KR102211866B1 - Nanoparticle dimer linked by Y-shaped oligonucleotide conjugate, Method for producing the same, and Probe for single molecule observation comprising the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 Y형 올리고 뉴클레오티드 결합체에 의해 연결된 나노입자 이합체, 이의 제조방법, 및 이를 포함하는 단일 분자 관찰용 프로브에 관한 것으로, 본 발명에서는 자이로스코픽(회전 운동의) 플라즈몬 나노입자를 개발하여 단백질-단백질 상호 작용과, 회전 및 측면 속도를 기반으로한 구조적 동역학의 반복 검증을 가능하게 함으로써, 단일 분자 스트로보스코픽 이미징 프로브를 제공한다.The present invention relates to a nanoparticle dimer linked by a Y-type oligonucleotide conjugate, a preparation method thereof, and a probe for single molecule observation including the same.In the present invention, a gyroscopic (rotational) plasmon nanoparticle was developed to develop a protein- It provides a single molecule stroboscopic imaging probe by enabling iterative validation of structural dynamics based on protein interactions and rotation and lateral velocities.
Description
본 발명은 Y형 올리고 뉴클레오티드 결합체에 의해 연결된 나노입자 이합체, 이의 제조방법, 및 이를 포함하는 단일 분자 관찰용 프로브에 관한 것이다.The present invention relates to a nanoparticle dimer linked by a Y-type oligonucleotide conjugate, a preparation method thereof, and a probe for single molecule observation including the same.
살아있는 세포에서 단백질의 회전 및 측면 이동은 열에너지에 의해 추진되고, 생물학적 과정에서 생체 분자내와 생체 분자 사이의 생화학적, 정전기적 상호 작용에 의해 동요된다. 따라서 각 분자의 방향과 운동을 실시간으로 관찰하면 균질 또는 불균질 분자 상호 작용과 그 구조적 동역학 모두가 나타난다.In living cells, the rotation and lateral movement of proteins are driven by thermal energy, and in biological processes, they are disturbed by biochemical and electrostatic interactions between biomolecules and biomolecules. Therefore, observing the direction and motion of each molecule in real time reveals both homogeneous or heterogeneous molecular interactions and their structural dynamics.
단일 분자 추적과 FRET(Forster resonance energy transferForster)을 기반으로 한 최근의 연구는 생물학적 과정에서 단백질-단백질 상호 작용과 구조 변화를 각각 보여준다. 이러한 미시적 방법은 개개의 생체 분자 동역학의 시간적 궤적을 디콘볼루션하여(deconvoluting) 앙상블 애버리징에 의해 가려진 구조 및 운동 데이터를 획득한다.Recent studies based on single molecule tracking and Forster resonance energy transferForster (FRET) reveal protein-protein interactions and structural changes in biological processes, respectively. This microscopic method deconvolutes the temporal trajectory of individual biomolecular dynamics to obtain structure and motion data obscured by ensemble averaging.
그러나 신호 전달 과정에서 구조 동역학 (conformational dynamics)과 그 전이 (transition)에 대한 조절은 여전히 불분명하다. 회전 역학이 근본적인 분자 메커니즘에 대한 새로운 통찰을 제공할 수 있을 것이다.However, the control of conformational dynamics and their transitions in the signaling process is still unclear. Rotational mechanics could provide new insights into the underlying molecular mechanisms.
단일 분자 수준에서 막 수용체 회전 및 측면 동역학을 이미징하기 위한 이상적인 프로브는, (i) 각 변위에 민감한 밝은 이미징 도메인, (ii) 구조적 동요를 방지하는 리지드한 링커, 및 (iii) 주요 회전 축에서 정확한 위치와 방향을 위한 특정 타겟팅 도메인을 포함할 것이다.Ideal probes for imaging membrane receptor rotation and lateral kinetics at the single molecule level include (i) a bright imaging domain sensitive to angular displacement, (ii) a rigid linker that prevents structural perturbation, and (iii) accurate at the major axis of rotation. It will include specific targeting domains for location and orientation.
상기한 요건을 만족하는 신규 프로브를 개발하기 위해 노력하던 중, 본 발명자들은 본 발명의 Y-형 올리고 뉴클레오티드 결합체에 의해 연결된 나노입자 이합체를 사용하여, 막 단백질, 상피 성장 인자 수용체 (EGFR)의 회전 운동을 모니터링하고, 분자 동요없이 살아있는 세포에서 규명되지 않은 구조 역학, 예를 들어 분자 어셈블리와 구조 변화를 시각화하는 전략을 제공할 수 있음을 규명하였으며, 분자 역학의 기본 메커니즘의 독자적인 통찰을 제공할 수 있음을 확인한 바, 본 발명을 완성하였다.While trying to develop a novel probe that satisfies the above requirements, the present inventors used the nanoparticle dimer linked by the Y-type oligonucleotide conjugate of the present invention to rotate the membrane protein and epidermal growth factor receptor (EGFR). It has been found that it can provide strategies to monitor motion and visualize unidentified structural dynamics, e.g. molecular assembly and structural changes in living cells without molecular perturbation, and can provide unique insights into the underlying mechanisms of molecular dynamics. It was confirmed that the present invention was completed.
본 발명의 목적은 (i) 각 변위에 민감한 밝은 이미징 도메인, (ii) 구조적 동요를 방지하는 리지드한 링커, 및 (iii) 주요 회전 축에서 정확한 위치와 방향을 위한 특정 타겟팅 도메인을 포함하는, 단일 분자 수준의 막 수용체 회전 및 측면 동역학 등을 이미징하기 위한 프로브를 위하여, 신규한 Y-형 올리고 뉴클레오티드 결합체에 의해 연결된 나노입자 이합체를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to comprise (i) a bright imaging domain sensitive to angular displacement, (ii) a rigid linker that prevents structural perturbation, and (iii) a specific targeting domain for precise position and orientation in the main axis of rotation. To provide a nanoparticle dimer linked by a novel Y-type oligonucleotide conjugate for a probe for imaging membrane receptor rotation and lateral kinetics at the molecular level.
본 발명의 다른 목적은 상기 신규 Y-형 올리고 뉴클레오티드 결합체에 의해 연결된 나노입자 이합체의 제조방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for preparing a nanoparticle dimer linked by the novel Y-type oligonucleotide conjugate.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규 Y-형 올리고 뉴클레오티드 결합체에 의해 연결된 나노입자 이합체를 포함하는 단일 분자 관찰용 프로브를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a probe for single molecule observation comprising a nanoparticle dimer linked by the novel Y-type oligonucleotide conjugate.
상기 목적을 달성하기 위하여,To achieve the above object,
본 발명은 3개의 올리고 뉴클레오티드의 상보적 결합에 의해 형성된 Y형 올리고 뉴클레오티드 결합체; 및The present invention provides a Y-type oligonucleotide conjugate formed by complementary bonding of three oligonucleotides; And
상기 Y형 올리고 뉴클레오티드 결합체에 의해 연결되는 2개의 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나노입자;를 포함하는 나노입자 이합체를 제공한다.It provides a nanoparticle dimer comprising; metal nanoparticles capable of two phlosmonic couplings connected by the Y-type oligonucleotide conjugate.
또한, 본 발명은 Y형 올리고 뉴클레오티드 결합체를 형성할 수 있는 상보적인 염기서열을 포함하는 제1-제3의 올리고 뉴클레오티드를 준비하는 단계;In addition, the present invention comprises the steps of preparing a first-third oligonucleotide comprising a complementary nucleotide sequence capable of forming a Y-type oligonucleotide conjugate;
상기 준비된 제1 및 제2 올리고 뉴클레오티드를 각각 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나노입자와 1가(monovalent)가 되도록 부착시키는 단계;Attaching the prepared first and second oligonucleotides to be monovalent with metal nanoparticles capable of phlosmonic coupling, respectively;
상기 단계에서 제조된 제1 올리고 뉴클레오티드가 부착된 1가 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나노입자와 제2 올리고 뉴클레오티드가 부착된 1가 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나노입자를 혼합하여, 나노입자 이합체를 제조하는 단계;를 포함하는, 나노입자 이합체의 제조방법을 제공한다.By mixing the metal nanoparticles capable of monovalent phlosmonic coupling to which the first oligonucleotide prepared in the above step is attached and the metal nanoparticles capable of monovalent phlosmonic coupling to which the second oligonucleotide is attached, the nanoparticles It provides a method for preparing a dimer comprising; preparing a dimer.
나아가, 본 발명은 3개의 올리고 뉴클레오티드의 상보적 결합에 의해 형성된 Y형 올리고 뉴클레오티드 결합체; 및Further, the present invention provides a Y-type oligonucleotide conjugate formed by complementary bonding of three oligonucleotides; And
상기 Y형 올리고 뉴클레오티드 결합체에 의해 연결되는 2개의 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나노입자;를 포함하는 단일 분자 관찰용 프로브를 제공한다.It provides a probe for single-molecule observation comprising; metal nanoparticles capable of two phlosmonic couplings connected by the Y-type oligonucleotide conjugate.
또한, 본 발명은 Y형 올리고 뉴클레오티드 결합체를 형성할 수 있는 상보적인 염기서열을 포함하는 제1-제3의 올리고 뉴클레오티드를 준비하는 단계;In addition, the present invention comprises the steps of preparing a first-third oligonucleotide comprising a complementary nucleotide sequence capable of forming a Y-type oligonucleotide conjugate;
상기 준비된 제1 및 제2 올리고 뉴클레오티드를 각각 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나노입자와 1가(monovalent)가 되도록 부착시키는 단계;Attaching the prepared first and second oligonucleotides to be monovalent with metal nanoparticles capable of phlosmonic coupling, respectively;
상기 단계에서 제조된 제1 올리고 뉴클레오티드가 부착된 1가 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나노입자와 제2 올리고 뉴클레오티드가 부착된 1가 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나노입자를 혼합하여, 나노입자 이합체를 제조하는 단계;By mixing the metal nanoparticles capable of monovalent phlosmonic coupling to which the first oligonucleotide prepared in the above step is attached and the metal nanoparticles capable of monovalent phlosmonic coupling to which the second oligonucleotide is attached, the nanoparticles Preparing a dimer;
제3 올리고 뉴클레오티드가 표적 단일 분자를 인식할 수 있도록 기능화시키는 단계;Functionalizing the third oligonucleotide to recognize the target single molecule;
상기 단계에서 기능화된 제3 올리고 뉴클레오티드를 하나 이상의 표적 단일 분자를 포함하는 샘플에 노출시키는 단계;Exposing the third oligonucleotide functionalized in said step to a sample comprising at least one target single molecule;
상기 샘플에 상기 나노입자 이합체를 처리하여 제3 올리고 뉴클레오티드와 혼성화시키는 단계; 및Hybridizing with a third oligonucleotide by treating the sample with the nanoparticle dimer; And
상기 샘플에서 나노입자 이합체를 탐지하는 단계;를 포함하는, 표적 단일 분자의 관찰 또는 검출 방법을 제공한다.It provides a method for observing or detecting a single target molecule comprising; detecting a nanoparticle dimer in the sample.
본 발명자들은 신규 Y형 올리고 뉴클레오티드 결합체로 연결된 나노입자 이합체를 적용하여, 2-차원 모델 막인 지질 이중층 (SLB)에서 지질 분자의 확산 역학(diffusive dynamics)을 시각화하였고, 다양한 이미징 프로브를 사용하여 측정된 확산 계수를 비교함으로써, 본 발명의 Y-형 나노입자 이합체(mGYRO)가 확산 동요없이 단일 분자 이미징 프로브로 사용될 수 있음을 확인한 바, 본 발명은 단일 분자 관찰 또는 검출에 유용한 신규 프로브를 제공하는 유용한 효과가 있다.The present inventors applied a nanoparticle dimer linked with a novel Y-type oligonucleotide conjugate to visualize the diffusive dynamics of lipid molecules in a lipid bilayer (SLB), a two-dimensional model membrane, and measured using various imaging probes. By comparing the diffusion coefficient, it was confirmed that the Y-type nanoparticle dimer (mGYRO) of the present invention can be used as a single molecule imaging probe without diffusion fluctuations, and the present invention is useful to provide a novel probe useful for single molecule observation or detection. It works.
도 1. (a) 두 단일 관능화된 금 나노입자 (mAu NPs) 컨쥬게이팅 mGYRO의 합성, (b) 기능화된 제어 궤적을 보여주는 mGYRO의 TEM 이미지, (c) 두 개의 mGYRO의 다크 필드(DF) 이미지 (별개의 각도 (위), 왼쪽) 및 상응하는 SEM 이미지 (오른쪽 위), 직선 편광은 일정 각도 (화살표)로 조사된다. 각도 변화에 따라 두 입자의 산란 강도가 플롯되고 사인 함수에 적용된다. 두 기간의 차이에 따라, 입자는, SEM과 잘 일치하는, 라디안으로 1.32의 다른 각도에 있다. (d) 0.14 편차 (n = 21)의 각도 오차 분포 (θOM - θSEM, rad). (e) 각도 민감도는 (Imax - Imin)/Imax로 계산되어 Au 구에 대해 0.14 ± 0.03 (mean ± SD), mGYRO에 대해 0.61 ± 0.08, Au 로드에 대해 0.60 ± 0.09의 값을 산출한다. (f-i) 0.2 mg/mL BSA 쿠션 처리된 SLB에서의 지질 분자 모니터링. (f) 지질 분자 궤도 (확산 계수, 0.52 μm2/s) 및 (g) 해당 강도 및 DF 이미지. (h) 누적 제곱 변위 (CSD)와 누적 제곱 각 변위 (CSAD)가 도시되어 있다. (i) 지질 분자의 평균 확산 계수와 각속도는 각각 0.35 ± 0.19 μm2/s, 52 rad/s, (n = 47)이다.
도 2. (a) EGFR 공동 국소화(colocalization)의 설계, (b) 입자간 거리에 따른 Au 다이머의 상대 산란 강도. EGFR의 관찰 가능한 공동 국소화(colocalization)의 세 가지 주요 유형, (c) 공동, (d) 일시적 접촉, 및 (e) 물리적 접촉 없이 지나감 (3 개의 독립적 인 실험으로부터 모아진 12 개의 세포 중 541 개의 동시 발병 사건으로부터 각각 3, 31, 66 %), 각 Au NP의 산란 강도 변화와 HMM 분석 (f-h), 누적 제곱 변위 (CSD)- 측면 확산 데이터로부터의 HMM 분석(i-k), 공동 국소화(colocalization) 전후의 일정한 CSD 기울기 (f, i), 두 개의 EGFR은 단순한 충돌 (g, j), 또는 물리적 접촉 (h, k)없이 지나가는 것을 도시한다.
도 3. 살아있는 세포와 그 전이 역학에서 EGFR의 올리고머화 및 구조적 상태, (a) mGYRO의 표적화 전략의 도식적 표현, (b) mGYRO의 특이적인 표지화를 보여주는 다크 필드 (DF) 이미지, (c) 선형 편광된 DF 영상에서 mGYRO의 산란 강도가 변동한다, (d) CSD (오렌지색)와 HMM 분석을 통해 분석된 2 개의 분리된 상태 (적색)는 EGFR이 가역적으로 단량체 및 이량체를 형성한다는 것을 나타낸다(상단). CSAD (청록색)와 HMM (청색)을 통해 분석된 3 개의 분리된 상태는 EGFR이 세포 내 도메인 (ICD) (하부)과 관련하여 그들의 형태를 변화시킨다는 것을 나타낸다. 해당 궤적이 강도 및 대비(삽화)의 변화와 함께 표시된다. (e) 올리고머 상태와 구조 상태의 전이는 상태 기호와 제안된 모델로 표현된다. 각 상태에 대한 체류 시간 (τ)은 표에 나열되어 있다. M1 = 100, M2 = 70, M3 = 0 (forbidden), D1 = 190, D2 = 20 및 D3 = 11) 20 개의 상이한 세포로부터 총 400 개의 별개의 상태가 관찰되었다.
도 4. 광학 특성과 표면 원자가를 고려한 mGYRO의 전반적인 합성 전략.
이미징 프로브에 대한 최상의 성능을 얻으려면 금 나노 입자 (Au NP)의 광학 특성을 확인해야한다. (a) mGYRO의 합성 전략의 개략도, 먼저, 투과 전자 현미경 (TEM) 측정 (b) 및 다크 필드 현미경 (삽입)으로 다양한 크기의 Au NP를 합성하고 특성화분석한다. 측정된 입자의 크기는 15 ± 1, 20 ± 2, 25 ± 3, 30 ± 3 nm이었다 (n = 118, 127, 53, 107). 다음으로, 1가 DNA로 기능화된 Au NP에 대해, 티올레이트화된 DNA의 농도가 증가함에 따른 적정이 수행된다. (c) 0, 0.3, 0.5 및 1 당량의 DNA 농도를 Au NP와 반응시키고 다가 입자의 수는 DNA 농도의 함수로서 증가시켰다. 아가로오스 겔 전기 영동은 다가 Au NP가 대량 증식으로 인해 더 느리게 이동한다는 것을 보여주었다. (d) 각 1-4 레인의 경우 1가 생성물의 백분율은 0, 7, 16 및 24 %이다. (e-g) 회전 이미징 프로브의 경우 서로 상보적인 DNA로 단일 작용화된 2 개의 25 nm Au NP를 사용하여 Au 이합체를 제작했다. (e) 따라서, 1가 입자를 아가로오스 겔 전기 영동으로 분리하고 상보적 1가 입자와 접합시킨 다음, 단량체 입자가 이합체 입자 (보라색으로 표시됨)보다 멀리 이동 (적색으로 표시)되도록 이합체를 분리한다. (f) 벌크 측정을 위해 UV-Vis 스펙트럼을 얻었다. 흡광도 피크 (상단)는 단량체의 경우 523 nm에 위치하고, 이론적인 유한 차이 시간 영역 (FDTD) 계산 데이터 (하단)와 잘 일치하는 이합체의 경우 535 nm로 이동한다. (g) 그 다음, 이합체에 대한 TEM 이미지와 다크 필드 현미경 이미지를 확인했다. (h) SNAP-EGFR-GFP 단백질을 발현하는 U2OS 세포는 세포 내 영역의 엔도좀의 산란 강도와 비교하여 녹색 (위쪽), 밝은 영역 (아래쪽) 및 다크 필드 채널 (삽입 영역)을 나타낸다. (i) Au NP와 엔도좀의 산란 강도의 비교. mGYRO의 강도는 유의하게 다르다 (***; p <0.001, nonparametric t- 검정). 그러나 크기가 15 ~ 30 nm 인 단량체 Au NP는 살아있는 세포의 엔도좀과 통계적으로 유의미한 차이가 없었다.
도 5. mGYRO의 광학 안정성. (a) 바이오틴 - 스트렙 타비 딘 상호 작용의 그래픽 (Protein Data Bank, 1MK5 참조) (b) 비오틴은 스트렙 타비 딘 주머니에서 다수의 협동 수소 결합과 소수성 상호 작용을한다(c) SNAP tag-benzylguanine 상호 작용의 그래픽 (PDB, 3KZZ 및 3L00 참조)(d) 벤질 그룹은 Glu159A, Pro140A 및 Tyr154A와의 다수의 소수성 상호 작용 및 SNAP의 포켓 내에서 Tyr158A와의 π-π 상호 작용을 갖는다. 금 나노 입자는 유기 염료와 같은 기존의 이미징 프로브와 비교하여 광학적으로 더 안정적이며 (사진 표백 및 깜박임이 없음) 높은 신호 대 노이즈 비율을 나타냅니다. 더욱이, mGYRO는 링커로서 이중 가닥 DNA를 사용하는데, 이것은 진동 섭동을 일으키지 않을만큼 충분히 단단하다. (e) 안정성을 확인하기 위해, 우리는 프로브에 비오틴을 접합시키고 이것을 표지 슬립에 결합된 스트렙타비딘에 연결시켰다. 산란 강도는 변동이 적고 안정적으로 오래 지속되었다. (f) 대조적으로 텍사스 레드는 단일 분자 강도 변동과 사진 표백을 보여준다. 고강도 조사 하에서, 분자는 1 초 내에 표백된다.
