KR102196527B1 - A system and a method for harvesting red blood cells during culturing erythroid cells - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포 배양을 지속적으로 유지하면서도 다양한 세포 혼합물로부터 적혈구를 수거하기 위한 시스템 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 적혈구의 수거를 위한 시스템 및 방법에 따라, 세포 배양을 유지하는 중에 먼저 생산되어 나오는 성숙 적혈구를 분리하게 되면, 성숙 적혈구에 적합한 배양/저장 조건의 제공에 의해 성숙 적혈구의 생존율을 높일 수 있을 뿐만 아니라, 연속 배양 공정 중에 성숙 적혈구를 배양기로부터 분리해 냄으로써, 배지 및 배양 공간의 효율성을 꾀할 수 있게 된다. 따라서, 본 발명에 따른 성숙 적혈구의 수거를 위한 시스템 및 방법은 체외 배양 적혈구의 최종 수득률을 높일 수 있다.The present invention relates to a system and method for collecting red blood cells from various cell mixtures while maintaining the cell culture continuously. According to the system and method for the collection of red blood cells of the present invention, if the mature red blood cells produced first are separated while maintaining the cell culture, the survival rate of mature red blood cells can be increased by providing suitable culture/storage conditions for mature red blood cells. In addition, by separating the mature red blood cells from the incubator during the continuous culture process, the efficiency of the medium and the culture space can be achieved. Therefore, the system and method for collecting mature red blood cells according to the present invention can increase the final yield of in vitro cultured red blood cells.

Description

적혈구계 세포 배양 중 적혈구를 수거하기 위한 시스템 및 방법{A system and a method for harvesting red blood cells during culturing erythroid cells}A system and a method for harvesting red blood cells during culturing erythroid cells}

본 발명은 세포 배양을 지속적으로 유지하면서도 다양한 세포 혼합물로부터 적혈구를 수거하기 위한 시스템 및 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a system and method for collecting red blood cells from various cell mixtures while maintaining the cell culture continuously.

수혈용 혈액 부족으로 인해 체외에서 줄기세포로부터 적혈구를 생산하는 기술에 대한 수요가 크다. 우리나라에서는 연간 약 210만 유닛(unit)의 적혈구 제제가 사용되고 있는데, 한 유닛 당 2×1012 적혈구가 있다고 계산하면 연간 약 4×1018 이상의 적혈구가 필요하다. 따라서, 적혈구의 체외 배양 기술이 상용화되기 위해서는 적혈구의 대량 생산이 가능해야 할 뿐만 아니라, 얻어진 적혈구의 성숙도와 생존율이 우수하여야 한다.Due to the lack of blood for transfusion, there is a great demand for a technology to produce red blood cells from stem cells in vitro. In Korea, about 2.1 million units of red blood cell preparations are used per year, and if you calculate that there are 2×10 12 red blood cells per unit, about 4×10 18 or more red blood cells per year are required. Therefore, in order to commercialize the technology for culturing red blood cells in vitro, mass production of red blood cells must be possible, and the maturity and survival rate of the obtained red blood cells must be excellent.

체외에서 줄기세포로부터 적혈구를 생산할 때, 세포성숙단계를 거치면서 배양중에는 미성숙 혹은 성숙 적혈구계 세포들이 섞여 있게 된다. 따라서 최종 산물로부터 탈핵 적혈구, 즉 망상 적혈구(enucleated reticulocyte) 및 적혈구(red blood cell, RBC)를 분리 및 수집하기 위한 자동화된 간단하면서도 고효율적인 방법이 세포의 생존율을 높이고 생산 단가를 낮추는 데 필수적이다. 그러나 적혈구의 체외 배양법 자체가 아직 개발중인 상태에서 여러 성숙단계의 적혈구계 세포 혼합물로부터 적혈구를 수거하는 기술은 체외 생산 혈액제제의 상품화에 큰 걸림돌로 지적되어 왔다. When red blood cells are produced from stem cells in vitro, immature or mature red blood cells are mixed during culture during the cell maturation stage. Therefore, an automated, simple and highly efficient method for separating and collecting enucleated red blood cells, that is, enucleated reticulocytes and red blood cells (RBCs) from the final product, is essential to increase the survival rate of cells and lower the production cost. However, while the in vitro culture method of red blood cells itself is still under development, the technology for collecting red blood cells from a mixture of erythrocyte-based cells in various stages of maturity has been pointed out as a major obstacle to commercialization of in vitro blood products.

적혈구를 생산하기 위해 적혈구 전구체를 배양시, 배양을 유지하면서 동시에, 배양기 안에 있는 다른 lineage의 세포라든가 다양한 성숙단계에 걸쳐있는 적혈구계 세포들, 즉 이질적인 세포 집단으로부터 자동 혹은 연속적으로 외부환경으로부터 닫힌 시스템(closed system) 안에서 무균상태를 유지하며 외부환경에의 노출이 없도록 성숙 적혈구를 분리하는 방법은 보고된 바 없었다. 기존 보고된 성숙 적혈구의 분리 방법은 세포의 배양 종료 후 전체 세포를 수거하거나, 말초혈액(peripheral whole blood)으로부터 일부 유핵적혈구(주로 말초혈액에 간혹 보일 수 있는 탈핵 직전의 유핵적혈구(orthochromatic erythroblast))를 농축시켜 분석에 이용하거나, 전통적으로 실험실 내에서 이루어지는 여러가지 세포 분리 방법(flow cytometry sorter, filter 등)으로 원하는 세포를 수거하거나, 세포에서 나온 목표 최종 산출물인 항체 같은 분비 산물을 여러가지 방법으로 채집하는 것으로 모두 원심분리 후 세포가 들어있는 용기(예컨대, 보틀)를 꺼내 내부에 있는 세포 중 원하는 부분을 외부환경에 노출시켜 분리할 수밖에 없었다.When culturing erythrocyte precursors to produce red blood cells, while maintaining the culture, a system closed from the external environment automatically or continuously from cells of different lineages in the incubator or erythrocytes that are in various stages of maturation, that is, from heterogeneous cell populations There has been no reported method of separating mature red blood cells to maintain aseptic conditions in (closed system) and prevent exposure to the external environment. The previously reported method of isolating mature red blood cells is to either collect whole cells after completion of cell culture, or some nucleated red blood cells from peripheral whole blood (orthochromatic erythroblasts, which can sometimes be seen in peripheral blood). Is concentrated and used for analysis, or the desired cells are collected by various cell separation methods (flow cytometry sorter, filter, etc.) traditionally performed in a laboratory, or secretion products such as antibodies, which are the target final products from cells, are collected by various methods. All of them had to be separated by taking out a container (eg, a bottle) containing cells after centrifugation and exposing a desired part of the cells inside to the external environment.

그러나 임상적용을 위한, 예컨대, 사람에게 혈관 투여되기 위한 혈액제제로 혹은 시약 생산용 적혈구 생산을 위한 배양인 경우 적혈구 분리에 있어서 다음과 같은 한계점이 있다.However, in the case of a culture for the production of red blood cells for clinical application, for example, as a blood product for vascular administration to humans or for production of reagents, there are the following limitations in the separation of red blood cells.

1) 배양액 안에 성숙 단계가 조금씩 다른 적혈구계 세포들이 섞여 있다(빨리 탈핵하는 세포들과 나중에 탈핵하는 세포들 사이에 시간적인 편차가 있다). 1) Red blood cells with slightly different maturation stages are mixed in the culture medium (there is a temporal deviation between cells that enucleate quickly and cells that enucleate later).

2) 계속 배양을 해도 모든 세포가 일제히 성숙적혈구로 되는 시점은 찾기 힘들다. 2) Even with continued culture, it is difficult to find the point at which all cells become mature red blood cells at once.

3) 탈핵한 적혈구의 경우는 배양기 내 조건과 다른 보관 조건이 필요하여 성숙 후 빨리 분리해 주어야 한다. 3) In the case of enucleated red blood cells, storage conditions different from those in the incubator are required, so they must be separated quickly after maturation.

4) 전체 세포에서 유핵세포를 필터링 할 경우(백혈구 필터를 이용하면 적혈구 전구체는 걸러지고 적혈구만 수거할 수 있음) 세포 손실이 너무 많은 문제가 있다.4) In the case of filtering nucleated cells from all cells (using a leukocyte filter, red blood cell precursors are filtered out and only red blood cells can be collected), there is a problem of too much cell loss.

5) 임상적용을 위해서는 전 배양 및 분리, 수거(harvest) 과정이 모두 닫힌 시스템(closed system)에서 자동화 기기 내에서 진행되어야 한다.5) For clinical application, the entire culture, separation, and harvest process must be carried out in an automated device in a closed system.

6) 대량생산이 가능하며, 외부환경 노출에 의한 감염 우려가 없으며, 자동화를 가능하게 해 비용절감 및 공정의 인증(qualification of process)이 가능해야 한다.6) Mass production is possible, there is no fear of infection due to exposure to the external environment, and cost reduction and qualification of the process should be possible by enabling automation.

따라서, 세포 배양을 유지하는 중에 먼저 생산되어 나오는 탈핵 적혈구를 연속적이며 자동으로 분리해 낼 수 있고, 이러한 적혈구의 수거가 닫힌 시스템 내에서 수행될 수 있다면, Therefore, if the enucleated red blood cells produced first during the maintenance of the cell culture can be continuously and automatically separated, and the collection of these red blood cells can be carried out in a closed system,

1) 전체 배양세포들의 배양환경에 맞추어 배양을 계속하는 한편, 1) While continuing cultivation according to the culture environment of all cultured cells,

2) 다른 배양/보관조건을 요구하는 적혈구를 최대한 빨리 분리하여 생존율을 높이고(기존에는 탈핵이 되어도 배양조건이 맞지 않아 금방 깨져서, 최종배양일까지 살지 못해 최종배양일의 적혈구 수득률이 낮았다), 2) To increase the survival rate by separating red blood cells that require different culture/storage conditions as quickly as possible (in the past, even if denuclearization was performed, the culture conditions were not met, so they were quickly broken, and the red blood cell yield on the final culture day was low),

3) 닫힌 시스템 내에서 분리한 것이므로 외부환경으로부터 오염/감염의 위험 없이 적혈구는 최종 산물로 수거해 치료에 이용할 수 있으며 유핵세포는 다시 연속적으로 배양기로 보내 배양을 계속할 수 있고,3) Since it is separated in a closed system, red blood cells can be collected as a final product and used for treatment without the risk of contamination/infection from the external environment, and the nucleated cells can be continuously sent to the incubator to continue culture.

4) 적혈구를 전체 배양 공간에서 제거하게 되면서 배지 및 배양공간 절약하게 되어 배양효율을 높이며, 4) As red blood cells are removed from the entire culture space, medium and culture space are saved, thereby increasing culture efficiency.

5) 따라서 전체적으로 적혈구의 최종 수득률을 높일 수 있다. 5) Therefore, it is possible to increase the final yield of red blood cells as a whole.

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공개특허 10-2006-0030861Patent Publication 10-2006-0030861 공개특허 10-2013-0137574Patent Publication 10-2013-0137574

본 발명은 세포 배양을 지속적으로 유지하면서도 다양한 세포 혼합물로부터 적혈구를 수거하기 위한 시스템 및 방법을 제공하고자 한다.An object of the present invention is to provide a system and method for collecting red blood cells from various cell mixtures while continuously maintaining cell culture.

본 발명은 세포 대량배양시 사용하기 어려운 기존의 세포분리법(flowcytometry cell sorting, 필터법, 배양물을 수거해 원심분리기에 따로 넣고 분리하는 방법 등)의 한계를 극복한 적혈구를 수거하기 위한 시스템 및 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.The present invention is a system and method for collecting red blood cells that overcome the limitations of the existing cell separation method (flowcytometry cell sorting, filter method, a method of collecting and separating cultures into a centrifuge, etc.), which is difficult to use when culturing cells in bulk. It aims to provide.

본 발명은 세포 배양을 지속적으로 유지하면서도 다양한 세포 혼합물로부터 적혈구를 수거하고, 미성숙 세포는 다시 배양에 이용할 수 있는 적혈구 수거 시스템 및 방법을 제공한다. The present invention provides a system and method for collecting red blood cells that can be used for culturing red blood cells from various cell mixtures while continuously maintaining cell culture, and re-culturing immature cells.

