KR102193023B1 - 감염성 안질환 동물모델 및 이의 제작방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 감염성 안질환 동물모델 및 이의 제작방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 감염성 안질환의 치료를 위해 사용되는 항생제 남용으로 인해 나타나는 병원성 내성을 감소시키기고, 치료 약제 개발 및 치료제 농도 측정을 진행할 수 있게 함으로서 다재 내성에 대한 대책과 감염환자 치료에 도움을 줄 수 있는 엔테로코쿠스(Enterococcus) 및 스타필로코쿠스스(Staphylococcus)를 이용한 감염성 안질환 동물모델을 제작하는 것에 관한 것이다.
Description
본 발명은 감염성 안질환 동물모델 및 이의 제작방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 감염성 안질환의 치료를 위해 사용되는 항생제 남용으로 인해 나타나는 병원성 내성을 감소시키기고, 치료 약제 개발 및 치료제 농도 측정을 진행할 수 있게 함으로서 다재 내성에 대한 대책과 감염환자 치료에 도움을 줄 수 있는 엔테로코쿠스(Enterococcus) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)를 이용한 감염성 안질환 동물모델을 제작하는 것에 관한 것이다.
눈은 외부환경 및 자극에 항상 노출되어 있다. 신체기관으로 항상성을 유지하기 위하여 눈꺼풀의 깜박임, 눈물의 각결막 표면청소 및 세균의 배출 작용, 결막의 풍부한 림프 조직 및 지속적인 결막상피 탈락, 눈물에 함유된 면역글로불린, 라이소자임, 락토페린, 보체의 항균작용 같은 여러 방어기전을 가지고 있다. 외부에서 침입한 세균의 수 및 병원성 정도에 따라 이러한 정상 방어기전이 무너질 때 다양한 감염성 안질환이 발생할 수 있다.
이러한 감염성 안질환은 결막염, 각막염, 안내염, 눈물주머니염 및 눈물소관염, 안내충전물감염증, 외상 후 안구파열, 기타 안감염 등을 포함하는 것으로, 여러 가지 합병증을 일으키기도 한다. 먼저 감염부위가 눈꺼풀이면 다래끼가 발병할 수 있다. 홍채, 모양체, 맥락막으로 확대되면 포도막염이 될 수 있다. 눈물샘이나 눈물을 배출하는 비루관이 감염되면 비루관 폐쇄증이 발병하는 경우도 있다. 감염이 각막궤양의 근본원인이 되기도 하는데 치료해도 회복이 어렵고 심각한 시력손상을 일으키는 질병이다. 감염성 안질환은 신속하고 적절한 치료가 이루어지지 않으면 미용적 문제부터 실명에 이르기까지 다양하고 심각한 합병증이 생길 수 있다.
감염성 안질환은 균 배양검사 이전에 광범위 항생제 치료를 시작하고 이후 임상반응 및 균 배양검사 결과에 따라 치료약제를 변경한다. 이와 같은 임상적인 현실은 항생제 남용으로 인한 병원균 내성의 증가가 발생할 가능성이 높다. 안내염은 눈 안에 발생하는 염증으로 시력이 치명적인 영향을 미칠 수 있는 질병으로 알려져 있다. 국내에서 발생되는 안내염 비율은 해마다 비슷하게 유지되고 있으며, 성별에 따른 차이는 없이 나이가 많을수록 감염 비율이 높게 나타나고 있다. 특히, 60대 ~ 80대 고령의 비율에서 높게 나타나고 있다.
안내염의 주요 원인 세균은 피부에 서식하는 스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis, SE)으로 알려져 있으며, 최근에는 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis, EF)의 감염 비율이 점차 증가하고 있는 추세이다.
상기 엔테로코구스 패칼리스는 그람 양성(Gram positive)균으로 임상검체에서 자주 발견되는 균주 중 하나로 많은 감염증의 원인으로 알려지고 있다. 아미노글리코사이드(Aminoglycoside) 계열, 반코마이신 (vancomycin), 안내염 치료에 많이 이용되는 플루오로퀴놀론(Fluoroquinolone) 계열 등 대한 약제 내성이 높다.
