KR102189645B1 - Method for mass production of nisin in Lactococcus lactis with carrot liquid and bacteriophage - Google Patents

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Abstract

본 발명은 당근액 및 박테리오파지를 이용한 락토코커스 락티스 내 나이신의 생산 방법에 관한 것으로, 저렴한 소재안 당근을 이용하고, 박테리오파지를 이용함으로써, 항균 활성이 있는 것으로 알려진 나이신을 락토코커스 락티스 내에서 경제적으로 대량 생산할 수 있다.The present invention relates to a method for producing niacin in Lactococcus lactis using carrot juice and bacteriophage, and by using carrots as an inexpensive material and using bacteriophage, niacin known to have antibacterial activity is economical in Lactococcus lactis. Can be mass produced.

Description

당근액 및 박테리오파지를 이용한 락토코커스 락티스 내 나이신의 대량 생산 방법 {Method for mass production of nisin in Lactococcus lactis with carrot liquid and bacteriophage}{Method for mass production of nisin in Lactococcus lactis with carrot liquid and bacteriophage}

본 발명은 항균물질로 알려진 나이신의 생산방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 당근액 및 박테리오파지를 이용한 락토코커스 락티스 내 나이신의 대량 생산 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing niacin known as an antibacterial substance, and more particularly, to a method for mass-producing niacin in Lactococcus lactis using carrot juice and bacteriophage.

유산균(Lactic acid bacteria)은 당류를 분해하여 젖산을 생성하는 세균으로 젖산균이라고도 한다. 유산균은 인간의 장내에서 해로운 물질을 억제할 뿐만 아니라 그 자체로서 면역력을 향상시키는데 기여하는 등 광범위한 효능이 있다. 또한, 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)는 항균 활성이 있는 나이신(nisin)을 생산하는 균주로 알려져 있다.Lactic acid bacteria are bacteria that produce lactic acid by decomposing sugars and are also called lactic acid bacteria. Lactobacillus not only suppresses harmful substances in the human intestine, but also has a wide range of effects, such as contributing to improving immunity by itself. In addition, Lactococcus lactis is known as a strain that produces nisin having antibacterial activity.

나이신(nisin)은 박테리오신의 일종으로 작은 펩타이드(peptide)인데, 미생물에 대한 정균(bacteriostatic) 효과와 살균(bactericidal) 효과가 있으며, 인간이 섭취할 경우 단백질 가수분해효소에 의해 분해되기 때문에 체내에 잔류하는 부작용이 없는 장점이 있다. Nisin is a type of bacteriocin, a small peptide. It has a bacteriostatic and bactericidal effect on microorganisms. When consumed by humans, it is decomposed by proteolytic enzymes. It has the advantage of no residual side effects.

따라서, 나이신은 식품 보존제로 널리 쓰일 뿐 아니라, 약품 및 화장품 원료로도 이용되어 산업적으로 매우 효용가치가 있는 물질이다. 또한, 화학 보존제를 대체할 수 있는 효과가 있어, 화학물질에 대한 소비자의 불안감을 저감시킬 수 있는 장점도 있다.Therefore, niacin is not only widely used as a food preservative, but also used as a raw material for pharmaceuticals and cosmetics, and thus is a material having very useful industrial value. In addition, since there is an effect that can replace chemical preservatives, there is also an advantage of reducing consumer anxiety about chemical substances.

대한민국 공개특허 제10-2007-0021132호(2007.02.22.공개)에는, 나이신 고생산 유산균 및 이의 선발방법이 개시되어 있다.Republic of Korea Patent Laid-Open Patent No. 10-2007-0021132 (published on February 22, 2007) discloses a high-producing niacin lactic acid bacteria and a selection method thereof. 대한민국 등록특허 제10-1600569호(2016.02.29.등록)에는, 당근잼을 이용한 발효유의 제조방법이 개시되어 있다.Republic of Korea Patent Registration No. 10-1600569 (registered on February 29, 2016) discloses a method for producing fermented milk using carrot jam.

본 발명은 나이신의 생산 효율을 더욱 증진시켜 고농도로 나이신을 생산하는 방법을 제공하고자 한다. 즉, 본 발명은 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)로부터 생산되는 천연 항균물질인 나이신(nisin)을 더욱 효율적으로 생산할 수 있는 방법을 개발하여 제공하고자 한다.An object of the present invention is to provide a method of producing niacin at a high concentration by further enhancing the production efficiency of niacin. That is, the present invention is to develop and provide a method capable of more efficiently producing nisin, a natural antibacterial substance produced from Lactococcus lactis .

