KR102142434B1 - Method for Manufacturing Animal Model with Stress Induced Hearing Loss - Google Patents
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Abstract
본 발명은 스트레스를 이용한 난청 동물 모델의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 랫트를 흔들기 (shaking) 및 가열 (heating)을 포함하는 스트레스에 노출시켜 돌발성 난청이 유도된 난청 동물 모델의 제조에 관한 것이다. 본 발명에 따른 스트레스를 이용한 난청 동물 모델의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 스트레스성 돌발성 난청 동물 모델은 스트레스성 난청 질환 연구에 적용할 수 있으므로, 스트레스성 돌발성 난청 질환 치료제 및 치료법 개발에 매우 유용하다.The present invention relates to a method for manufacturing an animal model of hearing loss using stress, and more particularly, to a method of manufacturing an animal model of hearing loss induced by sudden hearing loss by exposing the rat to stress including shaking and heating. . The method for manufacturing a hearing loss animal model using stress according to the present invention and the stress-induced hearing loss animal model prepared by the above method can be applied to the study of stress-induced hearing loss disease, and are very useful for the development of therapeutic and therapeutic methods for stress-induced hearing loss disease. .
Description
본 발명은 스트레스를 이용한 난청 동물 모델의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 랫트를 흔들기 (shaking) 및 가열 (heating)을 포함하는 스트레스에 노출시켜 돌발성 난청이 유도된 난청 동물 모델의 제조에 관한 것이다.The present invention relates to a method for manufacturing an animal model of hearing loss using stress, and more particularly, to a method of manufacturing an animal model of hearing loss induced by sudden hearing loss by exposing the rat to stress including shaking and heating. .
말이나 소리를 듣는 것에 어려움이 생기는 난청은 크게 전도성 난청과 감각신경성 난청으로 나뉘는데, 그 중 감각신경성 난청이란 내이와 청각 신경의 문제로 인해 난청이 생기는 것을 말한다. 원인은 다양하며 선천성과 후천성으로 나눌 수 있다. 선천성 난청은 유전적인 문제나 태아기 때의 미숙한 발달로 인해 생겨나며 후천성 난청은 돌발성, 소음성, 약물 중독에 의한 난청, 노화성 난청 등으로 나눌 수 있다. Hearing loss, which causes difficulty hearing words or sounds, is largely divided into conductive hearing loss and sensorineural hearing loss. Among them, sensorineural hearing loss refers to hearing loss caused by problems of the inner ear and hearing nerves. The causes are various and can be divided into congenital and acquired. Congenital hearing loss is caused by genetic problems or premature development in the prenatal period, and acquired hearing loss can be divided into sudden hearing, noise, drug-induced hearing loss, and aging hearing loss.
내이(inner ear)에는 코르티 기관이라는 청각 기관이 있어 내이질환이 있는 경우에 난청(hearing loss)이 발생하는데, 이러한 난청 중 돌발성 난청(sudden sensorineural hearing loss)은 연속되는 3주파수에서 적어도 30dB 이상의 청력감소가 3일 이내에 갑자기 발생하는 것을 말한다. The inner ear has a hearing organ called the Corti organ, which causes hearing loss when there is an inner ear disease. Sudden sensorineural hearing loss among these hearing loss decreases hearing by at least 30dB at 3 consecutive frequencies. It means that it occurs suddenly within 3 days.
돌발성 난청은 인구 10만명 당 5 내지 20명 정도에서 발생하는 응급 내이질환 중 하나로 알려져 있으며 (Fetterman BL et al., Am J Otol 17:529-36, 1996), 우리나라에서는 매년 5000명 이상 환자가 발생하는 것으로 보도된 바 있다 (http://health.chosun.com/site/data/html_dir/2017/08/24/ 2017082401733.html). 건강보험심사평가원 자료에 따르면 돌발성 난청 환자가 2012년 5만 9571명에서 2016년 7만 5937명으로 4년 동안 29% 증가하였다. 돌발성 난청은 주로 50대 이상에서 발생하는 질환이었지만, 최근 여러 스트레스 요인으로 인해 20~30대의 비교적 젊은 환자가 늘고 있다. Sudden hearing loss is known as one of the emergency inner ear diseases that occurs in about 5 to 20 people per 100,000 people (Fetterman BL et al., Am J Otol 17:529-36, 1996), and more than 5000 patients occur annually in Korea It has been reported to do so (http://health.chosun.com/site/data/html_dir/2017/08/24/ 2017082401733.html). According to the data from the Korea Health Insurance Review and Assessment Service, the number of patients with sudden hearing loss increased by 29% in 4 years from 5,9571 in 2012 to 7,937 in 2016. Sudden hearing loss was primarily a disease occurring in people in their 50s or older, but recently, relatively young patients in their 20s and 30s are increasing due to various stressors.
