KR102187862B1 - Methods for controlling the shape of DNA structures - Google Patents

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Abstract

본 발명은 DNA 오리가미 나노 구조체의 비틀림을 조절하는 방법에 관한 것으로서, DNA 오리가미 나노 구조체의 단위 블록에 하나 이상의 염기쌍을 삽입 또는 결실시키는 단계를 포함하고, 이들의 위치를 상대적으로 긴 크로스오버 거리를 지닌 가닥 또는 상대적으로 짧은 크로스오버 거리를 지닌 가닥에 상기 염기쌍을 삽입 또는 결실시킴으로써 상기 DNA 오리가미 나노 구조체의 비틀림을 포함한 형상을 조절할 수 있다. The present invention relates to a method for controlling the twist of a DNA origami nanostructure, comprising the step of inserting or deleting one or more base pairs in a unit block of the DNA origami nanostructure, and having a relatively long crossover distance By inserting or deleting the base pair into a strand or a strand having a relatively short crossover distance, the shape, including twisting of the DNA origami nanostructure, can be controlled.

Description

DNA 구조체의 형상 조절 기술 {Methods for controlling the shape of DNA structures}Technology for controlling the shape of DNA structures {Methods for controlling the shape of DNA structures}

본 발명은 DNA 구조체 또는 DNA 오리가미 구조체의 형상을 미세하게 조절할 수 있는 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a method capable of finely controlling the shape of a DNA structure or a DNA origami structure.

DNA 오리가미 기술은 사용자에 의해 프로그래밍된 염기서열을 지닌 수십에서 수백 개의 짧은 DNA 가닥들을 이용해 통상 7,000∼개 정도의 염기를 지닌 긴 DNA 가닥(strand)을 접어, 사용자가 목표하는 형상을 지닌 DNA 구조체를 제작하는 기술이다.DNA Origami technology uses dozens to hundreds of short DNA strands with nucleotide sequences programmed by the user, and folds long DNA strands, usually 7,000 to nucleotides, to create a DNA structure with the shape that the user wants It is a crafting technique.

DNA 나노기술에서는 목표 형상의 구조물을 만들기 위해 왓슨-크릭(Watson-Crick) 상보결합을 이용하여 미리 프로그래밍된 특정한 염기서열의 DNA 가닥들을 합성한다. 해당 DNA는 자신과 상보적인 염기서열을 갖는 다른 DNA와 자가 조립되어 이중나선 DNA를 이루며, 홀리데이 정션(Holliday junction) 혹은 크로스오버(crossover)라 불리는 결합부위(접힌 부위)를 통해 두 개의 이중나선 DNA를 평행하게 연결할 수 있다. 이와 같은 방법으로 다수의 이중나선 DNA를 연결하면 2차원 평면상에서 특정한 형상을 갖는 DNA 나노 구조체를 제작할 수 있으며, 같은 원리를 공간상으로 확장하면 특정한 격자구조를 갖는 3차원 형태의 구조물이 만들어진다.In DNA nanotechnology, preprogrammed DNA strands of a specific nucleotide sequence are synthesized using Watson-Crick complementary bonds to create a structure of a target shape. The DNA is self-assembled with other DNA having a base sequence that is complementary to itself to form a double-stranded DNA, and two double-stranded DNA through a bonding site (folded site) called a Holiday junction or crossover. Can be connected in parallel. If multiple double-stranded DNAs are connected in this way, a DNA nanostructure having a specific shape can be produced on a two-dimensional plane, and if the same principle is extended in space, a three-dimensional structure having a specific lattice structure is made.

DNA 오리가미에서는 구조물을 만들기 위한 기본 뼈대로 7,000∼개 정도의 염기로 구성된 긴 단일가닥 DNA를 사용하며, 이를 스캐폴드(scaffold) 가닥이라 부른다. 또한, 스캐폴드의 특정한 부분들을 연결하여 나노 구조체 만들기 위해 20∼개 정도의 염기로 구성된 짧은 단일가닥 DNA를 약 200개 정도 화학적으로 합성해 사용하며, 이러한 DNA 가닥을 스테이플(staple) 가닥이라 한다. 스테이플 가닥은 만들고자 하는 구조물의 형상에 따라 스캐폴드 가닥의 특정한 부분에만 결합될 수 있도록 사용자에 의해 그 길이와 염기서열이 정확하게 설계되어야 한다.In DNA origami, a long single-stranded DNA composed of about 7,000 to nucleotides is used as a basic skeleton for constructing a structure, and this is called a scaffold strand. In addition, about 200 short single-stranded DNA consisting of about 20 to 10 bases is chemically synthesized and used to connect specific parts of the scaffold to make nanostructures, and such DNA strands are called staple strands. The length and base sequence of the staple strand must be accurately designed by the user so that it can be bound only to a specific part of the scaffold strand according to the shape of the structure to be made.

스캐폴드 및 스테이플 가닥들 간 자가 조립은 수용액 상에서 이루어지며, 그 안에는 완충용액 버퍼와 DNA 사이의 정전기적 반발력을 완화시키기 위한 염이온(MgCl2 또는 NaCl)이 첨가된다. 모든 반응물이 포함된 용액을 80℃정도의 온도로 가열시킨 후 수 시간에서 수십 시간 동안 천천히 온도를 낮추는 열 풀림(thermal annealing) 기법을 이용하면 수용액 속 스테이플 가닥들이 스캐폴드 가닥의 지정된 위치에 상보적으로 결합하면서 DNA 나노 구조체를 이루게 된다.Self-assembly between the scaffold and staple strands is performed in an aqueous solution, and salt ions (MgCl 2 or NaCl) are added therein to mitigate the electrostatic repulsion between the buffer buffer and the DNA. If the solution containing all reactants is heated to a temperature of about 80℃ and then the temperature is slowly lowered for several hours to tens of hours, a thermal annealing technique is used to make the staple strands in the aqueous solution complementary to the designated positions of the scaffold strands. As a result, a DNA nanostructure is formed.

이러한 DNA 오리가미 기술은 수 나노미터(nm) 이내의 높은 정밀도로 기존의 하향식 제작기법으로 만들 수 없는 복잡한 형상의 2차원/3차원 나노 구조체를 제작할 수 있다. 이를 통해 다양한 나노 재료들을 원하는 위치에 정밀하게 배열하는 등의 응용이 가능하며, 또한 생체분자를 이용하므로 제작된 나노 구조체의 생체적합성이 매우 우수하다.Such DNA origami technology can fabricate complex 2D/3D nanostructures that cannot be made with conventional top-down manufacturing techniques with high precision within a few nanometers (nm). Through this, applications such as precisely arranging various nanomaterials at a desired location are possible, and since biomolecules are used, the biocompatibility of the fabricated nanostructure is very excellent.

그러나 DNA 오리가미 기술로 제조된 구조체에서 비틀림 각 등을 조절하고자 하는 등의 경우에는 현재로서는 미세한 조절이 어려우며, 조절 시 대부분의 스테이플 DNA 세트를 교체하거나, 전체 스테이플 DNA 세트를 새로 구성해야 하는 문제가 있다.However, in the case of trying to adjust the twist angle, etc. in a structure manufactured by DNA origami technology, it is currently difficult to finely control, and there is a problem that most of the staple DNA sets must be replaced or the entire staple DNA set must be newly constructed during the adjustment. .

Hendrik Dietz, et al., Folding DNA into Twisted and Curved Nanoscale Shapes, Science 325, 725-729, 2009Hendrik Dietz, et al., Folding DNA into Twisted and Curved Nanoscale Shapes, Science 325, 725-729, 2009

본 발명은 DNA 오리가미 나노 구조체의 비틀림을 미세하게 조절할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. An object of the present invention is to provide a method capable of finely controlling the twist of a DNA origami nanostructure.

항목 1. DNA 오리가미 나노 구조체의 단위 블록에 하나 이상의 염기쌍을 삽입 또는 결실시키는 단계를 포함하고, 상대적으로 긴 크로스오버 거리를 지닌 DNA 가닥 또는 상대적으로 짧은 크로스오버 거리를 지닌 DNA 가닥에 상기 염기쌍을 삽입 또는 결실시킴으로써 상기 DNA 오리가미 나노 구조체의 비틀림을 조절하는 방법으로서, 상기 크로스오버 거리는 DNA 오리가미 나노 구조체에서 인접한 두 개의 크로스오버 사이의 복수개의 연속된 염기쌍의 길이를 의미하고, 상기 단위 블록은 상기 DNA 오리가미 나노 구조체의 길이방향을 따라 나타나는 크로스오버 패턴의 최소 반복 단위로서, 상대적으로 긴 크로스오버 거리를 지닌 DNA 가닥 및 상대적으로 짧은 크로스오버 거리를 지닌 DNA 가닥을 포함하는, 방법.Item 1.Including the step of inserting or deleting one or more base pairs into a unit block of a DNA origami nanostructure, and inserting the base pair into a DNA strand having a relatively long crossover distance or a DNA strand having a relatively short crossover distance Or a method of controlling the twist of the DNA origami nanostructure by deletion, wherein the crossover distance refers to the length of a plurality of consecutive base pairs between two adjacent crossovers in the DNA origami nanostructure, and the unit block is the DNA origami A method comprising a DNA strand having a relatively long crossover distance and a DNA strand having a relatively short crossover distance as the minimum repeating unit of a crossover pattern appearing along the length direction of the nanostructure.

항목 2. 항목 1에 있어서, 상대적으로 긴 크로스오버 거리를 지닌 DNA 가닥에 상기 염기쌍을 삽입 또는 결실시킴으로써 상기 DNA 오리가미 나노 구조체에 상대적으로 작은 비틀림을 발생하게 하는, 방법. Item 2. The method according to item 1, wherein a relatively small twist occurs in the DNA origami nanostructure by inserting or deleting the base pair in a DNA strand having a relatively long crossover distance.

항목 3. 항목 1에 있어서, 상대적으로 짧은 크로스오버 거리를 지닌 DNA 가닥에 상기 염기쌍을 삽입 또는 결실시킴으로써 상기 DNA 오리가미 나노 구조체에 상대적으로 큰 비틀림을 발생하게 하는, 방법.Item 3. The method according to item 1, wherein a relatively large twist occurs in the DNA origami nanostructure by inserting or deleting the base pair in a DNA strand having a relatively short crossover distance.

항목 4. 항목 1 내지 3 중 어느 한 항목에 있어서, 스캐폴드 DNA에서 스테이플 DNA 가닥과 쌍을 이루지 않는 하나 이상의 뉴클레오티드를 도입하는 단계를 더 포함하는, 방법.Item 4. The method of any one of items 1 to 3, further comprising introducing one or more nucleotides not paired with the staple DNA strand in the scaffold DNA.

항목 5. 항목 4에 있어서, 스캐폴드 DNA 가닥에서 스테이플 DNA 가닥과 쌍을 이루지 않는 하나 이상의 뉴클레오티드를 도입하여 상기 DNA 오리가미 나노 구조체의 비틀림을 작게 하는, 방법.Item 5. The method according to item 4, wherein at least one nucleotide not paired with the staple DNA strand is introduced in the scaffold DNA strand to reduce the twist of the DNA origami nanostructure.

