KR102157421B1

KR102157421B1 - Composition for preventing or treating brain damage comprising gintonin

Info

Publication number: KR102157421B1
Application number: KR1020180113511A
Authority: KR
Inventors: 나승열; 최선혜
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2018-09-21
Filing date: 2018-09-21
Publication date: 2020-09-17
Also published as: KR20200034149A

Abstract

본 발명은 진토닌(Gintonin)을 유효성분으로 포함하는 뇌손상 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 상기 진토닌은 뇌성상세포의 글리코젠분해(astrocytic glycogenolysis)를 촉진시켜 뇌성상세포 내에서 ATP의 생산 및 글루타메이트의 흡수를 증가시키고, 저산소 및 재산소화 스트레스로부터 뇌성상세포를 보호함으로써 뇌손상 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. The present invention relates to a composition for preventing or treating brain injury diseases comprising gintonin as an active ingredient, wherein gintonin promotes astrocytic glycogenolysis of cerebral astrocytes to By increasing the production of ATP and absorption of glutamate, and protecting cerebral astrocytes from hypoxia and reoxygenation stress, it can be usefully used in the prevention or treatment of brain injury diseases.

Description

Composition for preventing or treating brain damage comprising gintonin {Composition for preventing or treating brain damage comprising gintonin}

본 발명은 진토닌을 유효성분으로 포함하는 뇌손상 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a composition for preventing or treating brain injury diseases comprising gintonin as an active ingredient.

뇌손상은 뇌가 제 기능을 하지 못하는 상태를 의미하는 것으로서, 산소 결핍이나 뇌에 대한 직접적인 타격으로 인해 일어날 수 있다. 뇌손상은 개방성 두부 손상, 폐쇄성 두부 손상, 감속손상, 독성 물질의 노출, 산소 부족, 종양, 감염, 뇌졸중과 같은 수많은 질병으로 발생할 수 있다. 뇌손상 질환 중에는 저산소성 뇌손상, 허혈성 뇌질환, 뇌졸중 또는 뇌허혈 등이 포함될 수 있고, 상기 허혈성 뇌질환은 뇌경색이라고도 하며, 혈전증, 색전증, 일과성 허혈발작, 백질이상증 또는 소경색 등으로 세분될 수 있다. 상기 뇌허혈은 세포 내로 칼슘의 과다유입이나 프리 라디칼(free radical) 관련 신경세포 손상 및 글루타메이트-수용체 매개 신경세포 손상이라고 알려져 있다. 즉, 뇌허혈이 발생하면 신경세포의 탈분극이 일어나고, 시냅스의 글루타메이트가 유리되어 세포 외 글루타메이트의 농도가 증가한다. 또한, ATP(Adenosine Triphosphate)의 감소로 인해 발생하는 능동수송의 역전은 세포 외 글루타메이트의 축적을 가속시킨다. Brain damage refers to a condition in which the brain is not functioning properly, and can occur due to lack of oxygen or a direct blow to the brain. Brain injury can result from a number of diseases such as open head injury, obstructive head injury, slowed injury, exposure to toxic substances, lack of oxygen, tumors, infections, and stroke. Brain injury diseases may include hypoxic brain injury, ischemic brain disease, stroke or cerebral ischemia, and the ischemic brain disease is also referred to as cerebral infarction, and may be subdivided into thrombosis, embolism, transient ischemic attack, leukoplasm or small infarction. . The brain ischemia is known as excessive inflow of calcium into cells, free radical related neuronal damage, and glutamate-receptor mediated neuronal damage. In other words, when cerebral ischemia occurs, depolarization of nerve cells occurs, and glutamate in synapses is released, thereby increasing the concentration of extracellular glutamate. In addition, reversal of active transport caused by a decrease in ATP (Adenosine Triphosphate) accelerates the accumulation of extracellular glutamate.

뇌성상세포 (astrocytes)는 뇌에서 가장 많은 세포로서 정상 또는 비정상 조건에서 다양한 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다 (Trends Mol Med 13(2): 54-63. 2007). 다른 뇌세포에 비해, 뇌성상세포의 독득한 특성은 글리코젠(glycogen)을 저장할 수 있다는 것으로서, 이러한 글리코젠은 뇌의 에너지 대사에 쓰일 수 있고, 인지 과정과 같은 고도의 뇌기능을 수행하는 동안 (Front Integr Neurosci 9:70, 2016) 및 저산소증과 같은 병리 생리학적 조건 동안 (Neurosci Lett 637:18-25, 2015) 뉴런을 도와주는데 사용될 수 있다고 보고되고 있다. 뇌성상세포-뉴런의 젖산 셔틀 (astrocyte-neuron lactate shuttle)에 대한 가설에 따르면, 뇌성상세포는 글리코젠을 젖산으로 대사 작용을 하고, 젖산은 산화적 대사를 위해 뉴런으로 흡수되는 것이다 (Dev Neurosci 20(4-5):291-299, 1998). 그러므로, 뇌성상세포의 글리코젠의 주요 기능은 정상 조건 및 저산소증, 허혈 및 저혈당과 같이 혈관을 통한 뇌(brain)로의 포도당 공급이 손상되는 비정상 조건에서 에너지 저장소로서 역할을 하는 것으로 볼 수 있다 (Nature Neuroscience 10(11):1377 - 1386, 2007). Cerebral astrocytes are the most numerous cells in the brain and are known to perform various functions under normal or abnormal conditions (Trends Mol Med 13(2): 54-63. 2007). Compared to other brain cells, the unique characteristic of cerebral astrocytes is that they can store glycogen. These glycogens can be used for energy metabolism in the brain, while performing high-level brain functions such as cognitive processes. (Front Integr Neurosci 9:70, 2016) and during pathophysiological conditions such as hypoxia (Neurosci Lett 637:18-25, 2015) it has been reported that it can be used to aid neurons. According to the hypothesis of the astrocyte-neuron lactate shuttle, cerebral astrocytes metabolize glycogen to lactic acid, and lactic acid is absorbed into neurons for oxidative metabolism (Dev Neurosci). 20(4-5):291-299, 1998). Therefore, the main function of glycogen in cerebral astrocytes can be seen as acting as an energy store in normal conditions and abnormal conditions in which glucose supply to the brain through blood vessels is impaired, such as hypoxia, ischemia and hypoglycemia (Nature Neuroscience 10(11):1377-1386, 2007).

진토닌(Gintonin)은 사포닌이 제거된 인삼(Panax ginseng) 유래의 G 단백질-연결 LPA 수용체 (G protein-couple LPA receptor)에 대한 외인성의 리간드(ligand)로서 인삼 메이저 라텍스-유사 단백질 151 및 지질의 복합체로 이루어져 있고, 주요 활성 성분은 LPA C_18:2(lysophosphatidic acid 18:2)이다 (Acta Crystallogr D Biol Crystallogr D 71:1039-1050, 2015). 진토닌은 신경계에서 in vitro 및 in vivo 효과를 유도하기 위해 G 단백질-연결 LPA 수용체 신호전달경로를 사용한다고 알려져 있다 (Neurochem Res. 25(5):573-82, 2000). Gintonin is an exogenous ligand for the G protein-couple LPA receptor derived from Panax ginseng from which saponin has been removed, and contains major latex-like proteins 151 and lipids in ginseng. It consists of a complex, and the main active ingredient is LPA C _18:2 (lysophosphatidic acid 18:2) (Acta Crystallogr D Biol Crystallogr D 71:1039-1050, 2015). Gintonin is known to use the G protein-linked LPA receptor signaling pathway to induce in vitro and in vivo effects in the nervous system (Neurochem Res. 25(5):573-82, 2000).

한국공개특허 재10-2011-0005144호Korean Patent Publication No. 10-2011-0005144

본 발명의 목적은 진토닌(Gintonin)을 유효성분으로 포함하는 뇌손상 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다. It is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating brain injury diseases comprising gintonin as an active ingredient.

본 발명의 또 다른 목적은 진토닌(Gintonin)을 유효성분으로 포함하는 뇌손상 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a food composition for preventing or improving brain damage diseases comprising gintonin as an active ingredient.

본 발명의 또 다른 목적은 약학적으로 유효한 양의 진토닌(Gintonin)을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌손상 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating brain injury diseases comprising administering a pharmaceutically effective amount of gintonin to an individual other than humans.

본 발명의 또 다른 목적은 진토닌(Gintonin)을 유효성분으로 포함하는 뇌성상세포(astrocyte) 보호용 조성물을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a composition for protecting cerebral astrocytes (astrocyte) comprising gintonin as an active ingredient.

본 발명의 또 다른 목적은 시험관 내에서 진토닌(Gintonin)을 뇌성상세포(astrocyte)에 처리하는 단계를 포함하는 뇌성상세포의 글리코젠분해(astrocytic glycogenolysis)를 촉진시키는 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a method of promoting astrocytic glycogenolysis of cerebral astrocytes comprising the step of treating gintonin to cerebral astrocytes (astrocyte) in vitro.

본 발명의 또 다른 목적은 시험관 내에서 진토닌(Gintonin)을 뇌성상세포(astrocyte)에 처리하는 단계를 포함하는 뇌성상세포 내에서 ATP 생산을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a method of increasing ATP production in cerebral astrocytes comprising the step of treating gintonin to cerebral astrocytes (astrocyte) in vitro.

본 발명의 또 다른 목적은 시험관 내에서 진토닌(Gintonin)을 뇌성상세포에 처리하는 단계를 포함하는 뇌성상세포 내에서 글루타메이트(glutamate)의 흡수를 증가시키는 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a method for increasing the absorption of glutamate in cerebral astrocytes comprising the step of treating cerebral astrocytes with gintonin in vitro.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 진토닌(Gintonin)을 유효성분으로 포함하는 뇌손상 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of brain damage diseases comprising gintonin (Gintonin) as an active ingredient.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 진토닌은 뇌성상세포의 글리코젠분해(astrocytic glycogenolysis)를 촉진시키는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the gintonin may promote astrocytic glycogenolysis of cerebral astrocytes.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 진토닌은 뇌성상세포 내에서 ATP의 생산 및 글루타메이트의 흡수를 증가시키는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the gintonin may increase the production of ATP and absorption of glutamate in cerebral astrocytes.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 진토닌은 저산소 및 재산소화 스트레스로부터 뇌성상세포를 보호하는 것일 수 있다. In an embodiment of the present invention, the gintonin may protect cerebral astrocytes from hypoxia and reoxygenation stress.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 뇌손상 질환은 저산소성 뇌손상, 허혈성 뇌질환, 뇌졸중, 뇌경색, 뇌허혈, 혈전증, 색전증, 일과성 허혈발작, 백질이상증 또는 소경색인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. In one embodiment of the present invention, the brain injury disease may be hypoxic brain injury, ischemic brain disease, stroke, cerebral infarction, cerebral ischemia, thrombosis, embolism, transient ischemic attack, leukemia or small infarction, but is limited thereto. no.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 진토닌은 0.1 내지 10 μg/mL의 농도로 투여되는 것일 수 있고, 바람직하게는 0.1 내지 1 μg/mL의 농도인 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 0.3 내지 1 μg/mL의 농도인 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the gintonin may be administered at a concentration of 0.1 to 10 μg/mL, preferably at a concentration of 0.1 to 1 μg/mL, more preferably 0.3 to It may be a concentration of 1 μg/mL.

또한, 본 발명은 진토닌(Gintonin)을 유효성분으로 포함하는 뇌손상 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. In addition, the present invention provides a food composition for preventing or improving brain damage diseases comprising gintonin as an active ingredient.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 진토닌(Gintonin)을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌손상 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. In addition, the present invention provides a method for preventing or treating brain injury diseases comprising administering a pharmaceutically effective amount of Gintonin to an individual other than a human.

또한, 본 발명은 진토닌(Gintonin)을 유효성분으로 포함하는 뇌성상세포(astrocyte) 보호용 조성물을 제공한다. In addition, the present invention provides a composition for protecting cerebral astrocytes (astrocyte) comprising gintonin (Gintonin) as an active ingredient.

