KR102134374B1

KR102134374B1 - 다시마 추출물을 함유하는 교모세포종 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR102134374B1
Application number: KR1020180110948A
Authority: KR
Inventors: 신운섭; 이석준; 박명진; 김정엽
Original assignee: 가톨릭관동대학교산학협력단
Priority date: 2018-09-17
Filing date: 2018-09-17
Publication date: 2020-07-15
Also published as: KR20200031896A

Abstract

본 발명은 다시마 추출물을 함유하는 교모세포종(glioblastoma) 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 약학 조성물은 교모세포종 (glioblastoma)의 구형형성을 억제하고, 부분적 세포사멸을 유도함으로써 암세포의 침범을 억제하며, 전리 방사선(ionizing radiation, IR)에 대한 교모세포종의 민감성을 증대함으로써 방사능 치료와 병행시 교모세포종만을 표적으로 한 치료가 가능하다.

Description

다시마 추출물을 함유하는 교모세포종 예방 또는 치료용 약학 조성물 {pharmaceutical composition for prevention or treatment of glioblastoma with Saccharina japonica extracts}

본 발명은 다시마 (Saccharina japonica) 추출물을 함유하는 교모세포종(glioblastoma)의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

교모세포종 (glioblastoma)은 뇌의 교세포에서 발생한 종양 중 조직학적으로 핵의 비정형성, 유사분열상, 혈관내피세포의 증식, 괴사가 관찰되는 악성도가 가장 높은 종양이다. 악성 교모세포종은 전체 뇌종양의 12~15%를 차지하고, 뇌 교종의 50~60%를 차지하는, 뇌에 발생하는 단일 종양 중 가장 흔히 발생하는 종양이다.

교모세포종은 매우 빠르게 성장하는 종양이며 이로 인해 뇌압이 급속히 상승하여 두통, 오심, 구토 등을 유발하고, 성인은 경련이 자주 발생한다. 이외에도 종양 자체 또는 종양에 동반되는 뇌 부종으로 인하여 인근 신경의 기능이 저하되어 사지 운동저하, 감각저하, 얼굴마비, 언어장애, 인지기능 저하, 좌-우 구분장애 등 다양한 증상이 나타날 수 있다. 이러한 신체 일부의 신경학적 결손은 종양의 발생 위치에 따라 매우 다양하여 어느 증상 하나만으로 진단을 내릴 수는 없다.

교모세포종이 발생하면 일반적으로 수술적 제거를 통해 최대한 종양을 절제한다. 하지만, 뇌 조직에서는 종양이 있다고 해서 무조건 제거할 경우 심각한 합병증이 남을 수 있기 때문에 절제의 범위를 신중하게 결정해야 한다. 수술은 일반적으로 전신마취 하에 시행하며 경우에 따라 의식이 있는 상태에서 통증을 없애고 수술 (awake surgery)을 시행하기도 한다. 수술 후 떼어낸 조직을 통해 조직학적으로 교모세포종이 확진된 후에는 방사선 치료와 항암치료를 시행하게 된다.

수술, 방사선 요법 및 화학 요법을 포함한 치료에 불구하고, 교모세포종은 교모세포종 줄기세포 (glioblastoma stem cell)라고 불리는 줄기세포 유사 암세포를 보유하고 있어, 치료 저항성이 매우 높아, 치료 후 예후가 좋지 못한 실정이다.

대한민국등록특허 제10-1787954호(2017.10.12)에는, 프로토파낙사디올류 진세노이드 화합물을 포함하는 교모세포종 치료 및 전이 억제용 약학 조성물에 관하여 기재되어 있다. 대한민국등록특허 제10-0920972호(2009.10.01)에는, 다시마 분말을 사용하여 해양 심층수를 사용한 장류에서 유리 아미노산의 함량을 증진시키는 방법, 항산화 활성을 증진시키는 방법 및 항암 활성을 증진시키는 방법에 관하여 기재되어 있다.

본 발명은 재발률이 매우 높은 교모세포종, 그 중에서도 암의 재발을 야기하는 교모세포종 줄기세포 (glioblastoma stem cell)만을 표적으로 하는 약학 조성물을 개발하여 제공하고자 한다.