이와 관련하여, 목시플록사신(Moxifloxacin)은 4세대 합성 플루오르퀴놀론 항세균제로, 바이엘사(Bayer AG, 초기 명칭은 BAY 12-8039)에서 개발하였다. 이 약은 경구 치료제 '아벨록스(Avelox)', 'Avalox', 'Avelon'의 명칭으로 판매되고 있으며, 대부분의 나라에서 정맥 투여를 위한 비경구의 형태로도 보급되고 있다. 목시플록사신은 또한 결막염의 치료를 위해 'Vigamox'의 명칭의 안과용 용액(안약)으로도 판매되고 있으나, 1개의 약제가 아닌 2개 이상의 약제에 저항을 가지는 다제 내성도 많이 발생되고 있어 감염환자 치료에 어려움이 발생되고 있다.
이러한 문제는 지나친 항생제 사용과 실제적인 치료 농도 측정이 이루어지지 않은 것이 문제점의 하나가 된 것으로 판단된다.
따라서, 전술한 문제점을 보완하기 위해 본 발명가들은 안구 내 사용할 수 있는 치료 약제 개발 및 치료제 농도 측정을 진행할 수 있게 함으로서 다재 내성에 대한 대책과 감염환자 치료에 도움을 줄 수 있는 동물모델의 개발이 시급하다 인식하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 염성 안질환의 치료를 위해 사용되는 항생제 남용으로 인해 나타나는 병원성 내성을 감소시키기 위해 엔테로코쿠스(Enterococcus) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)를 이용한 감염성 안질환 동물모델 및 이의 제작방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 엔테로코쿠스(Enterococcus) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)를 이용한 감염성 안질환 동물모델, 이의 제작방법 및 이의 스크리닝 방법을 제공한다.
이하, 본 명세서에 대하여 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명은 균주 엔테로코쿠스 및 스타필로코쿠스를 인간을 제외한 정상 포유동물에 투여하여 얻어진 것을 특징으로 하는 감염성 안질환 동물모델을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 엔테로코쿠스은 엔터로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis)이고, 상기 스타필로코쿠스는 스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 감염성 안질환은 결막염, 각막염, 안내염, 눈물주머니염, 눈물소관염, 안내충전물감염증, 외상 후 안구파열 또는 안검염인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 (S1) 균주 엔테로코쿠스 및 스타필로코쿠스를 인간을 제외한 정상 포유동물의 눈꺼풀에 점적하는 단계; 및 (S2) 상기 (S1) 단계 후 상기 포유동물의 눈을 봉합하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 감염성 안질환 동물모델의 제작방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 (S1) 단계의 엔테로코쿠스은 엔터로코쿠스 패칼리스이고, 상기 스타필로코쿠스는 스타필로코쿠스 에피더미디스인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 균주는 동물 개체 당 1 × 105 내지 1 × 109 CFU(Colony Forming Unit)로 접종되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 감염성 안질환은 결막염, 각막염, 안내염, 눈물주머니염, 눈물소관염, 안내충전물감염증, 외상 후 안구파열 또는 안검염인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 인간을 제외한 정상 포유동물은 토끼인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 균주 엔테로코쿠스, 스타필로코쿠스 및 플루오로퀴놀론계(Fluoroquinolone) 항생제 점안액을 인간을 제외한 정상 포유동물의 눈꺼풀에 점적하는 단계; 상기 포유동물의 눈을 봉합하는 단계; 및 상기 봉합된 눈을 절개하여 균을 확인하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 감염성 안질환 동물모델의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 (A1) 단계의 엔테로코쿠스은 엔터로코쿠스 패칼리스이고, 상기 스타필로코쿠스는 스타필로코쿠스 에피더미디스인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 플루오로퀴놀론계 항생제는 레보플록사신(levofloxacin), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 목시플록사신(moxifloxacin), 노르플록사신(norfloxacin) 또는 오플록사신(ofloxacin)인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 감염성 안질환 동물모델, 이의 제작방법 및 이의 스크리닝 방법에서 언급된 모든 사항은 서로 모순되지 않는 한 동일하게 적용된다.
