KR102194995B1

KR102194995B1 - stabilization compoation of improved dried humoral diagnosis and its opplication method

Info

Publication number: KR102194995B1
Application number: KR1020200118984A
Authority: KR
Inventors: 장혜란; 우종권; 스트로직 카타르지나
Original assignee: 장혜란
Priority date: 2020-09-16
Filing date: 2020-09-16
Publication date: 2020-12-28
Also published as: KR102386874B1; KR20220036821A; KR20220036822A; KR20220036820A; KR102439101B1; KR102386879B1; WO2022059885A1

Abstract

The present invention relates to an improved protein composition having storage stability and solubility of a biological sample, and an application method using the same. According to the present invention, the composition comprises a protein extracted from a cocoon of specific Bombyx mori, wherein the protein is composed of a heavy chain and a light chain having a molecular weight of approximately 35 to 400 kDa. According to the present invention, a stable protein composition can be prepared.

Description

Stabilization compoation of improved dried humoral diagnosis and its opplication method for diagnosis

본 발명은 원거리 진단의 정확성 및 신뢰성을 향상시키기 위해 개선된 건조체액 반점(Dried Humoral Spot)에 관한 것으로서, 구체적으로는 소량의 체액을 실크피브로인 단백질 조성물을 이용하여 건조체액반점화 함으로써, 다양한 조건 하에서 우수한 안정성을 보여 원격의료 진단을 위한 안정적인 매개체로서 사용할 수 있다.The present invention relates to an improved dry humoral spot in order to improve the accuracy and reliability of a long-distance diagnosis. Specifically, a small amount of body fluid is made into dry body fluid spots using a silk fibroin protein composition, under various conditions. It shows excellent stability and can be used as a stable medium for telemedicine diagnosis.

현재 사용되는 혈액 샘플 채취방법은 대규모의 검사 등이 요구되는 경우에 현장에 충분한 의료진이 없거나, 정맥 천자와 같은 외과적인 샘플 채취 방법에 대한 일반적인 거부감 등으로 인해 환자의 혈액 샘플을 쉽게 얻을 수 없다는 문제점이 존재하였다. 또한, 인간의 전혈 및 혈액 성분은 조건에 따라 매우 불안정할 수 있다. 때문에 이러한 불안정한 샘플을 정확하게 분석 및 평가하기 위해서는 샘플의 특별한 취급이 필요하다.The currently used blood sample collection method is a problem that it is not possible to easily obtain a patient's blood sample due to insufficient medical staff at the site when large-scale examinations, etc. are required, or due to general rejection of surgical sample collection methods such as venipuncture. Existed. In addition, human whole blood and blood components can be very unstable depending on the conditions. Therefore, special handling of the sample is required to accurately analyze and evaluate such an unstable sample.

현재 임상병리학적으로 사용되어지는 혈액 또는 혈액의 분획(혈장, 혈청 등)을 저장하고 취급하는 통상적인 방법은 동결(-20℃)에 의한 것이다. 특히, 매우 불안정한 RNA의 경우에는 샘플의 안전성을 보존하기 위해 초저온(-80℃)에서의 보관 및 운송해야 하는 등 큰 제약이 있다. 즉 샘플을 스티로폼 박스 또는 드라이아이스 등을 사용하여 이송하기 때문에 운송과정에서 고가의 운송요금을 추가로 부담하는 경우가 발생한다.The conventional method for storing and handling blood or blood fractions (plasma, serum, etc.) currently used clinically pathologically is by freezing (-20°C). Particularly, in the case of very unstable RNA, there are significant limitations such as storage and transportation at cryogenic temperatures (-80°C) to preserve the safety of the sample. In other words, since samples are transferred using a styrofoam box or dry ice, there is a case in which an expensive transportation fee is additionally charged during the transportation process.

일부 개발도상국 또는 원거리 필드 조건에서는 연속적인 냉장보관을 지원하는 최소한의 기반시설이 제대로 갖춰지지 않은 경우가 많아, 수행 가능한 정밀 진단의 범위가 제한된다. In some developing countries or in remote field conditions, the minimum infrastructure to support continuous refrigeration is often poorly in place, limiting the scope of detailed diagnostics that can be performed.

따라서, 약동학(PK) 스크리닝을 위해 치료 효능을 모니터하고 2차 요법으로 적절한 전환을 안내하기 위한 저렴하고 안정적인 저장 포맷(format)의 필요성이 절실하다.Thus, there is an urgent need for an inexpensive and stable storage format to monitor treatment efficacy for pharmacokinetic (PK) screening and guide proper transition to second-line therapy.

특히 세계적인 팬더믹(Pandemic)이 발생하였을 경우 의료진 및 환자의 대면 접촉으로 인한 질병의 2차 감염이 유발될 수 있다. In particular, when a global pandemic occurs, secondary infection of the disease may be caused due to face-to-face contact between medical staff and patients.

이러한 2차 감염을 방지하기 위해 앞으로의 의료 진단방향은 대면 접촉을 최소화하고, 원거리 진단을 통한 새로운 선별검사(Screening Test) 적용이 보편화될 것으로 전망된다.In order to prevent such secondary infection, the future medical diagnosis direction is expected to minimize face-to-face contact and apply a new screening test through distant diagnosis.

혈액 또는 혈장 등을 저장하고 보존하는 다른 방법으로는 셀룰로오스 매트릭스 기반의 기술이 혈액 시편 보존의 시장 점유율을 장악해오고 있다. 이는 손가락, 발뒤꿈치 등으로부터 란셋(Lancet)를 이용하여 소량의 혈액을 취한 후, 셀룰로오스 매트릭스가 포함된 시트지 상에 적용함으로써 건조된 혈액 반점(Dried Blood Spot, DBS, 이하 건조 혈반이라 칭함) 시편을 수득한다. 이러한 셀룰로오스 매트릭스는 부분적으로 혈액 시편의 안정성을 위해 효소 억제제를 포함시키는 경우도 있다.As another method for storing and preserving blood or plasma, etc., technology based on cellulose matrix has dominated the market share of blood specimen preservation. This is done by taking a small amount of blood from a finger, heel, etc. using a lancet, and then applying it on a sheet paper containing a cellulose matrix to prepare a dried blood spot (DBS, hereinafter referred to as a dry blood spot) specimen. To obtain. These cellulose matrices may partially contain enzyme inhibitors for stability of blood specimens.

셀룰로오스 매트릭스를 이용해 건조된 시편은, 분석실에서 펀치를 이용하여 작은 디스크 형태로 시트로부터 분리하고, 4℃의 완충 용액에서 마이크로타이터 플레이트 상에 충분한 시간을 두고 용리시킨다.The specimen dried using the cellulose matrix was separated from the sheet in the form of a small disk using a punch in an analysis chamber, and eluted on a microtiter plate in a buffer solution at 4° C. for a sufficient time.

또한, 용리된 물질을 함유하는 플레이트는 후속 시험을 위해 희석이 가능한 상태로 형성시킨다. In addition, plates containing the eluted material are formed in a dilutionable state for subsequent testing.

이와 같이 방식은 1960년대 이후로 개별적 진단법으로 사용되어지고 있다. 또한 셀룰로오스 기반 기술은 20-30년간 꾸준히 연구되고 있으며, 현재 미국 질병통제센터에서는 혈액 반점을 위한 독립적인 품질 관리 프로그램을 유지하고 있다. As such, the method has been used as an individual diagnosis method since the 1960s. In addition, cellulose-based technology has been continuously studied for 20 to 30 years, and the US Centers for Disease Control and Prevention currently maintains an independent quality control program for blood spots.

30년 이상 동안, 연구원들은 여러 질병 바이오마커를 대상으로 DBS 샘플의 온도 및 시편의 안정성에 대하여 연구해 왔고, 특히 소형화 및 원거리진단을 위한 스크리닝 분야에 사용이 용이하도록 많은 연구가 이루어졌다. For more than 30 years, researchers have been studying the temperature and stability of DBS samples for various disease biomarkers, especially for miniaturization and for ease of use in screening for remote diagnosis.

현재까지 셀룰로오스 기반의 포맷은 잠재적 분석 대상인 모든 분석물을 커버하기에는 적합하지 않으며, 일부 마커는 셀룰로오스 매트릭스와 화학적으로 반응하여 이를 분석하기 위한 충분한 회수 과정이 어렵다는 것을 발견하였다. To date, it has been found that cellulose-based formats are not suitable to cover all analytes that are potential analytes, and some markers chemically react with the cellulose matrix, making it difficult to perform a sufficient recovery process to analyze them.

이들 셀룰로오스 매트릭스 기반의 혈액 및 혈장 안정화 시스템의 몇몇 결점 또한, 수년간 지속된 광범위한 세트의 임상적 평가를 통해 밝혀져 왔다.Some of the shortcomings of these cellulose matrix based blood and plasma stabilization systems have also been uncovered through an extensive set of clinical evaluations that have persisted over the years.

이러한 결점은 건조 혈반 시편이 달성할 수 있는 검출 하한치(Lower Limit of Detection, LLD) 및 적정한 정량적 식별이 되는 동적 범위에 한계로 작용하여, 건조 혈반 시편의 완전성을 보장할 수 없고, RNA 바이러스에 대한 분자 시험을 위한 수송 수단으로 사용될 수 없다는 한계점으로 작용할 수 있다.This drawback acts as a limit on the lower limit of detection (LLD) that a dry blood spot specimen can achieve and the dynamic range of appropriate quantitative identification, so that the integrity of the dry blood spot specimen cannot be guaranteed. This can act as a limitation that it cannot be used as a vehicle for molecular testing.

따라서, 생물학적 샘플 및 성분을 충분히 안정화 할 수 있고, 검출 및 분석용의 안정화된 샘플로부터 다양한 분석을 수행하기 충분한 양의 샘플을 회수 할 수 있는 개선된 안정화 기술 및 제품의 개발 필요성이 시급하다.Therefore, there is an urgent need to develop an improved stabilization technology and product capable of sufficiently stabilizing biological samples and components and recovering a sufficient amount of samples to perform various analyzes from stabilized samples for detection and analysis.

본 발명에서는 일정 시간 및 일정 범위의 저장 온도에 걸쳐 전혈 및 특정 혈액 성분을 안정화시킬 수 있고, 분석을 위한 유효성분의 충분한 회수가 가능한 것을 특징으로 하는, 재조합된 피브로인 단백질을 제공한다.The present invention provides a recombinant fibroin protein, characterized in that it is possible to stabilize whole blood and specific blood components over a certain period of time and storage temperature in a certain range, and sufficient recovery of an active ingredient for analysis is possible.

본 발명의 조성물은 시트 상태에서 소량의 체액을 흡수하고, 이어서 안정화 단계로 진입한다. 그리고 박막 내의 혼합 착물로 공기 건조된다. 또한 불안정한 소량의 핵산을 함유하는 재구성된 혼합용액 응고기술을 동결 건조 기술과 접목하여 보다 안정적인 약동학 스크리닝에 적극 활용될 수 있을 것으로 기대된다. The composition of the present invention absorbs a small amount of body fluid in the sheet state, and then enters the stabilization stage. Then, it is air dried with the mixed complex in the thin film. In addition, it is expected that the reconstituted mixed solution coagulation technology containing a small amount of unstable nucleic acid can be actively used for more stable pharmacokinetic screening by grafting freeze-drying technology.

현재 혈액의 건식 저장을 위해 사용되는 유일한 기술은 셀룰로오스기반 기술이지만, 이 기술은 콜드 체인 성능 매트릭스와 매치할 수 없기 때문에 널리 채택되지 못하고 있다. 본 발명의 단백질 조성물은 온 페이퍼 장치를 대신하도록 사용 가능하며, 콜드 체인 저장에 의존하는 기존 방식에 의존하지 않는 보다 새로운 패러다임을 제시해줄 것으로 기대된다. Currently, the only technology used for dry storage of blood is a cellulose-based technology, but this technology is not widely adopted because it cannot match the cold chain performance matrix. The protein composition of the present invention can be used to replace the on-paper device, and is expected to present a new paradigm that does not depend on the existing method that relies on cold chain storage.

또한, 본 발명은 소변, 타액 및 다른 체액 또는 세포로부터의 샘플 수집의 또 다른 형태의 진단 유용성을 적용시킬 수 있을 것으로 기대된다.In addition, the present invention is expected to be applicable to another form of diagnostic utility of sample collection from urine, saliva and other bodily fluids or cells.

대한민국 등록특허 제10-2071733호Korean Patent Registration No. 10-2071733

상기한 문제점을 해결하기 위한 본 발명의 목적은 생체 시료의 안정적인 보존을 위한 시편의 조성물을 제공하는 것이다.An object of the present invention for solving the above problems is to provide a composition of a specimen for stable storage of a biological sample.

구체적으로, 본 발명은 집누에나방(Bombyx mori)의 고치로부터 추출한 단백질 중, β 구조를 형성할 수 있는 가능성이 있는 단위 폴리펩티드의 함량을 조절함으로써, Silk Ⅱ 구조로 전이되는 것을 최대한 지연시켜 보다 안정적인 단백질 조성물을 제조하는 것을 그 목적으로 한다.Specifically, the present invention controls the content of the unit polypeptide with the possibility of forming a β structure among proteins extracted from the cocoon of Bombyx mori , thereby delaying the transfer to the Silk II structure as much as possible, thereby making it a more stable protein. Its purpose is to prepare the composition.

본 발명은 상기와 같이 단위 폴리펩티드의 함량을 조절함으로써 자발적인 β 구조로의 전이를 감소시킨다. 이와 동시에, 생체 시료의 접촉시 단분자 상태에서도 생체 시료와의 β 구조 형성을 촉진하고, 분자 사슬 간의 상호작용에 영향을 주어 더욱 안정되고 견고한 β 구조로 변환됨으로써, 보다 안정적인 생체 시료의 보존이 가능하다.The present invention reduces spontaneous metastasis to the β structure by controlling the content of the unit polypeptide as described above. At the same time, when a biological sample is in contact, it promotes the formation of a β structure with the biological sample even in a monomolecular state, and influences the interaction between molecular chains to transform it into a more stable and robust β structure, enabling more stable storage of the biological sample. Do.

본 발명의 다른 목적은, 상기 피브로인 단백질 조성물을 포함하는 생물학적 샘플 수집 장치를 포함하는 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a kit comprising a biological sample collection device comprising the fibroin protein composition.