항목 6. DNA 오리가미 나노 구조체의 단위 블록에 하나 이상의 염기쌍을 삽입 또는 결실시키는 단계를 포함하고, 하나 이상의 염기 쌍이 삽입된 상대적으로 긴 크로스오버 거리를 지닌 DNA 가닥에 대한, 하나 이상의 염기 쌍이 삽입된 상대적으로 짧은 크로스오버 거리를 지닌 DNA 가닥의 비를 조절함으로써 상기 DNA 오리가미 나노 구조체의 비틀림을 조절하는 방법으로서, 상기 크로스오버 거리는 DNA 오리가미 나노 구조체에서 인접한 두 개의 크로스오버 사이의 복수개의 연속된 염기쌍의 길이를 의미하고, 상기 단위 블록은 상기 DNA 오리가미 나노 구조체의 길이방향을 따라 나타나는 크로스오버 패턴의 최소 반복 단위로서, 상대적으로 긴 크로스오버 거리를 지닌 DNA 가닥 및 상대적으로 짧은 크로스오버 거리를 지닌 DNA 가닥을 포함하는, 방법.Item 6. Relative to a DNA strand having a relatively long crossover distance into which one or more base pairs are inserted, comprising the step of inserting or deleting one or more base pairs into a unit block of a DNA origami nanostructure. As a method of controlling the twist of the DNA origami nanostructure by controlling the ratio of the DNA strands having a short crossover distance, the crossover distance is the length of a plurality of consecutive base pairs between two adjacent crossovers in the DNA origami nanostructure. Means, and the unit block is a minimum repeating unit of a crossover pattern appearing along the length direction of the DNA origami nanostructure, and a DNA strand having a relatively long crossover distance and a DNA strand having a relatively short crossover distance Containing, method.

항목 7. 항목 6에 있어서, 하나 이상의 염기 쌍이 삽입된 상대적으로 긴 크로스오버 거리를 지닌 DNA 가닥에 대한, 하나 이상의 염기 쌍이 삽입된 상대적으로 짧은 크로스오버 거리를 지닌 DNA 가닥의 비가 커질수록 상기 DNA 오리가미 나노 구조체의 비틀림이 증가되는, 방법.Item 7.The DNA origami according to item 6, as the ratio of the DNA strand having a relatively short crossover distance into which one or more base pairs are inserted to the DNA strand having a relatively long crossover distance into which one or more base pairs are inserted increases. The method, in which the torsion of the nanostructure is increased.

항목 8. 항목 6 또는 7에 있어서, 스캐폴드 DNA 가닥에 스테이플 DNA 가닥과 쌍을 이루지 않는 하나 이상의 뉴클레오티드를 도입하는 단계를 더 포함하는, 방법.Item 8. The method of item 6 or 7, further comprising introducing one or more nucleotides not paired with the staple DNA strand into the scaffold DNA strand.

항목 9. 항목 8에 있어서, 스캐폴드 DNA에서 스테이플 DNA 가닥과 쌍을 이루지 않는 하나 이상의 뉴클레오티드를 도입하여 상기 DNA 오리가미 나노 구조체의 비틀림을 작게 하는, 방법.Item 9. The method according to item 8, wherein at least one nucleotide not paired with the staple DNA strand is introduced in the scaffold DNA to reduce the distortion of the DNA origami nanostructure.

본 발명에 따른 DNA 오리가미 나노 구조체의 비틀림을 조절하는 방법은 염기 쌍의 삽입 또는 결실 위치에 따라서 DNA 오리가미 나노 구조체의 비틀림을 더욱 미세하게 조정할 수 있다. The method of controlling the twist of the DNA origami nanostructure according to the present invention can further finely adjust the twist of the DNA origami nanostructure according to the insertion or deletion position of the base pair.

또한 본 발명에 따른 방법은 DNA 오리가미 나노 구조체에 삽입 또는 결실되는 염기쌍의 수를 변화시키지 않으면서도 구조를 변경할 수 있으므로, DNA 오리가미 나노 구조체의 구조를 변경하고자 할 때 전체 스테이플 DNA 가닥을 교체할 필요가 없어, 경제적이다. In addition, since the method according to the present invention can change the structure without changing the number of base pairs inserted or deleted in the DNA origami nanostructure, it is necessary to replace the entire staple DNA strand when trying to change the structure of the DNA origami nanostructure. No, it's economical.

도 1은 기계적 섭동의 배열 설계를 도식화한 그림이다. (a) 벌집 격자에서 6HB의 다양한 크로스오버 간격을 보여준다. 이중 가닥 DNA(dsDNA) 및 크로스오버를 각각 사이안 및 파란색으로 나타내었다. (b) 각각의 실린더는 dsDNA를 나타낸다. 기계적 섭동이 도입된 곳에 따라 상이한 변형 에너지가 유도될 수 있다. ΔL0 및 Δθ0는 각각 축 배열 변화 및 비틀림 배열 변화를 의미한다. 녹색 및 빨간색 실린더는 각각 기계적 섭동이 14-염기쌍 길이의 크로스오버 간격 및 7-염기쌍 길이의 크로스오버 간격에 위치하는 것을 의미한다. (c) 상이한 배열에 대하여, 유연한 크로스오버를 이용한 CanDo에 의해 예측된 이들의 단위 블록 설계 및 평형 형상을 보여준다. (d) 본 발명에 따른 방법을 상이한 횡단면 모양에 적용한 결과이다. 다양한 횡단면 모양 (위), 이들의 최소 및 최대 비틀림 모양을 유연한 크로스오버를 이용한 CanDo로 예측하였으며, 단위 블록 내에서 각 나선 당 단지 하나의 염기쌍 만을 삽입하였다. 녹색 및 빨간색 원은 각각 저-변형-에너지 삽입 및 고-변형-에너지-삽입을 나타내고, 흰색 원은 변형되지 않은 크로스오버 간격을 가진 나선을 나타낸다.
도 2는 실험 및 분자동역학 시뮬레이션을 통한 본 발명에 따른 방법을 설명한다. (a) 주형 6HB. VB 및 FB는 각각 사이안 및 회색으로 나타내었다. FB 및 VB 사이의 두개의 긴 단일 가닥 DNA (ssDNA)는 회색선으로 나타내었다. 6HB의 전체적인 비틀림을 조절하기 위하여, 직선의 블록 (사이안 사각형) 일부를 양 및 형태가 다양한 비틀린 블록 (노랑 사각형)으로 대체하였다. (b) 6HB의 시스- 배열(위) 및 트랜스 배열(아래)의 AFM 이미지이다. (c) VB에서 상이한 조성으로부터 얻어진 6HB의 세가지 대표적인 비틀림 각(위) 및 각 6HB의 TR을 보여주는 이들의 AFM 이미지 (아래)이다. (d) TR을 실험적으로 측정한 결과 및 CanDo 분석으로 예측한 결과이다. 원 및 오차 막대는 각각 실험적으로 측정된 TR의 평균 및 표준 편차를 나타낸다. 비틀린 블록의 수에서 양수 및 음수는 각각 삽입 및 결실 블록의 수를 나타낸다. (e) 분자동역학 시뮬레이션에서 사용된 6HB의 초기 배열을 나타내는 이미지이다. (f) 분자동역학 시뮬레이션 동안 실효값 (root-mean-square; RMS) 변위 (displacements) (왼쪽) 및 각각의 구조체에 대한 분석 영역의 비틀림 각 분배의 히스토그램 (오른쪽)을 나타낸다. (g) 홀리데이 정션 배열의 정의 및 이들의 분배의 히스토그램을 나타낸다.
도 3은 배열 설계를 통해 비틀림 정도를 미세 조절하는 것을 보여준다. (a) H0 및 H6 배열에 있어서, 실험으로부터의 TR 및 CanDo 분석으로부터의 TR을 보여준다. 원 및 오차 막대는 각각 실험적으로 측정된 TR의 평균 및 표준 편차를 나타낸다. 각각의 삽입 배열에 대하여, 상응하는 비틀린 블록 설계, 변경된 AFM 이미지 및 유연한 크로스오버를 이용한 CanDo에 의해 예측된 비틀린 모양을 나타낸다. 변경된 AFM 이미지에서, 6HB의 시스 및 트랜스 배열은 각각 오랜지 및 녹색으로 나타내었다. (b) 각각의 설계 결과에 대한 아가로오스 젤 전기영동 결과를 보여준다. 박스 표시된 것은 단량체 구조체 밴드이고, 하단 밴드는 과량의 스테이플을 보여준다. L: 1kb DNA 래더, S: 스캐폴드 가닥. (c) 유연한 크로스오버를 이용한 CanDo를 사용하여 모든 가능한 삽입 배열에 대한 예상된 비틀림 정도를 상이한 삽입 배열에 따라 계산하였다. 각 횡단면 그림의 우하단에 가능한 삽입의 경우의 수를 기재하였다. (d) 축방향으로 다양한 삽입 배열을 가진 14HB를 보여준다.
도 4는 갭을 이용한 비틀림 제어를 보여준다. (a) 갭을 도입한 블록의 설계이다. 특정 스테이플 가닥을 대체함으로써 dsDNA 닉이 dsDNA 갭으로 치환되어 6HB의 비틀림 각도를 조절할 수 있다. (b) 측정된 평균 TR값을 보여준다. 오차 막대는 실험 데이터의 표준편차를 보여준다. 1 is a diagram schematically illustrating the arrangement design of mechanical perturbation. (a) It shows various crossover intervals of 6HB in a honeycomb grid. Double-stranded DNA (dsDNA) and crossovers are shown in cyan and blue, respectively. (b) Each cylinder represents dsDNA. Different strain energies can be induced depending on where the mechanical perturbation is introduced. ΔL0 and Δθ0 mean a change in axial arrangement and a change in torsional arrangement, respectively. Green and red cylinders mean that the mechanical perturbation is located at a crossover interval of 14-base pair length and a crossover interval of 7-base pair length, respectively. (c) For different arrangements, it shows their unit block design and equilibrium shape predicted by CanDo using flexible crossover. (d) The result of applying the method according to the invention to different cross-sectional shapes. Various cross-sectional shapes (above) and their minimum and maximum twist shapes were predicted by CanDo using flexible crossovers, and only one base pair was inserted for each helix within the unit block. Green and red circles represent low-strain-energy insertions and high-strain-energy-insertions, respectively, and white circles represent spirals with undeformed crossover spacing.
2 illustrates the method according to the present invention through experiments and molecular dynamics simulation. (a) Mold 6HB. VB and FB are shown in cyan and gray, respectively. The two long single-stranded DNAs (ssDNA) between FB and VB are shown as gray lines. In order to control the overall twist of 6HB, some of the straight blocks (cyan squares) were replaced with twisted blocks (yellow squares) of varying amounts and shapes. (b) AFM images of the cis-configuration (top) and trans configuration (bottom) of 6HB. (c) Three representative twist angles of 6HBs obtained from different compositions in VB (top) and their AFM images (bottom) showing the TR of each 6HB. (d) These are the results of experimentally measuring TR and the results of prediction by CanDo analysis. Circles and error bars represent the mean and standard deviation of the experimentally measured TR, respectively. Positive and negative numbers in the number of twisted blocks represent the number of inserted and deleted blocks, respectively. (e) An image showing the initial configuration of 6HB used in molecular dynamics simulation. (f) The histogram of the torsional angular distribution of the analysis area for each structure (left) and the root-mean-square (RMS) displacements (left) during molecular dynamics simulation are shown. (g) The definition of the holiday junction arrangement and the histogram of their distribution are shown.
3 shows fine control of the degree of twisting through the arrangement design. (a) For the HO and H6 configurations, TR from experiment and TR from CanDo analysis are shown. Circles and error bars represent the mean and standard deviation of the experimentally measured TR, respectively. For each insertion arrangement, a corresponding twisted block design, a modified AFM image, and a twisted shape predicted by CanDo with flexible crossovers are shown. In the modified AFM images, the cis and trans configurations of 6HB are shown in orange and green, respectively. (b) The results of agarose gel electrophoresis for each design result are shown. Boxed is the monomeric structure band, and the bottom band shows excess staples. L: 1 kb DNA ladder, S: scaffold strand. (c) Using CanDo with flexible crossover, the expected degree of twist for all possible insertion arrangements was calculated for different insertion arrangements. The number of possible insertion cases is listed in the lower right corner of each cross-sectional figure. (d) It shows a 14HB with various insertion arrangements in the axial direction.
4 shows a twist control using a gap. (a) This is a block design that introduces a gap. By replacing specific staple strands, dsDNA nicks can be replaced with dsDNA gaps, which can control the twist angle of 6HB. (b) It shows the measured average TR value. Error bars show the standard deviation of the experimental data.