본 발명은 다시마 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 교모세포종 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 다시마 추출물은, 바람직하게 다시마에 용매로 메탄올(methanol)을 첨가하여 추출한 후, 용매를 제거하여 추출물 분말을 수득하는 단계 (a); 상기 단계 (a)에서 수득한 추출물 분말에 용매로 에틸아세테이트(ethyl-acetate)를 첨가하여 추출한 후, 용매를 제거하는 단계 (b);를 포함하는 과정으로부터 추출한 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 다시마 추출물은, 바람직하게 약학 조성물에 0.05~5㎍/㎖ 또는 0.05~5㎍/g 첨가되는 것이 좋다.

본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은, 바람직하게 교모세포종 줄기세포(glioblastoma stem cell)를 표적으로 할 수 있다.

본 발명에서 있어서, 상기 약학 조성물은, 바람직하게 방사선 치료와 병용하여 사용되는 것이 좋다.

본 발명의 약학 조성물은 교모세포종 (glioblastoma)의 구형형성을 억제하고, 부분적 세포사멸을 유도함으로써 암세포의 침범을 억제하며, 전리 방사선(ionizing radiation, IR)에 대한 교모세포종의 민감성을 증대함으로써 방사능 치료와 병행시 교모세포종만을 표적으로 한 치료가 가능하다.

도 1은 다시마 추출물이 인간 유래 교모세포종 줄기세포(human glioblastoma stem cell, hGSCs)의 구형형성 능력에 미치는 영향을 확인한 결과이다 (a: 구형형성 분석, b: 한계 희석 분석).
도 2는 다시마 추출물 처리 후, EGFR/ EGFRvⅢ의 전사수준을 확인한 RT-PCR 결과이다.
도 3은 다시마 추출물 처리에 따른 EGFR/ EGFRvⅢ의 발현량을 비교한 결과이다.
도 4는 다시마 추출물 처리에 따른 EGFR/ EGFRvⅢ 분해 기전을 확인한 결과이다.
도 5는 다시마 추출물 처리 시간에 따른 작용 기전의 분자 메커니즘을 규명한 결과이다.
도 6은 다시마 추출물 처리 농도에 따른 작용 기전의 분자 메커니즘을 규명한 결과이다.
도 7은 다시마 추출물이 hGSCs의 세포사멸에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 8은 다시마 추출물이 정상세포의 손상에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 9는 다시마 추출물이 hGSCs의 침윤 활성에 미치는 영향을 확인한 결과이다 (A: Matrigel™-coated Transwell 침윤 분석 (magnification,×100, left/ quantification of the assays, ***P<0.001, right)), B: hGSCs의 침윤 분석을 위한 웨스턴블롯(Western blot) 분석).
도 10은 다시마 추출물이 hGSCs의 방사선 감수성에 미치는 영향을 확인한 결과이다 (values represent mean±SEM, ***P<0.001).

본 발명은 다시마 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 교모세포종 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 다시마는 조미재료로 예부터 널리 이용되어 왔으며, 단백질 성분인 글루탐산(glutamic acid)과 아스파르트산(aspartamic acid)을 다량 함유하고 있어 국물 제조에 널리 이용되어 왔다. 다시마에는 알긴산(alginic acid), 셀룰로오스(cellulose), 푸코이딘(fucoidin) 등의 다당류가 다량 함유되어 있고, 요오드, 칼륨, 나트륨, 칼슘, 마그네슘 등의 무기질 또한 다량 함유하고 있어, 동맥경화, 고혈압, 변비를 예방하는 효과가 뛰어난 것으로 알려졌다.

한편, 교모세포종은 종래 방사선 및 화학요법에 대한 저항성이 매우 강하고, 수술 후 재발률이 매우 높은 가장 치명적인 암이다. 많은 연구에서 암세포의 치료저항성, 혈관의 신생, 침윤, 전이 및 재발을 비롯한 암의 악성 형질이 모두 암 줄기세포 (cancer stem cell)에 의해 유발됨이 밝혀졌다. 교모세포종 역시, 높은 재발률, 치료저항성이 교모세포종 줄기세포 (glioblastoma stem cell)로부터 야기되는데, 본 발명을 통해 다시마 추출물이 교모세포종 줄기세포 (glioblastoma stem cell)만에 표적으로 작용하여 교모세포종의 치료 및 예방 효능을 발휘함을 확인할 수 있었다.