본 발명은 재용해도가 뛰어난 실크피브로인 단백질 조성물에 있어서, 상기 실크피브로인 단백질 조성물의 전체 아미노산 함량대비 글리신의 함량이 40 내지 50 중량%, 알라닌의 함량이 25 내지 35 중량%이며, 상기 실크피브로인 단백질 조성물의 평균 분자량이 32 kDa 내지 340 kDa를 가지는 것인, 실크피브로인 단백질 조성물을 제공한다.In the present invention, in the silk fibroin protein composition having excellent resolubility, the content of glycine relative to the total amino acid content of the silk fibroin protein composition is 40 to 50% by weight, alanine content is 25 to 35% by weight, and the silk fibroin protein composition It provides a silk fibroin protein composition that has an average molecular weight of 32 kDa to 340 kDa.

구체적으로, 상기 글리신은 글리신(β)와 글리신(α)로 구성되고, 상기 글리신(β)와 글리신(α)의 비율이 0.1 : 99.9 내지 10 : 90인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.Specifically, the glycine is composed of glycine (β) and glycine (α), and the ratio of glycine (β) and glycine (α) may be 0.1:99.9 to 10:90, but is not limited thereto.

구체적으로, 상기 알라닌은 알라닌(β)와 알라닌(α)로 구성되고, 상기 알라닌(β)와 알라닌(α)의 비율이 0.1 : 99.9 내지 10 : 90인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.Specifically, the alanine is composed of alanine (β) and alanine (α), and the ratio of alanine (β) to alanine (α) may be 0.1:99.9 to 10:90, but is not limited thereto.

또한, 구체적으로 상기 조성물은 중쇄(heavy chain) 및 경쇄(light chain)를 포함하고, 상기 중쇄(heavy chain)와 경쇄(light chain)의 중량 비율이 0.1 : 99.9 내지 10 : 90인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In addition, specifically, the composition includes a heavy chain and a light chain, and the weight ratio of the heavy chain and the light chain may be 0.1:99.9 to 10:90, It is not limited thereto.

상기 조성물은 pH 1 내지 13의 범위내에서 제조된 것일 수 있고, 0.1atm 내지 2.0atm의 범위내에서 제조된 것일 수 있으며, 3000RCF 내지 20000RCF의 G-Force 범위내에서 제조된 것일 수 있고, 60분 내지 240분의 반응 시간 범위내에서 제조된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The composition may be prepared within the range of pH 1 to 13, may be prepared within the range of 0.1 atm to 2.0 atm, may be prepared within the G-Force range of 3000 RCF to 20000 RCF, and 60 minutes It may be prepared within a reaction time range of to 240 minutes, but is not limited thereto.

구체적으로, 상기 조성물은 고체 또는 액체 형태이거나, 상기 조성물은 셀룰로오스 베이스 또는 플라스틱 스틱에 도포되어 동결 및 동결 건조된 시편 형태일 수 있다. Specifically, the composition may be in a solid or liquid form, or the composition may be in the form of a specimen applied to a cellulose base or a plastic stick and freeze-dried.

또한, 상기 조성물은 그 자체로 동결 및 동결 건조된 시편 형태이거나, 건조된 분말 입자 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In addition, the composition itself may be in the form of a freeze-dried and freeze-dried specimen, or may be in the form of dried powder particles, but is not limited thereto.

본 발명의 조성물은 피브로인 단백질이 3 내지 14일 동안 안정하게 유지되는 것을 특징으로 하며, 본 발명의 조성물은 22℃ 내지 38℃에서 30일동안 보관 안정성이 유지되는 것을 특징으로 한다.The composition of the present invention is characterized in that the fibroin protein is stably maintained for 3 to 14 days, and the composition of the present invention is characterized in that the storage stability is maintained at 22°C to 38°C for 30 days.

한편, 본 발명의 조성물은 부가적인 첨가제로서 글리세롤을 전체 중량의 20 내지 90중량% 첨가할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.Meanwhile, the composition of the present invention may add 20 to 90% by weight of glycerol as an additional additive, but is not limited thereto.

본 발명의 조성물은 물에 재가용화되어 피브로인 응집체가 없는 실크피브로인 용액을 형성하는 것을 특징으로 하며, 특히 재가용화 후 검출 가능한 양의 생물학적 시료 및 시료에 포함된 활성성분을 회수할 수 있는 것을 특징으로 한다.The composition of the present invention is characterized in that it is re-solubilized in water to form a silk fibroin solution free of fibroin aggregates, and in particular, it is characterized in that it is possible to recover a detectable amount of a biological sample and an active ingredient contained in the sample after re-solubilization. do.

상기 조성물을 재가용화 후 검출 가능한 양의 생물학적 시료를 회수할 수 있는 조건은 24시간 내지 14일의 시간, 43℃이하의 온도 조건에서 회수가 가능할 수 있고, 상기 생물학적 시료는 세포, 조직, 혈액 (예를 들어 전혈, 혈장, 혈청, 혈소판 등), 수유 생성물, 양수, 객담, 소변, 타액, 점액, 기관지 흡인물 또는 이들의 분획 또는 이들의 조합이거나, 또는 이들을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 활성성분은 펩티드, 단백질, 항체, 효소, 아미노산, 헥산, DNA 및 이들의 분획, RNA 및 이들의 분획, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 대사물, 지질, 당, 당단백질, 펩티도글리칸, 미생물, 세포 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 하나이상 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Conditions for recovering a detectable amount of a biological sample after resolubilization of the composition may be from 24 hours to 14 days, and may be recovered under a temperature condition of 43°C or less, and the biological sample may be selected from cells, tissues, blood ( For example, whole blood, plasma, serum, platelets, etc.), lactation products, amniotic fluid, sputum, urine, saliva, mucus, bronchial aspirate, or a fraction thereof or a combination thereof, or may be a combination thereof, and the active ingredient Silver peptides, proteins, antibodies, enzymes, amino acids, hexane, DNA and their fractions, RNA and their fractions, antisense oligonucleotides, metabolites, lipids, sugars, glycoproteins, peptidoglycans, microorganisms, cells and their It may be one or more selected from the group consisting of any combination, but is not limited thereto.

구체적으로, 상기 피브로인 단백질 조성물과 생물학적 샘플의 비율이 약 1 : 100 내지 100 : 1일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.Specifically, the ratio of the fibroin protein composition and the biological sample may be about 1: 100 to 100: 1, but is not limited thereto.

본 발명의 다른 측면은, 상기 피브로인 단백질 조성물을 포함하는 생물학적 샘플 수집 장치를 포함하는 키트를 제공한다.Another aspect of the present invention provides a kit comprising a biological sample collection device comprising the fibroin protein composition.

구체적으로, 상기 키트는 가용화제를 함유하는 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 가용화제는 물, 완충용액, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.Specifically, the kit may further include a container containing a solubilizing agent. The solubilizing agent may include water, a buffer solution, or a combination thereof.

또한, 구체적으로 상기 키트는 안정화제를 함유하는 용기를 포함할 수 있으며, 상기 안정화제는 생물학적 시료 샘플을 안정화하는 것일 수 있다.Further, specifically, the kit may include a container containing a stabilizer, and the stabilizer may stabilize a biological sample sample.

구체적으로, 상기 안정화제는 항산화제, 젤라틴 및 그 유도체, 알부민(인간 및 소 혈청), 아미노산, 양이온 및 음이온 계면활성제, 당 알코올 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 안정화제는 뉴클레아제 또는 프로테이나제 억제제일 수 있고, 가장 구체적으로는 안정화제가 RNase 억제제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.Specifically, the stabilizer may be selected from the group consisting of antioxidants, gelatin and derivatives thereof, albumin (human and bovine serum), amino acids, cationic and anionic surfactants, sugar alcohols, or any combination thereof. More specifically, the stabilizing agent may be a nuclease or proteinase inhibitor, and most specifically, the stabilizing agent may be an RNase inhibitor, but is not limited thereto.

또한, 구체적으로 상기 키트는 핵산 증폭제, 성분 정제제, 면역 검출제 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하여 구성되는 것일 수 있다.In addition, specifically, the kit may be configured to include one or more selected from the group consisting of a nucleic acid amplifying agent, a component purifying agent, an immune detection agent, or any combination thereof.

본 발명의 조성물을 이용하면, 기존의 건조 혈반(Dried Blood Spot, DBS)보다 안정성이 개선된 건조 체액 반점DHS(Dried Humoral Spot, DHS)의 조성물에 상기 체액 샘플을 투입한 후, 분석실까지 훨씬 안정적으로 이송할 수 있다.When the composition of the present invention is used, after the body fluid sample is added to the composition of DHS (Dried Humoral Spot, DHS), which has improved stability than the existing dry blood spot (DBS), it is much more stable to the analysis room. Can be transferred to.

이러한 DHS(Dried Humoral Spot)는 기존 셀룰로오스 기반의 제품의 단점인 특정 온도 및 습도에 영향을 받는다는 한계점을 극복하였으며, 이송 과정 중 혈액 샘플에서 단백질 무결성을 확보하여 보다 더 정확한 진단이 가능하다.DHS (Dried Humoral Spot) overcomes the limitation of being affected by specific temperature and humidity, which is a disadvantage of existing cellulose-based products, and secures protein integrity in blood samples during the transfer process, enabling more accurate diagnosis.

구체적으로, 본 발명의 단백질 조성물 및 이를 활용한 생물학적 시료의 보관 방법은 다음과 같은 장점을 갖는다.Specifically, the protein composition of the present invention and the storage method of a biological sample using the same have the following advantages.

첫째, 필드 및 소규모 병원에서 샘플 수집이 가능하다.First, sample collection is possible in the field and in small hospitals.

둘째, 비 숙련된 인원의 샘플 수집이 가능하다.Second, it is possible to collect samples by unskilled personnel.

셋째, 침습적 방법을 최소한도로 이용하여 샘플 수집이 가능하다.Third, it is possible to collect samples using minimally invasive methods.

넷째, 안정성이 높아 운송 과정의 편리성이 높다.Fourth, due to its high stability, the convenience of the transportation process is high.

다섯째, 외부 환경 요인에 대한 생물학적 시편의 안정성이 높다.Fifth, the stability of biological specimens against external environmental factors is high.

여섯째, 광범위한 생체 시편(혈액, 타액, 소변 등)의 샘플링이 가능하다.Sixth, it is possible to sample a wide range of biological specimens (blood, saliva, urine, etc.).

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.The effects of the present invention are not limited to the above effects, and should be understood to include all effects that can be deduced from the configuration of the invention described in the detailed description or claims of the present invention.

도 1은 Bombyx mori누에에서 피브로인추출 과정 중 본 발명에서 제시된 범위에서 정련과정을 거쳐 건조된 피브로인의 SEM 사진을 나타낸 것이다(A: 본 발명의 제시된 범위, B: 온도, 압력, 시간을 각각 10% 증가시킨 경우, C: 온도, 압력, 시간을 각각 20%씩 증가시킨 경우).
도 2는 본 발명 조성물인 건조체액 안정화 조성물의 분자량 및 크로마토그램 측정 자료를 나타내었다(A: DHS의 분자량 분포도, B: pH 2.5 수용액 상태에서 크로마토그램, C: pH 3.0 수용액 상태에서 크로마토그램, D: pH 3.5 수용액 상태에서 크로마토그램).
도 3은 본 발명 조성물의 pH에 따른 안정성을 측정한 자료를 나타내었다.
도 4는 도 3의 pH에 따른 변화과정을 Raman 분석을 통해 측정한 자료를 나타내었다.
도 5는 본 발명 조성물의 SEM 측정자료를 나타내었다(A: 본 발명 조성물의 SEM 자료, B: 본 발명 조성물에 플라즈마를 적용한 SEM 자료).
도 6은 본 발명 조성물의 XRD 측정 자료를 나타내었다(A: 실험 직후, B: 14일 경과 후).
도 7은 Luminex 면역 검정 시스템을 이용하여 38℃ 또는 22℃에서 30일동안 샘플을 보관 후 각 바이오 마커를 측정한 자료로서, 백색 블록은 DHS(혈장), 검정 블록은 DHS (혈액), 회색 블록은 액체 플라즈마를 나타내었다(A: SAP(serum amyloid P component), B: sVCAM-1(soluble cell adhesion molecule), C: CRP(C-reactive protein)).
도 8은 실험 직후 및 2주 후의 LP(Liquid Plasma), DBS(Dried Blood Spot (cellulose sheet)), DHS(Dried Humoral Spot (silk sheet))의 총 PSA 측정값을 나타내었다(A: 실험 직후, B: 22도 및 43도에서 2주 경과 후).
도 9는 실험 직후 및 2주 후의 LP(Liquid Plasma), DBS(Dried Blood Spot (cellulose sheet)), DHS(Dried Humoral Spot (silk sheet))의 렙틴 측정값을 나타내었다(A: 실험 직후, B: 22도 및 43도에서 2주 경과 후).
도 10은 실험 직후 및 2주 후의 LP(Liquid Plasma), DBS(Dried Blood Spot (cellulose sheet)), DHS(Dried Humoral Spot (silk sheet))의 프로락틴 측정값을 나타내었다(A: 실험 직후, B: 22도 및 43도에서 2주 경과 후).
도 11은 서로 다른 실크 피브로인 품종별(7 품종) 아미노산 함량을 크로마토그래픽으로 분석하여 측정한 자료를 나타내었다(A (Baekok jam), B (Geumgwang ju), C (Hansang Ⅱ), D (Hong bak), E (Imbakgal won), F (N74), G (SK), H (Won jam 125), I (Won won 126)).1 shows an SEM photograph of fibroin dried through a scouring process in the range suggested in the present invention during the fibroin extraction process from Bombyx mori silkworm (A: suggested range of the present invention, B: temperature, pressure, and time, respectively, 10% When increased, C: when temperature, pressure, and time were each increased by 20%).
Figure 2 shows the molecular weight and chromatogram measurement data of the dry body liquid stabilizing composition of the present invention (A: molecular weight distribution of DHS, B: chromatogram in the pH 2.5 aqueous solution state, C: chromatogram in the pH 3.0 aqueous solution state, D : Chromatogram in pH 3.5 aqueous solution).
3 shows the data of measuring the stability according to the pH of the composition of the present invention.
4 shows data measured through Raman analysis of the change process according to the pH of FIG. 3.
5 shows SEM measurement data of the composition of the present invention (A: SEM data of the composition of the present invention, B: SEM data of applying plasma to the composition of the present invention).
6 shows XRD measurement data of the composition of the present invention (A: immediately after the experiment, B: after 14 days).
7 is data obtained by measuring each biomarker after storing the sample at 38°C or 22°C for 30 days using the Luminex immune assay system, the white block is DHS (plasma), the black block is DHS (blood), gray block Represents a liquid plasma (A: serum amyloid P component (SAP), B: sVCAM-1 (soluble cell adhesion molecule), C: C-reactive protein (CRP)).
Figure 8 shows the total PSA measurement values of LP (Liquid Plasma), DBS (Dried Blood Spot (cellulose sheet)), DHS (Dried Humoral Spot (silk sheet)) immediately and after 2 weeks (A: immediately after the experiment, B: After 2 weeks at 22 degrees and 43 degrees).
9 shows the measured values of leptin in LP (Liquid Plasma), DBS (Dried Blood Spot (cellulose sheet)), DHS (Dried Humoral Spot (silk sheet)) immediately after and 2 weeks after the experiment (A: immediately after the experiment, B : After 2 weeks at 22 degrees and 43 degrees).
Figure 10 shows the measurement values of prolactin of LP (Liquid Plasma), DBS (Dried Blood Spot (cellulose sheet)), DHS (Dried Humoral Spot (silk sheet)) immediately after and 2 weeks after the experiment (A: immediately after the experiment, B : After 2 weeks at 22 degrees and 43 degrees).
Figure 11 shows the data measured by chromatographic analysis of the amino acid content of different silk fibroin varieties (7 varieties) (A (Baekok jam), B (Geumgwang ju), C (Hansang II), D (Hong bak) ), E (Imbakgal won), F (N74), G (SK), H (Won jam 125), I (Won won 126)).