이제 본 발명은 첨부된 도면을 참조로 하기에서 더욱 충분히 기술될 것이며, 그러나 본 발명의 전부가 아닌 단지 일부의 구체예가 예시된다. 실제로, 이들 발명은 많은 다양한 형태로 구체화될 수 있으며, 본원에 제시된 구체예로 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용되는 단수 형태는 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수한 대상을 포함한다.The invention will now be more fully described below with reference to the accompanying drawings, but only some, but not all, embodiments of the invention are illustrated. Indeed, these inventions may be embodied in many different forms and should not be construed as being limited to the embodiments presented herein. The singular forms used in this specification and the appended claims include plural objects unless clearly indicated otherwise.

스캐폴드 DNA는 단일가닥의 DNA로서 그 길이는 형성하고자 하는 구조체의 길이, 크기, 모양 등에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 통상적으로 7,000 내지 8,000nt 정도의 길이를 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 7,249 base 길이의 M13mp18 DNA를 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Scaffold DNA is a single-stranded DNA, and its length can be appropriately selected according to the length, size, shape, etc. of the structure to be formed, and generally, a length of about 7,000 to 8,000 nt can be used. In a specific embodiment of the present invention, M13mp18 DNA having a length of 7,249 base was used, but the present invention is not limited thereto.

스테이플 DNA는 적어도 일부 또는 전부가 상기 스캐폴드 DNA의 적어도 일부의 서열과 상보적인 서열로 이루어지며, 스캐폴드 DNA와 결합하여 스캐폴드 DNA가 특정 위치에서 접히거나 고정되도록 할 수 있다.At least part or all of the staple DNA consists of a sequence complementary to at least part of the sequence of the scaffold DNA, and may bind to the scaffold DNA so that the scaffold DNA is folded or fixed at a specific position.

스테이플 DNA는 그 길이는 형성하고자 하는 구조체의 길이, 크기, 모양 등에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 예를 들면 20 내지 50nt일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The length of the staple DNA may be appropriately selected according to the length, size, shape, etc. of the structure to be formed, and may be, for example, 20 to 50 nt, but is not limited thereto.

몇몇 적용 예에서, DNA 오리가미 나노 구조체의 굽힘 및 비틀림 정도는 기능성을 위하여 제어될 필요가 있는 중요한 구조적 특징이다. 예를 들어, 휜 구조체는 도넛 모양의 광학적 메타물질(metamaterial)을 설계하고, 리포좀의 크기 및 모양을 조절하고, 단백질의 모양 및 기능을 모사하는 데에 적용되었다. 비틀린 DNA 오리가미들은 또한 삽입된 약물의 방출 동역학, 키랄(chiral) 콜로이드성 액상 결정의 거시적 구조 및 탄성을 조절하는 능력이 있는 것으로 알려졌다. In some applications, the degree of bending and twisting of the DNA origami nanostructures is an important structural feature that needs to be controlled for functionality. For example, the curved structure was applied to design a donut-shaped optical metamaterial, to control the size and shape of liposomes, and to mimic the shape and function of proteins. Twisted DNA origami are also known to have the ability to modulate the release kinetics of the inserted drug, the macroscopic structure and elasticity of chiral colloidal liquid crystals.

대부분의 비선형 DNA 오리가미 나노 구조체는 직선의 표준 구조체에 염기쌍을 삽입 또는 결실시켜 설계되었다. 염기쌍의 도입 또는 결실은 표준 구조체에 기계적인 섭동으로서 작동하여 구조체를 구부러지고 비틀어지게 하여 크로스오버(crossover) 위치의 기하학적 정렬 불량을 최소화한다. 굽힘 및 비틀림 정도는 크로스오버 사이에 도입되는 염기쌍의 수에 의해 쉽게 조절될 수 있지만, 자연수의 염기쌍 도입 및 결실만 가능하므로 굽힘 및 비틀림 정도가 연속적이지 못하다는 한계가 있었다. DNA 삽입물과 결합 및 자외선 등을 통하여 DNA의 나사선성을 변화시킴으로써 비틀림 정도를 조절할 수 있으나, 이러한 방법은 지엽적인 비틀림 정도를 제어할 수 없고 공간적인 변형을 현실화할 수 없다는 단점이 있다. Most nonlinear DNA origami nanostructures were designed by inserting or deleting base pairs in a straight standard structure. The introduction or deletion of base pairs acts as a mechanical perturbation to the standard structure, causing the structure to bend and twist, minimizing geometric misalignment at the crossover location. The degree of bending and twisting can be easily controlled by the number of base pairs introduced between crossovers, but since only natural numbers of base pairs are introduced and deleted, there is a limit that the degree of bending and twisting is not continuous. The degree of twisting can be controlled by changing the helixity of the DNA through binding with the DNA insert and ultraviolet light, but this method has the disadvantage that it cannot control the degree of local twisting and cannot realize spatial modification.

본 발명은 DNA 오리가미 나노 구조체의 비틀림을 조절하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 방법은 DNA 오리가미 나노 구조체의 단위 블록에 하나 이상의 염기쌍을 삽입 또는 결실시키는 단계를 포함하고, 상대적으로 긴 크로스오버 거리를 지닌 DNA 가닥 또는 상대적으로 짧은 크로스오버 거리를 지닌 DNA 가닥에 상기 염기쌍을 삽입 또는 결실시킴으로써 상기 DNA 오리가미 나노 구조체의 비틀림을 조절하는 것을 특징으로 한다. 상기 단위 블록은 상기 DNA 오리가미 나노 구조체의 길이방향을 따라 나타나는 크로스오버 패턴의 최소 반복 단위로서, 상대적으로 긴 크로스오버 거리를 지닌 DNA 가닥 및 상대적으로 짧은 크로스오버 거리를 지닌 DNA 가닥을 포함한다. The present invention relates to a method of controlling the twist of a DNA origami nanostructure, the method according to the present invention comprises the step of inserting or deleting one or more base pairs in the unit block of the DNA origami nanostructure, and a relatively long crossover distance By inserting or deleting the base pair in a DNA strand having a DNA strand having a relatively short crossover distance or a DNA strand having a relatively short crossover distance, the twist of the DNA origami nanostructure is controlled. The unit block is a minimum repeating unit of a crossover pattern appearing along the length direction of the DNA origami nanostructure, and includes a DNA strand having a relatively long crossover distance and a DNA strand having a relatively short crossover distance.

DNA 오리가미 나노 구조체는 길이 방향으로 반복된 패턴의 크로스오버 배치를 갖는다. 예를 들어, 벌집 격자 구조를 갖는 DNA 오리가미 나노 구조체는 6개의 이중 나선 DNA 가닥을 포함하고, 여기에서 하나의 이중 나선 DNA 가닥은 7 bp 및 14 bp 간격을 두고 크로스오버가 반복적으로 나타난다. 이 때, 벌집 격자 구조를 갖는 DNA 오리가미 나노 구조체에서 단위 블록은 21 bp의 길이를 지니며, 상대적으로 긴 크로스오버는 14 bp의 거리를 갖고 상대적으로 짧은 크로스오버는 7 bp의 거리를 갖는다. 이러한 크로스오버 간격은 격자 구조의 형태에 따라 달라진다. 예를 들어, 정사각형 격자 구조를 갖는 DNA 오리가 나노 구조체에서 단위 블록은 32 bp 길이를 지니고, 크로스오버는 8, 16 혹은 24 bp 길이의 간격을 지닐 수 있다.The DNA origami nanostructure has a crossover arrangement of repeated patterns in the longitudinal direction. For example, a DNA origami nanostructure having a honeycomb lattice structure contains six double-helix DNA strands, where one double-helix DNA strand repeatedly shows crossovers at intervals of 7 bp and 14 bp. In this case, in the DNA origami nanostructure having a honeycomb lattice structure, the unit block has a length of 21 bp, a relatively long crossover has a distance of 14 bp, and a relatively short crossover has a distance of 7 bp. This crossover interval varies depending on the shape of the grid structure. For example, in a DNA origa nanostructure having a square lattice structure, a unit block may have a length of 32 bp, and a crossover may have an interval of 8, 16 or 24 bp.

본 발명의 일 실시예에서 본 발명의 방법은 DNA 오리가미 나노 구조체의 단위 블록에 하나 이상의 염기쌍을 삽입 또는 결실시키는 단계를 포함하고, 하나 이상의 염기 쌍이 삽입된 상대적으로 긴 크로스오버 거리를 지닌 DNA 가닥에 대한 하나 이상의 염기 쌍이 삽입된 상대적으로 짧은 크로스오버 거리를 지닌 DNA 가닥의 비를 조절함으로써 상기 DNA 오리가미 나노 구조체의 비틀림을 조절할 수 있다. 상기 크로스오버 거리는 DNA 오리가미 나노 구조체에서 인접한 두 개의 크로스오버 사이의 복수개의 연속된 뉴클레오티드의 길이를 의미한다.In one embodiment of the present invention, the method of the present invention comprises the step of inserting or deleting one or more base pairs in a unit block of a DNA origami nanostructure, and a DNA strand having a relatively long crossover distance into which one or more base pairs are inserted. The twist of the DNA origami nanostructure can be controlled by adjusting the ratio of the DNA strands having a relatively short crossover distance into which one or more base pairs are inserted. The crossover distance refers to the length of a plurality of consecutive nucleotides between two adjacent crossovers in the DNA origami nanostructure.