돌발성 난청의 주요원인 중 하나로 스트레스가 거론되고 있다 (Schmitt C et al., Int Tinnitus J 6(1):41-9, 2000). 이에 대한 가설은 스트레스로 인해 스트레스 호르몬인 코르티솔 (cortisol)이 방출되는데, 이 코르티솔은 내이에서 당질코르티코이드 수용체 (glucocorticoid receptor) 및 여러 수용체와 결합 및 작용하며, 내림프의 항상성에 영향을 미친다는 것이다 (Canlon B et al., Hear Res 226 (1-2):61-9, 2007). 다른 가설로는 과도한 스트레스에 의해 코르티솔이나 카테콜아민 (catecholamine)과 같은 스트레스 호르몬이 직접적으로 혈관을 수축시키고 유모세포로의 산소공급이 감소되는 문제를 일으켜 돌발성 난청을 유발할 수 있다는 것이다 (Westerlaken BO et al,, Ann Otol Rhinol Laryngol 112(11):993-1000, 2003).Stress is one of the main causes of sudden hearing loss (Schmitt C et al., Int Tinnitus J 6(1):41-9, 2000). The hypothesis for this is that stress causes the release of the stress hormone cortisol, which correlates with and acts on the glucocorticoid receptor and several receptors in the inner ear and affects the homeostasis of the lymph. Canlon B et al., Hear Res 226 (1-2):61-9, 2007). Another hypothesis is that stress hormones, such as cortisol or catecholamine, can directly cause blood vessels to contract and reduce the oxygen supply to hair cells by excessive stress, which can lead to sudden hearing loss (Westerlaken BO et al, , Ann Otol Rhinol Laryngol 112(11):993-1000, 2003).
하지만, 스트레스 유도 난청 동물 모델이 확립되어 있지 않아 이에 대한 기전 규명 및 적절한 치료법 개발 연구에 어려움이 있다. However, the stress-induced hearing loss animal model has not been established, and thus it is difficult to investigate the mechanism for this and develop an appropriate treatment method.
이에, 본 발명자들은 난청 동물 모델을 난청질환 연구에 적용하여, 난청 치료제 및 치료법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 스트레스에 노출시켜 돌발성 난청이 유도된 난청 동물 모델을 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.Thus, the present inventors applied a hearing loss animal model to hearing loss disease research, and as a result of diligent efforts to develop a treatment and treatment for hearing loss, it was confirmed that an animal model of hearing loss induced by sudden hearing loss by exposure to stress can be produced, The invention was completed.
본 발명의 목적은 스트레스성 돌발성 난청 질환 치료제 및 치료법을 개발하기 위해, 실험동물을 스트레스에 노출시켜 돌발성 난청 동물 모델을 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 돌발성 난청 동물 모델을 제공하는데 있다.An object of the present invention is to provide a method for preparing an animal model of a sudden hearing loss by exposing an experimental animal to stress, and a model of the animal having a sudden hearing loss produced by the above method, in order to develop a therapeutic agent and a treatment method for a stressful sudden hearing loss disease.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 난청 동물 모델을 이용하여 돌발성 난청 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a method for screening for a therapeutic agent for sudden hearing loss using the animal model of hearing loss produced by the above method.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 정상청력을 가진 실험동물을 선별하는 단계; (b) 상기 선별된 실험동물을 흔들기 (shaking) 및 가열 (heating)을 포함하는 스트레스에 노출시키는 단계; 및 (c) 난청이 유도된 실험동물을 돌발성 난청 동물 모델로 선별하는 단계를 포함하는 돌발성 난청 동물 모델의 제조방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention comprises the steps of (a) selecting a laboratory animal with normal hearing; (b) exposing the selected experimental animal to stress including shaking and heating; And (c) provides a method for producing an animal model of a sudden hearing loss comprising the step of selecting the experimental animal induced hearing loss as an animal model of a sudden hearing loss.
본 발명은 또한, 상기 방법에 따라 제작된 돌발성 난청 동물 모델을 제공한다.The present invention also provides an animal model of sudden hearing loss produced according to the above method.
본 발명은 또한, (a) 상기 난청 동물 모델에 돌발성 난청 치료제 후보 물질을 처리하는 단계; (b) 상기 후보물질이 처리된 난청 동물 모델의 청력 역치를 측정하는 단계; 및 (c) 후보물질 미처리 난청 동물 모델과 비교하여 청력 역치가 감소하는 경우의 후보물질을 돌발성 난청 치료제로 선별하는 단계를 포함하는 돌발성 난청 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.The present invention also comprises the steps of: (a) treating a candidate substance for treating a sudden hearing loss in the animal model of hearing loss; (b) measuring a hearing threshold of the deaf animal model treated with the candidate substance; And (c) screening a candidate substance for a sudden hearing loss treatment when the hearing threshold decreases compared to an animal model of a hearing loss not treated with a candidate substance.