이를 위해, 본 발명은 To this end, the present invention

적혈구계 세포의 체외 배양을 위한 세포 배양기;A cell incubator for culturing red blood cells in vitro;

원심분리 장치를 포함하는 세포 분리기; A cell separator including a centrifugation device;

성숙 적혈구 저장부; 및Mature red blood cell storage; And

이들을 무균적으로 연결해 주는 연결부를 포함하고,It includes a connection that connects them aseptically,

세포 배양을 유지하면서 동시에 성숙 적혈구를 수거하며, While maintaining the cell culture while simultaneously collecting mature red blood cells,

적혈구계 세포의 배양, 분리, 및 성숙 적혈구의 수거가 닫힌 시스템(closed system) 내에서 수행되는 것을 특징으로 하는,It is characterized in that the cultivation, isolation, and collection of mature red blood cells of red blood cells are carried out in a closed system,

적혈구계 세포 배양 중 적혈구를 수거하기 위한 시스템을 제공한다.It provides a system for collecting red blood cells during erythrocyte cell culture.

본 발명은 또한 줄기세포, 조혈모세포, 또는 적혈구 전구세포를 세포 배양기에서 적혈구계 세포로 배양하는 단계;The present invention also includes the steps of culturing stem cells, hematopoietic stem cells, or red blood cell progenitor cells into red blood cell cells in a cell culture medium;

상기 적혈구계 세포의 연속적인 배양 과정 중에 상기 배양된 적혈구계 세포의 일부를 원심분리 장치를 포함하는 세포 분리기로 이송하는 단계;Transferring a portion of the cultured red blood cell cells to a cell separator including a centrifugal separator during the continuous culture process of the red blood cell cells;

상기 적혈구계 세포들을 세포 분리기 내에서 원심분리를 통해 적혈구계 세포들을 성숙도에 따라 분리하는 단계; Separating the erythroid cells according to their maturity by centrifuging the erythroid cells in a cell separator;

성숙 적혈구를 성숙 적혈구 저장부로 이송하는 단계를 포함하며,Including the step of transferring the mature red blood cells to the mature red blood cell storage unit,

상기 세포 배양기, 세포 분리기 및 성숙 적혈구 저장부는 이들을 무균적으로 연결해 주는 연결부를 통해 연결되어 있고, The cell incubator, the cell separator, and the mature red blood cell storage unit are connected through a connection unit that aseptically connects them,

닫힌 시스템 내에서 구현되는 것을 특징으로 하는,Characterized in that it is implemented within a closed system,

적혈구계 세포 배양 중 적혈구를 수거하기 위한 방법을 제공한다. It provides a method for collecting red blood cells during cultivation of red blood cells.

도 1은 본 발명에 따른 적혈구의 수거를 위한 시스템 및 방법의 원리를 예시적으로 도시한 도면이다. 1 is a diagram illustrating the principle of a system and method for collecting red blood cells according to the present invention.

도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 시스템은 적혈구계 세포의 체외 배양을 위한 세포 배양기, 원심분리 장치를 포함하는 세포 분리기, 성숙 적혈구 저장부; 및 이들을 무균적으로 연결해 주는 연결부를 포함한다. As can be seen in Figure 1, the system of the present invention is a cell culture device for in vitro cultivation of erythroid cells, a cell separator including a centrifugation device, a mature red blood cell storage unit; And a connection portion for aseptically connecting them.

본 발명의 시스템에는 세포 배양기, 세포 분리기, 성숙 적혈구 저장부 및 연결부 외에도, 선택적으로 세포 잔해물이나 대식세포를 모으는 폐기물 저장부 및/또는 미성숙 세포를 그의 성숙도에 따라 추가로 배양하기 위한 제2, 제3, 제4의 세포 배양기 등이 포함될 수 있다. In the system of the present invention, in addition to the cell incubator, the cell separator, the mature red blood cell storage unit and the connection unit, a second, second and second unit for additionally culturing immature cells and/or a waste storage unit for selectively collecting cell debris or macrophages. 3, a fourth cell culture device, etc. may be included.

본 발명에 따른 세포 배양기는 적혈구계 세포의 체외 배양을 위한 챔버 또는 장치, 예컨대, 바이오리액터를 의미한다. 상기 세포 배양기는 세포 공급부 및 세포 배출부를 포함하며, 교반기, 배양 조건 모니터링 장치 및 배양 조건 조절 장치, 공기 유입부, 공기 배출부 등을 포함할 수 있다. 배양 조건 조절 장치의 일예로 세포, 공기 등의 유출입을 조절하는 부분에는 세포 배양기 내의 이들의 양을 감지하는 센서(배양 조건 모니터링 장치의 일예)의 작동에 의해 필요에 따라 세포, 공기 등의 유출입을 자동적으로 조절하는 개폐 장치 또는 밸브 등이 존재한다.The cell incubator according to the present invention refers to a chamber or apparatus, for example, a bioreactor for culturing red blood cells in vitro. The cell culture unit includes a cell supply unit and a cell discharge unit, and may include a stirrer, a culture condition monitoring device and a culture condition control unit, an air inlet unit, an air discharge unit, and the like. As an example of a culture condition control device, in the part that controls the inflow and outflow of cells, air, etc., by operating a sensor (an example of a culture condition monitoring device) that detects the amount of cells in the cell incubator, the inflow and outflow of cells, air, etc. There are opening and closing devices or valves that automatically adjust.

적혈구계 세포 배양을 위한 원천으로서 줄기세포, 조혈모세포, 또는 적혈구 전구세포를 세포 배양기에 공급하고, 적절한 배양 조건 하에서 적혈구계 세포로 배양할 수 있다.Stem cells, hematopoietic stem cells, or erythrocyte progenitor cells may be supplied to a cell incubator as a source for culturing red blood cells, and cultured as red blood cells under appropriate culture conditions.

본 발명에서 말하는 적혈구는 크게 유핵 적혈구와 탈핵 적혈구로 구분될 수 있으며, 체외 배양 과정을 거쳐 최종적으로 수거하고자 하는 적혈구는 탈핵 적혈구를 의미한다. 탈핵 적혈구는 망상적혈구(reticulocyte)와 적혈구(red blood cell, RBC)를 포함하는 개념이다. 핵이 빠져 나온 직후의 적혈구계 세포를 망상적혈구(reticulocyte)라고 하며 여기에 잔존해 있던 RNA 및 소기관(micro-organelles)가 없어지고 biconcave shape이 되면 성숙한 적혈구가 된다. 이러한 적혈구의 체외 배양을 위해서는 줄기세포, 조혈모세포, 적혈구 전구세포 등이 이용된다. 이들 세포들은 배양 플레이트, 바이오리액터 등의 배양 공간에서 체외 배양되며, 체외 배양 중인 세포들은 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이 여러 성숙 단계의 크고 작은 적혈구계 세포들이 혼합되어 있다. Red blood cells referred to in the present invention can be broadly classified into nucleated red blood cells and enucleated red blood cells, and red blood cells to be finally collected through an in vitro culture process mean enucleated red blood cells. Enucleated red blood cells are a concept including reticulocytes and red blood cells (RBCs). The red blood cells immediately after the nucleus comes out are called reticulocytes, and when the remaining RNA and micro-organelles disappear and become biconcave, they become mature red blood cells. Stem cells, hematopoietic stem cells, red blood cell progenitor cells, and the like are used for culturing these red blood cells in vitro. These cells are cultured in vitro in a culture space such as a culture plate or a bioreactor, and the cells in vitro culture are mixed with large and small red blood cell cells of various stages of maturation as shown in FIG. 1.

본 발명은 세포 배양기 내에 존재하는 이러한 이질적인 세포 집단의 일부 세포를 연속적인 배양 과정 중에 자동 또는 반자동적으로 세포 분리기로 이송하고, 원심분리 장치를 포함하는 세포 분리기를 통해 이들 세포들의 밀도 차이를 이용하여 다층으로 분리하는 기술을 제시한다. The present invention automatically or semi-automatically transfers some cells of this heterogeneous cell population present in the cell incubator to a cell separator during a continuous culture process, and uses the difference in density of these cells through a cell separator including a centrifugal separator. We present a technique for separating into multiple layers.

이를 위해, 본 발명에 따른 적혈구 수거 시스템은 세포 배양기, 세포 분리기, 성숙 적혈구 저장부; 및 이들을 무균적으로 연결해 주는 연결부 외에 이러한 기술을 구현하기 위한 제어부 및 조작부를 포함한다.To this end, the red blood cell collection system according to the present invention includes a cell culture device, a cell separator, and a mature red blood cell storage unit; And a control unit and a control unit for implementing this technology in addition to a connection unit for aseptically connecting them.

제어부에는 조작부를 통해 사용자가 입력한 지시에 따라 작동되는 프로그램이 존재한다. 조작부에서 사용자가 원심분리의 속도 및 시간 등과 연관된 팩터들을 입력하여 원심분리를 시작시키면 분리 모드가 가동된다. 원심분리 동안 또는 원심분리 후 성숙도에 따라 분리된 적혈구계 세포들은 세포 배출부를 통해 배출되어 이송 배관을 통해 제1, 제2 또는 제3의 세포 배양기, 또는 성숙 적혈구 저장부, 또는 폐기물 저장부 등으로 이송된다. 본 발명에 따른 적혈구 수거 시스템은 세포의 분리와 세포의 이송이 연속적으로 이루어지게 작동시킬 수도 있고, 다르게는, 필요에 따라, 분리 모드와 이송 모드로 나누어 작동될 수도 있다. 예를 들어, 분리 모드에서는 원심분리 장치의 원심분리 처리 챔버 내로 적혈구계 세포들이 유입되고, 원심분리 되어 성숙도에 따라 분리된다. 이송 모드는 분리 모드의 작동 완료 후 자동적으로 또는 사용자가 입력한 지시에 따라 가동되어 성숙도에 따라 분리된 적혈구계 세포들을 적절한 곳으로 이송시킨다. In the control unit, there is a program operated according to an instruction input by the user through the operation unit. Separation mode is activated when the user starts centrifugation by inputting factors related to the speed and time of centrifugation at the control panel. The red blood cells separated according to maturity during or after centrifugation are discharged through the cell discharge unit and transferred to the first, second or third cell incubator, or the mature red blood cell storage unit, or the waste storage unit through a transfer pipe. Is transported. The red blood cell collection system according to the present invention may be operated to continuously separate cells and transfer cells, or alternatively, as necessary, may be operated by dividing into a separation mode and a transfer mode. For example, in the separation mode, red blood cells are introduced into a centrifugation processing chamber of a centrifugal separator, and centrifuged to separate according to maturity. The transfer mode is operated automatically after the operation of the separation mode is completed or according to an instruction input by the user to transfer the separated red blood cells according to the maturity to an appropriate place.

본 발명에 따른 세포 배양기는 적혈구의 체외 배양을 위해 사용되는 줄기세포, 조혈모세포, 적혈구 전구세포 등이 공급될 수 있는 세포 공급부를 포함한다. 세포 공급부는 세포뿐만 아니라 세포 배양을 위한 배지 등의 성분이 공급될 수도 있다.The cell incubator according to the present invention includes a cell supply unit to which stem cells, hematopoietic stem cells, red blood cell progenitor cells, etc. used for culturing red blood cells in vitro can be supplied. The cell supply unit may supply not only cells but also components such as a medium for cell culture.

상기 세포 배양기는 세포 분리기로 배양 중인 세포의 일부를 보내기 위한 세포 배출부를 포함한다. 또한, 세포 분리기로의 세포의 이동을 자동적으로 혹은 수동적으로 수행하기 위해 펌프를 포함할 수 있다. 적혈구계 세포의 연속적인 배양 과정 중에 상기 배양된 적혈구 세포의 일부를 세포 배양기로부터 세포 분리기로의 이송하는 과정은 자동적으로 혹은 수동적으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 바이오리액터에서 배양 중인 세포의 일부를 세포 배출부를 통해 소정의 시간 간격을 두고 정기적으로 또는 비정기적으로 펌프를 이용하여 세포 분리기로 이송할 수 있다. The cell incubator includes a cell discharge unit for sending a portion of the cells being cultured to the cell separator. In addition, a pump may be included to automatically or passively carry out the movement of cells to the cell separator. During the continuous culturing process of red blood cell cells, the process of transferring a part of the cultured red blood cells from the cell incubator to the cell separator may be performed automatically or manually. For example, some of the cells being cultured in the bioreactor may be transferred to the cell separator using a pump regularly or irregularly at predetermined time intervals through the cell discharge unit.