본 발명은 염기쌍 삽입 및 결실의 개수뿐만 아니라 구조체 내에서의 삽입 및 결실의 배열을 이용하여 비틀린 DNA 오리가미 나노 구조체를 제조하고 형상을 조절하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 방법은 염기쌍이 삽입 또는 결실되는 수가 같더라도 삽입 또는 결실되는 위치에 따라서 변형 에너지가 달라진다는 점에 착안하였다. 삽입 및 결실을 구조적으로 설계함으로써 변형 에너지를 공간적으로 분배하여 DNA 오리가미 나노 구조체의 비틀림에 대한 미세한 조절을 가능하게 하였다. 이를 확인하기 위하여, 본 발명의 방법에 따라 체계적으로 설계된 벌집 격자(honeycomb lattice) 상의 6개의 나선 다발 기준 구조체 및 이의 비틀림 변수를 확인하였다. The present invention provides a method of preparing a twisted DNA origami nanostructure and controlling its shape by using not only the number of base pair insertions and deletions, but also the arrangement of insertions and deletions within the structure. The method according to the present invention was focused on the fact that even if the number of insertions or deletions of base pairs is the same, the transformation energy varies depending on the insertion or deletion position. By structurally designing insertions and deletions, the strain energy is spatially distributed to enable fine control of the distortion of the DNA origami nanostructure. In order to confirm this, six helical bundle reference structures on a honeycomb lattice systematically designed according to the method of the present invention and torsional parameters thereof were confirmed.

그 결과, 각각의 나선에 1개씩의 염기쌍만을 삽입한 단위 블록에서 총 6개의 삽입된 염기쌍의 배열을 조절함으로써 21bp 길이의 단위 블록의 비틀림을 15.0˚ 내지 25.7˚까지 조절할 수 있었으며, 평균 평균 1.8˚씩 증가시킬 수 있었다. 삽입 및 결실을 통해 기계적 섭동에 의해 유도된 변형 에너지를 낮추는 닉(nick) 위치에서 갭을 도입함으로써 더 미세하고 광범위한 비틀림 조절이 가능하였다. 분자동력학 시뮬레이션 결과, 홀리데이 정션(holiday junction)의 구조적 변화는 삽입 위치에 의존할 뿐만 아니라 도입된 변형 에너지가 홀리데이 정션 구조의 변형에 의해서 주로 완화됨을 확인하였다. As a result, by adjusting the arrangement of a total of 6 inserted base pairs in the unit block in which only one base pair was inserted into each helix, the twist of the 21 bp long unit block could be adjusted from 15.0˚ to 25.7˚, and the average average was 1.8˚. Could increase by increments. Finer and more extensive torsion control was possible by introducing a gap at the nick location that lowers the strain energy induced by mechanical perturbation through insertion and deletion. As a result of molecular dynamics simulation, it was confirmed that the structural change of the holiday junction not only depends on the insertion position, but also the introduced strain energy is mainly relaxed by the deformation of the holiday junction structure.

기계적 변형 에너지의 공간적 분배를 프로그래밍함으로써 DNA 오리가미 나노 구조체의 비틀림 각도를 조절하는 신규한 방법을 제공하고, 결과적으로 비틀린 다발에 대한 공간의 실현가능한 설계를 향상시킬 수 있다. 또한 비용 효율적인 방법으로 국지적인 비틀림을 개선할 수 있다. 종래의 방법과 같이, DNA 오리가미의 구조를 변형하기 위하여 염기쌍이 삽입 또는 결실되는 수를 변경하는 것은 대부분의 스테이플 가닥의 교체를 필요로 하는 반면, 본 발명에 따른 설계 방법은 비틀림 정도가 변경된 비틀린 블록에서의 스테이플 가닥의 서열만을 변경하면 된다. 이는 단위 블록에서 각각의 나선에 대한 염기쌍의 삽입 또는 결실의 총 수가 동일하게 유지되기 때문에 가능하다. 또한, 기계적인 섭동의 구조적인 설계 외에도, 대안적으로, 크로스오버 공간을 국지적으로 변화시키는 스테이플 크로스오버를 선택적으로 제거함으로써 변형 에너지의 공간적인 분배를 프로그래밍할 수 있다. DNA 나노 구조체의 내재적 특징에 기초하여, 본 발명은 다른 격자에 기초한 오리가미 또는 단일 가닥 타일에 기반한 DNA 나노 구조체와 같은 다른 형태의 DNA 나노 구조체에도 적용될 수 있다. Programming the spatial distribution of the mechanical strain energy provides a novel method of controlling the twist angle of the DNA origami nanostructure, and consequently improves the feasible design of the space for twisted bundles. It can also improve local distortion in a cost-effective way. As in the conventional method, changing the number of base pairs inserted or deleted in order to modify the structure of DNA origami requires replacement of most staple strands, whereas the design method according to the present invention requires a twisted block with a changed degree of twist. You only need to change the sequence of the staple strand in This is possible because the total number of insertions or deletions of base pairs for each helix in the unit block remains the same. Further, in addition to the structural design of the mechanical perturbation, alternatively, it is possible to program the spatial distribution of the strain energy by selectively removing the staple crossover that changes the crossover space locally. Based on the intrinsic characteristics of the DNA nanostructures, the present invention can also be applied to other types of DNA nanostructures, such as other lattice-based origami or single-stranded tile-based DNA nanostructures.

본 발명에서는 직선의 다발만을 실시예로 기재하였으나, 다발을 그들의 축을 따라 비틀어서구부릴 수 있으므로, 다발을 구부려서 이들을 나선형 코일로 변경하는 데에도 적용할 수 있을 것이다. CanDo 모델을 개선하여 6개의 나선형 번들의 비틀림 각도를 예측하였으며, 이를 통하여 비틀림 정도를 제어할 수 있는 설계 원칙을 제공한다. 또한 분자동역학 시뮬레이션을 통해 6개의 나선형 번들의 비틀림이 주로 홀리데이 정션 구조 변화에 의해 주로 달성됨을 확인하였다. 본 발명에 따른 방법을 적용함으로써 통상의 기술자는 다양한 비틀린 구조체를 설계하여 그들의 기능성을 최적화시킬 수 있을 것이다. In the present invention, only straight bundles are described as examples, but since the bundles can be twisted and bent along their axis, it may be applied to bending the bundles and changing them into spiral coils. The CanDo model was improved to predict the twist angles of six spiral bundles, and through this, a design principle that can control the degree of twist is provided. In addition, through molecular dynamics simulation, it was confirmed that the torsion of the six helical bundles was mainly achieved by the change in the holiday junction structure. By applying the method according to the invention the skilled person will be able to design various twisted structures and optimize their functionality.

하기 실시예는 오직 예시목적으로 의도되며, 어떤한 식이든 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다.The following examples are intended for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the invention in any way.

실시예 1. 방법Example 1. Method

1.1 DNA 오리가미 나노 구조체의 설계 및 자가 조립1.1 Design and self-assembly of DNA origami nanostructure

M13mp18 스캐폴드 가닥 (7249nt)을 이용하여 벌집 격자(honeycomb lattice)의 6개의 나선형 번들(6-helix-bundle; 6HB) DNA 오리가미 나노 구조체를 caDNAno 소프트웨어 (Douglas SM, et al., Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Res 37, 5001-5006, 2009) 및 CanDo (Kim D-N, et al., Quantitative prediction 3D solution shape and flexibility of nucleic acid nanostructures, Nucleic acids research 40, 2862-2868, 2011; Castro CE, et al., A primer to scaffolded DNA origami, Nature methods 8, 221, 2011; Pan K et al., Lattice-free prediction of three-dimensional structure of programmed DNA assemblies, Nature communications 5, 5578, 2014) 모델링 접근법으로 설계하였다. 10nM의 스캐폴드 DNA(New England Biolabs), 100nM의 각각의 스테이플 가닥 (Bioneer Corporation), 1 X TAE 완충액 (40 mM 트리스-아세테이트 및 1 mM EDTA) (Sigma-Aldrich) 및 20 mM의 MgCl2 (Sigma-Aldrich)를 혼합하였다. 열순환기(thermocycler, T100, Bio-Rad)에서 80℃부터 65℃까지 -0.25℃/분 및 65℃부터 25℃까지 -1℃/분으로 냉각시키면서 자가 조립 반응을 진행하였다. Six spiral bundles (6-helix-bundle; 6HB) DNA origami nanostructures of a honeycomb lattice using M13mp18 scaffold strands (7249nt) were converted into caDNAno software (Douglas SM, et al., Rapid prototyping of 3D DNA). -origami shapes with caDNAno.Nucleic Acids Res 37, 5001-5006, 2009) and CanDo (Kim DN, et al., Quantitative prediction 3D solution shape and flexibility of nucleic acid nanostructures, Nucleic acids research 40, 2862-2868, 2011; Castro CE, et al., A primer to scaffolded DNA origami, Nature methods 8, 221, 2011; Pan K et al., Lattice-free prediction of three-dimensional structure of programmed DNA assemblies, Nature communications 5, 5578, 2014) Designed with a modeling approach. 10 nM of scaffold DNA (New England Biolabs), 100 nM of each staple strand (Bioneer Corporation), 1 X TAE buffer (40 mM Tris-acetate and 1 mM EDTA) (Sigma-Aldrich) and 20 mM MgCl 2 (Sigma -Aldrich) were mixed. In a thermocycler (T100, Bio-Rad), the self-assembly reaction was carried out while cooling from 80°C to 65°C at -0.25°C/min and from 65°C to 25°C at -1°C/min.

1.2 아가로오스 젤 전기영동1.2 Agarose gel electrophoresis

나선형 DNA 오리가미 나노 구조체의 어닐링된 시료를 0.5 X TBE (45 mM 트리스-보레이트, 1mM EDTA, Sigma-Aldrich), 12 mM MgCl2 및 0.5μg/ml EtBr (ethidium bromide, Noble Bioscience Inc.)를 포함하는 1.5% 아가로오스 젤을 이용하여 전기영동 하였다. 전기영동은 75 V (~3.7 V/cm))에서 1.5시간 동안 냉수로 냉각된 챔버 (i-Myrun, Cosmo Bio CO. LTD.)에서 수행하였다. 젤 사진은 GelDoc XR+ 장치 및 Image Lab v5.1 프로그램(Bio-Rad)을 사용하여 수득하였다. The annealed sample of the helical DNA origami nanostructures was prepared with 0.5 X TBE (45 mM Tris-borate, 1 mM EDTA, Sigma-Aldrich), 12 mM MgCl 2 and 0.5 μg/ml EtBr (ethidium bromide, Noble Bioscience Inc.). Electrophoresis was performed using 1.5% agarose gel. Electrophoresis was performed in a chamber (i-Myrun, Cosmo Bio CO. LTD.) cooled with cold water for 1.5 hours at 75 V (~3.7 V/cm)). Gel photos were obtained using the GelDoc XR+ device and the Image Lab v5.1 program (Bio-Rad).

