KR102156684B1

KR102156684B1 - 수면장애 판별용 마커

Info

Publication number: KR102156684B1
Application number: KR1020190021630A
Authority: KR
Inventors: 차성원; 이보영; 최유래; 이시우; 백영화
Original assignee: 한국한의학연구원
Priority date: 2019-02-25
Filing date: 2019-02-25
Publication date: 2020-09-17
Also published as: KR20200103909A

Abstract

본 발명은 수면장애 판별 또는 예측 마커인 miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 수면장애 판별 또는 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 수면장애 판별 또는 예측용 키트 및 상기 마커의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 수면장애 판별 또는 예측을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 수면장애 판별 또는 예측용 조성물을 이용하면, 자각증상이 없는 수면장애를 객관적으로 판정할 수 있으므로, 수면장애 및 이로부터 유발되는 다양한 질환의 예방 및 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

수면장애 판별용 마커 {A marker for the determination of sleep disturbance}

본 발명은 수면장애 판별용 마커에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 수면장애 판별 또는 예측 마커인 miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 수면장애 판별 또는 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 수면장애 판별 또는 예측용 키트 및 상기 마커의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 수면장애 판별 또는 예측을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

수면장애란 건강한 수면을 취하지 못하거나, 충분한 수면을 취하고 있음에도 낮 동안에 각성을 유지하지 못하는 상태, 또는 수면리듬이 흐트러져 있어서 잠자거나 깨어 있을 때 어려움을 겪는 상태를 포함한다.

수면장애의 종류에는 불면증, 기면증, 하지불안증후군, 코골이/수면무호흡증으로 나눌 수 있다. 불면증은 잠들기 힘들거나, 잠은 들지만 자주 깨고, 새벽에 너무 일찍 잠에서 깨어 수면부족 상태가 되어, 이로 인해 낮동안 피로감, 졸음, 의욕상실 등의 결과를 초래하는 대표적인 수면장애이다. 과면증 (수면과다증) 은 야간에 최소 7시간 이상 수면을 취하고서도 낮에 과도한 졸음을 호소하는 경우 의심할 수 있다. 기면증도 주간의 과도한 수면과 관련된 질환으로, 누를 수 없는 졸음이 나타나 십 수분간 갑작스럽게 잠에 빠져들기도 하며, 이는 먹거나, 말하거나 운전하는 등 보통 졸릴만하지 않은 상황에서도 나타날 수 있다. 하지불안증후군은 잠들 무렵 다리(특히 종아리 부근)에 느껴지는 말로 표현하기 힘든 불편감으로 잠들기 힘들어, 수면부족을 초래하는 수면장애이다. 코골이가 있는 사람의 75%는 수면 중에 호흡이 멈추는 수면무호흡증을 동반하는데, 수면무호흡증이 하룻밤에 40회 이상 나타나는 경우에는 깊은 잠을 자지 못하고, 체내 산소 공급이 어렵게 되어, 낮 동안 피로감, 자도 잔 것 같지 않은 느낌, 아침 두통, 무기력감, 중력과 기억력 저하, 우울감 등을 유발한다.

이러한 수면장애를 치료하기 위하여는, 무엇보다도 수면장애가 발생되었는지의 여부를 확인하여야 하지만, 수면이라는 특성상 자각증상이 없어, 수면장애가 발생되었는지를 확인하기가 어렵다는 문제점이 있다. 이에, 수면장애가 발생되었는지를 확인하는 방법을 개발하려는 연구가 활발히 진행되었다. 예를 들어, 일본등록특허 제4990513호에는 트랜스사이레틴(TTR) 유전자를 검출할 수 있는 프라이머 염기쌍을 이용하여 수면장애의 발생여부를 확인하는 기술이 개시되어 있고, 일본공개특허 2014-085214에는 염, 아미노산, 지질, 당질, 아민, 아미드, 베타인, 카르보닐 화합물, 히드록시카르보닐 화합물, 글리세롤, 크레아틴, 단백질, 핵산 등의 비율을 이용하여 수면장애의 발생여부를 확인하는 기술이 개시되어 있다.

