KR102208378B1

KR102208378B1 - Pharmaceutical formulation comprising anti-egfr antibody

Info

Publication number: KR102208378B1
Application number: KR1020170104099A
Authority: KR
Inventors: 최용운; 김유훈; 최정섭
Original assignee: 주식회사 녹십자
Priority date: 2017-08-17
Filing date: 2017-08-17
Publication date: 2021-01-28
Also published as: KR20170098206A

Abstract

본 발명은 표피성장인자 수용체(EGFR)에 대한 항체를 포함하는 약학 제제에 관한 것으로, 본 발명에 따른 약학 제제는 가속 조건 하에서도 응집 및 입자 발생이 유발되지 않고 혼탁도가 낮으면서 안정하여 암 등과 같은 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a pharmaceutical formulation containing an antibody against epidermal growth factor receptor (EGFR), and the pharmaceutical formulation according to the present invention does not cause aggregation and particle generation even under accelerated conditions, and is stable with low turbidity. It can be usefully used in the treatment of the same disease.

Description

Pharmaceutical formulation comprising an anti-EGFR antibody TECHNICAL FIELD [Pharmaceutical Formulation COMPRISING ANTI-EGFR ANTIBODY]

본 발명은 항-EGFR 항체를 포함하는 약학 제제에 관한 것이다.The present invention relates to pharmaceutical formulations comprising an anti-EGFR antibody.

항-EGFR 항체는 표피성장인자 수용체(EGFR)와 결합하는 항체로서, 예를 들어 변이부가 마우스 유래이고 불변부가 인간 유래인 키메라 항체인 세툭시맙(cetuximab)(Naramura 등, Cancer lmmunol . Immunotherapy, 1993, 37: 343-349 및 국제특허공개 제 WO 96/40210호), EGFR에 대한 원조 마우스 항체인 MAB 425 등이 있다(Kettleborough 등, Protein Engineering, 1991, 4: 773-783).Wherein -EGFR antibody is human epidermal growth factor receptor as the antibody binding to the (EGFR), for example, mouse-derived mutant add a constant addition of human-derived chimeric antibody, when setuk Thank (cetuximab) (Naramura etc., Cancer lmmunol. Immunotherapy, 1993 , 37: 343-349 and International Patent Publication No. WO 96/40210), MAB 425, which is an original mouse antibody against EGFR (Kettleborough et al., Protein Engineering , 1991, 4: 773-783).

항-EGFR 항체를 이용한 시험관 내 및 생체 내의 다양한 연구 결과에 따르면, 상기 항-EGFR 항체는 암세포 증식을 저해하고, 종양 매개의 혈관신생을 감소시키고, 암세포 세포자멸사(apoptosis)를 유도하며, 방사선 및 전통적인 화학요법의 독성 효과를 증가시킴으로써, 다양한 수준에서의 종양을 억제할 수 있다.According to the results of various studies in vitro and in vivo using anti-EGFR antibodies, the anti-EGFR antibodies inhibit cancer cell proliferation, reduce tumor-mediated angiogenesis, induce cancer cell apoptosis, and radiation and By increasing the toxic effects of traditional chemotherapy, tumors can be suppressed at various levels.

그러나 항-EGFR 항체를 치료 목적을 위해 액상 제제 등으로 제제화하면, 이들 항체의 응집하려는 성질로 인하여 단백질 다량체(multimer)가 형성될 뿐만 아니라, 단백질 분해 반응에 의해 탈아미노 반응이 발생한다는 문제가 있다. 이러한 변성 반응은 예를 들어, 운송(transport)되는 동안 상승된 온도에서 저장하거나 전단 응력(shear stress)에 의해 발생된다. 항-EGFR 항체를 포함하는 액상 제제가 이와 같이 변성 반응이 일어나 응집되면, 생성물이 침전되고 입자를 형성할 수 있는데 이로 인해 색전증 등이 유발될 수 있다. However, when anti-EGFR antibodies are formulated in liquid formulations for therapeutic purposes, not only protein multimers are formed due to the properties of these antibodies to aggregate, but also a problem that a deamino reaction occurs due to proteolysis. have. These denaturation reactions are generated, for example, by storage at elevated temperatures during transport or by shear stress. When the liquid formulation containing the anti-EGFR antibody undergoes a denaturation reaction and aggregates, the product may precipitate and form particles, which may cause embolism and the like.

한편, 상기 액상 제제가 응집이 되는 것을 방지하기 위해서는 상기 액상 제제를 주사 등을 통해 환자에게 투여하기 전에 여과하는 방법이 있는데, 이러한 방법은 추가의 단계를 포함하게 되어 복잡하므로 임상 시험에 매우 부적합하며 여과하고 난 후에도 입자 형성이 지속되어 안정성이 떨어질 수 있다. On the other hand, in order to prevent the agglomeration of the liquid formulation, there is a method of filtering the liquid formulation before administering it to a patient through injection, etc., and this method is complicated because it includes an additional step, and is very unsuitable for clinical trials. Even after filtration, the formation of particles may continue, resulting in poor stability.

따라서, 가혹 보관 조건 하에서도 응집 및 입자 발생이 유발되지 않고 혼탁도가 낮으면서 안정한 항-EGFR 항체를 포함하는 약학 제제의 개발에 대한 요구가 지속되고 있다.Accordingly, there is a continuing need for the development of a pharmaceutical formulation containing an anti-EGFR antibody that is stable with low turbidity without causing aggregation and particle generation even under severe storage conditions.

한편, 기존의 항-EGFR 항체를 포함하는 약학 제제는 상기 약학 제제를 투여할 때 삼투압으로 인한 체내 통증 반응을 절감시키기 위하여 등장화제로 NaCl을 포함시킨다. 하지만, 단백질 성분의 약학제제는 각 제품마다 적합한 성분을 포함하여야 하며, NaCl 역시 적합한지 여부를 확인해야 한다.Meanwhile, conventional pharmaceutical preparations containing anti-EGFR antibodies contain NaCl as an isotonic agent in order to reduce pain in the body due to osmotic pressure when the pharmaceutical preparation is administered. However, the protein-based pharmaceutical preparation should contain an appropriate component for each product, and it should be checked whether NaCl is also suitable.

[특허문헌 1] 국제특허공개 제 WO 96/40210호[Patent Document 1] International Patent Publication No. WO 96/40210

[비특허문헌 1] Naramura 등, Cancer lmmunol . Immunotherapy, 1993, 37: 343-349[Non-Patent Document 1] Naramura et al . , Cancer lmmunol . Immunotherapy , 1993, 37: 343-349

[비특허문헌 2] Kettleborough 등, Protein Engineering, 1991, 4: 773-783[Non-Patent Document 2] Kettleborough et al., Protein Engineering , 1991, 4: 773-783

본 발명의 목적은 우수한 안정성을 갖는 항-EGFR 항체 함유 약학 제제를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a pharmaceutical formulation containing anti-EGFR antibodies having excellent stability.

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은, 염화나트륨(NaCl)을 포함하지 않고, 항-EGFR 항체, 무수아세트산 나트륨 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 약학 제제를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a pharmaceutical formulation containing an anti-EGFR antibody, sodium acetate anhydride, and polysorbate 80 without containing sodium chloride (NaCl).

본 발명에 따른 항-EGFR 항체를 포함하는 약학 제제는, 기존의 대부분의 항-EGFR 항체 함유 약학 제제에서 염화나트륨을 포함시키는 것과는 달리, 상기 염화나트륨을 포함하지 않음으로써 오히려 가속 조건 하에서도 응집 및 입자 발생이 유발되지 않고 혼탁도가 낮으면서 보다 안정한 효과를 나타내므로 암 등의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.The pharmaceutical formulation containing the anti-EGFR antibody according to the present invention, unlike most of the existing anti-EGFR antibody-containing pharmaceutical formulations containing sodium chloride, does not contain the sodium chloride, so that aggregation and particle generation under accelerated conditions It is not caused, turbidity, and more stable effect, so it can be usefully used in the treatment of cancer.

