yl)indolin-2-one; KS5]
64% (90 mg) 수율로 흰색 고체 화합물을 얻었다: MP 170-172℃; IR (ATR) νmax/cm-1 3360, 3130, 1694, 1612, 1459, 1325, 1220, 1136, 1042, 925, and 732; 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 11.05 (1H, s), 10.67 (1H, s), 7.37 (1H, d, J = 7.8 Hz), 7.30 (1H, d, J = 2.4 Hz), 7.26 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.06 (1H, t, J = 7.8 Hz), 7.00 (1H, d, J = 8.4 Hz), 6.99 (1H, s), 6.94 (1H, d, J = 9.0 Hz), 6.87 (1H, t, J = 7.8 Hz), 4.97 (1H, s); 13C NMR (150 MHz, DMSO-d6) δ 177.3, 141.4, 136.4, 132.6, 127.6, 125.7, 125.4, 124.7, 124.3, 121.2, 118.6, 118.2, 111.7, 110.6, 109.2, 44.4; HRMS m/z (M+) calculated for C16H11ClN2O: 282.0560. Found: 282.0562.
2-6. 7-클로로-3-(1H-인돌-3-일)인돌린-2-온 [7-Chloro-3-(1H-indol-3-yl)indolin-2-one; KS6]
77% (109 mg) 수율로 노란색 고체 화합물을 얻었다: MP 213-215℃; IR (ATR) νmax/cm-1 3369, 3133, 1697, 1616, 1455, 1322, 1224, 1133, 1098, 1047, 928, 739, 636, and 539; 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 11.06 (1H, s), 10.97 (1H, s), 7.38 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.30 (1H, d, J = 1.2 Hz), 7.27 (1H, d, J = 7.8 Hz), 7.07-7.03 (2H, m), 6.97 (1H, d, J = 7.2 Hz), 6.92 (1H, d, J = 8.4 Hz), 6.90-6.87 (1H, m), 5.07 (1H, s); 13C NMR (150 MHz, DMSO-d6) δ 177.5, 140.2, 136.4, 132.2, 127.7, 125.8, 124.6, 123.0, 122.7, 121.2, 118.6, 118.3, 113.5, 111.6, 109.3, 45.1; HRMS m/z (M+) calculated for C16H11ClN2O: 282.0560. Found: 282.0561.
2-7. 4-브로모-3-(1H-인돌-3-일)인돌린-2-온 [4-Bromo-3-(1H-indol-3-yl)indolin-2-one; KS7]
68% (111 mg) 수율로 흰색 고체 화합물을 얻었다: MP 216-218℃; IR (ATR) νmax/cm-1 3282, 3115, 3056, 1695, 1607, 1438, 1373, 1243, 1102, 1043, 733, 640, and 563; 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 11.01 (1H, s), 10.73 (1H, s), 7.35 (1H, d, J = 7.8 Hz), 7.27 (1H, d, J = 2.4 Hz), 7.19 (1H, t, J = 7.8 Hz), 7.07 (1H, d, J = 7.8 Hz), 7.04-7.01 (1H, m), 6.97-6.93 (2H, m), 6.83 (1H, t, J = 7.2 Hz), 4.88 (1H, s); 13C NMR (150 MHz, DMSO-d6) δ 176.5, 144.6, 136.3, 130.0, 129.1, 125.8, 125.4, 124.8, 121.0, 119.2, 118.5, 118.1, 111.6, 108.5, 107.7, 45.8; HRMS m/z (M+) calculated for C16H11BrN2O: 326.0055. Found: 326.0057.
2-8. 5-브로모-3-(1H-인돌-3-일)인돌린-2-온 [5-Bromo-3-(1H-indol-3-yl)indolin-2-one; KS8]
72% (118 mg) 수율로 흰색 고체 화합물을 얻었다: MP 202-204℃; IR (ATR) νmax/cm-1 3280, 3112, 3050, 1698, 1600, 1431, 1378, 1243, 1042, and 730; 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 11.05 (1H, s), 10.68 (1H, s), 7.39-7.36 (2H, m), 7.30 (1H, d, J = 2.4 Hz), 7.10 (1H, s), 7.05 (1H, t, J = 7.8 Hz), 7.01 (1H, d, J = 7.8 Hz), 6.91-6.87 (2H, m), 4.98 (1H, s); 13C NMR (150 MHz, DMSO-d6) δ 177.2, 144.8, 136.4, 133.1, 130.4, 127.0, 125.7, 124.7, 121.2, 118.7, 118.2, 113.1, 111.7, 111.2, 109.2, 44.4; HRMS m/z (M+) calculated for C16H11BrN2O: 326.0055. Found: 326.0052.
2-9. 3-(5-메톡시-1H-인돌-3-일)인돌린-2-온 [3-(5-Methoxy-1H-indol-3-yl)indolin-2-one; KS9]
76% (106 mg) 수율로 흰색 고체 화합물을 얻었다: MP 146-148℃; IR (ATR) νmax/cm-1 3201, 2921, 1697, 1616, 1466, 1271, 1211, 1021, 802, 749, and 678; 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 10.84 (1H, s), 10.52 (1H, s), 7.25 (1H, d, J = 9.0 Hz), 7.21 (1H, t, J = 7.8 Hz), 7.18 (1H, d, J = 1.8 Hz), 7.03 (1H, d, J = 6.6 Hz), 6.93 (1H, d, J = 7.8 Hz), 6.90 (1H, t, J = 6.6 Hz), 6.71 (1H, dd, J = 9.0, 1.8 Hz), 6.54 (1H, d, J = 1.2 Hz), 4.87 (1H, s), 3.60 (3H, s); 13C NMR (150 MHz, DMSO-d6) δ 177.7, 152.8, 142.6, 131.6, 130.3, 127.7, 126.4, 124.9, 124.4, 121.4, 112.1, 110.7, 109.6, 109.1, 101.0, 55.1, 44.2; HRMS m/z (M+) calculated for C17H14N2O2: 278.1055. Found: 278.1054.
