KR102157801B1 - Composition for determining male-sterility of onion - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 양파의 웅성불임(male-sterility)을 판별할 수 있는 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition capable of determining the male-sterility of onions.
양파(Allium cepa L.)는 토마토 다음으로 세계에서 두번째로 중요한 채소 작물이다. 하이브리드 품종의 양파는 고수율, 균일성(uniformity), 생물적/비생물적 스트레스에 대한 저항성으로 꾸준히 증가하고 있다. 하이브리드 종자를 생산하기 위해서는 양파에서 웅성불임(male-sterility)을 사용해야 한다. 양파에는 자기-비호환(self-incompatibility) 현상이 없다. 양파는 수백개의 완벽한 꽃으로 이루어지기 때문에, 인공-거세는 양파에 실제로 적용될 수 없다.Onions ( Allium cepa L.) is the second most important vegetable crop in the world after tomatoes. Hybrid varieties of onions are steadily increasing due to their high yield, uniformity, and resistance to biotic/abiotic stress. The use of male-sterility in onions is required to produce hybrid seeds. Onions do not have self-incompatibility. Since onions are made up of hundreds of perfect flowers, artificial castration cannot really be applied to onions.
생존 가능한 꽃가루 알갱이를 생산하지 못하는 유전적 웅성불임은 핵이나 미토콘드리아 유전자에 의해 발생할 수 있다. 그러나, 양파에서는 비정상적인 미토콘드리아 유전자에 의한 세포질의 웅성불임(cytoplasmic male-sterility; CMS)만 보고되고 있다. CMS는 많은 식물 종에 널리 분포되어 있다. 그것은 야생 개체군의 유전적 다양성 유지에 기여한다. CMS는 많은 작물 종에서 F1 잡종 종자 생산에 이용되어 왔다. 또한, CMS는 핵 및 미토콘드리아 게놈간의 통신(communication)을 연구하기 위한 매력적인 주제였다. Hereditary male infertility, which fails to produce viable pollen grains, can be caused by nuclear or mitochondrial genes. However, only cytoplasmic male-sterility (CMS) caused by abnormal mitochondrial genes has been reported in onions. CMS is widely distributed in many plant species. It contributes to maintaining the genetic diversity of wild populations. CMS has been used to produce F 1 hybrid seeds in many crop species. In addition, CMS has been an attractive topic for studying communication between the nuclear and mitochondrial genomes.
알려진 모든 CMS 유도 유전자는 식물 미토콘드리아 게놈의 특이한 특징으로 인해, 미토콘드리아 게놈에서 발견되었다. 단일 원형 엽록체 게놈과는 달리, 식물 미토콘드리아 게놈의 정확한 구조는 선형, 분지형 및 다중형체 형태가 제안되었으나, 여전히 논란의 여지가 있다. 식물 미토콘드리아 게놈의 크기는 소형 동물 미토콘드리아 게놈(15-18kb) 대비, 겨우살이(Viscum scurruloideum)의 66kb에서 장구채속(Silene conica)의 11.3Mb까지 종에 따라 매우 다양하다.All known CMS inducers have been found in the mitochondrial genome due to the unique features of the plant mitochondrial genome. Unlike the single circular chloroplast genome, the exact structure of the plant mitochondrial genome has been proposed in linear, branched and polymorphic forms, but is still controversial. The size of the plant mitochondrial genome varies greatly depending on the species, from 66 kb of mistletoe ( Viscum scurruloide um) to 11.3 Mb of the genus Silene conica compared to the small animal mitochondrial genome (15-18 kb ).
반복 서열 매개 재조합(Repeat sequence-mediated recombination)은 미토콘드리아 게놈의 동적 재배열(dynamic rearrangement)을 일으키는 동력으로 간주된다. CMS를 유도하는 이상 유전자는 이러한 재배열에 의해 생성되는 것으로 생각된다. 또한, 다중 서브게놈(multipartite subgenomes)은 반복 매개 재조합에 의해 생성되는 것으로 가정한다. 서브게놈의 특정 화학양론은 핵 유전자의 의해 유지되는 것으로 알려져 있다. 그러나, 핵 유전자의 돌연변이와 조직 환경과 같은 몇 가지 요인들 때문에, 서브 게놈의 특정 화학양론이 드물게 변한다. 서브게놈의 화학양론적 변화는 화학양론적 하부이동(substoichiometric shifting)이라고 부른다. CMS는 때때로, CMS를 유도하는 유전자를 포함하는 서브게놈의 사본(copy) 수가 증가하고, 충분한 수준의 유전자 산물이 생산될 때, 이러한 화학양론적 하부이동에 의해 발생할 수 있다. Repeat sequence-mediated recombination is considered to be the driving force behind dynamic rearrangement of the mitochondrial genome. It is believed that the abnormal genes that induce CMS are produced by this rearrangement. In addition, it is assumed that multipartite subgenomes are produced by repetitive mediated recombination. It is known that the specific stoichiometry of the subgenomic is maintained by the nuclear gene. However, due to several factors such as mutations in nuclear genes and tissue environment, the specific stoichiometry of the sub-genome changes infrequently. The stoichiometric change of a subgenomic is called substoichiometric shifting. CMS can sometimes be caused by this stoichiometric downshift when the number of copies of the subgenomic containing the gene that induces CMS is increased and a sufficient level of the gene product is produced.
경우에 따라, CMS의 번식 가능 표현형은 임성회복 핵유전자(nuclear restorer-of-fertility gene; Rf gene)에 의해 복원될 수 있다. CMS 유도 미토콘드리아 유전자 사이에 유의한 상동성은 발견되지 않았지만, Rf 유전자의 대부분은 펜타트리코펩티드 반복(pentatricopeptide repeat; PPR) 단백질을 암호화하는 것으로 알려져 있으나, 다른 유형의 Rf 유전자도 보고된 바 있다.In some cases, the reproductive phenotype of CMS can be restored by a nuclear restorer-of-fertility gene (Rf gene). Although no significant homology was found between CMS-induced mitochondrial genes, most of the Rf genes are known to encode a pentatricopeptide repeat (PPR) protein, but other types of Rf genes have also been reported.
양파에서 두가지 유형의 CMS가 보고되었다. CMS-S는 Jones와 Emsweller에 의해 발견되었는데, 그것의 임성회복(fertility restoration)은 단일 핵 Rf 유전자좌 Ms에 의해 통제되었다. 후에, CMS-T는 Berninger에 의해 보고되었는데, 적어도 3개의 독립적인 Rf 유전자좌가 생식능력 회복에 관여한다고 제안되었다. 그러나, 최근의 연구는 CMS-S와 CMS-T의 생식능력 회복이 동일한 Ms 유전자좌에 의해 조절될 수 있다고 제안하였다. 또한, CMS-S 세포질의 완전한 미토콘드리아 게놈 서열의 조립은 키메라 유전자 orf725가 CMS 유도를 담당하는 최상의 후보 유전자임을 시사한다. 또한, 정상 및 CMS-T 세포질의 미토콘드리아 게놈 서열은 orf725를 제외하고는 거의 동일하고, CMS-S와 CMS-T 모두의 남성 불임이 orf725에 유발될 수 있으며, 동일한 Ms 유전자좌에 의해 남성 생식력이 회복될 수 있음을 시사한다. Two types of CMS have been reported in onions. CMS-S was discovered by Jones and Emsweller, whose fertility restoration was controlled by a single nuclear Rf locus Ms. Later, CMS-T was reported by Berninger, suggesting that at least three independent Rf loci are involved in fertility recovery. However, recent studies have suggested that the recovery of fertility in CMS-S and CMS-T can be regulated by the same Ms locus. In addition, assembly of the complete mitochondrial genomic sequence of the CMS-S cytoplasm suggests that the chimeric gene orf725 is the best candidate gene responsible for CMS induction. In addition, normal and CMS-T cytoplasmic mitochondrial genomic sequences are almost identical except for orf725, male infertility in both CMS-S and CMS-T can be induced in orf725, and male fertility is restored by the same Ms locus. Suggests that it can be.