또한, 본 발명은 시험관 내에서 진토닌(Gintonin)을 뇌성상세포(astrocyte)에 처리하는 단계를 포함하는 뇌성상세포의 글리코젠분해(astrocytic glycogenolysis)를 촉진시키는 방법을 제공한다. In addition, the present invention provides a method of promoting astrocytic glycogenolysis of cerebral astrocytes comprising the step of treating gintonin to cerebral astrocytes in vitro.

또한, 본 발명은 시험관 내에서 진토닌(Gintonin)을 뇌성상세포(astrocyte)에 처리하는 단계를 포함하는 뇌성상세포 내에서 ATP 생산을 증가시키는 방법을 제공한다. In addition, the present invention provides a method of increasing ATP production in cerebral astrocytes comprising the step of treating gintonin to cerebral astrocytes (astrocyte) in vitro.

또한, 본 발명은 시험관 내에서 진토닌(Gintonin)을 뇌성상세포에 처리하는 단계를 포함하는 뇌성상세포 내에서 글루타메이트(glutamate)의 흡수를 증가시키는 방법을 제공한다. In addition, the present invention provides a method of increasing the absorption of glutamate in cerebral astrocytes comprising the step of treating cerebral astrocytes with gintonin in vitro.

본 발명에 따른 진토닌은 뇌성상세포의 글리코젠분해(astrocytic glycogenolysis)를 촉진시켜 뇌성상세포 내에서 ATP의 생산 및 글루타메이트의 흡수를 증가시키고, 저산소 및 재산소화 스트레스로부터 뇌성상세포를 보호함으로써 뇌손상 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. Gintonin according to the present invention promotes astrocytic glycogenolysis of cerebral astrocytes, thereby increasing the production of ATP and absorption of glutamate in cerebral astrocytes, and by protecting cerebral astrocytes from hypoxia and reoxygenation stress. It can be usefully used in the prevention or treatment of an injured disease.