이상의 본 발명의 목적들, 다른 목적들, 특징들 및 이점들은 첨부된 도면과 관련된 이하의 바람직한 실시예들을 통해서 쉽게 이해될 것이다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 또 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 실시예들은 본 발명의 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 통상의 기술자에게 본 발명의 기술적으로 구현되는 의도가 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다.The above objects, other objects, features, and advantages of the present invention will be easily understood through the following preferred embodiments related to the accompanying drawings. However, the present invention is not limited to the embodiments described herein and may be embodied in another form. Rather, the embodiments introduced herein are provided so that the content of the present invention may be thorough and complete, and the intention to be technically embodied in the present invention may be sufficiently conveyed to those skilled in the art.

각각의 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다. 첨부된 도면에 있어서, 수치는 본 발명의 명확성을 위하여 실제보다 확대하여 도시한 것이다. 제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.In describing each drawing, similar reference numerals have been used for similar elements. In the accompanying drawings, numerical values are shown to be enlarged than actual for clarity of the present invention. Terms such as first and second may be used to describe various components, but the components should not be limited by the terms. These terms are used only for the purpose of distinguishing one component from another component. For example, without departing from the scope of the present invention, a first element may be referred to as a second element, and similarly, a second element may be referred to as a first element. Singular expressions include plural expressions unless the context clearly indicates otherwise.

본 발명에서, 사용되어지는 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 구성요소, 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 구성요소 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 다른 부분 "상에" 있다고 할 경우, 이는 다른 부분 "바로 위에" 있는 경우뿐만 아니라 그 중간에 또 다른 부분이 있는 경우도 포함한다. 반대로 다른 부분 "하부에" 있다고 할 경우, 이는 다른 부분 "바로 아래에" 있는 경우뿐만 아니라 그 중간에 또 다른 부분이 있는 경우도 포함한다.In the present invention, the terms used are intended to designate the existence of features, numbers, steps, elements, or combinations thereof described in the specification, but one or more other features or numbers, steps, elements, or combinations thereof It is to be understood that the possibility of the existence or addition of one thing is not precluded. In addition, when it is said to be "on" another part, this includes not only the case where it is "directly above" the other part, but also the case where there is another part in the middle. Conversely, when the other part is "under", this includes not only the case where the other part is "directly below", but also the case where there is another part in the middle.

본 발명에 사용되는 집누에나방(Bombyx mori)에서 피브로인을 추출하는 과정 중 정련 방법은 통상의 기술자에게 알려진 공지된 방법을 포함해 여러 방법에 의해 제조될 수 있다.In the process of extracting fibroin from the house silkworm moth ( Bombyx mori ) used in the present invention, the refining method may be prepared by various methods including known methods known to those skilled in the art.

본 발명에서 상기 “피브로인(Fibroin)”은 집누에나방 유충 등의 다른 나방 속에 의해 생산되는 실크에 포함된 불용성 단백질을 의미한다.In the present invention, the "Fibroin" refers to an insoluble protein contained in silk produced by other moth genus such as house silkworm larvae.

본 발명에서 용어 “실크”는 가잠견(Bombyx mori silkworm, 집누에) 또는 야잠견(Tussah, Giant silkworm, 들누에)을 통칭하여 누에로부터 추출한 피브로인 및 실크 그 자체를 의미할 수 있으며, 본 발명에서는 집누에라고도 불리는 가잠견을 사용하여 본 발명의 조성물을 제조하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the term "silk" may collectively refer to Bombyx mori silkworm or wild silkworm (Tussah, Giant silkworm, wild silkworm), and may mean fibroin and silk itself extracted from silkworms, and in the present invention The composition of the present invention was prepared by using the Gajam Dog, which is also called, but is not limited thereto.

통상적으로 본 발명에 사용되는 누에는 가잠견 또는 야잠견에 국한되지 아니한다. 하지만, 가잠견의 경우 글리신(Glycin) 42 내지 47 중량 백분율, 알라닌(Alanine) 27 내지 32 중량 백분율, 세린(Serine) 10 내지 14 중량 백분율의 비율을 일정하게 유지하고 있어, 각 구성 성분의 비율 예측 및 조정 가능해 사용하기 유리하다.The silkworm commonly used in the present invention is not limited to sleep dogs or sleep dogs. However, in the case of Gajam dogs, the ratio of 42 to 47 weight percent of glycine, 27 to 32 weight percent of alanine, and 10 to 14 weight percent of serine is kept constant, so the ratio of each component is predicted. And it is adjustable, which is advantageous to use.

누에에서 추출되는 단백질인 실크 피브로인은 대부분 반복된 소수성 부위와 친수성 부위를 가지는 중쇄(heavy chain)와 친수성 아미노산으로 구성된 경쇄(light chain)로 구성되어있다.Silk fibroin, a protein extracted from silkworms, is mostly composed of a heavy chain having repeated hydrophobic and hydrophilic sites and a light chain consisting of hydrophilic amino acids.

전술한 바와 같이 누에의 정련 과정은 여러 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 다만, 종래의 방법으로 초기 정련과정을 진행하는 경우, 도 1과 같이 소수성 부위를 가지는 중쇄(heavy chain)부분이 증가된다. 이렇게 증가된 중쇄가 베타 시트(β-sheet) 연결 공유결합을 형성시켜 본 발명의 목적인 안정화에 영향을 미칠 수 있다. As described above, the silkworm refining process can be performed using several methods. However, when the initial refining process is performed by the conventional method, a heavy chain portion having a hydrophobic portion is increased as shown in FIG. 1. This increased heavy chain may affect the stabilization, which is the object of the present invention, by forming a covalent bond linked to a beta sheet (β-sheet).

본 발명은 체액의 안정화를 위한 피브로인 조성물을 제조하기 위한 Bombyx mori의 정련 및 추출 프로세스를 제공한다.The present invention provides a scouring and extraction process of Bombyx mori for preparing a fibroin composition for stabilizing body fluids.

구체적으로, Na₂CO₃를 사용하여 시간은 60분 내지 120분, 온도는 100도 내지 120도, 압력은 0.1 내지 2.0mbar인 조건에서 정련을 시행하였다. Specifically, the refining was performed under the conditions of using Na ₂ CO ₃ for a time of 60 to 120 minutes, a temperature of 100 to 120 degrees, and a pressure of 0.1 to 2.0 mbar.

상기의 조건을 초과하여 정련을 실행하는 경우, Bombyx mori가 비등(boiling)되어 가수분해된 피브로인이 부분적으로 생성되므로, 본 발명의 목적성에 부합하지 않는다.When refining is performed in excess of the above conditions, Bombyx mori is boiled and hydrolyzed fibroin is partially produced, which does not meet the purpose of the present invention.

상기 Bombyx mori로부터 추출된 실크피브로인은 수성 염 용액에 용해될 수 있다.The silk fibroin extracted from Bombyx mori can be dissolved in an aqueous salt solution.

상기의 목적을 달성하기 위한 수성 용액은 브로민화리튬, 리튬 티오시아네이트, 질산칼슘, 칼슘클로라이드 혼합물 또는 추출물을 용해할 수 있는 다른 화학물질을 사용할 수 있다. The aqueous solution for achieving the above object may be lithium bromide, lithium thiocyanate, calcium nitrate, calcium chloride mixture, or other chemical substances capable of dissolving the extract.

일반적으로 브로민화리튬 용액을 이용하는 경우 분자량의 저하가 발생되지 않지만 예를 들어 CaCl₂가 함유된 혼합용액을 사용하는 경우에는 분자량 저하가 발생한다.In general, when a lithium bromide solution is used, a decrease in molecular weight does not occur, but when a mixed solution containing CaCl ₂ is used, for example, a decrease in molecular weight occurs.

본 발명에서는 통상적인 방법인 8 내지 12몰의 브로민화리튬을 사용하여 실크피브로인을 용해하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, silk fibroin was dissolved using 8 to 12 moles of lithium bromide, which is a conventional method, but is not limited thereto.

이후 염 용액을 제거하는 과정에서는 통상적인 방법으로서 멤브레인을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.Subsequently, in the process of removing the salt solution, a membrane may be used as a conventional method, but is not limited thereto.

한 실시양태에서, 피브로인과 수성용액의 첨가 비는 1:5 내지 1:100일 수 있다. 예를 들어 적어도 1:5, 적어도 1:10, 적어도 1:15, 적어도 1:20, 적어도 1:25, 적어도1:30, 적어도 1:40, 적어도 1:45, 적어도 1:50, 적어도 1:55, 적어도 1:60, 적어도 1:65, 적어도 1:70, 적어도 1:75, 적어도 1:80, 적어도 1:85, 적어도 1:90, 적어도 1:95, 적어도 1:100 이다.In one embodiment, the addition ratio of fibroin and aqueous solution may be from 1:5 to 1:100. For example at least 1:5, at least 1:10, at least 1:15, at least 1:20, at least 1:25, at least 1:30, at least 1:40, at least 1:45, at least 1:50, at least 1 :55, at least 1:60, at least 1:65, at least 1:70, at least 1:75, at least 1:80, at least 1:85, at least 1:90, at least 1:95, at least 1:100.

일부 실시양태에서, 온도는 50도 내지 160℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In some embodiments, the temperature may be between 50 degrees and 160 degrees Celsius, but is not limited thereto.

일부 실시양태에서, 시간은 예를 들어 적어도 60분 내지 240분일 수 있다. 예를 들어, 적어도 60분, 적어도 70분, 적어도 80분, 적어도 90분, 적어도 100분, 적어도 110분, 적어도 120분, 적어도 130분, 적어도 140분, 적어도 150분, 적어도 160분, 적어도 170분, 적어도 180분, 적어도 190분, 적어도 200분, 적어도 210분, 적어도 220분, 적어도 230분, 적어도 240분이다.In some embodiments, the time can be, for example, at least 60 minutes to 240 minutes. For example, at least 60 minutes, at least 70 minutes, at least 80 minutes, at least 90 minutes, at least 100 minutes, at least 110 minutes, at least 120 minutes, at least 130 minutes, at least 140 minutes, at least 150 minutes, at least 160 minutes, at least 170 Minutes, at least 180 minutes, at least 190 minutes, at least 200 minutes, at least 210 minutes, at least 220 minutes, at least 230 minutes, at least 240 minutes.

일부 실시양태에서는, 압력은 0.1 내지 2.0 atm일 수 있다. 예를 들어 적어도 0.1atm, 적어도 0.2 atm, 적어도 0.3 atm, 적어도 0.4 atm, 적어도 0.5 atm, 적어도 0.6 atm, 적어도 0.7 atm, 적어도 0.8 atm, 적어도 0.9 atm, 적어도 1.0 atm, 적어도 1.1 atm, 적어도 1.2 atm, 적어도 1.3 atm, 적어도 1.4 atm, 적어도 1.5 atm, 적어도 1.6 atm, 적어도 1.7 atm, 적어도 1.8 atm, 적어도 1.9 atm, 적어도 2.0 atm이다.In some embodiments, the pressure can be 0.1 to 2.0 atm. For example at least 0.1 atm, at least 0.2 atm, at least 0.3 atm, at least 0.4 atm, at least 0.5 atm, at least 0.6 atm, at least 0.7 atm, at least 0.8 atm, at least 0.9 atm, at least 1.0 atm, at least 1.1 atm, at least 1.2 atm , At least 1.3 atm, at least 1.4 atm, at least 1.5 atm, at least 1.6 atm, at least 1.7 atm, at least 1.8 atm, at least 1.9 atm, at least 2.0 atm.

일부 실시양태에서는, 중력은 3000 내지 20000RCF일 수 있다. 예를 들어 적어도 3000 RCF, 적어도 4000 RCF, 적어도 5000 RCF, 적어도 6000 RCF, 적어도 7000 RCF, 적어도 8000 RCF, 적어도 9000 RCF, 적어도 10000 RCF, 적어도 11000 RCF, 적어도 12000 RCF, 적어도 13000 RCF, 적어도 14000 RCF, 적어도 15000 RCF, 적어도 16000 RCF, 적어도 17000 RCF, 적어도 18000 RCF, 적어도 19000 RCF, 적어도 20000 RCF이다.In some embodiments, the gravity can be between 3000 and 20000 RCF. For example at least 3000 RCF, at least 4000 RCF, at least 5000 RCF, at least 6000 RCF, at least 7000 RCF, at least 8000 RCF, at least 9000 RCF, at least 10000 RCF, at least 11000 RCF, at least 12000 RCF, at least 13000 RCF, at least 14000 RCF , At least 15000 RCF, at least 16000 RCF, at least 17000 RCF, at least 18000 RCF, at least 19000 RCF, at least 20000 RCF.

일부 실시양태에서는, heavy chain, light chain 및 p25 단백질로 구성되어 있는 이중 피브로인은 글리신, 알라닌 및 세린이 반복되는 결정성 영역을 형성하는 11개의 도메인, 중간부분 그리고 C-말단 N-말단의 비결정성 영역으로 구성되어있다. In some embodiments, the double fibroin, which is composed of heavy chain, light chain and p25 protein, has 11 domains forming a crystalline region in which glycine, alanine, and serine are repeated, and amorphous at the C-terminal N-terminus. It consists of areas.