본 발명에 따른 스트레스를 이용한 난청 동물 모델의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 스트레스성 돌발성 난청 동물 모델은 스트레스성 난청 질환 연구에 적용할 수 있으므로, 스트레스성 돌발성 난청 질환 치료제 및 치료법 개발에 매우 유용하다.The method for manufacturing a hearing loss animal model using stress according to the present invention and the stress-induced hearing loss animal model prepared by the above method can be applied to the study of stress-induced hearing loss disease, and are very useful for the development of therapeutic and therapeutic methods for stress-induced hearing loss disease. .
도 1은 랫트에 6일 동안 swimming, overcrowding, shaking & heating, cold stimuli, shaking 스트레스를 차례로 노출시키는 스케줄을 나타낸 것이다.
도 2는 (a) swimming, (b) cold stimuli, (c) overcrowding, (d) shaking & heating 스트레스에 노출시킨 랫트를 도식화한 것이다.
도 3은 스트레스 노출 전(Pre), 스트레스 노출 직후(1 w) 및 노출 중단 1주일 후(2 w)의 청력 역치의 변화를 청성뇌간반응검사를 통해 확인한 것이다.
도 4는 렛트에 heating을 제외한 swimming, overcrowding, cold stimuli, shaking 스트레스를 차례로 노출시키는 6일 동안의 스케줄을 4회 반복 진행하는 것을 보여주는 것이다.
도 5는 heating을 제외한 스트레스 노출 전(Pre), heating을 제외한 스트레스 스케줄을 2회 반복 노출 후 (2w) 및 heating을 제외한 스트레스 스케줄을 4회 반복 노출 후 (4 w)의 청력 역치의 변화를 청성뇌간반응검사를 통해 확인한 것이다.
도 6은 랫트를 shaking & heating 스트레스에만 노출시키기 전, 후의 청력 역치의 변화를 청성뇌간반응검사를 통해 확인한 것이다.FIG. 1 shows a schedule for sequentially exposing swimming, overcrowding, shaking & heating, cold stimuli, and shaking stress to the rat for 6 days.
FIG. 2 is a schematic diagram of rats exposed to (a) swimming, (b) cold stimuli, (c) overcrowding, and (d) shaking & heating stress.
FIG. 3 shows changes in hearing thresholds before (Pre) stress exposure, immediately after stress exposure (1 w), and one week after exposure interruption (2 w) through auditory brainstem response tests.
FIG. 4 shows that the 6-day schedule of exposing swimming, overcrowding, cold stimuli, and shaking stress in turn to rats is repeated four times.
5 shows hearing change in hearing threshold before (Pre) before stress exposure except heating, (2w) after repeated exposure of stress schedules excluding heating, and (4 w) after repeated exposure of stress schedules except heating (4w) It was confirmed by brain stem test.
FIG. 6 shows changes in hearing thresholds before and after exposure of rats to shaking & heating stress only through auditory brainstem response tests.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by a person skilled in the art to which the present invention pertains. In general, the nomenclature used herein is well known in the art and commonly used.
본 발명에서는 모델 동물의 제작 대상이 되는 동물을 총 6일 동안 스트레스에 노출시켜 돌발성 난청 동물 모델을 얻을 수 있었다. 보다 구체적으로 각 단계를 설명하면 2일차와 5일차를 제외한 모든 날의 오전, 오후 2차례 스트레스를 주었다. 1일차와 4일차의 오전에는 수영 (swimming)을 실시하였으며, 오후에는 차가운 자극 (cold stimuli) 과정을 진행하였다. 2일차와 5일차에는 22시간 동안 과밀 (overcrowding) 과정을 진행하였으며, 3일차 오전에는 swimming, 오후에는 흔들기 + 가열 (shaking + heating) 과정을 진행하였다. 6일차에는 오전에는 swimming, 오후에는 shaking 과정을 진행하여 스트레스에 노출시켰다. 그 다음, 청성뇌간반응검사를 실시하여 청력기능을 평가한 결과, 스트레스 노출 전과 비교하여 노출 후 청력 역치 값의 유의미한 증가가 관찰되었다.In the present invention, an animal subjected to the production of a model animal was exposed to stress for a total of 6 days to obtain a model of a sudden deaf animal. In more detail, each step was stressed twice in the morning and afternoon on all days except
따라서, 본 발명은 일 관점에서 (a) 정상청력을 가진 실험동물을 선별하는 단계; (b) 상기 선별된 실험동물을 흔들기 (shaking) 및 가열 (heating)을 포함하는 스트레스에 노출시키는 단계; 및 (c) 난청이 유도된 실험동물을 돌발성 난청 동물 모델로 선별하는 단계를 포함하는 돌발성 난청 동물 모델의 제조방법에 관한 것이다.Accordingly, the present invention provides a method of selecting an experimental animal having normal hearing in one aspect (a); (b) exposing the selected experimental animal to stress including shaking and heating; And (c) selecting the experimental animal from which hearing loss is induced into an animal model of sudden hearing loss.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 흔들기 (shaking) 및 가열 (heating)은 동시에 진행하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the shaking and heating in step (b) may be performed simultaneously.