본 발명은 당근 착즙액 또는 당근 추출액에 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)와 박테리오파지(Bacteriophage)를 접종하여 배양하는 것을 특징으로 하는 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법을 제공한다. The present invention provides a method for producing nisin in Lactococcus lactis , characterized in that inoculation and culture of Lactococcus lactis and Bacteriophage in carrot juice or carrot extract.

본 발명의 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법에 있어서, 상기 당근 착즙액 또는 당근 추출액은, 바람직하게 자몽씨 추출물(grapefruit seed extract)을 함유하는 것이 좋다. 이때, 더욱 바람직하게 상기 자몽씨 추출물(grapefruit seed extract)을 배양 중 간헐적으로 당근 착즙액 또는 당근 추출액에 첨가할 수 있다. In the production method of nisin in Lactococcus lactis of the present invention, the carrot juice or carrot extract preferably contains grapefruit seed extract. In this case, more preferably, the grapefruit seed extract may be intermittently added to the carrot juice or carrot extract during cultivation.

본 발명의 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법에 있어서, 상기 당근 착즙액 또는 당근 추출액은, 바람직하게 멸균처리된 것을 사용하는 것이 좋다. In the production method of nisin in Lactococcus lactis of the present invention, the carrot juice or carrot extract is preferably sterilized.

본 발명의 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법에 있어서, 상기 배양은, 바람직하게 30℃ 온도에서 혐기 조건으로 12-15시간 배양하는 것이 좋다. In the method for producing nisin in Lactococcus lactis of the present invention, the culture is preferably cultured at 30° C. under anaerobic conditions for 12-15 hours.

본 발명의 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법에 있어서, 상기 락토코커스 락티스는, 바람직하게 당근 착즙액 또는 당근 추출액 10 mL 당 1×109 CFU/mL) 접종하는 것이 좋다. In the method for producing nisin in Lactococcus lactis of the present invention, the Lactococcus lactis is preferably inoculated 1×10 9 CFU/mL per 10 mL of carrot juice or carrot extract.

본 발명의 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법에 있어서, 상기 박테리오파지(Bacteriophage)는 바람직하게 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)를 접종한 후, 시간 차를 두고 당근 착즙액 또는 당근 추출액에 접종하는 것이 좋다. 이때, 상기 박테리오파지는 더욱 바람직하게 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)를 접종한 후, 시간 차를 두고 당근 착즙액 또는 당근 추출액에 반복적으로 접종하는 것이 좋다.In the method for producing nisin in Lactococcus lactis of the present invention, the bacteriophage is preferably inoculated with Lactococcus lactis , and then carrot juice or carrot extract with a time difference. It is better to inoculate. At this time, the bacteriophage is more preferably Lactococcus lactis ( Lactococcus lactis ) after inoculation, it is good to repeatedly inoculate the carrot juice or carrot extract with a time difference.

본 발명의 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법에 있어서, 상기 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법은, 바람직하게 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 배양 후, 락토코커스 락티스 균체를 파쇄하기 위해 고압파쇄를 수행하는 것이 좋다. In the method for producing nisin in Lactococcus lactis of the present invention, the method for producing nisin in Lactococcus lactis is preferably Lactococcus lactis after culturing, Lactococcus lactis It is recommended to perform high-pressure crushing to crush lactis cells.

본 발명에 의할 경우, 저렴한 소재안 당근을 이용하고, 박테리오파지를 이용함으로써, 항균 활성이 있는 것으로 알려진 나이신을 락토코커스 락티스 내에서 경제적으로 대량 생산할 수 있다. According to the present invention, by using carrots in an inexpensive material and bacteriophage, niacin, known to have antibacterial activity, can be economically mass-produced in Lactococcus lactis.

또한, 본 발명에 의할 경우, 최소의 열처리 및 저온 유통으로 안정성을 확보할 수 있는 항균 제품을 개발할 수 있으며, 화학 보존제에 대한 소비자의 불안감을 해소할 수 있어 고품질의 항균 신제품으로 사용 가능하다. In addition, according to the present invention, it is possible to develop an antibacterial product that can secure stability with minimal heat treatment and low-temperature distribution, and it can be used as a high-quality antibacterial new product because it can relieve consumers' anxiety about chemical preservatives.

