KR102133013B1 - 분자 바코드 및 블로킹 올리고뉴클레오티드를 이용한 소량 돌연변이 증폭 및 정량 방법 - Google Patents

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Abstract

분자 바코드 및 블로킹 올리고뉴클레오티드를 이용한 소량 돌연변이 증폭 및 정량 방법에 관한 것이다.

Description

분자 바코드 및 블로킹 올리고뉴클레오티드를 이용한 소량 돌연변이 증폭 및 정량 방법{SMALL MUTATION AMPLIFICATION AND QUANTIFICATION METHOD USING MOLECULAR BARCODE AND BLOCKING OLIGONUCLEOTIDE}
본원은, 분자 바코드 및 블로킹 올리고뉴클레오티드를 이용한 소량 돌연변이 증폭 및 정량 방법에 관한 것이다.
PCR 클램핑(clamping) 법은 정상 DNA를 차단하여 돌연변이 DNA를 선택적으로 증폭하는 방법으로, 예를 들어, LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid) 및 MEMO(mutant-enrichment with 3'-modified oligonucleotide) 법 등이 있다. 이러한 방법들은 돌연변이 DNA의 증폭 효율을 증가시킴으로써, 돌연변이 DNA 검출 민감도 및 특이도를 향상시킬 수 있다.
그러나, 이러한 방법들은 돌연변이 DNA 를 정성적으로만 검출할 수 있을 뿐, 돌연변이 DNA 비율을 정량적으로 측정할 수 없는 문제점이 있다.
[선행기술문헌]
Urakawa et. al., 2003, Optimization of Single-Base-Pair Mismatch Discrimination in Oligonucleotide Microarray.
본원은, 분자 바코드 및 블로킹 올리고뉴클레오티드를 이용한 소량 돌연변이 증폭 및 정량 방법을 제공하고자 한다.
그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본원의 제 1 측면은, 분석 대상 이중가닥 DNA 단편의 양 말단에 어댑터를 부착하는 것; 상기 각 DNA 단편을 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 제공하는 것; 및 상기 프라이머 쌍을 이용하여 상기 어댑터가 부착된 DNA 단편을 증폭함으로써, 상기 분자 바코드를 포함하는 상기 각 DNA 단편의 증폭산물을 생성하는 것; 상기 분자 바코드를 포함하는 DNA 단편의 증폭산물 중, 선별하고자 하는 특정 DNA 서열을 핵산 프로브 및 블로킹 올리고뉴클레오티드를 이용하여 혼성화함으로써 포획하는 것; 상기 포획된 산물을 공통 프라이머 서열을 이용해 증폭하는 것을 포함하는, 차세대 염기서열 분석을 위한 라이브러리 제조 방법으로서, 상기 프라이머 쌍을 이루는 프라이머 각각은, i) 상기 어댑터에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 어댑터 상보 서열, ii) 각 DNA 단편마다 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 샘플 고유 서열, iii) 각 DNA 단편에 대해 고유한 뉴클레오티드 서열을 갖는 분자 바코드, 및 iv) 상기 분자 바코드와 DNA 서열을 구분하기 위한 고정 서열을 포함하는 것이고; 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드는 DNA 단편들 중 선별하고자 하는 특정 DNA 서열의 야생형 서열(wild-type)과 상보적인 서열을 갖는 것인; 차세대 염기서열 분석을 위한 라이브러리 제조 방법을 제공한다.
본원의 제 2 측면은, 본원의 제 1측면에 따른 방법에 의해 제조된 라이브러리에 대해 차세대 염기서열 분석을 수행하는 것; 상기 생성물 중 어댑터 상보 서열 및 분자 바코드 서열을 제거하고 레퍼런스 서열에 정렬하는 것; 상기 정렬된 서열에 분자 바코드를 재부착하는 것; 상기 재부착된 서열에 대해 서열 분석을 수행하는 것을 포함하는, 차세대 염기 서열 분석을 이용한 소량 돌연변이 서열 검출 방법을 제공한다.
본원의 일 구현예에 따르면, 소량의 돌연변이 DNA 를 보다 정확하게 분석하여 종래 차세대 염기서열 분석법에 의해 에러 판정으로 제거되었던 소량의 돌연변이 검출이 가능할 뿐만 아니라, 돌연변이 DNA 비율을 정량적으로 측정할 수 있는 효과를 갖는다.
도 1은, 본원의 일 구현예에 있어서, 분자 바코드의 원리를 나타낸 개략도이다.
도 2는, 본원의 일 구현예에 있어서, 블로킹 올리고뉴클레오티드의 원리를 나타낸 계략도이다.
도 3은, 본원의 일 실시예에 있어서, 분자 바코드 및 블로킹 올리고뉴클레오티드를 이용한 소량 돌연변이 증폭 및 정량 방법을 나타낸 개략도이다.
도 4는, 본원의 일 실시예에 있어서, 차세대 염기서열 분석 데이터의 분석 과정을 나타내는 흐름도이다.