한편, 마이크로 RNA(microRNA, miRNA)는 길이가 19 내지 25개의 뉴클레오티드를 가지는 짧은 단일가닥 리보핵산(RNA)으로, 세포내에서 발현되어 많은 유전자의 발현을 조절한다고 알려져 있다. 현재까지는 인간에서 약 2000여종이 발견되었는데, 하나의 miRNA가 여러 종류의 mRNA를 조절하는 것이 가능하기 때문에, 인간 유전자 중의 약 30%가 miRNA에 의해 조절될 것이라고 예측되고 있다.

miRNA는 세포내에서 자연적으로 만들어지며, 대부분 RNA 폴리머라제 II(RNA polymerase II) 에 의해 일차 miRNA(primary miRNA)로 전사된 후, 핵 내에서 Rnase III 효소인 드로샤(drosha)와 파샤(pasha, DGCR8) 등에 의해 전구체 miRNA(precursor miRNA)로 절단된다. 이후, 전구체 miRNA는 엑스포틴-5(Exportin5)에 의해 핵에서 세포질로 이동하고, 세포질내에서 RNase III 효소인 다이서(dicer)에 의하여 짧고 불완전한 이중가닥의 miRNA로 제조된다. 상기 제조된 miRNA는 리스크(RISC, RNA-induced silencing complex) 단백질 복합체와 결합하여 단일가닥으로 분리되며, 분리된 단일가닥의 miRNA는 표적 mRNA의 3'-UTR(untranslated region)의 염기서열에 상보적으로 결합하여 리보솜(ribosome)에 의해 mRNA가 단백질로 번역되는 과정을 억제하거나 또는 표적 mRNA가 분해되도록 하여 유전자의 발현을 억제하는 것으로 알려져 있다.

혈청 내에서 miRNA는 매우 안정적으로 존재하며 심혈관질환 및 여러 종류의 암들에서 정상인들에 비해 발현량이 유의미하게 변화됨이 보고되었다. 따라서 이런 질환들의 진단에 매우 유용한 바이오마커로 제시 되고 있다(Xi Chen et al., Cell Research, 2008). 그러나, 아직까지는 수면장애 판별 또는 예측용 마커로서 miRNA의 용도에 대해서는 밝혀진 바가 없다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 수면장애를 판별 또는 예측할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 수면장애가 있는 성인 남녀 개체군에서 정상 개체에 비해 발현량이 변화되는 2종의 miRNA를 사용할 경우, 수면장애를 판별 또는 예측할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 이루어진 miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 수면장애 판별 또는 예측용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 수면장애 판별 또는 예측용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 수면장애 판별 또는 예측을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.

본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시양태는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 이루어진 miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 수면장애 판별 또는 예측용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "miRNA"란, 대부분 염색체 상의 인트론 등에 끼어 들어가 있으며, 이는 전사가 일어난 후 드로사(Drosha) 등에 의해 프로세싱되어 전구체 형태 (precursor-miRNA, precursor form)로 전환되는 것을 의미한다. 이 후 엑스포틴 5 (exportin 5)에 의해서 핵을 빠져 나와 다이서(Dicer)에 의해 약 18 에서 22 bp 정도 길이의 성숙된 형태의 miRNA로 바뀌게 된다. 이러한 성숙된 miRNA는 RISC(RNA induced silencing complex)와 결합하여 기능을 나타내게 된다(Nat Rev Mol Cell Biol 6, 376-785; 2005). 본 발명에서는 miRNA는 microRNA 또는 마이크로 RNA 등으로 혼재되어 사용될 수 있다.

본 발명에서 제공하는 상기 miRNA는 수면장애의 판별 또는 예측에 사용될 수 있는 것이면 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, hsa-miR-4433b-3p 또는 hsa-miR-619-5p가 될 수 있고, 다른 예로서, 상기 hsa-miR-4433b-3p 또는 hsa-miR-619-5p의 isoform 형태가 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 서열번호 1 또는 2의 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 단편이 될 수 있다.상기 miRNA의 서열은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 구체적으로, 상기 hsa-miR-4433b-3p는 서열번호 1 일 수 있으며, 상기 hsa-miR-619-5p는 서열번호 2 일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "miRNA isoform"은 isomiR은 기준 miRNA 서열에 대해 변이를 갖는 서열을 의미한다. 예시적으로, miRNA의 코어 서열은 동일하나 코어 서열의 앞 뒤에 염기서열 일부가 추가 또는 삭제된 것이 될 수 있다. miRBase로부터 miRNA 시퀀스를 얻을 수 있으며, isomiR 발현 프로파일은 인종, 인구, 성별 의존성을 나타낼 수 있음이 알려져 있다.