도 1은 당근을 이용하여 락토코커스 락티스로부터 나이신을 생산하는 본 발명의 과정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 각각 당근, 오이, 사과, 상추를 이용하여 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)를 배양한 결과 그래프 (균체 성장 그래프)이다.
도 3은 본 발명의 락토코커스 락티스 배양시, 박테리오파지 접종 후 락토코커스 락티스 균수의 변화를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 배양에 따른 당근 배양액을 고압파쇄한 후, 지표균주에 대한 항균력을 측정한 결과이다 (도 4에서, a) control (당근배양액), b) 1회 처리, c) 3회 처리, d) 5회 처리 e) 1000배 희석).
도 5는 락토코커스 락티스가 파쇄된 당근 배양액을 사용하여 지표균주 중 'P2]' 균주 및 'P4]' 균주에 대해 시간별 (0h, 3h, 6h, 12h, 18h, 24h) /온도별 (23℃, 30℃, 37℃) 항균능을 확인한 결과이다.1 is a schematic diagram showing the process of the present invention for producing niacin from Lactococcus lactis using carrots.
2 is a graph (cell growth graph) of culturing Lactococcus lactis using carrots, cucumbers, apples, and lettuce, respectively.
Figure 3 shows the change in the number of Lactococcus lactis bacteria after inoculation with bacteriophage during the culture of Lactococcus lactis of the present invention.
Figure 4 is a result of measuring the antibacterial activity against the indicator strain after high pressure crushing the carrot culture medium according to the culture of the present invention (in Figure 4, a) control (carrot culture), b) one treatment, c) three times Treatment, d) treatment 5 times e) 1000 times dilution).
Figure 5 shows the time (0h, 3h, 6h, 12h, 18h, 24h) / temperature (23 ℃, 30 ℃, 37 ℃) is the result of confirming the antibacterial activity.

본 발명은 당근 착즙액 또는 당근 추출액에 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)와 박테리오파지(Bacteriophage)를 접종하여 배양하는 것을 특징으로 하는 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법을 제공한다. The present invention provides a method for producing nisin in Lactococcus lactis , characterized in that inoculation and culture of Lactococcus lactis and Bacteriophage in carrot juice or carrot extract.

나이신(nisin)은 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 유산균으로부터 생산되는 박테리오신(bacteriocin)으로 천연의 항균성 단백질이다. 나이신은 섭취하여도 인체 내의 단백질 가수분해효소에 의해 분해되기 때문에 체내에 잔류하는 부작용이 없는 장점이 있으며, 식품 뿐만 아니라 약품 또는 화장품 원료로도 이용될 수 있어 효용가치가 매우 높다.Nisin is a natural antibacterial protein as a bacteriocin produced from Lactococcus lactis lactic acid bacteria. Since niacin is decomposed by proteolytic enzymes in the human body even when ingested, it has the advantage of no side effects remaining in the body, and it can be used not only as food but also as a raw material for pharmaceuticals or cosmetics, so its useful value is very high.

본 발명은 나이신 생산을 위한 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)의 배양에 있어서 배지로 당근액 (당근 착즙액 또는 당근 추출액)을 사용하였다. 당근은 각종 비타민과 무기물 등 영양분이 풍부하고, 다른 채소에 비하여 산미가 낮아 별도의 pH 조정이 필요없으며, 당도가 높기 때문에 천연 배지로서 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)를 발효시키기에 적합한 것으로 본 발명에서 확인되었다 (도 2). In the present invention, carrot liquid (carrot juice or carrot extract) was used as a medium in the culture of Lactococcus lactis for the production of niacin . Carrot is rich in nutrients such as various vitamins and minerals, has low acidity compared to other vegetables, does not require a separate pH adjustment, and has high sugar content, so it is suitable for fermenting Lactococcus lactis as a natural medium. It was confirmed in (Fig. 2).

한편, 본 발명에서는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)의 배양시, 박테리오파지(bacteriophage)를 함께 첨가하여 배양시키고 있는데, 이를 통해 나이신(nisin)을 고농도로 생산할 수 있었다. Meanwhile, in the present invention, when Lactococcus lactis is cultured, bacteriophage is added and cultured, through which nisin could be produced at high concentration.