2-10. 3-(5-플루오로-1H-인돌-3-일)인돌린-2-온 [3-(5-Fluoro-1H-indol-3-yl)indolin-2-one; KS10]
62% (83 mg) 수율로 노란색 고체 화합물을 얻었다: MP 152-154℃; IR (ATR) νmax/cm-1 3291, 2921, 2853, 1696, 1620, 1465, 1292, 1230, 1180, 1098, 935, 797, 747, 680, and 596; 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 11.12 (1H, s), 10.51 (1H, s), 7.36 (1H, dd, J = 8.4, 4.2 Hz), 7.31 (1H, s), 7.22 (1H, t, J = 7.2 Hz), 7.04 (1H, d, J = 7.2 Hz), 6.95-6.93 (1H, m), 6.92-6.88 (2H, m), 6.75 (1H, d, J = 8.4 Hz), 5.01 (1H, s); 13C NMR (150 MHz, DMSO-d6) δ 177.4, 156.5 (d, J = 229.8 Hz), 142.5, 133.0, 130.0, 127.8, 126.2, 126.1 (d, J = 10.3 Hz), 124.4, 121.4, 112.5 (d, J = 9.1 Hz), 110.2 (d, J = 4.6 Hz), 109.3, 109.2 (d, J = 26.5 Hz), 103.0 (d, J = 22.9 Hz), 44.1; HRMS m/z (M+) calculated for C16H11FN2O: 266.0855. Found: 266.0856.
2-11. 5-메톡시-3-(5-메톡시-1H-인돌-3-일)인돌린-2-온 [5-Methoxy-3-(5-methoxy-1H-indol-3-yl)indolin-2-one; KS11]
75% (115 mg) 수율로 노란색 고체 화합물을 얻었다: MP 208-210℃; IR (ATR) νmax/cm-1 3256, 2924, 1698, 1489, 1280, 1200, 1024, 800, and 605; 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 10.84 (1H, s), 10.34 (1H, s), 7.25 (1H, d, J = 9.0 Hz), 7.19 (1H, d, J = 2.4 Hz), 6.85-6.84 (1H, m), 6.78 (1H, dd, J = 8.4, 2.4 Hz), 6.72 (1H, dd, J = 8.4, 1.8 Hz), 6.63 (1H, s), 6.55 (1H, d, J = 1.8 Hz), 4.84 (1H, s), 3.62 (3H, s), 3.60 (3H, s); 13C NMR (150 MHz, DMSO-d6) δ 177.5, 154.7, 152.8, 136.1, 131.7, 131.6, 126.4, 125.0, 112.5, 112.1, 111.3, 110.7, 109.7, 109.5, 101.0, 55.3, 55.2, 40.0; HRMS m/z (M+) calculated for C18H16N2O3: 308.1161. Found: 308.1162.
2-12. 3-(5-플루오로-1H-인돌-3-일)-5-메톡시인돌린-2-온 [3-(5-Fluoro-1H-indol-3-yl)-5-methoxyindolin-2-one; KS12]
70% (104 mg) 수율 노란색 고체를 얻었다: MP 214-216℃; IR (ATR) νmax/cm-1 3414, 3171, 2931, 1689, 1477, 1262, 1200, 1116, 1025, 779, 602, and 509; 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 11.13 (1H, s), 10.38 (1H, s), 7.37 (1H, dd, J = 9.0, 4.2 Hz), 7.34 (1H, d, J = 2.4 Hz), 6.92-6.86 (2H, m), 6.81 (1H, d, J = 2.4 Hz), 6.79-6.76 (1H, m), 6.66 (1H, s), 4.89 (1H, s), 3.62 (3H, s); 13C NMR (150 MHz, DMSO-d6) δ 177.4, 158.1 (d, J = 229.9 Hz), 154.9, 136.0, 133.2, 131.4, 126.5, 126.2 (d, J = 9.9 Hz), 112.8, 112.6, 111.4, 110.3 (d, J = 4.7 Hz), 109.7, 109.4 (d, J = 25.8 Hz), 103.2 (d, J = 23.1 Hz), 55.4, 44.7; HRMS m/z (M+) calculated for C17H13FN2O2: 296.0961. Found: 296.0958.
2-13. 3-(1-메틸-1H-피롤-2-일)인돌린-2-온 [3-(1-Methyl-1H-pyrrol-2-yl)indolin-2-one; KS13]
71% (75 mg) 수율로 갈색을 띠는 고체를 얻었다: MP 130-132℃; IR (ATR) νmax/cm-1 3075, 2927, 1703, 1611, 1467, 1315, 1157, 1088, 870, 711, and 547; 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 9.07 (1H, s), 7.15 (1H, t, J = 7.2 Hz), 7.11 (1H, d, J = 7.8 Hz), 6.95 (1H, t, J = 7.8 Hz), 6.83 (1H, d, J = 7.8 Hz), 6.54 (1H, br s), 5.98 (1H, t, J = 3.0 Hz), 5.81 (1H, br s), 4.68 (1H, s), 3.50 (3H, s); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 177.8, 141.4, 129.5, 128.4, 128.2, 125.1, 123.6, 122.6, 110.1, 109.0, 107.0, 45.4, 34.2; HRMS m/z (M+) calculated for C13H12N2O: 212.0950. Found: 212.0947.