도 1A 및 1B는 정상 산소 조건에서 뇌성상세포의 글리코젠분해 정도를 확인하기 위하여, 진토닌 (GT)을 농도 (0.1, 03. 1 및 3 μg/mL, A) 또는 시간 (0.5, 1, 2 및 8 시간, B)에 따라 처리한 후, 글리코젠의 양을 측정한 결과이다 (^* p < 0.01, ^** p < 0.001, 대조군 (Con)과 비교; ^# p < 0.05, 1 및 3 μg/mL의 진토닌과 비교; 및 데이터는 평균 ± SEM으로 표기하였음 (n = 4)).
도 1C 및 1D는 진토닌-중재 글리코젠분해에 관한 신호 조절자를 확인하기 위하여, 진토닌을 처리하기 전에 LPA1/3 수용체의 길항제인 Ki16425 (10 μM), PLC (phospholipase C) 억제제인 U73122 (5 μM), IP₃ (inositol 1,4,5-triphosphate) 수용체의 길항제인 2-APB (2-aminoethoxydiphenyl borate, 100 μM) 및 세포 내 Ca²⁺ 킬레이트인 BAPTA-AM (50 μM)을 처리한 후, 글리코젠의 양을 측정한 결과이다 (^* p < 0.01, Ki16425이 처리되지 않은 경우와 비교; ^** p < 0.001, 대조군 (Con)과 비교; ^# p < 0.05, ^## p < 0.01, ^### p < 0.001, 1 μg/mL의 진토닌 단독으로 처리된 경우와 비교; 및 데이터는 평균 ± SEM으로 표기하였음 (n = 4)).
도 1E는 0.1 μg/mL의 진토닌 단독 또는 동시에 ATP (10 μM) 또는 글루타메이트 (10 μM)를 처리한 후 글리코젠의 양을 측정한 결과이고, 도 1F는 1 μg/mL의 진토닌 단독 또는 동시에 ATP (100 μM) 또는 글루타메이트 (100 μM)를 처리한 후 글리코젠의 양을 측정한 결과이다 (^* p < 0.01, ^** p < 0.001, 대조군 (Con)과 비교; ^# p < 0.05, 진토닌, ATP 또는 글루타메이트 단독으로 처리된 경우와 비교; 및 데이터는 평균 ± SEM으로 표기하였음 (n = 4)).
도 2A는 진토닌 또는 LPA를 처리하기 전에 포스포릴라제 키나제 (phosphorylase kinase)의 억제제인 K252a을 처리한 후 글리코젠의 양을 측정한 결과이고, 도 2B는 글리코젠 포스포릴라제 (glycogen phosphorylase)의 억제제인 이소파고민 (isofagomine)을 처리한 후 글리코젠의 양을 측정한 결과이다 (^* p < 0.01, ^** p < 0.001, 진토닌을 처리하지 않거나 대조군 (Con)과 비교; ^# p < 0.05, 진토닌 또는 LPA 단독 처리한 경우와 비교; 및 데이터는 평균 ± SEM으로 표기하였음 (n = 4-5)).
도 2C는 진토닌을 농도 (1, 3 및 10 μg/mL, a) 및 시간 (0.5, 1, 2, 8 및 12 시간, b)에 따라 처리한 후, 글리코젠 포스포릴라제 (glycogen phosphorylase isoenzyme BB, brain form, GPBB)에 대한 면역침강 후 면역블럿을 수행하여 GPBB의 양을 측정한 결과이다 (input은 10% 세포분해물을 넣은 것; ^# p < 0.05, 진토닌을 처리하지 않은 경우와 비교; 및 데이터는 평균 ± SEM으로 표기하였음 (n = 4-5)).
도 2D는 진토닌을 처리한 후 글리코젠 신타제 (GS) 및 인산화된 글리코젠 신타제 (pGS)에 대한 면역블럿을 수행한 결과 및 pGS/GS의 양을 측정한 결과이다 (^* p < 0.01, 진토닌을 처리하지 않은 경우와 비교; 및 데이터는 평균 ± SEM으로 표기하였음 (n = 4-5)).
도 3은 정상 산소 (A, B), 저산소 (C, D) 및 재산소화 (E, F) 조건에서 진토닌을 처리 (B, D, F) 또는 처리하지 않은 경우 (A, C, E), 세포형태 및 세포분포를 비교한 결과이다 (Scale bar: 100 μm).
도 4A는 12시간 동안의 저산소 조건에서 진토닌을 농도(0, 0.1, 0.3, 1 및 3 μg/mL)에 따라 처리한 후 글리코젠의 양을 측정한 결과이고, 4B는 0.5, 1, 2 및 12 시간 동안의 저산소 조건에서 진토닌을 처리한 후 글리코젠의 양을 측정한 결과이다 (^* p < 0.05, ^** p < 0.01, 대조군 (Con)과 비교 (A) 또는 진토닌이 처리된 경우와 비교 (B); ^# p < 0.05, ^## p < 0.01, 진토닌이 처리되지 않은 경우와 비교; 및 데이터는 평균 ± SEM으로 표기하였음 (n = 4-5)).
도 4C는 12시간 동안 저산소 처리 후 30분 동안 재산소화 조건에서 진토닌을 농도 (0, 0.1, 0.3 및 1 μg/mL)에 따라 처리한 후 글리코젠의 양을 측정한 결과이고, 4D는 12시간 동안 저산소 처리 후 30분 또는 8시간 동안 재산소화 조건에서 진토닌을 처리한 후 글리코젠의 양을 측정한 결과이다 (^*** p < 0.001, 정상 산소 조건 (Con)과 비교; ^## p < 0.01, 진토닌이 처리되지 않은 경우와 비교 (C); ^** p < 0.01, 정상 산소 조건 (Con)과 비교 (D); ^*** p < 0.001, 정상 산소 조건 (Con)과 비교 (D); 및 데이터는 평균 ± SEM으로 표기하였음 (n = 4-5)).
도 5A 및 5B는 정상 산소 조건에서 진토닌을 농도 (0.1, 0.3, 1 및 3 μg/mL, A) 또는 시간 (0.5, 2 및 8 시간, B)에 따라 처리한 후 ATP의 양을 측정한 결과이다 (글리코젠 포스포릴라제의 억제제인 이소파고민 (300 μM)은 30분 동안 처리하였음; 및 B에서 진토닌은 0.3 μg/mL로 처리하였음) (^* p < 0.01, 대조군과 비교; ^# p < 0.05, 0.3 μg/mL의 진토닌을 처리한 경우와 비교; 및 데이터는 평균 ± SEM으로 표기하였음 (n = 4-5)).
도 5C는 12시간 동안 저산소 조건에서 진토닌을 농도 (0, 0.1, 0.3, 1 및 3 μg/mL, C)에 따라 처리한 후 ATP의 양을 측정한 결과이고, 5D는 시간 (0.5, 1, 2 및 12 시간, D)에 따라 저산소 조건에서 진토닌 (0.3 μg/mL)을 처리한 후 ATP의 양을 측정한 결과이다 (^* p < 0.01, 대조군과 비교;^** p < 0.001, 0.3 μg/mL의 진토닌을 처리한 경우와 비교; ^## p < 0.01, ^### p < 0.005, 진토닌을 처리하지 않은 경우와 비교 (C); ^# p < 0.05, ^## p < 0.01, 진토닌을 처리하지 않은 경우와 비교 (D); 및 데이터는 평균 ± SEM으로 표기하였음 (n = 4-5)).
도 5E는 12시간 동안 저산소 처리 후 2시간 동안의 재산소화 조건에서 진토닌을 농도 (0, 0.1, 0.3, 1 및 3 μg/mL)에 따라 처리한 후 ATP의 양을 측정한 결과이고, 5F는 12시간 동안 저산소 처리 후 시간 (0, 0.5, 2 및 8 시간)에 따른 재산소화 조건에서 진토닌 (0.3 μg/mL)을 처리한 후 ATP의 양을 측정한 결과이다 (^* p < 0.01, ^** p < 0.001, 대조군과 비교; ^## p < 0.01, ^### p < 0.005, 진토닌을 처리하지 않은 경우와 비교; ^# p < 0.005, 이소파고민이 처리된 경우와 비교; 및 데이터는 평균 ± SEM으로 표기하였음 (n = 4-5)).
도 6A 및 6B는 정상 산소 조건에서 진토닌을 농도 (0.1, 0.3, 1 및 3 μg/mL, A) 또는 시간 (5, 15, 30, 60 및 120 분, B)에 따라 처리한 후 세포 내 글루타메이트의 양을 측정한 결과이다 (글루타메이트 전달체의 억제제인 TBOA는 30 or 100 μM으로 처리하였음; 및 B에서 진토닌은 0.3 μg/mL로 처리하였음) (^* p < 0.01, ^** p < 0.005, 대조군 (Con)과 비교; ^# p < 0.01, 0.3 μg/mL의 진토닌을 처리한 경우와 비교; 및 데이터는 평균 ± SEM으로 표기하였음 (n = 4-5)).
도 6C는 12시간 동안 저산소 조건에서 진토닌을 농도 (0, 0.1, 0.3, 1 및 3 μg/mL, C)에 따라 처리한 후 세포 내 글루타메이트의 양을 측정한 결과이고, 6D는 시간 (0, 0.5, 1, 2 및 12 시간, D)에 따라 저산소 조건에서 진토닌 (0.3 μg/mL)을 처리한 후 세포 내 글루타메이트의 양을 측정한 결과이다 (^* p < 0.01, ^** p < 0.005, 대조군과 비교; ^# p < 0.05, ^## p < 0.01, ^### p < 0.001, 진토닌을 처리하지 않은 경우와 비교; 및 데이터는 평균 ± SEM으로 표기하였음 (n = 4-5)).
도 6E는 12시간 동안 저산소 처리 후 30분 동안의 재산소화 조건에서 진토닌을 농도 (0, 0.1, 0.3, 1 및 3 μg/mL)에 따라 처리한 후 세포 내 글루타메이트의 양을 측정한 결과이고, 6F는 12시간 동안 저산소 처리 후 시간 (0, 5, 15, 30, 60 및 120 분)에 따른 재산소화 조건에서 진토닌 (0.3 μg/mL)을 처리한 후 세포 내 글루타메이트의 양을 측정한 결과이다 (^* p < 0.01, ^** p < 0.005, 대조군과 비교; ^# p < 0.05, ^## p < 0.01, ^### p < 0.001, 진토닌을 처리하지 않은 경우와 비교; 및 데이터는 평균 ± SEM으로 표기하였음 (n = 4-5)).
도 7A는 정상 산소 조건에서 진토닌을 농도 (0.1, 0.3, 1 및 3 μg/mL)에 따라 30분 동안 처리한 후 XTT 어세이를 통해 세포생존율을 측정한 결과이고, 7B는 12시간 동안 저산소 처리 후 진토닌을 농도 (0.1, 0.3, 1 및 3 μg/mL)에 따라 30분 동안 처리한 후 XTT 어세이를 통해 세포생존율을 측정한 결과이고, 7C는 저산소 조건에서 이소파고민을 처리한 후 진토닌을 농도 (0.1, 0.3, 1 및 3 μg/mL)에 따라 30분 동안 처리한 후 XTT 어세이를 통해 세포생존율을 측정한 결과이다 (^* p < 0.05, 대조군과 비교; ^# p < 0.05, ^## p < 0.01, 진토닌을 처리하지 않은 경우와 비교; 및 데이터는 평균 ± SEM으로 표기하였음 (n = 4-5)).
도 7D 내지 7F는 12시간 동안 저산소 처리 후 30분 (D), 2시간 (E) 또는 8시간 (F) 동안의 재산소화 조건에서 진토닌을 농도 (0.1, 0.3, 1 및 3 μg/mL)에 따라 처리한 후 XTT 어세이를 통해 세포생존율을 측정한 결과이다 (^* p < 0.05, ^** p < 0.01, 대조군과 비교; ^# p < 0.05, ^## p < 0.01, 진토닌을 처리하지 않은 경우와 비교; 및 데이터는 평균 ± SEM으로 표기하였음 (n = 4-5)).
도 8은 뇌피질의 일차배양 뇌성상세포에서 LPA 수용체 세포막 신호전달경로에 의한 진토닌-중재 글리코젠분해의 세포 내 및 세포 사이의 효과를 대략적으로 나타낸 모식도로서, 세포 내 효과는 저산소 및 재산소화로 유도된 스트레스에서 ATP 생산 증가, 글루타메이트의 흡수 증가 및 세포생존율을 향상시키는 것이고, 세포 사이의 효과는 뇌성상세포-뉴런의 젖산 셔틀 (astrocyte-neuron lactate shuttle)로 연결되는데, 이는 뉴런이 저산소 또는 재산소화 스트레스 하에서 젖산을 에너지로 사용하도록 하는 것이고, 시냅스 전달 후나 저산소 조건 하에서 초과된 세포 외의 글루타메이트를 제거하여 글루타메이트 신경독성을 약화시키는 것이다.
도 9A 및 9B는 정상 산소 조건에서 뇌성상세포에 진토닌 (10 μg/mL)을 처리하지 않거나 (A) 처리 (B) 한 후, 형광 포도당인 2-NBDG를 사용하여 포도당 흡수 여부를 확인한 결과이고 (Scale bar: 50 μm), 9C는 진토닌 (0.1, 0.3, 1 및 3 μg/mL), 글루타메이트 (Glu, 100 μM) 및 LPA (1 μM)을 처리한 후 2-NBDG (또는 2-DG)의 흡수량을 측정한 결과이다.
도 10은 정상 산소 (A) 및 저산소 (B) 조건에서 진토닌을 농도에 따라 처리한 후 BrdU를 2시간 동안 넣고 화학발광의 측정을 통해 세포증식율을 측정한 결과이다 (^* p < 0.01, ^** p < 0.005, 대조군과 비교; ^# p < 0.05, ^## p < 0.01, 저산소 조건에서 진토닌을 처리하지 않은 경우와 비교; 및 데이터는 평균 ± SEM으로 표기하였음 (n = 4-5)).1A and 1B show the concentration of gintonin (GT) (0.1, 03. 1 and 3 μg/mL, A) or time (0.5, 1, and 1) in order to confirm the degree of glycogenolysis of cerebral astrocytes under normal oxygen conditions. After treatment for 2 and 8 hours, B), the amount of glycogen was measured ( ^* p <0.01, ^** p <0.001, compared with the control (Con); ^# p <0.05, 1 and 3 μg Compared with /mL of gintonin; and data expressed as mean ± SEM (n = 4)).
Figures 1C and 1D show, in order to identify the signal modulators for gintonin-mediated glycogenolysis, before treatment with gintonin, Ki16425 (10 μM), an antagonist of LPA1/3 receptor, and U73122, an inhibitor of PLC (phospholipase C) (5 μM), IP ₃ (inositol 1,4,5-triphosphate) receptor antagonist 2-APB (2-aminoethoxydiphenyl borate, 100 μM) and intracellular Ca ²⁺ chelate BAPTA-AM (50 μM) , This is the result of measuring the amount of glycogen ( ^* p <0.01, compared with the case where Ki16425 was not treated; ^** p <0.001, compared with the control (Con); ^# p <0.05, ^## p <0.01, ^{# ##} p <0.001, compared with the case of treatment with 1 μg/mL of gintonin alone; and the data are expressed as mean ± SEM (n = 4)).
1E is a result of measuring the amount of glycogen after treatment with 0.1 μg/mL of gintonin alone or at the same time ATP (10 μM) or glutamate (10 μM), and FIG. 1F is a result of measuring the amount of glycogen alone or It is the result of measuring the amount of glycogen after treatment with ATP (100 μM) or glutamate (100 μM) at the same time ( ^* p <0.01, ^** p <0.001, compared to control (Con); ^# p <0.05, ginseng Compared to treatment with Nin, ATP or glutamate alone; and data expressed as mean ± SEM (n = 4)).
2A is a result of measuring the amount of glycogen after treatment with K252a, an inhibitor of phosphorylase kinase, before treatment with gintonin or LPA, and FIG. 2B is a result of measuring the amount of glycogen. ) Isofagomine (isofagomine) inhibitor was measured and then the amount of glycogen was measured ( ^* p <0.01, ^** p <0.001, compared to the control group (Con) or not treated with gintonin; ^# p <0.05, compared with the case of treatment with gintonin or LPA alone; and data were expressed as mean ± SEM (n = 4-5)).
Figure 2C is a glycogen phosphorylase (glycogen phosphorylase) after treatment according to the concentration (1, 3 and 10 μg/mL, a) and time (0.5, 1, 2, 8 and 12 hours, b) of gintonin. This is the result of measuring the amount of GPBB by performing immunoblot after immunoprecipitation for isoenzyme BB, brain form, GPBB) (input is 10% cell lysate; ^# p <0.05, when not treated with gintonin Comparison; and data expressed as mean±SEM (n = 4-5)).
Figure 2D is a result of performing an immunoblot for glycogen synthase (GS) and phosphorylated glycogen synthase (pGS) after treatment with gintonin and a result of measuring the amount of pGS/GS ( ^* p <0.01 , Compared with the case without treatment with gintonin; and data are expressed as mean ± SEM (n = 4-5)).
Figure 3 is a case of treatment (B, D, F) or no treatment (A, C, E) of gintonin under normal oxygen (A, B), hypoxia (C, D) and reoxygenation (E, F) conditions. , Cell morphology and cell distribution were compared (Scale bar: 100 μm).
Figure 4A is a result of measuring the amount of glycogen after treating gintonin according to the concentration (0, 0.1, 0.3, 1 and 3 μg/mL) under hypoxic conditions for 12 hours, and 4B is 0.5, 1, 2 And it is the result of measuring the amount of glycogen after treating gintonin under hypoxic conditions for 12 hours ( ^* p <0.05, ^** p <0.01, compared with the control (Con) (A) or gintonin-treated Case and comparison (B); ^# p <0.05, ^## p <0.01, compared with the case without treatment with gintonin; and data are expressed as mean ± SEM (n = 4-5)).
Figure 4C is a result of measuring the amount of glycogen after treatment with gintonin according to the concentration (0, 0.1, 0.3 and 1 μg/mL) under the reoxygenation condition for 30 minutes after hypoxic treatment for 12 hours, 4D is 12 This is the result of measuring the amount of glycogen after treatment with gintonin in reoxygenation conditions for 30 minutes or 8 hours after hypoxic treatment for a period of time ( ^*** p <0.001, compared with normal oxygen conditions (Con); ^## p <0.01, compared with untreated gintonin (C); ^** p <0.01, compared with normal oxygen conditions (Con) (D); ^*** p <0.001, compared with normal oxygen conditions (Con) ( D); and data are expressed as mean ± SEM (n = 4-5)).
Figures 5A and 5B show the amount of ATP after treatment with gintonin at concentration (0.1, 0.3, 1 and 3 μg/mL, A) or time (0.5, 2 and 8 hours, B) under normal oxygen conditions. Results (Isopagomine (300 μM), an inhibitor of glycogen phosphorylase, was treated for 30 minutes; and gintonin in B was treated with 0.3 μg/mL) ( ^* p <0.01, compared with the control group; ^# p <0.05, compared with the case of treatment with 0.3 μg/mL of gintonin; and data are expressed as mean ± SEM (n = 4-5)).
Figure 5C is a result of measuring the amount of ATP after treating gintonin according to the concentration (0, 0.1, 0.3, 1 and 3 μg/mL, C) under hypoxic conditions for 12 hours, 5D is the time (0.5, 1 , 2 and 12 hours, D) after treatment with gintonin (0.3 μg/mL) under hypoxic conditions, the amount of ATP was measured ( ^* p <0.01, compared to the control group; ^** p <0.001, 0.3 Compared with the case of treatment with μg/mL of gintonin; ^## p <0.01, ^### p <0.005, compared with the case of not treatment with gintonin (C); ^# p <0.05, ^## p <0.01, Comparison with the case of not treated with gintonin (D); and data are expressed as mean ± SEM (n = 4-5)).
Figure 5E is a result of measuring the amount of ATP after treatment with gintonin according to the concentration (0, 0.1, 0.3, 1 and 3 μg/mL) in the reoxygenation condition for 2 hours after hypoxic treatment for 12 hours, 5F Is the result of measuring the amount of ATP after treatment with gintonin (0.3 μg/mL) under reoxygenation conditions according to time (0, 0.5, 2 and 8 hours) after hypoxic treatment for 12 hours ( ^* p <0.01, ^** p <0.001, compared to the control group; ^## p <0.01, ^### p <0.005, compared to the case without gintonin treatment; ^# p <0.005, compared to the case where isopagomine was treated; and data Is expressed as mean ± SEM (n = 4-5)).
6A and 6B show intracellular treatment after treatment with gintonin at concentration (0.1, 0.3, 1 and 3 μg/mL, A) or time (5, 15, 30, 60 and 120 minutes, B) under normal oxygen conditions. This is the result of measuring the amount of glutamate (TBOA, an inhibitor of the glutamate transporter, was treated with 30 or 100 μM; and Gintonin in B was treated with 0.3 μg/mL) ( ^* p <0.01, ^** p <0.005, Compared with the control group (Con); ^# p <0.01, compared with the case of treatment with gintonin at 0.3 μg/mL; and data were expressed as mean ± SEM (n = 4-5)).
6C is a result of measuring the amount of glutamate in cells after treatment with gintonin at a concentration (0, 0.1, 0.3, 1 and 3 μg/mL, C) under hypoxic conditions for 12 hours, 6D is the time (0 , 0.5, 1, 2, and 12 hours, D) after treatment with gintonin (0.3 μg/mL) in hypoxic conditions, the amount of glutamate in cells was measured ( ^* p <0.01, ^** p <0.005 , Compared with the control group; ^# p <0.05, ^## p <0.01, ^### p <0.001, compared with the case of not treated with gintonin; and data are expressed as mean ± SEM (n = 4-5)) .
6E is a result of measuring the amount of glutamate in cells after treatment with gintonin according to the concentration (0, 0.1, 0.3, 1 and 3 μg/mL) under the reoxygenation condition for 30 minutes after hypoxic treatment for 12 hours. , 6F is a measure of the amount of glutamate in cells after treatment with gintonin (0.3 μg/mL) in reoxygenation conditions according to time (0, 5, 15, 30, 60 and 120 minutes) after hypoxic treatment for 12 hours. Results ( ^* p <0.01, ^** p <0.005, compared with the control group; ^# p <0.05, ^## p <0.01, ^### p <0.001, compared with the case without gintonin treatment; and the data are average Expressed as ± SEM (n = 4-5)).
7A is a result of measuring cell viability through XTT assay after treating gintonin according to concentration (0.1, 0.3, 1 and 3 μg/mL) for 30 minutes under normal oxygen conditions, and 7B is hypoxic for 12 hours. After treatment, gintonin was treated according to the concentration (0.1, 0.3, 1, and 3 μg/mL) for 30 minutes, and then the cell viability was measured through XTT assay, and 7C is the result of treatment with isopagomine in hypoxic conditions. This is the result of measuring the cell viability through XTT assay after treating gintonin according to the concentration (0.1, 0.3, 1 and 3 μg/mL) for 30 minutes ( ^* p <0.05, compared to the control group; ^# p < 0.05, ^## p <0.01, compared with the case of not treated with gintonin; and data were expressed as mean ± SEM (n = 4-5)).
7D to 7F show the concentration of gintonin (0.1, 0.3, 1, and 3 μg/mL) under reoxygenation conditions for 30 minutes (D), 2 hours (E) or 8 hours (F) after hypoxic treatment for 12 hours. It is the result of measuring the cell viability through XTT assay after treatment according to ( ^* p <0.05, ^** p <0.01, compared with the control group; ^# p <0.05, ^## p <0.01, not treated with gintonin Comparison with case; and data are expressed as mean ± SEM (n = 4-5)).
8 is a schematic diagram schematically showing the intracellular and intercellular effects of gintonin-mediated glycogenolysis by the LPA receptor cell membrane signaling pathway in primary cultured cerebral astrocytes of the cerebral cortex, wherein the intracellular effects are hypoxia and reoxygenation. Increased ATP production, increased glutamate absorption, and improved cell viability in the stress induced by the cerebral astrocyte-neuron lactate shuttle, which leads to hypoxia or It is to use lactic acid as energy under reoxygenation stress, and to reduce glutamate neurotoxicity by removing excess extracellular glutamate after synaptic transmission or under hypoxic conditions.
9A and 9B show the results of confirming the absorption of glucose using 2-NBDG, which is a fluorescent glucose, after not treating cerebral astrocytes with gintonin (10 μg/mL) or (A) treatment (B) under normal oxygen conditions And (Scale bar: 50 μm), 9C is gintonin (0.1, 0.3, 1 and 3 μg/mL), glutamate (Glu, 100 μM) and LPA (1 μM) after treatment with 2-NBDG (or 2- It is the result of measuring the absorption amount of DG).
Figure 10 is a result of measuring the cell proliferation rate through the measurement of chemiluminescence after treating gintonin according to the concentration under normal oxygen (A) and hypoxic (B) conditions, and then adding BrdU for 2 hours ( ^* p <0.01, ^{* *} p <0.005, compared with the control group; ^# p <0.05, ^## p <0.01, compared with the case of not treated with gintonin under hypoxic conditions; and data were expressed as mean ± SEM (n = 4-5)) .