도 1의 A 내지 C는 계면활성제 및 긴장제의 종류를 선별하기 위하여 제조한 시료의 육안 검사, 혼탁도 및 동적 광산란(Dynamic Light Scattering, DLS) 분석 결과를 각각 나타낸 것이다.
도 2의 A 및 B는 응집 및 입자 생성 요소를 선정하기 위하여 제조한 시료의 혼탁도 및 DLS 분석 결과를 각각 나타낸 것이고; 도 3의 A 및 B는 이들 시료의 SE-HPLC 및 IE-HPLC 분석 결과를 각각 나타낸 것이다.
도 4의 A 내지 C는 긴장제의 종류를 스크리닝하기 위하여 제조한 시료의 육안 검사, 혼탁도 및 DLS 분석 결과를 각각 나타낸 것이다.
도 5의 A 내지 C는 폴리소르베이트 80의 농도를 결정하기 위하여 제조한 시료의 육안 검사, 혼탁도 및 DLS 분석 결과를 각각 나타낸 것이다.
도 6의 A 및 B는 본 발명의 제조예 및 비교예에 따른 약학 제제의 고온 보관 시 혼탁도 및 DLS 분석 결과를 각각 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 제조예 1 내지 3(제형 3 내지 5)의 온도별 제형 혼탁도 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 8의 A 및 B는 본 발명의 제조예 및 비교예에 따른 약학 제제를 37℃에서 보관시 비-환원 및 환원 상태별 SDS-PAGE 결과를 각각 나타낸 것이다.
도 9 내지 14는 RSM(Response Surface Methodolgy) 디자인으로 제조한 시료의 37℃에서 2주 보관 조건에 따른 육안 분석 결과, 단백 농도 분석 결과, SE-HPLC, IE-HPLC, IEF(Isoelectric focusing) 및 SDS-PAGE 결과를 각각 나타낸 것이다.
도 15 내지 18은 RSM 디자인으로 제조한 시료의 60℃에서 1일 보관 조건에 따른 육안 분석 결과, 혼탁도 분석 결과, DLS 분석 결과 및 역가 1(binding assay) 결과를 각각 나타낸 것이다.
도 19는 RSM 디자인으로 제조한 시료의 최적화된 플롯(plot) 결과를 나타낸 것이다.1A to 1C show visual inspection, turbidity, and dynamic light scattering (DLS) analysis results of samples prepared to select the types of surfactants and tension agents.
2A and 2B show turbidity and DLS analysis results of samples prepared to select agglomeration and particle generation factors, respectively; 3A and 3B show SE-HPLC and IE-HPLC analysis results of these samples, respectively.
4A to 4C show visual inspection, turbidity and DLS analysis results of samples prepared to screen the types of tonicity agents, respectively.
5A to 5C show visual inspection, turbidity and DLS analysis results of samples prepared to determine the concentration of polysorbate 80, respectively.
6A and 6B show turbidity and DLS analysis results of pharmaceutical formulations according to Preparation Examples and Comparative Examples of the present invention during high temperature storage.
7 is a graph showing changes in formulation turbidity by temperature of Preparation Examples 1 to 3 (formulations 3 to 5) of the present invention.
8A and 8B show SDS-PAGE results for each of non-reduced and reduced states when the pharmaceutical formulations according to Preparation Examples and Comparative Examples of the present invention are stored at 37°C.
9 to 14 are visual analysis results, protein concentration analysis results, SE-HPLC, IE-HPLC, IEF (Isoelectric focusing) and SDS according to storage conditions at 37°C for 2 weeks of samples prepared with RSM (Response Surface Methodolgy) design. -PAGE results are shown respectively.
15 to 18 show visual analysis results, turbidity analysis results, DLS analysis results, and titer 1 (binding assay) results according to storage conditions at 60°C for 1 day of samples prepared by RSM design.
19 shows the results of an optimized plot of a sample prepared by RSM design.

본 발명은 염화나트륨을 포함하지 않고, 항-표피성장인자 수용체(EGFR) 항체, 무수아세트산 나트륨 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 액상의 약학 제제를 제공한다.The present invention provides a liquid pharmaceutical formulation containing no sodium chloride and containing an anti-epidermal growth factor receptor (EGFR) antibody, sodium acetate anhydride, and polysorbate 80.

본 발명의 약학 제제는 사용자의 편의성을 고려하여 액상 제제의 형태가 바람직하다.The pharmaceutical formulation of the present invention is preferably in the form of a liquid formulation in consideration of user convenience.

본 발명의 약학 제제는 염화나트륨을 포함하지 않는 것을 특징으로 한다.The pharmaceutical formulation of the present invention is characterized in that it does not contain sodium chloride.

일반적으로 항-EGFR 항체를 포함하는 약학 제제는 상기 약학 제제를 투여할 때 삼투압으로 인한 체내 통증 반응을 절감시키기 위하여 등장화제로 NaCl을 포함시킨다. 하지만 본 발명에서는 가속 조건 하에서도 응집 및 입자 발생이 유발되지 않고 혼탁도가 낮으면서 보다 안정한 항-EGFR 항체 함유 약학 제제를 제조하기 위하여, 기존의 약학 제제들과는 다르게 염화나트륨을 포함하지 않는다. 본 발명에 사용되는 항-EGFR 항체는 NaCl과의 적합성을 고려하면 NaCl을 첨가하지 않는 것이 응집 및 입자 발생을 최소화하며 보다 안정한 제품을 유통하는 데 도움이 된다.In general, a pharmaceutical formulation containing an anti-EGFR antibody includes NaCl as an isotonic agent in order to reduce a pain response in the body due to osmotic pressure when the pharmaceutical formulation is administered. However, in the present invention, unlike conventional pharmaceutical preparations, sodium chloride is not included in order to prepare a more stable anti-EGFR antibody-containing pharmaceutical preparation with low turbidity without causing aggregation and particle generation even under accelerated conditions. Considering the compatibility with NaCl, the anti-EGFR antibody used in the present invention minimizes aggregation and particle generation when NaCl is not added and helps to distribute more stable products.

본 발명의 일 실시양태에 따르면, 항체 제제의 혼탁도, 응집 및 입자 생성에 영향을 미치는 주요한 요인을 선정한 결과, 혼탁도에 영향을 미치는 주요한 요인은 염화나트륨, 염화나트륨, 완충제의 농도 및 pH인 것으로 확인되었고(도 2의 A), DLS 분석을 통해 확인된 단량체 강도의 감소에 영향을 미치는 주된 요인은 pH와 염화나트륨인 것으로 확인되었다(도 2의 B). 또한, SE-HPLC 분석을 통해 확인된 메인 피크 감소에 영향을 미치는 주된 요인은 pH 및 염화나트륨이었으며(도 3의 A), IE-HPLC 분석을 통해 확인된 메인 피크 감소에 영향을 미치는 주된 요인은 pH 및 완충제의 농도인 것으로 확인되었다(도 3의 B). According to an embodiment of the present invention, as a result of selecting major factors that affect turbidity, aggregation and particle formation of the antibody preparation, it was confirmed that the main factors affecting the turbidity were sodium chloride, sodium chloride, the concentration and pH of the buffer. (Fig. 2A), it was confirmed that the main factors affecting the decrease in the monomer strength confirmed through DLS analysis were pH and sodium chloride (Fig. 2B). In addition, the main factors influencing the main peak reduction identified through SE-HPLC analysis were pH and sodium chloride (Fig. 3A), and the main factors affecting the main peak reduction identified through IE-HPLC analysis were pH. And the concentration of the buffering agent (Fig. 3B).

따라서, 상기 결과를 토대로 항체 제제에 있어 혼탁도를 감소시키고 응집 및 입자 생성을 억제하기 위해서는 염화나트륨을 포함하지 않는 것이 바람직하다. Therefore, in order to reduce turbidity and suppress aggregation and particle generation in the antibody preparation based on the above results, it is preferable not to include sodium chloride.

본 발명의 약학 제제는 항-EGFR 항체를 포함한다.The pharmaceutical formulation of the present invention comprises an anti-EGFR antibody.

상기 항-EGFR 항체는 1 내지 16 mg/ml, 바람직하게는 2 내지 10 mg/ml의 농도로 포함될 수 있으며, 예를 들어 10 mg/ml로 포함되는 것이 바람직하다. The anti-EGFR antibody may be included in a concentration of 1 to 16 mg/ml, preferably 2 to 10 mg/ml, and preferably, for example, 10 mg/ml.

상기 항-EGFR 항체는 공지되거나 시판중인 일반적인 항-EGFR 항체를 사용할 수 있으며, 예를 들어 미국 특허 제6,217,866호 또는 대한민국 등록특허 제1108642호에 기재된 항-EGFR 항체를 사용할 수 있다.As the anti-EGFR antibody, known or commercially available general anti-EGFR antibodies may be used, for example, anti-EGFR antibodies described in US Pat. No. 6,217,866 or Korean Patent No. 1108642 may be used.