본 발명에서 제공하는 상기 miRNA isoform은 miRNA와 동일하게 수면장애의 판별 또는 예측에 사용될 수 있는 것이면 제한되지 않는다. 본 발명에서는 miRNA isoform은 microRNA isoform 또는 isomiR 등으로 혼재되어 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 각 miRNA는 상기 각 서열번호로 기재한 miRNA 서열뿐만 아니라, 상기 서열과 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95%이상, 특히 구체적으로는 97% 이상의 상동성을 갖는 miRNA 서열을 포함할 수 있다. 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 상기 각 miRNA과 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 miRNA을 나타내는 서열이라면 제한 없이 포함한다. 또한, 이러한 상동성을 갖는 miRNA 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 miRNA 서열도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

본 발명에서 사용되는 용어 "수면장애"란 수면장애란 건강한 수면을 취하지 못 하거나, 충분한 수면을 취하고 있음에도 낮 동안에 각성을 유지하지 못 하는 상태 또는 수면리듬이 흐트러져 있어서 잠자거나 깨어 있을 때 어려움을 겪는 상태를 포함하는 상태를 의미한다.

상기 수면장애 상태인 개체는 PSQI 수면장애 설문 (도 2)에서 점수가 5점이하이고, 체질량지수(BMI) 정상범위(18.5kg/m² 이상, 25kg/m² 미만)에 속하며, 수면에 영향을 미칠만한 특별한 질병력이 없는 개체이며, 경추부의 외상 혹은 기질적인 질환, 약물 복용, 임신, 수유 등의 원인에 의하여 수면장애 상태를 나타내거나, 우울증, 기타 병력, 약물 복용, 임신, 수유 등의 원인에 의하여 수면장애 상태를 나타내는 것으로 추정되는 개체는 제외된다.

본 발명에서 사용되는 용어 "판별 또는 예측"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 일체의 행위를 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 판별 또는 예측은 수면장애의 진행 또는 발병 여부를 확인하는 것으로 해석될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제"란, 상기 miRNA, 이의 isoform 또는 이의 단편의 발현 여부를 확인하는 방법에 사용되는 제제를 의미한다. 예를 들어, RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅(Northern blotting), 유전자 칩 분석법 등의 방법에 사용되는 표적 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 또는 프로브가 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에서 사용되는 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "프로브"란, 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링될 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법,

또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서 수면장애를 판별 또는 예측한 결과, 정상인과 비교하여 남성 또는 여성에서 서열번호 1의 miRNA의 발현량이 하향 조절되는 결과를, 여성에서 서열번호 2의 miRNA의 발현량이 하향 조절되는 결과를 확인하였다(도 4).

이러한 결과를 통하여, 상기 miRNA들은 수면장애가 진행됨에 따라 발현량이 정상군에 비하여 유의하게 차이가 나타남을 확인할 수 있었고, 본 발명의 조성물을 이용하면 수면장애를 효과적으로 판별 또는 예측할 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 다른 실시양태는 상기 수면장애 판별 또는 예측용 조성물을 포함하는 수면장애 판별 또는 예측용 키트를 제공한다.

본 발명의 상기 키트는 수면장애가 의심되는 개체의 시료로부터 상기 miRNA의 발현 수준을 측정함으로써 수면장애의 발생여부를 판별 또는 예측하는데 사용될 수 있는데, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 miRNA, 이의 isoform, 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머 또는 프로브 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수도 있다.

예를 들어, miRNA의 발현 수준을 측정하기 위한 판별 또는 예측 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RTPCR 키트는, 상기 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

다른 예시로서, 본 발명의 키트는 유전자 칩 분석법을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. 유전자 칩 분석용 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 수면장애 판별 또는 예측을 위한 정보제공방법을 제공하는데, 구체적으로, (a) 수면장애가 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 서열번호 1 또는 2의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 miRNA의 발현 수준과 정상 대조군 시료의 해당 hsa-miR-4433b-3p 및 hsa-miR-619-5p의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함한다.

상기 수면장애에 대하여는 상술한 바와 동일하다.

상기 (a) 단계에 기재된 용어 "개체"란, 수면장애가 의심되는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 (a) 단계에 기재된 용어 "생물학적 시료"란, 상기 개체로부터 분리되어, 상기 miRNA의 수준을 측정할 수 있는 대상이 되는 조직, 세포, 혈액, 체액 등을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 시료는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 혈액시료가 될 수 있고, 다른 예로서, 혈액으로부터 분리된 혈청, 혈장 등이 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 혈액으로부터 분리된 RNA가 될 수 있다.