세포질 유형과 MS 유전자형의 마커-보조(marker-assisted) 선택을 용이하게 하기 위해 많은 분자 마커가 보고되었다. 양파는 2년생 작물이므로, 그러한 분자 마커는 육종가로 하여금 힘들고 시간 소모적인 자손(progeny) 검사를 피할 수 있게 한다. 본 연구에서는 CMS 유도 및 임성 회복을 담당하는 후보 유전자를 기반으로, 세포질형 및 MS 유전자형의 고효율 스크리닝에 최적인 분자마커를 개발하였다. 또한, 독립적인 화학양론적 변화에 의해 생성된 CMS-T 세포질의 변이가 이 연구에서 보고된다.Many molecular markers have been reported to facilitate marker-assisted selection of cytoplasmic types and MS genotypes. Since onions are biennial crops, such molecular markers allow breeders to avoid laborious and time-consuming progeny testing. In this study, based on candidate genes responsible for CMS induction and fertility recovery, molecular markers that are optimal for highly efficient screening of cytoplasmic and MS genotypes were developed. In addition, variations in the CMS-T cytoplasm produced by independent stoichiometric changes are reported in this study.
본 발명은 우수한 정확도로 양파의 웅성불임(male-sterility)을 판별할 수 있는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.It is an object of the present invention to provide a composition capable of determining male-sterility of onions with excellent accuracy.
1. 서열번호 20의 서열로 이루어진 순방향 프라이머, 서열번호 21의 서열로 이루어진 역방향 프라이머 및 서열번호 22의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 1. A primer set comprising a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 20, a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 21, and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 22;
서열번호 31의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 32의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;A primer set comprising a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 31 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 32;
서열번호 33의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 34의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;A primer set including a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 33 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 34;
서열번호 37의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 38의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;A primer set comprising a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 37 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 38;
서열번호 39의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 40의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;A primer set including a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 39 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 40;
서열번호 41의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 42의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;A primer set comprising a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 41 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 42;
서열번호 43의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 44의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;A primer set comprising a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 43 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 44;
서열번호 45의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 46의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;A primer set comprising a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 45 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 46;
서열번호 47의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 48의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 및A primer set including a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 47 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 48; And
서열번호 49의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 50의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 하나의 세트를 포함하는 양파의 웅성불임(male-sterility) 판별용 조성물.A composition for determining male-sterility of onions comprising one set selected from the group consisting of a primer set including a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 49 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 50.
2. 위 1에 있어서, 2. In 1 above,
서열번호 31의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 32의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;A primer set comprising a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 31 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 32;
서열번호 33의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 34의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;A primer set including a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 33 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 34;
서열번호 37의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 38의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;A primer set comprising a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 37 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 38;
서열번호 39의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 40의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;A primer set including a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 39 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 40;
서열번호 41의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 42의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;A primer set comprising a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 41 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 42;
서열번호 43의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 44의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;A primer set comprising a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 43 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 44;
서열번호 45의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 46의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;A primer set comprising a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 45 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 46;
서열번호 47의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 48의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 및A primer set including a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 47 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 48; And
서열번호 49의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 50의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 하나의 세트를 포함하는 조성물.A composition comprising one set selected from the group consisting of a primer set including a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 49 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 50.
3. 위 1에 있어서, 3. In 1 above,
서열번호 31의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 32의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 또는A primer set comprising a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 31 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 32; or
서열번호 43의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 44의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 포함하는 조성물.A composition comprising a primer set comprising a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 43 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 44.
4. 위 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프라이머는 HRM(High Resolution Melt) 분석용인 조성물.4. The composition of any one of the above 1 to 3, wherein the primer is for HRM (High Resolution Melt) analysis.
5. 위 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 양파의 웅성-임성 세포질형(cytoplasm type) 판별용인 조성물.5. The composition according to any one of the above 1 to 3, wherein the composition is for determining the male-fertility cytoplasmic type of onion.
6. 위 5에 있어서, 상기 세포질형은 웅성-가임(male fertility), CMS-S(cytoplasmic male sterility S) 또는 CMS-T(cytoplasmic male sterility T)인 조성물.6. The composition of the above 5, wherein the cytoplasmic type is male fertility, CMS-S (cytoplasmic male sterility S) or CMS-T (cytoplasmic male sterility T).
7. 위 2 또는 3에 있어서, 상기 조성물은 양파의 웅성-임성 세포질형 및 Ms 유전자좌(locus)에 위치한 AcPMS1 유전자의 유전형(genotype) 판별용인 조성물.7. The composition according to 2 or 3 above, wherein the composition is for determining the genotype of the AcPMS1 gene located at the male-pregnant cytoplasmic type of onion and the Ms locus.
8. 위 7에 있어서, 상기 세포질형은 웅성-가임, CMS-S 또는 CMS-T인 조성물.8. The composition of the above 7, wherein the cytoplasmic type is male-fertile, CMS-S or CMS-T.
9. 위 1 내지 3 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 양파의 웅성불임 판별용 키트.9. A kit for determining male infertility of onions comprising the composition of any one of the above 1 to 3.
10. 위 9에 있어서, 상기 키트는 양파의 웅성-임성 세포질형 판별용인 키트.10. In the above 9, the kit is a male-female cytoplasmic type identification kit of onion.
11. 위 1 내지 3 중 어느 한 항의 조성물을 판별 대상 양파의 gDNA(genomic DNA)에 처리하여 증폭시키는 단계를 포함하는 양파의 웅성불임 판별 방법.11. A method for determining male sterility of onions comprising the step of amplifying the composition of any one of the above 1 to 3 by processing and amplifying the gDNA (genomic DNA) of the target onion.
12. 위 11에 있어서, 증폭된 산물을 분석하여 양파의 웅성-임성 세포질형을 판단하는 단계를 더 포함하는 방법.12. The method of 11 above, further comprising the step of determining the male-fertility cytoplasmic type of onion by analyzing the amplified product.
본 발명의 조성물은 우수한 정확도로 양파의 웅성불임(male-sterility) 세포질형 및 특정 유전자의 유전자형을 판별할 수 있어, 그 산업적 이용가치가 매우 높다.The composition of the present invention can determine the male-sterility cytoplasmic type of onion and the genotype of a specific gene with excellent accuracy, so that its industrial value is very high.
도 1은 정상 및 CMS-T 미토콘드리아 게놈 서열 사이의 3개 SNP 위치를 나타낸 것이다. 화살표 모양의 상자는 5'에서 3' 방향을 나타내었다. 엑손과 인트론은 각각 회색과 빈 상자로 표시되었다. 미토콘드리아 게놈 서열상의 SNP 위치를 나타내기 위해, SNp 대립유전자의 염기서열을 수직선으로 나타내었다.
도 2는 CMS-T 세포질 변이체 사이의 cox1과 orf725의 화학양론에 차이가 있음을 나타낸 것이다. (A)는 Cy-F1, Cy-R1 및 MK-R1의 프라이머 조합으로 증폭된 PCR 산물을 나타낸 것으로서, 1 내지 4는 'T' SNP 대립 유전자를 갖는 CMS-T 세포질을 함유하는 양파이고, 5 내지 8은 'G' SNP 대립유전자를 갖는 CMS-T 세포질을 함유하는 양파이다(N: 정상, S: CMS-S). (B)는 정상, CMS-S 및 CMS-T 변이체에서 cox1 및 orf725의 상대적인 사본 수를 nad6의 사본 수와 비교한 것이다.
도 3은 정상 또는 CMS-S 미토콘드리아 게놈 서열에 특이적인 영역을 검출하기 위한 분자 마커의 개발과 관련된 것이다. (A)는 정상 및 CMS-S 미토콘드리아 게놈 간 차별적 영역의 구성을 나타내는 것인데, 화살표 모양의 채워진 상자는 유전자와 5'에서 3' 방향을 나타내는 것이고, 얇은 회색 상자는 신테닉 유전자간 영역을 나타내는 것이며, 수평 화살표는 프라이머의 결합 부위를 나타내는 것이다. (B)는 도 6A에 도시된 3개의 프라이머의 각 조합으로 증폭된 5개의 분자 마커의 PCR 산물을 나타내는 것이다(N: 정상, T: CMS-T, S: CMS-S).