본 발명의 엔테로코쿠스(Enterococcus) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)를 이용한 감염성 안질환 동물모델은 감염성 안질환의 치료를 위해 사용되는 항생제 남용으로 인해 나타나는 병원성 내성을 감소시키기고, 치료 약제 개발 및 치료제 농도 측정을 진행할 수 있게 함으로서 다재 내성에 대한 대책과 감염환자 치료에 도움을 줄 수 있다.
상기와 같은 동물모델은 감염성 안질환의 진단, 치료제 개발 및 스크리닝 등에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 제작방법에 따라 제작되는 감염성 안질환 동물모델에 대한 이미지이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 감염성 안질환 동물모델의 균주 병변에 대한 코로니(colony)를 확인한 이미지이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 감염성 안질환 동물모델의 균주 병변에 대한 세균의 항균효과 확인한 이미지이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 감염성 안질환 동물모델의 균주 병변에 대한 코로니(colony)를 확인한 이미지이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 감염성 안질환 동물모델의 균주 병변에 대한 세균의 항균효과 확인한 이미지이다.
본 발명은 감염성 안질환 동물모델, 이의 제작방법 및 이의 스크리닝 방법을 제공한다.
감염성 안질환 동물모델
본 발명은 엔테로코쿠스(Enterococcus) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)를 이용한 감염성 안질환 동물모델을 제공한다.
보다 구체적으로, 본 발명은 균주 엔테로코쿠스 패칼리스 및 스타필로코쿠스 에피더미디스를 인간을 제외한 정상 포유동물에 투여하여 제작된 감염성 안질환 동물모델에 관한 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 “감염성 안질환”이란, 외부에서 침입한 세균 또는 바이러스에 의해 정상 방어기전이 무너져 안구에 발생하는 질환의 총칭을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 엔테로코쿠스은 엔터로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis, EF)이고, 상기 스타필로코쿠스는 스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis, SE)인 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 감염성 안질환은 결막염, 각막염, 안내염, 눈물주머니염, 눈물소관염, 안내충전물감염증, 외상 후 안구파열 또는 안검염일 수 있으나, 외부 세균 또는 바이러스에 의해 발생한 안질환이라면 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 용어 “인간을 제외한 정상 포유동물”은 척삭동물문의 한 강인 포유강(Mammalia)에 속하는 동물의 총칭을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 포유동물은 바람직하게는 토끼일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 엔테로코쿠스 패칼리스 및 스타필로코쿠스 에피더미디스를 이용한 감염성 안질환 동물모델은 감염성 안질환의 치료를 위해 사용되는 항생제 남용으로 인해 나타나는 병원성 내성을 감소시키기고, 치료 약제 개발 및 치료제 농도 측정을 진행할 수 있게 함으로서 다재 내성에 대한 대책과 감염환자 치료에 도움을 줄 수 있다.
감염성 안질환 동물모델의 제작방법
본 발명은 하기의 단계를 포함하는 감염성 안질환 동물모델의 제작방법을 제공한다.
(S1) 균주 엔테로코쿠스 및 스타필로코쿠스를 인간을 제외한 정상 포유동물의 눈꺼풀에 점적하는 단계; 및
(S2) 상기 (S1) 단계 후 상기 포유동물의 눈을 봉합하는 단계.