상기 흔들기 속도는 200 내지 300 RPM인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 240 내지 260 RPM인 것이며, 가장 바람직하게는 250 RPM 속도인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.The shaking speed is preferably 200 to 300 RPM, more preferably 240 to 260 RPM, and most preferably 250 RPM, but is not limited thereto.
또한, 흔들기 시간은 30분 내지 2시간인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 55분 내지 1시간 10분인 것이며, 가장 바람직하게는 1시간 동안 흔드는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.In addition, the shaking time is preferably 30 minutes to 2 hours, more preferably 55 minutes to 1 hour and 10 minutes, and most preferably, shaking for 1 hour, but is not limited thereto.
또한, 상기 가열 온도는 38 내지 41℃인 것이 바람직하며, 시간은 55분 내지 1시간 10분인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 40℃로 1시간 동안 가열하는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.In addition, the heating temperature is preferably 38 to 41 ℃, the time is preferably 55 minutes to 1
따라서, 본 발명은 250 RPM 속도로 40℃에서 1시간 동안 흔들면서 가열하는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.Therefore, the present invention is most preferably heated while shaking at 40°C for 1 hour at 250 RPM, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 수영 (swimming), 차가운 자극 (cold stimuli), 과밀 (overcrowding) 및 흔들기 (shaking)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 스트레스에 추가로 노출시키는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, it is preferable that the step (b) is additionally exposed to any one or more stresses selected from the group consisting of swimming, cold stimuli, overcrowding, and shaking. , But is not limited thereto.
본 발명에 있어서, 상기 수영은 20~30℃ 온도의 물에서 30분~2시간 동안 진행시키는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 23~25℃ 온도의 물에서 50분~1시간 10분 동안 진행하는 것이며, 가장 바람직하게는 24℃ 온도의 물에서 1시간 동안 수영시키는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the swimming is preferably performed for 30 minutes to 2 hours in water at a temperature of 20 to 30°C, more preferably 50 minutes to 1
본 발명에 있어서, 상기 차가운 자극은 3~8℃의 온도에서 3~5시간 동안 진행시키는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 4℃의 온도로 4시간 동안 자극하는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the cold stimulation is preferably carried out for 3 to 5 hours at a temperature of 3 to 8 °C, more preferably for 4 hours at a temperature of 4 °C, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, 상기 과밀은 랫트 5 마리당 220W X 270D X 130H 사이즈 케이지를 사용하여, 22시간 동안 먹이와 물을 공급하지 않고 밝은 상태를 유지하여 스트레스를 유도하였다.In the present invention, the overcrowding using a 220W X 270D X 130H size cage per 5 rats, induced stress by maintaining a bright state without feeding and water for 22 hours.
본 발명에 있어서, 상기 흔들기 속도는 200 내지 300 RPM인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 240 내지 260 RPM인 것이며, 가장 바람직하게는 250 RPM 속도인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the shaking speed is preferably 200 to 300 RPM, more preferably 240 to 260 RPM, and most preferably 250 RPM, but is not limited thereto.
또한, 흔들기 시간은 30분 내지 2시간인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 55분 내지 1시간 10분인 것이며, 가장 바람직하게는 1시간 동안 흔드는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.In addition, the shaking time is preferably 30 minutes to 2 hours, more preferably 55 minutes to 1 hour and 10 minutes, and most preferably, shaking for 1 hour, but is not limited thereto.
본 발명의 일 실시예에서는 스트레스를 주는 기간을 총 6일로 하여, 1, 3, 4, 6일차에는 오전과 오후 2번 스트레스를 주었으며, 2, 5 일차에는 22시간 동안 과밀 (overcrowding) 스트레스를 주었다. 1, 4일차에는 수영 (swimming)과 차가운 자극 (cold stimuli) 스트레스를 주었으며, 3, 6일차에는 수영 (swimming)과 흔들기 (shaking) 스트레스를 주었다. 특히, 3일차 흔들기 과정에서는 가열 (heating)을 동시에 진행하였다. 3일차의 흔들기 (shaking)와 가열 (heating)이 동시에 진행되지 않으면, 랫트에서 스트레스에 의한 난청이 유도되지 않았다. 즉, 3일차에 가열을 제외하고 흔들기만 진행된 경우 난청이 유도되지 않았으며, 다른 스트레스 과정을 생략하고 가열하면서 흔들기만 진행한 경우에도 난청은 유도되지 않았다.In one embodiment of the present invention, the stressing period was set to 6 days, and the first and third, fourth, and sixth days were stressed twice in the morning and the afternoon, and the second and fifth days were stressed overcrowding for 22 hours. . On
본 발명에 있어서, 스트레스 노출 전, 후의 청력 기능 평가는 청성뇌간반응검사를 실시하여, 청력 역치가 36dB 이상일 경우 난청으로 판단하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the hearing function evaluation before and after stress exposure is performed by performing the auditory brainstem response test, and it is preferable to judge hearing loss when the hearing threshold is 36 dB or more, but is not limited thereto.