도 4는 정상 및 CMS 유도 세포질을 구별하기 위한 HRM 마커의 개발에 관련된 것이다. (A)는 cox1과 orf725 유전자의 구조를 나타낸 것인데, 화살표 모양의 상자는 5'에서 3' 방향을 나타내고, 동종 영역은 수직선으로 연결되며, 수평 화살표는 프라이머 가교 사이트를 나타내고, 직사각형 박스 내의 뉴클레오티드 서열은 도 4B 내 정렬되어 있다. (B)는 도 4A에서 직사각형 박스로 둘러싸인 cox1 및 orf725 뉴클레오티드 서열을 정렬한 것으로, 수평 화살표는 프라이머 결합 부위를 나타낸다. (C)는 도 4B에 도시된 3개의 프라이머로 증폭된 HRM 마커의 표준화된 용융 피크 패턴을 나타낸 것이다.
도 5는 Ms 유전자좌의 유전자형 분석을 위한 HRM 마커의 개발에 관련된 것이다. (A)는 Ms 유전자좌와 연결된 AcPMS1 대립 유전자의 구성을 나타낸 것으로, 화살표 모양의 상자는 5'에서 3' 방향을 나타내고, 엑손과 인트론은 각각 회색과 빈 상자로 표시되며, 채워진 상자는 큰 InDel 서열을 나타내고, 수평 막대는 HRM 마커의 위치를 나타내며, HRM 마커의 프라이머 서열은 표 2에 나타내었다. (B)는 Rf-HRM1 및 Rf-HRM7 마커의 표준화된 용융 피크(좌)와 곡선(우)을 나타낸 것이다.
도 6은 CAPS 및 HRM 마커는 정상 및 CMS 유도 세포질 사이의 단일 SNP를 기반으로 설계되었다. (A)는 DraI 제한효소로 절단된 CAPS 마커의 PCR 산물을 나타낸 것이고, (B)는 HRM 마커의 표준화된 용융 피크 패턴을 나타낸 것이다.
도 7은 양파 세포질 유형을 구별하기 위해 개발된 3가지 분자표지의 PCR 패턴을 나타낸 것이고, PCR 증폭은 각각의 참고문헌에 따라 수행되었다(N: 정상, T: CMS-T, S: CMS-S).
도 8은 AcPMS1 게놈 DNA 다형성에 기초하여 설계된 10개의 HRM 마커의 표준화된 용융 피크 패턴을 나타낸 것으로서, 각 마커의 위치는 도 5A에 도시되었다.Figure 1 shows the three SNP positions between the normal and CMS-T mitochondrial genomic sequence. Arrow-shaped boxes indicate the 5'to 3'direction. Exons and introns are indicated by gray and empty boxes, respectively. In order to indicate the SNP position on the mitochondrial genome sequence, the nucleotide sequence of the SNp allele is indicated by a vertical line.
Figure 2 shows that there is a difference in stoichiometry of cox1 and orf725 between CMS-T cytoplasmic variants. (A) shows a PCR product amplified with a primer combination of Cy-F1, Cy-R1 and MK-R1, 1 to 4 is an onion containing CMS-T cytoplasm having a'T' SNP allele, 5 To 8 are onions containing CMS-T cytoplasm with a'G' SNP allele (N: normal, S: CMS-S). (B) The relative number of copies of cox1 and orf725 in normal, CMS-S and CMS-T variants compared to the number of copies of nad6.
3 relates to the development of molecular markers for detecting regions specific to normal or CMS-S mitochondrial genomic sequences. (A) shows the composition of the differential regions between the normal and CMS-S mitochondrial genomes, the arrow-shaped filled boxes represent the genes and the 5'to 3'directions, and the thin gray boxes represent the synthenic intergenic regions. , Horizontal arrows indicate the binding site of the primer. (B) shows the PCR products of five molecular markers amplified by each combination of the three primers shown in Fig. 6A (N: normal, T: CMS-T, S: CMS-S).
Figure 4 relates to the development of HRM markers to differentiate between normal and CMS induced cytoplasm. (A) shows the structure of the cox1 and orf725 genes, the arrow-shaped box indicates the 5'to 3'direction, the homogeneous region is connected by a vertical line, the horizontal arrow indicates the primer cross-linking site, and the nucleotide sequence in the rectangular box Are aligned in Figure 4B. (B) is an alignment of the cox1 and orf725 nucleotide sequences enclosed in a rectangular box in FIG. 4A, and the horizontal arrows indicate the primer binding sites. (C) shows the normalized melting peak pattern of the HRM marker amplified with the three primers shown in FIG. 4B.
Figure 5 relates to the development of HRM markers for genotyping of the Ms locus. (A) shows the composition of the AcPMS1 allele linked to the Ms locus, with arrow-shaped boxes indicating the 5'to 3'direction, exons and introns are indicated by gray and empty boxes, respectively, and filled boxes are large InDel sequences. , The horizontal bar indicates the location of the HRM marker, and the primer sequence of the HRM marker is shown in Table 2. (B) shows the normalized melting peaks (left) and curves (right) of the Rf-HRM1 and Rf-HRM7 markers.
6, CAPS and HRM markers were designed based on a single SNP between normal and CMS induced cytoplasm. (A) shows the PCR product of the CAPS marker digested with DraI restriction enzyme, and (B) shows the normalized melting peak pattern of the HRM marker.
7 shows the PCR patterns of three molecular markers developed to distinguish onion cytoplasmic types, and PCR amplification was performed according to each reference (N: normal, T: CMS-T, S: CMS-S ).
Figure 8 shows the normalized melting peak pattern of 10 HRM markers designed based on AcPMS1 genomic DNA polymorphism, the location of each marker is shown in Figure 5A.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 양파의 웅성불임(male-sterility) 판별용 조성물을 제공한다.The present invention provides a composition for determining male-sterility of onions.
상기 웅성불임이란 웅성기관의 형태적 또는 기능적 이상 때문에 수분, 수정, 종자현상이 나타나지 않는 현상을 말하는 것으로, 환경적인 일시적 변이로서 발현하는 경우와, 유전형질로서 발현하는 경우가 존재한다. 전자는 영양조건의 불균형, 온도, 일조 등의 이상에 의하지만, 후자는 화분불임성, 웅성불임성, 수정불능에 의하는데, 본 발명의 조성물은 유전형질로서 발현하는 경우로서, 웅성불임성을 판별하는 용도에 관한 것이다.The male infertility refers to a phenomenon in which moisture, fertilization, and seed phenomena do not appear due to morphological or functional abnormalities of the male organs, and there are cases where it is expressed as an environmental temporary mutation and a case where it is expressed as a genotype. The former is due to abnormalities such as imbalance of nutritional conditions, temperature, sunlight, etc., but the latter is due to pollen sterility, male infertility, and inability to fertilize. It is about.
본 발명의 조성물은 서열번호 20의 서열로 이루어진 순방향 프라이머, 서열번호 21의 서열로 이루어진 역방향 프라이머 및 서열번호 22의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 31의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 32의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 33의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 34의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 37의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 38의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 39의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 40의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 41의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 42의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 43의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 44의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 45의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 46의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 47의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 48의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 및 서열번호 49의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 50의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 하나의 세트를 포함할 수 있다.The composition of the present invention comprises a primer set comprising a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 20, a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 21, and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 22; A primer set comprising a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 31 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 32; A primer set including a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 33 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 34; A primer set comprising a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 37 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 38; A primer set including a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 39 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 40; A primer set comprising a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 41 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 42; A primer set comprising a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 43 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 44; A primer set comprising a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 45 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 46; A primer set including a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 47 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 48; And it may include one set selected from the group consisting of a primer set including a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 49 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 50.
상기 프라이머는 판별 대상 양파의 gDNA(genomic DNA)에 처리하여 특정 부위를 증폭하는 용도로 사용되는 것인데, 프라이머와 판별 대상 양파의 gDNA 간 상보적으로 결합한 후 당업계 주지된 PCR 증폭과정을 거칠 수 있고, 상기 PCR 증폭산물을 분석함으로써 양파의 웅성불임 여부 또는 그 유형을 정확하게 판별할 수 있다.The primer is used to amplify a specific site by processing gDNA (genomic DNA) of the onion to be determined.After complementary binding between the primer and the gDNA of the onion to be determined, a PCR amplification process known in the art can be performed. , By analyzing the PCR amplification product, it is possible to accurately determine whether the onion is male or infertile.
