KR102129007B1 - Pharmaceutical composition for treating learning and memory disorder induced by sleep disturbance - Google Patents

Pharmaceutical composition for treating learning and memory disorder induced by sleep disturbance Download PDF

Info

Publication number
KR102129007B1
KR102129007B1 KR1020180150549A KR20180150549A KR102129007B1 KR 102129007 B1 KR102129007 B1 KR 102129007B1 KR 1020180150549 A KR1020180150549 A KR 1020180150549A KR 20180150549 A KR20180150549 A KR 20180150549A KR 102129007 B1 KR102129007 B1 KR 102129007B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
protein
seq
glcnac
test
zebrafish
Prior art date
Application number
KR1020180150549A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR20200064430A (en
Inventor
한인옥
이윤경
박지원
Original Assignee
인하대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 인하대학교 산학협력단 filed Critical 인하대학교 산학협력단
Priority to KR1020180150549A priority Critical patent/KR102129007B1/en
Publication of KR20200064430A publication Critical patent/KR20200064430A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR102129007B1 publication Critical patent/KR102129007B1/en

Links

Images

Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2440/00Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material
    • G01N2440/38Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material addition of carbohydrates, e.g. glycosylation, glycation
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2560/00Chemical aspects of mass spectrometric analysis of biological material

Abstract

본 발명은 UDP-GlcNAc, OGT(O-linked GlcNAc transferase) 및 O-GlcNAc화 기질을 포함하는 반응액에 피검 화합물 또는 조성물을 처리하는 단계; 상기 기질의 O-GlcNAc화 정도를 확인하는 단계; 및 피검 화합물 또는 조성물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 기질의 O-GlcNAc화를 유의하게 증가시킨 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는 수면장애에 의해 유발되는 학습 및 기억 장애 치료용 약학적 조성물을 제공한다.The present invention comprises the steps of treating a test compound or composition in a reaction solution containing UDP-GlcNAc, OGT (O-linked GlcNAc transferase) and O-GlcNAc-forming substrate; Confirming the degree of O-GlcNAcization of the substrate; And selecting a test compound or composition which significantly increased O-GlcNAc of the substrate compared to a control group not treated with the test compound or composition, for the treatment of learning and memory disorders caused by sleep disorders. Provided is a composition.

Description

수면장애에 의해 유발되는 학습 및 기억 장애 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for treating learning and memory disorder induced by sleep disturbance}Pharmaceutical composition for treating learning and memory disorder induced by sleep disturbance}

본 발명은 학습 및 기억 장애 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 더 상세하게는 수면장애에 의해 유발되는 학습 및 기억 장애 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment of learning and memory disorders, and more particularly, to a pharmaceutical composition for the treatment of learning and memory disorders caused by sleep disorders.