즉, 본 발명에서는 다시마 추출물이 교모세포종 줄기세포 (glioblastoma stem cell)만을 표적으로 작용하여, 교모세포종 (glioblastoma)의 구형형성, 즉 교모세포종의 교모세포종 줄기세포화를 억제하고, 부분적 세포사멸을 유도함으로써 암세포의 침윤을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명의 다시마 추추물은 전리 방사선(ionizing radiation, IR)에 대한 교모세포종의 민감성을 증대할 수 있음을 확인할 수도 있었는데, 이를 바탕으로 본 발명의 약학 조성물은, 바람직하게 방사선 치료와 병용하여 사용하면 보다 높은 치료 효능을 보일 수 있다.

한편, 본 발명의 다시마 추출물은 바람직하게 다시마에 용매로 메탄올(methanol)을 첨가하여 추출한 후, 용매를 제거하여 추출물 분말을 수득하는 단계 (a); 상기 단계 (a)에서 수득한 추출물 분말에 용매로 에틸아세테이트(ethyl-acetate)를 첨가하여 추출한 후, 용매를 제거하는 단계 (b);를 포함하는 과정으로부터 추출한 것일 수 있다.

한편, 본 발명의 교모세포종 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어, 상기 약학 조성물은 바람직하게 다시마 추출물을 0.05~5㎍/㎖ 또는 0.05~5㎍/g 포함하는 것이 좋은데, 1일 복용량 및 치료 효능을 위한 복용 기간은 증상의 정도, 환자의 상태 등을 고려하여 의사의 처방에 의해 다양하게 조절할 수 있다.

또한, 본 발명의 교모세포종 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어, 상기 약학 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 더욱 포함할 수 있다. 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘스테아레이트 및 광물유가 있으며, 이 중 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다.

또한, 상기 약학 조성물이 약제인 경우, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 중 선택되는 하나 이상을 추가적으로 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 교모세포종 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어, 상기 약학 조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화 하는 것이 좋다. 구체적인 제형의 예로는 경고제(PLASTERS), 과립제(GRANULES), 로션제(LOTIONS), 리니멘트제(LINIMENTS), 리모나데제(LEMONADES), 산제(POWDERS), 시럽제(SYRUPS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제(ELIXIRS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPENSIONS), 전제(DECOCTIONS), 침제(INFUSIONS), 정제(TABLETS), 좌제(SUPPOSITORIES), 주사제(INJECTIONS), 주정제(SPIRITS), 카타플라스마제(CATAPLSMA), 캅셀제(CAPSULES), 트로키제(TROCHES), 틴크제(TINCTURES), 파스타제(PASTES), 환제(PILLS), 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.

한편, 본 발명의 교모세포종 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어, 상기 약학 조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별, 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 좋다. 일 예로, 본 발명의 상기 약학 조성물은 유효성분을 기준으로 하였을 때 1일 0.00001 내지 100㎎/㎏(체중)으로 1회 이상 투여가능하다. 그러나 상기의 투여량은 예시하기 위한 일 예에 불과하며, 복용자의 상태에 따라 의사의 처방에 의해 변화될 수 있다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 및 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

< 실시예 1: 본 발명 다시마 추출물의 제조>

본 발명의 다시마 추출물을 제조하기 위하여, 다시마 (Saccharina japonica)를 영하 70℃의 딥 프리저 (deep freezer)에서 보관하였다. 그 후, 교반기에 잘게 자른 다시마 1kg과 100% 메탄올 3ℓ를 첨가하고 1일 동안 교반하여 메탄올 추출물을 수득하였다. 이후, 수득한 메탄올 추출물을 40℃, 진공 상태에서 증발시킨 후, 에틸아세테이트를 가하여 재추출하였다. 재추출한 에틸아세테이트 분획을 증발시켜, 본 발명의 다시마 추출물을 수득하였고, ESJ라 명명하였다.