2-14. 5-메톡시-3-(1-메틸-1H-피롤-2-일)인돌린-2-온 [5-Methoxy-3-(1-methyl-1H-pyrrol-2-yl)indolin-2-one; KS14]
91% (110 mg) 수율로 흰색 고체를 얻었다: MP 204-206℃; IR (ATR) νmax/cm-1 3200, 2990, 1692, 1612, 1480, 1315, 1092, and 806; 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 10.32 (1H, s), 6.82-6.78 (2H, m), 6.69-6.68 (2H, m), 5.89 (1H, t, J = 3.0 Hz), 5.62 (1H, br s), 4.92 (1H, s), 3.55 (3H, s), 3.35 (3H, s); 13C NMR (150 MHz, DMSO-d6) δ 176.2, 154.8, 135.8, 130.0, 127.1, 123.0, 113.0, 111.4, 109.7, 107.4, 106.3, 55.4, 45.0, 33.7; HRMS m/z (M+) calculated for C14H14N2O2: 242.1055. Found: 242.1056.
2-15. 4-클로로-3-(1-메틸-1H-피롤-2-일)인돌린-2-온 [4-Chloro-3-(1-methyl-1H-pyrrol-2-yl)indolin-2-one; KS15]
68% (84 mg) 수율로 흰색 고체 화합물을 얻었다: MP 116-118℃; IR (ATR) νmax/cm-1 3194, 2903, 2805, 1689, 1625, 1480, 1315, 1149, 1082, and 812; 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 10.66 (1H, s), 7.25 (1H, t, J = 7.8 Hz), 6.98 (1H, d, J = 8.4 Hz), 6.86 (1H, d, J = 7.2 Hz), 6.67 (1H, br s), 5.87 (1H, t, J = 3.0 Hz), 5.52 (1H, br s), 4.99 (1H, s), 3.59 (3H, s); 13C NMR (150 MHz, DMSO-d6) δ 175.4, 144.4, 130.0, 129.8, 126.2, 125.0, 122.7, 122.0, 108.2, 107.0, 106.4, 44.2, 33.7; HRMS m/z (M+) calculated for C13H11ClN2O: 246.0560. Found: 246.0562.
2-16. 4-브로모-3-(1-메틸-1H-피롤-2-일)인돌린-2-온 [4-Bromo-3-(1-methyl-1H-pyrrol-2-yl)indolin-2-one; KS16]
64% (93 mg) 수율로 흰색 고체 화합물을 얻었다: MP 208-210℃; IR (ATR) νmax/cm-1 3160, 2912, 2855, 1695, 1621, 1487, 1313, 1152, 1092, and 812; 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 10.64 (1H, s), 7.18 (1H, t, J = 7.2 Hz), 7.12 (1H, d, J = 7.2 Hz), 6.88 (1H, d, J = 7.8 Hz), 6.67 (1H, t, J = 2.4 Hz), 5.81 (1H, t, J = 2.4 Hz), 5.49 (1H, br s), 4.91 (1H, s), 3.59 (3H, s); 13C NMR (150 MHz, DMSO-d6) δ 175.3, 144.5, 130.1, 128.4, 127.6, 125.1, 124.9, 122.6, 118.9, 108.6, 106.5, 45.5, 33.7; HRMS m/z (M+) calculated for C13H11BrN2O: 290.0055. Found: 290.0058.
2-17. 5-브로로-3-(1-메틸-1H-피롤-2-일)인돌린-2-온 [5-Bromo-3-(1-methyl-1H-pyrrol-2-yl)indolin-2-one; KS17]
82% (119 mg) 수율로 흰색 고체를 얻었다: MP 112-114℃; IR (ATR) νmax/cm-1 3180, 2905, 2845, 1698, 1608, 1475, 1330, 1169, 1080, and 801; 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 10.63 (1H, s), 7.41 (1H, dd, J = 7.8, 2.4 Hz), 7.18 (1H, s), 6.85 (1H, d, J = 8.4 Hz), 6.71 (1H, t, J = 2.4 Hz), 5.90 (1H, t, J = 3.0 Hz), 5.62 (1H, br s), 5.03 (1H, s), 3.54 (3H, s); 13C NMR (150 MHz, DMSO-d6) δ 176.0, 142.0, 131.4, 130.8, 127.3, 126.4, 123.1, 113.2, 111.4, 107.5, 106.4, 44.5, 33.7; HRMS m/z (M+) calculated for C13H11BrN2O: 290.0055. Found: 290.0058.
2-18. 3-(티오펜-2-일)인돌린-2-온 [3-(Thiophen-2-yl)indolin-2-one; KS18]
75% (81 mg) 수율로 갈색을 띠는 고체 화합물을 얻었다: MP 140-142℃; IR (ATR) νmax/cm-1 3363, 2928, 1698, 1608, 1461, 1261, 1104, 840, 731, and 563; 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 9.25 (1H, s), 7.20 (1H, d, J = 7.8 Hz), 7.18-7.16 (2H, m), 6.98-6.94 (2H, m), 6.92-6.90 (1H, m), 6.85 (1H, d, J = 7.8 Hz), 4.80 (1H, s); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 177.5, 141.4, 137.6, 128.7, 127.0, 126.2, 125.3, 125.2, 122.7, 122.6, 110.3, 47.6; HRMS m/z (M+) calculated for C12H9NOS: 215.0405. Found: 215.0406.