본 발명에서 사용된 용어 “포함”이란, 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 (S1) 단계의 엔테로코쿠스는 엔터로코쿠스 패칼리스이고, 상기 스타필로코쿠스는 스타필로코쿠스 에피더미디스인 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 (S1) 단계 이전에 상기 인간을 제외한 정상 포유동물을 마취하는 과정을 추가적으로 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 인간을 제외한 정상 포유동물에 마취제를 투여하여 동물모델을 제작할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 “투여”란, 약 따위를 복용시키거나 주사하는 모든 행위의 총칭을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 투여는 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비 경구 투여할 수 있으며, 비 경구 투여 시 피부 외용 또는 복강내 주사, 직장내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 또는 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양해 질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (S1) 단계는 균주 엔테로코쿠스 패칼리스 및 스타필로코쿠스 에피더미디스를 인간을 제외한 정상 포유동물의 눈꺼풀에 점적하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 동물모델은 안구의 눈꺼풀에 균주 엔테로코쿠스 패칼리스 및 스타필로코쿠스 에피더미디스를 점적하여 제작된 동물모델일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 인간을 제외한 정상 포유동물의 눈꺼풀 아래쪽을 핀셋 등으로 내린 후, 피펫을 이용하여 상기 균주를 점적할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 동물모델은 병변의 시작, 진행, 및 약물의 치료효과에 대한 반응을 쉽고 간편하게, 그리고 재현가능하게 관찰할 수 있다는 점에서 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 균주는 동물 개체 당 1 × 105 내지 1 × 109 CFU(Colony Forming Unit)로 접종될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 동물의 종류, 크기 및 체중을 고려하여 당업자가 적절하게 판단할 수 있다. 예컨대, 체중이 3 내지 4 kg인 토끼를 사용할 경우, 2.5 × 107 CFU의 균주를 점적할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (S2) 단계는 상기 (S1) 단계 후 상기 포유동물의 눈을 봉합하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 “봉합”이란, 절단한 부위 또는 갈라진 부위를 꿰매어 붙이는 모든 일의 총칭을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 봉합은 상기 균주가 배출되는 것을 가장 효율적으로 방지하기 위해 연속봉합법으로 봉합하는 것이 바람직하나, 상기 균주의 배출을 방지하기 위한 봉합 방법이라면 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 감염성 안질환은 결막염, 각막염, 안내염, 눈물주머니염, 눈물소관염, 안내충전물감염증, 외상 후 안구파열 또는 안검염일 수 있으나, 외부 세균 또는 바이러스에 의해 발생한 안질환이라면 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 인간을 제외한 정상 포유동물은 기니피그(guinea pig), 햄스터, 쥐와 같은 설치류, 고양이, 개, 돼지, 토끼, 양, 염소, 사슴, 말, 소, 비비, 침팬지 및 원숭이와 같은 비-인간 영장류일 수 있으며, 바람직하게는 안질환 병변을 보다 상세하게 관찰할 수 있는 정도의 중소동물일 수 있으며, 보다 바람직하게는 토끼일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 감염성 안질환 동물모델의 제작방법은 보가 간편하게 동물모델을 제작할 수 있으며, 감염성 안질환의 진단, 치료제 개발 및 스크리닝 등에 유용하게 이용될 수 있다.
감염성 안질환 동물모델의 스크리닝 방법
본 발명은 하기의 단계를 포함하는 감염성 안질환 동물모델의 스크리닝 방법을 제공한다.
A1) 균주 엔테로코쿠스, 스타필로코쿠스 및 플루오로퀴놀론계(Fluoroquinolone) 항생제 점안액을 인간을 제외한 정상 포유동물의 눈꺼풀에 점적하는 단계;
(A2) 상기 (A1) 단계 후 상기 포유동물의 눈을 봉합하는 단계; 및
(A3) 상기 (A2) 단계에서 봉합된 눈을 절개하여 균을 확인하는 단계.
본 발명에 사용된 용어 “플루오로퀴놀론계 항생제”란, 퀴놀린의 6번 탄소 위치에 불소(F)가 결합된 항생제 화합물을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 동물모델의 스크리닝은 항생제 내성균에 효과가 있는지 확인하기 위한 스크리닝 방법이다.