본 발명은 뇌손상 질환을 예방 및 치료할 수 있는 약학 조성물을 제공하며, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는, 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). The present invention provides a pharmaceutical composition capable of preventing and treating brain injury diseases, and the pharmaceutical composition may further include a pharmaceutically acceptable carrier. As used herein, "pharmaceutically acceptable" refers to a composition that is physiologically acceptable and does not usually cause allergic reactions such as gastrointestinal disorders and dizziness or similar reactions when administered to humans. Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, a carrier for oral administration such as lactose, starch, cellulose derivatives, magnesium stearate, stearic acid, and the like, and for parenteral administration such as water, suitable oils, saline, aqueous glucose and glycol. Carrier, etc., and may further include a stabilizer and a preservative. Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite or ascorbic acid. Suitable preservatives are benzalkonium chloride, methyl- or propyl-paraben and chlorobutanol. Other pharmaceutically acceptable carriers may be referred to as those described in the following literature (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명에 따른 약학 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있고, 이에 한정되는 것은 아니다.The pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated in a suitable form according to a method known in the art together with a pharmaceutically acceptable carrier as described above. That is, the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared in various parenteral or oral administration forms according to known methods, and as a representative formulation for parenteral administration, an isotonic aqueous solution or suspension is preferable as a dosage form for injection. Formulations for injection can be prepared according to techniques known in the art using suitable dispersing or wetting agents and suspending agents. For example, each component can be formulated for injection by dissolving it in saline or buffer. In addition, formulations for oral administration include powders, granules, tablets, pills and capsules, but are not limited thereto.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어, "투여"란 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한, 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount. The term "administration" of the present invention means introducing a predetermined substance to an individual by an appropriate method, and the route of administration of the composition may be administered through any general route as long as it can reach the target tissue. Intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, or rectal administration may be performed, but are not limited thereto.

상기 용어, "개체"란 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 바람직하게는, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.The term "individual" refers to all animals including humans, such as mice, mice, and domestic animals. Preferably, it may be a mammal including a human.

상기 용어, "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며, 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성별, 연령, 체중, 건강 상태, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로, 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 투여는 상기 권장 투여량을 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.The term "pharmaceutically effective amount" refers to an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment and does not cause side effects, and the effective dose level is the patient's sex, age , Weight, health condition, type of disease, severity, activity of the drug, sensitivity to the drug, method of administration, time of administration, route of administration, and rate of excretion, duration of treatment, factors including drugs used in combination or concurrently, and other fields of medicine It can be readily determined by a person skilled in the art according to factors well known in the art. Administration may be administered once a day at the recommended dosage, or may be divided several times.

본 발명의 식품 조성물은 통상적인 의미의 식품을 모두 포함할 수 있으며, 기능성 식품, 건강기능식품 등 당업계에 알려진 용어와 혼용 가능하다.The food composition of the present invention may include all foods in a conventional sense, and may be mixed with terms known in the art, such as functional foods and health functional foods.

본 발명의 용어, "기능성 식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.The term "functional food" of the present invention refers to a food manufactured and processed using raw materials or ingredients having useful functionality for the human body according to the Health Functional Food Act No. 6727, and the term "functional" It means ingestion for the purpose of obtaining useful effects for health purposes such as controlling nutrients for structure and function or for physiological effects.

본 발명의 용어, "건강기능식품"은 건강보조의 목적으로 특정성분을 원료로 하거나 식품 원료에 들어있는 특정성분을 추출, 농축, 정제, 혼합 등의 방법으로 제조, 가공한 식품을 말하며, 상기 성분에 의해 생체방어, 생체리듬의 조절, 질병의 방지와 회복 등 생체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발휘할 수 있도록 설계되고 가공된 식품을 말하는 것으로서, 상기 건강식품용 조성물은 질병의 예방 및 질병의 회복 등과 관련된 기능을 수행할 수 있다. The term "health functional food" of the present invention refers to a food manufactured and processed by extracting, concentrating, refining, mixing, or extracting, concentrating, refining, and mixing specific ingredients contained in food ingredients or using specific ingredients for the purpose of health supplementation. It refers to foods designed and processed to sufficiently exert biological control functions such as biological defense, biological rhythm control, disease prevention and recovery, etc. by ingredients. The health food composition is used to prevent diseases and recover diseases. Can perform functions related to etc.

본 발명의 조성물이 사용될 수 있는 식품의 종류에는 제한이 없다. 아울러, 본 발명의 조성물은 당업자의 선택에 따라 식품에 포함될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림 류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 추출물 및 이의 분획물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다.There is no limitation on the kind of food in which the composition of the present invention can be used. In addition, the composition of the present invention may be prepared by mixing suitable other auxiliary ingredients and known additives that may be included in food according to the choice of a person skilled in the art. Examples of foods that can be added include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gum, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, drinks, alcoholic beverages, and There are vitamin complexes and the like, and can be prepared by adding the extract according to the present invention and a fraction thereof as a main component to juice, tea, jelly, and juice.

또한, 본 발명에 적용될 수 있는 식품에는 예컨대, 특수영양식품(예: 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예: 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예: 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예:스낵류), 유가공품(예: 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예: 과실, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면스프 등) 등 모든 식품을 포함할 수 있다.In addition, foods that can be applied to the present invention include, for example, special nutritional foods (e.g., formulas, infant foods, etc.), processed meat products, fish meat products, tofu, rice cakes, noodles (e.g., ramen, noodles, etc.), health supplement foods. , Seasoned foods (e.g. soy sauce, miso, red pepper paste, mixed sauce, etc.), sauces, confectionery (e.g. snacks), dairy products (e.g. fermented milk, cheese, etc.), other processed foods, kimchi, pickles (various kimchi, pickles, etc.) ), beverages (e.g. fruit, vegetable beverages, soy milk, fermented beverages, etc.), natural seasonings (e.g., ramen soup, etc.).

본 발명의 건강기능식품 조성물이 음료의 형태로 사용될 경우에는 통상의 음료와 같이 여러 가지 감미제, 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.When the health functional food composition of the present invention is used in the form of a beverage, it may contain various sweetening agents, flavoring agents, natural carbohydrates, and the like as an additional component, like a normal beverage. In addition to the above, the health functional food composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, electrolytes, flavoring agents, coloring agents, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin. , Alcohol, carbonated beverages, etc. may contain. In addition, it may contain flesh for the manufacture of natural fruit juice, fruit juice beverage and vegetable beverage.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are for explaining the present invention more specifically, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

실시예 1. 실험재료 및 방법Example 1. Experimental materials and methods

1.1. 실험재료1.1. Experimental material

인삼 사포닌이 제거된 진토닌은 인삼(Panax ginseng)에서 기존에 기재된 방법에 따라 준비되었다 (Neurosci Lett. 603:19-24, 2015). 진토닌은 실험에 사용하기 전에 탈염수에 녹이고 배지에 희석하였다. DMEM (Dulbecco's Minimum Essential Medium), FBS (fetal bovine serum), 페니실린 및 스트렙토마이신은 Invitrogen (Camarillo, CA, USA)에서 구입하였다. LPA (1-oleoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphate)는 Avanti Polar Lipids, Inc. (AL, USA)에서 구입하였고, Ki16425 및 이소파고민 (isofagomine)은 Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI, USA)에서 구입하였다. ATP, BAPTA-AM (1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid tetrakis-acetoxymethyl ester), 글루타메이트 (glutamate) 및 K252a를 포함한 다른 시약은 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)에서 구입하였다. TBOA (DL-threo-β-benzyloxyaspartate)은 Tocris Bioscience (Bristol, UK)에서 구입하였다.Ginseng saponin-depleted ginseng was prepared from Panax ginseng according to the previously described method (Neurosci Lett. 603:19-24, 2015). Gintonin was dissolved in demineralized water and diluted in a medium before use in the experiment. DMEM (Dulbecco's Minimum Essential Medium), FBS (fetal bovine serum), penicillin and streptomycin were purchased from Invitrogen (Camarillo, CA, USA). LPA (1-oleoyl-2-hydroxy- sn -glycero-3-phosphate) is manufactured by Avanti Polar Lipids, Inc. (AL, USA), Ki16425 and isofagomine were purchased from Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI, USA). Other reagents including ATP, BAPTA-AM (1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid tetrakis-acetoxymethyl ester), glutamate and K252a are Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA). TBOA (DL- threo- β-benzyloxyaspartate) was purchased from Tocris Bioscience (Bristol, UK).