본 발명의 약학 제제는 완충제로서, 무수아세트산 나트륨을 포함한다.The pharmaceutical formulation of the present invention contains sodium acetate anhydride as a buffering agent.

본 발명의 일 실시양태에 따르면, 혼탁도, 응집 및 입자 생성에 영향을 미치는 주요한 요인 중 하나는 완충제의 농도 및 pH이다. 따라서, 본 발명의 약학 제제에 포함되는 완충제의 종류, 이의 농도 및 pH는 중요한 요소이다.According to one embodiment of the present invention, one of the major factors affecting turbidity, aggregation and particle formation is the concentration and pH of the buffer. Therefore, the kind of buffering agent contained in the pharmaceutical formulation of the present invention, its concentration and pH are important factors.

상기 무수아세트산 나트륨은 본 발명의 약학 제제의 pH를 유지하기 위해 사용되며, 외부 변화로 인한 pH 변동을 최소화하는 역할을 한다. The sodium acetate anhydride is used to maintain the pH of the pharmaceutical formulation of the present invention, and serves to minimize pH fluctuations due to external changes.

상기 무수아세트산 나트륨은, 인산나트륨, 글루타메이트, 히스티딘 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 완충제로 대체될 수도 있으나, 약학 제제의 혼탁도를 감소시키고 응집 및 입자 생성을 억제시키기 위해서는 적절한 pH 범위가 선정되어야 한다. 본 발명에 따르면 pH 5 내지 6 부근에서는 완충제로 무수아세트산 나트륨을 사용하는 것이 보다 바람직하다. The sodium acetate anhydride may be replaced with a buffer selected from the group consisting of sodium phosphate, glutamate, histidine, and combinations thereof, but an appropriate pH range should be selected in order to reduce the turbidity of the pharmaceutical preparation and suppress aggregation and particle formation. do. According to the present invention, it is more preferable to use sodium acetate anhydride as a buffer in the vicinity of pH 5 to 6.

상기 무수아세트산 나트륨은 10 내지 200 mM, 바람직하게는 10 내지 100 mM의 농도로 포함될 수 있으며, 예를 들어 50 mM의 농도로 포함되는 것이 바람직하다. The sodium acetate anhydride may be included in a concentration of 10 to 200 mM, preferably 10 to 100 mM, and for example, it is preferably included in a concentration of 50 mM.

이에 따라, 본 발명의 약학 제제의 pH는 5 내지 7, 바람직하게는 5.3 내지 6.1일 수 있다.Accordingly, the pH of the pharmaceutical formulation of the present invention may be 5 to 7, preferably 5.3 to 6.1.

본 발명의 약학 제제는 계면활성제로서 폴리소르베이트 80을 포함한다.The pharmaceutical formulation of the present invention contains polysorbate 80 as a surfactant.

일반적으로 항체를 포함하는 용액은 공기-물 계면에서 높은 표면장력을 갖는다. 이러한 표면장력을 감소시키기 위해, 항체는 공기-물 계면에서 응집하려는 경향이 있다. 계면활성제는 공기-물 계면에서 항체 응집을 최소화함으로써 용액 중의 항체의 생물학적 활성을 유지하도록 돕는다. In general, solutions containing antibodies have a high surface tension at the air-water interface. To reduce this surface tension, antibodies tend to aggregate at the air-water interface. Surfactants help maintain the biological activity of the antibody in solution by minimizing antibody aggregation at the air-water interface.

본 발명의 일 실시양태에 따르면, 계면활성제로 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20 또는 폴록사머 188을 포함하는 항체 제제의 기계적 자극 시험을 수행한 결과, 계면활성제로 폴리소르베이트 80을 사용하는 것이 항체 제제의 혼탁도를 감소시키고 응집 및 입자 생성을 저해시키는 효과를 달성하기 위해 보다 바람직함을 확인할 수 있었다(실시예 1 참고). According to an embodiment of the present invention, as a result of performing a mechanical stimulation test of an antibody formulation comprising polysorbate 80, polysorbate 20 or poloxamer 188 as a surfactant, it is possible to use polysorbate 80 as a surfactant. It was confirmed that it is more preferable to achieve the effect of reducing the turbidity of the antibody preparation and inhibiting aggregation and particle generation (see Example 1).

또한, 본 발명의 다른 실시양태에 따르면, 다양한 농도의 폴리소르베이트 80을 포함하는 항체 제제에 있어, 0.05 내지 2.0 mg/ml의 농도로 포함된 항체 제제가 혼탁도 저해 효과가 있었으며 응집 생성을 저해하는 효과를 확인할 수 있었으며, 특히 0.2 mg/ml의 농도로 포함되는 것이 응집 생성 정도가 가장 낮게 나타났다(실시예 4 참고).In addition, according to another embodiment of the present invention, in the antibody preparation containing polysorbate 80 at various concentrations, the antibody preparation contained in a concentration of 0.05 to 2.0 mg/ml had an effect of inhibiting turbidity and inhibiting the formation of aggregation. It was possible to confirm the effect, and in particular, the concentration of 0.2 mg/ml showed the lowest degree of aggregation (refer to Example 4).

따라서, 상기 폴리소르베이트 80의 농도는 0.05 내지 2.0 mg/ml, 바람직하게는 0.1 내지 1.0 mg/ml일 수 있으며, 예를 들어 0.2 mg/ml인 것이 바람직하다. Accordingly, the concentration of the polysorbate 80 may be 0.05 to 2.0 mg/ml, preferably 0.1 to 1.0 mg/ml, and is preferably 0.2 mg/ml, for example.

본 발명의 약학 제제는 긴장제를 더 포함할 수 있다.The pharmaceutical formulation of the present invention may further include a tonicity agent.

본 발명에서 긴장제는 약학 제제의 응집 및 분해 방지 역할을 한다. In the present invention, the tonicity agent serves to prevent aggregation and decomposition of the pharmaceutical formulation.

특히 본 발명에서는 긴장제로 만니톨, 글라이신 또는 이의 조합을 사용하는 것이 항체 제제의 혼탁도를 감소, 응집 및 입자 생성을 저해 면에서 보다 바람직하다. 본 발명의 일 실시양태에 따르면, 긴장제로서 만니톨 또는 글라이신을 포함하는 항체 제제가 혼탁도 증가를 크게 억제하는 것을 확인할 수 있다(실시예 3 참고).In particular, in the present invention, the use of mannitol, glycine, or a combination thereof as a tonicity agent is more preferable in terms of reducing turbidity of the antibody preparation and inhibiting aggregation and particle formation. According to an embodiment of the present invention, it can be confirmed that an antibody preparation containing mannitol or glycine as a tonicity agent significantly inhibits an increase in turbidity (see Example 3).

상기 긴장제가 만니톨인 경우, 1 내지 20%(w/v), 바람직하게는 2 내지 10%(w/v)의 농도, 예를 들어 5%(w/v)로 포함될 수 있다.When the tonicity is mannitol, it may be included in a concentration of 1 to 20% (w/v), preferably 2 to 10% (w/v), for example, 5% (w/v).

상기 긴장제가 글라이신인 경우 1 내지 10%(w/v), 바람직하게는 2 내지 5%(w/v)의 농도, 예를 들어 3%(w/v)로 포함될 수 있다.When the tonicity is glycine, it may be included in a concentration of 1 to 10% (w/v), preferably 2 to 5% (w/v), for example 3% (w/v).

상기 긴장제가 만니톨 및 글라이신의 조합인 경우, 상기 긴장제는 5:1 내지 1:5의 중량비로 만니톨 및 글라이신을 혼합한 혼합물일 수 있으며, 1 내지 10%(w/v), 바람직하게는 2 내지 5%(w/v)의 농도로 포함될 수 있다. When the tonicity is a combination of mannitol and glycine, the tonicity may be a mixture of mannitol and glycine in a weight ratio of 5:1 to 1:5, and 1 to 10% (w/v), preferably 2 To 5% (w/v).

본 발명의 일 실시양태에 따르면, 염화나트륨을 포함하지 않고, 10 mg/ml의 항-EGFR 항체, 50 mM의 무수아세트산 나트륨, 및 0.2 mg/ml의 폴리소르베이트 80으로 이루어진 약학 제제를 제공한다. According to an embodiment of the present invention, there is provided a pharmaceutical formulation containing no sodium chloride and consisting of 10 mg/ml of anti-EGFR antibody, 50 mM of sodium acetate anhydride, and 0.2 mg/ml of polysorbate 80.