도 6. FDTD 계산에 의해 모의된 입자 간 거리와 크기에 따른 금 이합체의 플라즈모닉 커플링 강화. (a) 입경이 25 nm 일 때 입자 간 거리의 함수로서 산란 강도. (b) 거리가 2 nm 증가함에 따라, 최대 피크 위치는 플라즈몬 결합 효과의 손실로 인해 강도가 감소하면서 청색편이(靑色偏移)된다. 입자 거리가 1nm 일 때, 비대칭 입자에 대한 플라즈몬 공명의 가로 모드 (546nm) 및 세로 모드 (601nm)가 관찰된다. 다른 경우에는 두 가지 모드가 너무 가깝게 구별된다. 상대 강도는 (c)에 그려지고, 단일 지수 감쇄 함수에 맞추어진다. (d) 비대칭 입자는 두 가지 모드의 플라즈몬 공명을 가지기 때문에, 플라즈몬 피크 위치는 직선 편광의 각도에 의존한다. (e) 입자들 사이에 4 nm 간격을 갖는 25 nm 금 이량체의 산란 강도가 입사 된 편광의 각도의 함수로서 표시된다. 입자가 빛의 평면 (0 °) 일 때 강도는 최대 값이지만 입자가 빛의 바깥면 (90 °) 일 때 강도는 최소값이다. (f) 강도를 비교하면, 최대 강도는 최소보다 3 배 이상 높고 플롯은 코사인(cos) 함수에 적합하다.
도 7. 이미징 프로브의 부위-특이적 기능화. mGYRO의 가장 큰 장점은 구체적 위치를 정확하게 목표로 삼는 것이다. (a) Y형 DNA 혼성화가 링커가 이합체의 중심에서 기능화 할 수 있음을 보여주는 개략도이다. 이 경우 링커는 (b)에 표시된 TEM 측정을 위해 10 nm 금 구에 부착된 상보적인 DNA이다. 한편, Au 나노로드와 같은 유사한 선형 플라즈몬 구조는 (c)에 나타낸 바와 같이 연결점을 제어할 수 없다. 구형 나노 입자는 막대의 팁과 측면에 비특이적으로 결합한다.
도 8. mGYRO는 지지된 지질 이중층 (SLB)에서 지질 분자의 확산 동역학을 모니터링하기 위해 적용되었다. (a) mGYRO로 표기된 SLB상의 지질 분자의 다크 필드 스냅 샷이다. 점선 오렌지 라인 안의 입자의 2.5-s 총 궤적이 (b)에 그려져 있다. mGYRO가 Brownian 회전 또는 측면 움직임을 교란시키지 않는지 확인하기 위해 다양한 프로브를 테스트했다. (c) SLB에있는 지질 분자 (팔미트산, C15H31-COOH)의 확산 상수의 누적 분포가 표시되었다. 다양한 프로브는 표면에 다가 (多價, 녹색), 1가 (一價, 파란색) DNA, 금 이량 입자 (mGYRO,적색), 텍사스 레드 (자주색) 인 금 단량체 입자이다. 앙상블 측정을 위해서 FRAP 분석 (오렌지색)을 수행했다. 유리 슬라이드에 비 특이적으로 부착된 고정 Au 입자도 측정되었다 (회색). 누적 분포는 가우시안 함수에 적합하다. (평균 ± SD, 회색, n = 10, 0.006 ± 0.005 μm2/s, 녹색, n = 16, 0.075 ± 0.23 μm2/s; 오렌지색, n = 10, 0.65 ± 0.02㎛2/s; 청색, n = 80, 0.63 ± 0.31 ㎛2/s; 적색, n = 64, 0.66 ± 0.34 μm2/s; 보라색, n = 102, 0.65 ± 0.32 μm2/s). 그러나 지질 분자는 너무 빠르게 회전하여 강도 변동을 관찰한다. 따라서 소혈청 알부민 (BSA) 단백질이 운동을 느리게 하기 위해 적용된다. (d) BSA 농도가 증가함에 따라, 지질 분자의 측방 확산 계수는 감소한다. (평균 ± 표준 편차, 청색, n = 80, 0.63 ± 0.31 μm2/s, 황색, n = 32, 0.35 ± 0.19 μm2/s, 보라색, n = 33, 0.03 ± 0.04 μm2/s). (e) 입자 이동의 궤적으로 중첩된 첫 번째 스냅 샷의 다크 필드 현미경 사진. (f) 입자 궤도와 (g) 강도 변화의 예. 빠르게 움직이는 입자 (f, 왼쪽)는 비 연속적인 강도 변화 (g, 밝은 회색 선)를 나타내지만, 느리게 움직이는 입자 (f, 오른쪽)는 연속적인 강도 변화 (g, 검정색 선)를 나타낸다. 삽입된 사진은 빨간색 점선으로 표시된 기간 동안 입자의 다크 필드 이미지이다.
도 9. 살아있는 세포에 SNAP 태그 융합 EGFR의 특정 라벨링. (a) 시각화를 위한 세포 내 도메인에 연결 및 GFP 단백질에 대한 EGFR의 세포 외 도메인에 SNAP 태그 단백질의 도식을 나타낸다. SNAP 태그 EGFR-GFP는 U2OS 세포에서 잘 발현되어 안정한 세포주를 생성한다. 특이적인 표지를 위해 텍사스 레드 (b)와 골드 다이머 (c)를 벤질-구아닌 (BG-cDNA)과 연결된 DNA에 상보적인 프로브 DNA (각각 DNATR 및 DNAt3)로 기능화시켰다. SNAP 태그된 EGFR을 발현하는 U2OS 세포를 BG-cDNA로 표지하고 이어서 프로브-DNA로 표지하였다. 이미지는 GFP의 녹색 채널에서 형광 현미경으로 촬영하고 텍사스 레드에서는 적색 채널로 촬영하고 다크 필드 이미지는 컬러 카메라로 촬영했다. 첫 번째 줄에는 일반 U2OS 세포가 사용되었다. 따라서 녹색 형광이 보이지 않으며 프로브에는 레이블이 없다. 또한, BG-cDNA와 같은 링커가 없으면 특이적인 표지가 관찰되지 않았다 (두 번째 줄); 이는 양성 대조군 (4 번째 줄)으로서 cDNA (DNAblack)로 차단된 경우에도 해당된다. DNA 서열의 세부 사항은 표 1에 설명되어 있다.
도 10. EGFR 공동 국소화(colocalization)의 통계 분석. (a - c) EGFR의 관찰 가능한 공동 국소화(colocalization) 세 가지 주요 유형의 다크 필드 현미경 이미지; (a) 균질 공동, (b) 일시적 접촉, (c) 통과. (d-e) 플라즈모닉 커플링의 존재는 상대 산란 강도 (파란색)와 그들의 HMM 분석 (녹색)에 의해 각각 분석되었다. (g-i) 12 개의 상이한 단일 세포에서 일어나는 총 541 개의 동시 발현 사건을 분석하였다. (g, h) 각국 일치 사건의 발생 빈도는 유의미한 차이를 보였다. 동일한 시야에서 10 초 동안 관찰된 평균 사건은 균질 공동, 일시적 접촉 및 통과에 대해 각각 1.3 ± 0.7, 14.2 ± 4.6 및 29.6 ± 7.7 (평균 ± 표준 편차)이었다. (I, j) 공동 국소화 기간은 중요한 차이를 보여준다. 평균 지속 시간은 각각 220 ± 74, 72 ± 30 및 41 ± 18 ms였다. (평균 ± SD, ***, p <0.001, nonparametric t-검정). 플라스몬 커플링이 없는 "통과"를 나타내는 약간 높은 증진과 함께(m, n), 고도로 정렬된 공동화 현상은 거의 관찰되지 않았다(k, i) (541 건 중 2 건).
도 11. 시뮬레이션된 Brownian 외측 및 회전 궤적을 사용하여 HMM 분석을 평가하는 사고 실험. 확률론적 변화로부터 이산화 및 회전의 이산 상태를 검출하기 위해 우리는 mGYRO-EGFR의 궤적에 히든 Markov 알고리즘 (HMM-Bayes) 및 HaMMy를 통합 한 베이지안 모델을 적용했다. (a) 사고 실험의 도식 및 (b) 임의 수 생성에 의한 모의 궤도. 우리는 처음에 모델 사고 실험을 가정했는데, 수용체는 그들의 단량체 대 이량체 상태 (M 대 D)와 전개되지 않은 상태와 접힌 상태 (2 대 1) 때문에 각각 두 개의 측면 확산 및 두 개의 회전 상태에서 독립적으로 동적 변화를 나타낸다. 그런 다음 HMM을 적용하여 상태를 분리하고 그 결과를 비교하고 의도한 시뮬레이션 전환 (c, d)에서 누적 제곱 (각도) 변위 (CSD 및 CSAD)를 계산한다. 결과에서 모든 데이터가 완전히 분리된 것처럼 보인 것은 아니다. 일부 빠른 상태 전이는 HMM으로 분석할 수 없다. 따라서 우리는 HMM 분석을 위한 주 기간 프레임의 중요성을 검증했다. (e-g) 의도된 상태 (적색 선)와 HMM 분석 상태 (청색 선)는 상태 지속 기간 프레임 변경의 수로 표시된다. 각 계산에서 500 프레임이 스택되었고 느린 상태에서 빠른 상태로의 상태 전이가 7 번 발생하도록 설정되었다. 상태 기간 프레임의 수는 각각 (e) 3, (f) 5 및 (g) 9이다. (h) 상태 지속 기간 프레임의 함수로서 분리 확률 그래프. 각 지점에는 7 가지 계산이 포함되어 있다. 결과적으로, 5 프레임보다 짧은 상태 지속 시간은 낮은 확률로 HMM에 의해 식별되었다.
도 12. EGF 리간드 처리 후 EGFR의 올리고머화. 100 ng/μL EGF 20 μL를 적용한 후 SNAP-EGFR-GFP 발현 세포 (a) 0 및 (b) 30 분 후의 형광 이미지. (c) a, b의 흰색 점선 상자는 z 축의 강도를 보여주는 3 차원 이미지에서 재구성된다. 강도 강화점이 EGFR 클러스터 형성을 나타내는 것으로 명확하게 관찰되었다. (d-f) 활화 후 EGFR의 확산 역학을 조사하기 위해 FRAP 측정을 수행했다. 고강도의 빛을 특정 영역에 조사하여 GFP를 30 초 동안 표백시킨 후, 넓은 개방도에서 100ms의 노출 시간으로 아무런 간격도없이 사진을 3 분간 촬영했다. EGF 처리 후 0, 30 분 동안 확산 계수는 각각 0.16 ± 0.05 μm2/s와 0.09 ± 0.05 μm2/s (mean ± SD)로 계산되었다. (**; p <0.01, nonparametric t-검정). (g-i) 또한, 단일 분자 분석은 Au NP 및 텍사스 레드 (유기 염료)를 사용하여 수행되었다. EGF 처리 후 큰 응집체가 관찰되어 EGFR이 밀집되어 있음을 나타낸다.
도 13. 살아있는 세포의 표면에서 SNAP-EGFR 단백질의 확산 역학. 단일 입자 추적 분석은 다양한 프로브에 의해 표지된 U2OS 살아있는 세포에서 SNAP-EGFR 단백질에 대한 확산 계수를 얻기 위해 수행되었다. (a) 입자 운동의 궤적과 겹쳐지는 다크 필드 이미지의 스냅 샷. EGFR 단백질은 mGYRO (핑크색), 1가 Au NP (오렌지색) 및 다가 Au NPs (녹색)로 이미지화된다. 다가 Au NP의 경우, 비오틴 컨쥬게이팅된-EGFR 항체와 뉴트라비딘 컨쥬게이팅된-Au NP가 사용되었다. 뉴트라비딘의 여러 반응 부위 때문에 Au NP의 응집이 유도되어 더 낮은 확산 계수를 보였다. 유리 슬라이드상의 비특이적으로 고정된 Au NP도 또한 측정되었다 (회색). 엔도좀 (endosomes)도 추적되어 EGFR 단백질과 비교하여 구별할 수 있다. (b) 앙상블 측정을 위해 FRAP 분석 (녹색)을 수행하였다. (c) 가우시안 함수에 맞는 측면 확산 계수의 누적 분포 함수가 그려진다. (n = 189, 0.18 ± 0.09 μm2/s, 분홍색, n = 150, 0.16 ± 0.14 μm2/s, 노란색, n = 64, 0.28 ± 0.12 μm2/s, 녹색, n = 57, 0.06 ± 0.04 μm2/s, 회색, n = 10, 0.008 ± 0.005 μm2/s, FRAP, n = 25, 0.16 ± 0.05 μm2/s).
도 14. 편광자 삽입 전후의 강도 변동. (a) 강도 변동은 편광된 직선 구조로부터 유래한다. 단량체와 이합체는 편광자 삽입 전에 안정된 밝기를 나타내지만 편광자 삽입 후 이합체만 변동을 보인다. 결과는 강도 변화가 Z 축을 따라 아티팩트, 진동 또는 전위가 아닌 각 변위에 기인한다는 것을 나타낸다. (b) 선형 편광자의 인 시츄 설치용 셋업 사진. 전동 회전 컨트롤러에 장착된 편광자를 1-D 레일 스테이지에 설치했다.
도 15. HMM 분석에 의한 이합체 및 다양한 회전 상태를 포함하는 상태 사이의 전이. (a) HMM에 의한 6 가지 전이 분석. 일련의 분석에서 상단 패널에는 CSD 분포 (주황색)와 CSD-HMM 분석 (적색)으로 얻은 상대 확산 계수의 이진 플롯이 표시된다. 하단 패널은 회전 확산 운동을 설명한다. CSAD-HaMMy 분석 (청색)에 의해 얻어진 상대 회전 확산 계수의 CSAD 분포 (시안) 및 삼원 도표. 단량체와 이량체 또는 3 개의 입체 상태 사이의 전이는 명암 변화로 나타난다. (b) 수십 개의 궤적으로부터, CSAD로부터 얻은 회전 속도가 상태에 따라 도시되었다. 특히, 각 구조적 상태 (M1과 M2가 다르며 D1, D2, D3이 다르다)에서 회전 비율(rotation rate) (****; p <0.0001, nonparametric t-검정)가 유의하게 달랐지만, 동일한 구조 상태 D1 또는 M2 및 D2)는 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. 단량체의 회전율은 M1과 M2 각각 11 ± 11 rad2/s (평균 ± 표준 편차), 51 ± 18 rad2/s, 이량체의 회전율은 11 ± 10 rad2/s, 55 ± 14 rad2/s, D1, D2 및 D3에 대해 각각 86 ± 28 rad2/s을 나타낸다. (c) 각 상태의 상대적 체류 시간 (t)이 그래프에 표시된다. 단량체와 이량체 (M1과 D1) 둘 다에 대한 가장 느린 구조 상태는 시간이 우월하다. y-축의 간격은 물결표로 표시된다. 각 상태의 총 체류 시간이 결합되어 삽입 그래프에 표시된다. 이량체 상태 (D1, D2 및 D3)의 총 시간은 단량체 상태 (M1 및 M2)의 총 시간의 두 배이다. 결과는 이량체 올리고머 상태가 에너지적으로 안정하다는 것을 나타내는 것으로 해석될 수 있다.Figure 1.(a) Synthesis of two single functionalized gold nanoparticles (mAu NPs) conjugated mGYRO, (b) TEM image of mGYRO showing functionalized control trajectory, (c) dark field (DF) of two mGYROs Images (discrete angles (top), left) and corresponding SEM images (top right), linearly polarized light is irradiated with a certain angle (arrow). The scattering intensities of the two particles are plotted as the angle changes and applied to a sine function. Depending on the difference between the two periods, the particles are at different angles of 1.32 in radians, which agrees well with the SEM. (d) Angular error distribution (θ OM -θ SEM , rad) of 0.14 deviation (n = 21). (e) The angular sensitivity was calculated as (I max -I min )/I max , yielding a value of 0.14 ± 0.03 (mean ± SD) for Au sphere, 0.61 ± 0.08 for mGYRO, and 0.60 ± 0.09 for Au rod. do. (fi) Monitoring of lipid molecules in 0.2 mg/mL BSA cushioned SLB. (f) Lipid molecular orbital (diffusion coefficient, 0.52 μm 2 /s) and (g) corresponding intensity and DF images. (h) The cumulative squared displacement (CSD) and the cumulative squared angular displacement (CSAD) are shown. (i) The average diffusion coefficient and angular velocity of lipid molecules are 0.35 ± 0.19 μm2/s, 52 rad/s, (n = 47), respectively.
Figure 2. (a) Design of EGFR colocalization, (b) relative scattering intensity of Au dimer according to the distance between particles. Three main types of observable colocalization of EGFR, (c) cavity, (d) transient contact, and (e) passing without physical contact (541 simultaneous out of 12 cells collected from 3 independent experiments) 3, 31, 66% respectively from the onset event), change in scattering intensity of each Au NP and HMM analysis (fh), cumulative square displacement (CSD)-HMM analysis from lateral diffusion data (ik), before and after colocalization With a constant CSD slope of (f, i), the two EGFRs are shown to pass without a simple collision (g, j), or physical contact (h, k).
Figure 3. Oligomerization and structural state of EGFR in living cells and their metastatic kinetics, (a) schematic representation of the targeting strategy of mGYRO, (b) dark field (DF) images showing specific labeling of mGYRO, (c) linear The scattering intensity of mGYRO fluctuates in the polarized DF image, (d) CSD (orange) and two separate states (red) analyzed through HMM analysis indicate that EGFR reversibly forms monomers and dimers ( Top). The three separate states analyzed via CSAD (blue green) and HMM (blue) indicate that EGFR changes their morphology with respect to the intracellular domain (ICD) (bottom). The corresponding trajectory is displayed with changes in intensity and contrast (artwork). (e) The transition of the oligomer state and the structural state is represented by state symbols and the proposed model. The residence times (τ) for each state are listed in the table. M1 = 100, M2 = 70, M3 = 0 (forbidden), D1 = 190, D2 = 20 and D3 = 11) A total of 400 distinct states were observed from 20 different cells.
Fig. 4. Overall synthesis strategy of mGYRO considering optical properties and surface valence.
To get the best performance for your imaging probe, you should check the optical properties of gold nanoparticles (Au NPs). (a) Schematic diagram of the synthesis strategy of mGYRO, first, the synthesis and characterization of Au NPs of various sizes by transmission electron microscopy (TEM) measurement (b) and dark field microscopy (inset). The size of the measured particles was 15 ± 1, 20 ± 2, 25 ± 3, 30 ± 3 nm (n = 118, 127, 53, 107). Next, for Au NPs functionalized with monovalent DNA, titration is performed as the concentration of thiolated DNA increases. (c) DNA concentrations of 0, 0.3, 0.5 and 1 equivalent were reacted with Au NPs and the number of multivalent particles increased as a function of DNA concentration. Agarose gel electrophoresis showed that polyvalent Au NPs migrate more slowly due to mass proliferation. (d) For each lane 1-4 the percentage of monovalent product is 0, 7, 16 and 24%. (eg) In the case of a rotating imaging probe, Au dimers were fabricated using two 25 nm Au NPs single functionalized with DNA complementary to each other. (e) Thus, the monovalent particles are separated by agarose gel electrophoresis, conjugated with the complementary monovalent particles, and then the dimers are separated so that the monomer particles move farther than the dimer particles (indicated in purple) (indicated in red). do. (f) UV-Vis spectrum was obtained for bulk measurement. The absorbance peak (top) is located at 523 nm for the monomer and shifts to 535 nm for the dimer, which agrees well with the theoretical finite difference time domain (FDTD) calculation data (bottom). (g) Then, the TEM image and the dark field microscope image of the dimer were confirmed. (h) U2OS cells expressing the SNAP-EGFR-GFP protein exhibit green (top), bright (bottom) and dark field channels (inserted areas) compared to the scattering intensity of endosomes in the intracellular area. (i) Comparison of the scattering intensity of Au NPs and endosomes. The intensity of mGYRO is significantly different (***; p <0.001, nonparametric t-test). However, monomeric Au NPs with a size of 15 ~ 30 nm did not have a statistically significant difference from the endosomes of living cells.