도 5는, 본원의 일 실시예에 있어서, 차세대 염기서열 분석 데이터의 분자 바코드 추출 및 재부착 과정을 나타낸 개략도이다.
도 6은, 본원의 일 실시예에 있어서, 동일한 혼성화 온도 및 반응 시간에서, 블로킹 올리고뉴클레오티드의 농도에 따른 돌연변이 검출 빈도를 나타낸 그래프이다(◆: KRAS-G12D, ■: PIK3CA E545K, ▲: TP53 R175H).
도 7은, 본원의 일 실시예에 있어서, 동일한 혼성화 반응 시간 및 블로킹 올리고뉴클레오티드 농도에서, 혼성화 반응 온도에 따른 돌연변이 검출 빈도를 나타낸 그래프이다(◆: KRAS-G12D, ■: PIK3CA E545K, ▲: TP53 R175H).
도 8은, 본원의 일 실시예에 있어서, 동일한 혼성화 온도 및 블로킹 올리고뉴클레오티드 농도에서, 혼성화 반응 시간에 따른 돌연변이 검출 빈도를 나타낸 그래프이다(◆: KRAS-G12D, ■: PIK3CA E545K, ▲: TP53 R175H).
아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 “연결”되어 있다고 할 때, 이는 “직접적으로 연결”되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 소자를 사이에 두고 “전기적으로 연결”되어 있는 경우도 포함한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 “상에” 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 “포함” 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “약”, “실질적으로” 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “~(하는) 단계” 또는 “~의 단계”는 “~ 를 위한 단계”를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 “이들의 조합(들)”의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, “A 및/또는 B”의 기재는 “A 또는 B, 또는 A 및 B”를 의미한다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 1 측면은, 분석 대상 이중가닥 DNA 단편의 양 말단에 어댑터를 부착하는 것; 상기 각 DNA 단편을 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 제공하는 것; 및 상기 프라이머 쌍을 이용하여 상기 어댑터가 부착된 DNA 단편을 증폭함으로써, 상기 분자 바코드를 포함하는 상기 각 DNA 단편의 증폭산물을 생성하는 것; 상기 분자 바코드를 포함하는 DNA 단편의 증폭산물 중, 선별하고자 하는 특정 DNA 서열을 핵산 프로브 및 블로킹 올리고뉴클레오티드를 이용하여 혼성화함으로써 포획하는 것; 상기 포획된 산물을 공통 프라이머 서열을 이용해 증폭하는 것을 포함하는, 차세대 염기서열 분석을 위한 라이브러리 제조 방법으로서, 상기 프라이머 쌍을 이루는 프라이머 각각은, i) 상기 어댑터에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 어댑터 상보 서열, ii) 각 DNA 단편마다 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 샘플 고유 서열, iii) 각 DNA 단편에 대해 고유한 뉴클레오티드 서열을 갖는 분자 바코드, 및 iv) 상기 분자 바코드와 DNA 서열을 구분하기 위한 고정 서열을 포함하는 것이고; 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드는 DNA 단편들 중 선별하고자 하는 특정 DNA 서열의 야생형 서열(wild-type)과 상보적인 서열을 갖는 것인; 차세대 염기서열 분석을 위한 라이브러리 제조 방법을 제공한다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 분석 대상 이중가닥 DNA 는 자연에서 유래하거나 합성된 것일 수 있다. 예를 들어, 자연에서 유래한 DNA는 세포 유래 DNA 또는 세포 유리(cell-free) DNA일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 분석 대상 이중가닥 DNA 단편은 자연에서 유래한 것을 일정한 크기로 조각내는 과정을 거쳐 제공된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 초음파, 열, 효소 등을 이용하여 조각낼 수 있으며, 상기 효소는 Tn5 전이효소 또는 Tn3 전이효소와 같은 전이효소와 인테그레이즈, 재조합효소 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 분석 대상 이중가닥 DNA 단편의 양 말단이 평활 말단(blunt end) 형태가 되도록 하는 말단 수선(end repair) 과정을 포함할 수 있다. 또한, 상기 분석 대상 이중가닥 DNA 단편의 양 말단에 어댑터(adaptor)를 일정한 방향으로 결합시키기 위하여, 3' 말단에 한 개의 아데노신 염기를 결합시켜주는 아데노신-테일링(A-tailing) 과정을 포함할 수 있다. 상기 과정을 위해 예를 들어, T4 DNA 중합효소, 클레노우 절편(Klenow fragment) 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 분석 대상 이중가닥 DNA 단편의 양 5' 말단에 대한 인산화 과정을 더욱 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 인산화는 T4 폴리뉴클레오티드 인산화효소와 같은 효소에 의해 수행될 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 말단 수선 과정 및 아데노신-테일링 과정의 전후로 상기 분석 대상 이중가닥 DNA 단편을 정제하는 과정이 더 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 분석 대상 이중가닥 DNA 단편의 양 말단에 어댑터를 부착하는 것은 라이게이즈(ligase)를 이용하는 것일 수 있다. 