본 발명의 다른 실시양태에 따르면, 염화나트륨을 포함하지 않고, 10 mg/ml의 항-EGFR 항체, 50 mM의 무수아세트산 나트륨, 0.2 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 및 5%(w/v) 만니톨로 이루어진 약학 제제를 제공한다. According to another embodiment of the invention, without sodium chloride, 10 mg/ml of anti-EGFR antibody, 50 mM sodium acetate anhydride, 0.2 mg/ml polysorbate 80, and 5% (w/v) It provides a pharmaceutical formulation consisting of mannitol.

본 발명의 또 다른 실시양태에 따르면, 염화나트륨을 포함하지 않고, 10 mg/ml의 항-EGFR 항체, 50 mM의 무수아세트산 나트륨, 0.2 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 및 3%(w/v) 글라이신으로 이루어진 약학 제제를 제공한다. According to another embodiment of the invention, without sodium chloride, 10 mg/ml of anti-EGFR antibody, 50 mM sodium acetate anhydride, 0.2 mg/ml polysorbate 80, and 3% (w/v ) It provides a pharmaceutical formulation consisting of glycine.

상기 구성으로 이루어진 본 발명에 따른 약학 제제는 가혹 조건 하에서 측정된 안정성 분석 결과에서, 염화나트륨을 포함하는 약학 제제에 비해 무색 투명한 상태로 유지되고 혼탁도 증가율이 낮게 나타났으며, 장기 보관 시에도 응집이 발생되지 않아 순도 감소량 또한 낮게 나타났다. 이를 통해 항-EGFR 항체를 포함하는 약학 제제에 있어 염화나트륨을 포함하지 않는 것이 우수한 안정성을 나타냄을 알 수 있었다(시험예 참고). As a result of stability analysis measured under severe conditions, the pharmaceutical formulation according to the present invention having the above configuration maintained a colorless and transparent state and exhibited a lower increase in turbidity compared to the pharmaceutical formulation containing sodium chloride, and aggregation was observed even during long-term storage. As it did not occur, the amount of decrease in purity was also low. Through this, it was found that in the pharmaceutical formulation containing the anti-EGFR antibody, it was found that not containing sodium chloride showed excellent stability (see Test Example).

한편, 본 발명에 따른 약학 제제는, 필요에 따라 희석제, 담체, 안정화제, 산화방지제, 보존제 등의 약학적으로 허용가능한 첨가제를 추가로 포함할 수도 있다. Meanwhile, the pharmaceutical formulation according to the present invention may further include pharmaceutically acceptable additives such as diluents, carriers, stabilizers, antioxidants, and preservatives, if necessary.

상기 희석제로는 식염수, 글루코스, 링거(Ringer) 및 수성 완충 용액을 들 수 있으며, 상기 담체로는 완충된 식염수 용액, 에탄올, 폴리올(예를 들면 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 등을 들 수 있으며, 상기 안정화제로는 아미노산, 사이클로덱스트린, 폴리에틸렌글리콜, 알부민(예를 들면 인간 혈청 알부민(HSA) 및 소 혈청 알부민(BSA)), 염(예를 들면 염화나트륨, 염화마그네슘 및 염화칼슘), 킬레이터(예를 들면 EDTA) 등을 들 수 있으며, 상기 산화방지제로는 아스코르브산, 글루타티온 등을 들 수 있으며, 상기 보존제로는 페놀, m-크레졸, 메틸- 또는 프로필파라벤, 클로로부탄올, 벤즈알코늄클로라이드 등을 들 수 있다.Examples of the diluent include saline, glucose, Ringer, and an aqueous buffer solution, and the carrier includes a buffered saline solution, ethanol, polyol (eg, glycerol, propylene glycol, liquid polyethylene glycol, etc.). The stabilizer may include amino acids, cyclodextrin, polyethylene glycol, albumin (for example, human serum albumin (HSA) and bovine serum albumin (BSA)), salts (for example, sodium chloride, magnesium chloride, and calcium chloride), chelators. (For example, EDTA) and the like, and the antioxidants include ascorbic acid and glutathione, and the preservatives include phenol, m-cresol, methyl- or propylparaben, chlorobutanol, benzalkonium chloride And the like.

본 발명에 따른 약학 제제는, 당해 분야에 공지된 다양한 방식, 예를 들면 경구 또는 비경구 투여에 의해 투여될 수 있으며, 상기 비경구 투여 방식으로는 정맥내, 근육내, 동맥내, 막내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 기관지경, 피하, 피하층내, 관절내, 피막하, 지주막하강, 척추강내, 경막외 및 흉골 내 주사 및 주입을 포함하되 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.The pharmaceutical formulation according to the present invention may be administered by various methods known in the art, for example, oral or parenteral administration, and the parenteral administration method includes intravenous, intramuscular, intraarterial, intramembrane, and encapsulation. Intraorbital, intracardiac, intradermal, intraperitoneal, bronchoscope, subcutaneous, subcutaneous, intraarticular, subcapsular, subarachnoid, intrathecal, epidural and intrasternal injections and injections, but the present invention is limited thereto. It is not.

본 발명에 따른 약학 제제는, 통상적인 1일 투여량은 0.01 내지 10 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 0.01 내지 1.0 ㎎/㎏ 체중의 범위이며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 약학 제제의 실제 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.In the pharmaceutical formulation according to the present invention, a typical daily dosage is in the range of 0.01 to 10 mg/kg body weight, preferably 0.01 to 1.0 mg/kg body weight, and may be administered once or in several times. However, the actual dosage of the pharmaceutical preparation should be determined in light of various related factors such as the route of administration, the patient's age, sex and weight, and the severity of the disease, and therefore, the dosage limits the scope of the present invention in any way. Is not.

[실시예][Example]

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail by the following examples. However, the following examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited thereto.

하기 실시예에서 사용된 시약의 입수처는 다음과 같다. The source of the reagents used in the following examples is as follows.

시약 및 시액Reagents and solutions

무수 아세트산 나트륨(Scharlau, Cat. No. SO0032)Sodium Acetate Anhydrous (Scharlau, Cat.No. SO0032)

인산수소나트륨(Sodium phosphate monobaic; Scharlau, Cat. No. SO0333)Sodium phosphate monobaic (Scharlau, Cat.No. SO0333)

인산이수소나트륨(Sodium phosphate dibasic; JT Baker, Cat. No. 3817-05)Sodium phosphate dibasic (JT Baker, Cat.No. 3817-05)

폴리소르베이트 20 (Tween 20, Merck, Cat. No. 8.17072.1000)Polysorbate 20 (Tween 20, Merck, Cat.No. 8.17072.1000)

폴리소르베이트 80 (Tween 80, Fluka, Cat. No. 59924)Polysorbate 80 (Tween 80, Fluka, Cat.No. 59924)

폴록사머 188 (Pluronic F68, Sigma, Cat. No. P-1300)Poloxamer 188 (Pluronic F68, Sigma, Cat.No.P-1300)

염화 나트륨 (Scharlau, Cat. No. SO0225)Sodium chloride (Scharlau, Cat.No.SO0225)

만니톨 (JT Baker, Cat. No. 238506)Mannitol (JT Baker, Cat.No. 238506)

소르비톨 (Sigma, Cat. No. S7547)Sorbitol (Sigma, Cat.No. S7547)

글라이신 (Sigma, Cat. No. 15527)Glycine (Sigma, Cat.No. 15527)

트레할로스 디하이드레이트 (Sigma, Cat. No. T5251)Trehalose Dihydrate (Sigma, Cat.No. T5251)

아르기닌 염산염(Arg-HCl, Scharlau, Cat. No. AR0125)Arginine Hydrochloride (Arg-HCl, Scharlau, Cat.No. AR0125)

하기 실시예에서 제조한 시료는 각 디자인(design) 조건에 맞추어 혼합을 통해 조제한 후, 0.22 μm 필터로 여과하였다. 이어, 클린 벤치(clean bench)에서 3 ml 글래스 바이알(glass vial)에 소분한 후, 고무 마개로 스토퍼링(stoppering)하고 검체를 보관한 후 실험에 사용하였다.Samples prepared in the following examples were prepared by mixing according to each design condition, and then filtered through a 0.22 μm filter. Then, after subdividing into 3 ml glass vials on a clean bench, stoppering was performed with a rubber stopper, and the specimen was stored and used for the experiment.