상기 (b) 단계에 기재된 용어 "정상 대조군"이란, 수면장애가 발생되지 않은 정상 개체를 의미한다. 예를 들어, 6개월 이내 수면장애 및 일반건강에 불편증상이 없는 개체가 될 수 있다.

상기 (b) 단계에서 비교한 수면장애가 의심되는 개체의 miRNA의 발현 수준이 정상 대조군의 miRNA의 발현 수준에 비하여, 상대적으로 낮은 수준을 나타내는 경우, 상기 개체에서 수면장애가 발생한 것으로 판별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 수면장애가 의심되는 개체에서 측정된 miRNA의 발현 수준은 정상 대조군에서 측정된 miRNA의 발현 수준의 20 내지 50%가 될 수 있다.

본 발명에서 제공하는 수면장애 판별 또는 예측용 조성물을 이용하면, 자각증상이 없는 수면장애를 객관적으로 판정할 수 있으므로, 수면장애 및 이로부터 유발되는 다양한 질환의 예방 및 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 전체적인 실험의 모식도이다.
도 2는 수면 설문(PSQI, Pittsburgh Sleep Quality Index)을 나타낸다.
도 3은 수면장애군과 대조군 선정 및 제외 기준을 나타낸다.
도 4a 및 4b는 2차 검증집단 내 수면장애 RT-qPCR 분석 결과를 나타내는 것이다. 도 4a는 대조군과 수면장애군에서의 Has-miR-4433b-3p의 발현량을 비교한 결과를 나타낸 그래프이며, 4b는 대조군과 수면장애군에서의 Hsa-miR-619-5p의 발현량을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 수면장애 관련 두 개 검증 집단 대상 ROC curve 분석 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 연구대상자 선정

실시예 1-1. NGS 및 1차 검증 대상자

도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 전체적인 연구 방법을 도식화 하였다. 반복적인 수면장애 증상을 이유로 한방병원을 내원한 사람들을 대상으로 NGS와 1차 검증을 실시하였으며, 도 2의 Pittsburgh sleep quality index(PSQI) 수면장애 설문 점수가 확보된 40명(남자 17명과 여자 23명)을 수면장애군으로 설정하고, 주관적으로나 대사증후군 요소로나 건강 상태가 양호한 건강군 중에서 수면장애군 숫자에 맞춰 40명(남자 20명과 여자 20명)을 대조군으로 설정하였다. 수면장애군 40명 중에서 PSQI 점수가 높은 상위 10명을 NGS 분석에 사용하고 나머지 30명은 RT-qPCR 1차 검증 분석에 사용하는 것으로 나누었으며, 대조군도 NGS 분석을 위한 10명과 1차 검증을 위한 30명으로 나누었다. miRNA NGS(Next Generation Squencing) 분석을 위해 수면장애군과 대조군에서 각 10명씩(남녀 5명씩)을 배정하였고, RT-qPCR 1차 검증에서는 NGS에서 사용하지 않은 수면장애군과 대조군 각 30명씩을 배정하였다. 선정 및 제외 기준은 도 3에 작성된 것과 같다.

실시예 1-2. 2차 검증 대상자

2차 RT-qPCR 검증을 위해서 실시예 1-1의 NGS 및 1차 검증 대상자에서 사용하지 않은 대상군으로 추가적인 수면장애군과 대조군을 선별하였다. 2차 검증을 위한 수면장애군 선별은 지속적이고 반복적인 피로 증상을 이유로 한방병원을 내원한 사람들 중에서, PSQI 수면장애 설문 점수 5점보다 높고, 체질량지수(BMI) 정상범위(18.5kg/m² 이상, 25kg/m² 미만)에 속하며, 대사증후군과 수면에 영향을 미칠만한 특별한 질병력이 없는 사람들로 49명(남자 23명과 여자 26명)을 선정하였다.

건강군은 앞서 선별 및 제외 기준이 기술된 건강인 집단에서 수면장애군 숫자에 맞춘 50명(남녀 24명, 여자 26명)을 대조군으로 설정하였으며, PSQI 수면장애 설문 점수가 5점이하이고, 체질량지수(BMI) 정상범위(18.5kg/m² 이상, 25kg/m² 미만)에 속하며, 수면에 영향을 미칠만한 특별한 질병력이 없는 사람들로 하였다.