예를 들어, T4 DNA 라이게이즈, T7 DNA 라이게이즈, 또는 온도 순환시험(temperature cycling)이 가능한 라이게이즈를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 분석 대상 이중가닥 DNA 단편에 양 말단 부착되는 어댑터는 Y 자 형태 또는 U 자 형태를 가지는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 어댑터가 U 자 형태를 가질 경우, 상기 방법은 어댑터 부착 후 상기 어댑터 내 영역을 효소를 이용하여 절단하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 우라실 특이 절제 시약(USER)과 같은 효소를 이용하여, 상기 U 자 모양의 어댑터를 Y 자 형태의 말단을 갖는 어댑터로 절단할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 DNA 단편을 증폭하기 위한 프라이머 쌍이 제공될 수 있다. 상기 프라이머 쌍을 이루는 프라이머 각각은, i) 상기 어댑터에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 어댑터 상보 서열, ii) 각 DNA 단편마다 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 샘플 고유 서열, iii) 각 DNA 단편에 대해 고유한 뉴클레오티드 서열을 갖는 분자 바코드, 및 iv) 상기 분자 바코드와 DNA 서열을 구분하기 위한 고정 서열을 포함할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 분자 바코드는 각 DNA 단편마다 고유하게 부착되는 바코드 서열로서, 상이한 DNA 단편들이 서로 상호 구분될 수 있도록 하는 것일 수 있다. 상기 분자 바코드는, 한 샘플 내에 존재하는 각각의 단일가닥 DNA 단편에 대해 고유한 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로, 한 샘플 내에 존재하는 DNA 단편의 구분을 가능하게 하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 분자 바코드는 4 내지 10 개의 뉴클레오티드, 4 내지 8 개의 뉴클레오티드, 4 내지 6 개의 뉴클레오티드, 6 내지 10 개의 뉴클레오티드, 6 내지 8 개의 뉴클레오티드, 또는 8 내지 10 개의 뉴클레오티드로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 분자 바코드는 도 1 에 나타낸 바와 같이, A, T, C, G의 네가지 염기를 무작위적으로 합성하여 만든 염기서열일 수 있다. 예를 들어, 상기 무작위적 합성은 특정 위치에서 A, G, T, C 중 하나의 염기가 100%의 확률로 합성되지 아니한다는 것을 의미하는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 고정 서열은 상기 분자 바코드 상기 무작위적으로 합성된 염기서열인 분자 바코드 서열과, 분자 바코드가 아닌 분석하고자 하는 DNA 서열을 구분하기 위한 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 고정 서열은 상기 분자 바코드와 분석하고자 하는 DNA 서열 사이에 위치되는 것일 수 있으며, 시료마다 동일한 4 개의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 샘플 고유 서열은 각 샘플의 DNA 단편마다 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 각각의 서로 다른 DNA 샘플은 서로 다른 고유의 뉴클레오티드 서열을 가지고 있으며, 동일한 한 샘플 내에 존재하는 모든 DNA 단편은 같은 서열을 가지고 있다. 이에, 샘플 내에 있는 모든 DNA 단편은 같은 서열을 가지고 있어, 서로 다른 샘플 고유 서열을 가지고 있는 샘플들이 섞인 경우 구분이 가능한 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 프라이머 쌍을 이용한 증폭산물은 상기 DNA 단편의 양쪽 인접 영역(flanking region)에 각각 어댑터 상보 서열, 샘플 고유 서열, 분자 바코드 및 고정 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 증폭 반응은 상기 프라이머 쌍을 이용하는 PCR 반응일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 증폭 반응의 사이클은 4 회 내지 12 회, 4 회 내지 10 회, 4 회 내지 8 회, 4 회 내지 6 회, 6 회 내지 12 회, 6 회 내지 10 회, 6 회 내지 8 회, 8 회 내지 12 회, 8 회 내지 10 회, 또는 10 회 내지 12 회일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 포획을 통해 상기 증폭 산물 중 특정 DNA 서열(돌연변이 DNA)을 분리해낼 수 있다. 상기 포획은 혼성화에 의한 것으로, 예를 들어, 용액-기반 혼성화(solution-based hybridization) 방식일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 프로브 분자 중 일부 염기는 비오틴화된 것일 수 있다. 상기 비오틴화 염기를 포함하는 프로브와 혼성화된 DNA 단편은 스트렙타비딘이 코팅된 비드를 이용하여 선택적으로 분리될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 혼성화 과정에서 핵산 프로브와 함께 블로킹 올리고뉴클레오티드를 이용하여 정상 DNA의 PCR 증폭을 방지할 수 있다. 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드는 정상 DNA의 염기서열과 상보적인 올리고뉴클레오티드로서, 돌연변이 DNA 보다 정상 DNA 와 더 높은 효율로 결합함으로써, 정상 DNA의 PCR 증폭을 방지하는 물질이다.