본 발명에 있어서, 상기 (A1) 단계의 엔테로코쿠스은 엔터로코쿠스 패칼리스이고, 상기 스타필로코쿠스는 스타필로코쿠스 에피더미디스인 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 (A1) 단계에서 균주 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis, EF), 스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis, SE) 및 플루오로퀴놀론계(Fluoroquinolone) 항생제 점안액은 동시에 점적하거나 차례대로 점적할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 플루오로퀴놀론계 항생제는 레보플록사신(levofloxacin), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 목시플록사신(moxifloxacin), 노르플록사신(norfloxacin) 또는 오플록사신(ofloxacin)일 수 있으며, 바람직하게는 목시플록사신일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 플루오로퀴놀론계 항생제의 투여량은 동물모델의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양해 질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 감염성 안질환 병변의 변화를 관찰하는 단계는 육안, 현미경 또는 내시경을 이용한 관찰, 초음파, 외과적 수술, 조직 검사 또는 조직 염색을 포함하여 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의해 수행될 수 있으며, 구체적인 목적에 따라 당업자가 판단하여 적절하게 결정할 수 있다. 예컨대, 상기 감염성 안질환 병변의 변화를 관찰하는 단계는 바람직하게는 육안 관찰, 내시경, 또는 초음파를 이용해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 감염성 안질환 동물모델, 이의 제작방법 및 이의 스크리닝 방법에서 언급된 모든 사항은 서로 모순되지 않는 한 동일하게 적용된다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
실시예 1. 감염성 안질환 동물모델 제작을 위한 준비
1. 마취제 제조
마취제로서 조레틸(Zoletil) 마취제와 근육이완제 럼푼(Rompun)을 이용하였다. 상기 조레틸 마취제 5 ㎖에 근육이완제 럼푼 2 ㎖을 혼합하여 인간을 제외한 정상 포유동물을 마취하기 위해 마취제를 제조하였다.
2. 트립틱 소이 브로스(Triptic soy broth) 용액 제조
트립틱 소이 브로스 30 g을 정량하여 증류수 1000 ㎖에 혼합 후 121 ℃에서 20분 동안 고온멸균한 후 4 ℃에 보관하였다.
3. 컬러 디텍션 아가(Color detection agar) 배지 제조
엠비 셀(MB Cell)에서 시판 중인 컬러 디텍션 아가 58.12 g을 증류수 1000 ㎖에 혼합하고, 121 ℃에서 20분 동안 고온멸균한 후 페트리디쉬(petri dish)에 일정량을 부은 후 굳혀 배지를 제조하였다.
4. 엔테로코쿠스 패칼리스 및 스타필로코쿠스 에피더미디스 균액 제조.
트립틱 소이 브로스에 엔테로코쿠스 패칼리스 및 스타필로코쿠스 에피더미디스의 싱글 콜로니(Single colony)를 20시간 배양한 후 새로운 트립틱 소이 브로스에 배양된 균액 1%를 넣은 후 3시간 배양하였다. 배양된 두 균액은 원심분리기를 이용하여 분리하여 상층액 버리고 0.85% 식염수를 넣어 균액을 제조하였다. 이를 맥팔랜드 스탠다드 0.5 (Mcfarland standard 0.5)로 조졸하여 총 10 ㎖의 균액을 만든 후 원심분리기를 이용하여 분리한 후 상층액은 버리고 잔류물에 0.85% 식염수 0.5 ㎖를 넣어 2.0 × 109 CFU/㎖ 균액을 제조하였다. 4.0 × 109 CFU/㎖ 균액은 최종 잔류물에서 0.85 % 식염수 0.25 ㎖를 넣어 제조하였다.
실험예 1. 토끼 안구 내 세균 감염 확인
실험에 사용한 균주는 상기 실시예에서 제조된 엔테로코쿠스 패칼리스 및 스타필로코쿠스 에피더미디스 2종의 균주를 이용하여 실험하였으며, 자세한 내용은 하기 [표 1]에 나타내었다. 실험에 사용된 포유동물로는 3 내지 3.8 ㎏의 수컷 토끼를 이용하였으며, 모든 실험은 IRB 규정에 의거하여 진행하였다.