박테리오신(bacteriocin)은 일반적으로 생장이 힘든 가혹한 환경에서 높은 농도로 생산될 수 있는데, 본 발명에서 사용하는 박테리오파지는 유산균의 생육을 저해하는 물질로서, 가혹한 환경을 유도하는 역할을 하기 때문에 박테리오신의 일종인 나이신의 생산량을 늘릴 수 있는 것이다. 또한, 박테리오파지는 유산균을 파쇄시키는 역할을 수행할 수 있기 때문에, 균체 내에 있는 나이신을 균체밖으로 자연스럽게 배출하는 효과도 발휘하게 된다. Bacteriocin (bacteriocin) can be generally produced in a high concentration in a harsh environment where growth is difficult.The bacteriophage used in the present invention is a substance that inhibits the growth of lactic acid bacteria and is a kind of bacteriocin because it plays a role in inducing a harsh environment. It is possible to increase the production of nisin. In addition, since bacteriophage can play a role of crushing lactic acid bacteria, it also exerts an effect of naturally discharging nysine in the cells out of the cells.

다만, 박테리오파지를 첨가하여 배양할 경우, 유산균의 생육이 억제될 수 있고, 이는 나이신의 전체 생산량 감소로 이어질 수 있는데, 본 발명의 실험에 의할 경우 도 3에서 보는 바와 같이 일정 농도 이하로는 유산균의 균체량이 저하되지 않는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 균체량의 저감에 따른 나이신의 생산량 저감은 본 발명에서 그리 큰 우려사항은 아닌 것으로 판단되었다. However, when culturing by adding bacteriophage, the growth of lactic acid bacteria may be suppressed, which may lead to a decrease in the total production of niacin. According to the experiment of the present invention, as shown in FIG. 3, the lactic acid bacteria It was confirmed that the amount of cells did not decrease. Therefore, it was determined that the reduction in the production amount of niacin according to the reduction in the amount of cells was not a very big concern in the present invention.

본 발명의 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법에 있어서, 당근 착즙액 또는 당근 추출액은, 바람직하게 멸균처리된 것을 사용하는 것이 좋다. 멸균처리를 함으로써, 당근 추출액이 다른 균에 의해 사용되는 것을 막을 수 있고, 배양액에 다른 균에 의해 오염되는 것을 방지할 수 있기 때문이다. In the method for producing nisin in Lactococcus lactis of the present invention, the carrot juice or carrot extract is preferably sterilized. This is because by sterilizing, it is possible to prevent the carrot extract from being used by other bacteria, and to prevent contamination of the culture solution by other bacteria.

본 발명의 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법에 있어서, 상기 배양은, 바람직하게 30℃ 온도에서 혐기 조건으로 12-15시간 발효시키는 것이 좋다. 락토코커스 락티스는 혐기성 균으로 30℃ 내외에서 생육이 활발하기 때문이다. In the method for producing nisin in Lactococcus lactis of the present invention, the culture is preferably fermented at 30° C. under anaerobic conditions for 12-15 hours. This is because Lactococcus lactis is an anaerobic bacteria that grows actively around 30℃.

본 발명의 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법에 있어서, 상기 락토코커스 락티스는, 바람직하게 당근 착즙액 또는 당근 추출액 10 mL 당 1×109 CFU/mL) 접종하는 것이 좋다. In the method for producing nisin in Lactococcus lactis of the present invention, the Lactococcus lactis is preferably inoculated 1×10 9 CFU/mL per 10 mL of carrot juice or carrot extract.

본 발명의 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법에 있어서, 상기 박테리오파지(Bacteriophage)는 바람직하게 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)를 접종한 후, 시간 차를 두고 당근 착즙액 또는 당근 추출액에 접종하는 것이 좋다. 동시에 접종하는 경우 락토코커스 락티스의 생육이 현저히 저해될 수 있기 때문이다. 더욱 바람직하게는 대수기(exponential phase) 또는 정지기 (stationay phase)에 접종하는 것이 좋다. 또한, 시간 차를 두고 당근 착즙액 또는 당근 추출액에 박테리오파지(Bacteriophage)를 반복적으로 접종하는 것이 더욱 좋다. In the method for producing nisin in Lactococcus lactis of the present invention, the bacteriophage is preferably inoculated with Lactococcus lactis , and then carrot juice or carrot extract with a time difference. It is better to inoculate. This is because when inoculated at the same time, the growth of Lactococcus lactis may be significantly inhibited. More preferably, it is better to inoculate in the exponential phase or the stationay phase. In addition, it is better to repeatedly inoculate the carrot juice or carrot extract with bacteriophage at a time difference.