상기 특정부위는 상기 프라이머가 판별 대상 양파의 gDNA(genomic DNA)에 처리됨에 따라 상보적으로 결합함으로써 특정되는 것임은 본 발명을 실시하고자 하는 당업계 통상의 기술자에 자명한 것이다.It will be apparent to those skilled in the art to practice the present invention that the specific site is characterized by complementarily binding to the primer as it is treated with gDNA (genomic DNA) of the onion to be determined.
상기 PCR 증폭산물 분석은 CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence), ILP(intron length polymorphism), PCR(Polymerase Chain Reaction), RFLP(Restriction Fragment Lennth Polymorphism), STS(Sequence Tagged Site), SCAR(Sequence Characterized Amplified Regions), DNA 시퀀싱(DNA Sequencing), HRM(High Resolution Melt) 또는 서던 블럿(Southern blot) 분석 단계를 포함할 수 있고, 바람직하게는 HRM 분석 단계를 포함할 수 있으며, 이러한 경우, 상기 프라이머는 HRM 분석용일 수 있다.The PCR amplified product analysis is CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence), ILP (intron length polymorphism), PCR (Polymerase Chain Reaction), RFLP (Restriction Fragment Lennth Polymorphism), STS (Sequence Tagged Site), SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions). , DNA sequencing (DNA Sequencing), HRM (High Resolution Melt) or Southern blot (Southern blot) may include an analysis step, preferably may include an HRM analysis step, in this case, the primer is for HRM analysis I can.
상기 조성물은 양파의 웅성-임성 세포질형(cytoplasm type) 판별용일 수 있는데, 상기 웅성-임성이란 웅성 양파 개체의 생식능력(ability of fertilization)을 나타내는 것으로서, 상기 웅성-임성 세포질형은 웅성-가임(male fertility), CMS-S(cytoplasmic male sterility S) 또는 CMS-T(cytoplasmic male sterility T)일 수 있다. 상기 CMS-S와 CMS-T에 관련된 구체적인 설명은 상술한 배경기술에서 확인되는 바와 같다.The composition may be used to determine the male-feminous cytoplasm type of onion, wherein the male-fertility indicates the ability of fertilization of a male onion individual, and the male-fertile cytoplasmic type is male-fertile ( male fertility), CMS-S (cytoplasmic male sterility S), or CMS-T (cytoplasmic male sterility T). Detailed descriptions related to the CMS-S and CMS-T are as confirmed in the background art.
본 발명의 조성물은 바람직하게는, 서열번호 31의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 32의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 33의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 34의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 37의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 38의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 39의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 40의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 41의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 42의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 43의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 44의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 45의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 46의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 47의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 48의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 및 서열번호 49의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 50의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 하나의 세트를 포함할 수 있다.The composition of the present invention preferably comprises a primer set comprising a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 31 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 32; A primer set including a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 33 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 34; A primer set comprising a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 37 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 38; A primer set including a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 39 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 40; A primer set comprising a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 41 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 42; A primer set comprising a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 43 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 44; A primer set comprising a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 45 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 46; A primer set including a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 47 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 48; And it may include one set selected from the group consisting of a primer set including a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 49 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 50.
본 발명의 조성물은 더욱 바람직하게는, 서열번호 31의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 32의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 또는 서열번호 43의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 44의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 포함할 수 있다.More preferably, the composition of the present invention comprises a primer set comprising a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 31 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 32; Alternatively, a primer set including a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 43 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 44 may be included.
이러한 경우, 본 발명의 조성물은 상기 보다 바람직한 프라이머 세트를 포함함으로써, 양파의 웅성-임성 세포질형 및 Ms 유전자좌(locus)에 위치한 AcPMS1 유전자의 유전형(genotype) 판별용으로 사용될 수 있다. 양파의 웅성-임성 세포질형에 관한 구체적 내용은 상술한 바와 같고, AcPMS1 유전자는 양파의 웅성 임성회복((fertility restoration)을 통제하는 Ms 유전자좌(locus) 내 존재하는 14개의 유전자 중 하나로, 웅성 임성회복에 깊이 연관된 것으로 알려진 유전자로서, 하기 구체적 실시예에서 보다 구체적으로 언급하였다.In this case, the composition of the present invention may be used for determining the male-fertility cytoplasmic type of onion and the genotype of the AcPMS1 gene located at the Ms locus by including the more preferable primer set. The specific details of the male-fertility cytoplasmic type of onion are as described above, and the AcPMS1 gene is one of 14 genes present in the Ms locus that controls the male fertility restoration of onions. As a gene known to be deeply related to, it is more specifically mentioned in the following specific examples.
본 발명은 상기 조성물을 포함하는 양파의 웅성불임 판별용 키트를 제공한다.The present invention provides a kit for determining male sterility of onions comprising the composition.
본 발명의 키트는 상술한 프라이머 세트를 포함하고 있어, 양파의 웅성불임 여부, 양파의 웅성-임성 세포질형을 효과적으로 판별할 수 있으며, 상술한 바람직한 프라이머 세트를 포함하는 경우, 양파의 웅성불임 여부, 양파의 웅성-임성 세포질형 외에도, Ms 유전자좌(locus)에 위치한 AcPMS1 유전자의 유전형(genotype)의 판별 또한 가능하며, 구체적인 조성물 내 포함된 구성요소 및 기타 구체적 설명은 상술한 바와 같다.The kit of the present invention includes the above-described primer set, so that it is possible to effectively discriminate whether or not male sterility of onions and male-fertility cytoplasmic types of onions, and if the above-described preferred primer set is included, whether or not male sterility of onions, In addition to the male-fertility cytoplasmic type of onion, it is also possible to determine the genotype of the AcPMS1 gene located at the Ms locus, and the components included in the specific composition and other specific descriptions are as described above.
상기 키트는 본 발명의 프라이머 세트에 의해 특정되는 증폭 대상 부위의 증폭을 위해 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소 등을 포함하는 DNA 중합효소, Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 등을 추가적으로 더 포함할 수 있다.The kit includes a DNA polymerase containing a thermostable DNA polymerase, etc. that can be obtained from various bacterial species for amplification of the amplification target site specified by the primer set of the present invention, a cofactor such as Mg 2+ , dATP, dCTP, It may further include dGTP and dTTP.
또한, 상기 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.In addition, the kit may further include a user's guide describing the optimum reaction performance conditions. The guide is a printed matter explaining how to use the kit, for example, how to prepare a PCR buffer, and the reaction conditions presented. The guide includes a brochure in the form of a pamphlet or leaflet, a label affixed to the kit, and a description on the surface of the package containing the kit. In addition, the guide includes information disclosed or provided through electronic media such as the Internet.
본 발명은 상술한 조성물을 판별 대상 양파의 gDNA(genomic DNA)에 처리하여 증폭시키는 단계를 포함하는 양파의 웅성불임 판별방법을 제공한다.The present invention provides a method for determining male sterility of onions comprising the step of amplifying by processing the above-described composition on genomic DNA (gDNA) of an onion to be determined.
본 발명의 판별방법은 상술한 조성물을 이용하여 수행하는 것으로서, 판별 대상 양파의 웅성불임을 효과적으로 판별할 수 있다.The discrimination method of the present invention is performed using the above-described composition, and it is possible to effectively discriminate male sterility of the onion to be discriminated.
상기 판별 대상 양파의 gDNA 수득은 당업계 주지된 방법을 택하여 자유로이 수행할 수 있으며, 구체적인 수득방법은 하기 실시예에 제시하였다.The gDNA of the onion to be determined can be obtained freely by selecting a method well known in the art, and a specific method of obtaining it is presented in the following Examples.