상기 세포 배양기는 세포 배양액을 교반할 수 있는 교반기, 온도 및 산소 등의배양 조건을 모니터링하는 장치 및 모니터링 결과에 따라 배양 조건을 제어 및 조절하는 장치, 산소 등의 공기를 유입시킬 수 있는 공기 유입부, 불필요한 공기를 배출하는 공기 배출부 등을 추가로 포함할 수 있다. The cell incubator includes a stirrer capable of stirring the cell culture solution, a device that monitors culture conditions such as temperature and oxygen, a device that controls and adjusts the culture conditions according to the monitoring result, and an air inlet through which air such as oxygen can be introduced. , It may further include an air discharge unit for discharging unnecessary air.

또한, 본 발명에 따른 시스템은 세포 배양을 유지하면서 동시에 성숙 적혈구를 분리하며, 적혈구계 세포의 배양, 분리, 및 성숙 적혈구의 수거가 닫힌 시스템(closed system) 내에서 수행되는 것을 특징으로 한다. 여기에서, 닫힌 시스템 내에서 수행된다는 것은 다시 말해 적혈구계 세포의 배양, 분리, 및 성숙 적혈구의 수거를 위한 전 공정이 외부환경에의 노출 없이 무균 상태의 닫힌 공간 내에서 수행됨을 의미한다.In addition, the system according to the present invention is characterized in that the cell culture is maintained while at the same time separating mature red blood cells, and the cultivation, separation, and collection of mature red blood cells of red blood cells are performed in a closed system. Here, being performed in a closed system means that the entire process for culturing, separating, and collecting mature red blood cells of red blood cells is performed in an aseptic closed space without exposure to the external environment.

앞서 설명한 바와 같이, 세포 배양기 내에서 배양된 적혈구계 세포들은 성숙도가 각기 다르며, 이들 모두가 성숙 적혈구가 되는 시점을 찾기 힘들고, 이들 세포의 성숙도에 따라 적절한 배양 조건은 제각기 다르다. 따라서, 성숙된 적혈구를 수거하는 것과 동시에, 성숙도가 각기 다른 적혈구계 세포들 중에서, 아직 탈핵되지 않은 미성숙 세포는 다시 성숙 적혈구가 될 때까지 추가로 배양할 필요가 있다. As described above, the erythroid cells cultured in the cell incubator have different degrees of maturity, and it is difficult to find the time point at which all of them become mature red blood cells, and appropriate culture conditions are different depending on the maturity of these cells. Therefore, at the same time as the harvesting of mature red blood cells, among red blood cell cells having different maturities, immature cells that have not yet been enucleated need to be further cultured until they become mature red blood cells again.

이를 위해, 상기 세포 배양기는 세포 분리기로부터 탈핵되지 않은 미성숙 세포를 다시 받아들일 수 있는 미성숙 세포 유입부를 포함할 수 있다. 이러한 미성숙 세포 유입부는 세포 배양기의 세포 공급부와 동일한 것일 수도 있고 별도로 존재할 수도 있다. 예를 들어, 세포 배양기의 세포 공급부로 들어가는 이송 배관에 미성숙 세포 유입을 위한 이송 배관이 연결부를 통해 연결될 수 있다. To this end, the cell incubator may include an immature cell inlet unit capable of re-accepting immature cells that have not been enucleated from the cell separator. The immature cell inlet part may be the same as the cell supply part of the cell incubator or may exist separately. For example, a transfer pipe for introducing immature cells may be connected to a transfer pipe entering the cell supply part of the cell incubator through a connection part.

다르게는 세포 배양기의 공급부와는 별도로 미성숙 세포 유입부가 존재하여, 세포 분리기의 세포 배출부를 통해 배출된 미성숙 세포가 이송 배관을 통해 미성숙 세포 유입부로 이동될 수 있다. Alternatively, there is an immature cell inlet part separate from the supply part of the cell incubator, and the immature cells discharged through the cell outlet part of the cell separator may be transferred to the immature cell inlet part through the transfer pipe.

한편, 세포 배양기 또는 본 발명의 시스템은 세포 분리기로부터 세포 배양기로의 미성숙 세포의 재유입을 자동적 혹은 수동적으로 수행하기 위해 펌프를 포함할 수 있다.On the other hand, the cell culture device or the system of the present invention may include a pump to automatically or passively perform re-inflow of immature cells from the cell separator to the cell culture device.

다르게는, 상기 시스템은 원심분리 후 탈핵되지 않은 미성숙 적혈구계 세포의 추가의 성숙을 위한 별도의 세포 배양기를 추가로 포함할 수 있다. 적혈구의 체외 배양을 위해 초기에 세포 배양기로 공급되는 줄기세포, 조혈모세포, 적혈구 전구세포 등에 비해, 탈핵되지 않은 미성숙 적혈구계 세포는 추가의 배양 시간이 짧고, 적절한 배양 조건이 이들 초기 공급 세포와는 상이할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 시스템은 적혈구계 세포의 체외 배양을 위한 세포 배양기를 복수 개 포함할 수 있다. 즉, 초기에 공급되는 줄기세포, 조혈모세포, 적혈구 전구세포 등을 배양하는 세포 배양기를 제1 세포 배양기라 한다면, 미성숙 적혈구계 세포의 추가의 성숙을 위한 별도의 세포 배양기를 성숙도 별로 나누어 제2 세포 배양기, 제3 세포 배양기, 제4 세포 배양기라고 할 수 있다. 제2, 제3, 제4의 세포 배양기는 미성숙 적혈구계 세포를 세부적으로 분리하여 배양할 필요가 있는 경우 적절한 수로 둘 수 있다. 세포 분리기와 이들 세포 배양기는 무균적으로 연결해 주는 연결부에 의해 연결되어 있으며, 제2, 제3, 제4 세포 배양기는 제1 세포 배양기와 마찬가지로 세포 공급부(혹은 세포 유입부), 세포 배출부, 세포 배양액을 교반할 수 있는 교반기, 온도 및 산소 등의 배양 조건을 모니터링하는 장치 및 모니터링 결과에 따라 배양 조건을 제어 및 조절하는 장치, 산소 등의 공기를 유입시킬 수 있는 공기 유입부, 불필요한 공기를 배출하는 공기 배출부 등을 포함할 수 있다. Alternatively, the system may further include a separate cell incubator for further maturation of immature erythroid cells that have not been enucleated after centrifugation. Compared to stem cells, hematopoietic stem cells, and red blood cell progenitor cells, which are initially supplied to the cell incubator for in vitro cultivation of red blood cells, non-nucleated immature erythroid cells have a shorter additional culture time, and appropriate culture conditions are different from these initial supply cells. It can be different. Accordingly, the system according to the present invention may include a plurality of cell incubators for culturing red blood cells in vitro. That is, if the cell culture device that cultivates the initially supplied stem cells, hematopoietic stem cells, red blood cell progenitor cells, etc. is referred to as the first cell culture device, a separate cell culture device for further maturation of immature red blood cell cells is divided by maturity to the second cell. It can be referred to as an incubator, a third cell incubator, and a fourth cell incubator. The second, third, and fourth cell incubators may be placed in an appropriate number when it is necessary to separate and culture immature red blood cells in detail. The cell separator and these cell incubators are connected by a connection that connects them aseptically, and the second, third, and fourth cell incubators are similar to the first cell incubator, the cell supply unit (or cell inlet unit), the cell outlet unit, and the cell Agitator capable of stirring the culture medium, a device that monitors culture conditions such as temperature and oxygen, a device that controls and adjusts the culture conditions according to the monitoring results, an air inlet that can introduce air such as oxygen, and discharges unnecessary air It may include an air discharge unit and the like.

한편, 적혈구계 세포의 연속 배양 과정 중에 상기 배양된 적혈구계 세포의 일부는 원심분리 장치를 포함하는 세포 분리기로 이송된다. 상기 적혈구계 세포들을 세포 분리기 내에서 원심분리를 통해 적혈구계 세포들을 성숙도에 따라 분리된다.On the other hand, during the process of continuous culturing of red blood cell cells, some of the cultured red blood cell cells are transferred to a cell separator including a centrifugal separator. The red blood cell cells are separated according to maturity by centrifugation in a cell separator.

상기 세포 분리기는 세포 배양기로부터 보내진 세포를 받아들일 수 있는 세포 유입부를 포함한다. 또한, 세포 배양기로부터의 세포의 이동 또는 세포 분리기로부터 성숙 적혈구 저장부 또는 폐기물 저장부 등으로의 세포의 이동을 자동적으로 혹은 수동적으로 수행하기 위해 펌프를 포함할 수 있다. 세포 분리기의 세포 유입부와 세포 배출부, 원심분리 장치 등에는 유입 또는 배출되는 세포의 양 또는 부피 등을 감지하는 센서, 원심분리의 속도 등의 작동 조건을 감지하는 센서 등이 존재한다. 또한, 이들 센서의 작동에 의해 필요에 따라 세포 등의 유출입을 자동적으로 조절하는 개폐 장치 또는 밸브 등이 존재한다. 본 발명에 있어서, 센서나 자동 조절 개폐 장치 또는 밸브 등은 사용자가 조작부에 입력한 지시에 따라 혹은 미리 시스템에 입력된 소정의 조건에 따라 제어부에 의해 자동 또는 수동으로 조절된다.The cell separator includes a cell inlet unit capable of receiving cells sent from the cell incubator. In addition, a pump may be included to automatically or passively carry out the movement of cells from the cell incubator or from the cell separator to the mature red blood cell storage unit or waste storage unit. In the cell inlet, cell outlet, and centrifuge device of the cell separator, there are sensors that detect the amount or volume of cells that are introduced or discharged, and sensors that detect operating conditions such as the speed of centrifugation. In addition, there is an opening/closing device or valve that automatically controls the inflow and outflow of cells or the like as needed by the operation of these sensors. In the present invention, a sensor, an automatic adjustment opening/closing device, or a valve is automatically or manually adjusted by a control unit according to an instruction input by a user to an operation unit or a predetermined condition previously input to the system.

본 발명에 따른 적혈구 수거 시스템에서 사용되는 세포 분리기는 원심분리 장치를 포함한다. The cell separator used in the red blood cell collection system according to the present invention includes a centrifugal separator.

본 발명에서 사용되는 세포 분리기는 특별히 제한되지 않으나, 세포를 계속적으로 원심분리 장치로 유입시켜서 세포들을 분류시키면서 동시에 상층과 하층을 분리시켜 세포를 수거하는 과정이 자동적 그리고 연속적으로 이루어 질 수 있는 기기를 이용한다. The cell separator used in the present invention is not particularly limited, but a device capable of automatically and continuously collecting cells by separating the upper layer and the lower layer while simultaneously classifying the cells by continuously introducing the cells into the centrifuge device is provided. Use.

이러한 세포 분리기로는 예를 들어, 연속류 원심분리 성분채집 시스템(continuous-flow centrifugal apheresis system)일 수 있다. 상기 연속류 원심분리 성분채집 시스템은, 예컨대, 환자 치료용 혈액성분분리기(blood component separator) 혹은 혈장교환용 기기(Therapeutic Plasma Exchange System) 등의 용도로 활용되고 있다. 이러한 기기들은 본래 비교적 원심력만으로 분리가 용이한 말초혈액을 대상으로 개발된 것으로, 사람 혈관에서 전혈(whole blood)을 뽑아서 또는 이미 채취된 전혈을 원심분리기로 보내고 이를 원심분리하여 혈장, 백혈구층 혹은 성숙 적혈구를 분리하기 위해 만들어진 것이다. 종래에는 적혈구계 세포의 체외 배양이 연속적으로 이루어지고 있는 세포 배양기와 연속류 원심분리 성분 채집 시스템을 연결하여, 세포 배양을 유지하면서 동시에 성숙 적혈구를 수거하며, 적혈구계 세포의 배양, 분리, 및 성숙 적혈구의 수거가 닫힌 시스템(closed system) 내에서 수행하고자 한 적은 없었다.Such a cell separator may be, for example, a continuous-flow centrifugal apheresis system. The continuous flow centrifugal component collection system is used, for example, for a blood component separator for patient treatment or for a plasma exchange system (Therapeutic Plasma Exchange System). These devices were originally developed for peripheral blood that is relatively easy to separate with only a centrifugal force.Whole blood is drawn from human blood vessels or already collected whole blood is sent to a centrifuge and centrifuged to separate plasma, leukocyte layer or maturation. It is designed to separate red blood cells. Conventionally, by connecting a cell incubator in which erythrocyte-based cells are continuously cultured in vitro and a continuous flow centrifugation component collection system, the cell culture is maintained and mature red blood cells are collected at the same time, and the erythrocyte-based cells are cultured, separated, and matured. There has never been an attempt to perform red blood cell collection in a closed system.