2-19. 5-클로로-3-(티오펜-2-일)인돌린-2-온 [5-Chloro-3-(thiophen-2-yl)indolin-2-one; KS19]
78% (98 mg) 수율로 노란색을 띠는 고체 화합물을 얻었다: MP 155-157℃; IR (ATR)νmax/cm-1 3034, 2921, 2855, 1701, 1619, 1467, 1307, 1228, 1067, 791, 701, 662, and 556; 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 9.32 (1H, s), 7.19 (1H, t, J = 3.6 Hz), 7.17 (1H, s), 7.15-7.14 (1H, m), 6.93-6.92 (2H, m), 6.77 (1H, d, J = 8.4 Hz), 4.80 (1H, s); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 177.2, 140.0, 136.6, 130.4, 128.8, 128.1, 127.1, 126.4, 125.6, 125.5, 111.3, 47.7; HRMS m/z (M+) calculated for C12H8ClNOS: 249.0015. Found: 249.0019.
2-20. 5-브로모-3-(티오펜-2-일)인돌린-2-온 [5-Bromo-3-(thiophen-2-yl)indolin-2-one; KS20]
80% (117 mg) 수율로 노란색을 띠는 고체를 얻었다: MP 161-163℃; IR (ATR) νmax/cm-1 3172, 3109, 2922, 2853, 1708, 1680, 1470, 1308, 1218, 1191, 806, 690, and 559; 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 9.25 (1H, s), 7.38-7.37 (1H, m), 7.36 (1H, s), 7.26-7.25 (1H, m), 7.02-6.99 (2H, m), 6.97 (1H, d, J = 8.4 Hz), 4.87 (1H, s); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 177.0, 140.3, 136.6, 131.7, 130.8, 128.4, 127.1, 126.5, 125.6, 115.4, 111.7, 47.6; HRMS m/z (M+) calculated for C12H8BrNOS: 292.9510. Found: 292.9512.
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
<실험예 1> 박테리아 균주
Staphylococcus aureus (S. aureus; ATCC 25923), Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis; ATCC 12228), Staphylococcus saprophyticus (S. saprophyticus; ATCC 15305), Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa; ATCC 27853) 및 메티실린 저항성 S. aureus (MRSA) 균주를 1.5% Bacto-agar (Affymetrix) 플레이트 상에서 Tryptic Soy Broth (TSB; BD DifcoTM)로부터 분리하고 Muller-Hinton Broth (MHB; BD DifcoTM)에 접종하여 항-박테리아 활성 분석을 위해 접종물을 준비하였다.
<실험예 2> 항-S. aureus 활성을 나타내는 활성 화합물 스크리닝
디스크 확산법을 이용하여 항-S. aureus 활성을 나타내는 화합물을 스크리닝하였다.
모든 박테리아 균주를 MHB (400 μL)에서 하룻밤동안 생장시킨 배양물을 MH agar (BD DifcoTM) 20 mL에 접종한 후 직경 90 mm (SPL, Korea) 배양 접시에서 응고시켰다.
멸균 필터 디스크 (6 mm in diameter; Advantec)를 접종된 아가 접시의 표면에 올려놓았다. 멸균 필터 디스크에 화합물 2 g/L 스탁 용액의 10 μL로 떨어뜨려 최종 20 μg 양까지 함침시켰다.
상기 접시를 37℃에서 24시간 동안 배양하고 transparent ruler를 이용하여 억제 구역의 직경을 측정하여 항-박테리아 활성을 확인하였다.
각 화합물은 최소 3번씩 분석되었으며 하나의 대표 이미지를 나타내었다.
<실험예 3> MRSA 균주 확인
CCARM (Culture Collection of Antimicrobial Resistant Microbes; www.ccarm.or.kr)로부터 MRSA 균주를 구입하고, 균주 확인을 위해, 독립적인 두개의 실험을 수행하였다.
첫 번째, 6개의 개별적인 MRSA 균주 및 S. aureus (ATCC 25923)에 대한 분석 플레이트를 상기 디스크 확산 방법으로 준비하고 E-test® Oxacillin (BioMerieux) 을 이용하여 옥사실린 감수성을 확인하였다.
두 번째, mecA 유전자의 검출을 위해, 앞서 보고된 실험방법(37)에 따라 S. aureus 균주를 PCR 증폭하였다. PCR 프로토콜은 2× Quick Taq mix (Toyobo)를 이용하여 전체 20μL 용량으로 수행되었다.
PCR 프로그램은 94℃에서 3분간 초기변성, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 및 68℃에서 30초로 28 사이클 후 68℃에서 5분간 최종 신장으로 종료되었다.
PCR 생성물을 2% 아가로스 겔에서 전기영동하고 E-Graph Gel Documentation System (Atto, Japan)로 이미지화하였으며, 합성된 프라이머인 mecA-F (5′-GTAGAAATGACTGAACGTCCGATGA-3’) 및 mecA-R (5′-CCAATTCCACATTGTTTCGGTCTAA-3′)를 사용하여 증폭하였며, 상기 프라이머는 310 bp 크기의 PCR 증폭 산물을 생산하였다.