또한, 본 발명에서 수행된 시험 방법은 다음과 같다.In addition, the test method performed in the present invention is as follows.

(1) 기계적 자극(Mechanical stress): 볼텍스 혼합기(Vortex-Genie 2, Scientific Industries)에 바이알을 고정한 후, 3000 rpm으로 상온에서 4시간 동안 볼텍스하였다.(1) Mechanical stress: After fixing the vial in a vortex mixer (Vortex-Genie 2, Scientific Industries), it was vortexed for 4 hours at room temperature at 3000 rpm.

(2) 열적 자극: 바이알을 37℃ 항온 항습기(LHD-2250C, Labtech) 또는 60℃ 항온기(DX7, Hanyoung)에 넣었다.(2) Thermal stimulation: The vial was placed in a 37°C thermo-hygrostat (LHD-2250C, Labtech) or a 60°C thermostat (DX7, Hanyoung).

(3) 육안 분석(Appearance): 응집물이 보이는지 여부를 육안(naked eye)으로 관찰하였다.(3) Visual analysis (Appearance): It was observed with the naked eye (naked eye) whether or not aggregates were visible.

(4) 혼탁도(Turbidity): 각각의 검액을 희석 없이 1 mL 준비한 후, UV 분광광도계 (LibraS32, Biochem)를 이용하여 350 nm에서 흡광도를 측정한 후 혼탁도를 분석하였다.(4) Turbidity: After 1 mL of each sample solution was prepared without dilution, absorbance was measured at 350 nm using a UV spectrophotometer (LibraS32, Biochem), and turbidity was analyzed.

(5) 동적 광산란(Dynamic Light Scattering, DLS): 각각의 검액을 희석 없이 최소 1 mL 준비하여 DLS 기기(Zetasizer Nano ZS90, Malvern Instrument)를 이용하여 검액의 사이즈 분포 차트(size distribution chart) 결과를 확인하였다. (5) Dynamic Light Scattering (DLS): Prepare at least 1 mL of each sample solution without dilution and check the size distribution chart result of the sample solution using a DLS instrument (Zetasizer Nano ZS90, Malvern Instrument). I did.

(6) SDS-PAGE: 전기영동장치를 이용하여 통상적인 SDS-PAGE 분석 방법에 따라 수행하였다.(6) SDS-PAGE: It was performed according to a conventional SDS-PAGE analysis method using an electrophoresis device.

(7) IEF(Isoelectric focusing): 전기영동장치를 이용하여 통상적인 IEF 분석 방법에 따라 수행하였다.(7) IEF (Isoelectric focusing): It was performed according to a conventional IEF analysis method using an electrophoretic device.

(8) UV 단백 정량: 분광 광도계를 이용하여 280nm에서 흡광도를 측정하고 단백 정량을 분석하였다.(8) UV protein quantification: Using a spectrophotometer, absorbance was measured at 280 nm and protein quantification was analyzed.

(9) SE-HPLC: SE-HPLC 분석 컬럼(TSKgel G3000SW_XL,Cat. No. 08541, Tosoh corporation)을 사용하여 분석하였다.(9) SE-HPLC: Analysis was performed using a SE-HPLC analysis column (TSKgel G3000SW _XL , Cat. No. 08541, Tosoh Corporation).

(10) IE-HPLC: IE-HPLC 분석 컬럼(Propac WCX-10 analytical, Cat. No. 054993, Dionex)을 사용하여 분석하였다.(10) IE-HPLC: Analysis was performed using an IE-HPLC analytical column (Propac WCX-10 analytical, Cat. No. 054993, Dionex).

(11) 역가 1 (Binding assay): ELISA 리더(Spectra Max 190, Molecular Devices)를 이용하여 역가 1 분석에 사용하였다.(11) Titer 1 (Binding assay): An ELISA reader (Spectra Max 190, Molecular Devices) was used for titer 1 analysis.

(12) 역가 2 (Cell based assay): 96-웰 플레이트에 세포 카운팅(cell counting)을 통해 계산된 동일한 세포를 분주하였다. 24시간 배양 후 배양액을 제거한 다음, 검체 희석액을 웰당 100 μL 넣고, 희석된 표준품 및 희석된 검체를 웰당 100 μL 넣은 후 5일간 배양하였다. 각 웰에 MTS 시약을 40 μL 씩 넣은 후 호일에 싸서 37℃에서 3시간 반응시켰다. ELISA 리더(Spectra Max 190, Molecular Devices)를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.(12) Titer 2 (Cell based assay): The same cells calculated through cell counting were dispensed into a 96-well plate. After culturing for 24 hours, the culture solution was removed, and 100 μL of the sample dilution solution was added per well, and 100 μL of the diluted standard and diluted sample were added per well, followed by incubation for 5 days. After adding 40 μL of MTS reagent to each well, it was wrapped in foil and reacted at 37°C for 3 hours. Absorbance was measured at 490 nm using an ELISA reader (Spectra Max 190, Molecular Devices).

<최적화 항체 제제를 제조하기 위한 스크리닝><Screening to prepare an optimized antibody preparation>

실시예 1: 계면활성제 및 긴장제의 종류 선별Example 1: Type selection of surfactants and tension agents

응집 및 입자 생성을 저해하는 계면활성제 및 긴장제의 종류를 선별하기 위하여, 하기 표 1에 기재된 성분 및 함량을 혼합하여 시료를 제조하였다. In order to select the types of surfactants and tension agents that inhibit aggregation and particle generation, a sample was prepared by mixing the components and contents shown in Table 1 below.

상기에서 제조한 시료를 대상으로 기계적 자극 시험을 수행하였고 육안 검사, 혼탁도 및 DLS 분석을 수행한 결과를 각각 도 1의 A 내지 C에 나타내었다. Mechanical stimulation tests were performed on the samples prepared above, and results of visual inspection, turbidity, and DLS analysis are shown in FIGS. 1A to 1C, respectively.

도 1에서 보는 바와 같이, 육안 혼탁도는 #1, #5, #8 >#7, #9 > #6> #2, #3, #4 순으로 나타났다. 또한 혼탁도를 측정한 결과에서는 계면활성제를 첨가한 시료는 혼탁도 증가가 없었으며, 긴장제를 첨가한 경우 첨가하기 전과 비교하여 Arg-HCl을 첨가한 #6 시료는 46%가 감소하고, 트레할로스를 첨가한 #9는 12%가 감소하였다. DLS 분석 결과에서는 계면활성제가 응집 생성을 저해하고, 긴장제가 응집 강도(aggregation intensity)가 증가시킴을 알 수 있었다. As shown in FIG. 1, the visual turbidity was in the order of #1, #5, #8 >#7, #9> #6> #2, #3, and #4. In addition, as a result of measuring turbidity, there was no increase in turbidity in the sample to which surfactant was added. In the case of adding a tonicity agent, sample #6 with Arg-HCl decreased by 46% compared to before addition, and trehalose #9, which was added, decreased by 12%. From the DLS analysis results, it was found that the surfactant inhibited the formation of aggregation, and the tension agent increased the aggregation intensity.

따라서 계면 활성제의 경우 혼탁도, 응집 생성 및 경쟁 약물 제형 고려 시 폴리소프베이트 20(PS20) 또는 폴록사머 188(P-188)에 비해 폴리소르베이트 80(PS80)이 바람직하고, 긴장제의 경우 혼탁도 결과 고려 시 Arg-HCl가 바람직하였다.Therefore, in the case of surfactants, polysorbate 80 (PS80) is preferable compared to polysorbate 20 (PS20) or poloxamer 188 (P-188) when considering turbidity, aggregation generation, and competing drug formulations. In consideration of the results, Arg-HCl was preferred.

실시예 2: 응집 및 입자 생성 요소 선정Example 2: Agglomeration and Particle Generation Factor Selection

항-EGFR 항체(GC1118A, (재)목암생명공학연구소)를 포함하는 약학 제제에서 응집 및 입자 생성에 영향을 미치는 주요한 요인을 확인하기 위하여, 하기 표 2에 기재된 성분 및 함량을 혼합하여 시료를 각각 제조하였다. In order to identify the main factors affecting aggregation and particle generation in a pharmaceutical formulation containing an anti-EGFR antibody (GC1118A, Mok-Am Biotechnology Research Institute), samples were prepared by mixing the components and contents shown in Table 2 below. Was prepared.