1.3 AFM (Atomic force microscopy) 이미지1.3 AFM (Atomic force microscopy) image

젤 전기영동 동안 EtBr 삽입 및 염 농도 변화로 인한 DNA 오리가미 나노 구조체의 모양이나 기계적 특성에서 의도하지 않은 구조체의 형성를 회피하기 위하여, 정제되지 않은 시료를 사용하였다. 기질 상에서 단량체의 수를 조절하기 위하여 증착 전에 어닐링된 시료를 1:19의 비로 굽힘 용액 (folding solution) (1X TAE, 20 mM MgCl2)으로 희석하였다. 운모 기판 (가장 높은 등급의 V1 AFM Mica, Ted-Pella Inc.)에 20μl의 희석된 시료를 증착하고 5분간 인큐베이션하였다. 기판을 초순수(deionized water)로 세척하고 N2 건(gun)으로 부드럽게 건조(<0.1 kgf/cm2)하였다. AFM 이미지는 SmartScan 소프트웨어에서 비접촉 모드로 NX10 (Park Systems)으로 촬영하였다. 42N/m의 스프링 상수를 갖는 PPP-NCHR 프로브를 측정에 사용하였다. DNA 오리가미 나노 구조체의 단일 입자는 MATLAB 스크립트(Lee C, et al., Polymorphic design of DNA origami structures through mechanical control of modular components. Nature communications 8, 2067, 2017) 를 이용하여 AFM 이미지로부터 추출하였고 단일 입자의 분류는 정해진 절차에 따라 수행하였다. 성공적으로 접힌 단량체들은 2개의 플래그의 상대적 위치에 따라 시스- 및 트랜스-구조로 분류하였다. 적어도 4개의 AFM 이미지를 얻고 이들의 트랜스-구조 비율(trans-conformation ratio; TR)을 이용하여 각각의 구조에 대한 TR의 평균 및 표준 편차를 구하였다. In order to avoid the formation of unintentional structures in the shape or mechanical properties of DNA origami nanostructures due to EtBr insertion and salt concentration changes during gel electrophoresis, unpurified samples were used. In order to control the number of monomers on the substrate, the annealed sample before deposition was diluted with a folding solution (1X TAE, 20 mM MgCl 2 ) at a ratio of 1:19. A 20 μl diluted sample was deposited on a mica substrate (highest grade V1 AFM Mica, Ted-Pella Inc.) and incubated for 5 minutes. The substrate was washed with deionized water and gently dried (<0.1 kgf/cm 2 ) with an N 2 gun. AFM images were taken with NX10 (Park Systems) in a non-contact mode in SmartScan software. A PPP-NCHR probe with a spring constant of 42N/m was used for the measurement. Single particles of DNA origami nanostructures were extracted from AFM images using a MATLAB script (Lee C, et al., Polymorphic design of DNA origami structures through mechanical control of modular components.Nature communications 8, 2067, 2017). Classification was carried out according to the established procedure. Successfully folded monomers were classified into cis- and trans-structures according to the relative positions of the two flags. At least 4 AFM images were obtained and their trans-conformation ratio (TR) was used to obtain the mean and standard deviation of the TR for each structure.

1.4 분자동역학 시뮬레이션1.4 Molecular dynamics simulation

1x6의 삽입 분배가 있는 직선형의 H0 내지 H6 삽입 블록의 3개의 단위 블록으로 구성된 3개의 짧은 6개의 나선형 번들에 대한 100 ns의 시뮬레이션을 수행하였다 (도 2e). caDNAno를 이용하여 비틀린 DNA 나노 구조체의 최초의 원자 좌표를 설정하였다. 이들을 약 106 Å X 115 Å X 238 Å의 입방형의 TIP3P 물 박스에서 용매화하고 20 mM MgCl2로 전기적으로 중성화하였다. 분자동역학 시뮬레이션은 CHARMM36 역장(force field) (Hart K, et al., Optimization of the CHARMM Additive Force Field for DNA: Improved Treatment of the BI/BII Conformational Equilibrium, J Chem Theory Comput 8, 348-362, 2012)의 NAMD (Phillips JC, et al., Scalable molecular dynamics with NAMD, J Comput Chem 26, 1781-1802, 2005)를 이용하여 수행하였다. 반데르발스 및 정전위를 포함하는 짧은 범위의 비-굽힘 포텐셜을 18 Å 컷오프를 가지고 계산하였고, 긴 범위의 정전기학적 상호작용은 1Å의 격자 크기로 Particle Mesh Ewald (PME) (Essmann U, et al., A smooth particle mesh Ewald method, J Chem Phys 103, 8577-8593, 1995) 방법으로 계산하였다. 각각의 시스템에서, 포텐셜 에너지는 공액 구배법 (conjugate gradient method)을 이용하여 최소화하였다. 평형 궤적 (equilibrium trajectory)은 Langevin thermostat을 이용한 300K 및 Nose-Hoover Langevin 피스톤으로 1 bar의 등압-등온 (NPT) 앙상블 하에서 시뮬레이션하였다. 분자동역학 궤적으로부터, 염기쌍 스텝 파라미터들을 3DNA (Lu XJ, Olson WK, 3DNA: a software package for the analysis, rebuilding and visualization of three-dimensional nucleic acid structures, Nucleic acids research 31, 5108-5121, 2003)에서 정의한 바에 따라 계산하였다. 자유 경계(free boundary) 조건 및 홀리데이 정션들의 영향을 피하기 위하여, 중앙의 단위 블록만을 분석하였고, 분석에서 홀리데이 정션으로부터 2개의 염기쌍을 벗어난 곳은 제외하였다. A simulation of 100 ns was performed for 3 short 6 helical bundles consisting of 3 unit blocks of linear H0 to H6 insertion blocks with 1×6 insertion distribution (Fig. 2e). The initial atomic coordinates of the twisted DNA nanostructure were set using caDNAno. They were solvated in a cubic TIP3P water box of about 106 Å X 115 Å X 238 Å and electrically neutralized with 20 mM MgCl 2 . Molecular dynamics simulation was conducted using the CHARMM36 force field (Hart K, et al., Optimization of the CHARMM Additive Force Field for DNA: Improved Treatment of the BI/BII Conformational Equilibrium, J Chem Theory Comput 8, 348-362, 2012). Of NAMD (Phillips JC, et al., Scalable molecular dynamics with NAMD, J Comput Chem 26, 1781-1802, 2005). Short range non-bending potentials including van der Waals and electrostatic potentials were calculated with a cutoff of 18 Å, and long range electrostatic interactions were calculated with a grid size of 1 Å, Particle Mesh Ewald (PME) (Essmann U, et al. ., A smooth particle mesh Ewald method, J Chem Phys 103, 8577-8593, 1995). In each system, the potential energy was minimized using the conjugate gradient method. The equilibrium trajectory was simulated under an isothermal (NPT) ensemble of 1 bar with 300K and Nose-Hoover Langevin pistons using a Langevin thermostat. From molecular dynamics trajectories, base pair step parameters were defined in 3DNA (Lu XJ, Olson WK, 3DNA: a software package for the analysis, rebuilding and visualization of three-dimensional nucleic acid structures, Nucleic acids research 31, 5108-5121, 2003). It was calculated according to the bar. In order to avoid the influence of free boundary conditions and holiday junctions, only the central unit block was analyzed, and the part that deviated from two base pairs from the holiday junction was excluded in the analysis.

실시예 2. 결과Example 2. Results

2.1 설계 원리2.1 Design principle

격자 기반의 DNA 오리가미 나노 구조체에서, 일반적으로 크로스오버 간격은 나선에 따라 다르다. 예를 들어, 각각의 나선이 3개의 인접 나선과 연결되는 벌집 격자에서 설계된 직선 구조물의 경우에는, 모든 가능한 크로스오버들이 형성된다면, 크로스오버는 안쪽 나선에서 매 7 염기쌍마다 존재한다. 그러나 가장 바깥쪽 나선은 오직 두 개의 인접한 나선만이 이용가능하기 때문에, 가장 바깥쪽 나선은 7 염기쌍 또는 14 염기쌍마다 크로스오버를 갖는다. 특히 닫힌 횡단면을 갖는 6HB 에 있어서, 모든 나선의 크로스오버는 동일한 방식으로 위치한다 (도 1a). In lattice-based DNA origami nanostructures, in general, the crossover spacing depends on the helix. For example, in the case of a straight structure designed in a honeycomb lattice where each helix connects to three adjacent helices, if all possible crossovers are formed, then a crossover exists every 7 base pairs in the inner helix. However, because the outermost helix is only available with two adjacent helices, the outermost helix has a crossover every 7 base pairs or 14 base pairs. Particularly for 6HB with a closed cross section, the crossovers of all helices are located in the same way (Fig. 1a).

이러한 가변 크로스오버 배치는 구조적 설계에서 삽입 또는 결실 염기쌍의 위치를 중요하게 만든다. 기하학적인 불일치가 삽입 또는 결실된 염기쌍의 수에 의해 결정되면, 이들에 의해 유도된 변형 에너지는 이들이 위치한 나선 영역의 강성에 의존하며, 이는 기준 길이 또는 크로스오버 위치에 의존한다. 결과적으로, 7 염기쌍 크로스오버 배열의 나선 부분에서 삽입 또는 결실에 의한 변형 에너지는 14 염기쌍 영역에 도입될 때에 비하여 약 2배 더 높다 (도 1b). 따라서 삽입 또는 결실된 염기쌍의 위치를 변경함으로써 나선을 따라 그리고 횡단면을 걸쳐서 변형 에너지의 다양한 공간적 분배를 할 수 있었다. This variable crossover arrangement makes the location of the insertion or deletion base pairs important in the structural design. If the geometric mismatch is determined by the number of inserted or deleted base pairs, the strain energy induced by them depends on the stiffness of the helix regions in which they are located, which depends on the reference length or the crossover position. As a result, the energy of transformation by insertion or deletion in the helical portion of the 7 base pair crossover arrangement is about 2 times higher than when introduced into the 14 base pair region (Fig. 1B). Thus, by changing the position of the inserted or deleted base pair, various spatial distributions of the strain energy along the helix and across the cross section were possible.

각각의 삽입 또는 결실에 대한 두개의 위치적 선택지를 가지고도 구조적 설계 공간은 삽입 또는 결실된 염기쌍의 수로 기하급수적으로 확장되기 때문에, 비틀림 정도의 다양한 범위를 갖는 비틀린 DNA 오리가미 나노 구조체를 만드는 다목적 방법을 제공한다. Even with two positional options for each insertion or deletion, the structural design space expands exponentially with the number of inserted or deleted base pairs.Therefore, a multipurpose method of creating a twisted DNA origami nanostructure with a wide range of twisting degrees is used. to provide.

이러한 설계 원리를 DNA 오리가미에 대한 FE (finite element) 모델인 CanDo를 이용하여 컴퓨터로 테스트하였다. 2개의 비틀린 6HB 구조체를 7개의 21 염기쌍 길이의 단위 블록으로 이루어진 일직선의 기준 구조체에 염기쌍을 삽입하여 설계하였다. 단위 블록의 각 나선에서 7 염기쌍 또는 14 염기쌍 나선 세그먼트에 하나의 염기쌍만을 삽입 (단위 블록 당 총 6쌍의 삽입)하였다. 삽입된 염기쌍의 2가지 대표적인 배치를 고안하였으며, 모든 삽입이 14 염기쌍 나선 세그먼트에서 일어나는 경우 최소 변형 에너지 배열을 가지며, 모든 삽입이 7 염기쌍 나선 세그먼트에서만 존재하는 경우 최대 변형 에너지를 갖는다. 각각의 배열에 대한 CanDo 분석에 의해 예상된 비틀림 각은 각각 84.0˚ 및 165.6˚였고, 이는 제안된 설계 방법이 큰 가능성을 가짐을 보였다. This design principle was tested with a computer using CanDo, a finite element (FE) model for DNA origami. Two twisted 6HB structures were designed by inserting base pairs into a straight reference structure consisting of 7 unit blocks of 21 base pairs in length. In each helix of the unit block, only one base pair was inserted into the helix segment of 7 base pairs or 14 base pairs (a total of 6 pairs per unit block). Two representative configurations of interpolated base pairs were devised, with a minimum strain energy configuration when all insertions occur in a 14 base pair helix segment, and a maximum strain energy when all insertions are present only in a 7 base pair spiral segment. The torsional angles predicted by CanDo analysis for each array were 84.0˚ and 165.6˚, respectively, which showed that the proposed design method has great potential.