<실험예 4> MIC (Minimum inhibitory concentration) 확인
Microbroth dilution MIC testing을 수행하였다. 신선하게 하룻밤동안 배양된 세포를 혼탁도(A600)값 0.5 값까지 생장시키고, 500배로 희석된 세포를 96-웰 플레이트(SPL, Korea) 내 200 μL의 MHB에 접종한 후 Incu-MixerTM MP (Benchmark Scientific)를 이용하여 37℃에서 16시간 동안 250rpm으로 교반하여 배양하였다.
MIC 값은 하룻밤동안 배양 후 비 처리된 박테리아 접종물의 혼탁도가 90%까지로 감소될 때 화합물 또는 항생제의 최소 농도로 결정되며, 96-웰 플레이트에서 성장된 각 세포의 혼탁도 (A600)는 SPECTROstar Nano® (BMG LABTECH, Germany)를 이용하여 측정되었으며, MIC 값은 A600의 플롯 대 화합물의 농도로부터 계산되었다.
최소 5번의 독립적인 실험으로부터 대표적인 MIC 값을 확인하였으며, 모든 통계적 분석은 SigmaStat (Ver. 4.0) (Systat Software, Inc)를 이용하여 수행되었으며, 0.05 미만의 P값을 통계적으로 유의한 차이가 나타나는 것으로 간주하였다.
<실험예 5> 화합물 KS16와 시너지 효과를 나타내는 항생제 스크리닝
KS16에 의해 항-박테리아 활성이 증가되는 항생제를 확인하기 위해, SensititreTM Gram-positive MIC plate (EUST, Thermo Scientific)에서 5 μL의 DMSO 또는 KS16를 195 μL Muller Hinton broth에 첨가하고 ATCC 25923 세포를 접종하였다.
이후 상기 microbroth dilution 방법으로 AlamarBlue® cell viability reagent (Thermo Scientific)을 첨가하고 제조사의 설명서에 따라 박테리아 생장을 확인하여 MIC를 결정하였다.
working MIC 플레이트내 최종 농도는 원래 EUST 플레이트의 최종 농도의 1/4로 희석되었다.
<실험예 6> 항생제에 대한 화합물의 시너지 효과 확인
S. aureus에 대한 설계된 조합의 분할 저해 농도 지수(fractional inhibitory concentration indices; FICIs)를 확인하기 위해, 항생제를 평가하기 위한 스크리닝에 사용되었던 동일한 조건하에서 앞서 보고된 방법 (J. Chemother. 52, 1, 2003)으로 checkerboard assay를 수행하여 항생제와 선택된 화합물의 조합 활성을 확인하였다.
<실시예 1> 항-S. aureus 약물로서의 옥시인돌 유도체 스크리닝
신규하게 합성된 헤테로사이클 인돌린-2-온의 S. aureus에 대한 항-박테리아 활성을 디스크 확산법으로 확인하였다.
그 결과 도 2, 도 3 및 표 1과 같이 항-S. aureus 활성에 대한 20개의 화합물(KS1 to KS20) 중 14개 화합물에서 S. aureus에 대한 투명하게 억제 영역이 형성된 것을 확인할 수 있었다.
이중 10 mm 이상의 투명한 영역이 형성된 다섯개 화합물 (KS15, KS16, KS17, KS19 및 KS20)을 타겟 화합물로 선택하였다.
합성된 화합물의 향상된 항-박테리아 활성을 확인하기 위해, 동량의 활성 화합물의 합성에 사용된 출발 물질인 1-메틸피롤(1-methylpyrrole), 옥시인돌(oxindole) 또는 티오펜(thiophene)의 항-박테리아 활성을 확인하였다.
그러나 도 3B 및 표 1과 같이 20 μg씩 처리된 상기 기질들에서는 S. aureus에 대한 투명한 억제 영역이 형성되지 않았다.
타겟 화합물과 핵 화합물의 효과를 비교하기 위해, 20에서 1,000 μg의 다양한 양으로 1-메틸피롤, 옥시인돌 및 티오펜의 투명 영역 생성을 확인하였다.
그 결과, 도 3C와 같이 1,000 μg의 옥시인돌에서만 혼탁한 영역이 확인된 반면, 도 3D 및 3E와 같이 다른 화합물에서는 억제 활성이 전혀 나타나지 않았다.
상기 결과로부터 신규하게 합성된 화합물들은 시작 물질보다 최소 50배 이상의 활성을 나타내는 것이 확인되었다.
반응식 2와 같은 구조적 원근법으로부터 5개의 활성 화합물 KS15, KS16, KS17, KS19 및 KS20의 일반적인 구조적 특징은 3 위치에서 5 원소-헤테로사이클, 1-메틸피롤-2-일 또는 티오펜-2-일 기를 가진 C-4/C-5-할로겐화 인돌린-2-온이었다.
반면, 3-인돌릴인돌린-2-온 KS1-KS12는 상대적으로 불활성화된 것으로 나타났으며, 상기 결과로부터 3 위치의 기능화 성질은 기능 조절의 핵심 요소임이 확인되었다.
특히, 활성 KS15-KS17은 인돌린-2-온 모이어티의 벤젠 고리 내 4- 또는 5-위치에서 브롬화 또는 크롬화된 반면, 불활성 KS13-KS14은 4- 또는 5-위치가 비할로겐화되거나 5-위치에 메톡시가 치환되었다.
상기 결과로부터 인돌린-2-온의 5-위치의 할로겐화는 활성에 있어 중요한 요소임이 확인되었다.