상기에서 제조한 시료를 대상으로 열적 자극 시험을 수행하였다. 열적 자극시험(37℃에서 2주 동안 보관) 후 혼탁도를 육안으로 분석하고, 혼탁도 측정, DLS, SE-HPLC 및 IE-HPLC 분석을 통해 응집 및 입자 생성에 영향을 미치는 가장 주요한 요인 3가지를 선정하였다. A thermal stimulation test was performed on the sample prepared above. After a thermal stimulation test (stored at 37℃ for 2 weeks), the turbidity is visually analyzed, and the three most important factors affecting aggregation and particle formation through turbidity measurement, DLS, SE-HPLC and IE-HPLC analysis Was selected.

주요한 요인 선정 방법은 미니탭 소프트웨어(minitab software)를 이용하여 파레토 차트(pareto chart, alpha=0.15)를 통해 결과를 분석하는 방식으로 수행되었으며, 그 결과를 도 2의 A 및 B, 및 3의 A 및 B에 나타내었다.The main factor selection method was performed by analyzing the results through a Pareto chart (alpha=0.15) using minitab software, and the results were analyzed in A and B in FIGS. 2 and A and 3 in FIG. It is shown in B.

도 2에서 보는 바와 같이, 혼탁도에 미치는 주요한 요소는 NaCl, 버퍼 농도 및 pH이었으며(도 2의 A), DLS 분석 결과에서는 단량체 강도(Monomer intensity)의 감소에 영향을 미치는 주된 요인은 pH와 NaCl인 것으로 나타났다(도 2의 B).As shown in Fig. 2, the main factors affecting the turbidity were NaCl, buffer concentration, and pH (Fig. 2A), and in the DLS analysis results, the main factors affecting the decrease in monomer intensity were pH and NaCl. It was found to be (Fig. 2B).

또한, 도 3에서 보는 바와 같이, SE-HPLC 분석결과에서는 메인 피크 감소에 영향을 미치는 주요 요인은 pH 및 NaCl인 것으로 나타났으며(도 3의 A), IE-HPLC 분석결과에서는 메인 피크 감소에 영향을 미치는 주요 요인이 pH 및 버퍼 농도인 것으로 나타났다(도 3의 B).In addition, as shown in FIG. 3, in the SE-HPLC analysis result, it was found that the main factors affecting the main peak reduction were pH and NaCl (Fig. 3A), and in the IE-HPLC analysis result, the main peak reduction was It was found that the main factors influencing are pH and buffer concentration (FIG. 3B).

상기 결과를 통해 응집 및 입자 생성에 영향을 미치는 주요한 요인으로서 pH, NaCl 및 버퍼 농도를 선정하였으며, 추후 실험에서는 미니탭(Minitab) 프로그램으로 RSM (Response Surface Methodology) 디자인을 수행하였다.Through the above results, pH, NaCl, and buffer concentration were selected as major factors affecting aggregation and particle generation, and in a later experiment, RSM (Response Surface Methodology) design was performed with the Minitab program.

실시예 3: RSM 디자인을 통한 약학 제제의 조건 선정Example 3: Selection of conditions for pharmaceutical formulations through RSM design

상기 실시예 2에서 선정된 응집 및 입자 생성에 영향을 미치는 주요한 요인들을 대상으로 열적 자극에 안정한 액상 제제를 구현할 수 있는 최적화된 조건을 스크리닝하기 위하여, 미니탭 프로그램으로 RSM 디자인(CCI, 5 수준)하여 pH(4-8), NaCl(0-300 mM) 및 버퍼 농도(10-100mM)에 따른 다양한 시료를 제조하였다. In order to screen for the optimal conditions for implementing a liquid formulation that is stable against thermal stimulation, targeting the major factors that affect the aggregation and particle generation selected in Example 2, RSM design (CCI, 5 level) with Minitab program Various samples were prepared according to pH (4-8), NaCl (0-300 mM) and buffer concentration (10-100 mM).

제조한 시료의 구체적인 성분은 하기 표 3에 기재된 바와 같다. Specific components of the prepared sample are as described in Table 3 below.

먼저, 상기 표 3에 개시된 성분 및 함량을 갖는 각각의 시료를 제조하였다. 이어 제조한 시료를 열적 자극 시험, (i) 37℃에서 2주 동안 보관 조건; 및 (ii) 60℃에서 1일 동안 보관 조건에 각각 적용하였다. First, each sample having the components and contents disclosed in Table 3 was prepared. Then, the prepared sample was subjected to a thermal stimulation test, (i) storage conditions at 37°C for 2 weeks; And (ii) storage conditions at 60° C. for 1 day, respectively.

37℃에서 2주 동안 보관 조건에 따른 각 시료별 육안 분석 결과, 단백 농도 분석 결과, SE-HPLC, IE-HPLC, IEF 및 SDS-PAGE 결과를 도 9 내지 14에 나타내었다. 육안 분석 결과에서는 #9 시료만 불투명, 이외의 모든 시료는 무색 투명한 것으로 나타났으며, IEF 결과에서 #9 시료가 입자 생성으로 인해 밴드 끌림 현상이 발생하는 것으로 확인되었다. The results of visual analysis for each sample, protein concentration analysis, SE-HPLC, IE-HPLC, IEF and SDS-PAGE results according to storage conditions at 37° C. for 2 weeks are shown in FIGS. 9 to 14. In the results of visual analysis, only sample #9 was opaque, and all other samples were colorless and transparent, and in IEF results, sample #9 was found to have a band drag phenomenon due to particle generation.

또한, 60℃에서 1일 동안 보관 조건에 따른 각 시료별 육안 분석 결과, 혼탁도 분석 결과, DLS 분석 결과 및 역가(binding assay) 1 결과를 도 15 내지 18에 나타내었다. 육안 분석 결과에서는 #9>#5>#7>#1 및 #3순으로 불투명한 것으로 나타났고(이외의 모든 시료는 무색 투명), 역가 1 결과에서는 #15 검체가 대조군 대비 EC₅₀%가 114 ~ 121%인 것으로 확인되었다. In addition, the results of visual analysis for each sample, turbidity analysis results, DLS analysis results, and binding assay 1 results according to storage conditions at 60° C. for 1 day are shown in FIGS. 15 to 18. In the results of visual analysis, it was found to be opaque in the order of #9>#5>#7>#1 and #3 (all other samples were colorless and transparent), and in the titer 1 result, #15 sample had an EC ₅₀ % of 114 It was found to be ~ 121%.

또한, 상기 결과들을 토대로 최적화된 플롯(plot) 결과를 도 19 및 하기 표 4에 나타내었다.In addition, plot results optimized based on the above results are shown in FIG. 19 and Table 4 below.

상기 표 4의 결과를 토대로 통계적으로 분석하여 제안된 바람직한 약학 제제의 조건은 하기 표 5와 같다.Based on the results of Table 4, the conditions of the proposed pharmaceutical formulations are statistically analyzed and are shown in Table 5 below.

단백농도Protein concentration 완충액Buffer pHpH 긴장제Tension agent 최적화 플롯 기준Based on optimization plot 10 mg/mL 10 mg/mL 10-94 mM 아세트산나트륨10-94 mM sodium acetate 5.945.94 w/o NaClw/o NaCl 등고선 기준Contour criteria 10 mg/mL 10 mg/mL 10-100 mM 아세트산나트륨10-100 mM sodium acetate 5.3-6.15.3-6.1 0 mM NaCl0 mM NaCl

구체적으로 상기 열적 자극 조건에서 응집, 입자 생성 및 전위 변이를 최소화하며 역가를 만족시키는 조건은 단백(항-EGFR 항체) 농도가 10 mg/mL 일 때, 10 내지 100 mM 아세트산나트륨, pH 5.3 내지 6.1 및 0 mM NaCl을 포함하는 제제임을 확인되었다(등고선 기준). 또한, 상기 조건에서의 최적 안정성 조건은 pH 5.94, 50mM 아세트산나트륨 및 w/o NaCl(즉 0 mM NaCl)을 포함하는 제제임을 알 수 있었다(최적화 플롯 기준). Specifically, under the thermal stimulation conditions, aggregation, particle generation, and potential variation are minimized and the titer is satisfied. When the protein (anti-EGFR antibody) concentration is 10 mg/mL, 10 to 100 mM sodium acetate, pH 5.3 to 6.1 And 0 mM NaCl (based on contour lines). In addition, it was found that the optimum stability condition under the above conditions was a formulation containing pH 5.94, 50 mM sodium acetate and w/o NaCl (ie, 0 mM NaCl) (based on an optimization plot).