본 발명의 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법에 있어서, 상기 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법은, 바람직하게 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 배양 후, 락토코커스 락티스 균체를 파쇄하기 위해 고압파쇄를 수행하는 것이 좋다. 나이신은 단백질로서, 고온처리시 활성이 소실될 수 있는데, 고압을 이용하여 균체를 파쇄할 경우, 나이신이 열에 의해 활성이 소실되는 것을 방지할 수 있다. 고압파쇄 처리는 세포 파쇄 방법 중 하나로 세포 발효액을 고압 하에서 파쇄 하는 방법으로써, 다른 파쇄 방법에 비해 신속하고 간단한 방법이다. 이를 통해 세포 내 생성물인 나이신을 외부로 방출시킴으로써, 활성을 유지하고 있는 나이신을 고농도로 추출 가능한 것이다. In the method for producing nisin in Lactococcus lactis of the present invention, the method for producing nisin in Lactococcus lactis is preferably Lactococcus lactis after culturing, Lactococcus lactis It is recommended to perform high-pressure crushing to crush lactis cells. Nisine is a protein, and its activity may be lost during high temperature treatment. When the cells are crushed using high pressure, it is possible to prevent the activity from being lost due to heat. High-pressure disruption treatment is one of the cell disruption methods, which is a method of disrupting cell fermentation broth under high pressure, and is a quick and simple method compared to other disrupting methods. Through this, niacin, which is an intracellular product, is released to the outside, so that niacin, which maintains activity, can be extracted at high concentration.

한편, 본 발명의 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법에 있어서, 상기 당근 착즙액 또는 당근 추출액은, 바람직하게 자몽씨 추출물(grapefruit seed extract)을 함유하고 있을 수 있다. 자몽씨 추출물(Grapefruit seed extract)은 항균활성능이 있는 것으로 최근 주목받고 있으며, 상업적으로 쉽게 이용이 가능한 물질이다. 자몽씨 추출물에는 자몽씨앗, 펄프, 그리고 흰 막이 포함되며 상업적으로 화장품제조와 식품 보조제로 주로 쓰이는데, 자몽 씨 추출물이 천연항균제로 알려져 있기 때문이다. 이렇듯 자몽씨 추출물은 안전하고 자연적이며, 효과적인 보존제로서 그 가치가 있다. 또한, 상기 자몽씨 추출물(grapefruit seed extract)은 본 발명에서 더욱 바람직하게 배양 중 간헐적으로 당근 착즙액 또는 당근 추출액에 추가할 수 있다. Meanwhile, in the method for producing nisin in Lactococcus lactis of the present invention, the carrot juice or carrot extract may preferably contain grapefruit seed extract. Grapefruit seed extract has recently attracted attention for its antibacterial activity and is a material that can be easily used commercially. Grapefruit seed extract contains grapefruit seeds, pulp, and white film, and is commercially used as a cosmetic and food supplement because grapefruit seed extract is known as a natural antibacterial agent. As such, grapefruit seed extract is valuable as a safe, natural, and effective preservative. In addition, the grapefruit seed extract may be more preferably added to the carrot juice or carrot extract intermittently during cultivation in the present invention.

이하, 본 발명의 내용에 대해 하기 실시예 및 실험예에서 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.Hereinafter, the contents of the present invention will be described in more detail in the following Examples and Experimental Examples. However, the scope of the present invention is not limited only to the following examples, and includes modifications of equivalent technical ideas.

[실험예 1: 여러 채소를 이용한 락토코커스 락티스의 생육능 비교][Experimental Example 1: Comparison of viability of Lactococcus lactis using various vegetables]

본 실험에서는 여러 채소 (당근, 오이, 상추 또는 사과)의 착즙액을 배지로 하여 락토코커스 락티스의 생육능을 비교하고자 하였다. 대조군으로는 유산균 배양을 위해 많이 사용되는 MRS 배지를 사용하였다. In this experiment, the viability of Lactococcus lactis was compared using juices of various vegetables (carrot, cucumber, lettuce or apple) as a medium. As a control, MRS medium, which is widely used for culturing lactic acid bacteria, was used.

당근, 오이, 상추 또는 사과를 수세하여 박피하는 과정을 거친 후 효율적인 착즙을 위하여 2~4 cm로 썰어서 착즙기를 이용하여 주스를 추출하였다. 추출된 주스는 고압멸균기를 이용하여 완전한 제균 처리를 거쳐 유산균만을 선택적으로 발효시킬 수 있도록 하였다. 제균처리를 한 주스에 락토코커스 락티스 균주의 접종을 완료한 후, 30℃에서 12시간 배양하였다. After the process of peeling carrots, cucumbers, lettuces, or apples by washing with water, it was cut into 2-4 cm for efficient juice, and the juice was extracted using a juicer. The extracted juice was subjected to complete sterilization treatment using an autoclave to selectively ferment only lactic acid bacteria. After completing the inoculation of the Lactococcus lactis strain in the sterilized juice, it was incubated at 30° C. for 12 hours.