또한, 향상된 항-박테리아 활성에 대한 상기 구조적 영향을 추가적으로 확인하기 위해, 5-위치에 -Br 또는 -Cl 기를 가진 KS19 및 KS20 화합물을 20 μg 동일한 양으로 DMSO에 섞은 후 사용하여 S. aureus에 대한 항-박테리아 활성을 확인하였다.
그 결과, 도 2 및 도 3과 같이 S. aureus (ATCC 25923)에 대한 화합물의 억제영역이 확인된 반면, ND에서는 투명 영역이 전혀 나타나지 않았다.
일반적인 SAR 결과로부터 헤테로사이클릭 인돌린-2-온 KS13-KS20의 인돌린-2-온 모이어티의 3-위치에 1-메틸피롤-2-일 또는 티오펜-2-일 기와 옥시인돌 모이어티의 벤질 고리 내 4- 또는 5-위치의 할로겐화가 항-S. aureus 활성에 유의한 영향을 나타내는 것으로 확인되었다.
| Compound | Zone, mm |
| DMSO | ND |
| Indole | ND |
| Oxindole | ND |
| Thiophene | ND |
| 1-Methylpyrrole | ND |
| KS1 | 9.1±0.2 |
| KS2 | 9.2±0.3 |
| KS3 | 8.0±0.4 |
| KS4 | 9.2±0.7 |
| KS5 | 9.4±0.5 |
| KS6 | 8.9±0.5 |
| KS7 | 8.4±0.2 |
| KS8 | 9.1±0.2 |
| KS9 | ND |
| KS10 | 9.5±0.3 |
| KS11 | ND |
| KS12 | ND |
| KS13 | ND |
| KS14 | ND |
| KS15 | 12.5±0.8 |
| KS16 | 12.5±0.9 |
| KS17 | 12.1±0.8 |
| KS18 | ND |
| KS19 | 11.2±0.4 |
| KS20 | 11.4±0.7 |
<실시예 2> S. aureus에 대한 화합물의 MIC 확인
다양한 농도의 KS15, KS16, KS17, KS19 및 KS20에 대한 MIC를 대조군 항생제인 스트렙토마이신과 비교하였다.
도 4A 및 4B와 같이 KS15, KS16, KS17, KS19 및 KS20에 대한 MIC 값은 각각 6.38, 6.40, 8.72, 9.07 및 8.87 μg/mL로 확인된 반면, 스트렙토마이신의 MIC 값은 4.6 μg/mL인 것으로 확인되었다.
KS17와 비교하여 KS15 및 KS16에 대한 낮은 MIC 값이 확인됨에 따라, 옥시인돌 4-위치의 할로겐과 3-위치의 1-메틸피롤 또는 티오펜이 항-S. aureus 활성을 증가시키는 가장 중요한 요소인 것이 확인되었다.
이에 따라, 본 발명의 신규하게 합성된 화합물들은 상업적인 항생제와 비교될 수 있으며, 우수한 항생제 후보로 제공될 수 있다.
<실시예 3> 포도상구균 종에 대한 화합물의 특이성 확인
활성 화합물이 S. aureus의 성장을 선택적으로 억제할 수 있는 지를 확인하기 위해, 포도상구균의 다른 변종인 S. epidermidis (ATCC 12228) 및 S. saprophyticus (ATCC 15305)에 대한 화합물들의 MIC를 확인하였으며, 스트렙토마이신과 비교하였다.
그 결과, 도 5A 및 5B와 같이 5개의 화합물 (KS15, KS16, KS17, KS19, 및 KS20) 모두 실험 균에 활성을 나타내었으며, S. epidermidis 및 S. saprophyticus에 대하여 S. aureus와 비교하여 동일하거나 매우 높은 효과를 나타내었다.
한편, 스트렙토마이신은 S. saprophyticus에 대한 활성은 확인되었으나 S. epidermidis에 대해서는 상당히 적은 활성(MIC>20 μg/mL)을 나타내었다.
상기 결과로부터 헤테로사이클릭 옥시인돌 유도체는 대조군 항생제인 스트렙토마이신보다 S. aureus의 일반적인 점유종 구성에 대하여 광범위하면서 선택적인 항-박테리아 활성을 나타낼 수 있음이 확인되었다.
또한, 추가적인 확인을 통하여 화합물이 두 그람 음성 박테리아에 대한 효과를 나타낼 수 있는 지 확인하였다.
첫 번째로 E. coli 균주에서 화합물들의 박테리아 성장 억제 효과를 확인하였다. 그 결과, 도 5C와 같이 모든 화합물들은 E. coli 세포에 대하여 불활성화(MIC >20 μg/mL)된 반면, 스트렙토마이신은 억제 효과를 나타내는 것이 확인되었다.
두 번째로, 만성 상처와 다른 유형의 감염에서 S. aureus와 공통적으로 작용하는 P. aeruginosa에 대한 MIC를 확인하였다.
그 결과, 도 5C와 같이 P. aeruginosa (ATCC 27853)에 대한 모든 화합물들의 MIC 값은 E. coli 결과와 같이 20 μg/mL 이상으로 나타난 반면, 스트렙토마이신은 오직 20 μg/mL에서만 억제 활성이 나타났다. 그러나 도 4B 및 도 5B와 같이 10 μg/mL 미만의 화합물이 포도상구균 종에 효과적인 것을 고려할 때, 상기 농도는 비효과적인 것으로 간주될 수 있다.