Figure 5. Optical stability of mGYRO. (a) Graphic of biotin-streptavidin interactions (see Protein Data Bank, 1MK5) (b) Biotin has multiple cooperative hydrogen bonds and hydrophobic interactions in streptavidin pockets (c) SNAP tag-benzylguanine interactions Graphics of (see PDB, 3KZZ and 3L00) (d) Benzyl groups have multiple hydrophobic interactions with Glu159A, Pro140A and Tyr154A and π-π interactions with Tyr158A within the pocket of SNAP. Gold nanoparticles are optically more stable (no photo bleaching and flickering) compared to conventional imaging probes such as organic dyes, and exhibit a high signal-to-noise ratio. Moreover, mGYRO uses double-stranded DNA as a linker, which is hard enough to not cause vibrational perturbation. (e) To confirm the stability, we conjugated biotin to the probe and ligated it to streptavidin bound to the label slip. The scattering intensity has little fluctuation and has been stably long lasting. (f) In contrast, Texas Red shows single molecule intensity fluctuations and photographic bleaching. Under high intensity irradiation, the molecules are bleached within 1 second.
Fig. 6. Enhancement of plasmonic coupling of gold dimers according to the size and distance between particles simulated by FDTD calculation. (a) Scattering intensity as a function of the distance between particles when the particle diameter is 25 nm. (b) As the distance increases by 2 nm, the maximum peak position becomes blue shifted as the intensity decreases due to the loss of the plasmon binding effect. When the particle distance is 1 nm, the transverse mode (546 nm) and longitudinal mode (601 nm) of plasmon resonance for asymmetric particles are observed. In other cases, the two modes are distinguished too closely. Relative intensities are plotted in (c) and fitted to a single exponential decay function. (d) Since asymmetric particles have two modes of plasmon resonance, the plasmon peak position depends on the angle of linear polarization. (e) The scattering intensity of a 25 nm gold dimer with 4 nm spacing between the particles is plotted as a function of the angle of incident polarization. When the particle is in the plane of light (0°), the intensity is the maximum value, but when the particle is in the outer surface of the light (90°), the intensity is at the minimum. (f) Comparing the intensities, the maximum intensity is more than three times higher than the minimum, and the plot is suitable for the cosine function.
Figure 7. Site-specific functionalization of imaging probes. The biggest advantage of mGYRO is its precise targeting of specific locations. (a) Y-type DNA hybridization is a schematic diagram showing that the linker can function at the center of the dimer. In this case, the linker is a complementary DNA attached to a 10 nm metal for the TEM measurement shown in (b). On the other hand, similar linear plasmon structures such as Au nanorods cannot control the connection point as shown in (c). Spherical nanoparticles non-specifically bind to the tip and side of the rod.
8. mGYRO was applied to monitor the diffusion kinetics of lipid molecules in the supported lipid bilayer (SLB). (a) Dark field snapshot of lipid molecules on SLB denoted mGYRO. The 2.5-s total trajectory of the particle in the dotted orange line is plotted in (b). Various probes were tested to ensure that mGYRO did not disturb Brownian rotation or lateral movement. (c) The cumulative distribution of the diffusion constants of lipid molecules (palmitic acid, C 15 H 31 -COOH) in SLB is shown. Various probes are gold monomer particles that are polyvalent (多價, green), monovalent (一價, blue) DNA, gold dimer particles (mGYRO, red), and Texas red (purple) on the surface. FRAP analysis (orange) was performed for ensemble measurement. Fixed Au particles non-specifically attached to the glass slide were also measured (gray). The cumulative distribution fits a Gaussian function. (Mean ± SD, gray, n = 10, 0.006 ± 0.005 μm 2/ s, green, n = 16, 0.075 ± 0.23 μm 2/ s; orange, n = 10, 0.65 ± 0.02 μm 2/ s; blue, n = 80, 0.63 ± 0.31 μm 2/ s; red, n = 64, 0.66 ± 0.34 μm 2/ s; purple, n = 102, 0.65 ± 0.32 μm 2/ s). However, the lipid molecules rotate too quickly to observe intensity fluctuations. Therefore, bovine serum albumin (BSA) protein is applied to slow down exercise. (d) As the BSA concentration increases, the lateral diffusion coefficient of the lipid molecule decreases. (Mean ± standard deviation, blue, n = 80, 0.63 ± 0.31 μm 2/ s, yellow, n = 32, 0.35 ± 0.19 μm 2/ s, purple, n = 33, 0.03 ± 0.04 μm 2/ s). (e) Dark field micrograph of the first snapshot superimposed with the trajectory of particle movement. Examples of (f) particle trajectories and (g) intensity changes. Fast-moving particles (f, left) show non-continuous intensity changes (g, light gray line), while slow-moving particles (f, right) show continuous intensity changes (g, black line). The inserted picture is a dark field image of the particles during the period indicated by the red dotted line.
Figure 9. Specific labeling of EGFR with SNAP tag fusion in living cells. (a) A schematic of the SNAP tag protein in the extracellular domain of EGFR against the GFP protein and ligated to the intracellular domain for visualization is shown. The SNAP tag EGFR-GFP is well expressed in U2OS cells to produce a stable cell line. For specific labeling, Texas red (b) and gold dimer (c) were functionalized with probe DNA (DNA TR and DNA t3 , respectively) complementary to DNA linked to benzyl-guanine (BG-cDNA). U2OS cells expressing SNAP tagged EGFR were labeled with BG-cDNA followed by probe-DNA. Images were taken with a fluorescence microscope in the green channel of GFP, with the red channel in Texas Red, and the dark field image with a color camera. In the first line, normal U2OS cells were used. Therefore, there is no green fluorescence and there is no label on the probe. Also, in the absence of a linker such as BG-cDNA, no specific label was observed (second line); This is also the case when blocked with cDNA (DNAblack) as a positive control (line 4). Details of the DNA sequence are described in Table 1.
Figure 10. Statistical analysis of EGFR colocalization. (a-c) observable colocalization of EGFR Three main types of dark field microscopy images; (a) homogeneous cavity, (b) transient contact, (c) through. (de) The presence of plasmonic coupling was analyzed by relative scattering intensity (blue) and their HMM analysis (green), respectively. (gi) A total of 541 co-expression events occurring in 12 different single cells were analyzed. (g, h) There was a significant difference in the incidence of concordant events in each country. The average events observed for 10 seconds in the same field of view were 1.3 ± 0.7, 14.2 ± 4.6 and 29.6 ± 7.7 (mean ± standard deviation) for homogeneous cavity, transient contact and passage, respectively. (I, j) The period of colocalization shows an important difference. The mean durations were 220 ± 74, 72 ± 30 and 41 ± 18 ms, respectively. (Mean ± SD, ***, p <0.001, nonparametric t-test). With slightly higher enhancement indicating “pass” without plasmon coupling (m, n), highly ordered cavitation phenomena were rarely observed (k, i) (2 of 541).
Figure 11. An accident experiment evaluating HMM analysis using simulated Brownian outer and rotational trajectories. To detect discrete states of discrete and rotation from probabilistic changes, we applied a Bayesian model incorporating the hidden Markov algorithm (HMM-Bayes) and HaMMy on the trajectory of mGYRO-EGFR. (a) Schematic of accident experiment and (b) simulated trajectory by random number generation. We initially assumed model thinking experiments, where receptors were independent in two lateral diffusion and two rotational states, respectively because of their monomer-to-dimer state (M vs. D) and undeveloped and folded state (2 vs. 1). Represents dynamic change. Then, HMM is applied to separate the states, compare the results and calculate the cumulative squared (angular) displacements (CSD and CSAD) at the intended simulation transitions (c, d). Not all data appear to be completely separate in the results. Some fast state transitions cannot be analyzed with HMM. Thus, we verified the importance of the main period frame for HMM analysis. (eg) The intended state (red line) and the HMM analysis state (blue line) are indicated by the number of state duration frame changes. In each calculation, 500 frames were stacked and set so that the slow-to-fast state transition occurred 7 times. The number of state period frames is (e) 3, (f) 5 and (g) 9, respectively. (h) Separation probability graph as a function of state duration frames. Each point contains 7 calculations. As a result, state durations shorter than 5 frames were identified by HMM with low probability.
Figure 12. Oligomerization of EGFR after treatment with EGF ligand. Fluorescence images of SNAP-EGFR-GFP expressing cells (a) 0 and (b) 30 min after applying 20 μL of 100 ng/μL EGF. (c) The white dashed boxes in a and b are reconstructed from a three-dimensional image showing the intensity of the z-axis. It was clearly observed that the strength enhancement point indicates EGFR cluster formation. (df) FRAP measurements were performed to investigate the diffusion kinetics of EGFR after activation. After GFP bleaching for 30 seconds by irradiating a specific area with high intensity light, a picture was taken for 3 minutes without any interval at a wide opening with an exposure time of 100 ms. For 0 and 30 minutes after EGF treatment, the diffusion coefficients were calculated as 0.16 ± 0.05 μm 2 /s and 0.09 ± 0.05 μm 2 /s (mean ± SD), respectively. (**; p <0.01, nonparametric t-test). (gi) In addition, single molecule analysis was performed using Au NP and Texas Red (organic dye). Large aggregates were observed after EGF treatment, indicating that EGFR was concentrated.
Figure 13. Diffusion kinetics of SNAP-EGFR protein on the surface of living cells. Single particle tracking analysis was performed to obtain the diffusion coefficient for the SNAP-EGFR protein in U2OS living cells labeled by various probes. (a) Snapshot of dark field image overlapping the trajectory of particle motion. EGFR proteins are imaged as mGYRO (pink), monovalent Au NPs (orange) and polyvalent Au NPs (green). For multivalent Au NPs, biotin conjugated-EGFR antibodies and neutravidin conjugated-Au NPs were used. Due to the various reaction sites of neutravidin, aggregation of Au NPs was induced, resulting in a lower diffusion coefficient. Nonspecifically immobilized Au NPs on glass slides were also measured (gray). Endosomes can also be tracked and distinguished compared to the EGFR protein. (b) FRAP analysis (green) was performed for ensemble measurement. (c) The cumulative distribution function of the lateral diffusion coefficient that fits the Gaussian function is drawn. (n = 189, 0.18 ± 0.09 μm 2 /s, pink, n = 150, 0.16 ± 0.14 μm 2 /s, yellow, n = 64, 0.28 ± 0.12 μm 2 /s, green, n = 57, 0.06 ± 0.04 μm 2 /s, gray, n = 10, 0.008 ± 0.005 μm 2 /s, FRAP, n = 25, 0.16 ± 0.05 μm 2 /s).
14. Intensity fluctuations before and after insertion of a polarizer. (a) The intensity fluctuations originate from the polarized linear structure. The monomer and dimer show stable brightness before insertion of the polarizer, but only the dimer shows fluctuation after insertion of the polarizer. The results indicate that the change in intensity is due to angular displacement along the Z axis rather than artifacts, vibrations, or dislocations. (b) Picture of the setup for in-situ installation of a linear polarizer. The polarizer mounted on the electric rotation controller was installed on the 1-D rail stage.
Figure 15. Transitions between states including dimers and various rotational states by HMM analysis. (a) Analysis of six transitions by HMM. In a series of analyzes, the top panel shows a binary plot of the CSD distribution (orange) and the relative diffusion coefficients obtained by CSD-HMM analysis (red). The lower panel describes the rotational diffusion motion. CSAD distribution (cyan) and ternary plot of relative rotational diffusion coefficients obtained by CSAD-HaMMy analysis (blue). The transition between the monomer and the dimer or the three steric states appears as a change in contrast. (b) From dozens of trajectories, the rotational speed obtained from CSAD was plotted according to the state. In particular, the rotation rate (****; p <0.0001, nonparametric t-test) was significantly different in each structural state (M1 and M2 are different and D1, D2, D3 are different), but the same structural state D1 Or M2 and D2) did not show a statistically significant difference. The turnover rate of the monomers is 11 ± 11 rad 2 / s (mean ± standard deviation), 51 ± 18 rad 2 / s, respectively, the turnover rate of the dimer is 11 ± 10 rad 2 / s, and 55 ± 14 rad 2 /s , 86±28 rad 2 /s for D1, D2 and D3, respectively. (c) The relative residence time (t) of each state is shown in the graph. The slowest structural states for both monomers and dimers (M1 and D1) are superior in time. The y-axis spacing is indicated by a tilde. The total residence time of each state is combined and displayed in the inset graph. The total time of the dimer state (D1, D2 and D3) is twice the total time of the monomeric state (M1 and M2). The results can be interpreted as indicating that the dimer oligomer state is energetically stable.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, a preferred embodiment is presented to aid the understanding of the present invention. However, the following examples are provided for easier understanding of the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the examples.
본 발명의 일 측면에서, 상보적 결합이 가능한 2개의 올리고 뉴클레오티드; 및In one aspect of the present invention, two oligonucleotides capable of complementary binding; And
상기 상보적 결합이 가능한 2개의 올리고 뉴클레오티드에 의해 연결되는 2개의 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속;를 포함하는 나노입자 이합체가 제공된다.There is provided a nanoparticle dimer comprising two metals capable of phlosmonic coupling, which are linked by two oligonucleotides capable of complementary binding.
보다 구체적으로 본 발명의 나노입자 이합체는, 두 개의 나노입자로 구성되어 있고, 각각의 나노입자의 표면에 올리고뉴클레오티드가 결합되어 있으며, 기 두 개의 올리고뉴클레오티드 간의 혼성결합을 통하여 연결되어 있는 구조를 가지고 있다.More specifically, the nanoparticle dimer of the present invention is composed of two nanoparticles, an oligonucleotide is bonded to the surface of each nanoparticle, and has a structure that is linked through a hybrid bond between the two oligonucleotides. have.
또한, 상기 혼성결합이 이루어임으로써, 두 나노입자에 의한 플라즈모닉 커플링 효과에 의하여, 향상된 이미징을 제공할 수 있다.In addition, since the hybrid bonding is performed, improved imaging may be provided by the plasmonic coupling effect of the two nanoparticles.
여기서, 상기 올리고 뉴클레이티드 간의 적어도 일부 이상의 상보적인 서열을 통하여, 예를 들어 적어도 일부 이상의 혼성화를 통하여, 이합체를 형성할 수 있다.Here, a dimer may be formed through at least part of the complementary sequence between the oligonucleotides, for example, through at least part of the hybridization.
본 발명에서 상기 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속는 플라즈모닉 커플링이 가능한 모든 종류의 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속를 말하며, 예를 들어, 금 또는 은이다.In the present invention, the metal capable of the psmonic coupling refers to a metal capable of all types of plasmonic coupling capable of plasmonic coupling, for example, gold or silver.
따라서, 바람직한 양태로서 본 발명은 금 또는 은 나노입자 두개가 연결된 나노입자 이합체이고, 두 나노입자는 플라즈모닉 커플링을 한다.Therefore, as a preferred embodiment, the present invention is a nanoparticle dimer in which two gold or silver nanoparticles are connected, and the two nanoparticles perform plasmonic coupling.
상기와 같은 본 발명 나노입자 이합체는 호모이합체 또는 헤테로이합체로 존재할 수 있다. 호모이합체는 크기와 구조가 동일한 나노입자 두개가 연결되어 이합체를 형성하는 것이고, 헤테로 이합체는 크기 또는 구조가 서로 다른 나노입자 두개가 연결되어 이합체를 형성하는 것이다.The nanoparticle dimer of the present invention as described above may exist as a homodimer or a heterodimer. A homodimer is a unit in which two nanoparticles of the same size and structure are connected to form a dimer, and a heterodimer is a unit in which two nanoparticles having different sizes or structures are connected to form a dimer.
바람직하게 본 발명의 이합체는 호모이합체이고, 나노입자의 크기는 플라즈모닉 커플링을 가질 수 있는 것이라면 제한이 없으나, 예를 들어, 1-1000 nm, 1-500 nm, 1-100 nm, 바람지하게 1-50 nm, 1-40 nm, 1-30 nm, 2-50 nm, 5-50 nm, 10-40 nm, 20-40 nm, 20-30 nm, 또는 약 25 nm의 크기를 갖는 것, 예를 들어 나노입자는 형상면에서 대략 구형일 수 있으나, 임의의 형상 또는 불규칙 형상의 나노입자들이 사용될 수 있다.Preferably, the dimer of the present invention is a homodimer, and the size of the nanoparticles is not limited as long as it can have a plasmonic coupling, but, for example, 1-1000 nm, 1-500 nm, 1-100 nm, 1-50 nm, 1-40 nm, 1-30 nm, 2-50 nm, 5-50 nm, 10-40 nm, 20-40 nm, 20-30 nm, or having a size of about 25 nm , For example, the nanoparticles may be substantially spherical in shape, but nanoparticles of any shape or irregular shape may be used.
한편, 상기 두 입자 사이의 거리는 플라즈모닉 커플링을 가질 수 있는 것이라면 제한이 없으나, 예를 들어, 1 nm 이상, 1-10 nm, 1-8 nm, 1-7 nm, 2-8 nm, 3-6 nm, 또는 약 4nm일 수 있다.Meanwhile, the distance between the two particles is not limited as long as it can have plasmonic coupling, but, for example, 1 nm or more, 1-10 nm, 1-8 nm, 1-7 nm, 2-8 nm, 3 -6 nm, or about 4 nm.
본 발명의 나노입자 표면에는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드가 결합되어 기능화되어 있을 수 있으나, 바람직하게 하나의 올리고뉴클레오티드가 결합되어 기능화되어 있을 수 있다. 특히 제어된 이미징을 하기 위하여, 하나의 나노입자 표면에는 하나의 올리고뉴클레오티드가 결합되어 기능화되어 있는 것이 가장 바람직하다.One or more oligonucleotides may be functionalized by binding to the surface of the nanoparticles of the present invention, but preferably one oligonucleotide may be functionalized by binding. In particular, for controlled imaging, it is most preferable that one oligonucleotide is functionalized by binding to the surface of one nanoparticle.
나노입자 표면에 3' 또는 5' 말단이 티올로 개질되어 있는 하나의 올리고 뉴클레오티드가 결합될 수 있다. One oligonucleotide having a 3'or 5'end modified with a thiol may be attached to the nanoparticle surface.
여기서, 상기 두 나노입자가 갖는 각각의 올리고 뉴클레오티드는 서로 상보적 염기 서열을 갖는 것으로서, 두 나노입자는 각각의 올리고 뉴클레오티드의 혼성화(hybridization)를 통해 나노입자 이합체 구조가 형성된다.Here, each oligonucleotide of the two nanoparticles has a base sequence complementary to each other, and the two nanoparticles form a nanoparticle dimer structure through hybridization of each of the oligonucleotides.
단, 본 발명에서 제공하는 나노이합체는 상기 각각의 나노입자가 가지는 올리고 뉴클레오티드에 의하여 이합체가 형성되는 것이기는 하나, 반드시 적어도 상기 각각의 올리고 뉴클레오티드는 또 다른 제3의 올리고 뉴클레오티드와 혼성화 할 수 있는 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.However, although the nanodimer provided by the present invention is a dimer formed by oligonucleotides of each of the nanoparticles, at least each oligonucleotide must be a base capable of hybridizing with another third oligonucleotide. It is characterized by having a sequence.
즉, 본 발명에서 제공하는 나노입자 이합체는 두 나노입자 사이에 각각의 표면에 부착되는 올리고 뉴클레오티드를 제외하고 또 다른 하나의 올리고 뉴클레오티드와 함께 Y-형상의 상보적 결합을 형성하는 것을 특징으로 한다.That is, the nanoparticle dimer provided in the present invention is characterized by forming a Y-shaped complementary bond with another oligonucleotide except for the oligonucleotide attached to each surface between the two nanoparticles.
특히, 이 Y-형상을 통하여 보다 리지드한 결합이 가능하고, 불완전한 결합에 의하여 섭동(또는 동요) 없이 보다 양질의 이미징이 가능하다.In particular, through this Y-shape, more rigid coupling is possible, and better quality imaging without perturbation (or fluctuation) is possible due to incomplete coupling.
따라서, 본 발명에서 제공하는 나노입자 이합체는 두개의 나노입자 각각의 표면에 제1, 제2 올리고 뉴클레오티드를 갖되, 제1 및 제2 올리고 뉴클레오티드는 상보적 결합이 가능하되, 반드시 제3의 올리고 뉴클레오티드와의 상보적 결합이 가능해야 하며, 바람직하게 Y-형상의 리지드한 결합이 가능한 것으로 선택되어야 한다.Therefore, the nanoparticle dimer provided by the present invention has first and second oligonucleotides on the surfaces of each of the two nanoparticles, but the first and second oligonucleotides are capable of complementary binding, but must be a third oligonucleotide. Complementary bonding with and should be possible, and preferably, it should be selected as capable of Y-shaped rigid bonding.