상기 판별 대상 양파의 gDNA에 상술한 조성물을 처리하는 경우, 상기 조성물에 포함된 프라이머가 상기 gDNA에 상보적으로 결합하게 되고, 이로써 특정되는 증폭 대상 부위가 통상의 증폭 과정에 의해 증폭되어 증폭산물을 생성하게 된다. 이러한 증폭산물을 분석함에 따라 양파의 웅성불임, 양파의 웅성-임성 세포질형을 판별할 수 있고, 상술한 바람직한 프라이머 세트를 포함하는 조성물을 처리하는 경우, 양파의 웅성불임, 양파의 웅성-임성 세포질형 외에도, Ms 유전자좌(locus)에 위치한 AcPMS1 유전자의 유전형(genotype)의 판별 또한 가능하다.When the above-described composition is treated on the gDNA of the onion to be determined, the primers included in the composition are complementarily bound to the gDNA, whereby the specified amplification target site is amplified by a conventional amplification process to obtain an amplification product. Will be created. By analyzing these amplification products, it is possible to discriminate male sterility of onions and male-fertility cytoplasm of onions, and when treating a composition containing the above-described preferred primer set, male sterility of onions, male-fertility cytoplasm of onion In addition to the type, it is also possible to determine the genotype of the AcPMS1 gene located at the Ms locus.
상기 판별방법에 있어서, 구체적인 조성물 내 포함된 구성요소 및 기타 구체적 설명은 상술한 바와 같다.In the determination method, components included in the specific composition and other specific descriptions are as described above.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. Hereinafter, examples will be described in detail to illustrate the present invention in detail.
실험방법Experiment method
1. 작물, 총 게놈 DNA 추출1. Crop, total genomic DNA extraction
대한민국의 6개 기관에서 유지하고 관리한 243개의 육종 계통을 사용하여, 세포질 유형을 구분하기 위해 개발된 문자 마커의 신뢰성을 검증했다(표 1). 이러한 육종 라인의 총 게놈 DNA는 이전 연구(Kim, 2014)를 참조하여 분리되었고, Ms 유전자좌의 유전자형 분석을 위한 HRM(high resolution melting) 마커를 시험하기 위해, 남성 불임 육종 라인(506L)과 남성 가임 육종 라인(H6) 사이의 교차에서 유래한 F2:5 분리 개체군에서 96개를 무작위로 선택하였다. CTAB(cetyl trimethylammonium bromide) 방법을 사용하여, 모종의 잎 조직에서 총 게놈 DNA를 추출하였다.Using 243 breeding lines maintained and managed by 6 institutions in Korea, the reliability of the character markers developed to distinguish cytoplasmic types was verified (Table 1). The total genomic DNA of these breeding lines was isolated with reference to a previous study (Kim, 2014), and to test the high resolution melting (HRM) marker for genotyping of the Ms locus, male infertility breeding line (506L) and male fertility. 96 were randomly selected from the F 2:5 isolated population resulting from the intersection between the breeding lines (H6). Total genomic DNA was extracted from leaf tissues of seedlings using the CTAB (cetyl trimethylammonium bromide) method.
2. PCR 증폭, PCR 산물의 서열분석2. PCR amplification, sequence analysis of PCR products
5개의 mtDNA 기반 마커 분석을 위해, 0.05μg 주형, 1.0μL 10x PCR 완충액, 0.2μL 순방향 프라이머(10μM), 0.2μL 역방향 프라이머(10μM), 0.2μL dNTPs(각각 10mM) 및 0.25U Taq 폴리머라아제(Prime Tag DNA 중합 효소, GeNet Bio, 논산, 대한민국)를 포함하는 10μL 반응 혼합물에서 PCR 증폭을 수행하였다. 프라이머 서열은 하기 표 2에 나타내었다. PCR 증폭과정은 95℃에서 4분간 초기 변성단계; 30초 동안 95℃, 30초 동안 65℃(각 사이클마다 0.8℃씩 감소), 1분 동안 72℃, 10 사이클; 30초 동안 95℃, 30초 동안 57℃, 1분 동안 72℃, 35 사이클; 72℃에서 마지막 10분간 연장 단계로 구성되었다. PCR 생성물을 EtBr 염색 후, 1.5% 아가로오스 겔 상에서 시각화하였다. 절단되어 증폭된 다형성 서열(cleaved amplified polymorphic sequence; CAPS) 마커의 경우, PCR 생성물을 37℃에서 DraI 제한효소로 1시간 동안 분해하고, EtBr 염색 후, 1.5% 아가로오스 겔 상에서 시각화하였다. For the analysis of five mtDNA-based markers, 0.05 μg template, 1.0 μL 10x PCR buffer, 0.2 μL forward primer (10 μM), 0.2 μL reverse primer (10 μM), 0.2 μL dNTPs (10 mM each) and 0.25 U Taq polymerase ( PCR amplification was performed in a 10 μL reaction mixture containing Prime Tag DNA polymerase, GeNet Bio, Nonsan, Korea. The primer sequences are shown in Table 2 below. The PCR amplification process is an initial denaturation step at 95°C for 4 minutes; 95°C for 30 seconds, 65°C for 30 seconds (decrease by 0.8°C for each cycle), 72°C for 1 minute, 10 cycles; 95°C for 30 seconds, 57°C for 30 seconds, 72°C for 1 minute, 35 cycles; It consisted of an extension step for the last 10 minutes at 72°C. The PCR product was visualized on a 1.5% agarose gel after EtBr staining. In the case of a cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) marker, the PCR product was digested with DraI restriction enzyme at 37° C. for 1 hour, stained with EtBr, and visualized on a 1.5% agarose gel.
AcPMS1 대립 유전자의 전체 길이 게놈 DNA 서열을 얻기 위해, 0.05μg 주형, 2.5μL 10x PCR 완충액, 0.2μL 순방향 프라이머(10μM), 0.2μL 역방향 프라이머(10μM), 0.2μL dNTPs(각각 10mM) 및 0.25μL 폴리머라아제 믹스(Advantage 2 Polymerase Mix; Clontech, Palo Alto, CA, USA)를 포함하는 25μL 반응 혼합물에서 PCR 증폭을 수행하였다. 열사이클링(Thermocycling) 조건은 mtDNA 기반 마커 분석에 사용된 조건과 동일하다. 서열분석(Sequencing)을 위해, PCR 생성물을 QIAquick PCR 정제 키트(QIAGEN, Valencia, CA, USA)를 사용하여 정제 하였다. PCR 산물의 서열분석은 전문 회사(Macrogen, Seoul, Korea)가 수행했다.To obtain the full-length genomic DNA sequence of the AcPMS1 allele, 0.05 μg template, 2.5 μL 10x PCR buffer, 0.2 μL forward primer (10 μM), 0.2 μL reverse primer (10 μM), 0.2 μL dNTPs (10 mM each) and 0.25 μL polymer. PCR amplification was performed in a 25 μL reaction mixture containing a lase mix (
또한, 긴 PCR 증폭은 AcPMS1의 대형 인트론을 얻기 위해 수행되었다. 긴 PCR 증폭은 0.25μg 주형, 5μL 10x PCR 완충액, 0.2μM 순방향 프라이머, 0.2μM 역방향 프라이머, 0.2mM dNTPs 및 0.5μL Taq 폴리머라아제(TaKaRa LA PCRTM Kit Ver. 2.1; Takara Bio, Shiga, Japan)를 포함하는 50μL 혼합물에서 수행되었다. 긴 PCR 증폭 조건은 98℃에서 10초, 68℃에서 15분, 40 사이클로 구성되었다.In addition, long PCR amplification was performed to obtain large introns of AcPMS1. Long PCR amplification was performed with 0.25 μg template, 5 μL 10x PCR buffer, 0.2 μM forward primer, 0.2 μM reverse primer, 0.2 mM dNTPs and 0.5 μL Taq polymerase (TaKaRa LA PCRTM Kit Ver. 2.1; Takara Bio, Shiga, Japan). It was carried out in a 50 μL mixture containing. Long PCR amplification conditions consisted of 10 seconds at 98°C, 15 minutes at 68°C, and 40 cycles.