원심분리 장치는 회전하는 로터(rotor), 로터와 연결된 회전 디스크, 회전 디스크에 수용되는 원심분리 처리 챔버 등을 포함한다. 세포 배양기로부터 이동한 적혈구계 세포들은 세포 분리기의 원심분리 장치 내 원심분리 처리 챔버로 보내지며, 혈액 세포의 성숙도에 따라 밀도가 다르기 때문에 원심분리 후에는 성숙도에 따른 세포 집단과 세포 잔해물로 세포층이 분리된다. 예를 들어, 세포 집단들이 위치하는 층들 중 하층에는 가장 무거운 세포인 탈핵 적혈구가 배치되며 상층에 유핵 세포가 배치되게 된다.The centrifugal separation device includes a rotating rotor, a rotating disk connected to the rotor, a centrifugal processing chamber accommodated in the rotating disk, and the like. The red blood cells transferred from the cell incubator are sent to the centrifugation chamber in the centrifuge device of the cell separator, and the density varies according to the maturity of the blood cells, so after centrifugation, the cell layer is separated into cell populations and cell debris according to the maturity level. do. For example, among the layers in which cell populations are located, enucleated red blood cells, which are the heaviest cells, are arranged in the lower layer, and nucleated cells are arranged in the upper layer.

또한, 상기 세포 분리기는 원심분리 후 다층으로 분리된 세포들을 배출하는 세포 배출부를 포함한다. In addition, the cell separator includes a cell discharge unit for discharging cells separated into multiple layers after centrifugation.

세포 분리기에서, 세포 배출부는 하나 또는 복수로 구비될 수 있다. 세포 배출부에는 배출을 원하는 세포층을 이동시키기 용이하도록 튜브 또는 파이프가 연결되어 있을 수 있다. In the cell separator, one or a plurality of cell outlets may be provided. A tube or pipe may be connected to the cell discharge part to facilitate movement of the cell layer desired to be discharged.

세포 배출부가 복수 개일 경우, 예를 들어, 탈핵되지 않은 미성숙 세포를 다시 본래의 세포 배양기(제1 세포 배양기) 또는 추가의 성숙 배양을 위한 세포 배양기(제2, 제3의 세포 배양기)로 보낼 수 있는 미성숙 세포 배출부, 성숙 적혈구를 성숙 적혈구 저장부(별도의 저장 용기나 혈액백)로 이동시킬 수 있는 성숙 세포 배출부, 세포 잔해물과 대식세포 등을 폐기 공간으로 이동시킬 수 있는 폐기물 세포 배출부를 포함할 수 있다. 이 경우 복수 개의 세포 배출부는 상기 세포 배양기, 성숙 적혈구 저장부, 폐기물 저장부 등과 연결부를 통해 연결되어 있을 수 있다. In the case of a plurality of cell outlets, for example, immature cells that have not been enucleated can be sent back to the original cell incubator (first cell incubator) or a cell incubator for further maturation culture (second, third cell incubator). A discharge part for immature cells that can be used, a discharge part for mature cells that can move mature red blood cells to a storage part for mature red blood cells (separate storage container or blood bag), and a waste cell discharge part for moving cell debris and macrophages to the disposal space. Can include. In this case, the plurality of cell discharge units may be connected through a connection unit such as the cell culture unit, the mature red blood cell storage unit, and the waste storage unit.

다르게는, 세포 배출부는 하나이되 시간차를 두고 순차적으로 분리하거나 제1, 제2 또는 제3의 세포 배양기, 또는 성숙 적혈구 저장부, 또는 폐기물 저장부와 연결되는 복수 개의 배관 라인을 통해 선별적으로 분리하여, 배출하는 것도 가능하다. 또한, 이러한 세포 배출을 자동적 혹은 수동적으로 수행하기 위해 펌프를 포함할 수 있다. Alternatively, the cell discharge unit is one, but is sequentially separated at a time difference, or selectively separated through a plurality of piping lines connected to the first, second or third cell incubator, the mature red blood cell storage unit, or the waste storage unit. Thus, it is also possible to discharge. In addition, a pump may be included to automatically or manually perform such cell excretion.

일 구체예에서, 탈핵되지 않은 미성숙 세포를 세포 분리 전에 배양되던 본래의 세포 배양기('제1 세포 배양기'라고도 한다)로 돌려보내지 않고, 미성숙 세포의 추가의 성숙을 위한 별도의 세포 배양기('제2 세포 배양기'라고 한다)로 보낼 수 있다. In one embodiment, the non-nucleated immature cells are not returned to the original cell incubator (also referred to as the'first cell incubator') that was cultured prior to cell isolation, but a separate cell incubator for further maturation of the immature cells (' 2 It can be sent to a cell incubator).

즉, 본 발명에 있어서 세포 배양기는 복수 개로 존재할 수 있으며, 세포 배양에 따른 세포의 성숙 상태에 따라, 제2, 제3, 제4 등의 세포 배양기를 둘 수 있다. 제1 배양기와 세포 분리기가 연결부를 통해 연결되어 있는 것처럼, 제2, 제3, 제4의 세포 배양기 또한 세포 분리기와 연결부를 통해 무균적으로 연결된다. That is, in the present invention, there may be a plurality of cell incubators, and according to the maturation state of the cells according to the cell culture, second, third, fourth, etc. cell incubators may be provided. Just as the first incubator and the cell separator are connected through the connecting portion, the second, third, and fourth cell incubators are aseptically connected to the cell separator through the connecting portion.

세포의 성숙 단계에 따라 교반 속도, 온도 조건, 산소 농도 등의 배양 조건, 배양 배지는 모두 달리 적용될 수 있으며, 세포 성숙 단계에 따른 이들 조건은 당업자에 의해 적절히 변경될 수 있다. Depending on the maturation stage of the cells, culture conditions such as agitation speed, temperature conditions, oxygen concentration, etc., and culture media may all be differently applied, and these conditions according to the cell maturation stage may be appropriately changed by those skilled in the art.

또한 세포들을 원심분리 장치로 이동시킬 때 소정의 밀도를 갖는 하나 또는 복수개의 밀도 구배 시약을 추가하게 되면, 원심분리되면서 밀도구배에 의해 이질적인 세포들이 미성숙 적혈구계 세포, 탈핵된 망상적혈구, 성숙 적혈구 등의 성숙 단계별 세포 집단과 세포잔해물(debris) 등으로 분리되어, 이들 각각은 서로 다른 여러 개의 층에 위치하게 되어 더 정밀한 분리도 가능하다.In addition, when one or more density gradient reagents having a predetermined density are added when moving the cells to the centrifuge device, the heterogeneous cells by the density gradient are centrifuged, and the heterogeneous cells are immature red blood cells, enucleated reticulocytes, mature red blood cells, etc. It is separated into cell populations and debris at each stage of maturation, and each of them is located in several different layers, enabling more precise separation.

이처럼 세포층의 정밀한 세분화가 필요할 경우에는 Ficoll (Ficoll-Hypaque plus, Sigma)나 Percoll 시약을 이용해 밀도 구배(density gradient)법에 따라 적혈구 전구세포와 탈핵 적혈구/ 적혈구 층을 더 정확하게 분리할 수 있다. When precise subdivision of the cell layer is required, using Ficoll (Ficoll-Hypaque plus, Sigma) or Percoll reagent according to the density gradient method, the red blood cell progenitor cells and the enucleated red blood cell/red blood cell layer can be more accurately separated.

이에 제한되는 것은 아니나, 1회의 원심분리에 하나 또는 복수개의 밀도 구배 시약을 사용할 수 있으며, 이러한 원심분리 단계는 1회 이상 수행될 수 있다. Although not limited thereto, one or a plurality of density gradient reagents may be used for one centrifugation, and such a centrifugation step may be performed one or more times.

예를 들어, 본 발명의 한 구체예에서, 밀도 구배 시약을 이용한 원심분리 단계는 다양한 밀도 구배 시약을 이용하여 한번의 원심분리를 통해 세포들을 분리할 수 있다. 본 발명의 다른 구체예에서, 밀도 구배 시약을 이용한 원심분리 단계는 단계적으로 수행될 수도 있다. 예를 들어, Ficoll을 사용후 Percoll을 이용하여 원심분리하던가, 적혈구의 성숙 정도에 따라 일부 층만 분리한 후, 추가적으로 밀도 구배 시약을 이용하여 더 미세하게 세포들을 분리할 수도 있다. For example, in one embodiment of the present invention, the centrifugation step using a density gradient reagent may separate cells through a single centrifugation using various density gradient reagents. In another embodiment of the present invention, the centrifugation step using a density gradient reagent may be performed stepwise. For example, after using Ficoll, centrifugation using Percoll, or after separating only some layers according to the maturity of red blood cells, cells may be further finely separated using a density gradient reagent.

본 발명에서 밀도구배법을 적용하기 위해 사용할 수 있는 구동용액으로는 밀도구배를 위해 사용되고 있는 통상의 구동용액이면 어떠한 것이든 사용가능하며, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 밀도구배를 위한 구동용액으로는 다음과 같은 것을 사용할 수 있다. As the driving solution that can be used to apply the density gradient method in the present invention, any driving solution used for the density gradient may be used, and is not particularly limited. For example, the following can be used as a driving solution for the density gradient.

1) Percoll: a specific gravity 1.130 g/ml1) Percoll: a specific gravity 1.130 g/ml

2) Ficoll-Hypaque is a mixture of Ficoll (polysucrose) and Hypaque (sodium diatrizoate).　Ficoll-Hypaque Plus Product No. 10771 is a mixture of polysucrose and sodium diatrizoate at a density of 1.077 g/ml. 2) Ficoll-Hypaque is a mixture of Ficoll (polysucrose) and Hypaque (sodium diatrizoate). Ficoll-Hypaque Plus Product No. 10771 is a mixture of polysucrose and sodium diatrizoate at a density of 1.077 g/ml.

3) Histopaque-1077 is a sterile, endotoxin tested solution of polysucrose and sodium diatrizoate, adjusted to a density of 1.077g/mL. 3) Histopaque-1077 is a sterile, endotoxin tested solution of polysucrose and sodium diatrizoate, adjusted to a density of 1.077g/mL.

혈액 세포들의 밀도는 잘 알려져 있으므로 당업자라면 밀도 구배를 설정하기 위해, 각기 종류가 다른 용액들을 조합하여 다양한 밀도 구배를 설정할 수도 있고, 다르게는 한 종류의 용액을 다양한 농도로 희석하여 원하는 세포 분리에 적합하도록 다양한 밀도 구배를 설정할 수 있다.Since the density of blood cells is well known, those skilled in the art can set various density gradients by combining different types of solutions to set the density gradient, or alternatively, dilute one type of solution to various concentrations to set the desired cell separation. You can set various density gradients to do so.

예를 들어, 비중이 1.090 보다 가벼우면 (비중 <1.090) 성숙적혈구 외의 유핵적혈구와 다른 계열 세포들(leukocytes)가 분리되며, 비중이 1.090보다 무거우면 (>1.090) 적혈구가 거의 순수하게 분리된다. 적혈구층에 일부 섞일 수 있는 과립구 (중성구, neutrophil; 호산구, eosinophils)는 백혈구제거필터(leukoreducing filter)를 이용하면 99.9% 이상 제거되므로, 최종적으로 순도 높은 적혈구를 수거(harvest)할 수 있다.For example, when the specific gravity is lighter than 1.090 (specific gravity <1.090), nucleated red blood cells other than mature red blood cells and other leukocytes are separated, and when the specific gravity is more than 1.090 (>1.090), red blood cells are almost purely separated. Granulocytes (neutrophils; eosinophils), which may be partially mixed in the red blood cell layer, are removed by more than 99.9% by using a leukoreducing filter, and thus, finally, high-purity red blood cells can be harvested.