이에, 제한되지 않으나, 각각의 제1, 제2, 및 제3의 올리고 뉴클레오티드는 적어도 일부의 상보적 염기 서열을 갖고, 예를 들어, 제1 올리고 뉴클레오티드는 적어도 부분적으로 제2 뉴클레오티드와 상보적인 염기 서열을 갖으면서, 나머지 부분으로 제3 뉴클레오티드와 상보적인 염기 서열을 갖는 것이다. 동시에 제2 뉴클레오티드는 상기 제1 뉴클레오티드와 상보적인 염기 서열을 갖으면서, 제3 올리고 뉴클로에 티드의 나머지 부분과 상보적인 염기 서열을 갖는다.Thus, without limitation, each of the first, second, and third oligonucleotides has at least some complementary base sequence, e.g., the first oligonucleotide is at least partially complementary to the second nucleotide. While having a sequence, it has a base sequence complementary to the third nucleotide as the rest. At the same time, the second nucleotide has a base sequence that is complementary to the first nucleotide and a base sequence that is complementary to the rest of the third oligonucleotide.
물론 상기의 상보적 결합 또는 상보적인 염기 서열은 연속적이거나, 또는 적어도 하나 이상의 스페이서를 갖는 염기서열일 수 있으며, 본 발명이 제공하고자 하는 보다 리지드한 형태의 3개의 올리고 뉴클레오티드 간의 결합을 형성할 수 있는 것이라면, 제한 없이 본 발명에 포함된다.Of course, the complementary bond or the complementary nucleotide sequence may be continuous, or may be a nucleotide sequence having at least one spacer, and may form a bond between three oligonucleotides in a more rigid form to be provided by the present invention. If so, it is included in the present invention without limitation.
본 발명에서 용어 "표면 결합 기능기를 가지는 화합물"은 올리고뉴클레오티드를 코어 입자 표면에 부착시키기 위해 각 올리고뉴클레오티드의 3' 또는 5' 말단에 연결시킨 화합물을 말한다. 이러한 표면 결합 기능기를 가지는 화합물의 유형은 용액에 침전하지 않을 작은 응집체의 나노입자를 생성하는 한 제한되지 않는다. 표면 결합기능기를 통하여 나노 입자를 가교-결합시키는 방법은 당분야에 공지되어 있다(Feldheim, The Electrochemical Society Interface, Fall, 2001, pp. 22-25 참조). 표면 결합 기능기를 가지는 화합물의 한 말단은 입자 표면에 부착되는 표면 결합 기능기를 보유하는데, 바람직하게 황-함유기, 예컨대 티올기 또는 술프히드릴기(sulfhydryl, HS)이다. 상기 반응기는 알코올 및 페놀의 유도체로서 산소 자리에 황이 포함된 RSH 의 식을 가지는 화합물일 수 있다. 또는, 상기 반응기는 각각 RSSR' 또는 RSR'의 식을 가지는 티올 에스테르(thiol ester) 또는 다이티올 에스테르(dithiol ester)일 수 있다. 또는, 상기 반응기는 아미노기(-NH2)일 수 있다. 추가적으로, 상기 표면 결합 기능기를 가지는 화합물은 DNA 프로브, 항체, 올리고뉴클레오시드 및 아미노산 등과 같은 생체분자에 대한 반응 그룹(reactive group)으로서, 예컨대 -NH2, -COOH, -CHO, -NCO, 및 엑폭사이드기와 같은 다양한 반응기와 연결될 수 있다. 이러한 많은 반응성 기는 당분야에 공지되어 있고 본 방법 및 장치에 사용될 수 있다.In the present invention, the term "a compound having a surface-binding functional group" refers to a compound in which the oligonucleotide is linked to the 3'or 5'end of each oligonucleotide in order to attach it to the surface of the core particle. The type of compound with such a surface binding functional group is not limited as long as it produces small aggregated nanoparticles that will not precipitate in solution. Methods for crosslinking-linking nanoparticles through a surface-binding functional group are known in the art (see Feldheim, The Electrochemical Society Interface, Fall, 2001, pp. 22-25). One end of the compound having a surface-binding functional group has a surface-binding functional group attached to the surface of the particle, preferably a sulfur-containing group, such as a thiol group or a sulfhydryl (HS) group. The reactor may be a compound having the formula of RSH containing sulfur as a derivative of alcohol and phenol. Alternatively, the reactor may be a thiol ester or a dithiol ester having a formula of RSSR' or RSR', respectively. Alternatively, the reactor may be an amino group (-NH2). Additionally, the compound having the surface-binding functional group is a reactive group for biomolecules such as DNA probes, antibodies, oligonucleotides and amino acids, such as -NH2, -COOH, -CHO, -NCO, and epoxy It can be connected to various reactors such as side groups. Many of these reactive groups are known in the art and can be used in the present methods and devices.
또한, 상기 올리고뉴클레오티드에서 표면 결합 기능기를 가지는 화합물의 반대 말단은 스페이서 서열을 포함할 수 있으며 스페이서 서열은 코어 표면에 도입되는 쉘이 타겟포착 올리고뉴클레오티드의 타겟인식 서열을 커버하지(covering) 않으면서 적절한 쉘 두께를 유지할 수 있는 공간을 제공한다. 본 발명에서는 스페이서 서열의 하나의 예로서, A10-PEG를 사용할 수 있다.In addition, the opposite end of the compound having a surface-binding functional group in the oligonucleotide may include a spacer sequence, and the spacer sequence is appropriate without covering the target recognition sequence of the targeting oligonucleotide by the shell introduced to the core surface. It provides a space to maintain the shell thickness. In the present invention, as an example of the spacer sequence, A10-PEG may be used.
본 발명의 다른 측면에서, 3개의 올리고 뉴클레오티드의 상보적 결합에 의해 형성된 Y형 올리고 뉴클레오티드 결합체; 및In another aspect of the present invention, a Y-type oligonucleotide conjugate formed by complementary bonding of three oligonucleotides; And
상기 Y형 올리고 뉴클레오티드 결합체에 의해 연결되는 2개의 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나노입자;를 포함하는 나노입자 이합체가 제공된다.There is provided a nanoparticle dimer comprising; metal nanoparticles capable of two phlosmonic couplings connected by the Y-type oligonucleotide conjugate.
여기서, 상기 Y형 올리고 뉴클레오티드 결합체는 목적하는 표적과 결합할 수 있는 결합 부위를 갖는 것이거나, 또는 목적하는 표적과 결합할 수 있도록 추가의 결합 분자와 연결되는 것일 수 있다.Here, the Y-type oligonucleotide conjugate may have a binding site capable of binding to a target target, or may be connected with an additional binding molecule to bind to a target target.
예를 들어, 상기 Y형 올리고 뉴클레오티드 결합체의 제3 올리고 뉴클레오티드는 제1 및 제2 올리고 뉴클레오티드와 혼성하기 이전에 선택적으로 표적에 결합할 수 있도록 기능화되거나, 또는 Y형으로 혼성화한 후, 선택적으로 표적에 결합할 수 있도록 기능화될 수 있다.For example, the third oligonucleotide of the Y-type oligonucleotide conjugate is functionalized to selectively bind to the target before hybridization with the first and second oligonucleotides, or after hybridization to the Y-type, optionally the target It can be functionalized to be able to bind to.
여기서, 기능화는 선택적인 것으로서, 제3 올리고 뉴클레오티드를 인식하거나 또는 임의의 결합을 형성할 수 있는 표적이라면, 별도의 기능화가 요구되지 않을 수 있고, 또는 표적을 인식하거나, 또는 임의의 결합할 수 있도록 기능화되는 것을 말하며, Y형 올리고 뉴클레오티드 결합체를 인식 또는 임의의 결합할 수 있는 치환기 도입, 관능기 도입, 분자 도입, 개질 등을 수행할 수 있다.Here, functionalization is optional, and if it is a target capable of recognizing a third oligonucleotide or forming an arbitrary bond, separate functionalization may not be required, or to recognize a target, or to allow any binding. It refers to functionalization, and the introduction of a substituent capable of recognizing or arbitrary binding to a Y-type oligonucleotide conjugate, introduction of a functional group, introduction of a molecule, modification, and the like can be performed.
한편, 상기 3개의 올리고 뉴클레오티드의 염기 수는 특별히 제한되지는 않는 것이되, 예를들어 Y형 올리고 뉴클레오티드 결합체가 형성될 수 있는 최소한의 갯수일 수 있고, 바람직하게 견고한 Y형 올리고 뉴클레오티드 결합체가 형성될 수 있도록 선택할 수 있고, 다르게는 섭동(동요)가 최소화되거나 없을 수 있도록 갯수가 조정될 수 있다.On the other hand, the number of bases of the three oligonucleotides is not particularly limited, but may be, for example, the minimum number at which a Y-type oligonucleotide conjugate can be formed, and preferably a robust Y-type oligonucleotide conjugate is formed. The number can be selected so that perturbation is minimized or absent.
이에 제한되지 않으나, 상기 3개의 올리고 뉴클레오티드는 각각 20-80개, 25-70개, 또는 26-50개의 염기를 갖는 것일 수 있다.Although not limited thereto, the three oligonucleotides may each have 20-80, 25-70, or 26-50 bases.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 나노입자 이합체는,In one embodiment of the present invention, the nanoparticle dimer,
제1 금속 나노입자; 제2 금속 나노입자; 제1 금속 나노입자에 결합된 제1 ss-올리고 뉴클레오티드; 제2 금속나노입자에 결합된 제2 ss-올리고 뉴클레오티드; 제3 ss-올리고 뉴클레오티드를 포함하며;First metal nanoparticles; Second metal nanoparticles; A first ss-oligo nucleotide bound to the first metal nanoparticle; A second ss-oligo nucleotide bound to the second metal nanoparticle; A third ss-oligo nucleotide;
상기 제1 ss-올리고 뉴클레오티드는 제3 ss-올리고뉴클레오티드와 상보적 결합된 제1 결합영역을 형성하고;The first ss-oligonucleotide forms a first binding region complementarily bonded to the third ss-oligonucleotide;
상기 제2 ss-올리고 뉴클레오티드는 제1 ss-올리고 뉴클레오티드와 상보적 결합된 제2 결합영역을 형성하고;The second ss-oligo nucleotide forms a second binding region complementary to the first ss-oligo nucleotide;
상기 제3 ss-올리고 뉴클레오티드는 제2 ss-올리고 뉴클레오티드와 상보적 결합된 제3 결합영역을 형성하여,The third ss-oligo nucleotide forms a third binding region complementary to the second ss-oligo nucleotide,
상기 제1 금속 나노입자와 제2 금속 나노입자가 Y형 올리고 뉴클레오티드 결합체에 의해서 연결되는 것일 수 있다.The first metal nanoparticle and the second metal nanoparticle may be connected by a Y-type oligonucleotide conjugate.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 3개의 올리고 뉴클레오티드는 제1 ss-DNA, 제2 ss-DNA, 및 제3 ss-DNA로 이루어지되,In one embodiment of the present invention, the three oligonucleotides consist of a first ss-DNA, a second ss-DNA, and a third ss-DNA,
여기서, 제1 및 제2 ss-DNA는 5' 위치가 각각 상기 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나노입자와 결합될 수 있도록 개질되며, 제3 ss-DNA의 5' 위치는 목적하는 표적과 결합할 수 있도록 개질되거나, 또는 염기서열을 더 갖거나, 또는 추가의 결합 분자와 연결되는 것일 수 있다.Here, the first and second ss-DNAs are modified so that the 5'position can be combined with the metal nanoparticles capable of phlosmonic coupling, respectively, and the 5'position of the third ss-DNA is combined with the target target. It may be modified so as to be capable of, or may have a nucleotide sequence, or may be linked with an additional binding molecule.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 3개의 올리고 뉴클레오티드는 제1 ss-DNA, 제2 ss-DNA, 및 제3 ss-DNA로 이루어지되,In one embodiment of the present invention, the three oligonucleotides consist of a first ss-DNA, a second ss-DNA, and a third ss-DNA,
여기서, 제1 ss-DNA는 서열번호 1의 염기서열을 포함하고, 제2 ss-DNA는 서열번호 2의 염기서열을 포함하며, 및 제3 ss-DNA는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 것인, 나노입자 이합체일 수 있다.Here, the first ss-DNA includes the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, the second ss-DNA includes the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and the third ss-DNA includes the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 That, it may be a nanoparticle dimer.
서열번호 1: 5'-CTTACGGCGAATGACCGAATCAGCCT-3'SEQ ID NO: 1: 5'-CTTACGGCGAATGACCGAATCAGCCT-3'
서열번호 2: 5'-AGGCTGATTCGGTTCATGCGGATCGA-3'SEQ ID NO: 2: 5'-AGGCTGATTCGGTTCATGCGGATCGA-3'
서열번호 3: 5'-TCGATCCGCATGACATTCGCCGTAAG-3'SEQ ID NO: 3: 5'-TCGATCCGCATGACATTCGCCGTAAG-3'
본 발명의 또 다른 측면에서,In another aspect of the invention,
3개의 올리고 뉴클레오티드의 상보적 결합에 의해 형성된 Y형 올리고 뉴클레오티드 결합체; 및Y-type oligonucleotide conjugate formed by the complementary linkage of three oligonucleotides; And
상기 Y형 올리고 뉴클레오티드 결합체에 의해 연결되는 2개의 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나노입자;를 포함하는 단일 분자 관찰용 프로브가 제공된다.There is provided a probe for single molecule observation comprising; metal nanoparticles capable of two phlosmonic couplings connected by the Y-type oligonucleotide conjugate.
여기서, 상기 단일 분자 관찰용 프로브는, 예를 들어 나노플라즈모닉 바이오센서로 이해될 수 있으며, 상기 단일 분자 관찰용 프로브는, 나노입자 이합체를 탐지하는 것으로부터 단일 분자를 관찰 또는 검출하는 것으로 이해될 수 있다.Here, the probe for single molecule observation may be understood as, for example, a nanoplasmonic biosensor, and the probe for single molecule observation is to be understood as observing or detecting a single molecule from detecting a nanoparticle dimer. I can.
본 발명에서는 두 나노입자 사이의 플라즈모닉 커플링 현상을 활용한 센서로서, SLS, EGFR 등과 같이 단일 분자에 대한 민감하고 정확한 동역학적 관찰과 검출이 가능함을 확인하였다.In the present invention, as a sensor utilizing a plasmonic coupling phenomenon between two nanoparticles, it was confirmed that sensitive and accurate kinetic observation and detection for single molecules such as SLS and EGFR are possible.
특히, 본 발명의 나노입자 이합체는 리지드한 연결기(Y-형 DNA)로 연결되는 것으로부터, 섭동 없이 단일 분자를 관찰 또는 검출이 가능하다.In particular, since the nanoparticle dimer of the present invention is connected by a rigid linking group (Y-type DNA), a single molecule can be observed or detected without perturbation.
여기서, 상기 관찰은 본 발명 나노입자 이합체를 관찰 또는 검출할 수 있는 기기라면 제약 없이 사용될 수 있고, 예를 들어, 암시야 현미경, 라만-레일리 산란 현미 분광 시스템, 등을 사용할 수 있고, SEM, TEM 등 제약 없이 사용할 수 있다. 또한, 광산란 스펙트럼을 측정하는 기기, 예를 들어 분광사진기, CCD 카메라를 장착하여 광산란 스펙트럼을 측정할 수 있다.Here, the observation may be used without limitation, as long as it is a device capable of observing or detecting the nanoparticle dimer of the present invention, for example, a dark field microscope, a Raman-Reilly scattering microscopic system, etc. may be used, and SEM, TEM It can be used without restrictions. In addition, a device for measuring the light scattering spectrum, for example, a spectrograph or a CCD camera may be mounted to measure the light scattering spectrum.
여기서, 상기 단일 분자 관찰용 프로브는, 예를 들어 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 글리코프로테인, 리포프로테인, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 핵산, 당, 탄수화물, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 지방산, 지질, 호르몬, 대사산물, 사이토카인, 케모카인, 수용체, 신경전달물질, 항원, 알레르겐, 항체, 기질, 대사산물, 보조인자, 억제제, 약물, 약학물, 영양물, 프리온, 독소, 독물, 폭발물, 살충제, 화학무기제, 생체유해성 제제, 방사선동위원소, 비타민, 헤테로사이클릭 방향족 화합물, 발암물질, 돌연변이유발요인, 마취제, 암페타민, 바르비투레이트, 환각제, 폐기물 또는 오염물을 관찰 또는 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는, 단일 분자 관찰용 프로브일 수 있다.Here, the probe for single molecule observation is, for example, amino acids, peptides, polypeptides, proteins, glycoproteins, lipoproteins, nucleosides, nucleotides, oligonucleotides, nucleic acids, sugars, carbohydrates, oligosaccharides, polysaccharides , Fatty acids, lipids, hormones, metabolites, cytokines, chemokines, receptors, neurotransmitters, antigens, allergens, antibodies, substrates, metabolites, cofactors, inhibitors, drugs, pharmaceuticals, nutrients, prions, toxins, poisons, Explosives, pesticides, chemical weapons, biohazard agents, radioisotopes, vitamins, heterocyclic aromatic compounds, carcinogens, mutagenesis, anesthetics, amphetamines, barbiturates, hallucinogens, wastes or contaminants can be observed or detected. It may be a probe for single molecule observation, characterized in that there is.
본 발명의 다른 측면에서,In another aspect of the invention,
Y형 DNA를 형성할 수 있는 상보적인 염기서열을 포함하는 제1-제3의 올리고 뉴클레오티드를 준비하는 단계;Preparing a first-third oligonucleotide comprising a complementary nucleotide sequence capable of forming Y-type DNA;
상기 준비된 제1 및 제2 올리고 뉴클레오티드를 각각 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나노입자와 1가(monovalent)가 되도록 부착시키는 단계;Attaching the prepared first and second oligonucleotides to be monovalent with metal nanoparticles capable of phlosmonic coupling, respectively;
상기 단계에서 제조된 제1 올리고 뉴클레오티드가 부착된 1가 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나노입자와 제2 올리고 뉴클레오티드가 부착된 1가 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나노입자를 혼합하여, 나노입자 이합체를 제조하는 단계;를 포함하는, 나노입자 이합체의 제조방법이 제공된다.By mixing the metal nanoparticles capable of monovalent phlosmonic coupling to which the first oligonucleotide prepared in the above step is attached and the metal nanoparticles capable of monovalent phlosmonic coupling to which the second oligonucleotide is attached, the nanoparticles A method of preparing a dimer comprising; preparing a dimer is provided.
여기서, 상기 제조방법은 선택적으로 상기 제조된 나노입자 이합체를 제3 올리고 뉴클레오티드와 혼성화시키는 단계;를 더 포함할 수 있다.Here, the manufacturing method may further include a step of selectively hybridizing the prepared nanoparticle dimer with a third oligonucleotide.
이하, 본 발명의 나노입자 이합체의 제조방법을 단계별로 상세히 설명한다.Hereinafter, the method for preparing the nanoparticle dimer of the present invention will be described in detail step by step.
먼저, Y형 올리고 뉴클레오티드 결합체를 형성할 수 있는 상보적인 염기서열을 포함하는 제1-제3의 올리고 뉴클레오티드를 준비하는 단계는, 상술하여 설명하는 바와 같이, 본 발명이 제공하고자 하는 리지드하고 섭동(동요)이 없는 이미징 관찰을 달성하기 위한, Y형 올리고 뉴클레오티드 결합체를 형성할 수 있도록 상보적인 염기서열을 포함하는 올리고 뉴클레오티드 3종을 준비하는 단계를 말한다.First, the step of preparing the first-third oligonucleotide comprising a complementary nucleotide sequence capable of forming a Y-type oligonucleotide conjugate is, as described above, the rigid and perturbation to be provided by the present invention ( It refers to the step of preparing three oligonucleotides containing a complementary nucleotide sequence so as to form a Y-type oligonucleotide conjugate to achieve imaging observation without agitation).