본 발명의 다시마 추출물은 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 용해하여, 하기 실험에서 사용하였다.

< 실험예 1: 교모세포종에 대한 본 발명 다시마 추출물의 작용 효과 확인>

(1) 세포 배양

인간 유래 교모세포종 줄기세포(human glioblastoma stem cells, hGSCs)의 세포주 X01, 0315, 83 및 MD30은 각각 소에다 박사 (Gifu University School of Medicine, Gifu, Japan), 강 박사 (Yonsei University, Seoul, Korea) 및 나카노 박사 (Ohio State University, Columbus, OH, USA)로부터 분양받아 사용하였다.

hGSCs를 배양하기 위한 배지는, DMEM/F12 배지 (20ng/mL의 EGF, 10ng/mL의 bFGF, 0.1% B27 (GIBCO), 및 1% 항생제-항균제 용액 (Welgene) (complete medium))을 사용하였으며, 인큐베이터 (37℃, 5% CO₂)에서 구형의 부유 상태(floating sphere state)로 배양하였다.

(2) 구형형성 및 한계 희석 분석

인간 유래 교모세포종 줄기세포(human glioblastoma stem cell, hGSCs)의 구형형성 능력에 대하여 다시마 추출물이 미치는 영향을 확인하기 위하여, 아큐테이즈(accutase; MILLIPORE)를 이용하여, hGSCs를 단일세포로 분리하고 재현탁시켰다. 구형형성(sphere formation)을 위하여, 2㎖의 배지를 함유하는 6 웰 플레이트에 각 웰 당 단일 hGSCs 1×10³cell/㎖를 접종하였다. 실시예 1의 다시마 추출물을 농도별로 처리하여 7일 동안 배양하였다. 이후, 10% FBS를 첨가하여 hGSCs를 플레이트에 부착시키고, 0.05% 크리스탈 바이올렛 (crystal violet in 20% MeOH)으로 염색한 뒤, 계수하였다 (도 1의 a).

실험 결과, 다시마 추출물을 처리하였을 시, 4개의 상이한 hGSCs 세포주 X01, 0315, 83 및 MD30 모두에서 구형형성 능력이 억제되었다. 특히, 5㎍/㎖의 다시마 추출물을 처리하였을 시, 구형형성 능력이 거의 완벽하게 저해되었다.

한편, 시험관 내에서 구형 형성 능력을 평가하는 방법인, 한계 희석 분석(limiting dilution assay)을 통해 상기 구형형성 능력을 더욱 자세히 확인하고자 하였다. 이를 위하여, 100㎕의 배지가 담긴 96 웰 플레이트에 hGSCs를 각각 100, 50, 25, 12, 6 및 3개를 접종하고, 7일 동안 배양하였다. 구형이 없는 웰을 세고, 플롯(plot)하였다. p 값은 http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/에 있는 소프트웨어를 이용하여 계산하였다.

실험 결과, 다시마 추출물의 전처리는 hGSCs의 구형형성 능력을 농도의존적으로 크게 저해하였다 (도 1의 b). 도 1은 다시마 추출물이 인간 유래 교모세포종 줄기세포(human glioblastoma stem cell, hGSCs)의 구형형성 능력에 미치는 영향을 확인한 결과이다 (a: 구형형성 분석, b: 한계 희석 분석). 이러한 결과는 본 발명의 다시마 추출물이 hGSCs의 구형형성 성질을 효과적으로 억제함을 시사한다.

(3) 구형형성 억제에 관여하는 분자 메커니즘 분석

본 실험에서는 다시마 추출물에 의해 유도된 hGSCs의 구형형성 억제에 관여하는 분자 메커니즘을 확인하고자 하였다. 일반적으로 교모세포종의 공통적 특징으로 상피세포 성장인자 수용체 (Epidermal growth factor receptor, EGFR)와 EGFR의 변종인 EGFRvⅢ (Epidermal growth factor receptor variant Ⅲ)의 과발현이 보고되었다. 따라서, 본 발명자는 hGSCs에서의 EGFR/ EGFRvⅢ 매개 줄기세포능 시그널링 (stemness signaling)에 다시마 추출물이 미치는 영향을 조사하고자 하였다.