혼합되어 있는 세포 종류에 따라 밀도구배를 이용한 원심분리 단계는 1회 이상 수행될 수 있으며, 이 때 사용되는 구동 용액을 달리 설정할 수 있다. 예를 들어, 적혈구계 세포(erythroid cell)가 아닌 다른 lineage의 세포들, 예컨대, 백혈구 (예를 들어 과립구, 단핵구(monocyte), 대식세포(macrophages))가 세포 배양물 내에 다량으로 섞여 있는 경우, Ficoll-Hypaque를 처리하고 원심분리하여 먼저 leukocyte 를 분리 후 percoll을 처리하여 원심분리하여 적혈구계 세포들을 재분리하는 과정을 수행하거나, 한번에 여러 밀도 구배를 갖는 구동용액들을 사용하여 원심분리할 수도 있다. Depending on the type of mixed cells, the centrifugation step using a density gradient may be performed more than once, and the driving solution used at this time may be set differently. For example, when cells of a lineage other than erythroid cells, such as leukocytes (eg granulocytes, monocytes, macrophages) are mixed in a large amount in the cell culture, Ficoll-Hypaque is treated and centrifuged to separate leukocytes first, then percoll is treated and centrifuged to re-separate erythroid cells, or centrifugation may be performed using driving solutions having several density gradients at once.

한편, 본 발명에 따른 세포 분리기는 여러 층으로 분리될 수 있는 세포 집단과 세포 잔해물들을 분리 및 수거할 수 있도록 해 준다. On the other hand, the cell separator according to the present invention makes it possible to separate and collect cell populations and cell debris that can be separated into several layers.

원심분리에 의해 분리된 각각의 층 내에서 원하는 세포들만을 분리, 수거하는 기술은 잘 알려져 있으며, 특정 기술에 국한되지 않는다. 예를 들어, 세포 분리기의 세포 배출부에 연결된 튜브의 길이나 세포 배출부의 위치 차이를 이용하여 각각의 층으로부터 원심분리되고 있는 세포들을 각 튜브(배관)을 통해원하는 곳으로 보낼 수도 있고, 원심분리된 층들을 차례대로 올려 보내거나 내려 보내면서 순서대로 나오는 것을 분리할 수도 있다. 또한, 각각의 층의 색을 인지하여 원하는 층만 분리해 낼 수도 있다. 세포 분리기는 이러한 기술을 구현하기 위한 제어부 및 조작부를 포함한다. 예를 들어, 세포 분리기의 원심분리 장치의 세포 배출부와 인접한 곳에 자동적 혹은 사람이 입력한 비율이나 배출 배관 내 용액 색상에 따라 원심분리된 세포층의 일부분이 자동적으로 연결부를 통해 배출될 수 있도록 해 주는 센서가 구비될 수 있다. Techniques for separating and collecting only desired cells in each layer separated by centrifugation are well known, and are not limited to a specific technique. For example, by using the length of the tube connected to the cell outlet of the cell separator or the difference in the location of the cell outlet, the cells being centrifuged from each layer can be sent to a desired location through each tube (pipe). You can separate the ones that come out in order by sending them up or down one after another. In addition, it is possible to recognize the color of each layer and separate only the desired layer. The cell separator includes a control unit and an operation unit for implementing this technology. For example, a part of the centrifuged cell layer can be automatically discharged through the connection part in the vicinity of the cell discharge part of the centrifugal separator of the cell separator according to the ratio automatically or human input or the color of the solution in the discharge pipe. A sensor may be provided.

예컨대, 상기 센서는 세포 배출부와 연결될 배출 배관을 통해 배출되는 적혈구계 세포들을 포함하는 용액의 부피 또는 색상을 감지하는 센서일 수 있다. 일예로, 광학 센서는 원심분리된 세포들이 배출되는 세포 배출부와 연결된 배출 배관 색상을 감지하고, 이러한 색상 정보를 제어부로 보낸다. 제어부는 배출 배관의 색상 정보에 따라 복수 개의 이송 배관 중 색상 정보와 매치되는 이송 배관을 세포 분리기의 세포 배출부와 연결시킨다. 이러한 이송 배관의 이동은 제어부와 연결된 모터에 의해 구동될 수 있다. 또한, 상기 배출 배관 또는 이송 배관은 제어부에 의해 자동적으로 제어가능한 밸브를 통해 열리거나 차단될 수 있다. For example, the sensor may be a sensor that detects the volume or color of a solution containing red blood cells discharged through a discharge pipe to be connected to the cell discharge unit. For example, the optical sensor detects the color of the discharge pipe connected to the cell discharge part from which the centrifuged cells are discharged, and sends the color information to the control unit. The control unit connects the transfer pipe matching the color information among the plurality of transfer pipes to the cell discharge unit of the cell separator according to the color information of the discharge pipe. The movement of the transfer pipe may be driven by a motor connected to the control unit. In addition, the discharge pipe or the transfer pipe may be opened or blocked through a valve that can be automatically controlled by a control unit.

하기 실시예에서 사용된 'TERUMO BCT spectra Optia Asheresis System'는 원심분리된 각각의 층의 색을 인지하여 각 층에 포함된 성분을 분리해 주는 기능을 갖고 있다. The'TERUMO BCT spectra Optia Asheresis System' used in the following examples has a function of separating components contained in each layer by recognizing the color of each layer centrifuged.

본 발명의 적혈구 수거 시스템은 최종적으로 수거해야 하는 대상인 탈핵 적혈구계 세포, 즉 탈핵 망상세포 및 적혈구는 정제, 농축 및 보관을 위해 따로 성숙 적혈구 저장부로 이동시키고, 여러 층 중 세포잔해물이나 백혈구와 같은 다른 계열(lineage)의 세포는 폐기를 위해 폐기물 저장부로 이동시키고, 미성숙 적혈구계 세포들을 다시 본래의 세포 배양기로 돌려보내거나 제2, 제3 등의 추가의 세포 배양기로 보내 배양을 계속할 수 있다. 이렇게 되면, 탈핵 적혈구계 세포를 최종 수거 공간(성숙 적혈구 저장부)으로 보내 신속히 분리함으로써, 탈핵 적혈구를 위한 배양 조건에서 별도 저장할 수 있어 체외 배양 적혈구의 최종 수득률을 높일 수 있다. In the red blood cell collection system of the present invention, enucleated red blood cells, that is, enucleated reticulocytes and red blood cells, which are objects to be finally collected, are separately moved to a mature red blood cell storage unit for purification, concentration, and storage, and other layers such as cell debris or leukocytes Cells of the lineage may be moved to a waste storage for disposal, and the immature red blood cells may be returned to the original cell incubator or sent to an additional cell incubator such as a second, third, etc. to continue culture. In this case, the enucleated red blood cells are sent to the final collection space (mature red blood cell storage unit) for rapid separation, so that they can be separately stored under the culture conditions for the enucleated red blood cells, thereby increasing the final yield of in vitro cultured red blood cells.

성숙 적혈구 저장부는 용기 또는 혈액백일 수 있다. 탈핵 적혈구계 세포의 집단으로부터 백혈구 등의 추가의 세포 분리가 필요한 경우에는 용기 형태의 성숙 적혈구 저장부에 일단 저장한 후 다시 백혈구 필터 등을 이용하여 최종 정제 산물을 얻을 수 있다. 만일 탈핵 적혈구계 세포 집단의 순도가 높아 추가의 세포 분리가 불필요하다면 성숙 적혈구 저장부로서 혈액백을 사용할 수 있다. 성숙 적혈구를 수용하는 혈액백은 무균 연결장치 또는 무균 연결부를 통해 세포 분리기의 세포 배출부와 연결된다. 상기 혈액백은 사전에 항응고보존제가 충전되어 있을 수 있다. The mature red blood cell reservoir may be a container or a blood bag. When it is necessary to separate additional cells such as leukocytes from the population of enucleated red blood cells, the final purified product can be obtained by once stored in a container-type mature red blood cell storage unit and then again using a leukocyte filter. If the purity of the enucleated red blood cell population is high and additional cell separation is not necessary, a blood bag can be used as a storage unit for mature red blood cells. The blood bag containing mature red blood cells is connected to the cell outlet of the cell separator through a sterile connector or a sterile connector. The blood bag may be filled with an anticoagulant preservative in advance.

본 발명에 따른 적혈구 수거 시스템은 앞서 설명한 세포 배양기와 세포 분리기 등의 본 발명의 시스템 내의 각 부를 연결해 주는 연결부를 포함한다. 앞서 설명한 배출 배관 또는 이송 배관 또한 이러한 연결부에 포함되는 개념이다. The red blood cell collection system according to the present invention includes a connection part for connecting each part in the system of the present invention, such as a cell culture device and a cell separator described above. The above-described discharge pipe or transfer pipe is also a concept included in this connection.

본 발명에 따른 적혈구 수거 시스템에서 상기 연결부의 형태는 특별히 제한되지 않는다. 튜브 또는 파이프와 같은 형태일 수도 있고, 튜브와 튜브 사이에 연결 장치가 포함되어 있어도 무방하다. 연속류 원심분리 성분채집 시스템과 같은 종래의 기술에서 이미 이용되고 있는, 각 튜브를 무균적으로 연결해 주는 SCD (sterile connecting device)를 사용할 수도 있다. 도 1은 세포 배양기의 세포 배출부에 연결된 튜브와 세포 분리기의 세포 유입부에 연결된 튜브를 무균 연결 장치로 연결한 시스템을 도시하였다. In the red blood cell collection system according to the present invention, the shape of the connecting portion is not particularly limited. It may be in the form of a tube or a pipe, or a connection device may be included between the tube and the tube. It is also possible to use a stereo connecting device (SCD) that aseptically connects each tube, which is already used in conventional techniques such as continuous flow centrifugation component collection systems. 1 illustrates a system in which a tube connected to a cell outlet of a cell incubator and a tube connected to a cell inlet of a cell separator are connected by a sterile connection device.

앞서 설명한 바와 같이, 세포 배양기와 세포 분리기를 무균적으로 연결하여, 닫힌 시스템 내에서 유핵 적혈구와 탈핵 적혈구를 구분하는 것은 체외 배양 적혈구의 임상 적용을 위해 매우 중요한 의미를 갖는다. 추가로, 본 발명에 따른 시스템 및 방법은 상기 분리된 탈핵 적혈구계 세포를 다시 탈핵 망상세포와 적혈구로 분리하는 것을 포함할 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 탈핵 망상세포와 적혈구가 높은 순도로 존재하는 세포 배양물의 경우에는 밀도구배 시약을 사용하지 않고도 원심분리를 수행하면 상대적으로 가벼운 탈핵 망상세포를 순도는 높지 않지만 대략적으로 분리해 낼 수 있다. 이 경우 적혈구는 바로 냉장온도에 저장할 수 있는 저장공간으로 이동시키고, 탈핵 망상세포는 추가 성숙 공정을 위한 공간으로 이동시켜 별도로 성숙시키는 과정을 자동, 연속적으로 구현할 수 있다. As described above, the separation of nucleated red blood cells and enucleated red blood cells in a closed system by asepticly connecting the cell culture device and the cell separator has very important implications for clinical application of in vitro cultured red blood cells. Additionally, the system and method according to the present invention may include separating the separated enucleated erythroid cells into enucleated reticulocytes and red blood cells again. Although not limited thereto, in the case of cell cultures in which enucleated reticulocytes and red blood cells are present in high purity, centrifugation without the use of a density gradient reagent can separate relatively light enucleated reticulocytes, although the purity is not high. I can. In this case, the red blood cells are immediately moved to a storage space that can be stored at a refrigerated temperature, and the enucleated reticulocytes are moved to a space for an additional maturation process, so that the process of maturing separately can be implemented automatically and continuously.

본 발명의 적혈구의 수거를 위한 시스템 및 방법에 따라, 세포 배양을 유지하는 중에 먼저 생산되어 나오는 탈핵 적혈구계 세포를 분리하게 되면, 탈핵 적혈구계에 적합한 배양/저장 조건의 제공에 의해 적혈구의 생존율을 높일 수 있을 뿐만 아니라, 연속 배양 공정 중에 탈핵 적혈구계 세포를 배양기로부터 분리해 냄으로써, 배지 및 배양 공간의 효율성을 꾀할 수 있게 된다. 또한, 세포 배양기와 세포 분리기가 연결부를 통해 연결된 닫힌 시스템 내에서 적혈구의 수거가 가능하기 때문에, 오염이나 감염 없이 최종 생산물을 임상에 이용할 수 있게 한다. 따라서, 본 발명에 따른 적혈구의 수거를 위한 시스템 및 방법은 체외 배양 적혈구의 최종 수득률을 높이며 안전성을 보장해 사람에게 투여할 수 있는 시스템을 제공한다. According to the system and method for the collection of red blood cells of the present invention, if the enucleated erythroid cells produced first are separated while maintaining the cell culture, the survival rate of red blood cells is improved by providing culture/storage conditions suitable for the enucleated erythrocyte system. In addition to being able to increase, the efficiency of the medium and the culture space can be achieved by separating the enucleated erythroid cells from the incubator during the continuous culture process. In addition, since it is possible to collect red blood cells in a closed system in which the cell incubator and the cell separator are connected through a connection part, the final product can be used clinically without contamination or infection. Accordingly, the system and method for the collection of red blood cells according to the present invention provides a system that can be administered to humans by increasing the final yield of red blood cells cultured in vitro and ensuring safety.