현재까지 동물 실험과 인간에 관한 연구에 따르면 수면(sleep)의 양과 질 모두가 학습과 기억(learning and memory, L/M)에 큰 영향을 미친다는 것을 시사한다. 수면의 핵심 기능은 수면구조와 두뇌의 복잡성의 차이와 상관없이 단백질 기능이 수면의 필요성과 같이 종 전체에서 현저하게 일관되고 계통 발생 라인(phylogenetic lines)을 넘어서 보존되어 있기 때문에 세포 수준에서 분자 현상의 관리일 가능성이 높다. 번역 후 변형(post-translational modifications)은 단기 정보 저장에 필수적이며 장기간 정보 저장을 위해서는 새로운 단백질의 합성이 필요하다. 기억과 관련된 유전자 발현에 대한 많은 연구는 다른 유전자의 발현을 유도하고 뉴런의 기억 형성 중에 시냅스 가소성(synaptic plasticity)을 조절하는 N-methyl-D-aspartate(NMDA), brain-derived neurotrophic factor(BDNF), Homer1, cyclic AMP(cAMP) response element binding protein(CREB), CCAAT enhancer binding protein(C/EBP), early growth response factor(egr), c-fos, activity-regulated cytoskeleton-associated protein(Arc) 및 activating protein 1(AP-1)을 비롯한 몇몇 전사 인자 및 직접 초기 유전자의 활성 의존성 변화를 조사했다. 신진대사와 L/M의 핵심성분인 cAMP 의존성 단백질 카이네이즈 A(PKA)의 중요한 표적 중 하나인 CREB는 단기간에서 장기간의 기억으로의 전환에 중요하며 그 기능 결함은 많은 동물 모델에서 기억상실(memory deficits)을 일으킨다. 적절한 수면(proper sleep)은 정상적인 기억 기능을 위한 필수 요소로 간주되지만 근본적인 분자 메커니즘은 아직 많이 알려지지 않았으며 과학적 탐구의 영역으로 남아있다. 이와 관련하여 대한민국 등록특허 제1797010호는 기억력 증진 및 학습능력 향상을 위한 조성물에 대해 개시하고 있다. So far, animal experiments and human studies suggest that both the amount and quality of sleep have a significant impact on learning and memory (L/M). The key function of sleep is the molecular phenomena at the cellular level because protein function is markedly consistent across species, such as the need for sleep, and preserved beyond phylogenetic lines, regardless of differences in sleep structure and brain complexity. It is likely to be management. Post-translational modifications are essential for short-term information storage and the synthesis of new proteins is necessary for long-term information storage. Many studies on gene expression related to memory have been linked to N-methyl-D-aspartate (NMDA), a brain-derived neurotrophic factor (BDNF) that induces the expression of other genes and regulates synaptic plasticity during neuronal memory formation. , Homer1, cyclic AMP(cAMP) response element binding protein(CREB), CCAAT enhancer binding protein(C/EBP), early growth response factor(egr), c-fos, activity-regulated cytoskeleton-associated protein(Arc) and activating Several transcription factors, including protein 1 (AP-1), and the activity-dependent changes of direct early genes were investigated. CREB, one of the important targets of cAMP-dependent protein kinase A (PKA), a key component of metabolism and L/M, is important for the transition from short-term to long-term memory, and its functional defects are memory deficits in many animal models. ). Proper sleep is considered an essential component of normal memory function, but the underlying molecular mechanisms remain largely unknown and remain a domain of scientific inquiry. In this regard, Republic of Korea Patent No. 1797010 discloses a composition for improving memory and improving learning ability.

그러나 상기 선행기술의 경우, 항말라리아제로 널리 사용되고 있는 아모다이아퀸을 유효성분으로 하는 조성물로 O-GlcNAc hydrolase(OGA)의 억제를 통해 수면장애에 의한 학습 및 기억 장애 치료에 관한 연구는 아직 알려진 바가 없다. However, in the case of the prior art, a study on the treatment of learning disorders and memory disorders due to sleep disorders through the inhibition of O-GlcNAc hydrolase (OGA) as a composition containing amodiaquine widely used as an anti-malaria agent is not yet known. none.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 부작용이 없고 신경세포 보호능력이 우수하며 기억력 증강 및 학습능력 향상에 효과적인 수면장애에 의해 유발되는 학습 및 기억 장애 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.The present invention is to solve a number of problems, including the above problems, has no side effects, has excellent neuron protection ability, and is effective in enhancing memory and improving learning ability. It is an object to provide a composition. However, these problems are exemplary, and the scope of the present invention is not limited thereby.

본 발명의 일 관점에 따르면, UDP-GlcNAc, OGT(O-linked GlcNAc transferase) 및 O-GlcNAc화 기질을 포함하는 반응액에 피검 화합물 또는 조성물을 처리하는 단계; 상기 기질의 O-GlcNAc화 정도를 확인하는 단계; 및 피검 화합물 또는 조성물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 기질의 O-GlcNAc화를 유의하게 증가시킨 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는 수면장애에 의해 유발되는 학습 및 기억 장애 치료제 후보물질의 스크리닝 방법이 제공된다.According to an aspect of the present invention, treating a test compound or composition in a reaction solution comprising UDP-GlcNAc, O-linked GlcNAc transferase (OTG) and O-GlcNAc-forming substrate; Confirming the degree of O-GlcNAcization of the substrate; And selecting a test compound or composition that significantly increased O-GlcNAc formation of the substrate compared to a control group not treated with the test compound or composition. A screening method is provided.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 실험동물에 대하여 수면박탈을 수행하는 단계; 상기 수면박탈이 되기 전, 동시에 또는 후에 실험동물에 피검 화합물 또는 조성물을 투여하는 단계; 및 상기 실험동물의 뇌에서의 OGT 발현 또는 활성을 증가시킨 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는 수면장애에 의해 유발되는 학습 및 기억 장애 치료제 후보물질의 스크리닝 방법이 제공된다.According to another aspect of the invention, the step of performing sleep deprivation on the experimental animal; Administering a test compound or composition to the test animal before, simultaneously or after the sleep deprivation; And screening a test compound or composition that increases OGT expression or activity in the brain of the experimental animal.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, OGT 활성화제를 유효성분으로 포함하는 수면장애에 의해 유발되는 학습 및 기억 장애 치료용 약학적 조성물이 제공된다.According to another aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for the treatment of learning and memory disorders caused by sleep disorders comprising an OGT activator as an active ingredient.