상기의 조건에서 제시한 범위의 온도, 시간, 압력, 중력 범위 내에서 heavy chain과 light chain의 중량 비율은 0.1 : 99.9 내지 10.0 : 90.0이 되도록 할 수 있다.The weight ratio of the heavy chain and the light chain within the range of temperature, time, pressure, and gravity within the ranges suggested in the above conditions may be 0.1:99.9 to 10.0:90.0.

예를 들어 0.1 : 99.9, 적어도 0.2 : 99.8, 적어도 0.3 : 99.7, 적어도 0.4 : 99.6, 적어도 0.5 : 99.5, 적어도 0.6 : 99.4, 적어도 0.7 : 99.3, 적어도 0.8 : 99.2, 적어도 0.9 : 99.1, 적어도 1.0 : 99.0, 적어도 1.1 : 98.9, 적어도 1.2 : 98.8, 적어도 1.3 : 98.7, 적어도 1.4 : 98.6, 적어도 1.5 : 98.5, 적어도 1.6 : 98.4, 적어도 1.7 : 98.3, 적어도 1.8 : 98.2, 적어도 1.9 : 98.1, 적어도 2.0 : 98.0, 적어도 2.1 : 97.9, 적어도 2.2 : 97.8, 적어도 2.3 : 97.7, 적어도 2.4 : 97.6, 적어도 2.5 : 97.5, 적어도 2.6 : 97.4, 적어도 2.7 : 97.3, 적어도 2.8 : 97.2, 적어도 2.9 : 97.1, 적어도 3.0 : 97.0, 적어도 3.1 : 96.9, 적어도 3.2 : 96.8, 적어도 3.3 : 96.7, 적어도 3.4 : 96.6, 적어도 3.5 : 96.5, 적어도 3.6 : 96.4, 적어도 3.7 : 96.3, 적어도 3.8 : 96.2, 적어도 3.9 : 96.1, 적어도 4.0 : 96.0, 적어도 4.1 : 95.9, 적어도 4.2 : 95.8, 적어도 4.3 : 95.7, 적어도 4.4 : 95.6, 적어도 4.5 : 95.5, 적어도 4.6 : 95.4, 적어도 4.7 : 95.3, 적어도 4.8 : 95.2, 적어도 4.9 : 95.1, 적어도 5.0 : 95.0, 적어도 , 적어도 5.1 : 94.9, 적어도 5.2 : 94.8, 적어도 5.3 : 94.7, 적어도 5.4 : 94.6, 적어도 5.5 : 94.5, 적어도 5.6 : 94.4, 적어도 5.7 : 94.3, 적어도 5.8 : 94.2, 적어도 5.9 : 94.1, 적어도 6.0 : 94.0, 적어도 6.1 : 93.9, 적어도 6.2 : 93.8, 적어도 6.3 : 93.7, 적어도 6.4 : 93.6, 적어도 6.5 : 93.5, 적어도 6.6 : 93.4, 적어도 6.7 : 93.3, 적어도 6.8 : 93.2, 적어도 6.9 : 93.1, 적어도 7.0 : 93.0, 적어도 7.1 : 92.9, 적어도 7.2 : 92.8, 적어도 7.3 : 92.7, 적어도 7.4 : 92.6, 적어도 7.5 : 92.5, 적어도 7.6 : 92.4, 적어도 7.7 : 92.3, 적어도 7.8 : 92.2, 적어도 7.9 : 92.1, 적어도 8.0 : 92.0, 적어도 8.1 : 91.9, 적어도 8.2 : 91.8, 적어도 8.3 : 91.7, 적어도 8.4 : 91.6, 적어도 8.5 : 91.5, 적어도 8.6 : 91.4, 적어도 8.7 : 91.3, 적어도 8.8 : 91.2, 적어도 8.9 : 91.1, 적어도 9.0 : 91.0, 적어도 9.1 : 90.9, 적어도 9.2 : 90.8, 적어도 9.3 : 90.7, 적어도 9.4 : 90.6, 적어도 9.5 : 90.5, 적어도 9.6 : 90.4, 적어도 9.7 : 90.3, 적어도 9.8 : 90.2, 적어도 9.9 : 90.1, 적어도 10.0 : 90.0 이다.For example 0.1:99.9, at least 0.2:99.8, at least 0.3:99.7, at least 0.4:99.6, at least 0.5:99.5, at least 0.6:99.4, at least 0.7:99.3, at least 0.8:99.2, at least 0.9:99.1, at least 1.0: 99.0, at least 1.1:98.9, at least 1.2:98.8, at least 1.3:98.7, at least 1.4:98.6, at least 1.5:98.5, at least 1.6:98.4, at least 1.7:98.3, at least 1.8:98.2, at least 1.9:98.1, at least 2.0: 98.0, at least 2.1:97.9, at least 2.2:97.8, at least 2.3:97.7, at least 2.4:97.6, at least 2.5:97.5, at least 2.6:97.4, at least 2.7:97.3, at least 2.8:97.2, at least 2.9:97.1, at least 3.0: 97.0, at least 3.1:96.9, at least 3.2:96.8, at least 3.3:96.7, at least 3.4:96.6, at least 3.5:96.5, at least 3.6:96.4, at least 3.7:96.3, at least 3.8:96.2, at least 3.9:96.1, at least 4.0: 96.0, at least 4.1:95.9, at least 4.2:95.8, at least 4.3:95.7, at least 4.4:95.6, at least 4.5:95.5, at least 4.6:95.4, at least 4.7:95.3, at least 4.8:95.2, at least 4.9:95.1, at least 5.0: 95.0, at least, at least 5.1:94.9, at least 5.2:94.8, at least 5.3:94.7, at least 5.4:94.6, at least 5.5:94.5, at least 5.6:94.4, at least 5.7:94.3, at least 5.8:94.2, at least 5.9:94.1, at least 6.0:94.0, at least 6.1:93.9, at least 6.2:93.8, At least 6.3:93.7, at least 6.4:93.6, at least 6.5:93.5, at least 6.6:93.4, at least 6.7:93.3, at least 6.8:93.2, at least 6.9:93.1, at least 7.0:93.0, at least 7.1:92.9, at least 7.2:92.8, At least 7.3:92.7, at least 7.4:92.6, at least 7.5:92.5, at least 7.6:92.4, at least 7.7:92.3, at least 7.8:92.2, at least 7.9:92.1, at least 8.0:92.0, at least 8.1:91.9, at least 8.2:91.8, At least 8.3:91.7, at least 8.4:91.6, at least 8.5:91.5, at least 8.6:91.4, at least 8.7:91.3, at least 8.8:91.2, at least 8.9:91.1, at least 9.0:91.0, at least 9.1:90.9, at least 9.2:90.8, At least 9.3:90.7, at least 9.4:90.6, at least 9.5:90.5, at least 9.6:90.4, at least 9.7:90.3, at least 9.8:90.2, at least 9.9:90.1, at least 10.0:90.0.

일부 실시양태에서, 상기의 조건에서 제시한 범위의 온도, 시간, 압력, 중력 범위 내에서 Gly의 중량 비율이 40%일 때, Gly(β)와 Gly(α)의 비율이 0.1 : 99.9 내지 10.0 : 90.0이 되도록 할 수 있다.In some embodiments, when the weight ratio of Gly is 40% within the range of temperature, time, pressure, and gravity within the ranges set forth in the above conditions, the ratio of Gly(β) and Gly(α) is 0.1:99.9 to 10.0. : Can be set to 90.0.

예를 들어, Gly(β)와 Gly(α)의 비율은 0.1 : 99.9, 적어도 0.2 : 99.8, 적어도 0.3 : 99.7, 적어도 0.4 : 99.6, 적어도 0.5 : 99.5, 적어도 0.6 : 99.4, 적어도 0.7 : 99.3, 적어도 0.8 : 99.2, 적어도 0.9 : 99.1, 적어도 1.0 : 99.0, 적어도 1.1 : 98.9, 적어도 1.2 : 98.8, 적어도 1.3 : 98.7, 적어도 1.4 : 98.6, 적어도 1.5 : 98.5, 적어도 1.6 : 98.4, 적어도 1.7 : 98.3, 적어도 1.8 : 98.2, 적어도 1.9 : 98.1, 적어도 2.0 : 98.0, 적어도 2.1 : 97.9, 적어도 2.2 : 97.8, 적어도 2.3 : 97.7, 적어도 2.4 : 97.6, 적어도 2.5 : 97.5, 적어도 2.6 : 97.4, 적어도 2.7 : 97.3, 적어도 2.8 : 97.2, 적어도 2.9 : 97.1, 적어도 3.0 : 97.0, 적어도 3.1 : 96.9, 적어도 3.2 : 96.8, 적어도 3.3 : 96.7, 적어도 3.4 : 96.6, 적어도 3.5 : 96.5, 적어도 3.6 : 96.4, 적어도 3.7 : 96.3, 적어도 3.8 : 96.2, 적어도 3.9 : 96.1, 적어도 4.0 : 96.0, 적어도 4.1 : 95.9, 적어도 4.2 : 95.8, 적어도 4.3 : 95.7, 적어도 4.4 : 95.6, 적어도 4.5 : 95.5, 적어도 4.6 : 95.4, 적어도 4.7 : 95.3, 적어도 4.8 : 95.2, 적어도 4.9 : 95.1, 적어도 5.0 : 95.0, 적어도 , 적어도 5.1 : 94.9, 적어도 5.2 : 94.8, 적어도 5.3 : 94.7, 적어도 5.4 : 94.6, 적어도 5.5 : 94.5, 적어도 5.6 : 94.4, 적어도 5.7 : 94.3, 적어도 5.8 : 94.2, 적어도 5.9 : 94.1, 적어도 6.0 : 94.0, 적어도 6.1 : 93.9, 적어도 6.2 : 93.8, 적어도 6.3 : 93.7, 적어도 6.4 : 93.6, 적어도 6.5 : 93.5, 적어도 6.6 : 93.4, 적어도 6.7 : 93.3, 적어도 6.8 : 93.2, 적어도 6.9 : 93.1, 적어도 7.0 : 93.0, 적어도 7.1 : 92.9, 적어도 7.2 : 92.8, 적어도 7.3 : 92.7, 적어도 7.4 : 92.6, 적어도 7.5 : 92.5, 적어도 7.6 : 92.4, 적어도 7.7 : 92.3, 적어도 7.8 : 92.2, 적어도 7.9 : 92.1, 적어도 8.0 : 92.0, 적어도 8.1 : 91.9, 적어도 8.2 : 91.8, 적어도 8.3 : 91.7, 적어도 8.4 : 91.6, 적어도 8.5 : 91.5, 적어도 8.6 : 91.4, 적어도 8.7 : 91.3, 적어도 8.8 : 91.2, 적어도 8.9 : 91.1, 적어도 9.0 : 91.0, 적어도 9.1 : 90.9, 적어도 9.2 : 90.8, 적어도 9.3 : 90.7, 적어도 9.4 : 90.6, 적어도 9.5 : 90.5, 적어도 9.6 : 90.4, 적어도 9.7 : 90.3, 적어도 9.8 : 90.2, 적어도 9.9 : 90.1, 적어도 10.0 : 90.0 이다.For example, the ratio of Gly(β) and Gly(α) is 0.1:99.9, at least 0.2:99.8, at least 0.3:99.7, at least 0.4:99.6, at least 0.5:99.5, at least 0.6:99.4, at least 0.7:99.3, At least 0.8:99.2, at least 0.9:99.1, at least 1.0:99.0, at least 1.1:98.9, at least 1.2:98.8, at least 1.3:98.7, at least 1.4:98.6, at least 1.5:98.5, at least 1.6:98.4, at least 1.7:98.3, At least 1.8:98.2, at least 1.9:98.1, at least 2.0:98.0, at least 2.1:97.9, at least 2.2:97.8, at least 2.3:97.7, at least 2.4:97.6, at least 2.5:97.5, at least 2.6:97.4, at least 2.7:97.3, At least 2.8:97.2, at least 2.9:97.1, at least 3.0:97.0, at least 3.1:96.9, at least 3.2:96.8, at least 3.3:96.7, at least 3.4:96.6, at least 3.5:96.5, at least 3.6:96.4, at least 3.7:96.3, At least 3.8:96.2, at least 3.9:96.1, at least 4.0:96.0, at least 4.1:95.9, at least 4.2:95.8, at least 4.3:95.7, at least 4.4:95.6, at least 4.5:95.5, at least 4.6:95.4, at least 4.7:95.3, At least 4.8:95.2, at least 4.9:95.1, at least 5.0:95.0, at least, at least 5.1:94.9, at least 5.2:94.8, at least 5.3:94.7, at least 5.4:94.6, at least 5.5:94.5, at least 5.6:94.4, at least 5.7: 94.3, at least 5.8:94.2, at least 5.9:94.1, at least 6.0:94.0, at least 6.1:9 3.9, at least 6.2:93.8, at least 6.3:93.7, at least 6.4:93.6, at least 6.5:93.5, at least 6.6:93.4, at least 6.7:93.3, at least 6.8:93.2, at least 6.9:93.1, at least 7.0:93.0, at least 7.1: 92.9, at least 7.2:92.8, at least 7.3:92.7, at least 7.4:92.6, at least 7.5:92.5, at least 7.6:92.4, at least 7.7:92.3, at least 7.8:92.2, at least 7.9:92.1, at least 8.0:92.0, at least 8.1: 91.9, at least 8.2:91.8, at least 8.3:91.7, at least 8.4:91.6, at least 8.5:91.5, at least 8.6:91.4, at least 8.7:91.3, at least 8.8:91.2, at least 8.9:91.1, at least 9.0:91.0, at least 9.1: 90.9, at least 9.2:90.8, at least 9.3:90.7, at least 9.4:90.6, at least 9.5:90.5, at least 9.6:90.4, at least 9.7:90.3, at least 9.8:90.2, at least 9.9:90.1, at least 10.0:90.0.

일부 실시양태에서, 상기의 조건에서 제시한 범위의 온도, 시간, 압력, 중력 범위 내에서 Gly의 중량 비율이 45%일 때, 적어도 Gly(β)와 Gly(α)의 비율이 0.1 : 99.9 내지 10.0 : 90.0이 되도록 할 수 있다.In some embodiments, when the weight ratio of Gly is 45% within the range of temperature, time, pressure, and gravity in the ranges set forth in the above conditions, the ratio of Gly(β) and Gly(α) is at least 0.1:99.9 to It can be set to 10.0: 90.0.