도 1는 본 발명에 따른 적혈구의 수거를 위한 시스템 및 방법을 예시적으로 도시한 도면이다.
도 2는 각각 다른 케이스의 적혈구계 세포 배양시 Wright-Giemsa 염색을 한 결과를 보여주는 사진으로, 각 케이스마다 다른 비율로 미성숙 적혈구계 세포들과 탈핵된 적혈구 세포가 섞여 있음을 보여준다.
도 3 내지 6 은 분리 전 섞여 있는 세포들의 종류별로 밀도구배 및 원심분리 후의 다층 분리된 세포들을 분리 및 수거하는 과정 및 세포가 분리된 결과를 보여주는 사진이다.
도 7는 구동용액을 이용한 세포 분리 후 세포 안전성 확인한 결과를 보여준다.
도 8 및 도 9는 구배용액을 이용한 세포주와 적혈구계 세포의 분리 결과를 보여주는 사진이다.
도 10은 교반강도의 조절을 통한 적혈구계 세포의 분리가 가능함을 보여주는 결과이다.
도 11 및 12는 연속류 원심분리 성분채집 시스템의 하나인 'spectra optia apheresis system'을 본 발명에 따른 적혈구 수거 시스템에 적용하여 실험의 개략도와 실험 결과를 보여준다.1 is a diagram illustrating an exemplary system and method for collecting red blood cells according to the present invention.
FIG. 2 is a photograph showing the results of Wright-Giemsa staining during cultivation of red blood cell cells in different cases, and shows that immature red blood cell cells and enucleated red blood cells are mixed in different ratios for each case.
3 to 6 are photographs showing a process of separating and collecting multilayered cells after a density gradient and centrifugation for each type of mixed cells before separation, and a result of separating cells.
7 shows the results of cell safety confirmation after cell separation using a driving solution.
8 and 9 are photographs showing the separation results of cell lines and red blood cells using a gradient solution.
10 is a result showing that separation of red blood cell cells is possible through the control of the agitation intensity.
11 and 12 show schematic and experimental results by applying the'spectra optia apheresis system', which is one of the continuous flow centrifugal component collection systems, to the red blood cell collection system according to the present invention.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.Advantages and features of the present invention, and a method of achieving them will become apparent with reference to embodiments described below in detail. However, the present invention is not limited to the embodiments disclosed below, but will be implemented in a variety of different forms, only the present embodiments are intended to complete the disclosure of the present invention, and the general knowledge in the technical field to which the present invention pertains. It is provided to completely inform the scope of the invention to those who have it, and the invention is only defined by the scope of the claims.

[실시예] [Example]

[실시예 1] 본 발명에 따른 적혈구의 수거를 위한 시스템 및 방법[Example 1] System and method for collection of red blood cells according to the present invention

도 1은 본 발명에 따른 적혈구의 수거를 위한 시스템 및 방법을 개략한 도면이다. 본 발명의 시스템은 세포 배양 공간, 예컨대, 바이오리액터와 원심분리기기가 무균적으로 하나의 tubing으로 연결되어 있다. 도 1 및 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 배양 중인 세포 집단에는 미성숙 적혈구계 세포, 탈핵된 망상적혈구 및 성숙 적혈구들이 섞여 있다. 본 발명은 세포 배양 공간 내에 존재하는 이러한 이질적인 세포 집단의 일부 세포를 연속적인 배양 과정 중에 자동 또는 반자동적으로 세포 분리기로 보내고, 세포 분리기를 통해 이들 세포들을 다양한 밀도 차이를 이용하여 다층으로 분리하는 기술을 제시한다. 세포 배양 공간에서 이동한 세포들은 세포 분리기 내의 원심분리 장치 안으로 보내지며, 원심분리 결과 하층에 가장 무거운 세포인 성숙 적혈구가 배치되며 상층에 유핵세포가 배치되게 된다. 이들은 이 기기에서 자동/반자동으로 상층 세포를 다시 배양기로 돌려보내게 되며 하층은 최종적으로 성숙 적혈구 저장부(적혈구 채집백)으로 보내지게 된다. 1 is a schematic diagram of a system and method for collecting red blood cells according to the present invention. In the system of the present invention, a cell culture space, for example, a bioreactor and a centrifuge device are aseptically connected by one tubing. As can be seen in FIGS. 1 and 2, immature red blood cells, enucleated reticulocytes, and mature red blood cells are mixed in the cell population in culture. The present invention is a technology for automatically or semi-automatically sending some cells of this heterogeneous cell population present in the cell culture space to a cell separator during a continuous culture process, and separating these cells into multiple layers using various density differences through the cell separator. Present. Cells that have moved from the cell culture space are sent into a centrifuge device in the cell separator. As a result of centrifugation, mature red blood cells, the heaviest cells, are placed in the lower layer, and nucleated cells are placed in the upper layer. They automatically/semi-automatically return the upper layer cells back to the incubator, and the lower layer is finally sent to the mature red blood cell storage unit (erythrocyte collection bag).

[실시예 2] 체외 배양 중인 적혈구계 세포 내의 이질적 세포 집단 확인[Example 2] Identification of heterogeneous cell populations in red blood cell cells in vitro culture

각각 다른 샘플의 제대혈로부터 CD34+ 세포를 분리하여 무혈청 배양 배지에서 적혈구로 성숙시키며 배양시켰다. 도 2은 이렇게 체외 배양한 적혈구계 세포에 대해 Wright-Giemsa 염색한 결과를 보여주는 사진으로, 매 배양 시마다 다양한 정도로 구성되는 적혈구계 세포들의 분포를 보여준다. 세포가 클수록 미성숙한 적혈구임을 나타내며, 빨간 화살표는 탈핵한 적혈구를 나타낸다.CD34+ cells were isolated from umbilical cord blood of each of the different samples, and cultured to mature red blood cells in a serum-free culture medium. FIG. 2 is a photograph showing the result of Wright-Giemsa staining for the erythrocyte-based cells cultured in vitro, and shows the distribution of erythrocyte-based cells composed of varying degrees for each culture. Larger cells indicate immature red blood cells, and red arrows indicate enucleated red blood cells.

[실시예 3] 구배용액을 이용한 세분화된 적혈구계 세포의 분리 1[Example 3] Isolation of granular red blood cells using a gradient solution 1

70% isotonic Percoll, 45% isotonic Percoll을 아래 표와 같이 준비한다.Prepare 70% isotonic Percoll and 45% isotonic Percoll as shown in the table below.

Figure 112018129233362-pat00001
Figure 112018129233362-pat00001

Isotonic percoll : 원액 100% Percpll과 10X PBS를 9:1 비율로 혼합PBS (phosphate buffered saline)Isotonic percoll: Mixture of 100% Percpll and 10X PBS in a ratio of 9:1 PBS (phosphate buffered saline)

도 3은 적혈구계 세포 배양 중 두 가지 구배용액을 이용한 세분화된 세포 분리 예를 보여준다. 제대혈 조혈모세포(CD34+ cell)를 약 8일간 배양하면 거의 균일한 호염기성 적아구(basophilic erythroblast)가 되고(A), 이를 일주일 더 배양하면 다염성 적아구(polychromatic erythroblast)와 탈핵 직전 유핵세포인 정염성 적아구(orthochromatic erythroblast)가 대부분을 차지하게 된다(B). 이를 70% Percoll과 45% Percoll 두 가지 비중의 구동용액 위에 얹은 후(C) 원심분리하면(D) 상층(top)에 하얀색의 죽은 세포(debris) 혹은 대식세포가 분리되고(E), 빨간색 중간(middle) 층에 미성숙 적혈구계세포가 분리되며(F), 제일 하층(bottom)에 정염성 적아구가 90% 넘는 순도로 분리된다(G). 도 3에서 세포 사진은 Wright-Giemsa 염색 사진을 나타낸다. 3 shows an example of subdivided cell separation using two gradient solutions in erythrocyte-based cell culture. When umbilical cord blood hematopoietic stem cells (CD34+ cells) are cultured for about 8 days, they become almost uniform basophilic erythroblasts (A), and when they are cultured for another week, polychromatic erythroblasts and the nucleated cells immediately before enucleation Orthochromatic erythroblast occupies the majority (B). It is placed on a driving solution with two specific gravity of 70% Percoll and 45% Percoll (C) and centrifuged (D) to separate white dead cells (debris) or macrophages on the top layer (E), and red middle Immature red blood cells are separated in the (middle) layer (F), and infectious red blasts are separated with a purity of more than 90% in the bottom layer (G). In Figure 3, the cell picture shows the Wright-Giemsa staining picture.

[실시예 4] 구배용액을 이용한 세분화된 적혈구계 세포의 분리 2[Example 4] Isolation 2 of granular red blood cell cells using a gradient solution

70% isotonic Percoll, 45% isotonic Percoll을 아래 표와 같이 준비한다.Prepare 70% isotonic Percoll and 45% isotonic Percoll as shown in the table below.

Figure 112018129233362-pat00002
Figure 112018129233362-pat00002

Isotonic percoll : 원액 100% Percpll과 10X PBS를 9:1 비율로 혼합PBS (phosphate buffered saline)Isotonic percoll: Mixture of 100% Percpll and 10X PBS in a ratio of 9:1 PBS (phosphate buffered saline)

제대혈 CD34+ cell로부터 약 8일간 배양하면 거의 균일한 basophilic erythroblast가 되고(도 4A), 이를 일주일 더 배양한 세포 혼합물(도 4B) 을 기본배지(IMDM) 3ml 에 넣고 70% isotonic Percoll 3ml 위에, 45% isotonic Percoll 3ml을 얹고 세포 혼합물을 맨 위에 올린다. 이것을 1200 g에서 원심분리를 15분간 수행하였다. 그 결과, 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 밀도구배에 의해 다층으로 분리된 세포들을 얻을 수 있었다. 40% Percoll 용액 윗층에는 죽은 세포들과 찌꺼기 및 대식세포가 분리되었으며(도 4C), 40%와 70% Percoll 중간층에는 일부 미성숙세포가 분리되었다(도 4D). 70% isotonic Percoll (0.791 g/ml) 아랫층에는 polychromatic- 또는 orthochromatic- erythroblast (탈핵 전 유핵적혈구)가 분리된다. 도 4E는 정염성 적아구의 모습을 나타낸 사진으로, 95% 이상의 순도로 수득되었으며 생존도도 99.4%였다. 분리 전 세포구성에 따라 각 원심분리 조건은 유동적으로 적용시킬 수 있다. When cultured from umbilical cord blood CD34+ cells for about 8 days, it becomes almost uniform basophilic erythroblast (FIG. 4A), and the cell mixture (FIG. 4B) cultured for another week was added to 3 ml of basic medium (IMDM) and 70% isotonic Percoll 3 ml, 45% Add 3 ml of isotonic Percoll and place the cell mixture on top. This was centrifuged at 1200 g for 15 minutes. As a result, as can be seen in Figure 4, it was possible to obtain the cells separated into multiple layers by the density gradient. Dead cells, debris, and macrophages were separated in the upper layer of 40% Percoll solution (FIG. 4C), and some immature cells were separated in the intermediate layer of 40% and 70% Percoll (FIG. 4D). In the lower layer of 70% isotonic Percoll (0.791 g/ml), polychromatic- or orthochromatic-erythroblasts (nuclear red blood cells before enucleation) are isolated. FIG. 4E is a photograph showing the appearance of an infectious red bud, and was obtained with a purity of 95% or more, and the survival rate was 99.4%. Each centrifugation condition can be flexibly applied depending on the cell composition before separation.