EGFR/ EGFRvⅢ 발현량 확인을 위하여, 우선 제조업체의 프로토콜에 따라 TRIsure (BIOLINE)를 이용하여 hGSCs의 총 RNA를 분리하였다. 그 후, EGFR(1044bp)와 EGFRvⅢ(243bp)에 대한 RT-PCR을 수행하였다. EGFR/ EGFRvⅢ의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열은 표 1에 나타내었다 (도 2). 도 2는 다시마 추출물 처리 후, EGFR/ EGFRvⅢ의 전사수준을 확인한 RT-PCR 결과이다. 실험 결과, 다시마 추출물은 EGFR/ EGFRvⅢ의 전사 수준에는 영향을 미치지 않았다.

	forward primer	reverse primer
EGFR / EGFRv Ⅲ	5'-CTT CGG GGA GCA GCG ATG CGA C-3'	5'-ACC AAT ACC TAT TCC GTT ACA C-3'
18S RNA	5'-AAA CGG CTA CCA CAT CCA AG-3'	5'-CGC TCC CAA GAT CCA ACT AC-3'

한편, 단백질 수준에서의 EGFR/ EGFRvⅢ의 발현량을 비교하기 위하여, 다시마 추출물을 농도별로 전처리한 hGSCs를 RIPA 버퍼 (RiPA buffer; 50mMTris-HCl (pH7.4), 100mMNaCl, 5mMEDTA, 0.5% Nonidet P-40, phosphatase inhibitor cocktail set II (Calbiochem) 및 protease inhibitor cocktail tablet (Roche))에 용해시켰다. 그 후, Bio-Rad 프로테인 에세이 시약 (Bio-Rad protein assay reagent)을 이용하여 단백질을 분리하고, 수득한 단백질을 8~12%의 소디움도데실설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel)에 전기영동 시키고 분리된 단백질을 폴리비닐리덴플로라이드 (polyvinylidene difluoride, PVDF 입수처: Emdmillipore, Billerica, MA, USA) 멤브레인으로 전이시키고 비특이적인 결합을 방지하기 위하여 5% 탈지분유로 1시간 처리하였다. 이후, 하기 표시된 단일 항체를 4℃에서 교반하면서 오버나잇(overnight) 동안 반응시켰고, 각각의 항체에 상응하는 퍼옥시다제 (peroxidase-conjugated)가 결합된 이차 항체를 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. PVDF 멤브레인에 있는 각각의 단백질은 증대된 화학 발광기 키트를 이용하여 발현량을 확인하였다.

다시마 추출물 처리에 따른 EGFR/ EGFRvⅢ의 발현량을 비교한 결과, 다시마 추출물은 hGSCs에서의 EGFR/ EGFRvⅢ 발현을 억제하였다. 다만, 다시마 추출물 처리군에서 느리게 이동한 밴드(slow-migrating band)들이 확인되었다 (도 3). 도 3은 다시마 추출물 처리에 따른 EGFR/ EGFRvⅢ의 발현량을 비교한 결과이다.

상기 실험에서 느리게 이동한 밴드(slow-migrating band)가 나타남에 따라, 다시마 추출물 처리에 따른 EGFR/ EGFRvⅢ 분해 기전을 검증하기 위하여, hGSCs에 프로테아좀(proteasome) 의존성 분해 억제제인 MG132를 1시간 동안 전처리한 뒤, 5㎍/㎖의 다시마 추출물을 24시간 동안 처리하였다. 실험 결과, MG132의 처리는 hGSCs에서 EGFR/ EGFRvⅢ의 다시마 추출물에 의한 분해를 제한하였다 (도 4). 이는 다시마 추출물이 EGFR/ EGFRvⅢ의 프로테아좀 분해를 유도함을 의미한다. 도 4는 다시마 추출물 처리에 따른 EGFR/ EGFRvⅢ 분해 기전을 확인한 결과이다.