일부 실시양태에서, 상기의 조건에서 제시한 범위의 온도, 시간, 압력, 중력 범위 내에서 Gly의 중량 비율이 50%일 때, 적어도 Gly(β)와 Gly(α)의 비율이 0.1 : 99.9 내지 10.0 : 90.0이 되도록 할 수 있다.In some embodiments, when the weight ratio of Gly is 50% within the range of temperature, time, pressure, and gravity within the ranges set forth in the above conditions, at least the ratio of Gly(β) and Gly(α) is 0.1:99.9 to It can be set to 10.0: 90.0.

일부 실시양태에서, 상기의 조건에서 제시한 범위의 온도, 시간, 압력, 중력 범위 내에서 Ala의 중량 비율이 25%일 때, 적어도 Ala(β)와 Ala(α)의 비율이 0.1 : 99.9 내지 10.0 : 90.0이 되도록 할 수 있다.In some embodiments, when the weight ratio of Ala is 25% within the range of temperature, time, pressure, and gravity within the ranges set forth in the above conditions, at least the ratio of Ala(β) and Ala(α) is 0.1:99.9 to It can be set to 10.0: 90.0.

예를 들어, Ala(β)와 Ala(α)의 비율은 0.1 : 99.9, 적어도 0.2 : 99.8, 적어도 0.3 : 99.7, 적어도 0.4 : 99.6, 적어도 0.5 : 99.5, 적어도 0.6 : 99.4, 적어도 0.7 : 99.3, 적어도 0.8 : 99.2, 적어도 0.9 : 99.1, 적어도 1.0 : 99.0, 적어도 1.1 : 98.9, 적어도 1.2 : 98.8, 적어도 1.3 : 98.7, 적어도 1.4 : 98.6, 적어도 1.5 : 98.5, 적어도 1.6 : 98.4, 적어도 1.7 : 98.3, 적어도 1.8 : 98.2, 적어도 1.9 : 98.1, 적어도 2.0 : 98.0, 적어도 2.1 : 97.9, 적어도 2.2 : 97.8, 적어도 2.3 : 97.7, 적어도 2.4 : 97.6, 적어도 2.5 : 97.5, 적어도 2.6 : 97.4, 적어도 2.7 : 97.3, 적어도 2.8 : 97.2, 적어도 2.9 : 97.1, 적어도 3.0 : 97.0, 적어도 3.1 : 96.9, 적어도 3.2 : 96.8, 적어도 3.3 : 96.7, 적어도 3.4 : 96.6, 적어도 3.5 : 96.5, 적어도 3.6 : 96.4, 적어도 3.7 : 96.3, 적어도 3.8 : 96.2, 적어도 3.9 : 96.1, 적어도 4.0 : 96.0, 적어도 4.1 : 95.9, 적어도 4.2 : 95.8, 적어도 4.3 : 95.7, 적어도 4.4 : 95.6, 적어도 4.5 : 95.5, 적어도 4.6 : 95.4, 적어도 4.7 : 95.3, 적어도 4.8 : 95.2, 적어도 4.9 : 95.1, 적어도 5.0 : 95.0, 적어도 , 적어도 5.1 : 94.9, 적어도 5.2 : 94.8, 적어도 5.3 : 94.7, 적어도 5.4 : 94.6, 적어도 5.5 : 94.5, 적어도 5.6 : 94.4, 적어도 5.7 : 94.3, 적어도 5.8 : 94.2, 적어도 5.9 : 94.1, 적어도 6.0 : 94.0, 적어도 6.1 : 93.9, 적어도 6.2 : 93.8, 적어도 6.3 : 93.7, 적어도 6.4 : 93.6, 적어도 6.5 : 93.5, 적어도 6.6 : 93.4, 적어도 6.7 : 93.3, 적어도 6.8 : 93.2, 적어도 6.9 : 93.1, 적어도 7.0 : 93.0, 적어도 7.1 : 92.9, 적어도 7.2 : 92.8, 적어도 7.3 : 92.7, 적어도 7.4 : 92.6, 적어도 7.5 : 92.5, 적어도 7.6 : 92.4, 적어도 7.7 : 92.3, 적어도 7.8 : 92.2, 적어도 7.9 : 92.1, 적어도 8.0 : 92.0, 적어도 8.1 : 91.9, 적어도 8.2 : 91.8, 적어도 8.3 : 91.7, 적어도 8.4 : 91.6, 적어도 8.5 : 91.5, 적어도 8.6 : 91.4, 적어도 8.7 : 91.3, 적어도 8.8 : 91.2, 적어도 8.9 : 91.1, 적어도 9.0 : 91.0, 적어도 9.1 : 90.9, 적어도 9.2 : 90.8, 적어도 9.3 : 90.7, 적어도 9.4 : 90.6, 적어도 9.5 : 90.5, 적어도 9.6 : 90.4, 적어도 9.7 : 90.3, 적어도 9.8 : 90.2, 적어도 9.9 : 90.1, 적어도 10.0 : 90.0 이다.For example, the ratio of Ala(β) and Ala(α) is 0.1:99.9, at least 0.2:99.8, at least 0.3:99.7, at least 0.4:99.6, at least 0.5:99.5, at least 0.6:99.4, at least 0.7:99.3, At least 0.8:99.2, at least 0.9:99.1, at least 1.0:99.0, at least 1.1:98.9, at least 1.2:98.8, at least 1.3:98.7, at least 1.4:98.6, at least 1.5:98.5, at least 1.6:98.4, at least 1.7:98.3, At least 1.8:98.2, at least 1.9:98.1, at least 2.0:98.0, at least 2.1:97.9, at least 2.2:97.8, at least 2.3:97.7, at least 2.4:97.6, at least 2.5:97.5, at least 2.6:97.4, at least 2.7:97.3, At least 2.8:97.2, at least 2.9:97.1, at least 3.0:97.0, at least 3.1:96.9, at least 3.2:96.8, at least 3.3:96.7, at least 3.4:96.6, at least 3.5:96.5, at least 3.6:96.4, at least 3.7:96.3, At least 3.8:96.2, at least 3.9:96.1, at least 4.0:96.0, at least 4.1:95.9, at least 4.2:95.8, at least 4.3:95.7, at least 4.4:95.6, at least 4.5:95.5, at least 4.6:95.4, at least 4.7:95.3, At least 4.8:95.2, at least 4.9:95.1, at least 5.0:95.0, at least, at least 5.1:94.9, at least 5.2:94.8, at least 5.3:94.7, at least 5.4:94.6, at least 5.5:94.5, at least 5.6:94.4, at least 5.7: 94.3, at least 5.8:94.2, at least 5.9:94.1, at least 6.0:94.0, at least 6.1: 93.9, at least 6.2:93.8, at least 6.3:93.7, at least 6.4:93.6, at least 6.5:93.5, at least 6.6:93.4, at least 6.7:93.3, at least 6.8:93.2, at least 6.9:93.1, at least 7.0:93.0, at least 7.1: 92.9, at least 7.2:92.8, at least 7.3:92.7, at least 7.4:92.6, at least 7.5:92.5, at least 7.6:92.4, at least 7.7:92.3, at least 7.8:92.2, at least 7.9:92.1, at least 8.0:92.0, at least 8.1: 91.9, at least 8.2:91.8, at least 8.3:91.7, at least 8.4:91.6, at least 8.5:91.5, at least 8.6:91.4, at least 8.7:91.3, at least 8.8:91.2, at least 8.9:91.1, at least 9.0:91.0, at least 9.1: 90.9, at least 9.2:90.8, at least 9.3:90.7, at least 9.4:90.6, at least 9.5:90.5, at least 9.6:90.4, at least 9.7:90.3, at least 9.8:90.2, at least 9.9:90.1, at least 10.0:90.0.

일부 실시양태에서, 상기의 조건에서 제시한 범위의 온도, 시간, 압력, 중력 범위 내에서 Ala의 중량 비율이 30%일 때, 적어도 Ala(β)와 Ala(α)의 비율이 0.1 : 99.9 내지 10.0 : 90.0이 되도록 할 수 있다.In some embodiments, when the weight ratio of Ala is 30% within the range of temperature, time, pressure, and gravity in the ranges set forth in the above conditions, at least the ratio of Ala(β) and Ala(α) is 0.1:99.9 to It can be set to 10.0: 90.0.

예를 들어, Ala(β)와 Ala(α)의 비율은 0.1 : 99.9, 적어도 0.2 : 99.8, 적어도 0.3 : 99.7, 적어도 0.4 : 99.6, 적어도 0.5 : 99.5, 적어도 0.6 : 99.4, 적어도 0.7 : 99.3, 적어도 0.8 : 99.2, 적어도 0.9 : 99.1, 적어도 1.0 : 99.0, 적어도 1.1 : 98.9, 적어도 1.2 : 98.8, 적어도 1.3 : 98.7, 적어도 1.4 : 98.6, 적어도 1.5 : 98.5, 적어도 1.6 : 98.4, 적어도 1.7 : 98.3, 적어도 1.8 : 98.2, 적어도 1.9 : 98.1, 적어도 2.0 : 98.0, 적어도 2.1 : 97.9, 적어도 2.2 : 97.8, 적어도 2.3 : 97.7, 적어도 2.4 : 97.6, 적어도 2.5 : 97.5, 적어도 2.6 : 97.4, 적어도 2.7 : 97.3, 적어도 2.8 : 97.2, 적어도 2.9 : 97.1, 적어도 3.0 : 97.0, 적어도 3.1 : 96.9, 적어도 3.2 : 96.8, 적어도 3.3 : 96.7, 적어도 3.4 : 96.6, 적어도 3.5 : 96.5, 적어도 3.6 : 96.4, 적어도 3.7 : 96.3, 적어도 3.8 : 96.2, 적어도 3.9 : 96.1, 적어도 4.0 : 96.0, 적어도 4.1 : 95.9, 적어도 4.2 : 95.8, 적어도 4.3 : 95.7, 적어도 4.4 : 95.6, 적어도 4.5 : 95.5, 적어도 4.6 : 95.4, 적어도 4.7 : 95.3, 적어도 4.8 : 95.2, 적어도 4.9 : 95.1, 적어도 5.0 : 95.0, 적어도 , 적어도 5.1 : 94.9, 적어도 5.2 : 94.8, 적어도 5.3 : 94.7, 적어도 5.4 : 94.6, 적어도 5.5 : 94.5, 적어도 5.6 : 94.4, 적어도 5.7 : 94.3, 적어도 5.8 : 94.2, 적어도 5.9 : 94.1, 적어도 6.0 : 94.0, 적어도 6.1 : 93.9, 적어도 6.2 : 93.8, 적어도 6.3 : 93.7, 적어도 6.4 : 93.6, 적어도 6.5 : 93.5, 적어도 6.6 : 93.4, 적어도 6.7 : 93.3, 적어도 6.8 : 93.2, 적어도 6.9 : 93.1, 적어도 7.0 : 93.0, 적어도 7.1 : 92.9, 적어도 7.2 : 92.8, 적어도 7.3 : 92.7, 적어도 7.4 : 92.6, 적어도 7.5 : 92.5, 적어도 7.6 : 92.4, 적어도 7.7 : 92.3, 적어도 7.8 : 92.2, 적어도 7.9 : 92.1, 적어도 8.0 : 92.0, 적어도 8.1 : 91.9, 적어도 8.2 : 91.8, 적어도 8.3 : 91.7, 적어도 8.4 : 91.6, 적어도 8.5 : 91.5, 적어도 8.6 : 91.4, 적어도 8.7 : 91.3, 적어도 8.8 : 91.2, 적어도 8.9 : 91.1, 적어도 9.0 : 91.0, 적어도 9.1 : 90.9, 적어도 9.2 : 90.8, 적어도 9.3 : 90.7, 적어도 9.4 : 90.6, 적어도 9.5 : 90.5, 적어도 9.6 : 90.4, 적어도 9.7 : 90.3, 적어도 9.8 : 90.2, 적어도 9.9 : 90.1, 적어도 10.0 : 90.0 이다.For example, the ratio of Ala(β) and Ala(α) is 0.1:99.9, at least 0.2:99.8, at least 0.3:99.7, at least 0.4:99.6, at least 0.5:99.5, at least 0.6:99.4, at least 0.7:99.3, At least 0.8:99.2, at least 0.9:99.1, at least 1.0:99.0, at least 1.1:98.9, at least 1.2:98.8, at least 1.3:98.7, at least 1.4:98.6, at least 1.5:98.5, at least 1.6:98.4, at least 1.7:98.3, At least 1.8:98.2, at least 1.9:98.1, at least 2.0:98.0, at least 2.1:97.9, at least 2.2:97.8, at least 2.3:97.7, at least 2.4:97.6, at least 2.5:97.5, at least 2.6:97.4, at least 2.7:97.3, At least 2.8:97.2, at least 2.9:97.1, at least 3.0:97.0, at least 3.1:96.9, at least 3.2:96.8, at least 3.3:96.7, at least 3.4:96.6, at least 3.5:96.5, at least 3.6:96.4, at least 3.7:96.3, At least 3.8:96.2, at least 3.9:96.1, at least 4.0:96.0, at least 4.1:95.9, at least 4.2:95.8, at least 4.3:95.7, at least 4.4:95.6, at least 4.5:95.5, at least 4.6:95.4, at least 4.7:95.3, At least 4.8:95.2, at least 4.9:95.1, at least 5.0:95.0, at least, at least 5.1:94.9, at least 5.2:94.8, at least 5.3:94.7, at least 5.4:94.6, at least 5.5:94.5, at least 5.6:94.4, at least 5.7: 94.3, at least 5.8:94.2, at least 5.9:94.1, at least 6.0:94.0, at least 6.1:9 3.9, at least 6.2:93.8, at least 6.3:93.7, at least 6.4:93.6, at least 6.5:93.5, at least 6.6:93.4, at least 6.7:93.3, at least 6.8:93.2, at least 6.9:93.1, at least 7.0:93.0, at least 7.1: 92.9, at least 7.2:92.8, at least 7.3:92.7, at least 7.4:92.6, at least 7.5:92.5, at least 7.6:92.4, at least 7.7:92.3, at least 7.8:92.2, at least 7.9:92.1, at least 8.0:92.0, at least 8.1: 91.9, at least 8.2:91.8, at least 8.3:91.7, at least 8.4:91.6, at least 8.5:91.5, at least 8.6:91.4, at least 8.7:91.3, at least 8.8:91.2, at least 8.9:91.1, at least 9.0:91.0, at least 9.1: 90.9, at least 9.2:90.8, at least 9.3:90.7, at least 9.4:90.6, at least 9.5:90.5, at least 9.6:90.4, at least 9.7:90.3, at least 9.8:90.2, at least 9.9:90.1, at least 10.0:90.0.