다음으로, 상기 준비된 제1 및 제2 올리고 뉴클레오티드를 각각 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나노입자와 1가(monovalent)가 되도록 부착시키는 단계는, 본 발명의 제어된 플라즈모닉 커플링과 이미징 관찰을 위하여, 각각 상보적인 제1 및 제2 올리고 뉴클레오티드를 두개의 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나노입자에 1가 결합이 되도록 반응시키는 단계로 이해될 수 있다.Next, the step of attaching the prepared first and second oligonucleotides to be monovalent with metal nanoparticles capable of phlosmonic coupling, respectively, includes controlled plasmonic coupling and imaging observation of the present invention. For this purpose, it may be understood as a step of reacting each of the complementary first and second oligonucleotides to be monovalent bonded to two metal nanoparticles capable of phlosmonic coupling.
나아가, 상기 단계에서 제조된 제1 올리고 뉴클레오티드가 부착된 1가 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나노입자와 제2 올리고 뉴클레오티드가 부착된 1가 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나노입자를 혼합하여, 나노입자 이합체를 제조하는 단계이다.Further, by mixing the metal nanoparticles capable of monovalent phlosmonic coupling to which the first oligonucleotide prepared in the above step is attached and the metal nanoparticles capable of monovalent phlosmonic coupling to which the second oligonucleotide is attached, This is the step of preparing a nanoparticle dimer.
여기서 제조되는 나노입자 이합체는 상기 제1 및 제2 올리고 뉴클레오티드의 혼성화를 통하여 두 나노입자가 이에 의해 연결되어 이합체를 형성하는 것을 의마한다.The nanoparticle dimer prepared here means that the two nanoparticles are linked thereby to form a dimer through hybridization of the first and second oligonucleotides.
여기서, 상기 제1 및 제2 올리고 뉴클레오티드는 상보적 결합이 가능하되, 반드시 제3 올리고 뉴클레오티드와 동시에 상보적 결합이 되도록 하는 최소한의 염기 서열을 갖는 것이 바람직하다.Here, the first and second oligonucleotides are capable of complementary binding, but it is preferable to have a minimum nucleotide sequence such that they are complementary to the third oligonucleotide at the same time.
특히, 본 발명이 제공하고자 하는 섭동(동요) 없는 이미징 프로브를 달성하기 위해서는, Y형의 리지드한 상보적 결합이 형성될 수 있어야 하는 바, 상기 나노입자 이합체는 설사 제3 올리고 뉴클레오티드와 상보적 결합 이전이라도, 반드시 제1 및 제2 올리고 뉴클레오티드의 적어도 일부에는 제3 올리고 뉴클레오티드와 상보적 결합이 가능한 부위를 갖는 것이어야 한다.In particular, in order to achieve the perturbation-free imaging probe to be provided by the present invention, a Y-type rigid complementary bond must be formed, and the nanoparticle dimer is evenly complementary to the third oligonucleotide. Even before, at least a portion of the first and second oligonucleotides must have a site capable of complementary binding to the third oligonucleotide.
본 발명의 일 측면에서, 상기 나노입자 이합체를 하나 이상의 표적 단일 분자를 포함하는 샘플에 노출시키는 단계; 및In one aspect of the invention, exposing the nanoparticle dimer to a sample containing one or more target single molecules; And
상기 샘플에서 나노입자 이합체를 탐지하는 단계;를 포함하는, 표적 단일 분자의 관찰 또는 검출 방법이 제공된다.A method of observing or detecting a target single molecule comprising; detecting a nanoparticle dimer in the sample is provided.
여기서, 상기 나노입자 이합체는 제3 올리고 뉴클레오티드와 상보적 결합 이전의 것일 수 있으며, 선택적으로 제3 올리고 뉴클레오티드와 먼저 혼성화한 후 이를 표적에 인식 또는 결합시킬 수 있거나, 또는 제3 올리고 뉴클레오티드를 먼저 표적에 인식 또는 결합시킨 후, 상기 나노입자가 표적에 부착된 제3 올리고 뉴클레오티드와 후 혼성화하되는 것일 수도 있다.Here, the nanoparticle dimer may be prior to complementary binding with the third oligonucleotide, and may be selectively hybridized with the third oligonucleotide first and then recognized or bound to the target, or the third oligonucleotide may be first targeted. After recognition or binding to, the nanoparticles may be hybridized with the third oligonucleotide attached to the target.
본 발명의 다른 측면에서,In another aspect of the invention,
Y형 DNA를 형성할 수 있는 상보적인 염기서열을 포함하는 제1-제3의 올리고 뉴클레오티드를 준비하는 단계;Preparing a first-third oligonucleotide comprising a complementary nucleotide sequence capable of forming Y-type DNA;
상기 준비된 제1 및 제2 올리고 뉴클레오티드를 각각 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나노입자와 1가(monovalent)가 되도록 부착시키는 단계;Attaching the prepared first and second oligonucleotides to be monovalent with metal nanoparticles capable of phlosmonic coupling, respectively;
상기 단계에서 제조된 제1 올리고 뉴클레오티드가 부착된 1가 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나노입자와 제2 올리고 뉴클레오티드가 부착된 1가 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나노입자를 혼합하여, 나노입자 이합체를 제조하는 단계;By mixing the metal nanoparticles capable of monovalent phlosmonic coupling to which the first oligonucleotide prepared in the above step is attached and the metal nanoparticles capable of monovalent phlosmonic coupling to which the second oligonucleotide is attached, the nanoparticles Preparing a dimer;
제3 올리고 뉴클레오티드가 표적 단일 분자를 인식할 수 있도록 기능화시키는 단계;Functionalizing the third oligonucleotide to recognize the target single molecule;
상기 단계에서 기능화된 제3 올리고 뉴클레오티드를 하나 이상의 표적 단일 분자를 포함하는 샘플에 노출시키는 단계;Exposing the third oligonucleotide functionalized in said step to a sample comprising at least one target single molecule;
상기 샘플에 상기 나노입자 이합체를 처리하여 제3 올리고 뉴클레오티드와 혼성화시키는 단계; 및Hybridizing with a third oligonucleotide by treating the sample with the nanoparticle dimer; And
상기 샘플에서 나노입자 이합체를 탐지하는 단계;를 포함하는, 표적 단일 분자의 관찰 또는 검출 방법이 제공될 수 있다.A method of observing or detecting a single target molecule comprising; detecting a nanoparticle dimer in the sample may be provided.
이하 본 발명을 제조예, 실시예, 및 실험예를 통하여 상세히 설명한다. 단, 하기 제조예, 실시예, 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail through Preparation Examples, Examples, and Experimental Examples. However, the following Preparation Examples, Examples, and Experimental Examples are only illustrative of the present invention, and the present invention is not limited by the following.
<제조예 1> 금 나노 입자(Au NP)의 합성<Production Example 1> Synthesis of gold nanoparticles (Au NP)
금 나노 입자는 Chem. Mater. 2016, 28, 1066-1075에 개시된 방법을 약간 변형시켜 합성하였다. 10 nm 구의 경우, 100 ℃에서 25 μM의 탄닌산 100 μL를 함유하는 구연산 나트륨 (2.2 mM) 수용액 150 mL에 25 mM HAuCl4 (aq) 1 mL를 주입하였다. 25 nm 구의 경우, 동일한 합성 과정을 시드 형성을 위해 탄닌산 없이 반복하였다. 혼합물을 90 ℃로 냉각시킨 후, 추가로 1 mL의 HAuCl4를 주입하고 30 분 동안 배양하였다. 이 추가 주입을 한 번 더 반복한 다음 용액을 실온으로 냉각시켰다.The gold nanoparticles are Chem. Mater. The method disclosed in 2016, 28, 1066-1075 was synthesized with slight modifications. In the case of a 10 nm sphere, 1 mL of 25 mM HAuCl 4 (aq) was injected into 150 mL of an aqueous solution of sodium citrate (2.2 mM) containing 100 μL of 25 μM tannic acid at 100°C. For the 25 nm sphere, the same synthetic procedure was repeated without tannic acid for seed formation. After the mixture was cooled to 90° C., an additional 1 mL of HAuCl 4 was added and incubated for 30 minutes. This further injection was repeated once more, then the solution was cooled to room temperature.
두 구 모두에 대해, 구연산염 리간드는 20 mg의 BSPP를 첨가하여 콜로이드 안정성을 향상시키기 위해 BSPP와 교환하고 밤새 반응시켰다. 나노 입자를 정제하고 원심 분리에 의해 100 nM으로 농축시킨 다음 1 mg/mL BSPP 수용액에 재분산시켰다.For both spheres, the citrate ligand was exchanged with BSPP to improve colloidal stability by adding 20 mg of BSPP and reacted overnight. The nanoparticles were purified and concentrated to 100 nM by centrifugation and then redispersed in 1 mg/mL BSPP aqueous solution.
(흡광 계수: 10 nm 및 25 nm에 대하여, 각각 520 nm에서 1.01 x 108 M-1cm-1 및 524 nm에서 2.15 x 109 M-1cm-1).(Extinction coefficient: 1.01 x 10 8 M -1 cm -1 at 520 nm and 2.15 x 10 9 M -1 cm -1 at 524 nm, respectively, for 10 nm and 25 nm).
<제조예 2> 금 나노로드 (Au NR) (65 x 22 nm)의 합성<Preparation Example 2> Synthesis of gold nanorods (Au NR) (65 x 22 nm)
금 나노 로드는 ACS Nano 2012, 6, 2804-2817에 개시된 방밥을 약간 변형시켜 합성하였다. 시드 형성을 위해 5 mL의 0.5 mM HAuCl4를 5 mL의 CTAB 수용액 (0.2 M)에 첨가한 다음,격렬한 교반하에 1 mL의 NaBH4 (6.0 mM)을 이 혼합물에 주입하고, 30분 동안 성장시켰다. 금속 나노 로드의 성장을 위해, 연속적으로 4.0 mM AgNO3 6 mL 및 1.0 mM HAuCl4 125 mL를 CTAB (4.5 g) 및 5-브로모살리실산 (0.55 g)의 수용액 125 mL에 격렬한 교반하에 첨가하였다. 다음, 1 mL의 아스코빅산 (64.0 mM)를 첨가하여 Au3+를 Au1+로 환원시켰다. 마지막으로 50 μL의 시드 용액을 주입하고 추가 12 시간 동안 배양했다. Au NR를 정제하고 원심 분리에 의해 10 nM까지 농축시켰다(흡광 계수 : 3.58 x 109 M-1cm-1 at 707 nm).Gold nanorods were synthesized by slightly modifying the anti-dust disclosed in
BSPP의 기능화를 위해 10 nM Au NR 1 mL를 원심 분리하고 10 mg/mL BSPP 수용액과 페놀 : 클로로포름 : 이소아밀 알코올 (25 : 24 : 1)의 1 : 1 혼합물에 재 분산시켰다. 이 용액을 12 시간 동안 교반하였다. 수성 층을 추출하고 원심 분리에 의해 정제시켰다.For the functionalization of BSPP, 1 mL of 10 nM Au NR was centrifuged and redispersed in a 1:1 mixture of 10 mg/mL BSPP aqueous solution and phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25:24:1). This solution was stirred for 12 hours. The aqueous layer was extracted and purified by centrifugation.
<실시예> mGYRO의 제조<Example> Preparation of mGYRO
먼저, 본 발명에서 사용된 올리고 뉴클레오티드를 다음 표 1과 같다.First, the oligonucleotides used in the present invention are shown in Table 1 below.
단일 분자 회전Using Au dimer (mGYRO)
Single molecule rotation
TEM 측정For a specific target in the center of the dimer
TEM measurement
단백질 확산Using unit price Au particles
Protein diffusion
광학 안정성 검사Pinned to a glass slide
Optical stability check
특정 표지 시험As a negative control experiment
Specific label test
단계 1: Au NP와 ss-DNA의 1가 접합Step 1: Monovalent conjugation of Au NP and ss-DNA
BSP 캡핑된 Au NP의 농도는 UV-Vis 분광기로 흡광도를 측정하여 결정하였다. 입자 표면의 다중 반응 부위 때문에, 가수(valency)의 수는 푸아송(Poisson) 분포를 따르고, 결과적으로 DNA 비결합 및 다중-결합 NP가 혼합되어 있다.The concentration of BSP capped Au NP was determined by measuring the absorbance with a UV-Vis spectrometer. Because of the multiple reaction sites on the particle surface, the number of valency follows a Poisson distribution, resulting in a mixture of DNA unbound and multi-bound NPs.
1가 접합을 얻기 위해, ss-DNA와 Au NP 사이의 몰비가 조정되었다. 45 nL의 100 nM Au NP 및 45 nL의 30 nM 이황화-보호 DNA를 1.5 mL epi-tube에서 혼합하였다.To obtain a monovalent conjugation, the molar ratio between ss-DNA and Au NPs was adjusted. 45 nL of 100 nM Au NP and 45 nL of 30 nM disulfide-protected DNA were mixed in a 1.5 mL epi-tube.
10 ㎕의 BSPP 수용액 10 ㎎/100 ㎕를 첨가하여 디술피드 결합을 감소시키고, 혼합물을 밤새 배양하였다. Au 나노로드의 경우, 10 nM Au 나노 로드 45 μL와 100 nM 이황화-보호 DNA 45 μL를 1.5 mL epi-tube에 혼합하였으며, 다음 공정은 구체와 동일하다.10 µl of BSPP
Au NP에 대한 DNA 접합의 정도는 150V에서 15 분 동안 TBE (pH 7.6)에서 3 % 아가로스 겔로 전기 영동함으로써 확인되었다.The degree of DNA conjugation to Au NPs was confirmed by electrophoresis on a 3% agarose gel in TBE (pH 7.6) for 15 min at 150V.
단계 2: 아가로스겔 전기 영동을 통한 1가 DNA 결합 NP의 분리Step 2: Separation of monovalent DNA-binding NPs through agarose gel electrophoresis
BSPP로 코팅된 Au NP는 음전하를 띤다. Au NP에 DNA를 부착시키면 유체 역학적 크기가 증가하게된다. 따라서, 부착된 DNA 염기 쌍의 다른 수는 겔 전기 영동 동안 별개의 밴드를 이끌었다. 단일 작용기화를 위한 DNA의 적절한 농도는 3 % 아가로스 겔로 겔 전기 영동에 의해 결정되었다. 좁고 분리된 겔 밴드의 모양은 가변 접합 원자가에 할당되었다.Au NPs coated with BSPP have a negative charge. Attaching DNA to Au NPs increases the hydrodynamic size. Thus, different numbers of attached DNA base pairs led to distinct bands during gel electrophoresis. The appropriate concentration of DNA for single functionalization was determined by gel electrophoresis on a 3% agarose gel. The shape of the narrow, separated gel bands was assigned a variable conjugation valency.
단 결합체 Au를 깨끗한 레이저 블레이드 (smartSlicer Gel Cutting Tool & RaZor, Sigma-Aldrich)로 분리하고 투석 튜브 (SnakeSkin 투석 튜빙, MWKO 10K, Thermo Scientific)를 사용하여 추출하였다.However, the conjugate Au was separated with a clean laser blade (smartSlicer Gel Cutting Tool & RaZor, Sigma-Aldrich) and extracted using a dialysis tube (SnakeSkin dialysis tubing, MWKO 10K, Thermo Scientific).
단계 3: 2 개의 1가 Au NP를 사용한 mGYRO의 제조Step 3: Preparation of mGYRO using two monovalent Au NPs
첫째, DNA 부착 NP는 겔 전기 영동을 사용하여 분리된다. DNA1 단일 접합 Au NP 및 DNA2 단일 결합된 Au NP를 10,000 rpm에서 5 분간 원심 분리하여 세척하고 1 nM 농도로 PBS에 재분산시켰다. 상호 보완적인 2 개의 단일 관능화된 Au NP (DNA1과 DNA2)를 30 분 동안 함께 혼합하였다.First, DNA-attached NPs are separated using gel electrophoresis. DNA1 single conjugated Au NPs and DNA2 single conjugated Au NPs were washed by centrifugation at 10,000 rpm for 5 minutes and re-dispersed in PBS at a concentration of 1 nM. Two complementary single functionalized Au NPs (DNA1 and DNA2) were mixed together for 30 minutes.
겔 분석을 통해 감소된 이동의 새로운 바이올렛 밴드가 이합체(dimer)로 나타났다. 밴드는 1가 DNA 결합 NPs의 분리와 동일한 과정으로 분리되었다. 여러 추출 및 농축 공정 동안, 이합체 밴드를 제외한 어떠한 새로운 밴드도 관찰되지 않았으며 이는 Au-DNA 복합체가 DNA 분리없이 안정하게 접합되었음을 나타낸다. 분리된 이합체는 응집을 방지하기 위해 HS-EG6-CO2H (3 μL, 10 mM)로 표면 개질되었다. (도 1e)Gel analysis revealed a new violet band with reduced mobility as a dimer. The bands were separated by the same procedure as for the separation of monovalent DNA-binding NPs. During several extraction and concentration processes, no new bands were observed except for the dimer band, indicating that the Au-DNA complex was stably conjugated without DNA separation. The separated dimer was surface modified with HS-EG6-CO 2 H (3 μL, 10 mM) to prevent aggregation. (Fig. 1e)
<실험예 1> PEG 코팅 유리에서 mGYRO의 광학 안정성<Experimental Example 1> Optical stability of mGYRO in PEG coated glass
단일 mGYRO의 방향 및 각도 민감도를 검사하기 위해 프로브를 비오틴-스트렙타비딘 링커를 사용하여 커버슬립에 고정 시켰고, 입사 선형 편광 각도 Δθ를 변화시키면서 각 스팟의 밝기를 관찰하였다. 각 단일 프로브의 산란 강도는 θ의 함수로 측정되었고 π 주기로 사인-함수에 맞추어졌다.In order to check the direction and angular sensitivity of a single mGYRO, the probe was fixed to the coverslip using a biotin-streptavidin linker, and the brightness of each spot was observed while changing the incident linear polarization angle Δθ. The scattering intensity of each single probe was measured as a function of θ and fitted to a sine-function with π periods.
구체적으로, 섭동 없이 광학적 안정성을 확인하기 위해, 비오틴으로 코팅된 커버 슬립을 준비했다. 커버 슬립을 클리너로 씻어서 먼지를 제거하고 1.0M NaOH에 30 분 동안 담그고 아세톤으로 초음파 처리하였다. 1 mL의 APTES를 5 mL의 아세트산이 들어있는 100 mL의 MeOH 용액에 넣었다. 커버 슬립을 30 분 동안 MeOH 용액에서 인큐베이션하고 MeOH로 3 회 세정한 후 Ar로 건조시켰다. PEG 화를 위한 반응 완충액 (0.1 M, pH 8.5)을 제조하기 위해 84 mg의 NaHCO3를 10 mL의 탈 이온수에 용해시켰다. 0.2 mg의 바이오틴-PEG-SC 및 8 mg의 mPEG-SC를 epi-tube에서 혼합하였다. 64 μL의 반응 완충액을 PEG 혼합물에 첨가하고 70 μL을 세척 된 슬라이드 유리에 떨어 뜨린다.Specifically, in order to confirm optical stability without perturbation, a cover slip coated with biotin was prepared. The cover slip was washed with a cleaner to remove dust, immersed in 1.0M NaOH for 30 minutes, and sonicated with acetone. 1 mL of APTES was added to 100 mL of MeOH solution containing 5 mL of acetic acid. The cover slip was incubated in MeOH solution for 30 minutes, washed 3 times with MeOH, and dried over Ar. 84 mg of NaHCO 3 was dissolved in 10 mL of deionized water to prepare a reaction buffer (0.1 M, pH 8.5) for PEGylation. 0.2 mg of biotin-PEG-SC and 8 mg of mPEG-SC were mixed in an epi-tube. 64 μL of reaction buffer is added to the PEG mixture and 70 μL is dropped onto the washed slide glass.
밤새 건조를 방지하기 위해 어둡고 습한 환경에서 배양했다. 커버 슬립을 탈 이온수에 담가 여분의 PEG를 제거하고 분리한 후 탈 이온수로 세정하고 건조시켰다. 10 mM T50 완충액 (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl) 중 0.1 mg/mL의 스트렙타비딘 50 μL를 1 분간 배양하였다. T50 완충액으로 세척한 후, DNA 비오틴을 연결하고 여분의 DNA를 PBS로 제거 하였다. 마지막으로, mGYRO 이미지 프로브를 배양하여 접합시켰다.Incubated in a dark and humid environment to prevent drying overnight. The cover slip was soaked in deionized water to remove excess PEG, separated, washed with deionized water, and dried. 50 μL of 0.1 mg/mL streptavidin in 10 mM T50 buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl) was incubated for 1 minute. After washing with T50 buffer, DNA biotin was ligated and excess DNA was removed with PBS. Finally, the mGYRO image probe was cultured and conjugated.