본 발명은 다른 관점에서, 상기의 돌발성 난청 동물 모델의 제조방법에 따라 제작된 돌발성 난청 동물 모델에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a sudden hearing loss animal model produced according to the above method for manufacturing a sudden hearing loss animal model.
본 발명에 관한 모델 동물은 돌발성 난청 연구의 피험 약제의 약효 평가에 적합한 것이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 형태의 것이어도 사용할 수 있다. 예컨대, 랫트, 마우스, 모르모트, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 소, 양, 돼지 및 염소로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 비인간동물 어느 것이나 사용할 수 있다.The model animal according to the present invention is not particularly limited as long as it is suitable for evaluating the medicinal efficacy of the test drug of the sudden hearing loss study, and any type of animal can be used. For example, any one or more non-human animals selected from the group consisting of rat, mouse, mormot, monkey, dog, cat, rabbit, cow, sheep, pig and goat can be used.
랫트, 마우스, 모르모트, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 포유동물은 일정한 성질을 지닌 개체가 안정적으로 공급되고, 실험할 때에 사육이나 처리가 쉽다는 등의 이유 때문에 모델 동물로서 바람직하다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 랫트 (Spragu-Dawley 수컷 랫트)를 사용하였으나 이에 제한되지 않는다. 모델 동물을 제작하기 전의 사육 조건은 통상적인 방법에 따라 선택하면 되고 특별히 한정되지 않지만, 균질의 모델 동물을 얻기 위해서는 가능한 한 각 개체를 동일한 조건하에서 사육하는 것이 바람직하다.Mammals such as rats, mice, mormots, monkeys, dogs, cats, rabbits, cows, sheep, pigs, goats, etc., are stably supplied with individuals with certain properties, and are easy to breed or handle when experimenting. It is preferred as a model animal. In a specific embodiment of the present invention, a rat (Spragu-Dawley male rat) was used, but is not limited thereto. The breeding conditions before producing the model animal may be selected according to a conventional method and is not particularly limited, but in order to obtain a homogeneous model animal, it is preferable to breed each individual under the same conditions as much as possible.
본 발명에 있어서, 상기 난청 동물 모델의 스트레스에 의해 유도된 난청은 1주일 이상 유지되므로, 치료약의 효과를 안정적으로 평가할 수 있다. 종래의 난청 동물 모델에서 난청이 유지되지 않고 자연 치유가 신속하게 진행될 경우에는 약효 평가를 할 수 있는 시기가 짧아 약제 효과를 판정하기 어렵고, 동일한 방법에 의해서도 재현성이 떨어진다는 것을 고려하면, 본 발명의 모델 동물의 이러한 특성은 우수성이 인정된다고 할 수 있다.In the present invention, since the hearing loss induced by the stress of the animal model of hearing loss is maintained for more than a week, the effect of the therapeutic drug can be stably evaluated. In the case of a conventional hearing loss animal model, when hearing loss is not maintained and natural healing proceeds rapidly, it is difficult to determine the drug effect due to a short period of time for evaluating drug efficacy, and considering that the reproducibility is poor by the same method, the present invention It can be said that this characteristic of model animals is recognized for excellence.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 제8항의 난청 동물 모델에 돌발성 난청 치료제 후보 물질을 처리하는 단계; (b) 상기 후보물질이 처리된 난청 동물 모델의 청력 역치를 측정하는 단계; 및 (c) 후보물질 미처리 난청 동물 모델과 비교하여 청력 역치가 감소하는 경우의 후보물질을 돌발성 난청 치료제로 선별하는 단계를 포함하는 돌발성 난청 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.In another aspect, the present invention, (a) treating the candidate substance for the treatment of sudden hearing loss in the animal model of claim 8; (b) measuring a hearing threshold of the deaf animal model treated with the candidate substance; And (c) screening a candidate substance for a sudden hearing loss treatment when the hearing threshold decreases compared to an animal model of untreated hearing loss.
본 발명의 모델 동물을 이용한 평가방법의 대상이 되는 피험 약제는 특별히 제한되지 않고, 돌발성 난청에 대한 치료 효과를 평가하는 목적을 갖는 것이면 어떠한 것이어도 된다. 돌발성 난청을 치유하는 것을 목적으로 조제된 1종류 이상의 유효 성분을 함유하는 조성물은 그 대상에 포함된다. The test agent targeted for the evaluation method using the model animal of the present invention is not particularly limited, and may be any material as long as it has the purpose of evaluating the therapeutic effect on sudden hearing loss. A composition containing one or more active ingredients prepared for the purpose of healing sudden hearing loss is included in the subject.