(서열번호 1)M1-F1
(SEQ ID NO: 1)
(서열번호 2)M1-F2
(SEQ ID NO: 2)
(서열번호 3)M1-R1
(SEQ ID NO: 3)
(서열번호 4)M2-F1
(SEQ ID NO: 4)
(서열번호 6)M2-R1
(SEQ ID NO: 6)
(서열번호 7)M3-F1
(SEQ ID NO: 7)
(서열번호 9)M3-R2
(SEQ ID NO: 9)
(서열번호 10)M4-F1
(SEQ ID NO: 10)
(서열번호 12)M4-R2
(SEQ ID NO: 12)
(서열번호 13)M5-F1
(SEQ ID NO: 13)
(서열번호 15)M5-R1
(SEQ ID NO: 15)
(서열번호 16)CAPS-F1
(SEQ ID NO: 16)
(서열번호 17)CAPS-R1
(SEQ ID NO: 17)
(서열번호 18)Cy-HRM1-F1
(SEQ ID NO: 18)
(서열번호 19)Cy-HRM1-R1
(SEQ ID NO: 19)
(서열번호 20)Cy-HRM2-F1
(SEQ ID NO: 20)
(서열번호 21)Cy-HRM2-R1
(SEQ ID NO: 21)
(서열번호 23)Cy-F1
(SEQ ID NO: 23)
(서열번호 24)Cy-R1
(SEQ ID NO: 24)
(서열번호 26)RT-Com-F
(SEQ ID NO: 26)
(F:Forward, R:Reverse)Real-time quantitative PCR
(F:Forward, R:Reverse)
(서열번호 27)RT-cox1-R
(SEQ ID NO: 27)
(서열번호 31)Rf-HRM1-F
(SEQ ID NO: 31)
(서열번호 32)Rf-HRM1-R
(SEQ ID NO: 32)
3. HRM 분석, 실시간 정량 PCR 증폭3. HRM analysis, real-time quantitative PCR amplification
HRM 분석은 0.05μg 주형, 2.0μL 10x PCR 완충액, 1.0μL 순방향 프라이머(10μM), 1.0μL 역방향 프라이머(10μM), 1.0μL dNTPs(각각 10mM), 0.25U Taq 폴리머라아제(Prime Tag DNA 중합 효소, GeNet Bio, 논산, 대한민국) 및 100배 희석된 SYTO®9 녹색 형광 핵산 염색물질 1.0μL를 포함하는 20μL 반응 혼합물에서 수행되었다. 프라이머 서열은 상기 표 2에 나타내었다.HRM analysis was performed using 0.05 μg template, 2.0 μL 10x PCR buffer, 1.0 μL forward primer (10 μM), 1.0 μL reverse primer (10 μM), 1.0 μL dNTPs (10 mM each), 0.25 U Taq polymerase (Prime Tag DNA polymerase, GeNet Bio, Nonsan, Republic of Korea) and a 20 μL reaction mixture containing 1.0 μL of 100-fold diluted
먼저, PCR 증폭과정은 95℃에서 10분간 초기 변성단계; 10초 동안 95℃, 5초 동안 60℃, 5초 동안 72℃, 45 사이클로 구성되었다. 다음으로, PCR 생성물을 4.4℃/s의 속도로 95℃로 승온시켰고, 2.2℃/s의 속도로 40℃로 감온했으며, 2.2℃/s의 속도로 65℃로 다시 승온시켰다. HRM 곡선은 0.07℃/s의 속도로 65℃에서 97℃로 용융시켜 LightCycler® 96 시스템(Roche Molecular Systems, Pleasanton, CA, USA)으로 얻었다.First, the PCR amplification process is an initial denaturation step at 95° C. for 10 minutes; 95°C for 10 seconds, 60°C for 5 seconds, 72°C for 5 seconds, 45 cycles. Next, the PCR product was heated to 95°C at a rate of 4.4°C/s, reduced temperature to 40°C at a rate of 2.2°C/s, and heated again to 65°C at a rate of 2.2°C/s. HRM curves were obtained with a LightCycler ® 96 system (Roche Molecular Systems, Pleasanton, CA, USA) by melting from 65°C to 97°C at a rate of 0.07°C/s.
cox1 및 orf725의 상대적인 사본 수를 측정하기 위해, SYBR® Green Realtime PCR Master Mix(Toyobo Co., Osaka, Japan) 및 LightCycler® 96 시스템(Roche Molecular Systems)을 사용하여, 3개의 생물학적 복제본이 포함된 제조사의 지시에 따라, 실시간 정량 PCR 증폭을 수행했다. 미토콘드리아 유전자인 nad6가 내부 통제로 사용되었다. 이 유전자는 정상, CMS-T 및 CMS-S 미토콘드리아 게놈 중, 가장 큰 신테니 블록(syntenic block)에 위치한다. 실시간 정량 PCR에 사용된 프라이머 서열은 상기 표 2에 나타내었다.To determine the relative copy number of cox1 and orf725, a manufacturer containing three biological copies, using SYBR ® Green Realtime PCR Master Mix (Toyobo Co., Osaka, Japan) and LightCycler ® 96 system (Roche Molecular Systems). According to the instructions of, real-time quantitative PCR amplification was performed. The mitochondrial gene nad6 was used as an internal control. This gene is located in the largest syntenic block of the normal, CMS-T and CMS-S mitochondrial genomes. The primer sequences used for real-time quantitative PCR are shown in Table 2 above.
실험결과Experiment result
1. 양파의 정상 및 CMS 유도 세포질을 구별하기 위한 CMS-T 세포질 변이체의 확인 및 분자 마커 개발1. Identification of CMS-T cytoplasmic variants and development of molecular markers to distinguish normal and CMS-induced cytoplasm of onion
이전 연구들에 따르면, CMS-S, CMS-T 및 정상 세포질의 완전 미토콘드리아 게놈 서열의 집합을 보고했다. 정상 세포질과 비교하여, CMS-S 미토콘드리아 게놈은 고도로 재배열되었고, 499개의 SNP 또는 InDel이 확인되었다. 대조적으로, CMS-T 미토콘드리아 게놈의 구성은 양파의 CMS에 대한 캐주얼 유전자(casual gene)인 orf725를 제외하고는 정상적인 세포질과 거의 동일하다. Orf725를 제외한 후, 정상 및 CMS-T 미토콘드리아 게놈 서열 사이에는 단지 3개의 SNP가 발견되었다. 이러한 SNP들을 포함하는 신테닉 영역(syntenic region)은 CMS-S mtDNA 서열에서 식별되었다(도 1). CMS-S의 nad5의 5' 상류 영역에서의 SNP 유전자형은 CMS-T 세포질의 것과 동일하였다. 한편, CMS-S 미토콘드리아 게놈에서는 nad1의 5' 상류 영역에 2개의 연속적인 SNP를 포함하는 영역과, 합성된 2개의 131bp 염기서열이 발견되었다. 두 신테닉 영역에서 이러한 SNP 유전자형은 정상적인 세포질의 유전자형과 동일했다(도 1).According to previous studies, a set of CMS-S, CMS-T and normal cytoplasmic complete mitochondrial genomic sequences has been reported. Compared to the normal cytoplasm, the CMS-S mitochondrial genome was highly rearranged and 499 SNPs or InDels were identified. In contrast, the composition of the CMS-T mitochondrial genome is nearly identical to that of the normal cytoplasm, except for orf725, a casual gene for CMS in onion. After excluding Orf725, only 3 SNPs were found between the normal and CMS-T mitochondrial genomic sequences. Syntenic regions containing these SNPs were identified in the CMS-S mtDNA sequence (Fig. 1). The SNP genotype in the 5'upstream region of nad5 of CMS-S was the same as that of CMS-T cytoplasm. On the other hand, in the CMS-S mitochondrial genome, a region containing two consecutive SNPs in the 5'upstream region of nad1 and two synthesized 131 bp nucleotide sequences were found. In both synthenic regions, these SNP genotypes were identical to those of normal cytoplasm (Fig. 1).
nad5의 5' 상류 영역에 존재하는 SNP 유전자형은 정상 및 2개의 CMS 유도 세포질 사이에서 다르기 때문에, 이 SNP는 정상 및 CMS 유도 세포질을 구별하기 위한 CAPS 및 HRM 마커를 개발하는데 사용되었다. 정상 및 CMS 유도 세포질은 DraI 제한효소(도 6A) 및 HRM 마커(도 6B)로 소화된 PCR 산물을 바탕으로 명확하게 구별할 수 있었다. 그러나, 243개의 다양한 육종 계통을 분석한 결과, CMS-T 세포질을 포함한 4개의 개체군은 SNP의 'G' 대립유전자를 가지고 있는 반면, CMS-T를 갖는 149개의 다른 개체군은 'T' 대립유전자를 가지고 있었다(표 3).Since the SNP genotype present in the 5'upstream region of nad5 differs between the normal and the two CMS induced cytoplasms, this SNP was used to develop CAPS and HRM markers to differentiate between normal and CMS induced cytoplasm. The normal and CMS-induced cytoplasm could be clearly distinguished based on the PCR products digested with DraI restriction enzyme (Fig. 6A) and HRM marker (Fig. 6B). However, as a result of analyzing 243 different breeding lines, 4 populations including the CMS-T cytoplasm had the'G' allele of SNP, while 149 other populations with CMS-T had the'T' allele. Had (Table 3).