유핵적혈구는 media flow (agitation, pipetting, stirring) 등의 자극이 필요하므로, 이들을 따로 교반 탱크형 생물반응기(stirred tank bioreactor) 등으로 보내어 탈핵시킬 수 있다. Since nucleated red blood cells require stimulation such as media flow (agitation, pipetting, stirring), they can be denuclearized by sending them separately to a stirred tank bioreactor.

[실시예 5] 구배용액을 이용한 세분화된 적혈구계 세포의 분리 3[Example 5] Isolation 3 of granular red blood cells using a gradient solution

도 5는 미성숙 세포가 많은 세포 혼합물로부터 구배용액을 이용하여 분리한 예를 보여준다.5 shows an example of separation from a cell mixture containing many immature cells using a gradient solution.

도 4와 같은 방법으로 미성숙세포가 좀 더 많은 세포혼합물을 구배용액을 통해 분리시, 중간 층에는 호염기성 적아구 및 다염색성 적아구가 주로 분리되고(왼쪽 사진), 하단에는 오른쪽 사진의 정염성 적아구가 분리됨을 알 수 있다.When separating the cell mixture with more immature cells through the gradient solution in the same manner as in FIG. 4, basophilic red blasts and polystained red blasts are mainly separated in the middle layer (left photo), and the lower part is the right photo You can see that the red bud is separated.

[실시예 6] 구배용액을 이용한 세분화된 적혈구계 세포의 분리 4[Example 6] Separation of granular red blood cell cells using a gradient solution 4

도 6은 망상적혈구와 적혈구가 많은 세포혼합물로부터 구배용액을 이용해 분리한 예를 나타낸다. 망상적혈구와 적혈구가 많은 세포혼합물로부터 구배용액을 이용해 1200g로 15분 동안 원심분리하고, Isotonic percoll 45%와 70% 사이의 층에서 망상 적혈구(reticulocyte) 층을 분리하여 brilliant cresyl blue (BCB) 염색 후 세포를 확인한 결과, 망상적혈구(파란 침착물이 보이는 세포)가 순도 높게 분리된다. 6 shows an example of separation from a cell mixture containing many reticulocytes and red blood cells using a gradient solution. After centrifuging for 15 minutes at 1200 g using a gradient solution from a cell mixture containing many reticulocytes and red blood cells, separating the reticulocyte layer from the layer between 45% and 70% of isotonic percoll and staining brilliant cresyl blue (BCB). As a result of checking the cells, reticulocytes (cells showing blue deposits) are highly purified.

[실시예 7] 구동용액을 이용한 세포 분리 후 세포 안전성 측정[Example 7] Cell safety measurement after cell separation using a driving solution

추가의 배양이 필요한 미성숙 적혈구계 세포는 다시 배양공간으로 돌려 보내어 탈핵 적혈구계 세포가 될 때까지 배양할 수 있다. Immature red blood cells that need additional culture can be returned to the culture space and cultured until they become enucleated red blood cells.

본 발명자들의 실험 결과, 이러한 미성숙 적혈구계 세포를 다시 배양액으로 이동시켜 배양하더라도 viability 의 손상 없이 다시 배양 가능하다는 것이 확인되었다.As a result of the experiments of the present inventors, it was confirmed that these immature red blood cells can be re-cultured without impairing viability even if they are transferred to a culture medium and cultured.

도 7은 구동용액을 이용하여 세포를 분리한 후 세포의 안전성을 측정한 결과를 도시한 것이다. 세포 배양기로부터 적혈구계 세포(3 cases)를 모은 후 Percoll 구동용액 위에 얹은 후 원심분리하였다. 도 7A 및 7B는 적혈구계 세포 Case1 (4x108), case 2(2x108), case 3(2x10^7) 의 체외 배양 후 구동용액으로 1200g, 15min 원심분리한 결과 및 이들 세포의 Wright-Giemsa 염색결과를 나타낸다. 원심분리된 세포들을 수거하여 분리된 Orthochromatic erythroblast의 세포수를 계수하고 트리판 블루 염색하여 생존도(viability)((살아있는 세포수/전체 세포수)*100)를 측정한 결과, 도 7C 및 7D에서 확인할 수 있는 바와 같이, 세포생존도가 대부분 높아서 구동용액이 세포에 위해가 되지 않음을 확인하였다(도 7C: 최종세포수 = 세포수 X 세포 생존도(%), 도 7D: 생존도 = (살아있는 세포수/전체 세포수)*100). 또한 애초 세포 배양에 사용되었던 조혈모세포(CD34+ cell)도 Percoll 용액을 통해 분리 후 배양한 것이어서 구동용액이 세포의 분리 및 재배양에 안전함을 보여준다.7 shows the results of measuring the safety of cells after separating cells using a driving solution. After collecting red blood cells (3 cases) from the cell incubator, they were placed on a Percoll driving solution and centrifuged. 7A and 7B show the results of in vitro culture of erythroid cells Case 1 (4x10 8 ), case 2 (2x10 8 ), and case 3 (2x10^ 7 ) followed by centrifugation at 1200 g and 15 min with a driving solution and Wright-Giemsa staining of these cells Show the results. The number of cells of the orthochromatic erythroblast separated by collecting the centrifuged cells was counted and stained with trypan blue to measure the viability ((number of living cells/total number of cells)*100). As a result, in FIGS. 7C and 7D As can be seen, it was confirmed that the driving solution was not harmful to the cells because the cell viability was mostly high (FIG. 7C: final cell number = cell number X cell viability (%), FIG. 7D: viability = (living Cell count/total cell count)*100). In addition, hematopoietic stem cells (CD34+ cells), which were originally used for cell culture, were also cultured after separation using Percoll solution, showing that the driving solution is safe for cell separation and cultivation.

[실시예 8] 구배용액을 이용한 세분화된 세포주 및 적혈구계 세포의 분리 1[Example 8] Separation of subdivided cell lines and red blood cell cells using gradient solution 1

미성숙 적혈구 세포와 세포밀도가 비슷한 세포를 찾기 위해 Hela 세포주, K562 세포주, Adult RBC, 및 Young RBC를 각각의 튜브에서 구배용액을 이용해 분리층을 먼저 확인하였다. 각각의 세포주 및 적혈구계 세포들을 구배용액을 이용하여 400g로 30분 동안 원심분리한 결과, 도 8A에서 볼 수 있는 바와 같이, 45%와 70% Percoll 중간층에는 Hela 세포주 와 K562 세포주가 분리되었고, Young RBC와 Adult RBC는 70%와 93% Percoll 사이에서 확인되었다. Young RBC가 Adult RBC보다 약간 위쪽에 분포되는 것을 확인되었다. 도 8B의 세포 사진은 Wright-Giemsa 염색 사진을 나타낸다. In order to find cells with similar cell density to immature red blood cells, the Hela cell line, K562 cell line, Adult RBC, and Young RBC were first identified in each tube using a gradient solution. As a result of centrifuging each cell line and red blood cell cells at 400 g for 30 minutes using a gradient solution, as shown in FIG. 8A, Hela cell lines and K562 cell lines were isolated in the intermediate layers of 45% and 70% Percoll, and Young RBC and Adult RBC were identified between 70% and 93% Percoll. It was confirmed that Young RBC is slightly higher than Adult RBC. The cell picture of FIG. 8B shows a picture of Wright-Giemsa staining.

[실시예 9] 구배용액을 이용한 세분화된 세포주 및 적혈구계 세포의 분리 2[Example 9] Isolation 2 of subdivided cell lines and red blood cells using a gradient solution

세포주 및 적혈구계 세포들, 그리고 이들의 혼합물을 각각의 시험관에 넣고 구배용액을 이용하여 400g로 30분 동안 원심분리한 결과, 도 9A에서 볼 수 있는 바와 같이, K562 세포주와 미성숙한 적혈구계 세포들과 탈핵 전 유핵적혈구(orthochromatic- erythroblast)와 성숙 RBC가 분리되는 것을 확인하였다. 그러나 일부 탈핵 전 유핵적혈구가 다른 세포층에 섞여 있는 것을 확인되었다. 도 9B의 세포 사진은 Wright-Giemsa 염색 사진을 나타낸다. Cell lines, erythrocytes, and mixtures thereof were placed in each test tube and centrifuged at 400 g for 30 minutes using a gradient solution.As can be seen in Fig. 9A, K562 cell line and immature erythroid cells It was confirmed that orthochromatic-erythroblasts and mature RBCs were separated before denuclearization. However, it was confirmed that some nucleated red blood cells were mixed in different cell layers before enucleation. The cell picture of FIG. 9B shows a picture of Wright-Giemsa staining.

실시예 8 및 9의 결과는 교반강도의 조절을 통해 유핵 적혈구를 성숙시기에 따라 최적으로 분리할 수 있음을 확인하기 위해, 세포층 분리를 가시화시켜 분리된 세포들을 용이하게 분리해 낼 수 있게 해 주는 구배용액을 이용하여 적절한 조건을 찾을 수 있음을 보여준다.The results of Examples 8 and 9 are that in order to confirm that the nucleated red blood cells can be optimally separated according to the maturation time through the control of the agitation intensity, the separation of the cell layer is visualized so that the separated cells can be easily separated. It is shown that suitable conditions can be found using the gradient solution.

[실시예 10] 교반강도의 조절을 통한 적혈구계 세포의 분리[Example 10] Isolation of red blood cell cells by controlling the intensity of stirring

세포 분리에 적합하도록 다양한 밀도 구배를 설정하기 위해 교반강도와 시간을 조절하여 분리를 진행하였다. 도 10은 400g에서 30분(도 10A) 또는 1200g에서 15분(도 10B) 동안 각각 원심분리를 진행하여 탈핵 전 유핵적혈구(orthochromatic- erythroblast)와 성숙 적혈구 분리하였다. 400g에서 30분 동안 원심분리한 세포는 두 층으로 분리되어 위층에 일부 죽은 세포와 orthochromatic erythroblast, 아래층에 orthochromatic erythroblast와 RBC가 관찰되었다(도 10A). 1200g에서 15분 동안 원심분리된 세포는 세 층으로 분리되어, 위층에 일부 터져 죽은(apoptotic or necrotic 단계의) 세포와 orthochromatic erythroblast, 중간층에 대부분의 orthochromatic erythroblast와 일부 RBC, 아래층에는 일부 orthochromatic erythroblast와 대다수의 RBC 세포가 관찰되었다(도 10B). 높은 교반강도를 적용시켰을 때 세포의 분리가 명확히 갈리는 것이 확인되었다. 도 10의 세포 사진은 Wright-Giemsa 염색 결과를 나타낸다.Separation was performed by adjusting the stirring intensity and time to set various density gradients suitable for cell separation. 10 shows centrifugation at 400g for 30 minutes (FIG. 10A) or 1200g for 15 minutes (FIG. 10B) to separate orthochromatic-erythroblasts and mature red blood cells before enucleation. The cells centrifuged at 400 g for 30 minutes were separated into two layers, and some dead cells and orthochromatic erythroblast were observed in the upper layer, and orthochromatic erythroblast and RBC were observed in the lower layer (FIG. 10A). The cells centrifuged at 1200 g for 15 minutes were separated into three layers, partially bursting and dead (apoptotic or necrotic stage) cells in the upper layer and orthochromatic erythroblast, most orthochromatic erythroblast and some RBCs in the middle layer, and some orthochromatic erythroblast and the majority in the lower layer. RBC cells were observed (Fig. 10B). When high agitation strength was applied, it was confirmed that the separation of the cells was clearly divided. The cell photograph of FIG. 10 shows the results of Wright-Giemsa staining.

기존 문헌과 달리 orthochromatic erythroblast는 전 층에 걸쳐 나오기 때문에 단순 비중 차이로 잘 분리되지 않음을 알 수 있으며, 적절한 원심분리힘 (specific gravity) 에 의해서 적혈구와 층이 분리되는 정도가 다름을 알 수 있었다.Unlike the existing literature, orthochromatic erythroblast is found to be difficult to separate due to a simple difference in specific gravity because it is spread over the entire layer, and it was found that the degree of separation between red blood cells and layers by appropriate centrifugation force (specific gravity) was different.