실시예 2. NGS 분석

실시예 2-1. 혈청 내 RNA 분리

상기 실시예 1-1에서 선정한 수면장애군 10명 및 대조군 10명으로부터 각각의 혈액시료를 수집하고, 이로부터 각각의 혈청을 분리하였다. 상기 1.5 ㎖ 혈청에서 miRNeasy Serum/Plasma kit(QIAGEN)을 이용하여 전체 RNA를 분리한 후, Bioanalyzer(Agilent Technologies)를 이용하여 extracellular RNA의 quality check를 실시하였다.

실시예 2-2. DNA 라이브러리 제작

샘플 마다 10 ng extracellular RNA를 input으로하여 NEBNext® Multiplex Small RNA Library Prep Set을 이용해 miRNA 길이에 맞는 것들을 대상으로 cDNA 라이브러리를 제작하였다.

실시예 2-3. Quaqlity control

Illumina Nextseq 500(Illumina) 장비를 이용하여 제작된 cDNA 라이브러리 염기서열을 분석하고, 불필요한 정보(리이브러리 제작시 발생한 어뎁터 다이머)와 낮은 퀄리티(Read length가 15 nt 미만)를 보이는 서열정보들을 FASTQ Toolkit app(Illumina)을 사용하여 제거하였다.

실시예 2-4. RNA 염기서열분석

Small RNA profiling analysis를 과정을 거치면서 데이터 전처리와 quality check를 수행하였다. miRNA 별로 전체 20개 샘플(수면장애군 10개, 대조군 10개)의 50% 이상 0인 count 값을 가지는 miRNA는 분석에서 제외함으로써, 총 2,588개 mature miRNA 중에서 2,290개를 제외한 298개 miRNA를 선별하였다. 염기서열(read sequence)들의 정성적 분석(인간유전체와 miRNA 데이터베이스를 이용한 mapping)과 정량적 분석(normalized read count 분석)을 진행하였다.

실시예 2-5. miRNA들의 발현량 차이 통계 분석

수면장애군과 대조군 사이에 miRNA들의 발현량 증감비율(로그변환)과 통계적 유의성(P-value < 0.05)들을 DESeq2 알고리즘의 nbinomWaldTest를 이용하여 분석하였다.

실시예 2-6. NGS 분석 결과 37개 수면장애 연관 후보 miRNA 선정

Normalized mean count에 대한 log2 fold change 값을 확인해보면, 대조군 10명 대비 수면장애군 10명에 대하여(남녀 각각 5명씩) 양(Read count)이 유의미하게(P < 0.05) 증가 또는 감소되는 miRNA 37개(표 1)를 선별하며, RT-qPCR을 이용한 검증 분석(1차 & 2차)을 수행하였다.

실시예 3. NGS miRNA 검증(RT-qPCR)

실시예 3-1. 혈청 내 miRNA 분리

상기 실시예 2-1에서 사용된 것과 동일한 0.4 ㎖ 혈청에 spike-in control RNA(Cel-miR-39)를 첨가한 후, Mirvana Paris kit(Ambion)을 이용하여 혈청으로부터 전체 RNA를 분리하였다.

실시예 3-2. cDNA 제작

TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit(Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 miRNA에 대한 cDNA를 제작하였다.

실시예 3-3. RT-qPCR 분석

각각의 miRNA 특이적인 TaqMan 프로브와 TaqMan PreAmp master mix(Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 예비증폭(12 cycle) 시킨 후, TaqMan small RNA assay/TaqMan universal PCR Master mix II(Thermo Fisher Scientific)과 real-time PCR 시스템(LightCycler® 480 system, Roche) 장비를 사용하여 miRNA들의 정량적 분석을 진행하였다.

실시예 3-4. miRNA들의 발현량 차이 통계분석

miRNA들의 Ct(threshold cycle) 값을 spike-in control RNA(Cel-miR-39) Ct 값으로 실험적 오차에 대한 보정을 한 후에, 수면장애군과 대조군 사이에 miRNA들의 발현량 증감비율에 로그변환을 한 후 통계적 유의성(P-value < 0.05)들을 T-test 방법으로 분석하였다.