실시예 3: 긴장제의 종류 스크리닝Example 3: Screening of types of tension agents

본 발명에 따른 약학 제제에서 사용할 긴장제의 종류를 선별하기 위하여, 하기 표 6에 기재된 성분 및 함량을 이용하여 시료를 제조하였다. 이어, 상기 시료들을 60℃에서 1일 동안 보관한 후 육안 검사, 혼탁도 및 DLS 분석을 수행한 결과를 각각 도 4의 A 내지 C에 나타내었다. In order to select the type of tonicity agent to be used in the pharmaceutical formulation according to the present invention, a sample was prepared using the ingredients and contents shown in Table 6 below. Subsequently, after storing the samples at 60° C. for 1 day, the results of visual inspection, turbidity and DLS analysis are shown in FIGS. 4A to 4C, respectively.

도 4에서 보는 바와 같이, 육안 시험 결과 모든 시료가 무색 투명한 것으로 나타났으며(도 4의 A), 혼탁도 및 DLS 분석 결과는 임시 제형(Control) 대비 3% 글라이신 및 5% 만니톨을 각각 포함하는 제제가 혼탁도 증가를 크게 억제하는 것으로 나타났다(도 4의 B 및 C).As shown in FIG. 4, the visual test result showed that all samples were colorless and transparent (FIG. 4A), and turbidity and DLS analysis results containing 3% glycine and 5% mannitol, respectively, compared to the temporary formulation (Control). The formulation was found to significantly inhibit the increase in turbidity (Fig. 4B and C).

실시예 4: 폴리소르베이트 80의 농도 결정 Example 4: Determination of the concentration of polysorbate 80

본 발명에 따른 약학 제제에서 사용할 폴리소르베이트 80의 농도를 결정하기 위하여, 하기 표 7에 기재된 성분 및 함량을 이용하여 시료를 제조하였다. 이어, 상기 시료들을 대상으로 기계적 자극 시험을 수행한 후, 혼탁도 및 DLS 분석을 수행한 결과를 각각 도 5의 A 내지 C에 나타내었다. In order to determine the concentration of polysorbate 80 to be used in the pharmaceutical formulation according to the present invention, a sample was prepared using the components and contents shown in Table 7 below. Subsequently, after performing a mechanical stimulation test on the samples, results of performing turbidity and DLS analysis are shown in FIGS. 5A to 5C, respectively.

도 5에서 보는 바와 같이 #1 시료만 불투명하였고 그 외 시료 모두 무색 투명하게 나타났다(도 5의 A). 또한, 혼탁도 면에서도 #1 시료를 제외하고 유의할 만한 혼탁도 변화는 없었으며, 0.05 내지 2.0 mg/ml 농도 범위 모두에서 혼탁도 저해 효과가 있음을 알 수 있었다(도 5의 B). 한편, DLS 분석 결과에서도 0.05 내지 2.0 mg/mL의 모든 농도 범위에서 응집 생성을 저해하는 것을 알 수 있었다(도 5의 C). As shown in FIG. 5, only sample #1 was opaque, and all other samples were colorless and transparent (FIG. 5A). In addition, in terms of turbidity, there was no significant change in turbidity except for the #1 sample, and it was found that there was an effect of inhibiting turbidity in both the 0.05 to 2.0 mg/ml concentration range (FIG. 5B). On the other hand, in the DLS analysis result, it was found that aggregation production was inhibited in all concentration ranges of 0.05 to 2.0 mg/mL (FIG.

그 중 폴리소르베이트 80의 0.2 mg/mL 농도가 응집 정도가 가장 낮게 나타나 최적 농도로 선택하였다.Among them, the 0.2 mg/mL concentration of polysorbate 80 showed the lowest degree of aggregation and was selected as the optimum concentration.

제조예 1 내지 3, 및 비교 제조예 1 및 2: 약학 제제의 제조Preparation Examples 1 to 3, and Comparative Preparation Examples 1 and 2: Preparation of a pharmaceutical formulation

하기 표 8에 기재된 성분 및 함량을 이용하여 통상적인 방식에 따라 액상의 약학 제제를 제조하였다. A liquid pharmaceutical formulation was prepared according to a conventional method using the components and contents shown in Table 8 below.

단백농도Protein concentration 버퍼buffer pHpH 계면활성제Surfactants 긴장제Tension agent 비교 제조예 1
(#1 임시제형)Comparative Preparation Example 1
(#1 temporary sentence) 10.0 mg/ml10.0 mg/ml 50mM
아세테이트나트륨50mM
Sodium acetate 5.85.8 -- 110mM
NaCl110mM
NaCl 비교 제조예 2
(#2 임시제형)Comparative Preparation Example 2
(#2 temporary sentence) 0.2 mg/ml 폴리소르베이트80 (PS80)0.2 mg/ml polysorbate 80 (PS80) 110mM
NaCl110mM
NaCl 제조예 1
(#3 w/o NaCl 및 PS80)Manufacturing Example 1
(#3 w/o NaCl and PS80) 10.0 mg/ml10.0 mg/ml 50mM
아세테이트나트륨50mM
Sodium acetate 5.7
(0.4)5.7
(0.4) 0.2 mg/ml PS800.2 mg/ml PS80 w/o NaClw/o NaCl 제조예 2
(#4 글라이신 및 PS80)Manufacturing Example 2
(#4 glycine and PS80) 0.2 mg/ml PS800.2 mg/ml PS80 3% 글라이신3% glycine 제조예 3
(#5 만니톨 및 PS80)Manufacturing Example 3
(#5 mannitol and PS80) 0.2 mg/ml PS800.2 mg/ml PS80 5% 만니톨5% mannitol

시험예: 약학 제제의 안정성 분석 Test Example: Stability analysis of pharmaceutical formulations

상기 제조예 1 내지 3, 및 비교 제조예 1 및 2에서 제조한 약학 제제를 하기 기재된 가혹 조건에 보관한 후, 육안 분석, 혼탁도, DLS, 단백함량, SE-HPLC, IE-HPLC, SDS-PAGE, IEF 및 역가 1 및 2를 분석하였다.After storing the pharmaceutical preparations prepared in Preparation Examples 1 to 3 and Comparative Preparation Examples 1 and 2 under the severe conditions described below, visual analysis, turbidity, DLS, protein content, SE-HPLC, IE-HPLC, SDS- PAGE, IEF and titers 1 and 2 were analyzed.

가혹 조건Harsh conditions

(1) 60℃에서 2주 동안 보관(1일, 3일, 1주 및 2주)(1) Store at 60℃ for 2 weeks (1 day, 3 days, 1 week and 2 weeks)

(2) 5℃, 25℃ 및 37℃에서 2주 내지 12개월 동안 보관(최초, 2주, 4 주, 6주, 8주, 3개월 내지 12개월)(2) Storage at 5℃, 25℃ and 37℃ for 2 weeks to 12 months (first, 2 weeks, 4 weeks, 6 weeks, 8 weeks, 3 months to 12 months)

결과result

60℃에서 2주 동안 보관하는 조건에서는, 육안 검사 결과 비교 제조예 1 및 2는 불투명한 것으로 나타났으며, 제조예 3의 제제는 60℃에서 2주 동안 보관하여도 무색 투명하게 유지됨을 알 수 있었다. 혼탁도 및 DLS 분석 결과에서는 만니톨 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 제조예 3의 제제가 혼탁도 증가율이 가장 낮음을 알 수 있었다(도 6의 A 및 B). Under the conditions of storage at 60° C. for 2 weeks, the results of visual inspection showed that Comparative Preparation Examples 1 and 2 were opaque, and the preparation of Preparation Example 3 remained colorless and transparent even when stored at 60° C. for 2 weeks. there was. From the results of turbidity and DLS analysis, it was found that the formulation of Preparation Example 3 containing mannitol and polysorbate 80 had the lowest turbidity increase rate (FIG. 6A and B).