배양 결과, 도 2의 a) 및 b)에서 보는 바와 같이, 당근을 사용하는 경우가 오이, 상추 또는 사과를 사용하는 경우에 비해 균체 (락토코커스 락티스)의 생장이 우수한 것으로 확인되었다. 또한, 당근은 유산균 발효에 많이 사용되는 MRS 배지보다도 동등 또는 그 이상의 우수한 생육능을 나타냈다. As a result of cultivation, as shown in Fig. 2 a) and b), it was confirmed that the growth of cells (Lactococcus lactis) was superior in the case of using carrots compared to the case of using cucumbers, lettuces, or apples. In addition, carrots exhibited superior growth capacity equal to or higher than that of MRS medium, which is often used for fermentation of lactic acid bacteria.

[실시예 1: 본 발명의 나이신 생산 공정의 확립][Example 1: Establishment of niacin production process of the present invention]

상기에서 우수한 배지 소재로 선택된 당근을 이용하여 하기와 같이 본 발명을 실시하였다. 당근은 수세하여 박피하는 과정을 거친 후 효율적인 착즙을 위하여 2~4 cm로 썰어서 착즙기를 이용하여 당근 주스를 추출하였다. 추출된 주스는 고압멸균기를 이용하여 완전한 제균 처리를 거쳐 유산균만을 선택적으로 발효시킬 수 있도록 하였다.The present invention was carried out as follows using a carrot selected as an excellent medium material above. Carrots were washed with water and peeled, then sliced into 2-4 cm for efficient juice, and carrot juice was extracted using a juicer. The extracted juice was subjected to complete sterilization treatment using an autoclave to selectively ferment only lactic acid bacteria.

제균처리를 한 당근 주스에 락토코커스 락티스 균주의 접종을 완료한 후, 30℃에서 12시간 배양하였다. 이때, 락토코커스 락티스를 호스트 (host)로 하는 박테리오파지(103 PFU/mL)를 락토코커스 락티스 접종과 동시에 당근주스에 접종하여 함께 배양하였다. 박테리오신의 일종인 나이신은 힘든 환경이 주어졌을 때 농도가 높게 생산될 수 있기 때문에, 배양 동안에 함께 박테리오파지를 첨가해 주어 배양시킨 것이다. 접종 후, 12시간 동안 배양하고, 나이신의 보존과 발효를 중지하기 위해 냉장보관을 하였다. After completing the inoculation of the Lactococcus lactis strain in the sterilized carrot juice, it was incubated at 30° C. for 12 hours. At this time, bacteriophage (10 3 PFU/mL) having Lactococcus lactis as a host was inoculated with carrot juice at the same time as Lactococcus lactis inoculation, and cultured together. Nisin, a kind of bacteriocin, can be produced at high concentrations when given a difficult environment, so it is cultured by adding bacteriophage together during culture. After inoculation, culture was performed for 12 hours, and refrigerated storage was performed to stop the preservation and fermentation of nisin.

도 3은 본 발명의 락토코커스 락티스 배양시, 박테리오파지 접종 후, 시간의 경과에 따른 유산균 수의 변화를 나타낸 것이다. Figure 3 shows the change in the number of lactic acid bacteria over time, after inoculation of bacteriophage, during culture of Lactococcus lactis of the present invention.

[실험예 2: 상기 실시예 1에서 배양 완료 후, 수득한 당근 배양액의 병원성 균주에 대한 항균능 측정][Experimental Example 2: Measurement of antimicrobial activity against pathogenic strains of the obtained carrot culture solution after completion of cultivation in Example 1]

본 실험에서는 상기 실시예 1의 배양을 통해 수득한 당근 배양액의 항균능을 측정하고자 하였다. 우선, 당근 배양액 중 락토코커스 락티스의 파쇄를 위해, 고압파쇄를 실시하였는데, 고압파쇄는 1회 처리 시 압력 세기 20,000 psi으로 진행하였으며, 1회 처리 후 5분간 열을 식히는 단계를 거치면서 총 3회 진행하였다.In this experiment, the antimicrobial activity of the carrot culture solution obtained through the cultivation of Example 1 was measured. First, for the crushing of Lactococcus lactis in the carrot culture, high-pressure crushing was performed, and the high-pressure crushing was carried out at a pressure of 20,000 psi per treatment. After one treatment, a total of 3 It proceeded twice.