본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, OGT 활성화제를 유효성분으로 포함하는 수면장애에 의해 유발되는 기억력 및 인지능력 감소 개선용 건강기능식품이 제공된다.According to another aspect of the present invention, there is provided a health functional food for reducing memory and cognitive ability caused by sleep disorders containing OGT activator as an active ingredient.

상기한 바와 같이 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 학습 및 기억 장애 치료용 약학적 조성물은 부작용 없이 수면장애(SD)에 의해 유발된 학습 및 기억 장애를 신속하게 회복하고 보다 향상된 기억력 및 학습능력 향상 효과를 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.As described above, according to one embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition for the treatment of learning and memory disorders of the present invention quickly recovers learning and memory disorders caused by sleep disorder (SD) without side effects, and improves memory and Can improve the learning ability. Of course, the scope of the present invention is not limited by these effects.

도 1a는 성체 제브라피쉬 SD에서 수면장애(SD)에 의해 유도된 행동 및 인지 변화를 관찰한 것으로 SD의 표시된 시점에서 제브라피쉬 탐색 활동의 대표적인 흔적을 분석한 그래프이다. 막대는 1시간 세션 동안 상단, 중간 및 하단 레이어의 유영 횟수를 나타낸다. n=19-32/실험군; Tukey 다중 비교 사후검정 결과로, 하층 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01 및 c는 P < 0.001를 나타냄. 정상적인 명/암 조건 하에서 12시간 내지 144시간 동안 회복 유무에 관계없이 3, 6, 12, 24, 48 및 72시간 동안 연장된 빛 단계 하에서 제브라피쉬를 노출시킴으로써 유도되었다.
도 1b는 SD의 표시된 시점에서 신규 탱크 잠수 테스트(novel tank diving test) 결과를 분석한 그래프이다. 막대는 1시간 세션 동안 상단, 중간 및 하단에 대한 유영 횟수를 나타낸다. n=9-22/실험군; Tukey 다중 비교 사후검정 결과로, 상층 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01 및 c는 P < 0.001를 나타냄.
도 1c는 본 발명의 수동 회피 시험 탱크(passive avoidance test tank)의 개략적인 형태를 나타내는 개략도이다.
도 1d는 명시된 SD 시점의 대표적인 수동 회피 테스트를 결과를 분석한 그래프이다. 교차 시간은 훈련 세션에서 3회 측정되었고 2시간 간격 후에 시험 세션에서 1회 측정되었다. 그래프는 교차 시간 및 SEM의 평균을 나타낸다. n=10-18/실험군; 사후검정 스튜던트-뉴만-쿨스(Student-Newman-Keuls) 검정 결과로, 1차 학습 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01 및 c는 P < 0.001를 나타내고, #은 윌콕슨(Wicoxon) 순위 합계 검정 결과로 3차 학습 P > 0.05을 나타냄.
도 1e는 72시간 SD 후 정상적인 명암주기에서 지시된 회복 시점에서의 탐색 활동 결과를 나타내는 그래프이다. n=14-25/실험군; 튜키(Tukey's) 다중 비교 사후검정 결과로, 하층 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01 및 c는 P < 0.001를 나타냄.