[표 1]
실험에 사용된 토끼는 5 ㎖ 주사기를 이용하여 상기 실시예에서 제조된 마취제 1.5 ㎖를 정량한 후 3 ~ 3.8 ㎏ 토끼 뒷다리에 주사하여 마취시켰다. 그리고, 마취된 토끼의 눈 아래쪽 눈꺼풀을 핀셋으로 들어 올리고 피펫을 이용하여 상기 엔테로코쿠스 패칼리스 및 스타필로코쿠스 에피더미디스 2종의 균액을 각각 12.5 ㎕씩 안구 안쪽에 떨어뜨렸다. 균액의 콜로니 수는 2.5 x 107 CFU 이다. 이후 수술용 실을 이용하여 연속봉합법으로 눈을 봉합하였다. 4시간이 지난 후 흡입용 마취제를 이용하여 토끼를 마취한 후 수술용 가위를 이용하여 봉합된 수술용 실을 제거하고, 핀셋으로 토끼 눈 아래쪽 눈꺼풀을 든 후 면봉으로 눈꺼풀 안쪽에 밀착시켜 이동하면서 세균을 채취하였다. 세균이 채취된 면봉은 0.85% 식염수 1 ㎖에 넣고 혼합기를 이용하여 풀어낸 후 10배 단위로 희석하였다. 희석된 용액은 컬러 디텍션 아가 배지(Color detection agar, MB Cell)에 100 ㎕를 떨어뜨려 퍼뜨린 후 37 ℃에서 24시간 동안 배양한 후 콜로니 색깔을 이용하여 세균의 콜로니(colony)를 확인하였다. 확인된 콜로니는 조절된 CFU(Colony Forming Unit)에 맞춰 아래의 [계산식]을 이용하여 계산하였다.
[계산식]
(Ⅰ) 2 x 10
9
CFU/ml 일 경우
(ⅰ) 10
6
으로 희석된 콜로니 수 < 200 일 때
200 CFU ÷ 106 으로 희석된 콜로니 수 = 비율, 106 으로 희석된 콜로니 수 × 비율 = 조절된 콜로니 수
(ⅱ) 10
6
으로 희석된 콜로니 수 > 200 일 때
(106 으로 희석된 콜로니 수 ÷ 200 CFU) - 1 = 비율, 106 으로 희석된 콜로니 수 - ( 106 으로 희석된 콜로니 수 × 비율) = 조절된 콜로니 수
(Ⅱ) 4 x 10
9
CFU/ml 일 경우
(ⅰ) 10
6
으로 희석된 콜로니 수 < 400 일 때
400 CFU ÷ 106 으로 희석된 콜로니 수 = 비율, 106 으로 희석된 콜로니 수 × 비율 = 조절된 콜로니 수
(ⅱ) 10
6
으로 희석된 콜로니 수 > 400 일 때
(106 으로 희석된 콜로니 수 ÷ 400 CFU) - 1 = 비율, 106 으로 희석된 콜로니 수 - ( 106 으로 희석된 콜로니 수 × 비율) = 조절된 콜로니 수
상기 결과를 하기 [표 2]와 도 2에 나타내었다.
[표 2]
상기 [표 2]는 102으로 희석하여 배양한 결과로서, 엔테로코쿠스 패칼리스 는 4시간 234.04으로 나타났으며, 스타필로코쿠스 에피더미디스은 4시간 46.86으로 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
또한 [도 2]는 (A) 10, (B)102, (C) 103 및 (D) 104배로 희석하여 각각 배양한 결과로서 파란색의 엔테로코쿠스 패칼리스와 베이지색의 스타필로코쿠스 에피더미디스 확인되고 있으며, [표 2]의 결과와 부합된 결과를 보여주고 있다. 따라서, 상기 결과로부터 엔테로코쿠스 패칼리스 및 스타필로코쿠스 에피더미디스로 인해 발현된 감염성 안질환 동물모델이 제작되었음을 확인할 수 있다.