락토코커스 락티스가 파쇄된 당근 배양액의 항균능 측정은 spot-on-lawn과 paper disc 방법을 사용하였다. 지표균주가 함유된 TSB 연한천배지(0.65% 한천 첨가)를 TSB 한천배지에 중층하여 건조시킨 후, 고압파쇄 처리까지 완료되어 락토코커스 락티스가 파쇄된 당근 배양액을 spot-on-lawn의 경우 10 uL 떨어뜨리고, disc는 80 uL 흡수시켜 12시간 후 나이신에 의한 저해환을 확인하였다.The antimicrobial activity of the carrot culture broth with Lactococcus lactis crushed was measured using spot-on-lawn and paper disc methods. After drying the TSB soft agar medium (addition of 0.65% agar) containing the indicator strains on TSB agar medium and drying, high-pressure crushing treatment was completed, and the carrot culture solution in which Lactococcus lactis was crushed was used for spot-on-lawn 10 uL was dropped, and the disc was absorbed by 80 uL, and after 12 hours, the inhibition ring by niacin was confirmed.

도 4는 본 발명의 배양에 따른 당근 배양액을 고압파쇄한 후, 지표균주에 대한 항균력을 측정한 결과이다 (도 4에서, a) control (당근배양액), b) 1회 처리, c) 3회 처리, d) 5회 처리 e) 1000배 희석).Figure 4 is a result of measuring the antibacterial activity against the indicator strain after high pressure crushing the carrot culture medium according to the culture of the present invention (in Figure 4, a) control (carrot culture), b) one treatment, c) three times Treatment, d) treatment 5 times e) 1000 times dilution).

한편, 상기에서 수득한 락토코커스 락티스가 파쇄된 당근 배양액을 사용하여 지표균주 중 P2] 균주 및 P4] 균주에 대해 시간별/온도별 항균능을 확인하였는데, 23~30℃에서 12~24시간 배양 시 P2] 균주에 대하여 최대 1000배의 항균능을 확인할 수 있었다.On the other hand, using the carrot culture broth obtained by crushing the Lactococcus lactis obtained above, antibacterial activity by time/temperature was confirmed for the P2] and P4] strains of the indicator strains, and cultured at 23 to 30° C. for 12 to 24 hours Si P2] was able to confirm the antimicrobial activity of up to 1000 times for the strain.

도 5는 락토코커스 락티스가 파쇄된 당근 배양액을 사용하여 지표균주 중 'P2]' 균주 및 'P4]' 균주에 대해 시간별 (0h, 3h, 6h, 12h, 18h, 24h) 및 온도별 (23℃, 30℃, 37℃) 항균능의 유지에 대해 확인한 결과이다.Figure 5 shows the time (0h, 3h, 6h, 12h, 18h, 24h) and temperature (23) for the'P2]' strain and the'P4]' strain of the indicator strains using the carrot culture broth from which Lactococcus lactis is crushed. ℃, 30 ℃, 37 ℃) is the result of confirming the maintenance of antibacterial activity.

[실시예 2: 당근 주스에 천연항균물질인 자몽씨추출액을 500 ppm 첨가하여 락토코커스 락티스의 배양][Example 2: Culture of Lactococcus lactis by adding 500 ppm of grapefruit seed extract, a natural antibacterial substance, to carrot juice]

제균 처리를 한 당근주스에 자몽씨 추출물 500 ppm을 첨가한 후, 락토코커스 락티스 균주를 접종하였다. 첨가 후, 30℃에서 배양이 12시간 정도 진행되면 나이신의 보존과 락토코커스 락티스의 발효를 중지하기 위해 냉장보관하였다. 한편, 별도 실시예 2-1에서는 상기 배양시, 실시예 1과 같은 방법으로 박테리오파지를 함께 접종하였다. After adding 500 ppm of grapefruit seed extract to the sterilized carrot juice, the Lactococcus lactis strain was inoculated. After the addition, when the culture proceeded at 30° C. for about 12 hours, it was stored refrigerated to stop the preservation of nisin and the fermentation of Lactococcus lactis. On the other hand, in the separate Example 2-1, during the culture, bacteriophage was inoculated together in the same manner as in Example 1.