그 결과, 배향은 맞추어진 함수로 결정되었고, SEM 이미징으로부터의 배향과 잘 일치됨으로써 ~ 8° 오차를 갖는 각도-의존 양상을 보였다. 각도 감도는 구형 입자의 4.4 배였고, 직선 입자로 일반적으로 사용되는 로드의 감도와 유사하였다.As a result, the orientation was determined as a fitted function, and it showed an angle-dependent pattern with an error of ~8° by being well matched with the orientation from SEM imaging. The angular sensitivity was 4.4 times that of the spherical particles, and was similar to that of the rod, which is commonly used with straight particles.
결과적으로, 본 발명의 mGYRO는 편광하에서 2-차원적 배향(방향)을 쉽게 측정할 수 있다.As a result, the mGYRO of the present invention can easily measure a two-dimensional orientation (direction) under polarized light.
본 발명자들은 회전 프로브 (mGYRO)로서 Y 형태의 올리고 뉴클레오티드 구조로 조립된 1가(m)-, 금 이량체를 합성하였다. 이 이량체 금 나노 입자(Au NP)는, 입자간 거리가 4 nm이고 25 nm 크기로 최적화되었다.The present inventors synthesized a monovalent (m)-, gold dimer assembled into a Y-shaped oligonucleotide structure as a rotating probe (mGYRO). These dimer gold nanoparticles (Au NP) have an interparticle distance of 4 nm and are optimized for a size of 25 nm.
이 프로브는 DF(dark-field) 현미경 관찰시 시토졸 세포소기관과 구별되며, 이중 가닥 DNA (dsDNA)와 링커는 이전의 TEM 및 X-선 관찰과 일치하는 어떠한 동요 없이 적절한 안정성과 견고성을 나타낸다. 두 나노입자 사이의 크기와 거리는 FDTD (finite-ifference timedomain method)를 통해 실험적으로 이론적으로 평가된다. TEM 분석은 실제로 프로브가 이량체 형태로 형성된다는 직접적인 증거를 제공하였다.This probe is distinguished from cytosolic organelles when observed under a dark-field (DF) microscope, and the double-stranded DNA (dsDNA) and linker exhibit adequate stability and robustness without any perturbation consistent with previous TEM and X-ray observations. The size and distance between the two nanoparticles are evaluated experimentally and theoretically through the finite-ifference time domain method (FDTD). TEM analysis actually provided direct evidence that the probe was formed in a dimeric form.
DNA를 사용하는 이점에는 Au 이량체의 정확한 중심에서 분자 어셈블리를 쉽게 타겟팅의 용이성, 더 많은 관능기를 컨쥬게이트할 수 있는 모듈성, 및 상업적 이용 가능성이 포함된다.Advantages of using DNA include the ease of targeting molecular assembly easily at the exact center of the Au dimer, the modularity to conjugate more functional groups, and commercial availability.
본 발명자들은 Au 이량체의 중심으로 작은 Au 나노입자들을 포함하고, 위치 특이적 및 화학량론적 방식으로 프로브 타겟을 지정하는, 나노입자의 집합체를 관찰하였고, 반면, 비슷한 선형 플라즈몬 구조인 Au 나노로드는 비위치특이성을 나타냈다.The present inventors observed an aggregate of nanoparticles, containing small Au nanoparticles as the center of the Au dimer, and specifying the probe target in a site-specific and stoichiometric manner, whereas Au nanorods, which have a similar linear plasmon structure, It showed non-location specificity.
<실험예 2> 지질 분자의 확산 역학(diffusive dynamics) 이미징<Experimental Example 2> Imaging of diffusive dynamics of lipid molecules
본 발명자들은 이 회전 프로브를 적용하여, 2-차원 모델 막인 지질 이중층 (SLB)에서 지질 분자의 확산 역학(diffusive dynamics)을 시각화하고, 다양한 이미징 프로브를 사용하여 측정된 확산 계수를 비교함으로써 mGYRO이 확산 동요없이 단일 분자 이미징 프로브로 사용될 수 있는지 확인하였다.The present inventors applied this rotating probe to visualize the diffusive dynamics of lipid molecules in the lipid bilayer (SLB), a two-dimensional model membrane, and by comparing the measured diffusion coefficients using various imaging probes, mGYRO is diffused. It was confirmed that it could be used as a single molecule imaging probe without shaking.
유리에 지지된 지질 이중층(SLB)의 제조Preparation of a lipid bilayer (SLB) supported on glass
작은 단일 라멜라 소포 (SUVs)는 DOPC에 의해 클로로포름 용액에 준비되었다. 이 클로로포름 혼합물을 아르곤 스트림에 의해 제거하고 4.0 μM의 최종 농도를 만들기 위해 500 μL의 PBS에 재현탁시켰다. 2 mm 층상 마이크로팁 (cat # 630-0423)을 갖는 프로브-팁 소니케이터 (Sonics, VCX 750)를 사용하여 큰 소포를 SUV로 나누어주었다. 유액이 투명해질 때까지 현탁액을 40 분 동안 초음파 처리 하였다. 유리 바닥 접시 (MatTek, No. 0 유리, 10 mm 웰, 35 mm 접시)를 1.0 M NaOH로 30 분 동안 세척하고 DI 수로 세척 하였다. SUV 현탁액 10 μL를 함유 한 160 μL의 PBS를 유리에 침착시켰다. 용액을 30 분 동안 유리 상에 SLB를 생성시키고 PBS로 3 회 조심스럽게 세척 하였다. 지질 분자의 확산 속도를 조절하기 위해 SLB를 형성하기 전에 BSA (150 μL/0 ~ 0.5 mg/mL)를 적용했다.Small single lamellar vesicles (SUVs) were prepared in chloroform solution by DOPC. This chloroform mixture was removed by a stream of argon and resuspended in 500 μL of PBS to make a final concentration of 4.0 μM. Large vesicles were divided into SUVs using a probe-tip sonicator (Sonics, VCX 750) with a 2 mm layered microtip (cat # 630-0423). The suspension was sonicated for 40 minutes until the emulsion became clear. Glass bottom dishes (MatTek, No. 0 glass, 10 mm wells, 35 mm dishes) were washed with 1.0 M NaOH for 30 min and with DI water. 160 μL of PBS containing 10 μL of SUV suspension was deposited on the glass. The solution was produced SLB on glass for 30 min and washed carefully 3 times with PBS. BSA (150 μL/0 ~ 0.5 mg/mL) was applied before SLB formation to control the diffusion rate of lipid molecules.
지질-접합된 DNA (lipid-DNA)의 제조Preparation of lipid-conjugated DNA (lipid-DNA)
지질 분자와 DNA를 연결하기 위해 팔미틴산의 카르복실기를 EDC/NHS 커플링에 의해 아민 말단 DNA(DNA linker)의 아민기에 결합시켜 안정한 아미드 결합을 형성시켰다.To link the lipid molecule and DNA, the carboxyl group of palmitic acid was bonded to the amine group of the amine-terminated DNA (DNA linker) by EDC/NHS coupling to form a stable amide bond.
DCM 중 팔미틴산 0.064 g 및 THF 5 mL 중 NHS 0.035 g을 25 mL 둥근 바닥 플라스크에서 혼합하였다. 이어서, 0.575g의 EDC를 플라스크에 첨가하고, 혼합물이 투명해질 때까지 초음파 처리하고, 실온에서 추가로 12 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 수용액으로 세척하여 유기층과 수성층을 분리하였다. 선별된 유기 용액을 무수 Na2SO4 칼럼으로 여과하여 건조시키고, 용액을 회전에 의해 증발시켰다. 생성물을 NMR 분석에 의해 확인하였다.0.064 g of palmitic acid in DCM and 0.035 g of NHS in 5 mL of THF were mixed in a 25 mL round bottom flask. Then 0.575 g of EDC was added to the flask, sonicated until the mixture became clear, and stirred at room temperature for an additional 12 hours. The reaction mixture was washed with a saturated aqueous NaHCO 3 solution to separate an organic layer and an aqueous layer. The selected organic solution was filtered through anhydrous Na 2 SO 4 column, dried, and the solution was evaporated by rotation. The product was confirmed by NMR analysis.
7mg/mL의 NHS-활성화된 팔미트산을 건조 DMSO에 용해시키고 -20 ℃에서 저장 하였다. 안정한 아미드 결합을 얻기 위해, 반응은 약간 알칼리성 조건 하에서 수행되었다. 100 μM DNA 링커 20 μL, 탈 이온수 38 μL, HEPES 완충액 (0.5 M, pH 8.5) 20 μL 및 7 mg/mL의 NHS 활성 팔미틴산을 20 mL의 epi-tube에 넣었다. 혼합물을 10 분 동안 초음파 처리하고 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 생성물을 7k MWCO 0.5 mL 제바스핀 탈염 칼럼 (Thermo fisher)을 사용하여 탈염시키고 에탄올로 침전시켰다. lipid-DNA 팔레트를 200 μL DI 물에 최종 농도 10 μM의 재현탁하고 4 ℃에서 보관했다.7 mg/mL of NHS-activated palmitic acid was dissolved in dry DMSO and stored at -20°C. In order to obtain a stable amide bond, the reaction was carried out under slightly alkaline conditions. 20 μL of 100 μM DNA linker, 38 μL of deionized water, 20 μL of HEPES buffer (0.5 M, pH 8.5), and 7 mg/mL of NHS-activated palmitic acid were placed in a 20 mL epi-tube. The mixture was sonicated for 10 minutes and incubated for 1 hour at room temperature. The product was desalted using a 7k MWCO 0.5 mL zevaspin desalting column (Thermo fisher) and precipitated with ethanol. The lipid-DNA palette was resuspended in 200 μL DI water at a final concentration of 10 μM and stored at 4°C.
Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) 분석Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) analysis
이미징 프로브를 확인하려면, 연결된 분자의 확산성을 교란시키지 않으며, 살아있는 세포에서뿐만 아니라 지지된 지질 이중층 (SLB)에서 FRAP 분석이 수행되어야 한다.To identify the imaging probes, FRAP analysis must be performed in live cells as well as in supported lipid bilayers (SLB), which do not disturb the diffusivity of the linked molecules.
지질 이중층에서 lipid-DNA를 1 μM 용액 3 μL를 15 분간 인큐베이트하여 SLB에 인터칼레이션하고 PBS로 조심스럽게 씻었다.In the lipid bilayer, 3 μL of a 1 μM solution of lipid-DNA was incubated for 15 minutes, intercalated in SLB, and carefully washed with PBS.
1 μM DNATR 3 μL를 30 분 동안 배양하고 다시 씻었다. FRAP 분석을 위해, 현미경 검사의 필드 다이어프램은 광이 16μm 지름의 시야를 지질 이중층으로 통과시킬 수 있도록 닫혔다. 빛을 고강도로 조사하여 10 초 동안 형광 물질을 표백시켰다.3 μL of 1 μM DNATR was incubated for 30 minutes and washed again. For FRAP analysis, the field diaphragm of microscopy was closed to allow light to pass through the 16 μm diameter field of view into the lipid bilayer. The fluorescent material was bleached for 10 seconds by irradiating light with high intensity.
지질 이중층 이미지는 즉시 저조도로 되돌아오고 다이아프라그램은 완전히 열렸다. 저속 영상은 100 ms 노출 시간을 사용하여 3 분 동안 간격없이 수행되었다.The geological bilayer image immediately returns to low light and the diagram is fully open. Slow imaging was performed without intervals for 3 minutes using a 100 ms exposure time.
다양한 프로브를 사용하여 SLB에서 단일 지질 분자 추적Tracking single lipid molecules in SLB using a variety of probes
기존의 유기 염료 탐침의 경우 PBS에 1 μM Texas Red-DHPE 6 μL를 삽입하여 SLB에 삽입했다. mGYRO의 경우 같은 양의 지질 DNA가 SLB에 인터칼레이션되어 지질의 약 2 %를 공유하고 DNA3이 침착되었다. 과량의 DNA를 PBS로 3 회 세척하였다. 3 nL의 100 nM mGYRO를 첨가하고 추가로 5 분 동안 인큐베이션 하였다. Au 프로브의 경우 DNAm 접합 Au NP가 추가되었다.In the case of a conventional organic dye probe, 6 μL of 1 μM Texas Red-DHPE was inserted into PBS and inserted into the SLB. In the case of mGYRO, the same amount of lipid DNA was intercalated into SLB to share about 2% of the lipid and DNA 3 was deposited. Excess DNA was washed 3 times with PBS. 3 nL of 100 nM mGYRO was added and incubated for an additional 5 minutes. In the case of Au probe, DNAm-conjugated Au NPs were added.
비 접합된 프로브를 PBS로 세척하였다. 저속 현미경으로 저속 현미경을 5 초 노출 시간 없이 10 초 동안 기록했다.Unconjugated probes were washed with PBS. Slow microscopy was recorded for 10 seconds without a 5 second exposure time with a slow microscope.
단일 분자 추적 및 HMM 분석.Single molecule tracking and HMM analysis.
단일 분자의 추적 및 궤적 분석을 위해 Image J의 TrackMate Plugin을 사용 하였다. 평균 제곱 변위 (MSD)는 최대 시간 지연을 궤적 지속 시간의 1/10로 계산 하였다. MSD 플롯은 브라운 운동에 대응하는 선형 방정식에 맞추어졌다. MSD의 처음 10개 점은 확산 계수를 평가하는데 사용되었다.Image J's TrackMate Plugin was used for single molecule tracking and trajectory analysis. Mean squared displacement (MSD) calculated the maximum time delay as 1/10 of the trajectory duration. The MSD plot was fitted to a linear equation corresponding to Brownian motion. The first 10 points of the MSD were used to evaluate the diffusion coefficient.
베이지안 모델 선택 (HMM-Bayes)을 이용한 히든 마르코프 모델링에 기반한 소프트웨어를 사용하여 단일 확산 EGFR 궤적으로부터 측면 확산 상태의 수와 그 전환을 추론했다.A software based on Hidden Markov modeling using Bayesian model selection (HMM-Bayes) was used to infer the number of lateral diffusion states and their transitions from a single diffusion EGFR trajectory.
히든 마르코프 모델링 (HaMMy)를 사용하는 또 다른 소프트웨어는 회전 확산 상태를 분리하는 강도 궤도를 분석하는데 사용되었다.Another software using Hidden Markov Modeling (HaMMy) was used to analyze intensity trajectories separating the rotational diffusion states.
HMM-Bayes와 HaMMy는 모의된 추적 데이터를 사용하여 평가되었으며, 이는 임의의 숫자로 생성되어 Brownian 측면 및 회전 변위를 모방한 것이다.HMM-Bayes and HaMMy were evaluated using simulated tracking data, which were generated with random numbers to mimic Brownian lateral and rotational displacements.
신뢰할 수 있는 결과에 필요한 프레임 수를 확인하기 위해 상태 기간 수를 2에서 10까지 변경했다.We changed the number of state periods from 2 to 10 to see the number of frames required for reliable results.
한편, 지질 분자는 회전 운동을 관찰하기에 지나치게 빠른 바, 0.2 mg/mL BSA를 사용하여 SLB의 확산 동역학을 늦춰주었는데, 결과적으로, 지질 분자는 관측 가능한 회전 동역학으로 0.35 ± 0.19 μm2/s로 늦추어졌고, 연속적인 강도 변화를 나타내었다.On the other hand, the lipid molecule was too fast to observe the rotational motion, so 0.2 mg/mL BSA was used to slow the diffusion kinetics of SLB.As a result, the lipid molecule was 0.35 ± 0.19 μm 2 /s due to the observable rotational kinetics. It was slowed down and showed a continuous intensity change.
본 발명 mGYRO는 명백한 비동요 단일 분자 이미징 제제로서, 기울기 변화가 있는 지질 분자의 브라운 회전 및 측면 이동을 표시한다.The mGYRO of the present invention is a clear, non-shaken single molecule imaging agent that displays Brownian rotation and lateral movement of lipid molecules with gradient changes.
<실험예 3> 살아있는 세포에서 단일 EGFR 이미징<Experimental Example 3> Single EGFR imaging in living cells
먼저, 살아있는 세포에서 단일 EGFR 이미징을 위한 1가 나노프로브를 적용하기 위해, SNAP-EGFR-GFP를 발현하는 안정한 세포주를 생성하고 특히 수용체를 벤질구아닌 (BG), 링커 DNA 및 mGYRO로 표지하였다.First, in order to apply a monovalent nanoprobe for single EGFR imaging in living cells, a stable cell line expressing SNAP-EGFR-GFP was generated and the receptor was specifically labeled with benzylguanine (BG), linker DNA and mGYRO.
SNAP-EGFR-GFP 발현 세포주SNAP-EGFR-GFP expressing cell line
SNAP-EGFR-GFP는 고전적 PCR 클로닝 기술에 의해 구축되었다. pSNAPf 벡터 (NEB)를 EGFR-GFP 구조물 (Addgene)의 N- 말단에 삽입하였다. SNAP-EGFR-GFP 플라스미드를 열 충격 변환에 의해 최상위 10 개 대장균 (Thermo Fisher)으로 형질 전환시켰다. 대장균은 O.D.600 2~4가 되도록 배양 하였다. 플라스미드 정제는 제조자의 프로토콜 (Qiagen, miniprep)에 따랐다. SNAP-EGFR-GFP를 제조사의 프로토콜 (파라미터, 팁 : 10 μL, 세포 수 : 3.5 x 105, 플라즈미드 : 1 μg, 펄스 전압, 폭 및 수 : 각각 1,230 V, 10 ms, 4)에 따라 Neon Transfection System (Thermo Fisher, MPK5000)을 사용하여 U2OS 세포주에 형질 감염시켰다. 이어서 1,000 ㎍/㎖ G418로 10 일 동안 선별하였다. 세포를 10 % FBS가 함유 된 DMEM에서 배양하고, T25 플라스크 (Corning)에서 매 3-4 일마다 배양하였다. 모든 세포는 가습기 배양기 (Binder, Model C 170)에서 37 ℃와 5 % CO2로 유지되었다. SNAP-EGFR-GFP를 발현하는 U2OS 안정 세포주를 추가 선택없이 사용 하였다.SNAP-EGFR-GFP was constructed by classical PCR cloning technique. The pSNAPf vector (NEB) was inserted into the N-terminus of the EGFR-GFP construct (Addgene). The SNAP-EGFR-GFP plasmid was transformed into the top 10 E. coli (Thermo Fisher) by heat shock transformation. E. coli was cultured to an OD600 of 2-4. Plasmid purification followed the manufacturer's protocol (Qiagen, miniprep). Neon Transfection of SNAP-EGFR-GFP according to the manufacturer's protocol (parameters, tips: 10 μL, number of cells: 3.5 x 10 5 , plasmid: 1 μg, pulse voltage, width and number: 1,230 V, 10 ms, 4, respectively). System (Thermo Fisher, MPK5000) was used to transfect U2OS cell lines. Subsequently, 1,000 µg/ml G418 was selected for 10 days. Cells were cultured in DMEM containing 10% FBS and cultured every 3-4 days in T25 flasks (Corning). All cells were maintained at 37 ℃ and 5% CO 2 in a humidifier incubator (Binder, Model C 170). A U2OS stable cell line expressing SNAP-EGFR-GFP was used without further selection.
높은 NA 목표를 가진 현미경 관찰을 위해, 세포는 콜라겐 I로 코팅 된 35 mm 유리 바닥 접시 (MatTek, P35G-0-10-C)에 플레이팅되었으며, 라멜리포디아(lamellipodia)의 꼭대기 표면을 선택하여 세포체 주위의 밑면 (focal adhesion)과 가파른 경사면과의 물리적 접촉을 피한다.For microscopic observation with a high NA target, cells were plated on a 35 mm glass bottom dish (MatTek, P35G-0-10-C) coated with collagen I, and the apical surface of lamellipodia was selected. This avoids physical contact with focal adhesion and steep slopes around the cell body.
벤질구아닌-NHS의 제조Preparation of benzylguanine-NHS
벤질구아닌-NHS 링커는 New England Biolabs에서 구매가 가능하며(), 하기 반응식과 같이 수행하여 합성되었다. 달리 명시하지 않는 한, 모든 화학 반응은 실온(rt)에서 질소 (99.999 %) 대기하에서 수행되었다.The benzylguanine-NHS linker can be purchased from New England Biolabs (), and was synthesized by performing the following reaction scheme. Unless otherwise specified, all chemical reactions were carried out at room temperature (rt) under nitrogen (99.999%) atmosphere.