도 1f는 72h SD 후 정상적인 명암주기 하에서 지시된 회복 시간 지점에서 대표적인 수동 회피 시험 결과를 분석한 그래프이다. n=13-19/실험군; 스튜던트-뉴만-쿨스 사후검정 결과로, 1차 학습 대비 a는 P < 0.05, b는 P <0.01 및 c는 P < 0.001를 나타내고, #는 윌콕슨(Wilcoxon) 순위 합계 검정 결과로 3차 학습 대비 P > 0.05를 나타냄.
Cont, 대조군;
SD, 수면박탈;
T, 상단;
M, 중간;
B, 바닥;
L, 학습;
M, 기억;
T, 테스트;
R, 회복.
도 2a는 제브라피쉬 두뇌에서 L/M에 관여하는 유전자의 변화를 관찰한 것으로 표시된 SD 시점에서 선택된 유전자의 대표적인 PCR 및 정량 실시간 PCR 그래프이다. 막대는 세 가지 독립적인 실험의 평균과 SEM을 나타낸다. n=4/실험군; 튜키 다중 비교 사후검정 결과로, 0시간 또는 대조군 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01 및 c는 P < 0.001를 나타냄:
C, 대조군;
SD, 수면박탈;
Rec, 회복.
도 2b는 제브라피쉬 두뇌에서 L/M에 관여하는 유전자의 변화를 관찰한 것으로 72 시간 SD 실험군의 회복 시간을 분석한 그래프이다.
도 3a는 학습 훈련 유무에 따른 대조군과 SD 제브라피쉬의 뇌에서 HBP의 글루코스 대사 경로 효소와 대사 산물의 변화를 관찰한 것으로 글루코스 HBP의 플럭스 맵(Flux maps)이다.
도 3b는 학습 훈련 유무에 따른 대조군 또는 SD 제브라피쉬의 두뇌에서 GC-MS/MS에 의해 선택된 대사 물질의 정량을 분석한 그래프이다. 실험은 7번 반복하였다. n=31/실험군, 크루스칼-월리스(Kruskal-Wallis) 검정 결과로, a는 P < 0.05, b는 P < 0.01 및 c는 P < 0.001를 나타냄.
도 3c는 학습과제 수행 유무에 따른 SD 제브라피쉬 및 대조군의 두뇌에서 대사산물의 변화를 나타내는 해당과정(glycolysis) 및 TCA 주기의 플럭스 맵이다.
도 3d는 학습과제 수행 유무에 따른 SD 제브라피쉬 및 대조군의 두뇌에서 GC-MS/MS에 의해 선택된 대사산물의 정량을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 각 실험은 7차례 반복하였고, n=31/그룹이며 통계처리를 위해 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 검정을 적용한 결과, a는 P < 0.05, b는 P < 0.01을 나타낸다.
도 3e는 수면박탈 실험군(SD)의 SD 유도 시간에 따른 선택된 유전자(HK-1, HK-2, GK, PFKP-α, PFKP-β, PFKL-α, PFKL-β, G6PDH, PKM-α, GFPT-1, GFPT-2, OGT1, OGT2, OGA, TK-α, PYGB, GLUT1, GLUT3)의 PCR 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 사진(좌측) 및 상기 유전자들에 대한 정량적 실시간 PCR 결과를 분석한 결과를 나타내는 그래프(우측)이다. n=4/실험군; 통계처리를 위해 튜키 다중 비교 사후검정을 적용한 결과, 0시간 대비 a는 P < 0.05, b는 P <0.01, c는 P < 0.001을 나타낸다.
도 3f는 대조군의 학습 훈련 후 회복시간의 경과에 따른 선택된 유전자(HK-1, HK-2, GK, PFKP-α, PFKP-β, PFKL-α, PFKL-β, G6PDH, PKM-α, GFPT-1, GFPT-2, OGT1, OGT2, OGA, TK-α, PYGB, GLUT1, GLUT3)의 PCR 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 사진(좌측) 및 상기 유전자들에 대한 정량적 실시간 PCR 결과를 분석한 결과를 나타내는 그래프(우측)이다. n=4/실험군; 통계처리를 위해 튜키 다중 비교 사후검정을 적용한 결과, 0시간 대비 a는 P < 0.05, b는 P <0.01, c는 P < 0.001을 나타낸다.