일부 실시양태에서, 상기의 조건에서 제시한 범위의 온도, 시간, 압력, 중력 범위 내에서 Ala의 중량 비율이 35%일 때, 적어도 Ala(β)와 Ala(α)의 비율이 0.1 : 99.9 내지 10.0 : 90.0이 되도록 할 수 있다.In some embodiments, when the weight ratio of Ala is 35% within the range of temperature, time, pressure, and gravity in the ranges set forth in the above conditions, at least the ratio of Ala(β) and Ala(α) is 0.1:99.9 to It can be set to 10.0: 90.0.

예를 들어, 0.1 : 99.9, 적어도 0.2 : 99.8, 적어도 0.3 : 99.7, 적어도 0.4 : 99.6, 적어도 0.5 : 99.5, 적어도 0.6 : 99.4, 적어도 0.7 : 99.3, 적어도 0.8 : 99.2, 적어도 0.9 : 99.1, 적어도 1.0 : 99.0, 적어도 1.1 : 98.9, 적어도 1.2 : 98.8, 적어도 1.3 : 98.7, 적어도 1.4 : 98.6, 적어도 1.5 : 98.5, 적어도 1.6 : 98.4, 적어도 1.7 : 98.3, 적어도 1.8 : 98.2, 적어도 1.9 : 98.1, 적어도 2.0 : 98.0, 적어도 2.1 : 97.9, 적어도 2.2 : 97.8, 적어도 2.3 : 97.7, 적어도 2.4 : 97.6, 적어도 2.5 : 97.5, 적어도 2.6 : 97.4, 적어도 2.7 : 97.3, 적어도 2.8 : 97.2, 적어도 2.9 : 97.1, 적어도 3.0 : 97.0, 적어도 3.1 : 96.9, 적어도 3.2 : 96.8, 적어도 3.3 : 96.7, 적어도 3.4 : 96.6, 적어도 3.5 : 96.5, 적어도 3.6 : 96.4, 적어도 3.7 : 96.3, 적어도 3.8 : 96.2, 적어도 3.9 : 96.1, 적어도 4.0 : 96.0, 적어도 4.1 : 95.9, 적어도 4.2 : 95.8, 적어도 4.3 : 95.7, 적어도 4.4 : 95.6, 적어도 4.5 : 95.5, 적어도 4.6 : 95.4, 적어도 4.7 : 95.3, 적어도 4.8 : 95.2, 적어도 4.9 : 95.1, 적어도 5.0 : 95.0, 적어도 , 적어도 5.1 : 94.9, 적어도 5.2 : 94.8, 적어도 5.3 : 94.7, 적어도 5.4 : 94.6, 적어도 5.5 : 94.5, 적어도 5.6 : 94.4, 적어도 5.7 : 94.3, 적어도 5.8 : 94.2, 적어도 5.9 : 94.1, 적어도 6.0 : 94.0, 적어도 6.1 : 93.9, 적어도 6.2 : 93.8, 적어도 6.3 : 93.7, 적어도 6.4 : 93.6, 적어도 6.5 : 93.5, 적어도 6.6 : 93.4, 적어도 6.7 : 93.3, 적어도 6.8 : 93.2, 적어도 6.9 : 93.1, 적어도 7.0 : 93.0, 적어도 7.1 : 92.9, 적어도 7.2 : 92.8, 적어도 7.3 : 92.7, 적어도 7.4 : 92.6, 적어도 7.5 : 92.5, 적어도 7.6 : 92.4, 적어도 7.7 : 92.3, 적어도 7.8 : 92.2, 적어도 7.9 : 92.1, 적어도 8.0 : 92.0, 적어도 8.1 : 91.9, 적어도 8.2 : 91.8, 적어도 8.3 : 91.7, 적어도 8.4 : 91.6, 적어도 8.5 : 91.5, 적어도 8.6 : 91.4, 적어도 8.7 : 91.3, 적어도 8.8 : 91.2, 적어도 8.9 : 91.1, 적어도 9.0 : 91.0, 적어도 9.1 : 90.9, 적어도 9.2 : 90.8, 적어도 9.3 : 90.7, 적어도 9.4 : 90.6, 적어도 9.5 : 90.5, 적어도 9.6 : 90.4, 적어도 9.7 : 90.3, 적어도 9.8 : 90.2, 적어도 9.9 : 90.1, 적어도 10.0 : 90.0 이다.For example, 0.1:99.9, at least 0.2:99.8, at least 0.3:99.7, at least 0.4:99.6, at least 0.5:99.5, at least 0.6:99.4, at least 0.7:99.3, at least 0.8:99.2, at least 0.9:99.1, at least 1.0 :99.0, at least 1.1:98.9, at least 1.2:98.8, at least 1.3:98.7, at least 1.4:98.6, at least 1.5:98.5, at least 1.6:98.4, at least 1.7:98.3, at least 1.8:98.2, at least 1.9:98.1, at least 2.0 : 98.0, at least 2.1:97.9, at least 2.2:97.8, at least 2.3:97.7, at least 2.4:97.6, at least 2.5:97.5, at least 2.6:97.4, at least 2.7:97.3, at least 2.8:97.2, at least 2.9:97.1, at least 3.0 : 97.0, at least 3.1:96.9, at least 3.2:96.8, at least 3.3:96.7, at least 3.4:96.6, at least 3.5:96.5, at least 3.6:96.4, at least 3.7:96.3, at least 3.8:96.2, at least 3.9:96.1, at least 4.0 : 96.0, at least 4.1:95.9, at least 4.2:95.8, at least 4.3:95.7, at least 4.4:95.6, at least 4.5:95.5, at least 4.6:95.4, at least 4.7:95.3, at least 4.8:95.2, at least 4.9:95.1, at least 5.0 : 95.0, at least, at least 5.1:94.9, at least 5.2:94.8, at least 5.3:94.7, at least 5.4:94.6, at least 5.5:94.5, at least 5.6:94.4, at least 5.7:94.3, at least 5.8:94.2, at least 5.9:94.1, At least 6.0:94.0, at least 6.1:93.9, at least 6.2:93.8, At least 6.3:93.7, at least 6.4:93.6, at least 6.5:93.5, at least 6.6:93.4, at least 6.7:93.3, at least 6.8:93.2, at least 6.9:93.1, at least 7.0:93.0, at least 7.1:92.9, at least 7.2:92.8, At least 7.3:92.7, at least 7.4:92.6, at least 7.5:92.5, at least 7.6:92.4, at least 7.7:92.3, at least 7.8:92.2, at least 7.9:92.1, at least 8.0:92.0, at least 8.1:91.9, at least 8.2:91.8, At least 8.3:91.7, at least 8.4:91.6, at least 8.5:91.5, at least 8.6:91.4, at least 8.7:91.3, at least 8.8:91.2, at least 8.9:91.1, at least 9.0:91.0, at least 9.1:90.9, at least 9.2:90.8, At least 9.3:90.7, at least 9.4:90.6, at least 9.5:90.5, at least 9.6:90.4, at least 9.7:90.3, at least 9.8:90.2, at least 9.9:90.1, at least 10.0:90.0.

일부 실시양태에서, 본 조성물의 수용액의 pH 변화에 따라 분자쇄(chain) 간의 상호 결합 시간이 달라질 수 있다. In some embodiments, the mutual bonding time between molecular chains may vary depending on the pH change of the aqueous solution of the composition.

즉, 이론적으로는 피브로인을 포함한 단백질은 등전점(isoelectronic point) 부근에서 중쇄(heavy chain), 경쇄(light chain) 및 랜덤 코일(random coil) 분자쇄들이 양쪽성 이온(zwitter ion)을 형성하여 상호간의 이온 반발력이 최소화하게 된다. 이에 따라 거대 분자쇄들 사이에 소수성결합, 수소결합, 이온결합 등의 증가 또는 감소에 의해 β-sheet 구조가 형성되고, 망상구조로 발달하게 되어 겔의 형성에 영향을 준다. In other words, in theory, proteins containing fibroin form zwitter ions with heavy chain, light chain and random coil molecular chains near the isoelectronic point. Ion repulsion is minimized. Accordingly, a β-sheet structure is formed by the increase or decrease of hydrophobic bonds, hydrogen bonds, ionic bonds, etc. between the macromolecular chains, and develops into a network structure, which affects the formation of the gel.

본 발명에 생성된 조성물에서 적어도 pH 1 이하일때, 분자쇄간 상호 반발력이 작용하여 겔이 생성되지 않았다. pH 1 내지 13일 때는 분자쇄간 상호 반발력이 감소하여 겔 형성 시간이 감소되었다. pH 3 일 때 분자쇄간 상호 반발력이 최소이며, pH가 증가할수록 분자쇄간 상호 반발력이 증가하여 겔 형성 시간이 증가되었다. In the composition produced in the present invention, when the pH was at least 1 or less, the mutual repulsive force between the molecular chains worked, and the gel was not generated. When the pH was 1 to 13, the mutual repulsion between the molecular chains decreased, and the gel formation time was decreased. At pH 3, the mutual repulsion between molecular chains was minimal, and as the pH increased, the mutual repulsion between molecular chains increased and the gel formation time increased.

적어도 pH 13 이상에서는 분자쇄간의 음전하 또는 양전하가 우세하게 되며, 이에 따라 발생하는 분자간의 강한 이온 반발력으로 인하여 분자쇄들 사이에 응집이 이루어지지 않음을 실시예를 통해서 확인하였다.At least at pH 13 or higher, negative or positive charges between molecular chains predominate, and it was confirmed through examples that aggregation between molecular chains was not made due to the strong ionic repulsion between molecules.

일부 실시양태에서, 상기의 pH변화에 따른 분자쇄간의 상호 결합시간은 조성물의 농도에 따라 달라질 수 있으며, 농도는 0.1 중량 분율 내지 60 중량 분율일 수 있다. In some embodiments, the mutual bonding time between molecular chains according to the pH change may vary depending on the concentration of the composition, and the concentration may be 0.1 to 60 weight fraction.

예를 들어, 농도는 적어도 조성물의 농도가 0.1 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 1 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 2 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 3 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 4 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 5 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 6 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 7 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 8 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 9 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 10 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 11 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 12 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 13 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 14 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 15 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 16 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 17 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 18 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 19 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 20 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 21 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 22 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 23 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 24 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 25 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 26 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 27 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 28 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 29 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 30 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 31 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 32 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 33 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 34 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 35 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 36 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 37 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 38 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 39 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 40 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 41 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 42 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 43 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 44 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 45 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 46 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 47 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 48 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 49 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 50 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 51 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 52 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 53 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 54 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 55 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 56 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 57 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 58 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 59 중량 분율 일때, 적어도 조성물의 농도가 60 중량 분율 일때, 상기의 pH에 대한 특성이 발현된다.For example, the concentration is at least when the concentration of the composition is 0.1 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 1 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 2 weight fraction, when the concentration of the composition is at least 3 weight fraction, at least the concentration of the composition When is 4 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 5 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 6 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 7 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 8 weight fraction, at least the concentration of the composition When is 9 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 10 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 11 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 12 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 13 weight fraction, at least the concentration of the composition When is 14 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 15 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 16 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 17 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 18 weight fraction, at least the concentration of the composition Is 19 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 20 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 21 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 22 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 23 weight fraction, at least the concentration of the composition Is 24 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 25 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 26 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 27 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 28 weight fraction, at least the concentration of the composition Is 29 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 30 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 31 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 32 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 33 weight fraction, at least the concentration of the composition Is 34 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 35 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 36 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 37 weight fraction, at least of the composition When the concentration is 38 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 39 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 40 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 41 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 42 weight fraction, at least of the composition When the concentration is 43 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 44 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 45 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 46 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 47 weight fraction, at least of the composition When the concentration is 48 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 49 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 50 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 51 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 52 weight fraction, at least of the composition When the concentration is 53% by weight, at least when the concentration of the composition is 54% by weight, at least when the concentration of the composition is 55% by weight, at least when the concentration of the composition is 56% by weight, at least when the concentration of the composition is 57% by weight, When the concentration is 58 weight fraction, at least when the concentration of the composition is 59 weight fraction, and when the concentration of the composition is at least 60 weight fraction, the above characteristics for pH are expressed.

일부 실시양태에서, 상기 전체의 과정에서 제조된 본 발명의 조성물의 안정성을 추가하기 위해 추가적인 첨가물로써 글리세롤을 첨가할 수도 있다.In some embodiments, glycerol may be added as an additional additive to add stability to the composition of the present invention prepared in the entire process.

글리세롤의 첨가 함량은 본 발명의 수용액상 조성물 대비 적어도 20 중량 백분율, 적어도 25 중량 백분율, 적어도 30 중량 백분율, 적어도 35 중량 백분율, 적어도 40 중량 백분율, 적어도 45 중량 백분율, 적어도 50 중량 백분율, 적어도 55 중량 백분율, 적어도 60 중량 백분율, 적어도 65 중량 백분율, 적어도 70 중량 백분율, 적어도 75 중량 백분율, 적어도 80 중량 백분율, 적어도 85 중량 백분율, 적어도 90 중량 백분율 이다. The amount of glycerol added is at least 20% by weight, at least 25% by weight, at least 30% by weight, at least 35% by weight, at least 40% by weight, at least 45% by weight, at least 50% by weight, at least 55% by weight relative to the aqueous composition of the present invention. Percentage, at least 60 weight percentage, at least 65 weight percentage, at least 70 weight percentage, at least 75 weight percentage, at least 80 weight percentage, at least 85 weight percentage, at least 90 weight percentage.

상기의 범위 이상이면 글리세롤 함량이 증가함에 따라 겔화 시간이 서서히 감소한다. 이는 글리세롤의 강한 친수성 작용으로 단백질영역 내에서 물을 배제시켜 단백질의 소수성을 증가시킴으로써 소수성결합에 영향을 미치는 구조로 되어 안정화되기 때문이다.If it is more than the above range, the gelation time gradually decreases as the glycerol content increases. This is because the strong hydrophilic action of glycerol excludes water from within the protein region, thereby increasing the hydrophobicity of the protein, resulting in a structure that affects the hydrophobic bond and is stabilized.

일부 실시양태에서, 상기 과정에서 제조된 본 발명의 조성물은 셀룰로오스 베이스에 도포를 하여 동결 및 동결 건조된 시편 형태일 수 있다.In some embodiments, the composition of the present invention prepared in the above process may be applied to a cellulose base and freeze-dried and freeze-dried.