[반응식][Reaction Scheme]
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 1.74(t, 2H), 2.18(m, 4H), 2.60(t, 4H), 4.24(d, 2H), 5.44(s, 2H), 6.27(s, 2H), 7.26(d, 2H), 7.43(d, 2H), 7.80(s, 1H), 8.33(t, 1H), 12.4(s, 1H) /Yield: 84% (0.0502 mmol, 0.024 g) 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 1.74 (t, 2H), 2.18 (m, 4H), 2.60 (t, 4H), 4.24 (d, 2H), 5.44 (s, 2H), 6.27(s, 2H), 7.26(d, 2H), 7.43(d, 2H), 7.80(s, 1H), 8.33(t, 1H), 12.4(s, 1H) /Yield: 84% (0.0502 mmol, 0.024 g)
벤질 구아닌 결합 DNA (BG-DNA)의 제조Preparation of benzyl guanine binding DNA (BG-DNA)
BG-NHS를 DMSO에 녹여 10mg/mL의 농도로 -20 ℃에서 보관하였다. BG-NHS와 아민말단기의(amineterminated) DNA (DNA linker)를 결합하기 위해, 100 μM DNA 결합제 20 μL, DI 물 38 μL, HEPES 완충액 (0.5 M, pH 8.5) 20 μL 및 10 mg/mL NHS 활성 벤질 구아닌 2 mL를 에피튜브에 첨가하였다. 상기 용액을 10 분 동안 초음파 처리로 보조하여 혼합하고 추가로 1 시간 동안 배양하였다. 생성물을 Zeba 스핀 탈염 컬럼 (Thermo fisher, 7k MWCO, 0.5 mL)을 사용하여 정제하고 에탄올로 침전시켰다. 이어서, BG-DNA 팔레트를 DI 물에 최종 농도 50 μM의 스톡에 재현탁하고 4 ℃에서 보관하였다.BG-NHS was dissolved in DMSO and stored at -20°C at a concentration of 10mg/mL. To bind BG-NHS and amineterminated DNA (DNA linker), 20 μL of 100 μM DNA binding agent, 38 μL of DI water, 20 μL of HEPES buffer (0.5 M, pH 8.5) and 10 mg/
살아있는 세포에서의 mGYRO의 특이적인 표지Specific labeling of mGYRO in living cells
SNAP-EGFR-GFP를 안정적으로 발현하는 세포를 콜라겐 I 코팅된 유리 바닥 접시에 ~ 50 %의 밀도로 플레이팅 하였다. 표지하기 전에 50 μL의 1 μM BG-DNA와 50 μL의 1.2 μM DNAT3을 혼합하고 세포를 37 ℃에서 10 분 동안 DNA 혼합물과 함께 배양했다. 세포를 10 % FBS를 함유한 배양 배지로 3 회 세척한 후, 알칼리 가용성 카세인 0.5 %를 함유하는 배양 배지에 분산된 1 nM의 mGYRO를 세포에 처리하였다. rt에서 4 분 배양 후, 현미경하기 전에 결합되지 않은 프로브를 배지로 세척하였다. 염료-비교 단일 분자 확산 실험을 위해 1.2 μM DNATR을 사용하여 BG-DNA와 반응시켰다.Cells stably expressing SNAP-EGFR-GFP were plated on a collagen I coated glass bottom dish at a density of ~ 50%. Before labeling, 50 μL of 1 μM BG-DNA and 50 μL of 1.2 μM DNA T3 were mixed and the cells were incubated with the DNA mixture at 37° C. for 10 minutes. After washing the cells three times with a culture medium containing 10% FBS, 1 nM mGYRO dispersed in a culture medium containing 0.5% alkali-soluble casein was treated to the cells. After incubation for 4 minutes at rt, unbound probes were washed with medium before microscopy. For dye-comparative single molecule diffusion experiments, 1.2 μM DNA TR was used to react with BG-DNA.
살아있는 세포에서 막 단백질의 회전을 모니터링하기 위한 이미징 프로브 디자인 Imaging probe design to monitor the rotation of membrane proteins in living cells
비대칭 나노 입자가 각도 의존적인 강도 변화를 보임에 따라, Au NRs는 생체 분자의 회전 동역학을 위한 방향 센서 또는 모니터링 프로브로 사용되어 왔다. 예를 들어 살아있는 세포에서 효소와 운동 단백질 역학을 모니터링한다. 각도 의존 특성을 최대화하기 위해, 생체 분자를 나노 입자에 연결시키는 링커는 나노 입자의 중심에 위치해야 한다. 그러나, 링커의 부위 선택적 기능화는 어렵다. 나노 프로브의 중앙에 링커를 배치하기 위해, 우리는 두 개의 금 NP와 Y 형 DNA로 이합체화된 나노 입자를 설계했다.As asymmetric nanoparticles show an angle-dependent intensity change, Au NRs have been used as orientation sensors or monitoring probes for rotational dynamics of biomolecules. For example, it monitors the dynamics of enzymes and motor proteins in living cells. In order to maximize the angle-dependent properties, the linker that connects the biomolecule to the nanoparticle should be located at the center of the nanoparticle. However, it is difficult to functionalize the site-selective linker. To place the linker in the center of the nanoprobe, we designed nanoparticles dimerized with two gold NPs and Y-type DNA.
Au 이합체는 플라즈몬 결합에 의한 광학 특성면에서 Au NR(나노로드)과 유사하다.Au dimer is similar to Au NR (nanorod) in terms of optical properties due to plasmon bonding.
Au 이합체의 플라즈몬 성질은 입자 크기, 거리 및 입사된 편광의 각도에 의존한다. 모니터링 프로브로서 최고의 성능을 위해서는 최적화된 입자 크기와 입자 간 거리가 결정되어야 한다. 섭동(perturbation)을 고려할 때, 작은 Au 다이머가 가장 바람직하다. 그러나 살아있는 세포는 많은 엔도좀을 가지고 있다. 탐침 역할을 하려면 나노 탐침을 엔도좀과 구별해야한다. 우리는 다양한 크기의 나노입자와 엔도좀의 강도를 측정했다.The plasmonic properties of Au dimers depend on the particle size, distance and angle of incident polarization. For best performance as a monitoring probe, the optimized particle size and particle-to-particle distance must be determined. When considering perturbation, a small Au dimer is most preferred. However, living cells have many endosomes. To act as a probe, nano probes must be distinguished from endosomes. We measured the strength of nanoparticles and endosomes of various sizes.
30 nm 나노 입자가 살아있는 세포에서 실험적으로 엔도좀과 구별되지는 않지만 25 nm 이량체 나노 입자는 엔도좀 보다 훨씬 밝고 살아있는 세포에서 명확하게 구별된다. 또한, 25 nm Au 이량체가 단백질 이동에서 섭동을 일으키지 않음을 확인했다.Although 30 nm nanoparticles are not experimentally distinguished from endosomes in living cells, 25 nm dimer nanoparticles are much brighter than endosomes and are clearly distinguished in living cells. In addition, it was confirmed that the 25 nm Au dimer did not cause perturbation in protein migration.
플라즈몬 결합 효과를 고려할 때, 입자 간 거리가 짧을수록 지수적으로 더 큰 산란 강도를 나타내며 DNA 염기 쌍의 수에 의해 제어될 수 있다. 그러나 DNA 이중(duplex) 안정성도 고려해야한다.In consideration of the plasmon binding effect, the shorter the distance between particles, the exponentially greater scattering intensity and can be controlled by the number of DNA base pairs. However, DNA duplex stability should also be considered.
DNA 이중 안정성은 인접한 소수성 염기 사이의 반데르 발스 (Van der Waals) 상호 작용에 기인한다. 더 많은 적층 염기 쌍은 보다 나은 안정성을 제공한다. 따라서 두 가지 요소 모두 고려해야한다.DNA double stability is due to Van der Waals interactions between adjacent hydrophobic bases. More stacked base pairs provide better stability. Therefore, both factors must be considered.
DNA 염기쌍의 열 안정성과 관련하여 37 ℃에서 적어도 10 쌍이 필요하며 용융 온도는 표준 편차가 10 ℃ 인 약 50 ℃이다. 열은 DNA 이중 분해를 유도한다. 또한, 세 개의 Y 형 단일 가닥의 방향을 고려할 때, 각 이중 나선은 한 턴을 가지기 위해 10-13 쌍이 필요하다. 그러므로 우리는 입자들 사이에 4 nm 간격을 제공하면서 각 상보적인 부분에 대해 결합하기 위해 염기 13 쌍을 선택한다.Regarding the thermal stability of DNA base pairs, at least 10 pairs are required at 37°C, and the melting temperature is about 50°C with a standard deviation of 10°C. Heat induces DNA double degradation. Also, considering the orientation of the three Y-shaped single strands, each double helix needs 10-13 pairs to have one turn. Therefore, we choose 13 pairs of bases to bind for each complementary moiety, giving 4 nm spacing between the particles.
FDTD (finite-difference time-domain) 계산을 사용하여 회전 프로브로 거리의 유효성을 검사했다. 4 nm 갭을 갖는 25 nm Au 다이머는 커플링되지 않은 이량체보다 3 배 더 높은 강도를 가지며 편광된 빛에 대해 충분한 강도 차이를 보였다. 또한, 모든 스펙트럼이 4 nm 간격으로 500 nm와 600 nm 사이에 위치하기 때문에 광학 기기 적용에 문제는 없다(수은등 (380-600 nm), 편광 필터 (400-700 nm), EM CCD (400-900 nm) 등).FDTD (finite-difference time-domain) calculations were used to validate the distance with a rotating probe. The 25 nm Au dimer with 4 nm gap had an intensity three times higher than that of the uncoupled dimer and showed sufficient intensity difference for polarized light. In addition, since all spectra are located between 500 nm and 600 nm at 4 nm intervals, there is no problem in applying optical devices (mercury lamp (380-600 nm), polarization filter (400-700 nm), EM CCD (400-900 nm). nm), etc.).
EGFR 이량체화 동안 회전 방향의 선택Selection of the direction of rotation during EGFR dimerization
특히 올리고머 상태가 다르더라도 동일한 회전 상태에서 거의 동일한 회전 운동성 값을 측정했으며, 올리고머 상태가 변할 때 (즉, M1에서 D1로 또는 그 반대로) 회전 속도 유지가 관찰됨으로써 "이량체화 중에 회전 속도 보존"을 확인하였다.In particular, even though the oligomer states were different, almost the same rotational motility values were measured in the same rotational state, and when the oligomer state was changed (ie, from M1 to D1 or vice versa), rotational speed maintenance was observed, thus "preserving rotational speed during dimerization" Confirmed.
EGFR transmembrane domain (TM)의 관성 모멘트 (I)를 평가하기 위해 단백질 주 데이터 뱅크 (PDB, 2M0B)에서 원자 좌표를 얻었으며, 회전의 주축은 질량의 중심을 통과하는 z 축이라고 가정하였다.To evaluate the moment of inertia (I) of the EGFR transmembrane domain (TM), atomic coordinates were obtained from the protein main data bank (PDB, 2M0B), and the main axis of rotation was assumed to be the z-axis passing through the center of mass.
좌표 x, y, z 및 각각의 원자량의 질량으로부터 계산된 관성 모멘트는 식 (1)을 사용하여 얻어지고 각 운동량 (L)의 식은 식 (2)로부터 얻어진다.The moment of inertia calculated from the coordinates x, y, z and the mass of each atomic mass is obtained using equation (1), and the equation of angular momentum (L) is obtained from equation (2).
여기서, m, r 및 w는 각각 원자 질량, 주축으로부터 각 원자의 수직 거리 및 각속도를 나타낸다.Here, m, r and w represent the atomic mass, the vertical distance and angular velocity of each atom from the main axis, respectively.
계산된 I 비율은 i) 2 개의 단일 EGFR의 이합체가 완전 비탄성 충돌을 이루고, ii) 시스템의 각 운동량이 보존되고, iii) 2 개의 EGFR의 회전 방향이 일치 할 때 이합체가 발생한다고 가정하면, ~ 0.5 (IM과 ID 각각 5.80, 11.02 x 10-39 g · m2)이며 이는 회전 속도 보존과 일치한다.The calculated I ratio is assuming that i) dimers of two single EGFRs are in complete inelastic collision, ii) angular momentum of the system is preserved, and iii) dimers occur when the rotation directions of the two EGFRs coincide, ~ 0.5 (IM and ID 5.80, 11.02 x 10-39 g m2, respectively), which is consistent with conservation of rotational speed.
Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) 분석Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) analysis
살아있는 세포에서의 EGFR의 확산 분석을 위해, SNAP-EGFR-GFP를 안정적으로 발현하는 살아있는 세포에서 FRAP 분석을 수행하였다.For analysis of the proliferation of EGFR in living cells, FRAP analysis was performed in living cells stably expressing SNAP-EGFR-GFP.
이 과정은 형광을 30 초간 조사하는 것을 제외하고는 지질 이중층에서 수행 한 것과 유사하다.This process is similar to that performed on the lipid bilayer, except that fluorescence is irradiated for 30 seconds.
확산 계수는 다음과 같이 결정된다. D = r2γ/4t1/2, 여기에서 r은 표백 된 영역의 반경, γ는 표백 된 영역의 형태 (원형의 경우 γ = 1)에 의존하는 매개 변수이고, t1/2는 회복의 절반에 소요되는 시간이다.The diffusion coefficient is determined as follows. D = r 2 γ/4t 1/2 , where r is the radius of the bleached area, γ is a parameter dependent on the shape of the bleached area (γ = 1 in the case of a circle), and t 1/2 is the recovery That's half the time.
먼저 노멀라이즈화된 FRAP 곡선을 지수 성장 함수에 맞추고 절반 시간 (t1/2)을 얻었다. 표백(bleached)된 영역의 반 너비 (r)는 가우시안 함수가 적용된 강도 분포의 반치폭 (FWHM)으로 정의된다.First, the normalized FRAP curve was fitted to an exponential growth function and half time (t 1/2 ) was obtained. The half width (r) of the bleached area is defined as the half width (FWHM) of the intensity distribution to which the Gaussian function is applied.
산란 강도와 x-y 위치의 흔적은 DF 현미경을 통해 얻어졌다. 최근 연구에 따르면, EGFR은 주로 가역적 이량체화로부터 단백질-단백질 상호 작용에 기인한 측면 확산의 역동적 변화를 보여준다. 그러나 이량체의 존재는 여전히 논쟁의 여지가있다.The scattering intensity and traces of the x-y position were obtained through a DF microscope. According to recent studies, EGFR shows a dynamic change in lateral diffusion mainly due to protein-protein interactions from reversible dimerization. However, the existence of dimers is still debatable.
EGFR의 올리고머 상태와 그것의 상응하는 확산성을 검증하기 위해서는 오랜 시간 관찰이 필수적이다 (> 1 분, 시간 해상도: ~ 20ms). 본 발명자들은 처음에 살아있는 세포에서 1가 Au NP (mAu)를 사용하여 단일 수용체의 공동 국소화 사건(n = 541)을 추적했다.Long time observations are essential to verify the oligomer state of EGFR and its corresponding diffusivity (> 1 min, time resolution: ~ 20 ms). We initially followed the colocalization event of a single receptor (n = 541) using monovalent Au NPs (mAu) in living cells.
올리고머화 상태를 확인하기 위해, 결합된 플라즈몬 강도, 두 개의 Au NP 사이의 거리 (d)의 함수, 및 연관된 단백질 수의 함수인 측면 확산도를 동시에 측정했다.To confirm the oligomerization state, the bound plasmon intensity, a function of the distance (d) between the two Au NPs, and the lateral diffusivity as a function of the number of associated proteins were measured simultaneously.
궤적으로부터 올리고머의 추계학적 전이로부터 이산 상태를 검출하기 위해, 통계적 기계 학습 분석, 히든 마코프 모델 (HMM-Bayes) 및 HaMMy를 통합한 베이지안 모델을 사용했다.To detect discrete states from stochastic transitions of oligomers from trajectories, a Bayesian model incorporating statistical machine learning analysis, Hidden Markov model (HMM-Bayes) and HaMMy was used.
한편, 상피 성장 인자 수용체 (EGFR) 단백질은 0.16 ± 0.14 μm2/s로 지질 분자 보다 훨씬 느리기 때문에, 단백질을 관찰하는데 어려움이 없었다.On the other hand, since the epidermal growth factor receptor (EGFR) protein was much slower than the lipid molecule at 0.16 ± 0.14 μm 2 /s, there was no difficulty in observing the protein.
우리는 Brownian 외측 및 회전 궤적을 시뮬레이션함으로써 HMM 방법의 시간적 정확성을 평가하고 결과의 일관성을 확인했다.We evaluated the temporal accuracy of the HMM method by simulating Brownian outer and rotational trajectories and confirmed the consistency of the results.
EGFR 궤적의 HMM 분석은 리간드 (EGF)없는 조건에서 고차원 올리고머화의 드문 관찰로 가역적인 EGFR 이량체화를 나타냈다.HMM analysis of the EGFR trajectory indicated reversible EGFR dimerization with rare observation of high-order oligomerization in ligand (EGF)-free conditions.
또한, 우리는 리간드 바인딩 후 EGFR 역학을 조사했다.In addition, we investigated EGFR dynamics after ligand binding.
형광성 단백질 (GFP) 및 유기 염료 (텍사스 레드)뿐만 아니라 클러스터 된 Au NP가 관찰되어 EGFR 올리고머화가 나타났다.Fluorescent protein (GFP) and organic dye (Texas Red) as well as clustered Au NPs were observed, indicating EGFR oligomerization.
다음으로 우리는 mGYRO가 SNAP-EGFR-GFP를 특이적으로 표적으로하고 살아있는 세포에서 EGFR 이동성을 변화시키지 않는다는 것을 확인했다.Next, we confirmed that mGYRO specifically targets SNAP-EGFR-GFP and does not change EGFR mobility in living cells.
인접한 탐침 사이의 광학 혼선을 최소화하기 위해 낮은 표지 밀도에서 편광 된 DF는 mGYRO의 산란 강도 (IEGFR)의 변동과 함께 확산 EGFR의 희소 표시를 나타낸다.To minimize optical crosstalk between adjacent probes, polarized DF at low labeling density exhibits a sparse indication of diffuse EGFR with fluctuations in the scattering intensity (IEGFR) of mGYRO.
이러한 결과를 바탕으로 우리는 측면 확산과 회전 확산 모두에서 급격한 변화를 조사하여 몇 가지 상태가 존재함을 나타낸다.Based on these results, we investigated abrupt changes in both lateral diffusion and rotational diffusion, indicating that several states exist.
변동의 기원을 조사하기 위해, 우리는 서로 다른 편광 각도 (평행, 일 정치 및 수직, I +)를 갖는 고정 된 mGYRO 사이의 강도를 측정하였다.To investigate the origin of the fluctuations, we measured the intensity between fixed mGYROs with different polarization angles (parallel, constant and vertical, I+).
여기서, (i) 편광되지 않은 편광 된 조사 하에서 고정 된 모든 프로브는 밝기가 안정적이며, (ii) 비극성 빛 아래에서 프로브를 확산 시키더라도 안정성을 유지하고, (iii) IEGFR은 항상 일과 I + 사이 였고 (iv) IEGFR은 확률 적으로 변동했다.Here, (i) all probes fixed under unpolarized polarized irradiation have stable brightness, (ii) maintain stability even if the probe is diffused under non-polar light, and (iii) IEGFR was always between work and I+ (iv) IEGFR fluctuated probabilistically.
따라서, 확산 프로브로부터의 IEGFR의 변화는 Au NPs 또는 z 축을 따른 전위 사이의 아티팩트 또는 진동에 기인 한 것이 아니라, 편광 된 빛 하에서의 mGYRO의 각 변위에 기인한다.Thus, the change in IEGFR from the diffusion probe is not due to artifacts or oscillations between Au NPs or potentials along the z axis, but rather due to the angular displacement of mGYRO under polarized light.