본 발명에 따른 방법은 일반적으로 적용 가능하므로, 임의의 격자 유형에서 설계된 임의의 횡단면 모양을 갖는 다른 구조체의 비틀림 각을 조절할 수 있다. 이를 확인하기 위하여, 7가지의 기준 구조 (벌집 격자에서 4가지 및 사각 격자에서 3가지)를 각각의 구조체에 대해 2개의 삽입 배열을 설계하였다 (도 1d). 변형 에너지에 기반한 배열 설계 접근법은 비록 구조체 각각의 나선은 격자 유형, 격자 상에서 나선의 위치 및 인접한 나선 사이의 연결성에 따라 상이한 크로스오버 간격을 갖지만 CanDo 분석 시 잘 맞아 떨어지도록 작동함을 확인하였다. Since the method according to the invention is generally applicable, it is possible to adjust the twist angle of other structures having any cross-sectional shape designed in any grid type. To confirm this, seven reference structures (four in a honeycomb grid and three in a square grid) were designed with two insertion arrangements for each structure (Fig. 1d). The array design approach based on the strain energy confirmed that although each helix of the structure has a different crossover spacing depending on the grid type, the position of the helix on the grid, and the connectivity between adjacent helices, it works to fit well in CanDo analysis.

2.2 비틀림 각의 변화2.2 Change of twist angle

체계적으로 그리고 정량적으로 비틀림을 제어하기 위한 본 발명을 확인하기 위하여, 표준의 직선 DNA 오리가미 나노 구조체를 가변부 (variable body; VB) 및 고정부(fixed body; FB)의 2 부분으로 구분하였다 (도 2a). 6개의 21 염기쌍 길이의 나선으로 구성된 20개의 단위 블록들은 비틀림 정도가 삽입 또는 결실에 의하여 제어되어 각각 우선성(right-handed twist) 또는 좌선성(left-handed twist)으로 비틀린 구조를 형성하게 되는 VB를 포함한다. VB의 말단에는 2개의 직선 FB 부분이 결합된다. 각각의 영역은 6HB 코어 외에도 10개의 63 염기쌍 길이의 나선으로 구성된 단일층의 플래그 영역을 갖는다. FB의 플래그는 AFM 이미지에 의해 운모 표면에 증착될 때 비틀린 구조체의 2가지 형태학적 상태를 구분하기 위하여 구조체에 추가하였다. 2개의 긴 단일 가닥 DNA (ssDNA) 루프는 VB 및 FB 사이의 계면에 존재하여 VB에서 임의의 변화를 위해 필요한 추가적인 염기를 공급하거나 FB를 조절함으로써 FB에서 DNA 가닥의 서열이 바뀌지 않도록 유지한다. In order to confirm the present invention for systematically and quantitatively controlling torsion, the standard linear DNA origami nanostructure was divided into two parts: a variable body (VB) and a fixed body (FB) (Fig. 2a). Twenty unit blocks composed of six 21-base pairs of helix are controlled by insertion or deletion to form a twisted structure with right-handed twist or left-handed twist, respectively. Includes. At the end of VB, two straight FB segments are joined. In addition to the 6HB core, each region has a single-layer flag region consisting of ten 63 base pairs long helices. Flags of FB were added to the structure to differentiate between the two morphological states of the distorted structure when deposited on the mica surface by AFM image. Two long single-stranded DNA (ssDNA) loops exist at the interface between VB and FB to keep the sequence of the DNA strands in FB unchanged by supplying the additional bases necessary for any change in VB or by regulating FB.

기준 구조체의 꼬임의 변화를, 이 구조체의 총 비틀림 각을 결정하는, VB에서 비틀린 단위 블록의 수 및 이의 비틀림 정도를 체계적으로 변화시킴으로써 설계하고 제작하였다 (도 2a). 단일 염기쌍 삽입 또는 결실만이 단위 블록 내의 각각의 나선에 도입되도록 하였다 (이하 각각 삽입 블록 또는 결실 블록이라고 함). 삽입 또는 결실된 염기쌍의 2가지 대표적인 형태는 삽입 또는 결실을 14-염기쌍 나선 세그먼트에 모두 도입하거나 7-염기쌍 나선 세그먼트에 모두 도입함으로써 고안하였다. 이들 두 형태는 각각 H0 및 H6로 지칭하였고, 여기서 H는 높은 변형 에너지의 나선 세그먼트 (또는 7 염기쌍 크로스오버 간격)를 나타내고 숫자는 세그먼트에 위치한 삽입 또는 결실의 총 수를 나타낸다. 따라서 H0 배열에서 단위 블록은 14 염기쌍 나선 세그먼트에만 삽입을 가지므로 가장 낮은 비틀림 정도를 갖고, H6 배열은 가장 큰 비틀림 정도를 갖는다. The change in twist of the reference structure was designed and fabricated by systematically changing the number of unit blocks twisted in VB and the degree of twisting thereof, which determines the total twist angle of the structure (Fig. 2A). Only a single base pair insertion or deletion was introduced into each helix in the unit block (hereinafter referred to as insertion block or deletion block, respectively). Two representative types of inserted or deleted base pairs were designed by introducing both insertions or deletions into the 14-base pair helix segment or both into the 7-base pair helix segment. These two forms were referred to as HO and H6, respectively, where H represents a high strain energy helix segment (or 7 base pair crossover interval) and the number represents the total number of insertions or deletions located in the segment. Therefore, in the H0 configuration, the unit block has the lowest degree of torsion since it has insertions only in the 14-base pair helix segment, and the H6 configuration has the largest degree of torsion.

운모 표면에 증착될 때, 이들 구조체는 AFM 이미지에서 성공적으로 비틀린 단량체들의 두 개의 플래그들의 상대적 위치에 의해 쉽게 확인될 수 있는 두 개의 상이한 배열을 가질 수 있다. 두 개의 플래그는 동일하거나 반대편의 구조 (각각 시스 배열 또는 트랜스 배열이라 한다)로 존재할 수 있다 (도 2b). 두 배열 모두 증착의 확률적 특성으로 인하여 임의의 설계된 구조체에서 확인될 수 있지만, 이들의 비율은 구조체의 비틀림 각도에 따라 달라진다. 비틀림 각도가 0˚에 가깝다면 시스 배열이 주요하지만, 180˚에 가깝게 비틀리도록 설계되었다면 트랜스 배열의 구조체가 더 주요할 것이다 (도 2c). When deposited on the mica surface, these structures can have two different arrangements that can be easily identified by the relative position of the two flags of successfully twisted monomers in the AFM image. The two flags may exist in the same or opposite structure (respectively referred to as cis or trans configuration) (Fig. 2b). Both arrangements can be found in any designed structure due to the probabilistic nature of the deposition, but their ratio depends on the twist angle of the structure. If the twist angle is close to 0°, the sheath arrangement is important, but if it is designed to be twisted close to 180°, the structure of the trans array will be more important (FIG. 2C).

AFM 이미지로부터 성공적으로 비틀린 단량체의 트랜스 배열 비율 (trans-conformational ratio; TR)을 계산하여 비틀림 각도를 도출하였다. 다만, 증착 공정 동안 비틀림 각도의 불확실성으로 인하여 트랜스 배열 역시 가능하여 직선의 구조체 역시 TR 값이 0이 되지는 않는다. TR 값은 H0 및 H6에서 모두 비틀림 각이 180˚에 상응하는 피크에 도달할 때까지 삽입 또는 결실 블록의 수에 따라 증가하고 (도 2d), 180˚를 초과하면 비틀림 각도가 감소하기 시작한다. H6 배열이 단위 블록으로 사용될 때 TR에서 유의적으로 더 높은 변화율을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 단위 블록의 비틀림 정도에 삽입 또는 결실된 염기쌍의 배열 설계의 효과를 확인하였다. 결실 블록을 사용하였을 때 조금 더 낮은 TR 값을 얻었으며, 이는 결실 블록의 구조가 삽입 블록의 구조보다 짧아 비틀림에서 더 딱딱하게 되는 것에 기인한다. The twist angle was derived from the AFM image by calculating the trans-conformational ratio (TR) of the successfully twisted monomer. However, due to the uncertainty of the twist angle during the deposition process, the trans arrangement is also possible, so the TR value of the straight structure also does not become 0. The TR value increases with the number of inserted or deleted blocks until the torsion angle reaches a peak corresponding to 180° in both H0 and H6 (Fig. 2d), and when it exceeds 180°, the torsion angle begins to decrease. When the H6 sequence was used as a unit block, a significantly higher rate of change in TR was confirmed, and through this, the effect of the sequence design of the inserted or deleted base pairs on the degree of torsion of the unit block was confirmed. When the deletion block was used, a slightly lower TR value was obtained, which is due to the fact that the structure of the deletion block is shorter than that of the insertion block and becomes harder in twist.

측정된 TR 값은, H0 배열에서 14개의 삽입 블록이 사용되었을 때 알 수 없는 이유로 현저하게 낮은 TR 값이 관찰된 것 제외하고, 블록의 수에 대하여 정현파 (sinusoidal) 프로필을 나타냈다 (도 2d). 측정된 TR 곡선으로부터 2가지 배열에서 삽입 블록의 평균 비틀림을 정량하였다. 여기에서, 구조체의 비틀림 각은 삽입 블록의 수에 따라 선형적으로 증가하고 최저 및 최대 TR 값은 각각 0˚ 및 180˚이며, TR 곡선은 이들의 피크에 대하여 대칭적인 것으로 가정하였다. TR 값의 피크는 H0 배열에서 12 삽입 블록에서, 그리고 H6 배열에서는 7 삽입 블록에서 나타났고, H0 및 H6 배열에서 각각 15˚ 및 25.7˚의 평균 비틀림 정도를 보였다. The measured TR values showed a sinusoidal profile for the number of blocks, except that a significantly low TR value was observed for unknown reasons when 14 inserted blocks were used in the HO array (FIG. 2D ). From the measured TR curves, the average twist of the insertion block in two arrangements was quantified. Here, the torsion angle of the structure increases linearly with the number of inserted blocks, the minimum and maximum TR values are 0° and 180°, respectively, and the TR curves are assumed to be symmetric with respect to their peaks. The peaks of the TR value appeared in 12 insertion blocks in the H0 configuration and 7 insertion blocks in the H6 configuration, respectively, and the average degree of twisting was 15° and 25.7° in the H0 and H6 configurations, respectively.