실험예 2. 토끼 안구 내 세균의 항균효과 확인
실험에 사용된 토끼는 5 ㎖ 주사기를 이용하여 상기 실시예에서 제조된 마취제 1.5 ㎖를 정량한 후 3 ~ 3.8 ㎏ 토끼 뒷다리에 주사하여 마취시켰다. 그리고, 마취된 토끼의 눈 아래쪽 눈꺼풀을 핀셋으로 들어 올리고 피펫을 이용하여 상기 엔테로코쿠스 패칼리스 및 스타필로코쿠스 에피더미디스 2종의 균액을 각각 12.5 ㎕씩 안구 안쪽에 떨어뜨렸다. 균액의 콜로니 수는 2.5 x 107 CFU 이다. 그리고 항생제로서 목시플록사신을 추가적으로 점적하였다. 이후 수술용 실을 이용하여 연속봉합법으로 눈을 봉합하였다. 4시간이 지난 후 흡입용 마취제를 이용하여 토끼를 마취한 후 수술용 가위를 이용하여 봉합된 수술용 실을 제거하고, 핀셋으로 토끼 눈 아래쪽 눈꺼풀을 든 후 면봉으로 눈꺼풀 안쪽에 밀착시켜 이동하면서 세균을 채취하였다. 세균이 채취된 면봉은 0.85% 식염수 1 ㎖에 넣고 혼합기를 이용하여 풀어낸 후 10배 단위로 희석하였다. 희석된 용액은 컬러 디텍션 아가 배지(Color detection agar, MB Cell)에 100 ㎕를 떨어뜨려 퍼뜨린 후 37 ℃에서 24시간 동안 배양한 후 콜로니 색깔을 이용하여 세균의 콜로니(colony)를 확인하였고, 그 결과를 하기 [표 3]에 나타내었다.
[표 3]
상기 [표 3]은 102배로 희석하여 배양한 결과를 참조하면, 항생제로서 목시플록사신을 넣지 않은 동물모델과 목시플록사신을 넣은 동물모델을 비교하면, 항생제로서 목시플록사신을 넣은 동물모델에서 엔테로코쿠스 패칼리스 및 스타필로코쿠스 에피더미디스 균주가 적게 나타나는 것을 확인할 수 있다. 위와 같은 결과는 [도 3]을 통해 확인되는 것을 볼 수 있다.
상기 결과로부터, 본 발명의 감염성 안질환 동물모델이 염성 안질환의 진단, 치료제 개발 및 스크리닝 등에 유용하게 이용될 수 있음을 확인할 수 있다.
이상 설명으로부터, 본 발명에 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다.
Claims (11)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- (S1) 균주 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis, EF) 및 스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis, SE)를 인간을 제외한 정상 포유동물의 눈꺼풀에 점적하는 단계; 및
(S2) 상기 (S1) 단계 후 상기 포유동물의 눈을 연속봉합하는 단계;를 포함하고,
상기 균주는 동물 개체 당 1 × 107 CFU(Colony Forming Unit)로 접종되는 것을 특징으로 하는 감염성 안질환 동물모델의 제작방법. - 삭제
- 삭제
- 제4항에 있어서,
상기 감염성 안질환은 결막염, 각막염, 안내염, 눈물주머니염, 눈물소관염, 안내충전물감염증, 외상 후 안구파열 또는 안검염인 것을 특징으로 하는 감염성 안질환 동물모델의 제작방법. - 제4항에 있어서,
상기 인간을 제외한 정상 포유동물은 토끼인 것을 특징으로 하는 감염성 안질환 동물모델의 제작방법. - (A1) 균주 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis, EF) 및 스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis, SE) 및 목시플록사신(moxifloxacin) 점안액을 인간을 제외한 정상 포유동물의 눈꺼풀에 점적하는 단계;
(A2) 상기 (A1) 단계 후 상기 포유동물의 눈을 연속봉합하는 단계; 및
(A3) 상기 (A2) 단계에서 봉합된 눈을 절개하여 균을 확인하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 감염성 안질환 동물모델의 스크리닝 방법. - 삭제
- 삭제
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| KR1020180100058A KR102193023B1 (ko) | 2018-08-27 | 2018-08-27 | 감염성 안질환 동물모델 및 이의 제작방법 |
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| Int J Ophthalmol, Vol. 10, No. 5, pp.679-683(2017.05.18. 온라인 공개일)* |
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| Nippon Ganka Gakkai Zasshi, Vol. 103, No. 7, pp.56-511(1999.07.31. 온라인 공개일)* |
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