상기 모든 결과로부터 화합물 KS15, KS16, KS17, KS19 및 KS20은 포도상구균 종에 대한 특이성을 나타내며, P. aeruginosa 또는 다른 그람 음성 박테리아와의 동시 감염에 있어서 좁은 범위 항생제로서 포도상구균 종의 제거를 위해 사용될 수 있음이 확인되었다.
<실시예 4> 메티실린 저항성 S. aureus (MRSA)
균주에 대한 화합물의 활성 확인
활성 화합물이 임상적으로 분리된 MRSA 균주에 대한 억제 효과를 나타낼 수 있는지 확인하였다.
실험하고자 하는 MRSA 균주의 MIC 결정을 포함하여 메티실린에 대한 S. aureus의 내성 결정에 대한 정의용 표준인 mecA 유전자를 증폭하는 PCR을 수행하여 확인하였다.
그 결과, 도 6A와 같이 6종류의 MRSA 균주 모두 옥사실린 내성을 갖는 MSSA보다 매우 적은 민감성을 나타내었으며, 533 bp 크기의 mecA PCR 산물을 생성하였다.
또한, MRSA 균주에 대하여 5개 활성 화합물 (KS15, KS16, KS17, KS19 및 KS20)의 MIC를 결정하였다.
도 6C 및 6D를 참고하면 모든 MRSA 균주에 대한 화합물의 MIC 값은 4.5 내지 9.7 μg/mL로 나타났으며, 상기 값은 ATCC 25923 (MSSA)와 유사하거나 약간 낮은 것으로 확인되었다. 흥미롭게도 KS15 및 KS16는 MSSA 보다 MRSA에 대한 강한 활성을 나타내었다.
상기 결과로부터 KS15 및 KS16는 MRSA 균주 제거에 사용가능성이 있는 화합물로 제안될 수 있으며, 이는 다른 평가 화합물과 비교하여 특이적인 작용기 때문일 수 있다.
상기 결과들은 다른 위치에서 특정 작용기를 갖는 헤테로사이클을 가지는 옥시인돌 유도체의 항-박테리아 활성을 변화시키는 방법에 대한 추가적인 통찰력을 제공할 수 있으며, 본 발명에 따른 화합물들은 메치실린 감수성 및 메치실린 내성 포도상구균의 특이적 제거를 위한 항생제의 대안으로 제공될 수 있다.
<실시예 5> 아미노글리코사이드 항생제와 KS16의 시너지 효과 확인
앞선 실험에서 확인된 바와 같이 5개의 화합물 KS15, KS16, KS17, KS19 및 KS20은 S. aureus 종에 대하여 상업적 항생제인 스트렙토마이신과 유사한 수준의 활성을 나타내었다. 또한, 상기 화합물들은 스트렙토마이신과 다르게 포도상구균에 대한 특이적인 활성을 나타내는 것이 확인되었다.
상기 결과들로부터 상기 신규하게 합성된 화합물들은 특이적인 항-S. aureus 제제로 사용가능한 것이 확인되었다.
한편, 상기 화합물들의 메커니즘을 이해하기 위해, 항생제와 화합물이 동일한 경로로 S. aureus를 사멸시킬 것으로 가정하고 신규한 활성 화합물에 의해 활성이 증가될 수 있는 항생제를 확인하였다.
이를 위해, 활성이 우수한 화합물 중 하나인 KS16을 선택하고 도 7A와 같이 사전에 제작한 SensititreTM Gram-positive MIC plate에 항생제를 주입하여 결합 활성을 확인하였으며, 도 4과 같이 S. aureus의 사멸이 나타나지 않은 농도인 2.5 μg/mL로 KS16를 처리하거나 처리하지 않는 조건에서 MIC 값을 결정하였다.
그 결과, 도 7B, 7C 및 표 2와 같이 KS16가 추가된 시프로플록사신(ciprofloxacin), 겐타마이신 (gentamicin), 카나마이신 (kanamycin) 및 스트렙토마이신 (streptomycin) 항생제는 대조군과 비교하여 S. aureus에 대한 감수성이 증가된 것을 확인할 수 있었다.
흥미롭게도 플루오로퀴놀론 계열 광범위 항생제인 시프로플록사신을 제외하고 선택된 모든 항생제는 박테리아 리보솜을 표적하는 단백질 합성 억제제로 작용하는 것으로 알려져 있다. 이들 중 겐타마이신과 카나마이신의 S. aureus의 감수성이 4배 이상 증가하였다.
겐타마이신 또는 카나마이신과 KS16의 병용 요법의 효과를 각각의 개별 활성과 비교하기 위해, checkerboard assay를 수행하여 상승 효과를 확인하였다.
그 결과, 도 7D와 같이 겐타마이신 또는 카나마이신과 KS16의 조합은 상승적인 약물 병용 효과를 기대할 수 있는 FICI 0.5으로 나타났다.
상기 결과로부터 KS16는 겐타마이신과 카나마이신에 의한 항-박테리아 활성에 세포 표적 또는 경로의 일부를 공유함으로써 겐타마이신과 카나마이신의 상승 효과를 나타낼 수 있는 병용처리용 화합물임이 확인되었다.