1.2. 마우스 대뇌피질 유래 뇌성상세포(astrocytes)의 일차배양1.2. Primary culture of mouse cerebral cortex-derived astrocytes

뇌성상세포의 일차배양은 Kim et al. 의 방법 (Neurosci Lett. 603:19-24, 2015)에 따라 생후 1일된 ICR (CD-1®) 마우스의 대뇌피질로부터 준비되었다. 세포는 폴리-L-라이신 하이드로브로마이드(poly-L-lysine hydrobromide, 100 μg/mL; Sigma-Aldrich)가 코팅된 culture dish에 접종되었고, 10% FBS, 100 units/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지를 이용하여 37°C, 5 % CO₂ 인큐베이터에서 배양되었다. 일차배양세포가 100% confluence로 자란 시점(5일 내지 7일)에, 세포는 0.05% 트립신/EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) 용액 (Life technologies, Carlsbad, CA, USA)으로 모아졌고, 미리 처리된 폴리-L-라이신 하이드로브로마이드(100 μg/mL; Sigma-Aldrich)가 코팅된 culture dish에 접종되었으며, 10% FBS, 100 units/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지를 이용하여 배양한 후 다른 실험에 사용되었다. Primary culture of cerebral astrocytes was performed by Kim et al . (Neurosci Lett. 603:19-24, 2015) was prepared from the cerebral cortex of 1 day old ICR (CD-1®) mice. Cells were inoculated into culture dishes coated with poly-L-lysine hydrobromide (100 μg/mL; Sigma-Aldrich), 10% FBS, 100 units/mL penicillin and 100 μg/mL strepto. It was cultured in an incubator at 37°C and 5% CO ₂ using DMEM medium containing mycin. At the time point when primary cultured cells were grown with 100% confluence (5 to 7 days), cells were collected with 0.05% trypsin/EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) solution (Life technologies, Carlsbad, CA, USA), and pretreated poly- L-lysine hydrobromide (100 μg/mL; Sigma-Aldrich) was inoculated into a coated culture dish, and cultured using DMEM medium containing 10% FBS, 100 units/mL penicillin and 100 μg/mL streptomycin. Later used in other experiments.

1.3. 뇌성상세포의 글리코젠분해 측정1.3. Measurement of glycogen breakdown of cerebral astrocytes

일차배양세포가 가득 자란 후에, 글리코젠 어세이가 기존에 기재된 방법과 같이 수행되었다 (J Neurosci 12(12):4923-4931, 1992). 글리코젠 어세이가 수행되기 전에는 5 mM 글루코오스를 포함하는 serum-free DMEM 배지로 갈아주었다. 교환된 배지로 4시간 동안 배양한 후, 세포는 37℃에서 진토닌이 포함 또는 포함되지 않은 배지로 처리되었다. 세포 내 글리코젠의 수준은 Glycogen Assay Kit (Cayman Chemicals)를 이용하여 제조사에 의해 제시된 방법에 따라 측정되었다. 모든 샘플의 글리코젠 양은 각 샘플의 단백질 양으로 표준화하였다. After the primary cultured cells were full grown, the glycogen assay was performed in the same manner as previously described (J Neurosci 12(12):4923-4931, 1992). Before the glycogen assay was performed, it was changed to serum-free DMEM medium containing 5 mM glucose. After culturing with the exchanged medium for 4 hours, the cells were treated with a medium containing or not containing gintonin at 37°C. The level of glycogen in the cell was measured according to the method suggested by the manufacturer using the Glycogen Assay Kit (Cayman Chemicals). The amount of glycogen in all samples was normalized to the amount of protein in each sample.

1.4. 저산소증 (hypoxia) 또는 재산소화 (re-oxygenation)의 유도1.4. Induction of hypoxia or re-oxygenation

뇌성상세포는 BD GasPak^TM EZ anaerobic system을 이용하여 저산소 조건에 노출되었다 (Stroke 24(6):855-63, 1993). 세포가 0, 0.5, 1, 2 또는 12 시간 동안 저산소 조건에 노출된 후에는 세척되었다. 재산소화 조건의 경우에는 새로운 배지로 교환되었고, 이후, 세포는 실험 과정에 따라 정상 배양 조건에서 0, 0.5, 2 또는 8 시간 동안 0 내지 0.3 μg/mL의 진토닌이 처리되었다. Cerebral astrocytes were exposed to hypoxic conditions using the BD GasPak ^™ EZ anaerobic system (Stroke 24(6):855-63, 1993). The cells were washed after being exposed to hypoxic conditions for 0, 0.5, 1, 2 or 12 hours. In the case of the re-digestion condition, it was exchanged with a new medium, and then, the cells were treated with 0 to 0.3 μg/mL of gintonin for 0, 0.5, 2 or 8 hours under normal culture conditions according to the experimental procedure.

1.5. 세포 내 ATP 생산 및 세포 내 글루타메이트 측정1.5. Intracellular ATP production and intracellular glutamate measurement

세포 내 ATP 양은 ATP Assay Kit (Abcam, Cambridge, UK)을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행되어 결정되었다. 뇌성상세포는 6-well plate에 1 × 10⁶ cells/well로 접종되어 밤새 부착되도록 하였다. 세포는 4시간 동안 교환된 배지에서 배양된 후, 정상 산소, 저산소증 및 재산소화 조건에서 진토닌이 포함되거나 포함되지 않은 배지로 주어진 시간 및 농도에 따라 처리되었다. 이후, 세포는 차가운 PBS (phosphate-buffered saline)로 세척되었고, 세포 스크랩퍼 (cell scraper)를 이용하여 ATP Assay Buffer에 세포를 모았다. ATP 값은 샘플에 있는 단백질 양으로 보정되었고, 대조군 ATP 값으로 표준화하였다. The amount of ATP in cells was determined by performing according to the manufacturer's protocol using the ATP Assay Kit (Abcam, Cambridge, UK). Cerebral astrocytes were inoculated into 6-well plates at 1 × 10 ⁶ cells/well and allowed to adhere overnight. Cells were cultured in the exchanged medium for 4 hours, and then treated with a medium containing or without gintonin under normal oxygen, hypoxia and reoxygenation conditions at a given time and concentration. Thereafter, the cells were washed with cold PBS (phosphate-buffered saline), and the cells were collected in ATP Assay Buffer using a cell scraper. ATP values were corrected for the amount of protein in the sample and normalized to the control ATP values.

세포 내 글루타메이트의 양은 Glutamate Assay Kit (Abcam)을 이용하여 제조사의 지시에 따라 수행되어 측정되었다. 세포 내 글루타메이트 어세이를 수행하기 위해, 상기와 같이 세포를 준비하고 진토닌이 포함되거나 포함되지 않은 배지로 처리한 후, 100 μM 글루타메이트를 배지에 넣고, 7분 후에 종료시켰다. 글루타메이트 값은 샘플에 있는 단백질 양으로 보정하였고, 대조군의 글루타메이트 값으로 표준화하였다. The amount of glutamate in the cells was measured by performing according to the manufacturer's instructions using the Glutamate Assay Kit (Abcam). In order to perform the intracellular glutamate assay, cells were prepared as described above and treated with a medium containing or not containing gintonin, and then 100 μM glutamate was added to the medium, followed by termination after 7 minutes. Glutamate values were corrected by the amount of protein in the sample and normalized to the glutamate values of the control.

1.6. XTT (2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide) 어세이 및 세포 형태(morphology)1.6. XTT (2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide) assay and cell morphology

세포생존율은 XTT Assay Kit (Daeillab Service, Seoul, Korea)으로 결정되었다. 세포는 96-well plate에 접종되었고, 밤새 부착되었으며, 이후, 정상 산소, 저산소증 및 재산소화 조건에서 진토닌이 처리되었다. 2시간 동안 XTT를 처리한 후, 450 nm에서 Microplate Reader (SpectraMax®Plus 384 Microplate Reader)로 측정되었다. Cell viability was determined with the XTT Assay Kit (Daeillab Service, Seoul, Korea). Cells were inoculated into 96-well plates, attached overnight, and then treated with gintonin under normal oxygen, hypoxia and reoxygenation conditions. After treatment with XTT for 2 hours, it was measured with a Microplate Reader (SpectraMax®Plus 384 Microplate Reader) at 450 nm.

세포 형태를 관찰하기 위하여, 세포는 6-well plate에 있는 커버 글라스에 5 x 10⁵ cells/well로 접종되었다. 정상 산소, 저산소증 또는 재산소화 조건에서 진토닌을 처리한 후, 세포는 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 1시간 동안 고정되었고, PBS로 세척되었다. 이미지는 AE2000 Inverted Phase Contrast Microscope로 관찰되었다 (×20 objective). To observe the cell morphology, cells were inoculated at 5 x 10 ⁵ cells/well on a cover glass in a 6-well plate. After treatment with gintonin under normal oxygen, hypoxia or reoxygenation conditions, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 1 hour and washed with PBS. Images were observed with an AE2000 Inverted Phase Contrast Microscope (×20 objective).

1.7. 인산화된 글리코젠 포스포릴라제 (phosphorylated glycogen phosphorylase)의 면역블럿 1.7. Immunoblot of phosphorylated glycogen phosphorylase

세포 분해물은 12% SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리되었고, NC 멤브레인 (nitrocellulose membranes, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 옮겨졌다. 멤브레인은 TTBS (20 mM Tris [pH 7.6], 137 mM NaCl, 및 0.1% Tween 20)에 넣은 5% BSA (bovine serum albumin)으로 1시간 동안 블러킹되었고, 이후, anti-GPBB (glycogen phosphorylase isoenzyme BB) antibody (Abcam), anti-pGS (phospho-glycogen synthase), anti-GS (glycogen-synthase) antibody (Cell signaling), 또는 mouse monoclonal β-actin antibody (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)를 넣은 후 4℃에서 밤새 반응시켰다. 다음으로, 멤브레인은 5분 간격으로 TTBS로 여러 번 세척되었고, anti-rabbit HRP (horseradish peroxidase)-conjugated secondary antibody (Millipore)를 넣은 후 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 단백질 밴드는 ECL Kit (Abfrontier, Seoul, Korea)를 사용하여 화학발광에 의해 가시화되었다. Cell lysates were separated by 12% SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) and transferred to NC membranes (nitrocellulose membranes, Bio-Rad, Hercules, CA, USA). The membrane was blocked for 1 hour with 5% bovine serum albumin (BSA) in TTBS (20 mM Tris [pH 7.6], 137 mM NaCl, and 0.1% Tween 20), and then, anti-GPBB (glycogen phosphorylase isoenzyme BB) antibody (Abcam), anti-pGS (phospho-glycogen synthase), anti-GS (glycogen-synthase) antibody (Cell signaling), or mouse monoclonal β-actin antibody (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) Then, it was reacted at 4°C overnight. Next, the membrane was washed several times with TTBS at intervals of 5 minutes, and anti-rabbit HRP (horseradish peroxidase)-conjugated secondary antibody (Millipore) was added and reacted at room temperature for 2 hours. Protein bands were visualized by chemiluminescence using ECL Kit (Abfrontier, Seoul, Korea).

1.8. 인산화된 글리코젠 포스포릴라제 (phosphorylated glycogen phosphorylase)의 면역침강법1.8. Immunoprecipitation of phosphorylated glycogen phosphorylase

세포 분해물은 변형된 Radioimmunoprecipitation Assay Buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.25% sodium deoxycholate, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid, protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich) 및 phosphatase inhibitor cocktail (phosStop; Roche, USA))를 사용하여 준비되었다. 이후, 350 μg의 세포 분해물에 3 μg의 anti-phosphoserine antibody (Abcam)를 넣고 4℃에서 밤새 반응시키고, protein A-agarose beads (GE Healthcare)가 있는 anti-phosphoserine antibody를 넣고 4℃에서 밤새 침전시켰다. 면역블럿은 anti-GPBB antibody (Abcam)으로 수행되었다. 각 인산화 강도는 처리되지 않은 대조군으로 표준화하였다. Cell lysates were modified Radioimmunoprecipitation Assay Buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.25% sodium deoxycholate, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid, protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich) and phosphatase inhibitor cocktail ( phosStop; Roche, USA)). Thereafter, 3 μg of anti-phosphoserine antibody (Abcam) was added to 350 μg of cell lysate, reacted overnight at 4°C, and anti-phosphoserine antibody containing protein A-agarose beads (GE Healthcare) was added and precipitated overnight at 4°C. . Immunoblot was performed with an anti-GPBB antibody (Abcam). Each phosphorylation intensity was normalized to an untreated control.