일부 실시양태에서, 상기 과정에서 제조된 본 발명의 조성물은 그 자체로 동결 및 동결 건조된 시편 형태일 수 있다.In some embodiments, the composition of the present invention prepared in the above process may itself be in the form of a frozen and freeze-dried specimen.

일부 실시양태에서, 상기 과정에서 제조된 본 발명의 조성물은 건조된 분말 입자 형태일 수 있다.In some embodiments, the composition of the present invention prepared in the above process may be in the form of dried powder particles.

일부 실시양태에서, 상기 전체의 과정에서 제조된 본 발명의 조성물은 플라스틱 및 그와 유사한 스틱에 도포하여 동결 및 동결 건조한 시편 형태일 수 있다.In some embodiments, the composition of the present invention prepared in the entire process may be in the form of freeze-dried and freeze-dried specimens applied to plastics and similar sticks.

일부 실시양태에서, 상기 전체의 과정에서 제조된 본 발명의 조성물은 수용액 상태의 시편일수도 있다.In some embodiments, the composition of the present invention prepared in the entire process may be a specimen in an aqueous solution state.

이하, 바람직한 실시예가 본 발명에 상세하게 묘사되고 기술되었지만, 관련 기술의 숙련자는 다양한 변형, 추가, 대체 등이 본 발명의 취지를 벗어남 없이 이루어질 수 있고 이것이 청구항에 정의된 본 발명의 범위 내에서 고려될 수 있음을 명확히 한다. 본 발명에 기술되고 설명된 다양한 실시 예 중 어느 하나가 본 발명에 개시된 다른 임의의 실시예에서 보여지는 특징을 도입하여 추가로 변형될 수 있다는 것이 통상의 관련 기술자에 의해 이해될 수 있다.Hereinafter, preferred embodiments have been described and described in detail in the present invention, but those skilled in the related art can make various modifications, additions, substitutions, etc. Make it clear that it can be. It can be understood by those skilled in the art that any one of the various embodiments described and described in the present invention may be further modified by introducing features shown in any other embodiment disclosed herein.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by examples. However, the following examples are only illustrative of the present invention, and the present invention is not limited by the following examples.

실시예 1. 고체 시편의 Ser, Gly, Ala 함량 분석Example 1. Analysis of Ser, Gly, Ala Content of Solid Specimen

본 발명의 고체 시편의 아미노산 조성을 확인하기 위하여, 세린(Ser), 글라이신(Gly) 및 알라닌(Ala)의 함량을 아미노산 분석기(L-8900, hitachi)를 사용하여 분석하였다. In order to confirm the amino acid composition of the solid specimen of the present invention, the contents of serine (Ser), glycine (Gly) and alanine (Ala) were analyzed using an amino acid analyzer (L-8900, hitachi).

구체적으로, 본 발명 조성물에 6N 염산 10mL을 가한 후, 내부를 질소 가스로 치환 및 밀봉하여 110℃ 온도에서 24시간 가열하여 가수분해한 후 아미노산을 측정하였다.Specifically, after 10 mL of 6N hydrochloric acid was added to the composition of the present invention, the inside was replaced with nitrogen gas, sealed, heated at 110° C. for 24 hours, hydrolyzed, and then amino acids were measured.

이때, 피브로인과 가용성 염의 비율은 1 대 40으로 고정하였고, G-Force는 3000 RCF로 고정하였으며, 온도, 시간, 압력 및 pH를 달리하여 1차 아미노산 중 Ser, Gly, Ala의 함량 차이를 확인하였다.At this time, the ratio of fibroin and soluble salt was fixed at 1 to 40, G-Force was fixed at 3000 RCF, and the difference in the contents of Ser, Gly, and Ala among the primary amino acids was confirmed by varying the temperature, time, pressure and pH. .

실험 1은 온도 50도, 실험 2는 온도 140도에서 제조하였고, 시간은 60분, 압력은 0.1atm, pH 2.5에서 제조하여 측정하였다.Experiment 1 was prepared at a temperature of 50 degrees and experiment 2 was prepared at a temperature of 140 degrees, and the time was 60 minutes, the pressure was 0.1 atm, and the pH was 2.5.

실험 3는 시간 60분, 실험 4는 시간 240분에서 제조하였고, 온도 50도, 압력은 0.1atm, pH 2.5에서 제조하여 측정하였다.Experiment 3 was prepared at a time of 60 minutes and experiment 4 was prepared at a time of 240 minutes, and a temperature of 50 degrees and a pressure were prepared and measured at 0.1 atm and pH of 2.5.

실험 5는 압력 0.1atm, 실험 6은 압력 2.0atm에서 제조하였고, 온도 50도, 시간은 60분, pH 2.5에서 제조하여 측정하였다.Experiment 5 was prepared at a pressure of 0.1 atm and test 6 at a pressure of 2.0 atm, and the temperature was 50 degrees, the time was 60 minutes, and the pH was 2.5.

실험 7은 pH 2.5, 실험 8은 pH 3.0, 실험 9는 pH 3.5에서 제조하였고, 온도 50도, 시간은 60분, 압력은 0.1atm에서 제조하여 측정하였다.Experiment 7 was prepared at pH 2.5, Experiment 8 was prepared at pH 3.0, Experiment 9 was prepared at pH 3.5, and the temperature was 50 degrees, time was 60 minutes, and the pressure was prepared and measured at 0.1 atm.

실험 1Experiment 1 실험 2Experiment 2 실험 3Experiment 3 실험 4Experiment 4 실험 5Experiment 5 실험 6Experiment 6 실험 7Experiment 7 실험 8Experiment 8 실험 9Experiment 9 SerSer 2.52.5 4.04.0 1.81.8 1.31.3 3.63.6 3.23.2 3.93.9 3.23.2 3.53.5 GlyGly 40.440.4 40.640.6 41.041.0 46.546.5 40.840.8 40.240.2 40.640.6 40.440.4 46.446.4 AlaAla 30.430.4 28.328.3 28.328.3 30.730.7 28.428.4 29.829.8 27.927.9 28.228.2 27.127.1

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 본 실험을 통해 본 발명에서 제시한 범위에서 제조한 실크 피브로인 단백질 조성물의 1차 아미노산 서열 중 글리신 및 알라닌 함량은 증가되는 반면, 상대적으로 세린의 함량은 감소하여 본 발명의 조성물이 수용액상에서의 안정성을 확보할 수 있음을 확인하였다.As shown in Table 1 above, the content of glycine and alanine in the primary amino acid sequence of the silk fibroin protein composition prepared in the range presented in the present invention through this experiment increased, while the content of serine was relatively decreased. It was confirmed that the composition of can secure stability in an aqueous solution.

실시예 2. 건조체액반점(DHS)의 분자량 분포 측정Example 2. Measurement of molecular weight distribution of dry body liquid spot (DHS)

분자량 분포를 측정하기 위해 동결 건조된 시편을 요소에 첨가하여 4M의 실크 수용액을 제조한 후 Fast Protein Liquid Chromatography(FPLC)(AKTA Purifier, Amersham Biosciences)로 측정하였다. 칼럼은 superdex 200 10/300GL를 사용하였고, 유량속도는 0.5ml/min으로 하였다.To measure the molecular weight distribution, a freeze-dried specimen was added to the urea to prepare a 4M aqueous silk solution, and then measured by Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) (AKTA Purifier, Amersham Biosciences). The column was superdex 200 10/300GL, and the flow rate was 0.5 ml/min.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 수용액 상태의 피브로인 시료는 크로마토그램에서는 분자량의 상한분획한계에 해당하는 10 min 지점에서 날카로운 피크(sharp peak)와 15 min에서 30 min까지 넓은 영역에서 넓은 피크(broad peak)를 나타내었다. As a result, as shown in Fig. 2, the fibroin sample in the aqueous solution state in the chromatogram shows a sharp peak at 10 min, corresponding to the upper fraction limit of molecular weight, and a broad peak in a wide range from 15 min to 30 min. peak).

즉, 수용액 상태의 피브로인은 약 350kDa의 heavy chain의 펩타이드로부터 칼럼의 분획한계인 30 kDa 이하까지 넓은 범위의 분자량 분포를 가지는 것을 확인하였다. That is, it was confirmed that fibroin in aqueous solution has a wide range of molecular weight distribution from about 350 kDa heavy chain peptide to 30 kDa or less, which is the fraction limit of the column.

10 min에 나타나는 peak는 부분적으로 중쇄(heavy chain), 경쇄(light chain), 랜덤 코일(random coil)이 시간의 경과에 따라 분자쇄 간의 β-sheet를 형성함으로써 겔을 형성하는 것을 확인하였다.It was confirmed that the peak appearing at 10 min partially formed a gel by partially forming a β-sheet between molecular chains of a heavy chain, a light chain, and a random coil over time.

유전자 염기서열에 기반하여 계산한 중쇄(heavy chain)의 분자량은 340kDa이므로, 상기 실험 결과를 보면 본 발명의 피브로인 조성물은 분자쇄가 서로 뭉쳐서 단백질 콜로이드를 형성하는 것을 억제하는 것으로 보인다. Since the molecular weight of the heavy chain calculated based on the gene sequence is 340 kDa, the above experimental results show that the fibroin composition of the present invention inhibits the formation of protein colloids due to the aggregation of molecular chains.

또한, 이와 동시에 서로 연결되는 3차원적 망상구조를 형성하는 분산계의 반고형 겔 형성을 억제함으로써, 보다 안정화된 조성물을 제조할 수 있음을 확인하였다.In addition, it was confirmed that a more stabilized composition can be prepared by suppressing the formation of a semi-solid gel of a dispersion system that forms a three-dimensional network that is connected to each other at the same time.

실시예 3. 건조체액반점(DHS)의 13C NMR 구조 분석Example 3. 13C NMR structure analysis of dry body liquid spots (DHS)

실크 피브로인에 대한 구조적 유사성을 확인하기 위하여, 13C NMR 분석을 실시하였다. In order to confirm the structural similarity to silk fibroin, 13C NMR analysis was performed.

본 발명을 통해 제조한 실크 단백질 조성물을 물로 결정화시킨 시료에서는 분광 분석 결과 Gly(C_α) 44.6ppm, Gly(C=O) 169.5ppm, Ala(C_α)49.8ppm, Ala(C_β) 21.4ppm, Ala(C=O) 173.0 ppm에서 peak가 관측되었다.In the sample obtained by crystallizing the silk protein composition prepared through the present invention with water, the spectroscopic analysis result of Gly(C _α ) 44.6 ppm, Gly(C=O) 169.5 ppm, Ala(C _α ) 49.8 ppm, Ala(C _β ) 21.4 ppm , Ala(C=O) peak was observed at 173.0 ppm.

메탄올을 이용하여 결정화시킨 조성물에서는 각각 Gly(C_α) 45.6ppm, Gly (C=O) 170.4ppm, Ala(C_α) 50.7ppm, Ala(C_β) 22.1 ppm, Ala(C=O) 173.9 ppm에서 peak가 관측되었다. In the composition crystallized using methanol, Gly(C _α ) 45.6 ppm, Gly (C=O) 170.4 ppm, Ala(C _α ) 50.7 ppm, Ala(C _β ) 22.1 ppm, Ala(C=O) 173.9 ppm, respectively A peak was observed at.

그리고 메탄올과 물의 혼합 용액에(80:20)의해 결정화된 조성물은 Gly(C_α) 44.5 ppm, Gly(C=O) 169.4ppm, Ala(C_α) 49.7ppm, Ala(C_β) 20.7 ppm, Ala(C=O) 172.0 ppm에서 peak가 관측이 되었다.And the composition crystallized by a mixed solution of methanol and water (80:20) was Gly(C _α ) 44.5 ppm, Gly(C=O) 169.4 ppm, Ala(C _α ) 49.7 ppm, Ala(C _β ) 20.7 ppm, A peak was observed at 172.0 ppm of Ala(C=O).

silk Ⅱ의 구조에서 특징적으로 나타나는 Ala β 탄소 Ala(C_β)에 의한 peak가 20 ppm 부근에서 나타나는 것으로 보아, 본 발명에서 제조된 조성물은 모두 피브로인과 유사한 구조적인 특성을 나타나는 것을 확인하였다.It was confirmed that the peak due to the Ala β carbon Ala (C _β ), which is characteristic in the structure of silk Ⅱ, appears at around 20 ppm, and all of the compositions prepared in the present invention exhibit structural properties similar to fibroin.

실시예 4. 생물학적 시편으로부터의 혈액 회수Example 4. Blood recovery from biological specimens

본 발명에서 사용되는 생체 시편의 혈장 및 혈액의 회수율을 계산하기 위하여, 혈액 및 혈장 시편으로부터 회수된 단백질의 수치를 공여자와 일치된 혈장에서 발견된 농도로 정확하게 변환하여 회수율 효율을 측정하였다. In order to calculate the plasma and blood recovery rates of the biological specimens used in the present invention, the levels of proteins recovered from the blood and plasma specimens were accurately converted to the concentration found in the plasma matched with the donor, and the recovery efficiency was measured.

혈액 및 혈장의 물리적 측정을 위해 흄 후드(Fume Hood)에서 24시간 동안 전혈 또는 전체 혈장을 건조시키고 잔류물을 측정함으로써, 혈액 또는 혈장의 무게/부피 분율(중량%; 단위 부피(ml)당 혈액 또는 건조된 혈장(g))을 측정하였다. 그리고 혈액 중 혈장 부피를 기존 문헌에 따라 55%로 가정하여 혈액 부피 당 혈장 고체의 중량 분율을 추정하였으며, 이를 하기 계산식 1 및 2에 나타내었다.For physical measurement of blood and plasma, by drying whole blood or whole plasma for 24 hours in a fume hood and measuring the residue, the weight/volume fraction of blood or plasma (% by weight; blood per unit volume (ml)) Alternatively, dried plasma (g)) was measured. In addition, the weight fraction of plasma solids per blood volume was estimated by assuming that the plasma volume in blood was 55% according to the existing literature, and these are shown in the following calculation equations 1 and 2.