통상 의약품이나 의약부외품을 가리키는데, 특정 보건용 식품(기능성 식품), 특정 영양 보조 식품, 건강 식품 등과 같은 보조 식품 등도 포함된다. It usually refers to pharmaceutical products or quasi-drugs, and includes supplements such as certain health foods (functional foods), certain nutritional supplements, and health foods.
당연히 기존의 작용 메커니즘을 갖는 약제뿐 아니라 신규 작용 메커니즘을 갖는 약제를 스크리닝할 수도 있다.Naturally, it is also possible to screen drugs that have a new mechanism of action as well as drugs that have an existing mechanism of action.
투여 시기나 투여 횟수 등의 투여 조건은 약제의 성질, 시험 및 평가 목적 등에 따라 적절하게 최적이 되도록 설정하면 되며 특별히 제한되지 않는다. 예컨대, 투여 시기에 대해서는 모델 동물 제작 직후부터 30분 마다 수회 투여한 후, 그 다음 1시간 마다 수회 투여하고, 그때마다 증상의 변화를 관찰, 평가하는 방법이 많이 이용될 수 있다. 투여 횟수에 대해서는 약제의 성질에 따라 다르고, 1회 이상 수회가 될 수도 있다. The administration conditions, such as the administration timing and the number of administrations, may be set to be appropriately optimal according to the properties of the drug, test and evaluation purposes, and are not particularly limited. For example, the administration timing of the model animal is administered several times every 30 minutes immediately after production, and then administered several times every 1 hour, and a method for observing and evaluating the change in symptoms can be frequently used every time. The frequency of administration depends on the nature of the drug, and may be one or more times.
[[ 실시예Example ]]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not to be construed as limited by these examples.
실시예Example 1: 스트레스 유도 난청 모델 제작 1: Creating a stress-induced hearing loss model
난청 모델 제작에는 8주령 수컷 Sprague-Dawley Rat (250-300 g)을 사용하였으며, 온도 23±2 ℃ 및 12시간의 명암 조건 (8시~20시 lighting)의 습도가 조절된 조건에서 사육하였다. 물과 음식은 자유롭게 섭취시켰다.The 8-week-old male Sprague-Dawley Rat (250-300 g) was used for the production of hearing loss models, and was bred under conditions of controlled humidity of 23±2 °C and 12 hours of contrast (8 to 20 hours lighting). Water and food were consumed freely.
스트레스에 노출시키기 전에 청성뇌간반응검사 (Auditory brainstem response; ABR test)를 실시하여, 랫트의 청력기능을 평가하고 청력이 정상임을 확인하였다.An auditory brainstem response (ABR test) was performed prior to exposure to stress to evaluate the rat's hearing function and confirm that hearing was normal.
총 6일 동안 스트레스를 주고, 2일차와 5일차를 제외한 모든 날에는 오전(09:00)과 오후(13:00)로 나누어 스트레스를 주었다. 1일차와 4일차의 오전에는 수영 (swimming)을 실시하였으며, 오후에는 차가운 자극 (cold stimuli) 과정을 진행하였다. 2일차와 5일차에는 22시간 동안 과밀 (overcrowding) 과정을 진행하였으며, 3일차에는 오전에는 swimming, 오후에는 가열하면서 흔들기 (shaking + heating) 과정을 진행하였다. 6일차에는 오전에는 수영 (swimming), 오후에는 흔들기 (shaking) 과정을 진행하였다 (도 1). The stress was given for a total of 6 days, and the stress was divided into morning (09:00) and afternoon (13:00) on all days except
또한, 모든 스트레스 단계는 동일하고 3일차 오후에 가열하면서 흔들기 (shaking + heating) 과정에서 가열을 제외한 흔들기 과정만을 진행한 6일 스케쥴의 스트레스 과정을 4회 반복 노출하여 동물을 제조하였다 (도 4).In addition, all stress stages are the same and animals are prepared by repeatedly exposing the stress process of the 6-
1-1: 수영 (swimming)1-1: swimming
수영 과정에서는 10마리의 랫트를 사용하였다. 랫트의 발이 땅에 닿지 않을 정도의 물을 수조에 채운 다음, 물의 온도는 상온과 같은 온도 (24℃)로 맞추고 1시간 동안 실험을 진행하였다. 랫트가 다른 랫트의 등에 올라타거나, 수조 밖을 나가려는 행동은 실험자가 제재하였다 (도 2a).In the swimming process, 10 rats were used. After the rat's feet were filled with water so that the water did not reach the ground, the temperature of the water was set to the same temperature as that at room temperature (24°C) and the experiment was conducted for 1 hour. The experimenter sanctioned the behavior of the rat riding on the back of another rat or going out of the tank (FIG. 2A ).