[실시예 11] 성분채집 시스템을 이용한 적혈구계 세포의 분리[Example 11] Isolation of red blood cells using an ingredient collection system

연속류 원심분리 성분채집 시스템의 하나인 'spectra optia apheresis system'을 본 발명에 따른 세포 분리기의 일례로 사용하였다. 도 11 및 12는 연속류 원심분리 성분채집 시스템의 하나인 'spectra optia apheresis system'을 본 발명에 따른 적혈구 수거 시스템에 적용하여 실험의 개략도와 실험 결과를 보여준다.One of the continuous flow centrifugation component collection systems, the'spectra optia apheresis system', was used as an example of the cell separator according to the present invention. 11 and 12 show schematic and experimental results by applying the'spectra optia apheresis system', which is one of the continuous flow centrifugal component collection systems, to the red blood cell collection system according to the present invention.

연속류 원심분리 성분채집 시스템을 세포 분리기로서 본 발명에 따른 적혈구 수거 시스템에 적용할 수 있다는 점을 보이기 위한 실험이나, 'spectra optia apheresis system'을 적절히 구동하기 위해서는 세포 배양기로부터 공급되는 적혈구계 세포의 양이 상당히 많이 준비되어야 하는 현실적 문제가 있다. 따라서, 본 실시예에서는 충분한 양의 세포로 적절한 실험을 하기 위해 전혈 400ml과 함께 유핵세포로서 4.2X108의 CD34- 세포와, 6.7X107의 K562 세포를 혼합하여 사용하였다. 세포 배양기에 상기 세포들과 함께, 생리식염수 1L, 및 항응고보존제인 ACDA 용액을 넣었다. 세포 배양기의 세포 배출부를 튜브를 통해 세포 분리기, 즉 'spectra optia apheresis system'의 세포 유입부와 SCD (sterile connecting device)를 사용하여 무균적으로 연결시켰다(closed system으로 연결됨). 펌프를 통해 세포 배양기 내의 세포들을 'spectra optia apheresis system'의 세포 유입부를 통해 'spectra optia apheresis system' 내의 원심분리 장치로 이동시켰다. It is an experiment to show that the continuous flow centrifugation component collection system can be applied to the red blood cell collection system according to the present invention as a cell separator. However, in order to properly drive the'spectra optia apheresis system', the red blood cells supplied from the cell incubator There is a real problem in that the quantity must be prepared in quite large quantities. Therefore, in this example, 4.2X10 8 CD34-cells and 6.7X10 7 K562 cells as nucleated cells were mixed together with 400 ml of whole blood in order to conduct an appropriate experiment with a sufficient amount of cells. 1L of physiological saline, and an anticoagulant preservative ACDA solution were put together with the cells in a cell incubator. The cell outlet of the cell incubator was aseptically connected to the cell inlet of the cell separator, that is, the'spectra optia apheresis system' through a tube, using a stereo connecting device (SCD) (connected with a closed system). The cells in the cell incubator were moved to the centrifuge device in the'spectra optia apheresis system' through the cell inlet of the'spectra optia apheresis system' through the pump.

'spectra optia apheresis system'의 Packing factor 값(PF)을 달리하여 수거백에 탈핵전 유핵세포를 채집할 수 있는 최적값을 찾고 마지막 원심분리 채널 및 return tube에서 순수 RBC만 수거하고자 하였다. 이를 위해 실험차수에 따라 PF값을 조절하여 수거백이나 return tube의 혈액을 수집하고 채집된 세포를 분석하였다. 1st product에서 3rd product까지는 PF를 증가시켜 세포를 분리하였고, 4th product는 다시 P.F값을 시작값과 동일하게 낮추어 세포를 분리하였다. Collection reference(CP)를 참고하여 세포를 분리하였다. Packing factor(PF)는 원심분리 장치의 rpm 및 세포 유입부로 유입되는 세포 부피와 연관된 값으로, 원심분리 rpm 및 G-force 값과도 관련되어 있다.By varying the packing factor value (PF) of the'spectra optia apheresis system', we tried to find the optimum value for collecting nucleated cells before denuclearization in the collection bag, and only collected pure RBCs from the last centrifugation channel and return tube. To this end, the PF value was adjusted according to the experimental order to collect blood from the collection bag or return tube, and the collected cells were analyzed. Cells were separated by increasing PF from 1 st product to 3 rd product, and 4 th product again lowered the PF value to the same as the starting value to separate cells. Cells were isolated by referring to Collection reference (CP). The packing factor (PF) is a value related to the rpm of the centrifugation device and the volume of cells flowing into the cell inlet, and is also related to the centrifugation rpm and G-force values.

표 1은 실험차수별 일반 혈액 검사 (Complete blood cell count, CBC)의 결과를 보여준다. Table 1 shows the results of a general blood test (Complete blood cell count, CBC) for each experimental order.

[표 1] [Table 1]

Figure 112018129233362-pat00003
Figure 112018129233362-pat00003

실험 결과, P.F 값이 증가 할수록 WBC(백혈구)와 PLT(혈소판)수가 줄고 RBC수가 다소 증가되었다. 도 12의 염색 사진에 볼 수 있는 바와 같이, P.F 14 (3rd product)에서 탈핵전 유핵세포를 관찰할 수 있었다.As a result of the experiment, as the PF value increased, the number of WBC (white blood cells) and PLT (platelet) decreased and the number of RBCs slightly increased. As can be seen in the staining picture of FIG. 12, the nucleated cells before denuclearization were observed in PF 14 (3 rd product).

비중을 원리로 연속적으로 세포를 분리하는 세포 분리기에서 낮은 g-force(P.F1.6)에서 원심분리하며 상층분리시 미성숙 세포를 농축해 분리 가능하며(1st product), 좀 더 높은 g-force (PF 4.5 및 PF 14)로 원심분리시 상층에서 탈핵 전의 유핵적혈구를 농축 분리 가능함을(2nd 보다 3th product에서 ortho 더 많이 관찰됨) 확인하였다. 낮은 g-force에서 원심분리하며 1st return tubing 에서 얻은 적혈구 product (1st return) 및 2nd return product(2nd return)에서도 적혈구가 순수하게 수거 되었음을 확인하였다. Centrifugation at low g-force (P.F1.6) in a cell separator that continuously separates cells based on the specific gravity principle, and can be separated by concentrating immature cells in the upper layer separation (1 st product), and a higher g- the force (PF and 4.5 PF 14) to concentrate the nucleated red blood cells prior to enucleation in the upper layer during centrifugal separation available was confirmed (more 2 nd at the 3th ortho product being observed more frequently). It was confirmed that red blood cells were collected purely in the red blood cell product (1 st return) and 2 nd return product (2 nd return) obtained by centrifugation at low g-force and obtained in 1st return tubing.

실시예 11의 결과, 세포의 연속 배양 중에 세포 분리기를 통해 탈핵 적혈구계 세포를 오염이나 감염 없이 분리할 수 있는 시스템의 적용이 가능함을 확인하였다.As a result of Example 11, it was confirmed that the application of a system capable of separating enucleated red blood cell cells without contamination or infection through a cell separator during continuous cell culture was possible.

Claims (7)

적혈구계 세포의 체외 배양을 위한 세포 배양기;
원심분리 장치를 포함하는 세포 분리기;
성숙 적혈구 저장부; 및
이들을 무균적으로 연결해 주는 연결부를 포함하는 시스템으로,
상기 세포 배양기는 원심분리 후 탈핵되지 않은 미성숙 적혈구계 세포를 다시 받아들일 수 있는 미성숙 세포 유입부를 포함하거나,
상기 시스템은 원심분리 후 탈핵되지 않은 미성숙 적혈구계 세포의 추가의 성숙을 위한 별도의 세포 배양기를 추가로 포함하는 것이고,
세포 배양을 유지하면서 동시에 성숙 적혈구를 수거하며,
적혈구계 세포의 배양, 분리, 및 성숙 적혈구의 수거가 닫힌 시스템(closed
system) 내에서 수행되는 것을 특징으로 하는,
적혈구계 세포 배양 중 적혈구를 수거하기 위한 시스템.A cell incubator for culturing red blood cells in vitro;
A cell separator including a centrifugation device;
Mature red blood cell storage; And
A system including a connection that connects them aseptically,
The cell incubator includes an immature cell inlet unit capable of re-accommodating immature red blood cell cells that have not been enucleated after centrifugation, or
The system further includes a separate cell incubator for further maturation of immature erythroid cells that have not been enucleated after centrifugation,
While maintaining the cell culture while simultaneously collecting mature red blood cells,
A closed system for cultivation, isolation, and collection of mature red blood cells of red blood cells.
system), characterized in that,
A system for collecting red blood cells during erythrocyte cell culture. 제1항에 있어서,
상기 세포 배양기는 세포 공급부 및 세포 배출부를 포함하며,
교반기, 배양 조건 모니터링 장치, 배양 조건 조절 장치, 공기 유입부 및 공기 배출부를 포함하는 것인,
적혈구계 세포 배양 중 적혈구를 수거하기 위한 시스템. The method of claim 1,
The cell incubator includes a cell supply unit and a cell discharge unit,
It comprises a stirrer, culture condition monitoring device, culture condition control device, air inlet and air outlet,
A system for collecting red blood cells during erythrocyte cell culture. 제1항에 있어서,
상기 원심분리 장치를 포함하는 세포 분리기는 연속류 원심분리 성분채집 시스템(continuous-flow centrifugal apheresis system)인,
적혈구계 세포 배양 중 적혈구를 수거하기 위한 시스템. The method of claim 1,
The cell separator comprising the centrifugation device is a continuous-flow centrifugal apheresis system,
A system for collecting red blood cells during erythrocyte cell culture. 제1항에 있어서,
상기 세포 분리기는 원심분리 후 다층으로 분리된 세포들을 배출하는 세포 배출부를 하나 또는 복수 개 구비한 것인
적혈구계 세포 배양 중 적혈구를 수거하기 위한 시스템. The method of claim 1,
The cell separator is provided with one or a plurality of cell discharge units for discharging cells separated into multilayers after centrifugation.
A system for collecting red blood cells during erythrocyte cell culture. 제1항에 있어서,
상기 시스템은 추가로 폐기물 저장부 및/또는 미성숙 세포를 추가로 배양하기 위한 제2 세포 배양기를 포함하는 것인,
적혈구계 세포 배양 중 적혈구를 수거하기 위한 시스템.The method of claim 1,
The system further comprises a waste storage and/or a second cell incubator for further culturing immature cells,
A system for collecting red blood cells during erythrocyte cell culture. 줄기세포, 조혈모세포, 또는 적혈구 전구세포를 세포 배양기에서 적혈구계 세포로 배양하는 단계;
상기 적혈구계 세포의 연속적인 배양 과정 중에 상기 배양된 적혈구계 세포의 일부를 원심분리 장치를 포함하는 세포 분리기로 이송하는 단계;
상기 적혈구계 세포들은 세포 분리기 내에서 원심분리를 통해 적혈구계 세포들을 성숙도에 따라 분리하는 단계;
성숙 적혈구를 성숙 적혈구 저장부로 이송하는 단계를 포함하며,
상기 세포 배양기, 세포 분리기 및 성숙 적혈구 저장부는 이들을 무균적으로 연결해 주는 연결부를 통해 연결되어 있고,
상기 세포 배양기는 원심분리 후 탈핵되지 않은 미성숙 적혈구계 세포를 다시 받아들일 수 있는 미성숙 세포 유입부가 연결되어 있거나,
상기 세포 분리기는 원심분리 후 탈핵되지 않은 미성숙 적혈구계 세포의 추가의 성숙을 위한 별도의 세포 배양기가 추가로 연결되어 있는 것이고,
닫힌 시스템 내에서 구현되는 것을 특징으로 하는,
적혈구계 세포 배양 중 적혈구를 수거하기 위한 방법.Culturing stem cells, hematopoietic stem cells, or red blood cell progenitor cells as red blood cell cells in a cell culture medium;
Transferring a portion of the cultured red blood cell cells to a cell separator including a centrifugal separator during the continuous culture process of the red blood cell cells;
Separating the red blood cell cells according to their maturity through centrifugation in a cell separator;
Including the step of transferring the mature red blood cells to the mature red blood cell storage unit,
The cell incubator, the cell separator, and the mature red blood cell storage unit are connected through a connection unit that aseptically connects them,
The cell incubator is connected to an immature cell inlet unit capable of re-accepting immature red blood cell cells that have not been enucleated after centrifugation, or
The cell separator is additionally connected to a separate cell incubator for further maturation of immature red blood cell cells that have not been enucleated after centrifugation,
Characterized in that it is implemented within a closed system,
A method for collecting red blood cells during cultivation of red blood cells. 삭제delete
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