원칙적으로 세포막에서 transmembrane (TM) 단백질의 기존 실린더 모델의 각도 및 측면 확산 계수 (DR, DL)는 Saffman-Delbruck 관계를 따른다.In principle, the angular and lateral diffusion coefficients (DR, DL) of the conventional cylinder model of the transmembrane (TM) protein in the cell membrane follow the Saffman-Delbruck relationship.
여기서, T, η, h 및 r은 각각 지질 막의 온도, 점도, TM 단백질의 높이 및 반경을 나타낸다.Here, T, η, h and r represent the temperature, viscosity, and height and radius of the TM protein of the lipid membrane, respectively.
단일 분자 EGFR 확산의 라이브 세포 실험에서, TM 도메인 주위의 T 및 η는 상수이어야하고, 형태 학적 인자 (r, h)의 변화는 헬리컬 TM 도메인의 본래의 구조적 안정성으로 인해 무시할만하다.In live cell experiments of single molecule EGFR diffusion, T and η around the TM domain must be constant, and the change in morphological factors (r, h) is negligible due to the inherent structural stability of the helical TM domain.
따라서 우리는 형태 학적 요인을 변화시키는 추가적인 요인이 있다고 가정했다.Therefore, we hypothesized that there are additional factors that change the morphological factor.
EGFR 이량체화에서 키나제 도메인 (KDs)의 비대칭 결합은 중요한 단계이며, 최근의 핵 자기 공명 및 분자 역학 연구는 KD가 자체적으로 원형질막에 묻혀있을 때 KD 이합체 화가 억제됨을 확인했다.Asymmetric binding of kinase domains (KDs) in EGFR dimerization is an important step, and recent nuclear magnetic resonance and molecular dynamics studies have confirmed that KD dimerization is inhibited when KD is itself buried in the plasma membrane.
리간드 유도 EGFR 이합체화는 막 상호 작용 요소 (특히, 막 막 부분 내의 LRRLL 모티프 및 KD)를 원형질 막으로부터 알로 스테 틱하게 얽히게함으로써 세포 내 도메인 (ICD)의 활성 구조를 안정화시킨다.Ligand-induced EGFR dimerization stabilizes the active structure of the intracellular domain (ICD) by allostically entangled membrane interacting elements (especially the LRRLL motif and KD within the membrane membrane portion) from the plasma membrane.
따라서 우리는 EGFR의 각 변위의 확률 적 변화의 기원을 ICD와 지질막의 상호 작용으로 해석한다.Therefore, we interpret the origin of the probabilistic change in angular displacement of EGFR as the interaction of ICD and lipid membrane.
또한, 이것은 r (α r-2 vs ln (r-1))에 대한 의존성으로 인하여 횡 이동도에 비해 상대적으로 회전 이동성이 우세하며, 이는 ICD와 지질 이중층 사이의 소수성 상호 작용이 회전 올리고머 상태는 아니다.In addition, it has a relatively dominant rotational mobility compared to the lateral mobility due to its dependence on r (α r-2 vs ln (r-1)), which means that the hydrophobic interaction between the ICD and the lipid bilayer results in the rotational oligomer state. no.
ICD 도킹으로 인한 구조적 상태의 수와 올리고머 상태와의 상관 관계를 결정하기 위해, 우리는 HMM이있는 궤적으로부터 CSAD와 CSD를 모두 분석했다.To determine the correlation between the number of structural states due to ICD docking and oligomer states, we analyzed both CSAD and CSD from trajectories with HMM.
결과는 측정 된 궤도에서 추론되었다. CSD의 2 개의 올리고머 상태(M, D), CSAD의 3 개의 구조 상태(1, 2, 3)를 포함한다.The results were inferred from the measured trajectories. It includes two oligomer states of CSD (M, D) and three structural states of CSAD (1, 2, 3).
수십개의 궤도에서 세 가지 주목할만한 관찰이 얻어졌다:Three notable observations were obtained in dozens of orbits:
(i) 두 개의 단량체 (M1, M2) 및 세 개의 이량체 (D1, D2, D3) 상태가 관찰되었으며, 회전 상태간에 유의 한 차이가 있음에도 불구하고 동일한 회전 상태에서 거의 동일한 각속도를 보였다. (M1-D1 대 M2-D2 대 D3, ~ 10, 50, 90 rad2/s).(i) Two monomers (M1, M2) and three dimers (D1, D2, D3) states were observed, and almost the same angular velocity was observed in the same rotational state, despite significant differences between the rotational states. (M1-D1 vs M2-D2 vs D3, ~10, 50, 90 rad 2 /s).
(ⅱ) 각 상태의 체류 시간 (τ)을 고려할 때, KD가 묻혀있는 EGFR 형태를 예상하는 가장 느린 회전 상태 (M1 및 D1)는 에너지적으로 안정하다.(Ii) Considering the residence time (τ) of each state, the slowest rotational states (M1 and D1) predicting the EGFR form in which KD is buried are energetically stable.
(iii) 상태 기호를 고려할 때, 시간적 전이에 대한 더 상세한 조사가 필요하다. 각 관찰에는 독립적인 고려가 필요하다.(iii) When considering state symbols, more detailed investigations of temporal transitions are needed. Each observation requires independent consideration.
첫째로, 회전 상태는 올리고머 상태가 변화하는 동안 (즉, M1 내지 D1 및 그 반대로) 유지되며, 이는 2 개의 EGFR의 회전 방향이 일치할 때 발생하는 이량체화를 나타낼 수 있다.First, the rotational state is maintained while the oligomer state changes (i.e., M1 to D1 and vice versa), which may indicate dimerization that occurs when the directions of rotation of the two EGFRs coincide.
둘째로, 멤브레인으로부터 분리된 ICD가 EGFR 활성화의 중요한 고찰이지만, M3 상태는 수백 가지 동적 전환 중 검출되지 않았다.Second, although ICD isolated from the membrane is an important consideration of EGFR activation, the M3 state was not detected during hundreds of dynamic transitions.
검출되지 않은 M3 상태는 후속적인 이량체화가 해체 된 ICD 형태를 더욱 안정화시키는 방식으로 해석될 수 있으며, 이는 또한 EGFR KD의 제안 된 형태와 일치한다.The undetected M3 state can be interpreted in such a way that subsequent dimerization further stabilizes the dissociated ICD form, which is also consistent with the proposed form of EGFR KD.
마지막으로, 전이가 단량체와 이량체 사이에서만 발생한다는 것을 보여주는 관측을 포함하여, 근사 접근법에 의해, M1과 D1 상태 사이에서 대부분의 전이가 일어난다는 사실이 밝혀졌다.Finally, it was found that most of the transitions occur between the M1 and D1 states, including the observation that the transition occurs only between the monomer and the dimer.
요약하면,이 연구는 현장 특유의 플라즈몬 나노 입자, 스트로보 조영 이미징 방법 및 수학적 알고리즘을 사용하여 이전에 살아있는 세포, 단일 분자 수준에서 검출할 수 없었던 EGFR의 ICD의 구조 동역학을 밝혀냈다.In summary, this study uncovered the structural kinetics of the ICD of EGFR, which was previously undetectable at the living cell, single-molecule level using field-specific plasmon nanoparticles, strobe contrast imaging methods, and mathematical algorithms.
이 방법은 분자 확산 및 회전의 시각화뿐만 아니라 신호 전달 중에 단백질의 구조적 전이 분석을 가능하게 했다.This method allowed the visualization of molecular diffusion and rotation, as well as the analysis of the structural transfer of proteins during signal transduction.
회전 및 전이를 영상화하는 본 발명의 성공은 견고한 광학 안정성 및 정밀하게 제어된 나노 물질 표면 화학에 기인한다.The inventive success of imaging rotations and transitions is due to robust optical stability and precisely controlled nanomaterial surface chemistry.
<110> DAEGU GYEONGBUK INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Nanoparticle dimer linked by Y-shaped oligonucleotide conjugate, Method for producing the same, and Probe for single molecule observation comprising the same <130> 2019P-01-046 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> one of the 3 polynucleotides for forming self-assemblable Y structured DNA <400> 1 cttacggcga atgaccgaat cagcct 26 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> one of the 3 polynucleotides for forming self-assemblable Y structured DNA <400> 2 aggctgattc ggttcatgcg gatcga 26 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> one of the 3 polynucleotides for forming self-assemblable Y structured DNA <400> 3 tcgatccgca tgacattcgc cgtaag 26 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for forming monovalent Au particle <400> 4 cttacggcga atgtcatgcg gatcga 26 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for Specific labeling test <400> 5 actgactgac tgactgactg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for Specific labeling test <400> 6 cagtcagtca gtcagtcagt 20 <110> DAEGU GYEONGBUK INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Nanoparticle dimer linked by Y-shaped oligonucleotide conjugate, Method for producing the same, and Probe for single molecule observation comprising the same <130> 2019P-01-046 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> one of the 3 polynucleotides for forming self-assemblable Y structured DNA <400> 1 cttacggcga atgaccgaat cagcct 26 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> one of the 3 polynucleotides for forming self-assemblable Y structured DNA <400> 2 aggctgattc ggttcatgcg gatcga 26 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> one of the 3 polynucleotides for forming self-assemblable Y structured DNA <400> 3 tcgatccgca tgacattcgc cgtaag 26 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for forming monovalent Au particle <400> 4 cttacggcga atgtcatgcg gatcga 26 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for Specific labeling test <400> 5 actgactgac tgactgactg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for Specific labeling test <400> 6 cagtcagtca gtcagtcagt 20
Claims (12)
상기 Y형 올리고 뉴클레오티드 결합체에 의해 연결되는 2개의 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나노입자;를 포함하고,
상기 2개의 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나노입자간의 거리는 1nm 내지 10nm이며,
상기 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나노입자의 직경은 15nm 내지 30nm 인 것을 특징으로 하는 나노입자 이합체.
Y-type oligonucleotide conjugate formed by the complementary linkage of three oligonucleotides; And
Including; metal nanoparticles capable of two phlosmonic couplings connected by the Y-type oligonucleotide conjugate,
The distance between the two metal nanoparticles capable of phlosmonic coupling is 1 nm to 10 nm,
Nanoparticle dimer, characterized in that the diameter of the metal nanoparticles capable of the phlosmonic coupling is 15nm to 30nm.
상기 Y형 올리고 뉴클레오티드 결합체는 목적하는 표적과 결합할 수 있는 결합 부위를 갖는 것이거나, 또는 목적하는 표적과 결합할 수 있도록 추가의 결합 분자와 연결되는 것인, 나노입자 이합체.
The method of claim 1,
The Y-type oligonucleotide conjugate has a binding site capable of binding to a target of interest, or is linked with an additional binding molecule so as to bind to a target of interest.
상기 3개의 올리고 뉴클레오티드는 각각 26 - 50개의 염기서열을 포함하는 것인, 나노입자 이합체.
The method of claim 1,
The three oligonucleotides each containing 26-50 base sequences, nanoparticle dimer.
상기 3개의 올리고 뉴클레오티드는 제1 ss-DNA, 제2 ss-DNA, 및 제3 ss-DNA로 이루어지되,
여기서, 제1 및 제2 ss-DNA는 5' 위치가 각각 상기 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나노입자와 결합될 수 있도록 개질되며, 제3 ss-DNA의 5' 위치는 목적하는 표적과 결합할 수 있도록 개질되거나, 또는 염기서열을 더 갖거나, 또는 추가의 결합 분자와 연결되는 것인, 나노입자 이합체.
The method of claim 1,
The three oligonucleotides consist of a first ss-DNA, a second ss-DNA, and a third ss-DNA,
Here, the first and second ss-DNAs are modified so that the 5'position can be combined with the metal nanoparticles capable of phlosmonic coupling, respectively, and the 5'position of the third ss-DNA is combined with the target target. It is modified to be able to, or further has a nucleotide sequence, or will be linked with an additional binding molecule, nanoparticle dimer.
상기 나노입자 이합체는,
제1 금속 나노입자; 제2 금속 나노입자; 제1 금속 나노입자에 결합된 제1 ss-올리고 뉴클레오티드; 제2 금속나노입자에 결합된 제2 ss-올리고 뉴클레오티드; 제3 ss-올리고 뉴클레오티드를 포함하며;
상기 제1 ss-올리고 뉴클레오티드는 제3 ss-올리고뉴클레오티드와 상보적 결합된 제1 결합영역을 형성하고;
상기 제2 ss-올리고 뉴클레오티드는 제1 ss-올리고 뉴클레오티드와 상보적 결합된 제2 결합영역을 형성하고;
상기 제3 ss-올리고 뉴클레오티드는 제2 ss-올리고 뉴클레오티드와 상보적 결합된 제3 결합영역을 형성하여,
상기 제1 금속 나노입자와 제2 금속 나노입자가 Y형 올리고 뉴클레오티드 결합체에 의해서 연결되는 것인, 금속 나노입자 이합체.
The method of claim 1,
The nanoparticle dimer,
First metal nanoparticles; Second metal nanoparticles; A first ss-oligo nucleotide bound to the first metal nanoparticle; A second ss-oligo nucleotide bound to the second metal nanoparticle; A third ss-oligo nucleotide;
The first ss-oligonucleotide forms a first binding region complementarily bonded to the third ss-oligonucleotide;
The second ss-oligo nucleotide forms a second binding region complementary to the first ss-oligo nucleotide;
The third ss-oligo nucleotide forms a third binding region complementary to the second ss-oligo nucleotide,
The first metal nanoparticles and the second metal nanoparticles are connected by a Y-type oligonucleotide conjugate.
상기 Y형 올리고 뉴클레오티드 결합체에 의해 연결되는 2개의 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나노입자;를 포함하고,
상기 2개의 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나노입자간의 거리는 1nm 내지 10nm이며,
상기 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나노입자의 직경은 15nm 내지 30nm인 것을 특징으로 하는 단일 분자 관찰용 프로브.
Y-type oligonucleotide conjugate formed by the complementary linkage of three oligonucleotides; And
Including; metal nanoparticles capable of two phlosmonic couplings connected by the Y-type oligonucleotide conjugate,
The distance between the two metal nanoparticles capable of phlosmonic coupling is 1 nm to 10 nm,
The probe for single molecule observation, characterized in that the diameter of the metal nanoparticles capable of phlosmonic coupling is 15nm to 30nm.
상기 단일 분자 관찰용 프로브는,
아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 글리코프로테인, 리포프로테인, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 핵산, 당, 탄수화물, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 지방산, 지질, 호르몬, 대사산물, 사이토카인, 케모카인, 수용체, 신경전달물질, 항원, 알레르겐, 항체, 기질, 대사산물, 보조인자, 억제제, 약물, 약학물, 영양물, 프리온, 독소, 독물, 폭발물, 살충제, 화학무기제, 생체유해성 제제, 방사선동위원소, 비타민, 헤테로사이클릭 방향족 화합물, 발암물질, 돌연변이유발요인, 마취제, 암페타민, 바르비투레이트, 환각제, 폐기물 또는 오염물을 관찰 또는 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는, 단일 분자 관찰용 프로브.
The method of claim 7,
The probe for single molecule observation,
Amino acids, peptides, polypeptides, proteins, glycoproteins, lipoproteins, nucleosides, nucleotides, oligonucleotides, nucleic acids, sugars, carbohydrates, oligosaccharides, polysaccharides, fatty acids, lipids, hormones, metabolites, cytokines, Chemokines, receptors, neurotransmitters, antigens, allergens, antibodies, substrates, metabolites, cofactors, inhibitors, drugs, pharmaceuticals, nutrients, prions, toxins, poisons, explosives, insecticides, chemical weapons, biohazard agents, radiation Isotopes, vitamins, heterocyclic aromatic compounds, carcinogens, mutagenic factors, anesthetics, amphetamines, barbiturates, hallucinogens, wastes or pollutants, characterized in that it can observe or detect, single molecule observation probe.
상기 준비된 제1 및 제2 올리고 뉴클레오티드를 각각 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나노입자와 1가(monovalent)가 되도록 부착시키는 단계;
상기 단계에서 제조된 제1 올리고 뉴클레오티드가 부착된 1가 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나노입자와 제2 올리고 뉴클레오티드가 부착된 1가 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나노입자를 혼합하여, 나노입자 이합체를 제조하는 단계;를 포함하고,
상기 제1 올리고 뉴클레오티드가 부착된 1가 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나노입자와 제2 올리고 뉴클레오티드가 부착된 1가 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나오입자간의 거리는 1nm 내지 10nm이며,
상기 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나노입자의 직경은 15nm 내지 30nm인 것을 특징으로 하는 나노입자 이합체의 제조방법.
Preparing a first-third oligonucleotide comprising a complementary nucleotide sequence capable of forming Y-type DNA;
Attaching the prepared first and second oligonucleotides to be monovalent with metal nanoparticles capable of phlosmonic coupling, respectively;
By mixing the metal nanoparticles capable of monovalent phlosmonic coupling to which the first oligonucleotide prepared in the above step is attached and the metal nanoparticles capable of monovalent phlosmonic coupling to which the second oligonucleotide is attached, the nanoparticles Including; preparing a dimer;
The distance between the metal nanoparticles capable of monovalent phlosmonic coupling to which the first oligonucleotide is attached and the metal nanoparticles capable of monovalent phosmonic coupling to which the second oligonucleotide is attached is 1 nm to 10 nm,
The method of manufacturing a nanoparticle dimer, characterized in that the diameter of the metal nanoparticles capable of the phlosmonic coupling is 15nm to 30nm.
상기 제조된 나노입자 이합체를 제3 올리고 뉴클레오티드와 혼성화시키는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 나노입자 이합체의 제조방법.
The method of claim 9,
Hybridizing the prepared nanoparticle dimer with a third oligonucleotide; characterized in that it further comprises, the method of producing a nanoparticle dimer.
상기 샘플에서 나노입자 이합체를 탐지하는 단계;를 포함하는, 표적 단일 분자의 관찰 또는 검출 방법.
Exposing the nanoparticle dimer of claim 1 to a sample comprising one or more target single molecules; And
Detecting the nanoparticle dimer in the sample; containing, observation or detection method of the target single molecule.
상기 준비된 제1 및 제2 올리고 뉴클레오티드를 각각 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나노입자와 1가(monovalent)가 되도록 부착시키는 단계;
상기 단계에서 제조된 제1 올리고 뉴클레오티드가 부착된 1가 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나노입자와 제2 올리고 뉴클레오티드가 부착된 1가 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나노입자를 혼합하여, 나노입자 이합체를 제조하는 단계;
제3 올리고 뉴클레오티드가 표적 단일 분자를 인식할 수 있도록 기능화시키는 단계;
상기 단계에서 기능화된 제3 올리고 뉴클레오티드를 하나 이상의 표적 단일 분자를 포함하는 샘플에 노출시키는 단계;
상기 샘플에 상기 나노입자 이합체를 처리하여 제3 올리고 뉴클레오티드와 혼성화시키는 단계; 및
상기 샘플에서 나노입자 이합체를 탐지하는 단계;를 포함하고,
상기 제1 올리고 뉴클레오티드가 부착된 1가 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나노입자와 제2 올리고 뉴클레오티드가 부착된 1가 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나오입자간의 거리는 1nm 내지 10nm이며,
상기 플로즈모닉 커플링이 가능한 금속 나노입자의 직경은 15nm 내지 30nm인 것을 특징으로 하는, 표적 단일 분자의 관찰 또는 검출 방법.
Preparing a first-third oligonucleotide comprising a complementary nucleotide sequence capable of forming Y-type DNA;
Attaching the prepared first and second oligonucleotides to be monovalent with metal nanoparticles capable of phlosmonic coupling, respectively;
By mixing the metal nanoparticles capable of monovalent phlosmonic coupling to which the first oligonucleotide prepared in the above step is attached and the metal nanoparticles capable of monovalent phlosmonic coupling to which the second oligonucleotide is attached, the nanoparticles Preparing a dimer;
Functionalizing the third oligonucleotide to recognize the target single molecule;
Exposing the third oligonucleotide functionalized in said step to a sample comprising at least one target single molecule;
Hybridizing with a third oligonucleotide by treating the sample with the nanoparticle dimer; And
Including; detecting a nanoparticle dimer in the sample,
The distance between the metal nanoparticles capable of monovalent phlosmonic coupling to which the first oligonucleotide is attached and the metal nanoparticles capable of monovalent phosmonic coupling to which the second oligonucleotide is attached is 1 nm to 10 nm,
The method of observing or detecting a single target molecule, characterized in that the diameter of the metal nanoparticles capable of the phlosmonic coupling is 15 nm to 30 nm.
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