1-2: 차가운 자극 (cold stimuli)1-2: cold stimuli
차가운 자극 과정에서는 랫트를 restraint 케이지 (50Ø x 170H)에 1마리씩 넣고, 4℃에서 4시간 동안 방치하였다 (도 2b).In the cold stimulation process, one rat was placed in a restraint cage (50Ø×170H) and left at 4° C. for 4 hours (FIG. 2B ).
1-3: 과밀 (overcrowding)1-3: overcrowding
과밀 과정에서는 규격이 작은 마우스용 케이지 (220W x 270D x 130H)에 랫트를 5마리씩 넣고 22시간 동안 먹이와 물을 공급하지 않았다. 조명은 끄지 않고 밝은 상태를 유지하였다 (도 2c).In the overcrowding process, 5 rats were placed in a small sized cage for mice (220W x 270D x 130H), and food and water were not supplied for 22 hours. The lighting was kept off and kept bright (FIG. 2C ).
1-4: 흔들기 (shaking)1-4: Shaking
흔들기 과정에서는 Shaking incubator를 사용하여 상온에서 1시간 동안 250 RPM의 속도로 스트레스를 주었으며, 가열하면서 흔들기 (shaking + heating) 과정에서는 40℃에서 1시간 동안 250 RPM의 속도로 스트레스를 주었다 (도 2d).In the shaking process, the stress was applied at a speed of 250 RPM for 1 hour at room temperature using a shaking incubator, and during heating, the shaking (shaking + heating) process was stressed at a speed of 250 RPM for 1 hour at 40°C (FIG. 2D). .
실시예Example 2: 스트레스 유도 난청 모델의 청력 변화 2: Hearing changes in the stress-induced hearing loss model
2-1: 가열하면서 흔들기 (shaking + heating) 스트레스에 노출된 난청 모델2-1: Shaking + heating Stress model of hearing loss exposed to stress
실시예 1의 가열하면서 흔들기 (shaking + heating)가 포함된 스트레스에 랫트를 노출시킨 다음, 졸레틸 50을 이용하여 마취 후에 청성뇌간반응검사 (Auditory brainstem response; ABR test)를 실시하여 청력기능을 평가하였다. 16kHz, 32kHz의 tone burst음을 주어 wave V의 파형이 나오는 최소자극 음 크기 (dB)를 청력 역치로 하였으며, 36 dB 이상일 경우 난청이 유도되었다고 판단하였다. After exposing the rat to stress including shaking while heating in Example 1, the hearing function was evaluated by performing an auditory brainstem response (ABR test) after anesthesia using zoletyl 50. Did. A tone burst sound of 16 kHz and 32 kHz was given to set the minimum stimulus sound volume (dB) of the wave V waveform as a hearing threshold, and it was judged that hearing loss was induced when it was 36 dB or more.
스트레스 노출 후 청력의 변화를 관찰한 결과, 44마리 중 33마리 (75%)에서 스트레스 노출 전과 비교하여 노출 후 청력 역치 값의 유의미한 증가가 관찰되었다 (*P < 0.001). 스트레스 노출 전에는 16 kHz에서 11.0±3.7 dB, 32 kHz에서는 11.3±3.7 dB의 역치 값이 측정되었으며, 스트레스 노출한 직후(1 w)에는 16 kHz에서 45.7±13.3 dB, 32 kHz에서는 45.0±12.6 dB의 역치 값을 측정되었다 (도 3). As a result of observing the change in hearing after stress exposure, a significant increase in hearing threshold value after exposure was observed in 33 out of 44 (75%) compared to before stress exposure (* P <0.001). Before stress exposure, threshold values of 11.0±3.7 dB at 16 kHz and 11.3±3.7 dB at 32 kHz were measured, and 45.7±13.3 dB at 16 kHz and 45.0±12.6 dB at 32 kHz immediately after stress exposure (1 w). Threshold values were measured (Figure 3).
또한, 스트레스 노출 중단 1주일 후(2 w), 다시 무작위로 11마리 랫트에서 ABR 테스트를 진행하였다. 그 결과, 스트레스 노출이 중단되었음에도 불구하고 1주일 동안 역치 값이 유지되었다 (도 3).In addition, one week after the stress exposure was stopped (2 w), the ABR test was performed again in 11 rats at random. As a result, the threshold value was maintained for one week despite the stress exposure being stopped (FIG. 3 ).