이 4개의 육종 계통의 세포질 유형을 확인하기 위해, orf725 기반 마커를 사용하여 분석하였다. CMS-T를 함유한 대부분의 수용체(accession)와 마찬가지로, PCR 산물은 cox1 및 orf725 모두로부터 증폭되었다. 그러나, orf725로부터 증폭된 PCR 밴드의 강도는 SNP의 'T' 대립유전자를 함유한 CMS-T 수용체에서의 강도보다 약했다(도 2A). orf725 및 cox1 유전자의 상대 사본 수는 실시간 정량 PCR을 사용하여 추정하였는데, 그 결과에 따르면, 'G' 대립유전자를 함유한 수용체에서의 orf725의 상대적 사본 수는 'T' 대립유전자를 함유한 수용체에서의 절반보다 적었다(도 2B). To identify the cytoplasmic types of these four sarcoma lineages, orf725 based markers were used to analyze. Like most receptors containing CMS-T, PCR products were amplified from both cox1 and orf725. However, the intensity of the PCR band amplified from orf725 was weaker than that in the CMS-T receptor containing the'T' allele of SNP (Fig. 2A). The relative number of copies of the orf725 and cox1 genes was estimated using real-time quantitative PCR. According to the results, the relative number of copies of orf725 in the receptor containing the'G' allele was estimated in the receptor containing the'T' allele. It was less than half of (Fig. 2B).
이러한 'G' 대립유전자를 함유한 수용체의 다른 세포질과의 유사성을 평가하기 위해, 정상 및 CMS-S 미토콘드리아 게놈 사이의 10개 미분 영역을 표지하는 5개의 분자 마커가 개발되었다(도 3A). 결과는 이들 4가지 수용체에서 5가지 분자 마커의 PCR 증폭 패턴이 정상 및 CMS-T의 그것과 동일함을 보여주었고(도 3B), 이 4가지 'G' 대립유전자를 함유한 수용체의 미토콘드리아 게놈 구성이 정상 또는 CMS-T 세포질과 유사함을 암시하였다. 또한, 다른 연구에서 개발된 3개의 분자 마커의 PCR 증폭 패턴은 정상 또는 CMS-T의 그것들과 동일했다(도 7).In order to evaluate the similarity of receptors containing this'G' allele with other cytoplasms, five molecular markers were developed that mark the ten differential regions between the normal and CMS-S mitochondrial genomes (Fig. 3A). The results showed that the PCR amplification pattern of the five molecular markers in these four receptors is the same as that of normal and CMS-T (Fig. 3B), and the mitochondrial genome composition of the receptors containing these four'G' alleles It was implied that it was similar to normal or CMS-T cytoplasm. In addition, the PCR amplification patterns of the three molecular markers developed in other studies were the same as those of normal or CMS-T (Fig. 7).
모든 CMS 세포질이 nad5의 5' 상류의 SNP에 기초하여 설계된 마커를 사용하여 구별될 수 없기 때문에, Cy-HRM2로 지칭된 다른 HRM 마커가 하나의 공통 프라이머(Cy-HRM2-F1) 및 cox1과 orf725 각각에 결합하는 2개의 특이적 프라이머(Cy-HRM2-R1 및 Cy-HRM2-R2)의 조합을 이용하여 개발되었다(도 4A, 4B). 정상 세포질의 표준화된 용융 피크는 CMS 세포질과 명확하게 구분되었다(도 4C). CMS-S와 CMS-T의 용융 피크가 서로 명확하게 분리되지는 않았지만, SNP의 'G'와 'T' 대립유전자를 포함하는 CMS-T 변이형은 'G'와 'T' 대립유전자를 포함하는 수용체간 orf725의 서로 다른 화학양론을 반영하는 독특한 용융 피크를 보였다(도 4C). Since all CMS cytoplasm cannot be distinguished using a marker designed based on the SNP 5'upstream of nad5, another HRM marker, referred to as Cy-HRM2, has one common primer (Cy-HRM2-F1) and cox1 and orf725 It was developed using a combination of two specific primers (Cy-HRM2-R1 and Cy-HRM2-R2) that bind to each (Fig. 4A, 4B). The normalized melting peak of the normal cytoplasm was clearly distinguished from the CMS cytoplasm (Fig. 4C). Although the melting peaks of CMS-S and CMS-T are not clearly separated from each other, the CMS-T variant containing the'G' and'T' alleles of SNP contains the'G' and'T' alleles. It showed a unique melting peak reflecting the different stoichiometry of orf725 between the receptors (Fig. 4C).
2. 양파의 Ms 유전자좌의 유전형 분석을 위한 최적 HRM 마커의 개발2. Development of Optimal HRM Markers for Genotyping of Ms Locus in Onion
Ms 유전자좌와 연계 불균형을 보이는 14개의 유전자가 이전의 연구에서 밝혀졌는데, 14개의 유전자 중 하나인 AcPMS1으로 명명된 유전자가 웅성 생식력 회복을 위한 캐주얼 유전자(casual gene)로 제안되었다. InDel 마커는 이전 연구에서 AcPMS1 대립유전자의 부분 서열에 기초하여 개발되었다. 최적의 HRM 마커를 개발하기 위해, AcPMS1의 전체 길이 게놈 DNA 서열을 동형접합성(homozygous) 우성과 열성 대립유전자로부터 얻었다. 동형접합성 우성 및 열성 개인으로부터 12 엑손으로 구성된 약 15kb의 전체 길이 DNA 서열을 조립하였다. 2개의 AcPMS1 대립유전자는 94.4%의 염기 서열 동일성을 보였다. 그들 사이에 800개 이상의 SNP 또는 InDel이 있었다. 2개의 인트론에서 50 염기쌍보다 큰 3개의 InDel이 확인되었다(도 5A). 동형접합성 우성 및 열성 대립유전자의 전체 길이 뉴클레오티드 서열은 GenBank에서 MK780036 및 MK780037의 수탁번호 하에 기탁되었다. 14 genes showing linkage imbalance with the Ms locus were identified in previous studies, and one of the 14 genes, named AcPMS1, was proposed as a casual gene for recovery of male fertility. InDel markers were developed based on the partial sequence of the AcPMS1 allele in previous studies. In order to develop the optimal HRM marker, the full length genomic DNA sequence of AcPMS1 was obtained from the homozygous dominant and recessive alleles. A full length DNA sequence of approximately 15 kb consisting of 12 exons was assembled from homozygous dominant and recessive individuals. The two AcPMS1 alleles showed 94.4% nucleotide sequence identity. There were more than 800 SNPs or InDels between them. Three InDels larger than 50 base pairs were identified in two introns (FIG. 5A). The full length nucleotide sequences of the homozygous dominant and recessive alleles were deposited under the accession numbers of MK780036 and MK780037 in GenBank.
최적의 HRM 마커를 개발하기 위해, 전체 길이 AcPMS1 서열 전체에 걸쳐 총 10개의 프라이머 조합을 설계했다(도 5A). 각 HRM 마커는 웅성불임 및 동형접합성 우성 웅성불임 모계 라인의 교배로부터 유래된 96 F2:5 작물로부터 추출한 게놈 DNA를 이용하여 테스트하였다. 결과는 9가지 프라이머 조합이 3개의 유전자형을 구별할 수 있는 용융 피크 패턴을 나타냄을 보였다(도 8). 그 중, Rf-HRM1 및 Rf-HRM7 마커의 정상적인 용융 피크 및 곡선 패턴에서 3가지 유전자형이 더 명확하게 분리되었고, 동일한 유전자형 내에서의 변이가 상대적으로 적었다(도 5B). 또한, 독립적인 반응과 실험자 사이에서 두 마커의 재현성은 다른 분자 마커에 비해 높았다.To develop the optimal HRM marker, a total of 10 primer combinations were designed across the entire length AcPMS1 sequence (Figure 5A). Each HRM marker was tested using genomic DNA extracted from 96 F 2:5 crops derived from crosses of male infertility and homozygous dominant male sterile maternal lines. The results showed that the nine primer combinations exhibited a melting peak pattern capable of distinguishing the three genotypes (FIG. 8). Among them, three genotypes were more clearly separated from the normal melting peaks and curve patterns of the Rf-HRM1 and Rf-HRM7 markers, and there were relatively few variations within the same genotype (FIG. 5B). In addition, the independent response and the reproducibility of the two markers between experimenters were higher than that of other molecular markers.