도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드는 정상 DNA 염기서열과 상보적이므로, 상기 정상 DNA에 높은 친화도로 결합하여 상기 정상 DNA의 PCR 증폭을 방지할 수 있다. 그러나, 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드의 염기는 돌연변이 DNA와 완벽하게 상보적이지 않으므로(염기 불일치), 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드와 상기 돌연변이 DNA 의 결합도는 상대적으로 낮다. 이에 따라, 상기 돌연변이 DNA 는 상기 정상 DNA 보다 상대적으로 잘 PCR 증폭되어서, 정상 DNA 의 PCR 산물 양 과 돌연변이 DNA 의 PCR 산물 양의 비율은 왜곡(bias)될 수 있다. 그러나, 상기 분자 바코드와 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드를 동시에 이용함으로써, 상기 분자 바코드와 표적 DNA 염기서열을 같이 읽어 돌연변이가 있는 DNA 가닥의 분자 바코드 수를 계산하여 돌연변이 비율을 환산하여, 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드에 따른 증폭 왜곡과 관계 없이 원 시료에서 DNA 돌연변이 비율을 정량적으로 측정할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드는 LNA(locked nucleic acid, PNA(peptide nucleic acid), 또는 3'-변형 올리고뉴클레오티드(3'-modified oligonucleotide)일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드는 4 내지 20 개의 뉴클레오티드로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드는 5 내지 50 개의 뉴클레오티드, 5 내지 40 개의 뉴클레오티드, 5 내지 30 개의 뉴클레오티드, 5 내지 20 개의 뉴클레오티드, 5 내지 10 개의 뉴클레오티드, 10 내지 50 개의 뉴클레오티드, 10 내지 40 개의 뉴클레오티드, 10 내지 30 개의 뉴클레오티드, 10 내지 20 개의 뉴클레오티드, 20 내지 50 개의 뉴클레오티드, 20 내지 40 개의 뉴클레오티드, 20 내지 30 개의 뉴클레오티드, 30 내지 50 개의 뉴클레오티드, 30 내지 40 개의 뉴클레오티드, 또는 40 내지 50 개의 뉴클레오티드로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 혼성화는 약 40℃ 내지 약 95℃의 온도 범위에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 혼성화가 약 40℃ 미만에서 수행될 경우, 이중가닥인 DNA 단편이 단일가닥으로 분리가 되지 않아 블로킹 올리고뉴클레오티드와 상보적으로 결합하지 못할 수 있거나, 상기 DNA 단편이 단일가닥으로 분리되어 블로킹 리고뉴클레오티드와 결합하더라도 특정 DNA 단편이 아닌 불특정한 랜덤 DNA 단편과 결합될 가능성이 있기 때문에, 상기 혼성화는 약 40℃ 내지 약 95℃의 온도 범위에서 수행되는 것이 바람직하다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 혼성화가 약 95℃를 초과하여 수행될 경우, DNA 단편이 단일가닥으로만 존재하여, 상기 단일가닥 DNA가 블로킹 올리고뉴클레오티드와 결합하지 못하기 때문에, 상기 혼성화는 약 40℃ 내지 약 95℃의 온도 범위에서 수행되는 것이 바람직하다.
예를 들어, 상기 혼성화는 약 40℃ 내지 약 95℃, 약 40℃ 내지 약 80℃, 약 40℃ 내지 약 65℃, 약 40℃ 내지 약 50℃, 약 50℃ 내지 약 95℃, 약 50℃ 내지 약 80℃, 약 50℃ 내지 약 65℃, 약 65℃ 내지 약 95℃, 약 65℃ 내지 약 80℃, 또는 약 80℃ 내지 약 95℃의 온도 범위에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 혼성화는 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드의 농도가 상기 프로브의 농도에 대해 약 1 배 내지 약 100 배인 범위에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드의 농도가 상기 프로브 농도에 대해 약 1배 미만일 경우, 충분한 양의 블로킹 올리고뉴클레오티드가 혼합물에 존재하지 않아, 핵산 프로브가 돌연변이가 있는 DNA 가닥을 선택적으로 포획하지 못할 수 있다. 또한, 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드의 농도가 상기 프로브 농도에 대해 약 100 배 초과일 경우, 다량의 블로킹 올리고뉴클레오티드가 혼합물에 존재하여 핵산 프로브와 경쟁적으로 DNA 단편과 결합하게 된다. 이에, 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드로 인해 해당 영역의 DNA 단편은 핵산 프로브와의 결합 확률이 낮아져 포획률 효율이 감소할 수 있으므로, 상기 혼성화는 상기 올리고뉴클레오티드의 농도가 상기 프로브의 농도에 대해 약 1 배 내지 약 100 배인 범위에서 수행되는 것이 바람직하다.
예를 들어, 상기 올리고뉴클레오티드의 농도가 상기 프로브의 농도에 대해 약 1 배 내지 약 100 배, 약 1 배 내지 약 50 배, 약 1 배 내지 약 20 배, 약 1 배 내지 약 10 배, 약 10 배 내지 약 100 배, 약 10 배 내지 약 50 배, 약 10 배 내지 약 20 배, 약 20 배 내지 약 100 배, 약 20 배 내지 약 50 배, 또는 약 50 배 내지 약 100 배일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 혼성화는 약 1 시간 내지 약 24 시간 동안 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화가 1 시간 미만으로 수행될 경우 핵산 프로브, 블로킹 올리고뉴클레오티드, 및 DNA 단편이 결합할 시간이 부족하여 충분한 포획물을 획득하지 못할 수 있으므로, 상기 혼성화는 약 1 시간 내지 약 24 시간 동안 수행되는 것이 바람직하다.