본 발명의 KS16은 시너지 효과의 정확한 메커니즘은 확인되지 않았으나 겐타마이신과 반코마이신의 조합에서 항생제를 타겟으로 하는 리보솜의 침투성을 증가시킬 것으로 예상됨에 따라, 복합 종에 대한 겐타마이신과 카나마이신의 광범위 활성에도 불구하고 KS16은 S. aureus에 대하여 아직 확인되지 않은 경로를 표적하여 높은 특이성으로 항균 및 상승 작용제의 기능을 모두 수행할 수 있음이 확인되었다.
| Antibiotics | Acronym | Subclass (cellular target) | -KS16 (μg/mL) | +KS16 (μg/mL) |
| Cefoxitin | FOX | Beta-lactam (penicillin-binding proteins) | 2 | 2 |
| Chloramphenicol | CHL | Amphenicol (50S) | 16 | 16 |
| Ciprofloxacin | CIP | Fluoroquinolone (DNA gyrase) |
0.5 | 0.25 |
| Clindamycin | CLI | Lincosamide (50S) | 0.125 | 0.125 |
| Erythromycin | ERY | Macrolide (50S) | 0.5 | 0.5 |
| Fusidate | FUS | Steroid (EF-G) | 0.25 | 0.25 |
| Gentamicin | GEN | Aminoglycoside (30S) | 1 | 0.25 |
| Kanamycin | KAN | Aminoglycoside (30S) | 4 | 1 |
| Linezolid | LZD | Oxazolidinone (50S) | 2 | 2 |
| Mupirocin | MUP | Isoleucyl t-RNA synthetase | 0.25 | 0.25 |
| Penicillin | PEN | Beta-lactam (peptidoglycan) | 0.063 | 0.063 |
| Quinupristin/ Dalfopristin | SYN | Lincosamide (50S) | 0.25 | 0.25 |
| Rifampin | RIF | Rifampicin(RNA polymerase) | 0.015 | 0.015 |
| Streptomycin | STR | Aminoglycoside (30S) | 8 | 4 |
| Sulfamethoxazole | SMX | Sulphonamide (Dihydropteroate synthase, DHPS) | 64 | 64 |
| Tetracycline | TET | Tetracycline (30S) | 0.5 | 0.5 |
| Tiamulin | TIA | Pleuromutilin (50S) | 1 | 1 |
| Trimethoprim | TMP | Dihydrofolate reductase | 2 | 2 |
| Vancomycin | VAN | Glycopeptide (cell wall) | 2 | 2 |
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (13)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 하기 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 옥시인돌 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항균조성물.
[화학식 2]
상기 화학식 2에 있어서,
R1은 수소, C1 내지 C4의 알킬, C1 내지 C4의 알콕시 및 할로겐으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고, R2는 수소, C1 내지 C4의 알콕시 및 할로겐으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나임.
[화학식 3]
상기 화학식 3에 있어서,
R1 은 수소, C1 내지 C4 알콕시 및 할로겐으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이고, X는 NCH3 및 S로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나임. - 청구항 6에 있어서, 상기 화학식 2로 표시되는 옥시인돌 유도체는 3-(1H-인돌-3-일)인돌린-2-온, 3-(1H-인돌-3-일)-5-메틸인돌린-2-온 , 3-(1H-인돌-3-일)-5-메톡시인돌린-2-온, 5-플루오로-3-(1H-인돌-3-일)인돌린-2-온, 5-클로로-3-(1H-인돌-3-일)인돌린-2-온, 7-클로로-3-(1H-인돌-3-일)인돌린-2-온, 4-브로모-3-(1H-인돌-3-일)인돌린-2-온, 5-브로모-3-(1H-인돌-3-일)인돌린-2-온, 3-(5-메톡시-1H-인돌-3-일)인돌린-2-온, 3-(5-플루오로-1H-인돌-3-일)인돌린-2-온, 5-메톡시-3-(5-메톡시-1H-인돌-3-일)인돌린-2-온 및 3-(5-플루오로-1H-인돌-3-일)-5-메톡시인돌린-2-온으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 옥시인돌 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항균조성물.
- 청구항 6에 있어서, 상기 화학식 3으로 표시되는 옥시인돌 유도체는 3-(1-메틸-1H-피롤-2-일)인돌린-2-온, 5-메톡시-3-(1-메틸-1H-피롤-2-일)인돌린-2-온, 4-클로로-3-(1-메틸-1H-피롤-2-일)인돌린-2-온, 4-브로모-3-(1-메틸-1H-피롤-2-일)인돌린-2-온, 5-브로로-3-(1-메틸-1H-피롤-2-일)인돌린-2-온, 3-(티오펜-2-일)인돌린-2-온, 5-클로로-3-(티오펜-2-일)인돌린-2-온 및 5-브로모-3-(티오펜-2-일)인돌린-2-온으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 옥시인돌 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항균조성물.
- 청구항 6에 있어서, 상기 항균조성물은 포도상구균(Staphylococcus species)에 대하여 특이적인 항균활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 항균조성물.
- 청구항 6에 있어서, 상기 항균조성물은 시프로플록사신(ciprofloxacin), 겐타마이신 (gentamicin), 카나마이신 (kanamycin) 및 스트렙토마이신 (streptomycin)으로 이루어진 군에서 선택되는 항생제와 병용처리되는 것을 특징으로 하는 항균조성물.
- 삭제
- 청구항 6에 따른 항균조성물을 유효성분으로 함유하는 포도상구균(Staphylococcus species) 억제용 약학조성물.
- 청구항 6에 따른 항균조성물을 유효성분으로 함유하는 포도상구균(Staphylococcus species) 억제용 식품보존제 조성물.
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