[실시예 3: 당근 주스에 천연항균물질인 자몽씨추출액을 100 ppm 첨가하여 배양][Example 3: Culture by adding 100 ppm of grapefruit seed extract, a natural antibacterial substance, to carrot juice]

제균 처리를 한 당근 주스에 자몽씨 추출물을 100 ppm을 첨가한 후, 락토코커스 락티스 균주를 접종하였다. 이후, 30℃에서 배양을 진행하고 배양이 진행되는 3시간, 5시간, 8시간 마다 100 ppm을 추가 접종하였다. 이후, 배양이 12-15시간 정도 진행되면 나이신의 보존과 락토코커스 락티스의 발효를 중단하기 위해 냉장 보관하였다. 한편, 별도 실시예 3-1에서는 상기 배양시, 실시예 1과 같은 방법으로 박테리오파지를 함께 접종하였다.After adding 100 ppm of grapefruit seed extract to the sterilized carrot juice, the Lactococcus lactis strain was inoculated. Thereafter, the culture was performed at 30° C., and 100 ppm was additionally inoculated every 3 hours, 5 hours, and 8 hours during the culture process. Thereafter, when the culture proceeded for about 12 to 15 hours, it was stored in a refrigerator to stop the preservation of nisin and the fermentation of Lactococcus lactis. On the other hand, in a separate Example 3-1, during the culture, bacteriophage was inoculated together in the same manner as in Example 1.

Claims (9)

당근 착즙액에 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)와 박테리오파지(Bacteriophage)를 접종하여 배양한 후, 수득된 당근 배양액을 고압파쇄하여 락토코커스 락티스 균체를 파쇄하여 나이신을 방출하며,
상기 박테리오파지는 락토코커스 락티스를 호스트로 하는 박테리오파지인 것을 특징으로 하는 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법.
After inoculating and culturing the carrot juice with Lactococcus lactis and bacteriophage, the obtained carrot culture is crushed with high pressure to crush the Lactococcus lactis cells to release nicin,
The bacteriophage is a method for producing nisin in Lactococcus lactis, characterized in that the bacteriophage is a host of Lactococcus lactis.
 제1항에 있어서,
상기 당근 착즙액은,
자몽씨 추출물(grapefruit seed extract)을 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법.
The method of claim 1,
The carrot juice,
A method for producing nisin in Lactococcus lactis, characterized in that it contains grapefruit seed extract.
 제2항에 있어서,
상기 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법은,
자몽씨 추출물(grapefruit seed extract)을 배양 중 간헐적으로 당근 착즙액에 추가하는 것을 특징으로 하는 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법.
The method of claim 2,
The method for producing nisin in the Lactococcus lactis,
A method for producing nisin in Lactococcus lactis, characterized in that grapefruit seed extract is intermittently added to carrot juice during cultivation.
 제1항에 있어서,
상기 당근 착즙액은,
멸균처리된 것을 특징으로 하는 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법.
The method of claim 1,
The carrot juice,
A method for producing nisin in Lactococcus lactis, which is sterilized.
 제1항에 있어서,
상기 배양은,
30℃ 온도에서 혐기 조건으로 12-15시간 배양하는 것을 특징으로 하는 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법.
The method of claim 1,
The culture,
A method for producing nisin in Lactococcus lactis, characterized in that incubation for 12-15 hours under anaerobic conditions at 30°C.
 제1항에 있어서,
상기 락토코커스 락티스는,
당근 착즙액 10 mL 당 1×109 CFU/mL 접종하는 것을 특징으로 하는 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법.
The method of claim 1,
The Lactococcus lactis,
A method for producing nisin in Lactococcus lactis, characterized in that 1×10 9 CFU/mL is inoculated per 10 mL of carrot juice.
 제1항에 있어서,
상기 박테리오파지(Bacteriophage)는
락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)를 접종한 후, 시간 차를 두고 당근 착즙액에 접종하는 것을 특징으로 하는 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법.
The method of claim 1,
The bacteriophage (Bacteriophage) is
After inoculation of Lactococcus lactis , a method for producing nisin in Lactococcus lactis , characterized in that inoculation into carrot juice at a time difference.
 제7항에 있어서,
상기 박테리오파지는,
락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)를 접종한 후, 시간 차를 두고 당근 착즙액에 반복적으로 접종하는 것을 특징으로 하는 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법.
The method of claim 7,
The bacteriophage,
After inoculation of Lactococcus lactis , a method of producing nisin in Lactococcus lactis , characterized in that the inoculation is repeated in carrot juice at a time difference.
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