예를 들어, 상기 혼성화는 약 1 시간 내지 약 24 시간, 약 1 시간 내지 약 20 시간, 약 1 시간 내지 약 16 시간, 약 1 시간 내지 약 12 시간, 약 1 시간 내지 약 6 시간, 약 6 시간 내지 약 24 시간, 약 6 시간 내지 약 20 시간, 약 6 시간 내지 약 16 시간, 약 6 시간 내지 약 12 시간, 약 12 시간 내지 약 24 시간, 약 12 시간 내지 약 20 시간, 약 12 시간 내지 약 16 시간, 약 16 시간 내지 약 24 시간, 약 16 시간 내지 약 20 시간, 또는 약 20 시간 내지 약 24 시간 동안 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 포획된 산물을 공통 프라이머 서열을 이용하여 증폭시킴으로써, 차세대 염기서열 분석을 위한 라이브러리를 제조할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 포획된 산물을 증폭하는 것은, 상기 포획된 산물에 존재하는 분자 바코드에는 영향을 주지 않으므로, 이 단계에서 생성된 산물은 상기 분자 바코드를 분석함으로써 제거할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 2 측면은, 본원의 제 1측면에 따른 방법에 의해 제조된 라이브러리에 대해 차세대 염기서열 분석을 수행하는 것; 상기 생성물 중 어댑터 상보 서열 및 분자 바코드 서열을 제거하고 레퍼런스 서열에 정렬하는 것; 상기 정렬된 서열에 분자 바코드를 재부착하는 것; 상기 재부착된 서열에 대해 서열 분석을 수행하는 것을 포함하는, 차세대 염기 서열 분석을 이용한 소량 돌연변이 서열 검출 방법을 제공한다.
본원의 제 2측면에 따른 검출 방법에 대하여, 본원의 제 1측면과 중복되는 부분들에 대해서는 상세한 설명을 생략하였으나, 그 설명이 생략되었더라도 본원의 제 1 측면에 기재된 내용은 본원의 제 2 측면에 동일하게 적용될 수 있다.
도 4 및 도 5를 통해, 소량 돌연변이 서열 검출 방법을 설명할 수 있다. 먼저, 상기 라이브러리 제조 방법에 의해 제조된 라이브러리에 대해 차세대 염기서열 분석을 수행한다. 그 후, FASTQ Filtration 과정에서 상기 차세대 염기서열 분석에 의해 생성된 데이터 파일 중 어댑터 상보 서열과 분자 바코드 서열을 제거한다. 예를 들어, 상기 복수개의 증폭 산물에서 동일한 분자 바코드가 확인되는 경우, 이를 중복으로 결정하여 제거하는 것일 수 있다. 제거하지 않을 경우, 레퍼런스 서열에 정렬 시 리드 서열 외 추가 서열이 존재하면 특정 영역이 아닌 랜덤한 영역에 잘못 정렬될 수 있다.
그 후, 상기 어댑터 서열 및 분자 바코드 서열이 제거된 서열을 레퍼런스 서열에 정렬한다. 상기 레퍼런스 서열은 당해 분야에서 이용 가능한 서열 데이터베이스에 저장되어 있는 서열 정보일 수 있다. 상기 리드의 정렬은 당해 분야에 알려진 서열 얼라인먼트(alignment) 도구 또는 리드 정렬을 위해 개발된 도구를 이용하여 수행될 수 있다. 상기 서열 얼라인먼트 도구는 예를 들면, BWA, BarraCUDA, BBMap, BLASTN, Bowtie, NextGENe, 또는 UGENE일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
다음으로, 상기 정렬된 서열에 주어진 고유 번호(sequence identifier)를 이용하여 Sorting 과정에서 추출한 분자 바코드를 각 DNA 서열에 재부착한다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 분자 바코드를 재부착하는 이유는, 원 DNA 시료에서 DNA 돌연변이 비율을 정량하기 위한 것이다. 상기 분자 바코드의 비율을 계산함으로써, 증폭된 돌연변이 비율을 증폭 전 DNA 돌연변이의 비율로 환산할 수 있다. 예를 들어, 상기 분자 바코드를 제거하지 않고 서열 분석을 진행할 경우, 정상적으로 작업 수행이 불가능할 수 있다.