1.9. 데이터 분석1.9. Data analysis

그룹 간의 차이는 unpaired Student's t-tests, Bonferroni post-hoc test와 함께 one-way 또는 two-way ANOVA (analyses of variance)로 결정되었고, p < 0.05에서 유의한 것으로 간주되었다. 데이터는 평균±SEM (standard error of the mean)으로 표기하였다. Differences between groups were determined as one-way or two-way ANOVA (analyses of variance) with unpaired Student's t-tests and Bonferroni post-hoc test, and were considered significant at p <0.05. Data were expressed as mean±SEM (standard error of the mean).

실시예 2. 피질의 일차 뇌성상세포에서 글리코젠분해 (glycogenolysis)에 관한 진토닌 또는 LPA (Lysophosphatidic acid)의 효과 및 이의 신호전달경로Example 2. Effect of gintonin or LPA (Lysophosphatidic acid) on glycogenolysis in primary cerebral astrocytes of the cortex and its signaling pathway

뇌성상세포(astrocytes)는 에너지 대사를 위해 뇌에서 글리코젠을 저장하고, [Ca²⁺]_i transients에 연결된 G protein-coupled receptor의 리간드는 뇌성상세포에서 글리코젠분해를 촉진시킨다는 것 (Dev Neurosci 20(4-5):291-299, 1998)을 근거로, 본 발명자들은 배양된 마우스 피질의 일차 뇌성상세포에서 글리코젠분해에 관한 진토닌의 효과를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 그 결과, 진토닌(GT) 또는 LPA C_18:1 을 뇌성상세포에 30분 동안 처리한 경우 농도-의존적으로 글리코젠분해가 촉진된다는 것을 확인하였다 (도 1A 및 1D). 또한, 진토닌(1 μg/mL)은 시간-의존적으로 뇌성상세포의 글리코젠분해를 촉진시켰다 (도 1B). 흥미롭게도, 진토닌-중재 뇌성상세포의 글리코젠분해는 진토닌을 처리하고 30분 후에 최대로 분해가 일어난 것으로 확인되었고, 2시간 까지는 분해가 감소되다가 다시 8시간까지는 글리코젠분해가 증가된 것으로 확인되었다 (도 1B). Cerebral astrocytes store glycogen in the brain for energy metabolism, and the ligand of the G protein-coupled receptor linked to [Ca ²⁺ ] _i transients promotes glycogen breakdown in cerebral astrocytes (Dev Neurosci). 20(4-5):291-299, 1998), the present inventors performed an experiment to confirm the effect of gintonin on glycogenolysis in primary cerebral astrocytes of cultured mouse cortex. As a result, it was confirmed that glycogen degradation was promoted in a concentration-dependent manner when gintonin (GT) or LPA C _18:1 was treated for 30 minutes on cerebral astrocytes (FIGS. 1A and 1D). In addition, gintonin (1 μg/mL) accelerated glycogenolysis of cerebral astrocytes in a time-dependent manner (FIG. 1B). Interestingly, it was confirmed that glycogenolysis of gintonin-mediated cerebral astrocytes maximally decomposed 30 minutes after treatment of gintonin, decreased by 2 hours, and increased glycogenolysis by 8 hours. Confirmed (Fig. 1B).

다음으로, 본 발명자들은 LPA1/3 수용체의 길항제인 Ki16425을 처리한 경우 또는 처리하지 않은 경우에서 뇌성상세포의 글리코젠분해에 대한 진토닌의 효과를 살펴보았다. 그 결과, Ki16425을 처리한 경우에는 진토닌 또는 LPA에 의해 촉진된 글리코젠분해가 현저하게 감소되었음을 확인하였다 (도 1C 및 1D). 또한, 뇌성상세포에 PLC (phospholipase C) 억제제인 U73122, IP₃ (inositol 1,4,5-triphosphate) 수용체의 길항제인 2-APB (2-aminoethoxydiphenyl borate) 및 세포 내 Ca²⁺ 킬레이트인 BAPTA-AM를 처리한 경우에도 진토닌에 의해 촉진된 글리코젠분해는 억제되었다 (도 1C). 상기 결과에 의해, 진토닌은 LPA1/3 수용체 신호전달경로에 의해 뇌성상세포의 글리코젠분해를 촉진시킨다는 것을 확인하였다. Next, the present inventors examined the effect of gintonin on the glycogenolysis of cerebral astrocytes in the case of treatment with or without the treatment of Ki16425, an antagonist of LPA1/3 receptor. As a result, when Ki16425 was treated, it was confirmed that glycogen decomposition promoted by gintonin or LPA was significantly reduced (FIGS. 1C and 1D). In addition, in cerebral astrocytes, the PLC (phospholipase C) inhibitor U73122, IP ₃ (inositol 1,4,5-triphosphate) receptor antagonist 2-APB (2-aminoethoxydiphenyl borate) and intracellular Ca ²⁺ chelate, BAPTA- Even in the case of treatment with AM, glycogen decomposition promoted by gintonin was suppressed (Fig. 1C). From the above results, it was confirmed that gintonin promotes glycogen degradation of cerebral astrocytes by the LPA1/3 receptor signaling pathway.

또한, 본 발명자들은 뇌성상세포의 글리코젠분해에서 ATP 또는 글루타메이트의 효과를 확인하는 실험을 수행하였다 (Dev Neurosci 20(4-5):291-299, 1998; 및 News Physiol Sci 14(5):177-182, 1999). 그 결과, ATP 또는 글루타메이트를 30분 동안 처리한 경우 농도-의존적으로 뇌성상세포의 글리코젠분해를 촉진시킨다는 것을 확인하였다 (도 1E 및 1F). 특히, 각각 10 μM의 ATP 또는 글루타메이트와 함께 0.1 μg/mL의 진토닌을 동시-처리한 경우에는 각각 단독으로 처리한 경우에 비해 뇌성상세포의 글리코젠분해에 대한 상승효과가 나타났다 (도 1E). 다만, 100 μM의 ATP 또는 글루타메이트와 함께 1 μg/mL의 진토닌을 동시-처리한 경우에는 글리코젠분해에 대한 상승효과가 보이지 않았는데 (도 1F), 이는 고농도의 리간드에 따른 포화 효과로 보여진다. 흥미롭게도, 진토닌은 형광 포도당인 2-NBDG를 사용한 실험에서 포도당 흡수(glucose uptake)에 관한 유의적인 효과가 없었다 (도 9).In addition, the present inventors performed an experiment to confirm the effect of ATP or glutamate on glycogenolysis of cerebral astrocytes (Dev Neurosci 20(4-5):291-299, 1998; And News Physiol Sci 14(5): 177-182, 1999). As a result, it was confirmed that treatment with ATP or glutamate for 30 minutes promotes glycogen decomposition of cerebral astrocytes in a concentration-dependent manner (FIGS. 1E and 1F ). In particular, in the case of co-treatment of 0.1 μg/mL of gintonin with 10 μM of ATP or glutamate, respectively, a synergistic effect on glycogenolysis of cerebral astrocytes was shown compared to the case of treatment alone (FIG. 1E ). . However, when co-treatment with 1 μg/mL of gintonin with 100 μM of ATP or glutamate did not show a synergistic effect on glycogen decomposition (Fig. 1F), which is seen as a saturation effect according to the high concentration of ligand. . Interestingly, gintonin had no significant effect on glucose uptake in the experiment using the fluorescent glucose 2-NBDG (FIG. 9).

실시예 3. 정상 산소 조건의 일차 뇌성상세포에서 글리코젠분해-관련 효소 및 글리코젠 신타제 (glycogen synthase)-관련 효소에 관한 진토닌의 효과Example 3. Effect of gintonin on glycogenase-related enzymes and glycogen synthase-related enzymes in primary cerebral astrocytes under normal oxygen conditions

본 발명자들은 진토닌 또는 LPA에 의해 촉진된 뇌성상세포의 글리코젠분해에서 포스포릴라제 키나제 (phosphorylase kinase)의 억제제인 K252a 및 글리코젠 포스포릴라제 (glycogen phosphorylase)의 억제제인 이소파고민 (isofagomine)의 효과를 확인하는 실험을 수행하였다 (Neurochem Int 36(4-5):435-440, 2000). 그 결과, 상기 두 억제제는 진토닌 또는 LPA에 의해 촉진된 뇌성상세포의 글리코젠분해를 현저하게 감소시켰음을 확인하였다 (도 2A 및 2B). 또한, 본 발명자들은 포스포릴라제 키나제에 의한 글리코젠 포스포릴라제의 인산화가 글리코젠분해의 중요 시작 단계라는 것을 근거로, 글리코젠 포스포릴라제의 인산화 정도를 평가하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 뇌성상세포에 진토닌을 처리한 경우 농도 및 시간-의존적으로 글리코젠 포스포릴라제 (glycogen phosphorylase isoenzyme BB, brain form, GPBB) 의 인산화가 향상되었음을 확인하였다 (도 2C 및 2D). 그러나, LPA1/3 수용체의 길항제인 Ki16425을 처리한 경우에는 글리코젠 포스포릴라제의 인산화가 감소되었다 (도 2C의 b). The present inventors described K252a, an inhibitor of phosphorylase kinase, and isopagomine, an inhibitor of glycogen phosphorylase in glycogenolysis of cerebral astrocytes promoted by gintonin or LPA ( isofagomine) was conducted (Neurochem Int 36(4-5):435-440, 2000). As a result, it was confirmed that the two inhibitors significantly reduced the glycogenolysis of cerebral astrocytes promoted by gintonin or LPA (FIGS. 2A and 2B). In addition, the present inventors conducted an experiment to evaluate the degree of phosphorylation of glycogen phosphorylase on the basis that phosphorylation of glycogen phosphorylase by phosphorylase kinase is an important starting step of glycogen decomposition. As a result, it was confirmed that the phosphorylation of glycogen phosphorylase isoenzyme BB (brain form, GPBB) was improved in a concentration and time-dependent manner when cerebral astrocytes were treated with gintonin (FIGS. 2C and 2D ). However, when Ki16425, an antagonist of LPA1/3 receptor, was treated, phosphorylation of glycogen phosphorylase was decreased (FIG. 2C b ).

다음으로, 본 발명자들은 글리코젠 신타제의 인산화 증가가 글리코젠분해의 감소와 연결된다는 것을 근거로, 글리코젠 신타제의 인산화에 대한 진토닌의 효과를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 그 결과, 뇌성상세포에 진토닌을 처리한 경우 처리되지 않은 대조군 세포에 비해 글리코젠 신타제의 인산화가 감소됨을 확인하였다 (도 2D). 이는 진토닌이 LPA 수용체 - PLC (phospholipase C) - 세포 내 IP₃ 수용체 - [Ca²⁺]_i transient 신호전달경로의 활성에 의한 뇌성상세포의 글리코젠분해와 연결되며, 상기 경로는 글리코젠 합성이 아닌, 글리코젠 포스포릴라제를 인산화시키는 것으로 보여진다. Next, the present inventors conducted an experiment to confirm the effect of gintonin on the phosphorylation of glycogen synthase based on the fact that the increase in phosphorylation of glycogen synthase is associated with a decrease in glycogen decomposition. As a result, it was confirmed that when the cerebral astrocytes were treated with gintonin, phosphorylation of glycogen synthase was decreased compared to the untreated control cells (FIG. 2D ). This is linked to the glycogenization of cerebral astrocytes by the activation of the LPA receptor-PLC (phospholipase C)-intracellular IP ₃ receptor-[Ca ²⁺ ] _i transient signaling pathway, and the pathway is glycogen synthesis. Rather, it appears to phosphorylate glycogen phosphorylase.