[계산식 1][Calculation 1]

혈액 중 고체 혈장 중량 fraction(g/mL) = 혈장 중량 fraction(g/mL) Ⅹ 0.55 (혈장 부피 mL/전체 혈액 부피 mL)Solid plasma weight fraction in blood (g/mL) = plasma weight fraction (g/mL) Ⅹ 0.55 (plasma volume mL/total blood volume mL)

[계산식 2][Calculation 2]

생체 시편의 중량 당 고체혈장 fraction(g/g) = 혈액 중의 건조된 혈장 중량 fraction(g/mL) Ⅹ 0.02 mL 혈액Solid plasma fraction per weight of biological specimen (g/g) = Dry plasma weight fraction in blood (g/mL) Ⅹ 0.02 mL blood

고체 혈장의 질량 표준화는 40mg 시편 중 혈장 농도(mg/mL)와 곱하고 이것을 960ul의 1ⅩPBS에 현탁한 부피(약 1.02±0.05 mL) 중 총 고체 혈장의 질량을 표준화하여 계산식 3 및 4에 나타내었다.The mass normalization of solid plasma was multiplied by the plasma concentration (mg/mL) in a 40 mg specimen, and the mass of total solid plasma was normalized in the volume (about 1.02±0.05 mL) suspended in 960 ul of 1×PBS, and is shown in Equations 3 and 4.

[계산식 3][Calculation 3]

40mg 생체 시편 중 이론적 혈장 fraction (mg/mL) = 혈장 시편의 중량 당 고체 혈장(mg/mg) Ⅹ 시편 40mg Ⅹ (혈장 농도(mg/mL)/(고체 혈장 중량 fraction(mg/mL) Ⅹ PBS 현탁부피(mL))Theoretical plasma fraction (mg/mL) in 40mg biological specimen = solid plasma per weight of plasma specimen (mg/mg) Ⅹ specimen 40mg Ⅹ (plasma concentration (mg/mL)/(solid plasma weight fraction (mg/mL)) Ⅹ PBS Suspension volume (mL))

[계산식 4][Equation 4]

40mg 생체 시편 중 이론적 혈액 fraction (mg/mL) = 혈액 시편의 중량 당 고체 혈장(mg/mg) Ⅹ 시편 40mg Ⅹ (혈장 농도(mg/mL)/(고체 혈장 중량 fraction(mg/mL) Ⅹ PBS 현탁부피(mL))Theoretical blood fraction (mg/mL) in 40mg biological specimen = solid plasma per weight of blood specimen (mg/mg) Ⅹ specimen 40mg Ⅹ (plasma concentration (mg/mL)/(solid plasma weight fraction (mg/mL)) Ⅹ PBS Suspension volume (mL))

상기한 방법 및 계산식을 이용하여 5명의 혈액을 1ml씩 추출하고, 이들의 측정 평균치를 하기 표 2에 나타내었다.Using the above-described method and calculation formula, 1 ml of blood was extracted from 5 people, and the average values of these measurements are shown in Table 2 below.

혈액 중량 fractionBlood weight fraction 혈장 중량 fractionPlasma weight fraction 고체 혈장 중량 fractionSolid plasma weight fraction 혈액 중량 당
고체 혈장Per blood weight
Solid plasma 혈장 중량 당
고체 혈장Per weight of plasma
Solid plasma 0.220.22 0.100.10 0.060.06 0.040.04 0.070.07

상기의 결과로부터, 본 발명의 조성물을 이용하면 혈액 및 혈장의 회수율이 통계학적으로 유의한 수준에 도달할 수 있음을 확인하였다.따라서, 본 발명의 조성물을 사용하면 혈액 및 혈장의 종류에 관계없이, 생체 시편으로부터 분석물을 효과적으로 회수할 수 있음을 확인하였다.From the above results, it was confirmed that the recovery rate of blood and plasma can reach a statistically significant level when the composition of the present invention is used. Therefore, when the composition of the present invention is used, regardless of the type of blood and plasma, it was confirmed , It was confirmed that the analyte can be effectively recovered from the biological specimen.

실시예 5. C-반응성단백질의 회수율Example 5. Recovery rate of C-reactive protein

본 발명의 조성물을 이용하는 경우의 분석물 회수율을 측정하였다. 마커로 사용된 분석물로서 C-반응성단백질을 사용하였고, 측정 결과 통계학적으로 유의한 수준에 도달한 것을 확인하였다. When using the composition of the present invention, the analyte recovery rate was measured. C-reactive protein was used as an analyte used as a marker, and it was confirmed that the measurement result reached a statistically significant level.

구체적으로, 본 실험방법은 간단한 채혈로 얻은 검체를 면역 검사(immunoassay)를 이용하여 C-반응성 단백질의 함량을 측정하였다. Specifically, in this experimental method, the content of C-reactive protein was measured using an immunoassay from a sample obtained by simple blood collection.

일반적으로 사용하는 면역 검사 방법(immunoassay)으로는 응집법(particle immunoassay), 효소 면역 측정법(enzyme immunoassay, EIA), 방사 면역 측정법, 형광 면역 측정법, 화학 발광 면역 측정법 등을 사용할 수 있다. 본 실시예 에서는 효소 면역 측정법(enzyme immunoassay, EIA)을 이용하여 C-반응성단백질을 수치화 하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다. As a generally used immunoassay, a particle immunoassay, an enzyme immunoassay (EIA), a radioimmunoassay, a fluorescence immunoassay, a chemiluminescence immunoassay, and the like can be used. In this example, the C-reactive protein was quantified using an enzyme immunoassay (EIA), but the present invention is not limited thereto.

전 처리과정을 거친 두 종의 샘플에 결합하는 항체에 효소를 미리 부착시켜 놓고 항원 항체반응을 유도하였다. 그 후 결합한 효소에 반응하는 기질을 첨가하여 효소 반응을 유도하였다.The enzyme was previously attached to the antibody that binds to the two samples that had undergone the pretreatment process, and the antigen-antibody reaction was induced. Thereafter, a substrate reacting to the bound enzyme was added to induce an enzyme reaction.

이때 사용되는 효소는 알카리성 인산분해효소(alkaline phosphatase), 당근과산화효소(horseradish peroxidase), 메타갈라토시다제(β-galactosidase) 중 어느 하나를 사용하여 측정 가능하다. 그리고 효소 반응 후 분광광도계(spectrophotometer)을 사용하여 C-반응성 단백질의 농도를 도출하였다.The enzyme used at this time can be measured using any one of alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, and β-galactosidase. And after the enzyme reaction, the concentration of C-reactive protein was derived using a spectrophotometer.

건강한 성인 남성 10명을 대상으로 측정한 결과 플라즈마 샘플에서는 평균 수치는 0.7±0.2(mg/dL)을 나타내었으며, 본 조성물에서 측정한 수치는 0.7±0.23(mg/dL)로 나타나는 것을 확인하였다. As a result of measuring 10 healthy adult males, the average value in the plasma sample was 0.7±0.2 (mg/dL), and it was confirmed that the value measured in this composition was 0.7±0.23 (mg/dL).

실시예 6. 액체 혈장대비 매트릭스의 안정화 검증 실험Example 6. Stabilization verification experiment of matrix versus liquid plasma

본 실시예는 Luminex Assays 프로토콜을 이용하여 액체 혈장대비 매트릭스의 안정화를 비교하는 실험을 실시하였다.In this example, an experiment was conducted to compare the stabilization of a matrix versus liquid plasma using the Luminex Assays protocol.

구체적으로, 본 조성물의 저장 상태 및 샘플운송 시간 프레임을 시뮬레이션하기 위해 22℃ 및 38℃의 항온 인큐베이터에서 30일 동안 샘플을 보관한 후, 별도의 공여자 혈액 샘플에서 3개의 마커를 측정하였다. Specifically, after storing the sample for 30 days in a constant temperature incubator at 22 ℃ and 38 ℃ in order to simulate the storage state and sample transport time frame of the present composition, three markers were measured in separate donor blood samples.

상기 3개의 마커는 SAP(혈청 아밀로이드 P 성분, serum amyloid P component), sVCAM-1(수용성 세포 부착 분자, soluble cell adhesion molecule) 및 CRP(C-반응성 단백질, C-reactive protein)를 사용하였다.As the three markers, SAP (serum amyloid P component), sVCAM-1 (soluble cell adhesion molecule) and CRP (C-reactive protein, C-reactive protein) were used.

22℃에서의 보관 안정성은 표 3에, 38℃에서의 보관 안정성은 표 4에 나타내었다. 이때, 건조체액시편(DHS)에 혈장을 처리한 것은 DHS(혈장), 혈액을 처리한 것은 DHS(혈액)으로 표시하였다. 또한, 혈장은 -20℃에서 동결 보관 및 해동 후에 검측하였다.Storage stability at 22°C is shown in Table 3, and storage stability at 38°C is shown in Table 4. At this time, the dried bodily fluid specimen (DHS) treated with plasma was expressed as DHS (plasma), and the blood treated as DHS (blood). In addition, plasma was detected after freezing and thawing at -20°C.

DHS (혈장)DHS (plasma) DHS (혈액)DHS (blood) 혈장plasma CRP % recoveryCRP% recovery 8585 7575 9595 SAP % recoverySAP% recovery 9595 110110 9595 sVCAM-1 % recoverysVCAM-1% recovery 9797 105105 8080

DHS (혈장)DHS (plasma) DHS (혈액)DHS (blood) 혈장plasma CRP % recoveryCRP% recovery 8080 7575 9595 SAP % recoverySAP% recovery 110110 110110 110110 sVCAM-1 % recoverysVCAM-1% recovery 9595 105105 4040

상기 결과에 나타난 바와 같이, 본 조성물을 이용해 처리한 혈장 및 혈액은 sVCAM-1, CRP, SAP에서 -20℃에서 동결된 혈장과 비슷한 수준의 회복 정도를 보여, 우수한 안정성을 가지는 것을 확인하였다.As shown in the above results, plasma and blood treated with the present composition showed a degree of recovery similar to that of plasma frozen at -20°C in sVCAM-1, CRP, and SAP, and it was confirmed to have excellent stability.

실시예 7. 보존 온도 및 시간에 따른 바이오 마커의 회수 및 안정성 실험Example 7. Recovery and stability experiments of biomarkers according to storage temperature and time

상기 실시예 6에서 확인한 3종의 바이오마커 외에 프로락틴(prolactin), 태아성암항원(carcinoembryonic antigen, CEA), 렙틴(leptin), TNF 관련 세포사멸 유도 리간드(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand, TRAIL) 및 총 전립선 특이 항원(total prostate specific antigen, total PSA)을 대상으로 온도 및 시간에 따른 회수 및 안정성 실험을 실시하였고, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.In addition to the three biomarkers identified in Example 6, prolactin, carcinoembryonic antigen (CEA), leptin, TNF-related apoptosis inducing ligand (tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand, TRAIL), and The total prostate specific antigen (total PSA) was subjected to recovery and stability experiments according to temperature and time, and the results are shown in Table 5 below.

이때, 하기 표 5에서 LP는 액체 혈장(Liquid Plasma), DHS는 본 발명 조성물 시트 기반의 건조체액반점, DBS는 셀룰로오스 시트 기반의 건조체액 반점을 나타내었다.At this time, in Table 5 below, LP represents liquid plasma, DHS represents dry body fluid spots based on the composition sheet of the present invention, and DBS represents dry body fluid spots based on cellulose sheet.

0 일(DAY)0 DAY 2주 후2 weeks later LPLP DHSDHS DBSDBS LPLP DHSDHS DBSDBS 보존온도 (℃)Storage temperature (℃) -80℃-80℃ 22℃22℃ 22℃22℃ 22℃22℃ 22℃22℃ 43℃43℃ 22℃22℃ 43℃43℃ 22℃22℃ 43℃43℃
마hemp
커Big PROLACTINPROLACTIN ●● ●● ●● ○○ ○○ ○○ ●● ●● ○○ ○○ CEACEA ●● ●● ●● ○○ ●● ○○ ●● ●● ●● ○○ LEPTINLEPTIN ●● ●● ●● ○○ ●● ○○ ◎◎ ●● ○○ ○○ TRAILTRAIL ●● ●● ●● ●● ○○ ●● ●● ●● ●● ○○ TOTAL PSATOTAL PSA ●● ●● ●● ○○ ○○ ○○ ●● ●● ○○ ○○ - ● : 유의한 차이가 없음
- ◎ : 유의하게 낮은 수준
- ○ : 안정성 문제 발생-●: No significant difference
-◎: Significantly low level
-○: Stability problem occurred

상기 실험 결과에 나타난 바와 같이, 본 발명의 조성물인 DHS는 상온 및 높은 온도에서 우수한 저장안정성을 보이며, 기존 기술인 셀룰로오스 시트 기반의 기술 대비 현저히 개선된 효과를 나타내는 것을 확인하였다.전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.As shown in the above experimental results, it was confirmed that the composition of the present invention, DHS, exhibits excellent storage stability at room and high temperatures, and significantly improved effects compared to the conventional cellulose sheet-based technology. Is for illustration, and those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains will be able to understand that other specific forms can be easily transformed without changing the technical spirit or essential features of the present invention. Therefore, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not limiting. For example, each component described as a single type may be implemented in a distributed manner, and similarly, components described as being distributed may also be implemented in a combined form.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.The scope of the present invention is indicated by the claims to be described later, and all changes or modified forms derived from the meaning and scope of the claims and the concept of equivalents thereof should be construed as being included in the scope of the present invention.

Claims

In the silk fibroin protein composition excellent in resolubility,
The content of glycine relative to the total amino acid content of the silk fibroin protein composition is 40.2 to 46.5% by weight, the content of alanine is 27.1 to 30.7% by weight, and the content of serine is 1.3 to 4.0% by weight,
The silk fibroin protein composition has an average molecular weight of 32 kDa to 340 kDa,
The composition is prepared in the range of pH 2.5 to 3.5, atmospheric pressure 0.1 atm to 2.0 atm, acceleration of gravity of 3000 RCF, and reaction time of 60 to 240 minutes,
The composition is itself freeze-dried and freeze-dried or in any one of freeze-dried and freeze-dried specimens applied to a cellulose base or plastic stick,
The composition is characterized in that the storage and recovery stability of at least one biomarker selected from the group consisting of SAP, sVCAM-1, CRP, prolactin, CEA, leptin, TRAIL and PSA at 22°C to 38°C for at least 14 days is maintained. To, silk fibroin protein composition.

The method of claim 1,
The glycine is composed of glycine (β) and glycine (α),
The ratio of glycine (β) and glycine (α) is 0.1:99.9 to 10:90,
The alanine is composed of alanine (β) and alanine (α),
The ratio of alanine (β) and alanine (α) is 0.1:99.9 to 10:90,
The composition comprises a heavy chain and a light chain,
Silk fibroin protein composition, wherein the weight ratio of the heavy chain and the light chain is 0.1:99.9 to 10:90.

delete

The method of claim 1,
The composition is re-solubilized in water to form a silk fibroin solution free of fibroin aggregates, silk fibroin protein composition.