실시예 3-5. 1-2차 RT-qPCR 분석 결과 2개 miRNA 검증

NGS 분석에서 얻어진 37개 miRNA에 대해서 1차와 2차 RT-qPCR 검증을 실시예 3-1에서 3-4까지 기술한 방법으로 동일하게 진행하였다. 순차적으로 1차와 2차 RT-qPCR 검증을 수행하였으며, 37개 miRNA를 실시예 1-1에서 기술한 1차 검증 대상자 60명(수면장애군 30명, 대조군 30명)에 대해서 진행한 후에, 1차에서 검증된 miRNA를 실시예 1-2의 2차 검증 대상자 99명(수면장애군 49명, 대조군 50명)에 대해서 추가로 진행하여 최종 검증된 miRNA를 확보하였다.

RT-qPCR 분석으로 1차 수면장애 연관 miRNA를 검증한 결과, 6개 miRNA(hsa-miR-296-3p, hsa-let-7a-5p, hsa-miR-1273d, hsa-miR-4433b-3p, hsa-miR-642a-3p, hsa-miR-619-5p)가 NGS 결과와 경향성이 일치하면서 유의미한 결과를 보였다.

도 4a 및 4b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 1차 검증된 6개 miRNA를 대상으로 2차 검증 대상자 99명(수면장애군 49명, 대조군 50명)에 대해서 RT-qPCR 분석으로 수면장애 연관 miRNA를 검증한 결과, 최종 2개 miRNA(hsa-miR-4433b-3p, hsa-miR-619-5p)가 NGS와 1차 검증 결과와 경향성이 일치하면서 유의미한 결과를 보였다. 도 4a 및 도 4b는 대조군과 수면장애군에서 hsa-miR-4433b-3p 또는 hsa-miR-619-5p 각각에 대한 발현수준을 비교하여 box plot으로 나타낸 결과로, 대조군에 비해 수면장애군에서 두 miRNA 모두 낮은 발현수준을 확인하였다. 또한, 성별로는 남성에서는 hsa-miR-4433b-3p가 재현성이 있었던 반면에, 여성에서는 2개 miRNA 모두 재현성을 나타냈다.

실시예 4. ROC(Receiver Operating Curve) 분석

SPSS 통계프로그램을 이용하여 나이, 성별, miRNA 발현량을 변수로 하는 로지스틱회귀분석 모델을 이용하여 각각의 샘플들에 대해 수면장애 예측 확률 값, 민감도(sensitivity), 1-특이도(specificity)를 계산하였다.

상기 계산된 결과 값들을 바탕으로 SPSS 프로그램을 이용하여 x축을 1-특이도로 y축을 민감도로 하는 ROC를 그리고, 판별 정확도를 의미하는 AUC(Area Under the Curve)값과 유의성을 보여주는 P 값을 계산하였다.

2개의 miRNA의 ROC 분석에서 나온 AUC 분석 결과, 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 1차 검증 집단 60명에서의 두 개 miRNA의 통합 AUC 값은 93%였으며, 2차 검증 집단 99명에서의 통합 AUC 값은 86%로 확인하였다. 따라서 두 개의 miRNA가 수면장애를 판별할 수 있는 객관적 생체 지표로 활용되는 것에 대한 가능성을 보여주었다.

이상의 내용을 종합하면, 본 발명에서 검증된 2개의 miRNA (hsa-miR-4433b-3p와 hsa-miR-619-5p)를 수면장애 판별용 마커로 활용함으로써, 생물학적 마커를 통하여 객관적으로 수면장애 상태를 판별 또는 예측할 수 있음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Korea Institute of Oriental Medicine <120> A marker for the determination of sleep disturbance <130> KPA190184-KR <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA <400> 1 caggaguggg gggugggacg u 21 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA <400> 2 gcugggauua caggcaugag cc 22

Claims

서열번호 1 또는 서열번호 2로 이루어진 miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 수면장애 판별 또는 예측용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 제제는 miRNA의 isoform의 발현수준을 측정하는 것인, 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 제제는 상기 miRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것인, 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는, 수면장애 판별 또는 예측용 키트.
제 4항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 유전자 칩 키트인 것인 수면장애 판별 또는 예측용 키트.
(a) 수면장애가 의심되는 개체로부터 분리된 혈액 시료에서 서열번호 1 또는 2의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 측정된 miRNA의 발현 수준과 정상 대조군 시료의 해당 miRNA의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하는, 수면장애 판별 또는 예측을 위한 정보제공방법.
제 6항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 비교한 수면장애가 의심되는 개체의 miRNA의 발현 수준이 정상 대조군의 miRNA의 발현 수준에 비하여, 상대적으로 낮은 수준을 나타내는 경우, 상기 개체에서 수면장애가 발생한 것으로 판별하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 정보제공방법.