실시예 4. 정상 산소, 저산소증 또는 재산소화 조건에서 뇌성상세포의 세포형태 및 분포에 관한 진토닌의 효과Example 4. Effect of Gintonin on Cell Type and Distribution of Cerebral Astrocytes under Normal Oxygen, Hypoxia or Reoxygenation Conditions

본 발명자들은 정상 뇌성상세포를 정상 산소, 저산소증 및 재산소화 조건에서 배양하고 진토닌을 처리한 경우 세포형태 및 세포분포에 변화가 있는지 확인하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 진토닌은 정상 산소 조건에서 세포 형태에 어떠한 영향을 주지 않았고, 세포수는 약간 증가시키는 효과가 있었다 (도 3A 및 3B). 진토닌을 처리하지 않고, 12시간 동안의 저산소 조건(도 3C) 및 12시간 동안 저산소 조건 후 2시간 동안의 재산소화 조건(도 3E)의 경우에는 배양 시 세포형태 및 세포분포에서의 변화가 유도되었다. 상기 조건 하에서의 세포들은 고르게 분포되어 있지 않고 밀집되는 경향을 보였고, 정상 산소 조건의 세포들에 비해 세포 사이에서의 빈 공간이 관찰되었으며 이는 세포들 간의 연결이 적은 것으로 보여졌다 (도 3C 및 3E). 그런데, 저산소 조건 및 재산소화 조건에서도 2시간 동안 진토닌을 처리한 경우에는 정산 산소 조건에서 관찰된 것과 유사할 정도로 세포분포 및 세포형태가 다시 회복되었다 (도 3D 및 3F). 상기 결과로부터, 진토닌은 저산소증 및 재산소화에 의해 유도된 뇌성상세포의 손상으로부터 보호하는 효과가 있음을 확인하였다. The present inventors performed an experiment to determine whether there is a change in cell morphology and cell distribution when normal cerebral astrocytes are cultured under normal oxygen, hypoxia and reoxygenation conditions and treated with gintonin. As a result, gintonin did not have any effect on cell morphology under normal oxygen conditions, and had the effect of slightly increasing the number of cells (FIGS. 3A and 3B). In the case of hypoxic conditions for 12 hours without treatment with gintonin (Fig. 3C) and re-digestion conditions for 2 hours after hypoxic conditions for 12 hours (Fig. 3E), changes in cell morphology and cell distribution are induced during culture. Became. Cells under the above conditions were not evenly distributed and tended to be dense, and empty spaces between cells were observed compared to cells under normal oxygen conditions, which was shown to have fewer connections between cells (FIGS. 3C and 3E ). However, even under hypoxic conditions and reoxygenation conditions, when gintonin was treated for 2 hours, cell distribution and cell morphology were restored to a degree similar to that observed in the oxygen condition (FIGS. 3D and 3F). From the above results, it was confirmed that gintonin has an effect of protecting against damage to cerebral astrocytes induced by hypoxia and reoxygenation.

실시예 5. 저산소증 및 재산소화 조건에서 뇌성상세포의 글리코젠분해에 대한 진토닌의 효과Example 5. Effect of Gintonin on Glycogen Degradation of Cerebral Astrocytes in Hypoxia and Reoxygenation Conditions

진토닌이 뇌성상세포에서 저산소 및 재산소화 스트레스에 의해 유도된 세포형태 및 세포분포의 변화를 막는 효과가 있었고, 뇌성상세포의 글리코젠분해는 저산소 조건에서 증가하는 경향이 있다는 기존 보고(Stroke 24(6):855-63, 1993)를 근거로, 본 발명자들은 진토닌이 저산소 및 재산소화 조건에서 뇌성상세포의 글리코젠분해에 어떠한 영향을 주는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 그 결과, 진토닌-중재 뇌성상세포의 글리코젠분해는 저산소 및 재산소화 조건에서 이중효과를 보였는데, 특히, 진토닌-중재 뇌성상세포의 글리코젠분해는 저산소 조건에서 진토닌을 처리한 후 30분 및 1시간에 증가되었고, 2시간 까지 약간 증가되었으나, 12시간에서는 글리코젠분해가 감소되어 글리코젠의 양이 증가되었다 (도 4A 및 4B). 이러한 진토닌의 이중효과는 진토닌이 뇌성상세포에 작용될 때, 저산소증 후의 초기 단계에서는 뇌성상세포의 글리코젠분해를 증가시키고, 후기 단계에서는 글리코젠의 양을 증가시키는 것으로 보여진다. 유사하게도, 진토닌을 뇌성상세포에 처리하고, 12시간 동안 저산소증에 처리된 후 30분 동안의 재산소화 조건에 노출시킨 경우에는 농도-의존적으로 글리코젠분해가 촉진되었으나 (도 4C), 12시간 저산소증에 처리된 후 8시간 동안의 재산소화 조건에 노출된 경우에는 진토닌이 처리되지 않은 뇌성상세포에 비해 글리코젠의 양이 증가되었다 (도 4D). 상기 결과로부터, 저산소증 및 재산소화 조건에서 진보닌-중재 뇌성상세포의 글리코젠분해는 저산소증 또는 재산소화된 기간에 따라 이중효과를 보였음을 확인하였다. It has been reported that gintonin has the effect of preventing changes in cell morphology and cell distribution induced by hypoxia and reoxygenation stress in cerebral astrocytes, and that glycogen breakdown of cerebral astrocytes tends to increase in hypoxic conditions (Stroke 24 (6):855-63, 1993), the present inventors conducted an experiment to confirm how gintonin affects glycogenolysis of cerebral astrocytes under hypoxia and reoxygenation conditions. As a result, glycogenolysis of gintonin-mediated cerebral astrocytes exhibited a double effect under hypoxia and re-digestion conditions. In particular, glycogenization of gintonin-mediated cerebral astrocytes was performed after treatment with gintonin under hypoxic conditions. It increased at 30 minutes and 1 hour, and slightly increased until 2 hours, but at 12 hours, glycogen decomposition decreased and the amount of glycogen increased (FIGS. 4A and 4B). This dual effect of gintonin is shown to increase glycogen decomposition of cerebral astrocytes in the early stages after hypoxia, and increase the amount of glycogen in the later stages when gintonin acts on cerebral astrocytes. Similarly, when gintonin was treated with cerebral astrocytes and subjected to hypoxia for 12 hours and then exposed to reoxygenation conditions for 30 minutes, glycogen degradation was promoted in a concentration-dependent manner (Fig. 4C), but for 12 hours. When exposed to reoxygenation conditions for 8 hours after being treated with hypoxia, the amount of glycogen was increased compared to cerebral astrocytes not treated with gintonin (FIG. 4D ). From the above results, it was confirmed that glycogenolysis of jinbonin-mediated cerebral astrocytes under hypoxia and re-digestion conditions showed a double effect depending on the period of hypoxia or re-digestion.

실시예 6. 정상 산소, 저산소증 및 재산소화 조건에서 ATP 생산에 관한 진토닌의 효과Example 6. Effect of Gintonin on ATP Production in Normal Oxygen, Hypoxia and Reoxygenation Conditions

본 발명자들은 진토닌-중재 뇌성상세포의 글리코젠분해가 정상 산소, 저산소증 및 재산소화 조건에서 ATP 생산과 연결되는지 확인하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 정상 산소 조건에서 뇌성상세포에 진토닌을 처리한 경우에는 농도-의존적으로 ATP 생산이 증가되었고 (도 5A), 시간에 따른 결과에서는 진토닌을 처리한 후 30분에서 ATP 생산이 가장 증가되었고, 이후에는 약간 상승된 정도였다 (도 5B). 그러나, 뇌성상세포의 진토닌에 의해 중재된 ATP 생산의 향상은 글리코젠 포스포릴라제의 억제제인 이소파고민(isofagomine)에 의해 억제되었다 (도 5A). The present inventors conducted an experiment to confirm whether glycogenolysis of gintonin-mediated cerebral astrocytes is linked to ATP production under normal oxygen, hypoxia and reoxygenation conditions. As a result, when gintonin was treated in cerebral astrocytes under normal oxygen conditions, ATP production was increased in a concentration-dependent manner (Fig. 5A). It was increased, and thereafter slightly increased (Fig. 5B). However, the enhancement of ATP production mediated by gintonin in cerebral astrocytes was inhibited by isofagomine, an inhibitor of glycogen phosphorylase (FIG. 5A).

저산소증은 ATP 생산을 현저하게 감소시키는데, 이는 저산소 조건에서 대사적 스트레스로 인해 뇌성상세포가 손상될 수 있다는 것을 의미한다. 이러한 저산소 조건에서 진토닌을 처리한 경우 ATP 수준이 현저하게 상승되었음을 확인하였고, 반면, 이소파고민은 진토닌에 의한 ATP 생산을 억제시켰음을 확인하였다 (도 5C). 더욱이, 저산소증의 기간이 길어지면 ATP 생산은 더욱 감소되었고, 반면, 저산소 상태에서 진토닌이 처리된 경우에는 ATP 고갈이 방지되고 대조군 수준으로 ATP 생산을 유지하였음을 확인하였다 (도 5D). Hypoxia significantly reduces ATP production, meaning that in hypoxic conditions, metabolic stress can damage cerebral astrocytes. It was confirmed that the ATP level was remarkably elevated when gintonin was treated under these hypoxic conditions, whereas isopagomine inhibited ATP production by gintonin (FIG. 5C). Moreover, when the period of hypoxia was prolonged, ATP production was further reduced, whereas when gintonin was treated in hypoxia, ATP depletion was prevented and ATP production was maintained at a control level (FIG. 5D).

또한, 본 발명자들은 12시간 동안의 저산소 조건을 처리한 후 2시간 동안의 재산소화 조건을 처리하고 ATP 수준에 대한 진토닌의 효과를 확인하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 저산소 처리 후 재산소화 조건은 대조군에 비해 ATP 수준을 감소시켰으나, 진토닌을 처리한 경우에는 ATP 수준이 증가되었고, 1 μg/mL 농도에서 최대 증가 효과를 보였다 (도 5E). 이러한 진토닌의 효과는 저산소증에서와 같이 농도-의존적으로 증가되는 것은 아니었다. 시간에 따른 결과에 있어서, 진토닌은 시간-의존적으로 ATP 생산을 촉진시켰으며, 2시간에서 포화된 것으로 보여졌다 (도 5F). 정상 산소 조건에서와 같이, 저산소 조건 및 재산소화 조건에서도 이소파고민을 처리한 경우에는 진토닌에 의한 ATP 생산을 억제하였다 (도 5C 및 5E). 상기 결과로부터, 진토닌-중재 ATP 생산에서의 증가는 뇌성상세포의 글리코젠분해와 매우 관련이 있으며, 뇌성상세포에 진토닌을 처리한 경우 저산소증 및 재산소화 스트레스에 노출된 후 관찰되는 ATP 고갈을 약화시키는 것으로 확인되었다. In addition, the present inventors treated the hypoxic conditions for 12 hours and then treated the reoxygenation conditions for 2 hours and performed an experiment to confirm the effect of gintonin on the ATP level. As a result, after hypoxic treatment, the reoxygenation conditions decreased ATP levels compared to the control group, but when gintonin was treated, the ATP level was increased, showing a maximum increase effect at the concentration of 1 μg/mL (FIG. 5E ). This effect of gintonin was not increased in a concentration-dependent manner as in hypoxia. In the results over time, gintonin promoted ATP production in a time-dependent manner, and appeared to be saturated at 2 hours (Fig. 5F). As in the normal oxygen condition, when isopagomine was treated in hypoxic and reoxygenated conditions, ATP production by gintonin was suppressed (FIGS. 5C and 5E). From the above results, the increase in gintonin-mediated ATP production is highly related to the glycogenolysis of cerebral astrocytes, and ATP depletion observed after exposure to hypoxia and reoxygenation stress when gintonin is treated in cerebral astrocytes. Was found to weaken.