굽은 구조체의 비틀림 각도를 CanDo를 이용하여 계산하고 이들을 간단한 기하학적 모델(Chen H, et al., Dynamic and progressive control of DNA origami conformation by modulating DNA helicity with chemical adducts, ACS nano 10, 4989-4996, 2016)을 사용하여 TR 값으로 변환하였다. 그러나 CanDo로 도출된 비틀림 각도는 실험 값에 비하여 낮은 비틀림 각도를 보였다. 이러한 불일치는 홀리데이 정션이 유연한 것으로 알려져 있는 반면 CanDo에서는 크로스오버가 단단한 것으로 간주된 단순화된 기계적 모델인 것에 기인한다고 가정하였다. 비틀림 각도 상의 크로스오버 성질에 대한 민감도 분석은, 만약 홀리데이 정션이 유연하고, 특히 이들의 구부러짐 강도가 구조체의 비틀림 각도에 가장 큰 영향을 미친다면, 비틀림 각도에 대한 이들의 영향은 무시할 수 없음을 나타내었다. 따라서, 실험에서와 같이 H0 배열에서 12 삽입 블록을 가진 구조체의 예상된 비틀림 각도가 180˚가 되도록 굽힘 강도가 선택된 유연한 크로스오버 모델을 개발하였다. 그리고 유연한 크로스오버 모델을 이용하여 CanDo로 모든 다른 구조체의 비틀림 각도를 계산하였다. 변경된 TR 값은 H0 및 H6 단위 블록을 가진 구조체 설계 모두에서 실험 값에 상응하였다. Calculate the twist angle of the bent structure using CanDo and calculate them with a simple geometric model (Chen H, et al., Dynamic and progressive control of DNA origami conformation by modulating DNA helicity with chemical adducts, ACS nano 10, 4989-4996, 2016). Was converted to a TR value. However, the twist angle derived by CanDo showed a lower twist angle than the experimental value. This discrepancy was assumed to be due to a simplified mechanical model where the holiday junction is known to be flexible, while in CanDo the crossover is considered rigid. Sensitivity analysis of the crossover properties on the twist angle indicates that if the holiday junctions are flexible, especially if their bend strength has the greatest effect on the twist angle of the structure, their effect on the twist angle cannot be ignored. Done. Therefore, as in the experiment, a flexible crossover model was developed in which the bending strength was selected so that the predicted twist angle of the structure with 12 insertion blocks in the H0 array was 180°. And using the flexible crossover model, the twist angles of all other structures were calculated with CanDo. The changed TR values corresponded to the experimental values in both the H0 and H6 unit block structures design.

3개의 단위 블록으로 이루어진 6HB 구조체 (도 2e)에 대한 200 ns 길이의 분자동역학 시뮬레이션은 H0 및 H6 배열 간의 차이를 보여주었다 (도 2f). 마지막 40 ns의 분자동역학 스냅샷으로부터 측정된 2 단위 블록에 상응하는 비틀림 각은 H0 및 H6 배열에서 각각 34.1˚ 및 56.7˚였다 (도 2f). 분자 동역학 시뮬레이션은 실험 값(30.0˚ 및 51.4˚) 및 CanDo의 예상값 (27.0˚ 및 51.5˚)에 비하여 비틀림 각이 조금 높게 나타났으나, 배열 설계의 실질적인 영향을 명확히 보여주었다. 홀리데이 정션 배열의 추가적인 정량 분석은 분자 단위에서 2가지 삽입 배열의 구조적 차이를 보여주었다 (도 2g). H6 배열을 갖는 비틀린 구조체에서 홀리데이 정션 다리는 H0 배열을 가진 구조체에서 보다 평면으로부터 덜 이격되었고, 결과적으로, 개별적인 나선의 더 약한 기복(undulation)을 보였다. 이는 7-염기쌍 나선 세그먼트가 14-염기쌍 나선 세그먼트에 비하여 더 단단하므로 염기쌍이 7-염기쌍 세그먼트로 삽입되었을 때 홀리데이 정션 다리가 덜 구부러질 수 있음에 기인한 것으로 보인다. 반대로 비틀린 구조체에 대하여 염기쌍 스텝 파라미터에서 유의미한 변화는 보이지 않았다. 따라서 다발 비틀림은 홀리데이 정션의 배열상의 변화에 의한 것으로 보인다. Molecular dynamics simulation of 200 ns length for a 6HB structure consisting of three unit blocks (FIG. 2E) showed the difference between the H0 and H6 arrangements (FIG. 2F). The twist angles corresponding to the two unit blocks measured from the last 40 ns molecular dynamics snapshot were 34.1° and 56.7° in the H0 and H6 configurations, respectively (Fig. 2f). Molecular dynamics simulation showed slightly higher torsional angle than the experimental values (30.0˚ and 51.4˚) and the predicted values of CanDo (27.0˚ and 51.5˚), but it clearly showed the practical effect of the arrangement design. Additional quantitative analysis of the holiday junction arrangement showed structural differences between the two insertion arrangements at the molecular level (Fig. 2g). Holiday junction legs in the twisted structure with H6 arrangement were less spaced from the plane than in the structure with the H0 arrangement, and consequently showed a weaker undulation of individual helices. This seems to be due to the fact that the 7-base pair helical segment is harder than the 14-base pair helical segment, so the Holiday junction leg may be less bent when the base pair is inserted into the 7-base pair segment. Conversely, there was no significant change in the base pair step parameter for the twisted structure. Therefore, the bundle twist appears to be due to a change in the arrangement of the holiday junction.

2.3 비틀림 정도의 미세 조정2.3 Fine adjustment of the degree of twist

단위 블록에서 높은 변형 에너지의 나선 세그먼트로 삽입된 염기쌍의 수를 변화시킴으로써 구조체로 다양한 비틀림 정도를 프로그래밍할 수 있다. 본 발명자는 VB에서 6개의 비틀린 단위 블록을 갖는 5개의 추가적인 구조체(H1 내지 H5)를 설계하였다 (도 3a). AFM 이미지 분석을 통해 이들 구조체의 평균 TR 값은 H1에서 0.57부터 H5에서 0.74까지 고-변형-에너지 삽입의 수에 따라 단조롭게 증가하였고 (H0의 평균 TR값은 0.50이고, H6의 평균 TR값은 0.79임), 이를 통해 본 발명에 따른 기계적 섭동의 구조적 설계에 의해 비틀림 정도를 미세하게 조절할 수 있음을 확인하였다. By varying the number of base pairs inserted into the high strain energy helix segment in the unit block, the structure can be programmed with varying degrees of twist. The inventors designed 5 additional structures (H1 to H5) with 6 twisted unit blocks in VB (Fig. 3A). Through AFM image analysis, the average TR value of these structures monotonically increased with the number of high-strain-energy insertions from 0.57 in H1 to 0.74 in H5 (average TR value of H0 is 0.50, average TR value of H6 is 0.79). Im), through this, it was confirmed that the degree of twisting can be finely adjusted by the structural design of the mechanical perturbation according to the present invention.

유연한 크로스오버 모델을 사용한 CanDo 예측은 모델 파라미터에 대한 추가의 조정 없이도 실험 결과와 거의 일치했다. H0 내지 H6 배열 설계로 달성된 구조체의 비틀림 각은 85.0˚ 내지 148.0˚였으며, 단위 블록 당 1.8˚의 평균 증가로서 14.2˚ 내지 24.7˚의 비틀림 정도에 상응한다. 비틀림 제어에 대한 이러한 구조적 변화는 DNA 오리가미의 수율에는 거의 영향을 미치지 않았다 (도 3b).CanDo prediction using a flexible crossover model closely matched the experimental results without any further adjustments to the model parameters. The twist angle of the structure achieved with the H0 to H6 arrangement design was 85.0° to 148.0°, which corresponds to a degree of twist of 14.2° to 24.7° as an average increase of 1.8° per unit block. These structural changes to the torsion control had little effect on the yield of DNA origami (Fig. 3b).

CanDo를 이용한 다른 삽입 배열에 대해 추가적으로 계산한 결과, 비틀림 정도를 제어하는 가장 주요한 인자는 고-변형-에너지 삽입의 수 (도 3c)였다. 예를 들어, 모든 나선이 단위 블록 당 1개의 삽입 염기쌍을 가질 때, 총 64개의 삽입 배열이 가능한데, H0 내지 H6에 상응하는 단지 7가지의 상이한 비틀림 정도만이 얻어졌다. 이들 값은 고-변형-에너지 삽입의 수에 따라 증가하였으며, 이는 상기의 실험 결과와 일치하였다. 유사한 결과를 1.5x4 및 2x3을 포함하는 삽입 강도와 같은 다른 삽입 배열에서도 얻을 수 있었다. 추가적으로, 하나 이상의 삽입 염기쌍이 사용될 때, 다양한 변형 에너지 분배가 가능하여 동일한 수의 고-변형-에너지에서도 조금씩 상이한 비틀림 정도를 얻을 수 있었다. As a result of additional calculation for other insertion arrangements using CanDo, the most important factor controlling the degree of twist was the number of high-strain-energy insertions (FIG. 3C). For example, when every helix has 1 interpolation base pair per unit block, a total of 64 intercalation arrangements are possible, with only 7 different degrees of twisting corresponding to HO to H6 obtained. These values increased with the number of high-strain-energy insertions, which was consistent with the above experimental results. Similar results could be obtained with other insertion arrangements, such as insertion strength including 1.5x4 and 2x3. Additionally, when more than one interpolation base pair is used, various strain energy distributions are possible, so that slightly different degrees of twisting can be obtained even with the same number of high-strain-energies.

본 발명의 배열 설계 접근법은 다른 수의 나선 및 횡단면 모양을 갖는 임의의 상이한 구조체에도 쉽게 적용될 수 있다. 이를 확인하기 위하여 단위 블록 당 각각의 나선에 하나의 염기쌍이 삽입된 24개의 단위 블록으로 구성된 14개의 나선 번들을 설계하였다. 고-변형-에너지 삽입의 수가 H4 내지 H14로 매 4개의 단위 블록 당 2개씩 점진적으로 증가하는 축방향으로 다양한 삽입 배열을 프로그래밍하였다 (도 3d). 4개의 내부 나선들은 다른 것들과 달리 3개의 인접한 나선을 갖고, 따라서 모든 가능한 크로스오버가 형성될 때만 7 염기쌍 나선 세그먼트가 존재하였다. CanDo 분석을 통해 4개의 단위 블록의 비틀림 각은 고-변형-에너지 삽입의 수에 따라 36.9˚ 내지 73.4˚까지 증가함을 확인하였다. 이는 H4 내지 H14의 모든 가능한 삽입 배열을 고려하고 고-변형-에너지 삽입의 수에 관한 비틀림 각도의 선형 변수를 가정할 때, 단위 블록 당 0.9˚의 평균 증가로 9.2˚ 내지 18.4˚의 비틀림 정도를, 본 발명에 따른 방법을 이용한 특정 14 나선 다발 구조체에 프로그래밍할 수 있음을 알 수 있다. The arrangement design approach of the present invention can be easily applied to any different structure with a different number of helix and cross-sectional shapes. To confirm this, we designed 14 helix bundles consisting of 24 unit blocks with one base pair inserted into each helix per unit block. Various insertion arrangements were programmed in the axial direction in which the number of high-strain-energy insertions gradually increased from H4 to H14 by 2 per every 4 unit blocks (Fig. 3D). The four inner helices, unlike others, had three contiguous helices, so there were only 7 base pair helix segments when all possible crossovers were formed. Through CanDo analysis, it was confirmed that the twist angle of the four unit blocks increased from 36.9˚ to 73.4˚ depending on the number of high-strain-energy insertions. This gives a degree of twist of 9.2° to 18.4° with an average increase of 0.9° per unit block, taking into account all possible insertion arrangements H4 to H14 and assuming a linear variable of twist angle with respect to the number of high-strain-energy inserts. , It can be seen that programming in a specific 14-helix bundle structure using the method according to the present invention.