마지막으로, 상기 분자 바코드 재부착 후 서열 분석을 통해 소량 돌연변이 서열을 검출하는 단계는, 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드에 의한 왜곡 현상에 따라, 증폭 전 후에 변화하는 소량 돌연변이 서열의 비율을 상기 재부착된 분자 바코드를 통하여 환산하는 것을 추가 포함하는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드는 정상 DNA 염기서열과 상보적이므로, 상기 정상 DNA에 높은 친화도로 결합하여 상기 정상 DNA의 PCR 증폭을 방지할 수 있다. 그러나, 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드의 염기는 돌연변이 DNA와 완벽하게 상보적이지 않으므로 (염기 불일치), 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드와 상기 돌연변이 DNA 의 결합도는 상대적으로 낮다. 이에 따라, 상기 돌연변이 DNA 는 상기 정상 DNA 보다 상대적으로 잘 PCR 증폭되어서, 정상 DNA 의 PCR 산물 양 과 돌연변이 DNA 의 PCR 산물 양의 비율은 왜곡(bias)될 수 있다. 그러나, 상기 분자 바코드와 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드를 동시에 이용함으로써, 상기 분자 바코드와 표적 DNA 염기서열을 같이 읽어 돌연변이가 있는 DNA 가닥의 분자 바코드 수를 계산하여 돌연변이 비율을 환산하여, 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드에 따른 증폭 왜곡과 관계 없이 원 시료에서 DNA 돌연변이 비율을 정량적으로 측정할 수 있다.
이하, 본원의 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 본원의 이해를 돕기 위하여 예시하는 것 일뿐, 본원의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
라이브러리 제작
Horizon 사의 세포-유리 DNA(cell-free DNA) 표준물질 (reference material)을 이용하여 NGS를 통해 세포-유리 DNA 의 서열을 분석하기 위하여 라이브러리를 제작하였다.
먼저, 라이브러리 제작은 일반적인 Illumina 플랫폼의 라이브러리 키트를 사용하였다. 첫 번째로, DNA의 양 말단을 균일하게 맞춰주며 NGS 장비에서 flowcell의 프라이머와 결합하는 어댑터(adaptor)를 단일 방향으로 결합 효율을 높이기 위한 End-repair 및 A-tailing 단계, 절반의 서열을 갖는 어댑터를 DNA 양 말단에 결합시키는 Adaptor-ligation 단계로 이루어졌다. 어댑터는 DNA 방향으로 8개의 무작위적 뉴클레오티드로 이루어진 분자 바코드를 포함하였다.
다음으로, DNA의 양 말단에 부착된 절반 서열의 어댑터(어댑터 상보 서열)를 기준으로, 온전한 어댑터를 붙이기 위한 PCR을 진행하였다. 온전한 어댑터는 NGS를 위한 어댑터 상보 서열, 샘플 고유 서열, 분자 바코드, 고정 서열로 이루어진 한 쌍의 프라이머를 이용하였다. 분자 바코드와, 분석하고자 하는 DNA 서열을 구분하기 위하여 4개의 뉴클레오티드로 이루어진 고정 서열을 분자 바코드와 DNA 사이에 위치시켰다.
절반 서열의 어댑터가 결합된 DNA 20 uL, 프라이머 각각 2.5 uL씩, 증폭 혼합액(NG218-01) 25 uL를 포함하여, 총 50 uL의 혼합액을 하기 조건으로 반응시켰다. 반응은 98℃ 에서 2 분 후 98℃ 20 초, 65℃ 30 초, 72℃ 1 분으로 이루어진 사이클을 6 내지 10회 반복한 뒤, 72℃ 에서 10 분 동안 반응하여 4℃에 보관하였다.
다음으로, 분자 바코드가 부착된 DNA 중 특정 DNA 서열만을 분석하기 위하여 In-solution hybridization 방법으로 DNA 포획을 진행하였다. In-solution hybridization 방법은 특정 DNA 서열과 상보적으로 결합할 수 있는 뉴클레오티드로 이루어진 핵산 프로브를, 분자 바코드가 부착된 DNA 1 ug과 혼합하여 특정 DNA 분자만을 선별하는 방법이다.
먼저, 선별하고자 하는 특정 DNA의 일반적인 서열과 상보적인 서열을 갖는 블로킹 올리고뉴클레오티드를 상기 핵산 프로브와 같이 혼합하여, 일반적인 서열을 갖는 DNA의 선별 효율을 낮추고 돌연변이 서열을 갖는 DNA의 선별 효율을 높여주었다. 분자 바코드가 부착된 DNA를 95℃에 10 분 반응 후, 핵산 프로브와 상기 핵산 프로브 대비 5 배의 블로킹 올리고뉴클레오티드를 혼합하여 65℃에 4시간 동안 반응 시켰다. 다음으로, 4시간 반응한 혼합액을 자성을 띄는 스트랩타비딘 비드와 혼합한 후 65℃에서 45분 동안 반응시켰다. 스트랩타비딘 비드는 프로브의 특정 분자와 결합하며, 이에 따라 핵산 프로브와 결합된 특정 DNA를 선별하였다.