5℃, 25℃ 및 37℃에서 2주 내지 12개월 동안 보관하는 조건에서는, 육안 검사 결과 모든 약학 제제가 모든 온도 및 보관 조건에서 무색 투명한 것으로 나타났다. 온도에 따른 제형별 혼탁도 변화를 살펴보면, 5℃ 및 25℃에서 보관한 시료의 경우 제형 종류에 상관없이 혼탁도의 변화가 없었으나, 37℃ 보관 시료 중에서는 제조예 2에 따른 제형 #4가 처음 대비 8주 보관 시의 혼탁도가 2.3배 높음을 알 수 있었다(도 7). Under the conditions of storage at 5°C, 25°C and 37°C for 2 weeks to 12 months, visual inspection showed that all pharmaceutical formulations were colorless and transparent at all temperatures and storage conditions. Looking at the change in turbidity for each formulation according to temperature, in the case of samples stored at 5°C and 25°C, there was no change in turbidity regardless of the type of formulation, but formulation #4 according to Preparation Example 2 among samples stored at 37°C It was found that the turbidity when stored for 8 weeks compared to the first time was 2.3 times higher (FIG. 7).

한편, UV 단백정량 분석 결과에서는 모든 제형들이 모든 온도 보관 조건에서 처음 대비 95 내지 105% 범위 안에 위치함으로써 유의할 만한 변화 없었다. On the other hand, in the UV protein quantitative analysis results, there was no significant change since all formulations were located within the range of 95 to 105% compared to the first in all temperature storage conditions.

SDS-PAGE 분석 결과에서는, 보관 온도에 따른 제조예와 비교 제조예간의 밴드 패턴 차이는 없었다. 하지만 도 8의 A 및 B에서 볼 수 있듯이, 처음 및 37℃에서 8주 보관한 시료의 비-환원(Non-reducing) 및 환원 상태에서의 결과에서는 처음 대비 고온 보관 시료의 밴드 패턴 차이를 확인할 수 있었다. 비-환원 조건에서 비교 제조예 및 제조예에 따른 #1 내지 #5 모두 37℃ 보관 시에 250 kD 크기의 밴드 및 37 내지 50 kD 크기의 밴드 강도가 진해지는 것을 확인할 수 있었다. 또한 환원 조건에서는 처음 대비 37℃ 보관 시료에서 75 kD 크기의 밴드 강도가 진해지고, 25 내지 50 kD 크기의 여러 밴드들이 새롭게 생성되는 것을 확인할 수 있었다. In the results of SDS-PAGE analysis, there was no difference in the band pattern between Preparation Example and Comparative Preparation Example according to storage temperature. However, as can be seen from A and B of FIG. 8, the difference in the band pattern of the sample stored at high temperature compared to the first can be confirmed in the results in the non-reducing and reduced state of the sample stored for 8 weeks at 37°C. there was. In non-reducing conditions, both #1 to #5 according to the Comparative Preparation Example and Preparation Example were found to have a 250 kD-sized band and a 37 to 50 kD-sized band strength when stored at 37°C. In addition, under the reducing conditions, it was confirmed that the band intensity of 75 kD in the sample stored at 37° C. increased, and several bands of 25 to 50 kD were newly generated.

한편, IEF 분석 결과, 모든 보관 조건에서 제형 간 그리고 온도 간 IEF 밴드 패턴 차이 없었으며 pI 7.8-8.3 사이에 위치하는 것을 확인할 수 있었다.On the other hand, as a result of IEF analysis, it was confirmed that there was no difference in IEF band pattern between formulations and between temperatures under all storage conditions, and was located between pI 7.8-8.3.

SE-HPLC 분석 결과, 비교 제조예 및 제조예에 따른 #1 내지 #5 모두 5℃ 및 25℃ 보관 조건에서는 유의할 만한 순도 변화가 없었으나, 37℃에서는 8주 보관 결과, 제제 #1은 95.66%, 제제 #2는 95.15%, 제제 #3은 96.46%, 제제 #4는 96.42%, 그리고 제제 #5는 96.56%로 처음 대비 3.14 내지 4.55%의 순도 감소 발생하였다. 즉, 본 발명에 따른 제조예의 안정성이 비교 제조예보다 우수한 것을 알 수 있었으며, 특히 비교 제조예들의 제형에서는 순도 감소량이 큰데 이것은 메인 피크 앞의 프리-피크(pre-peak) 부분(응집 추정) 증가로 인한 결과로 확인되었다.As a result of SE-HPLC analysis, there was no significant change in purity at 5°C and 25°C storage conditions for both #1 to #5 according to the Comparative Preparation Example and Preparation Example, but storage results at 37°C for 8 weeks, Formulation #1 95.66% , Formulation #2 was 95.15%, formulation #3 was 96.46%, formulation #4 was 96.42%, and formulation #5 was 96.56%, resulting in a decrease in purity of 3.14 to 4.55% compared to the first. That is, it was found that the stability of the preparation example according to the present invention was superior to that of the comparative preparation example, and in particular, in the formulation of the comparative preparation examples, the amount of purity decrease was large, which increased the pre-peak portion (estimated aggregation) in front of the main peak. Confirmed as a result of.

역가 2의 분석(세포에 근거한 에세이 분석) 결과에서는 상기 모든 제제가 보관 온도에 상관없이 대조군 대비 EC₅₀가 70 내지 130% 사이로 유의할 만한 변화가 없었다.In the results of the analysis of titer 2 (cell-based assay analysis), there was no significant change in EC ₅₀ of 70 to 130% compared to the control for all of the above preparations regardless of storage temperature.

이상의 결과를 통해, 항-EGFR 항체를 포함하는 약학 제제에 있어서, 열적 자극 조건에서 응집 및 입자 생성을 억제하는 긴장제로는 NaCl, 글라이신 및 만니톨 등을 들 수 있고 NaCl 또는 만니톨이 바람직하며, 기계적 자극 조건에서 혼탁도, 응집 및 입자 생성을 억제하는 폴리소르베이트 80의 바람직한 농도는 0.2 mg/mL임을 확인하였다. From the above results, in a pharmaceutical formulation containing an anti-EGFR antibody, examples of tonic agents that inhibit aggregation and particle generation under thermal stimulation conditions include NaCl, glycine and mannitol, and NaCl or mannitol is preferable, and mechanical stimulation It was confirmed that the preferred concentration of polysorbate 80 that suppresses turbidity, agglomeration and particle generation under conditions was 0.2 mg/mL.

또한, 60℃의 고온에서 보관한 후 약학 제제의 안정성을 분석한 결과, 10 mg/ml의 항-EGFR 항체를 포함하는 제제는 50 mM 아세테이트 나트륨, pH 5.7±0.4, 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80 및 5% 만니톨을 포함하는 것이 기계적/열적 자극에서 안정화시킬 수 있음을 확인하였다. In addition, as a result of analyzing the stability of the pharmaceutical formulation after storage at a high temperature of 60°C, the formulation containing 10 mg/ml of anti-EGFR antibody was 50 mM sodium acetate, pH 5.7±0.4, 0.2 mg/mL polysorbate. It was confirmed that containing 80 and 5% mannitol can stabilize under mechanical/thermal stimulation.

아울러, 5℃, 25℃ 및 37℃에서 8주 동안 보관한 후 약학 제제의 안정성을 분석한 결과에서는, 10 mg/ml의 항-EGFR 항체를 포함하는 제제가 50 mM 아세테이트 나트륨, pH 5.7±0.4, 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80 및 w/o NaCl을 포함하는 것이 물리/화학적 안정성면에서 바람직한 제형임을 알 수 있다.In addition, as a result of analyzing the stability of the pharmaceutical formulation after storage at 5°C, 25°C and 37°C for 8 weeks, the formulation containing 10 mg/ml of anti-EGFR antibody was 50 mM sodium acetate, pH 5.7±0.4 , It can be seen that containing 0.2 mg/mL polysorbate 80 and w/o NaCl is a preferred formulation in terms of physical/chemical stability.

Claims

Does not contain sodium chloride (NaCl) and glycine,
As a pharmaceutical formulation comprising an anti-epidermal growth factor receptor (EGFR) antibody, sodium acetate anhydride and polysorbate 80,
A pharmaceutical formulation comprising the anti-EGFR antibody at a concentration of 1 to 16 mg/ml and a pH of 5.7±0.4.

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The method of claim 1,
A pharmaceutical formulation, characterized in that the anti-EGFR antibody is contained in a concentration of 2 to 10 mg/ml.

The method of claim 1,
A pharmaceutical formulation comprising the sodium acetate anhydride in a concentration of 10 to 100 mM.

The method of claim 1,
A pharmaceutical formulation comprising the polysorbate 80 at a concentration of 0.05 to 2.0 mg/ml.

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