2.4 갭을 이용한 기계적 완화를 통한 비틀림 제어2.4 Torsion control through mechanical relaxation using gaps

DNA 이중 구조에서 짧은 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드, 즉 갭(gap)은 긴장을 경감시키는 것으로 알려졌다. 이 구조적 특징은 예를 들어, 정방 격자 (square lattice) 상에 설계된 구조체에서 축적된 변형 에너지를 경감하거나 구부러진 번들의 국소 힌지 강도를 감소시키거나 역동적인 DNA 나노 구조체를 설계하는 데에 이용되었다. 지금까지 본 발명에서는 삽입 또는 결실된 염기쌍의 배열 설계의 효율성을 보였는데, 비틀림 제어를 위해 기계적 변형뿐만 아니라 구조체에 기계적 완화를 도입할 수도 있다. Short, unpaired nucleotides, or gaps, in the DNA duplex structure are known to relieve tension. This structural feature was used to design dynamic DNA nanostructures, for example, to alleviate the strain energy accumulated in structures designed on a square lattice, to reduce the local hinge strength of a bent bundle. Until now, the present invention has shown the efficiency of designing the arrangement of inserted or deleted base pairs, but it is also possible to introduce mechanical relaxation to the structure as well as mechanical deformation for torsion control.

이를 확인하기 위하여 기계적인 섭동에 의해 야기되는 변형 에너지를 국지적으로 낮추는 변형 경감 구조적 모티프로서 갭을 사용하였다. 갭은 더 짧은 부분의 닉 위치에서 스테이플 가닥을 교체함으로써 구조체에 쉽게 도입할 수 있다 (도 4a). 경감의 정도는 갭 길이 (갭의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드의 수) 및 갭 밀도 (갭에 의해 대체된 닉의 수를 단위 블록 내에 닉의 총 수로 나눈 값)에 의해 조절할 수 있다. H0 배열을 가진 6 삽입 블록으로 이루어진 비틀린 구조체에 상이한 갭 모티브를 도입함으로써 6개의 상이한 구조체를 설계하였으며, 2가지의 갭 길이 (1 및 3 뉴클레오티드) 및 3가지의 갭 밀도 (1/3, 2/3 및 1)로 제작하였다. 갭을 갖는 모든 구조체에 대하여 아가로오스 젤에서는 깨끗한 단량체 밴드를 확인하였고, AFM 이미지에서는 유의미한 형태 변형이 일어나지 않았다. 더 높은 갭 밀도 및 더 긴 갭 길이에서는 TR 값 (또는 비틀림 각도)에서 더 높은 감소를 확인하였다 (도 4b). 최대 밀도의 3개의 뉴클레오티드 길이의 갭을 사용하였을 때, TR 값이 0.5에서 0.17로 감소된 것과 마찬가지로 비틀림 각도는 30˚까지 감소하였다. 이러한 결과는 갭을 통한 기계적인 완화를 구조적 디자인 접근법에 도입함으로써 더 미세한 조절 가능성을 가지고 제어 가능한 범위의 비틀림 각도를 더 넓힐 수 있을 것이다. In order to confirm this, a gap was used as a structural motif for reducing deformation that locally lowers the deformation energy caused by mechanical perturbation. The gap can be easily introduced into the structure by replacing the staple strand at the nick location of the shorter part (Fig. 4A). The degree of mitigation can be controlled by the gap length (the number of unpaired nucleotides in the gap) and the gap density (the number of nicks replaced by the gap divided by the total number of nicks in the unit block). Six different structures were designed by introducing different gap motifs into the twisted structure consisting of 6 insertion blocks with the HO arrangement, and 2 gap lengths (1 and 3 nucleotides) and 3 gap densities (1/3, 2/ It was produced in 3 and 1). For all structures having a gap, a clean monomer band was confirmed in the agarose gel, and no significant shape modification occurred in the AFM image. At higher gap density and longer gap length, a higher decrease in TR value (or twist angle) was observed (Fig. 4b). When a gap of 3 nucleotide length of maximum density was used, the twist angle was reduced to 30° as the TR value was reduced from 0.5 to 0.17. These results could lead to a wider range of torsion angles in the controllable range with finer controllability by introducing mechanical mitigation through gaps into the structural design approach.

예를 들어, 청구항 구성 목적을 위해, 이하 기재되는 청구항은 어떤 식으로든 이의 문자 그대로의 언어보다 좁게 해석되어선 안 되고, 따라서 명세서로부터의 예시적 구현예가 청구항으로 읽혀서는 안 된다. 따라서, 본 발명은 예시로서 기재되었고, 청구항의 범위에 대한 제한이 아님이 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명은 하기 청구항에 의해서만 제한된다. 본 출원에 인용된 모든 간행물, 발행된 특허, 특허 출원, 서적 및 저널 논문은 이들의 전체내용이 참조로서 본원에 각각 포함된다.For example, for the purposes of claim construction, the claims set forth below should not be construed in any way narrower than their literal language, and therefore exemplary embodiments from the specification should not be read as claims. Accordingly, it should be understood that the invention has been described as an example and is not a limitation on the scope of the claims. Accordingly, the invention is limited only by the following claims. All publications, issued patents, patent applications, books, and journal articles cited in this application are each incorporated herein by reference in their entirety.

Claims (9)

DNA 오리가미 나노 구조체의 크로스오버 거리를 기준으로 염기쌍이 삽입 또는 결실되는 단위 블록 내 DNA 가닥을 선택하는 단계; 및
상기 단위 블록에 하나 이상의 염기쌍을 삽입 또는 결실시키는 단계를 포함하고,
상기 크로스오버 거리는 DNA 오리가미 나노 구조체에서 인접한 두 개의 크로스오버 사이의 복수개의 연속된 염기쌍의 길이를 의미하고,
상기 단위 블록은, 상기 DNA 오리가미 나노 구조체의 길이방향을 따라 나타나는 크로스오버 패턴의 최소 반복 단위로서, 서로 다른 복수개의 크로스오버 거리를 지닌 DNA 가닥을 포함하는, DNA 오리가미 나노 구조체의 비틀림을 조절하는 방법.Selecting a DNA strand within a unit block into which a base pair is inserted or deleted based on the crossover distance of the DNA origami nanostructure; And
Including the step of inserting or deleting one or more base pairs in the unit block,
The crossover distance refers to the length of a plurality of consecutive base pairs between two adjacent crossovers in the DNA origami nanostructure,
The unit block is a minimum repeating unit of a crossover pattern appearing along the length direction of the DNA origami nanostructure, and includes DNA strands having a plurality of crossover distances different from each other, a method for controlling the twist of a DNA origami nanostructure . 청구항 1에 있어서, 상대적으로 긴 크로스오버 거리를 지닌 DNA 가닥에 상기 염기쌍을 삽입 또는 결실시킴으로써 상기 DNA 오리가미 나노 구조체에 상대적으로 작은 비틀림을 발생하게 하는, 방법. The method according to claim 1, wherein a relatively small twist occurs in the DNA origami nanostructure by inserting or deleting the base pair in a DNA strand having a relatively long crossover distance. 청구항 1에 있어서, 상대적으로 짧은 크로스오버 거리를 지닌 DNA 가닥에 상기 염기쌍을 삽입 또는 결실시킴으로써 상기 DNA 오리가미 나노 구조체에 상대적으로 큰 비틀림을 발생하게 하는, 방법.The method of claim 1, wherein the base pair is inserted or deleted in a DNA strand having a relatively short crossover distance, thereby causing a relatively large twist in the DNA origami nanostructure. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 스캐폴드 DNA에서 스테이플 DNA 가닥과 쌍을 이루지 않는 하나 이상의 뉴클레오티드를 도입하는 단계를 더 포함하는, 방법.The method of any one of claims 1-3, further comprising introducing one or more nucleotides not paired with staple DNA strands in the scaffold DNA. 청구항 4에 있어서, 스캐폴드 DNA에서 스테이플 DNA 가닥과 쌍을 이루지 않는 하나 이상의 뉴클레오티드를 도입하여 상기 DNA 오리가미 나노 구조체의 비틀림을 작게 하는, 방법.The method according to claim 4, wherein the twist of the DNA origami nanostructure is reduced by introducing one or more nucleotides not paired with the staple DNA strand in the scaffold DNA. DNA 오리가미 나노 구조체의 크로스오버 거리를 기준으로 염기쌍이 삽입 또는 결실되는 단위 블록 내 DNA 가닥을 선택하는 단계; 및
상기 단위 블록에 삽입 또는 결실되는 염기쌍 수의 변화 없이, 하나 이상의 염기쌍을 삽입 또는 결실시켜 염기쌍이 삽입 또는 결실된 서로 다른 크로스오버 거리를 가진 DNA 가닥의 비를 조절하는 단계를 포함하고,
상기 크로스오버 거리는 DNA 오리가미 나노 구조체에서 인접한 두 개의 크로스오버 사이의 복수개의 연속된 염기쌍의 길이를 의미하고,
상기 단위 블록은, 상기 DNA 오리가미 나노 구조체의 길이방향을 따라 나타나는 크로스오버 패턴의 최소 반복 단위로서, 서로 다른 복수개의 크로스오버 거리를 지닌 DNA 가닥을 포함하는, DNA 오리가미 나노 구조체의 비틀림을 조절하는 방법.Selecting a DNA strand within a unit block into which a base pair is inserted or deleted based on the crossover distance of the DNA origami nanostructure; And
Without changing the number of base pairs inserted or deleted in the unit block, inserting or deleting one or more base pairs to adjust the ratio of DNA strands having different crossover distances in which base pairs are inserted or deleted,
The crossover distance refers to the length of a plurality of consecutive base pairs between two adjacent crossovers in the DNA origami nanostructure,
The unit block is a minimum repeating unit of a crossover pattern appearing along the length direction of the DNA origami nanostructure, and includes DNA strands having a plurality of crossover distances different from each other, a method for controlling the twist of a DNA origami nanostructure . 청구항 6에 있어서, 하나 이상의 염기 쌍이 삽입된 상대적으로 긴 크로스오버 거리를 지닌 DNA 가닥에 대한, 하나 이상의 염기 쌍이 삽입된 상대적으로 짧은 크로스오버 거리를 지닌 DNA 가닥의 비가 커질수록 상기 DNA 오리가미 나노 구조체의 비틀림이 증가되는, 방법.The method according to claim 6, wherein the DNA strand having a relatively short crossover distance into which one or more base pairs are inserted to a DNA strand having a relatively long crossover distance is increased, the greater the ratio of the DNA origami nanostructure. How torsion is increased. 청구항 6 또는 7에 있어서, 스캐폴드 DNA에서 스테이플 DNA 가닥과 쌍을 이루지 않는 하나 이상의 뉴클레오티드를 도입하는 단계를 더 포함하는, 방법.The method of claim 6 or 7, further comprising introducing one or more nucleotides not paired with the staple DNA strand in the scaffold DNA. 청구항 8에 있어서, 스캐폴드 DNA에서 스테이플 DNA 가닥과 쌍을 이루지 않는 하나 이상의 뉴클레오티드를 도입하여 상기 DNA 오리가미 나노 구조체의 비틀림을 작게 하는, 방법.The method according to claim 8, wherein the twist of the DNA origami nanostructure is reduced by introducing one or more nucleotides not paired with the staple DNA strand in the scaffold DNA.
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