그 후, 선별된 DNA를 정제하기 위하여 65℃와 상온에서 반복 세척하였다. 선별된 DNA의 어댑터 상보서열을 기준으로 PCR 진행
선별된 DNA 20 uL, 포워드/리버스 프라이머 혼합액 5 uL, 증폭 혼합액 (NG218-01) 25 uL를 포함하여 총 50 uL의 혼합액을 하기 조건으로 반응시켰다. 반응은, 98℃ 에서 45 초 반응 후 98℃ 15 초, 60℃ 30 초, 72℃ 1 분으로 이루어진 사이클을 12회 반복한 뒤, 72℃에서 10 분 동안 반응하여 4℃에 보관하였다. 정제 비드(Purification bead, DxSeq) 75 uL와 증폭된 혼합물을 반응시켜 증폭된 DNA를 정제하였다(실시예 1).
라이브러리 제작
상기 혼성화 조건에 따른 돌연변이 검출의 최적화를 위하여, 상기 실시예 1의 라이브러리 제작 방법과 동일하되, 캡쳐 프로브와 블로킹 올리고뉴클레오티드를 혼합하여 포획하는 반응에서 반응 온도와 블로킹 올리고뉴클레오티드의 농도, 및 반응 시간만 다르게 하여 각각의 라이브러리를 제작하였다. 각 실시예 2 내지 실시예 11에 대한 혼성화 반응 온도, 블로킹 올리고뉴클레오티드의 농도, 및 반응 시간은 하기 표 1 내지 4에 나타낸 바와 같다.
핵산 서열 분석
상기 혼성화(In-solution hybridization) 및 PCR의 최종 산물을 Illumina사의 MiSeq 장비를 이용하여 시퀀싱 진행 후, 염기서열 정보를 가지고 있는 원자료(raw data)인 FASTQ 데이터파일을 생성하였다. FASTQ 데이터파일은 상기 최종 산물에 포함된 모든 DNA 분자 서열, 어댑터 서열 및 분자 바코드 서열 정보를 포함하였다.
다음으로, 상기 FASTQ 에 존재하는 모든 서열 중, 어댑터 서열과 분자 바코드 서열을 제거한 후 DNA 분자 서열들을 인간 표준 게놈 (Human Reference Genome)에 정렬하였다. 정렬 후 각 DNA 서열에 주어진 고유 번호(sequence identifier)를 사용하여 분자 바코드 서열을 재부착하였다.
이후, DNA 서열에 존재하는 변이의 종류 및 비율을 확인하는 작업인 염기서열 변이정보 추출(variant calling)을 수행하였다(도 4).
블로킹 올리고뉴클레오티드에 의한 왜곡 현상으로 인해, 돌연변이 DNA의 비율은 증폭 전과 달라지게 되는 것을 재부착된 분자 바코드를 통해 증폭 전 돌연변이 비율을 환산하였다.
도 6 및 표 1은, 동일한 혼성화 온도 및 반응 시간에서, 프로브 대비 블로킹 올리고뉴클레오티드의 농도(배수)에 따른 돌연변이 검출 빈도를 나타낸 그래프이다(대립 유전자 빈도 1%, ◆: KRAS-G12D, ■: PIK3CA E545K, ▲: TP53 R175H).
조건 온도(℃) 농도( 프로브 대비 블로킹 올리고의 배수) 시간(hr)
실시예1 65 0 4
실시예 2 65 1 4
실시예 3 65 10 4
실시예 4 65 100 4
도 6 및 표 1에서 나타낸 바와 같이, 분자 바코드가 부착된 DNA를 핵산 프로브와 블로킹 올리고뉴클레오티드와 혼합한 포획 반응을 65℃에서 4 시간 동안, 프로브 대비 블로킹 올리고뉴클레오티드의 농도를 0 배(실시예 1), 1 배(실시예 2), 10 배(실시예 3), 및 100 배(실시예 4)의 농도로 반응시킨 실시예 3에서 가장 높은 돌연변이 빈도를 나타내었다.
도 7 및 표 2는, 동일한 혼성화 반응 시간 및 블로킹 올리고뉴클레오티드 농도에서, 혼성화 반응 온도에 따른 돌연변이 검출 빈도를 나타낸 그래프이다(대립 유전자 빈도 1%, ◆: KRAS-G12D, ■: PIK3CA E545K, ▲: TP53 R175H).
조건 온도(℃) 농도( 프로브 대비 블로킹 올리고의 배수) 시간(hr)
실시예 5 57 10 4
실시예 6 61 10 4
실시예 7 65 10 4
도 7 및 표 2에서 나타낸 바와 같이, 분자 바코드가 부착된 DNA를 핵산 프로브와 블로킹 올리고뉴클레오티드와 혼합한 포획 반응을 65℃에서 4 시간 동안, 프로브 대비 블로킹 올리고뉴클레오티드의 농도를 10 배의 농도로 반응시킨 실시예 7에서 가장 높은 돌연변이 빈도를 나타내었다.
도 8과 표 3은, 동일한 혼성화 온도 및 블로킹 올리고뉴클레오티드 농도에서, 혼성화 반응 시간에 따른 돌연변이 검출 빈도를 나타낸 그래프이다(대립 유전자 빈도, ◆: KRAS-G12D, ■: PIK3CA E545K, ▲: TP53 R175H).