한편, EGFR/ EGFRvⅢ 시그날링의 억제는 줄기세포능 관련 유전자의 하향조절 (downregulation)을 초래하기 때문에, 다시마 추출물 처리에 따른 작용 기전의 분자 메커니즘을 규명하고자 하였다. 실험 결과, 다시마 추출물의 처리는 Notch, n-p-b-catenin, Sox2를 포함하는 줄기세포능 관련 유전자의 발현을 시간 및 농도의존적으로 감소시켰다 (도 5, 6). 이러한 결과는 hGSCs의 구형형성 능력을 담당하는 Notch, b-catenin, STAT3의 신호전달 경로를 억제함을 의미하는 것이다. 도 5는 다시마 추출물 처리 시간에 따른 작용 기전의 분자 메커니즘을 규명한 결과이며, 도 6은 다시마 추출물 처리 농도에 따른 작용 기전의 분자 메커니즘을 규명한 결과이다.

(4) 세포주기 진행 분석

유동세포 계측법에 의한 세포주기 분석을 위하여, hGSCs에 5㎍/㎖의 다시마 추출물을 72시간 동안 전처리하고, 단일 세포로 분리하였다. 이후, 세포를 75% 에탄올로 고정하고, 1시간 동안 영하 20℃에서 배양한 뒤, PBS로 세척하였다. 그 후, 세포를 0.1㎎/㎖의 RNase A, 50㎎/㎖의 프로피디움 요오드화물 (propidium iodide, PI) 및 0.05% Triton X-100이 들어있는 PBS를 첨가하여 실온에서 40분간 재현탁하고, PBS로 세척한 뒤, 유동 세포 계측법(flow cytometric analysis)을 수행하였다. 유동 세포 계측법에 의한 다시마 추출물로 유도된 세포사멸을 관찰하기 위해, 제조사의 프로토콜에 따라, hGSCs을 Annexin-V 및 PI 염색법으로 측정하였다 (도 7). 도 7은 다시마 추출물이 hGSCs의 세포사멸에 미치는 영향을 확인한 결과이다.

실험 결과, 다시마 추출물의 처리는 세포주기를 전반적으로 크게 변화시키지는 않았으나, 72시간 후에는 경미하지만 유의한 sub-G1 분율(fraction) 증가를 보였다 (도 7의 A, C). sub-G1 분율(fraction) 증가는 세포사멸의 지표이므로, 세포사멸 확인을 위하여 Annexin-V 및 PI 염색법을 수행한 결과, 다시마 추출물이 경미하지만 유의한 세포 사멸을 유도하였다 (도 7의 B, D). 이러한 결과는 다시마 추출물이 hGSCs의 부분적 세포사멸을 유도할 가능성이 있음을 시사한다.

한편, 다시마 추출물이 정상세포의 손상에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 정상적인 인간성상세포 (normal human astrocytes, NHAs)에 다시마 추출물을 농도별로 72시간 동안 처리한 뒤, MTT 어세이(MTT assay, 490nm)를 통해 세포증식을 확인하였다 (도 8). 도 8은 다시마 추출물이 정상세포의 손상에 미치는 영향을 확인한 결과이다. 실험 결과, 10㎍/㎖의 다시마 추출물을 처리한 군에서 유의한 세포사멸이 확인되었다. 다만, 5㎍/㎖의 다시마 추출물 처리는 정상세포의 손상에 영향을 미치지 않았다.

(5) 교모세포종의 침윤 활성 분석

침윤은 악성종양의 특징 중 하나로, 본 실험에서는 다시마 추출물이 hGSCs의 침윤 활성에 미치는 영향을 조사하였다 (도 9). 도 9는 다시마 추출물이 hGSCs의 침윤 활성에 미치는 영향을 확인한 결과이다 (A: Matrigel™-coated Transwell 침윤 분석 (magnification,×100, left/ quantification of the assays, ***P<0.001, right)), B: hGSCs의 침윤 분석을 위한 웨스턴블롯(Western blot)분석). Matrigel™-coated Transwell을 이용한 침윤 분석은 해당 프로토콜에 의하여 진행되었다.