실시예 7. 정상 산소, 저산소증 및 재산소화 조건에서 세포 내 글루타메이드의 수준에 관한 진토닌의 효과Example 7. Effect of Gintonin on the level of glutamaid in cells under normal oxygen, hypoxia and reoxygenation conditions

글루타메이트는 주요 신경전달물질 (neurotransmitter)로서, 뇌의 정상 시냅스 활성 동안 뉴런에서 분비되는 물질이며, 뇌 허혈증 (brain ischemia)은 뉴런에서 많은 양의 글루타메이트의 분비를 유도한다고 보고되었다 (J Cereb Blood Flow Metab 5(3): 413-419, 1985; 및 Brain Res Bull 25(2): 319-324, 1990). 뉴런 밖에 글루타메이트가 축적되면 신경계에 흥분성의 신경독성이 유도되는 것이므로, 뇌성상세포의 주요 역할 중 하나는 글루타메이트의 흡수를 통해 세포 외의 글루타메이트 농도를 감소시키는 것이다 (Acta Pharmacol Sin 30(4):379-387, 2009). 뇌성상세포-중재의 글루타메이트 흡수는 일정한 ATP 공급이 필수적이며, 이를 통해 정상적인 글루타메이트의 평형을 유지할 수 있다. 이를 근거로, 본 발명자들은 정상 산소, 저산소증 및 재산소화 조건에서 진토닌에 의한 ATP 생산의 증가가 뇌성상세포의 세포 내 글루타메이트 수준의 상승과 연결되는지 확인하는 실험을 수행하였다. Glutamate is a major neurotransmitter, a substance secreted by neurons during normal synaptic activity in the brain, and brain ischemia has been reported to induce the secretion of large amounts of glutamate in neurons (J Cereb Blood Flow Metab. 5(3): 413-419, 1985; and Brain Res Bull 25(2): 319-324, 1990). Since glutamate accumulation outside neurons induces excitatory neurotoxicity in the nervous system, one of the main roles of cerebral astrocytes is to reduce the extracellular glutamate concentration through absorption of glutamate (Acta Pharmacol Sin 30(4):379- 387, 2009). Cerebral astrocyte-mediated glutamate uptake requires a constant supply of ATP, thereby maintaining a normal glutamate equilibrium. Based on this, the present inventors conducted an experiment to confirm whether the increase in ATP production by gintonin in normal oxygen, hypoxia, and reoxygenation conditions is associated with an increase in intracellular glutamate levels of cerebral astrocytes.

그 결과, 정상 산소 조건에서 진토닌을 처리한 경우 시간-의존적으로 뇌성상세포의 세포 내 글루타메이트 수준이 증가되었음을 확인하였다 (도 6B). 흥미롭게도, 진토닌에 의한 세포 내 글루타메이트 수준은 0.3 μg/mL의 농도에서 최대로 상승하였고, 높은 농도(1 및 3 μg/mL)의 진토닌에서는 글루타메이트 수준이 약간 감소한 것으로 나타났다 (도 6A). 0.3 μg/mL의 진토닌을 시간에 따라 뇌성상세포에 처리한 경우에는 30분 후에 거의 포화된 것으로 확인되었다 (도 6B). 그런데, 진토닌 (0.3 μg/mL)과 함께 글루타메이트 전달체 (glutamate transporter)의 억제제인 TBOA를 동시-처리한 경우에는 진토닌에 의해 유도된 세포 내 글루타메이트의 증가가 억제되었다 (도 6A). 상기 결과로부터, 진토닌-중재의 세포 내 글루타메이트 농도의 상승은 글루타메이트 전달체와 관련되는 것으로 확인되었다. As a result, it was confirmed that the intracellular glutamate level of cerebral astrocytes was increased in a time-dependent manner when gintonin was treated under normal oxygen conditions (FIG. 6B). Interestingly, the intracellular glutamate level by gintonin increased to a maximum at the concentration of 0.3 μg/mL, and the glutamate level was slightly decreased in the high concentration (1 and 3 μg/mL) of gintonin (Fig. 6A). When the cerebral astrocytes were treated with 0.3 μg/mL of gintonin over time, it was found to be almost saturated after 30 minutes (Fig. 6B). However, when TBOA, an inhibitor of glutamate transporter, was co-treated with gintonin (0.3 μg/mL), the increase in intracellular glutamate induced by gintonin was suppressed (FIG. 6A). From the above results, it was confirmed that the increase of the gintonin-mediated intracellular glutamate concentration was related to the glutamate transporter.

저산소 조건에 노출된 뇌성상세포는 정상 산소 조건에서의 세포에 비해 세포 내 글루타메이트 수준이 낮았고, 진토닌 (0.3 μg/mL)을 처리한 경우에는 진토닌을 처리하지 않은 세포에 비해 세포 내 글루타메이트 수준이 최대로 증가되었다 (도 6C). 또한, 진토닌은 대조군에 비해 1 내시 12시간 동안 세포 내 글루타메이트 수준을 증가시켰다 (도 6D). 저산소 후 재산소화 조건의 뇌성상세포에서도 정상 산소 조건인 대조군에 비해 세포 내 글루타메이트 수준이 낮았으나, 진토닌이 처리된 경우 대조군에 비해 농도- 및 시간-의존적으로 세포 내 글루타메이트 수준이 현저히 증가되었다 (도 6E 및 6F). 상기 결과로부터, 진토닌-중재 뇌성상세포의 글리코젠분해에서 관찰된 세포 내 ATP의 상승은 글루타메이트 전달체를 통한 글루타메이트 흡수와 연결되는 것으로 보여진다. Cerebral astrocytes exposed to hypoxic conditions had a lower intracellular glutamate level than cells under normal oxygen conditions, and when treated with gintonin (0.3 μg/mL), the intracellular glutamate level compared to cells not treated with gintonin. This was increased to the maximum (Figure 6C). In addition, gintonin increased the intracellular glutamate level for 1 hour and 12 hours compared to the control (FIG. 6D). In cerebral astrocytes under hypoxia and re-digestion conditions, the intracellular glutamate level was lower than that of the control group under normal oxygen conditions, but when gintonin was treated, the intracellular glutamate level was significantly increased in a concentration- and time-dependent manner compared to the control group ( 6E and 6F). From the above results, it is shown that the increase of intracellular ATP observed in glycogenolysis of gintonin-mediated cerebral astrocytes is associated with glutamate uptake through glutamate transporters.

실시예 8. 정상 산소, 저산소증 및 재산소화 조건에서 뇌성상세포의 세포생존율에 관한 진토닌의 효과Example 8. Effect of Gintonin on Cell Viability of Cerebral Astrocytes in Normal Oxygen, Hypoxia and Reoxygenation Conditions

본 발명자들은 정상 산소, 저산소증 및 재산소화 조건에서 뇌성상세포의 세포생존율에 관한 진토닌-중재 뇌성상세포의 글리코젠분해 효과를 확인하기 위하여, 대사 활성에 기초한 세포수로 세포생존율 및 세포증식율을 평가하는 XTT 어세이 및 BrdU (bromodeoxyuridine) 어세이를 수행하였다. 그 결과, 정상 산소 조건에서 뇌성상세포에 진토닌을 처리한 경우 농도-의존적으로 세포생존율 및 세포증식율이 증가하였다 (도 7A 및 도 10A). 또한, 12시간 동안 저산소 조건에서도 진토닌을 처리한 경우 농도-의존적으로 세포생존율 및 세포증식율이 증가하였다 (도 7B 및 도 10B). 그러나, 글리코젠 포스포릴라제의 억제제인 이소파고민이 처리된 경우에는 진토닌에 의한 세포생존율의 증가가 약화되었고 (도 7C), 이는 진토닌-중재 뇌성상세포의 글리코젠분해가 세포생존에 필수적인 역할을 하는 것으로 보여진다. In order to confirm the glycogenolysis effect of gintonin-mediated cerebral astrocytes on the cell viability of cerebral astrocytes under normal oxygen, hypoxia, and reoxygenation conditions, the present inventors determined the cell viability and cell proliferation rate with the number of cells based on metabolic activity. An XTT assay to evaluate and a bromodeoxyuridine (BrdU) assay were performed. As a result, when the cerebral astrocytes were treated with gintonin under normal oxygen conditions, the cell viability and cell proliferation rate were increased in a concentration-dependent manner (FIGS. 7A and 10A ). In addition, when gintonin was treated even under hypoxic conditions for 12 hours, the cell viability and cell proliferation rate were increased in a concentration-dependent manner (FIGS. 7B and 10B ). However, when isopagomine, an inhibitor of glycogen phosphorylase, was treated, the increase in cell viability due to gintonin was weakened (Fig. 7C), which is due to glycogen decomposition of gintonin-mediated cerebral astrocytes. Seems to play an essential role in

그런데, 저산소 처리 후 재산소화 조건에서는 진토닌에 의한 세포생존율에 있어 정상 산소 및 저산소 조건에서 관찰 된 것에 비해 약간 다른 패턴을 보였다. 저산소 처리 후 30분 및 2시간 동안의 재산소화 조건에서는 0.3 μg/mL의 진토닌이 처리된 경우 최대의 세포생존율이 보였다 (도 7D 및 7E). 저산소 처리 후 8시간 동안의 재산소화 조건에서는 진토닌이 농도-의존적으로 세포생존율 향상시키는 것으로 나타났다. 재산소화 조건에서도 이소파고민은 진토닌에 의해 증가된 세포생존율을 약화시켰다 (data not shown). 흥미롭게도, 저산소 조건에서의 세포생존율은 재산소화 조건에 비해 낮았다. 상기 결과로부터, 진토닌은 저산소증 후 재산소화 과정 동안에 적용될 때 더욱 보호 효과가 뛰어날 수 있음을 확인하였다. However, in the re-oxygenation condition after hypoxic treatment, a slightly different pattern was observed in the cell viability by gintonin compared to that observed under normal oxygen and hypoxic conditions. In the reoxygenation conditions for 30 minutes and 2 hours after hypoxic treatment, the maximum cell viability was observed when 0.3 μg/mL of gintonin was treated (FIGS. 7D and 7E). It was found that under the conditions of reoxygenation for 8 hours after hypoxic treatment, gintonin improved the cell viability in a concentration-dependent manner. Even under reoxygenation conditions, isopagomine weakened the cell viability increased by gintonin (data not shown). Interestingly, the cell viability under hypoxic conditions was lower than that of reoxygenation conditions. From the above results, it was confirmed that gintonin may have an excellent protective effect when applied during the reoxygenation process after hypoxia.

따라서, 진토닌은 저산소증에 의해 유도된 세포생존율의 감소를 회복시키는 효과가 있으며, 저산소증 및 재산소화 스트레스에 노출된 후 진토닌-중재 뇌성상세포의 글리코젠분해가 뇌성상세포의 생존에 기여할 수 있음을 확인하였다. Therefore, gintonin has the effect of recovering the decrease in cell viability induced by hypoxia, and glycogenization of gintonin-mediated cerebral astrocytes after exposure to hypoxia and reoxygenation stress can contribute to the survival of cerebral astrocytes. Confirmed that there is.

Claims

A pharmaceutical composition for preventing or treating brain injury diseases comprising gintonin and glutamate as active ingredients.

The method of claim 1,
The composition characterized in that the gintonin and glutamate promote astrocytic glycogenolysis of cerebral astrocytes.

The method of claim 1,
The composition, characterized in that the gintonin increases the production of ATP and absorption of glutamate in cerebral astrocytes.

The method of claim 1,
The composition characterized in that the gintonin protects cerebral astrocytes from hypoxia and reoxygenation stress.

The method of claim 1,
The brain injury disease is hypoxic brain injury, ischemic brain disease, stroke, cerebral infarction, cerebral ischemia, thrombosis, embolism, transient ischemic attack, leukoplasm or small infarction.

delete

Gintonin (Gintonin) and a food composition for preventing or improving brain damage disease comprising glutamate as active ingredients.

delete

The method of claim 7,
The brain injury disease is hypoxic brain injury, ischemic brain disease, stroke, cerebral infarction, cerebral ischemia, thrombosis, embolism, transient ischemic attack, leukoplasm or small infarction.

A method for preventing or treating brain injury diseases comprising administering a pharmaceutically effective amount of gintonin and glutamate to an individual other than humans.

delete

A method of promoting astrocytic glycogenolysis of cerebral astrocytes comprising the step of treating gintonin in vitro into cerebral astrocytes (astrocyte).

A method of increasing ATP production in cerebral astrocytes, comprising the step of processing gintonin into cerebral astrocytes (astrocyte) in vitro.

A method for increasing the absorption of glutamate in cerebral astrocytes comprising the step of treating cerebral astrocytes with gintonin in vitro.