조건 온도(℃) 농도( 프로브 대비 블로킹 올리고의 배수) 시간(hr)
실시예 8 65 10 2
실시예 9 65 10 4
실시예 10 65 10 6
도 8 및 표 3에서 나타낸 바와 같이, 혼성화 반응 시간에 따라 돌연변이의 빈도는 증가하나, 4 시간 이후로 일정한 수준으로 유지되는 것을 확인할 수 있었다.
표 4는, 프로브 농도 대비 블로킹 올리고뉴클레오티드의 농도에 따른 돌연변이 검출 빈도를 나타낸 그래프이다(대립 유전자 빈도 1%). 하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 프로브 농도 대비 블로킹 올리고뉴클레오티드의 농도를 5배로 높인 결과 대립 유전자 빈도가 13 내지 17배 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
조건 온도(℃) 농도( 프로브 대비 블로킹 올리고의 배수)
실시예 11 65 10
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> DXOME CO., LTD. <120> SMALL MUTATION AMPLIFICATION AND QUANTIFICATION METHOD USING MOLECULAR BARCODE AND BLOCKING OLIGONUCLEOTIDE <130> DP20180500KR <150> KR 10-2017-0113828 <151> 2017-09-06 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer including molecular barcode <400> 1 aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca ttactcgaca ctctttccct acacgacgct 60 cttccgatct nnnnnnnngt ca 82 <210> 2 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 2 caagcagaag acggcatacg agattatagc ctgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatctnnnn nnnngtca 78 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> blocking oligonucleotide <400> 3 gttggagctg gtggcgta 18

Claims (10)

  1. 분석 대상 이중가닥 DNA 단편의 양 말단에 어댑터를 부착하는 것;
    상기 각 DNA 단편을 증폭하기 위한 분자바코드가 포함된 프라이머 쌍을 제공하는 것; 및
    상기 프라이머 쌍을 이용하여 상기 어댑터가 부착된 DNA 단편을 증폭함으로써, 상기 분자 바코드를 포함하는 상기 각 DNA 단편의 증폭산물을 생성하는 것;
    상기 분자 바코드를 포함하는 DNA 단편의 증폭산물 중, 선별하고자 하는 특정 DNA 서열을 핵산 프로브 및 블로킹 올리고뉴클레오티드를 이용하여 혼성화함으로써 포획하는 것;
    상기 포획된 산물을 공통 프라이머 서열을 이용해 증폭하는 것
    을 포함하는, 차세대 염기서열 분석을 위한 라이브러리 제조 방법으로서,
    상기 프라이머 쌍을 이루는 프라이머 각각은,
    i) 상기 어댑터에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 어댑터 상보 서열,
    ii) 각 DNA 단편마다 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 샘플 고유 서열,
    iii) 각 DNA 단편에 대해 고유한 뉴클레오티드 서열을 갖는 분자 바코드, 및
    iv) 상기 분자 바코드와 DNA 서열을 구분하기 위한 고정 서열을 포함하는 것이고;
    상기 블로킹 올리고뉴클레오티드는 DNA 단편들 중 선별하고자 하는 특정 DNA 서열의 야생형 서열(wild-type)과 상보적인 서열을 갖는 것이고;
    상기 혼성화는 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드의 농도가 상기 프로브의 농도에 대해 1 배 내지 10 배인 범위에서 수행되는 것인;
    차세대 염기서열 분석을 위한 라이브러리 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 분자 바코드는 4 내지 10 개의 뉴클레오티드로 이루어진 것인, 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 블로킹 올리고뉴클레오티드는 15 내지 50 개의 뉴클레오티드로 이루어진 것인, 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 블로킹 올리고뉴클레오티드는 LNA(locked nucleic acid, PNA(peptide nucleic acid), 또는 3'-변형 올리고뉴클레오티드(3'-modified oligonucleotide)인 것인, 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 프라이머 쌍을 이용한 증폭 반응의 사이클은 4 회 내지 12 회 동안 수행되는 것인, 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 혼성화는 40℃ 내지 95℃의 온도 범위에서 수행되는 것인, 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 혼성화는 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드의 농도가 상기 프로브의 농도에 대해 10배인 범위에서 수행되는 것인, 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 혼성화는 1 시간 내지 24 시간 동안 수행되는 것인, 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 라이브러리에 대해 차세대 염기서열 분석을 수행하는 것;
    상기 차세대 염기서열 분석이 수행된 라이브러리 중 어댑터 상보 서열 및 분자 바코드 서열을 제거하고 레퍼런스 서열에 정렬하는 것;
    상기 정렬된 서열에 분자 바코드를 재부착하는 것;
    상기 재부착된 서열에 대해 서열 분석을 수행하는 것
    을 포함하는,
    차세대 염기 서열 분석을 이용한 소량 돌연변이 증폭 및 정량 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 서열 분석은,
    상기 블로킹 올리고뉴클레오티드에 의한 왜곡 현상에 따라, 증폭 전 후에 변화하는 소량 돌연변이 서열의 비율을 상기 재부착된 분자 바코드를 통하여 환산하는 것을 추가 포함하는 것인, 방법.

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