실험 결과, 5㎍/㎖의 다시마 추출물을 72시간 동안 처리한 처리군에서 메트리겔(Matrigel)이 코팅된 트렌스웰(Transwell)을 통한 hGSCs의 침윤이 거의 완벽하게 억제되었다 (도 9의 A). 또한, 교모세포종의 침윤과 관련이 있다고 알려진 간엽마커 (mesenchymal marker), Snail 과 Slug의 발현을 분석한 결과, 시간의존적으로 Snail 과 Slug의 발현이 하향조절 (downregulation)되었다. 또 다른 간엽마커인 fibronectin, vimentin, Twist, Zeb1도 다시마 추출물 처리 후 미미하게나마 하향조절 (downregulation)되었다 (도 9의 B). 이러한 결과는 다시마 추출물이 Snail 과 Slug의 하향조절을 통해 hGSCs의 침윤을 억제함을 의미하는 것이다.

(6) 전리 방사선(IR) 민감도 분석

hGSCs는 일반적으로 전리 방사선에 내성을 지니나, γ-secretase 및 Notch shRNA를 포함하는 Notch 차단제의 이용은 hGSCs의 전리 방사선에 대한 민감도를 높이는데 기여한다. 본 실험의 도 5, 6에서 다시마 추출물의 처리가 Notch의 발현을 하향조절함을 확인함에 따라, 전리 방사선 (ionizing radiation, IR)에 대한 hGSCs의 저항성을 측정하기 위하여, 6웰 플레이트에 1×10³ cell/㎖의 hGSCs를 접종하였다.

이후, 2㎍/㎖의 다시마 추출물을 1시간 동안 처리한 뒤, ¹³⁷Cs γ-ray source (BIOBEAM8000, 2.6 Gy/min, Gamma-serviceMedical GmbH)를 이용하여 γ-선을 조사하였다. 그 후, 7일간 배양한 후에 10% PBS를 첨가하여 구체(sphere)를 부착시키고, PBS로 세척한 뒤, 0.05% 크리스탈 바이올렛 (crystal violet in 20% MeOH)으로 염색하였다. 이후, 증류수로 3회 세척 후, 콜로니를 계수하였다 (도 10). 도 10은 다시마 추출물이 hGSCs의 방사선 감수성에 미치는 영향을 확인한 결과이다 (values represent mean±SEM, ***P<0.001). 실험 결과, 2㎍/㎖의 다시마 추출물의 전처리는 4개의 hGSCs 세포주 모두에서 구형형성을 25% 억제함으로써, 전리 방사선에 대한 민감도가 증가하였음을 알 수 있었다.

이상의 결과를 종합하면, 본 발명의 다시마 추출물은 EGFR/ EGFRvⅢ의 분해 및 하류 신호전달 경로의 억제를 유도함으로써, 교모세포종 줄기세포의 클론원성 활성 (clonogenic activity)을 효과적으로 억제함이 확인되었다. 또한, 전리 방사선에 대한 민감도를 증가함으로써, 교모세포종 줄기세포의 표적화를 위한 전리 방사선 치료의 병용 치료제로 사용될 수 있음이 확인되었다.

Claims

다시마(Saccharina japonica) 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 교모세포종 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 다시마 추출물은,
다시마에 용매로 메탄올(methanol)을 첨가하여 추출한 후, 용매를 제거하여 추출물 분말을 수득하는 단계 (a);
상기 단계 (a)에서 수득한 추출물 분말에 용매로 에틸아세테이트(ethyl-acetate)를 첨가하여 추출한 후, 용매를 제거하는 단계 (b);를 포함하는 과정으로부터 추출한 것을 특징으로 하는 교모세포종 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 다시마 추출물은,
약학 조성물에 0.05~5㎍/㎖ 또는 0.05~5㎍/g 첨가되는 것을 특징으로 하는 교모세포종 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 약학 조성물은,
교모세포종 줄기세포(glioblastoma stem cell)를 표적으로 하는 것을 특징으로 하는 교모세포종 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 약학 조성물은,
방사선 치료와 병용하여 사용되는 것을 특징으로 하는 교모세포종 예방 또는 치료용 약학 조성물.