2-2: 가열을 제외한 흔들기 (shaking)를 포함한 스트레스에 2-2: For stress including shaking, excluding heating 노출된 노출된Exposed exposed 난청 모델 Hearing loss model
본 실시예에서는 랫트를 실시예 1 스트레스 노출 과정에서 가열 (heating)만 제외하여 스트레스에 노출시켰다. 총 6일 동안 가열 (heating)을 제외한 수열 (swimming), 과밀 (overcrowding), 차가운 자극 (cold stimuli), 흔들기 (shaking) 스트레스에 차례로 노출하는 6일 동안의 스케줄을 2회 반복 후 (2 w) 및 4회 반복 후 (4 w)에 ABR test를 진행하였다. In this example, the rat was exposed to stress by excluding heating only in the course of stress exposure in Example 1. After repeating the schedule for 6 days exposing to swimming, overcrowding, cold stimuli, and shaking stress for a total of 6 days excluding heating,
그 결과, 가열 (heating)을 제외하고 스트레스를 주었을 경우, 난청이 유도되지 않았다.As a result, hearing loss was not induced when stress was applied except heating.
실시예Example 3: 가열하면서 흔들기 (shaking + heating) 스트레스에 의한 동물 모델의 청력 변화 3: Hearing changes in animal models due to shaking + heating stress
본 실시예에서는 실시예 1과 동일한 조건에서 사육한 랫트를 250RPM 속도로 흔들기 (shaking) 및 40℃ 온도로 가열 (heating)하여, 가열하면서 흔들기 스트레스에만 1회 노출시켰다. 스트레스 노출 1일 전 및 1일 후에 청성뇌간반응검사 (Auditory brainstem response; ABR test)를 실시하여 청력기능의 변화를 평가하였다.In this example, the rats bred under the same conditions as in Example 1 were shaken at a rate of 250 RPM and heated to a temperature of 40° C., and exposed once only to shake stress while heating. Auditory brainstem response (ABR test) was performed 1 day before and 1 day after stress exposure to evaluate changes in hearing function.
그 결과, 수영, 차가운 자극, 과밀, 흔들기 등의 다른 스트레스 과정 없이 가열하면서 흔들기 (shaking + heating)만을 1회만 수행하였을 경우, 난청이 유도되지 않았다 (도 6) As a result, hearing loss was not induced when only shaking (shaking + heating) was performed once while heating without other stress processes such as swimming, cold stimulation, overcrowding, and shaking (FIG. 6).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.Since the specific parts of the present invention have been described in detail above, it will be apparent to those of ordinary skill in the art that these specific techniques are only preferred embodiments, and the scope of the present invention is not limited thereby. will be. Therefore, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
Claims (10)
(a) 인간을 제외한 동물 중 정상청력을 가진 실험동물을 선별하는 단계;
(b) 상기 선별된 실험동물을 흔들기 (shaking) 및 가열 (heating)을 포함하는 스트레스에 노출시키는 단계; 및
(c) 난청이 유도된 실험동물을 돌발성 난청 동물 모델로 선별하는 단계.
A method of manufacturing an animal model of a sudden hearing loss comprising the following steps:
(a) selecting an experimental animal having normal hearing among animals other than humans;
(b) exposing the selected experimental animal to stress including shaking and heating; And
(c) The step of selecting the experimental animal from which hearing loss is induced into an animal model of sudden hearing loss.
The method according to claim 1, wherein the shaking and heating of step (b) are performed simultaneously.
The method of claim 1, wherein the step (b) is characterized by further exposing to any one or more stresses selected from the group consisting of swimming, cold stimuli, overcrowding, and shaking. Manufacturing method.
The method according to claim 2, wherein the shaking speed is 200 to 300 RPM.
The method of claim 2, wherein the heating temperature is 38 to 41°C.
The method of claim 1, wherein the hearing loss has a hearing threshold of 36 dB or more.
The method of claim 1, wherein the animal is at least one non-human animal selected from the group consisting of rat, mouse, mormot, monkey, dog, cat, rabbit, cow, sheep, pig, and goat.
An animal model of sudden hearing loss produced according to the method of claim 1.
9. The animal model of claim 8, wherein the hearing loss is maintained for at least one week.
(a) 제8항의 난청 동물 모델에 돌발성 난청 치료제 후보 물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 후보물질이 처리된 난청 동물 모델의 청력 역치를 측정하는 단계; 및
(c) 후보물질 미처리 난청 동물 모델과 비교하여 청력 역치가 감소하는 경우의 후보물질을 돌발성 난청 치료제로 선별하는 단계.
A method for screening for a therapeutic agent for sudden hearing loss comprising the following steps:
(a) treating the candidate substance for treating a sudden hearing loss in the animal model of hearing loss of claim 8;
(b) measuring a hearing threshold of the deaf animal model treated with the candidate substance; And
(c) selecting a candidate substance as a treatment for sudden hearing loss when the hearing threshold decreases compared to an animal model of untreated hearing loss.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180111493A KR102142434B1 (en) | 2018-09-18 | 2018-09-18 | Method for Manufacturing Animal Model with Stress Induced Hearing Loss |
Applications Claiming Priority (1)
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| KR1020180111493A KR102142434B1 (en) | 2018-09-18 | 2018-09-18 | Method for Manufacturing Animal Model with Stress Induced Hearing Loss |
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