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Composition for determining male-sterility of onion <130> 19P05028 <160> 50 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 1 <400> 1 attaattcag gccgatgttc cgcctat 27 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 2 <400> 2 cacttagaag cgaacccgga gaactga 27 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 3 <400> 3 agaagctatg aggtgctcca cgggact 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 4 <400> 4 tctatccgca gggcactgag cttattc 27 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 5 <400> 5 tgttgtgtgg ttgaaggccc tttttatt 28 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 6 <400> 6 tgatgtggag gggaagatct gcttatg 27 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 7 <400> 7 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cataaagaca ttt 23 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 40 <400> 40 gcataagcta aaaggctcca 20 <210> 41 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 41 <400> 41 gaaggttgtt aatggtgatg aaa 23 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 42 <400> 42 caaacaaatc ctttgatggt ga 22 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 43 <400> 43 cctattcaat ccctggacat tt 22 <210> 44 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 44 <400> 44 gagtttgaag ggctatcttt acttg 25 <210> 45 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 45 <400> 45 tttgcattta ctggtatcag gtt 23 <210> 46 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 46 <400> 46 tgataaaacc aagattgaac tgc 23 <210> 47 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 47 <400> 47 aatttacgtt tgactgcatg att 23 <210> 48 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 48 <400> 48 aattgcatat atacacaaac tcgaa 25 <210> 49 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 49 <400> 49 ccattttgca tagtaaattc atcc 24 <210> 50 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 50 <400> 50 aattgagatc acagcataga aactaa 26 <110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Composition for determining male-sterility of onion <130> 19P05028 <160> 50 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 1 <400> 1 attaattcag gccgatgttc cgcctat 27 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 2 <400> 2 cacttagaag cgaacccgga gaactga 27 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 3 <400> 3 agaagctatg aggtgctcca cgggact 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 4 <400> 4 tctatccgca gggcactgag cttattc 27 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 5 <400> 5 tgttgtgtgg ttgaaggccc tttttatt 28 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 6 <400> 6 tgatgtggag gggaagatct gcttatg 27 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 7 <400> 7 ctatgggaaa ccggggattt gacttgt 27 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 8 <400> 8 cagtaggtct gccatgggca tttgata 27 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 9 <400> 9 gacttggagg tggcgaacaa gttcctat 28 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 10 <400> 10 taacgagcat cgataagctg tcgcaag 27 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 11 <400> 11 tcatagggct tccccatatc actctgc 27 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 12 <400> 12 ccgggcgatc atacaactac tcagaaa 27 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 13 <400> 13 ttatggaaca gccctaatgt tgtgttgg 28 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 14 <400> 14 tcgcatcagt ggaatcctat tctctgc 27 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 15 <400> 15 cggcttacga aaaggtaagc ggttagg 27 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 16 <400> 16 ctcattgccc caatcttccc tgtaggc 27 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 17 <400> 17 actctcattt tgttgggcac ggcgatg 27 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 18 <400> 18 aacaatcatc aaaggcgatt 20 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 19 <400> 19 tcacgagccc tttcttttt 19 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 20 <400> 20 agctatcaaa gagacgaaaa gc 22 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 21 <400> 21 cgcgaccttt tcttctttta 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 22 <400> 22 gtgcaatccc cgatacattc 20 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 23 <400> 23 cagatgctta cgccggatgg aa 22 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 24 <400> 24 ccgttccgaa ggcgaataaa aatttgg 27 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 25 <400> 25 aatcctagtg tccggggttt ct 22 <210> 26 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 26 <400> 26 tggagaactt ccagctatca aagagacga 29 <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 27 <400> 27 tccgtttgat ccaaccattc attctga 27 <210> 28 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 28 <400> 28 ggactcgtgc aatccccgat acattc 26 <210> 29 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 29 <400> 29 ggtgaaaaga caggatgtat tccgacga 28 <210> 30 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 30 <400> 30 gtgagcgaga tgtcgatttg gtctgtc 27 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 31 <400> 31 gcgaagaata ttttaaggtt gtcg 24 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 32 <400> 32 caggagagat accagaccca tt 22 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 33 <400> 33 ttgcatttcg ttgatttata gc 22 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 34 <400> 34 gcatacgagt ttgcaatacg a 21 <210> 35 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 35 <400> 35 gcatgccatt tagacatatt tgg 23 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 36 <400> 36 aaatccataa atgcaaaaca tga 23 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 37 <400> 37 cactctgggt cagtaaaatc tgaa 24 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 38 <400> 38 ccaatttgac gagcaatctt t 21 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 39 <400> 39 ccgtatttgg cataaagaca ttt 23 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 40 <400> 40 gcataagcta aaaggctcca 20 <210> 41 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 41 <400> 41 gaaggttgtt aatggtgatg aaa 23 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 42 <400> 42 caaacaaatc ctttgatggt ga 22 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 43 <400> 43 cctattcaat ccctggacat tt 22 <210> 44 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 44 <400> 44 gagtttgaag ggctatcttt acttg 25 <210> 45 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 45 <400> 45 tttgcattta ctggtatcag gtt 23 <210> 46 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 46 <400> 46 tgataaaacc aagattgaac tgc 23 <210> 47 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 47 <400> 47 aatttacgtt tgactgcatg att 23 <210> 48 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 48 <400> 48 aattgcatat atacacaaac tcgaa 25 <210> 49 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 49 <400> 49 ccattttgca tagtaaattc atcc 24 <210> 50 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence 50 <400> 50 aattgagatc acagcataga aactaa 26
Claims (12)
A composition for determining male-sterility of onions comprising; a primer set including a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 43 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 44.
서열번호 20의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 21의 서열로 이루어진 역방향 프라이머 및 서열번호 22의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;
서열번호 31의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 32의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;
서열번호 33의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 34의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;
서열번호 37의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 38의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;
서열번호 39의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 40의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;
서열번호 41의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 42의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;
서열번호 45의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 46의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;
서열번호 47의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 48의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 및
서열번호 49의 서열로 이루어진 순방향 프라이머 및 서열번호 50의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 하나의 세트를 더 포함하는 조성물.
The method according to claim 1,
A primer set comprising a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 20, a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 21, and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 22;
A primer set comprising a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 31 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 32;
A primer set including a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 33 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 34;
A primer set comprising a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 37 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 38;
A primer set including a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 39 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 40;
A primer set comprising a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 41 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 42;
A primer set comprising a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 45 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 46;
A primer set including a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 47 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 48; And
A composition further comprising one set selected from the group consisting of a primer set including a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 49 and a reverse primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 50.
The composition of claim 1 or 2, wherein the primer is for High Resolution Melt (HRM) analysis.
The composition according to claim 1 or 2, wherein the composition is for determining the male-fertility cytoplasmic type of onion.
The composition of claim 5, wherein the cytoplasmic type is male fertility, cytoplasmic male sterility S (CMS-S), or cytoplasmic male sterility T (CMS-T).
The composition according to claim 2, wherein the composition is for determining the genotype of the AcPMS1 gene located at the male-pregnant cytoplasmic type of onion and the Ms locus.
The composition of claim 7, wherein the cytoplasmic type is male-fertile, CMS-S or CMS-T.
A kit for determining male sterility of onions comprising the composition of claim 1 or 2.
The method according to claim 9, wherein the kit is a kit for determining the male-fertility cytoplasmic type of onion.
A method for determining male sterility of onions comprising the step of amplifying the composition of claim 1 or 2 by treating it with gDNA (genomic DNA) of the onion to be determined.
The method of claim 11, further comprising the step of analyzing the amplified product to determine the male-fertility cytoplasmic type of onion.
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