도 3g는 72시간 SD 실험군의 학습훈련 후 회복시간의 경과에 따른 선택된 유전자(HK-1, HK-2, GK, PFKP-α, PFKP-β, PFKL-α, PFKL-β, G6PDH, PKM-α, GFPT-1, GFPT-2, OGT1, OGT2, OGA, TK-α, PYGB, GLUT1, GLUT3)의 PCR 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 사진(좌측) 및 상기 유전자들에 대한 정량적 실시간 PCR 결과를 분석한 결과를 나타내는 그래프(우측)이다. n=4/실험군; 통계처리를 위해 튜키 다중 비교 사후검정을 적용한 결과, 0시간 대비 a는 P < 0.05, b는 P <0.01, c는 P < 0.001을 나타낸다.
도 3h는 학습 및 기억 과정에서의 대조군 및 SD 제브라피쉬 실험군의 두뇌에서의 글루코스 대사 효소의 발현 변화를 관찰한 결과를 나타내는 그래프이다. 교차 시간은 훈련 및 시험 세션에서 측정되었다. 첫 번째 학습 세션 2시간 후에 1차 테스트 세션(M1)이 실시되었고, 첫 번째 학습 세션 24시간 경과 후 두 번째 학습 세션이 실시되었으며, 두 번째 학습 세션 2시간 후 및 24시간 후 각각 두 번째(M2) 및 세 번째(M3) 테스트 세션이 실시되었다. n=11~13/실험군으로, 통계처리를 위해 스튜던트-뉴만-쿨스 사후검정을 적용한 결과, c는 1차 학습 대비 P < 0.001를 나타내고, #는 윌콕슨 순위 합계 검정 결과로 3차 학습 대비 P > 0.05를 나타낸다.
도 3i는 대조군 또는 72 시간 SD 제브라피쉬 두뇌에서 회피 훈련 및 기억 테스트 후 표시된 시점에서 수행한 PCR 및 정량 실시간 PCR 결과를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 총 mRNA는 첫 번째 학습 세션 후 2시간 후(M1) 및 두 번째 학습 세션 후 2시간(M2) 및 24시간 후(M3) 수득하였다. 막대는 세 번 독립적인 실험에서의 평균 및 표준오차(SEM)를 나타내며, n=4/실험군으로 통계처리를 위해 튜키 다중 비교 사후검정을 적용한 결과, 대조군 대비 a는 P < 0.05, b는 P <0.01, c는 P < 0.001을 나타내며, 두 그룹 사이의 비교를 위해 대응표본 스튜던트 t-검정을 적용한 결과로, 대조군 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01을 나타낸다.
도 4a는 성체 제브라피쉬의 전체 두뇌의 구조를 개략적으로 도시한 개요도(좌측) 및 좌측의 박스는 a축 단면의 확대도이다. Dl(등쪽 중뇌의 측면 구역) 및 Vd(중뇌의 배쪽 지역)은 좌측 박스에 표시되었다.
도 4b는 대조군(C)과 72시간 SD 실험군(SD)에서 수동 회피 테스트 6시간 후 희생시킨 제브라피쉬의 종뇌를 대상으로 공초점 형광현미경을 이용하여 40배율로 촬영된 DAPI(청색) 염색 및 PKA-cα(좌측 패널, 녹색) 또는 p-CREB(우측 패널, 녹색)에 대한 각각의 면역형광 염색 이미지(x40) 및 상기 이미지들의 병합 이미지(상단) 및 상기 형광면역 염색 결과를 정량화하여 나타낸 그래프(하단)이다. 우측 패널에서 확대된 이미지는 흰색 박스로 표시하였다. 그래프는 PKA-cα 또는 p-CREB의 농도 측정결과를 나타낸다. 실험군당 4두의 실험동물을 사용하였고, 각 실험동물당 5개의 박편을 사용하였으며, 통계처리를 위해 튜키 다중 비교 사후검정을 적용한 결과, 대조군 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01, 및 c는 P < 0.001를 나타내며, 두 그룹 간 비교를 위해 대응표본 스튜던트 t-검정을 적용한 결과, 대조군 대비 b는 P < 0.01, c는 P < 0.001를 나타내며, 스케일 바는 50 μm을 나타낸다.
도 4c는 수동 회피 테스트 6시간 후 희생시킨 대조군(C) 및 72시간 SD 실험군(SD) 제브라피쉬로부터 적출된 뇌의 사이토졸(Cyt)과 핵(Nuc)에서 p-CREB와 CREB 발현을 웨스턴블랏 분석을 이용하여 분석한 결과를 나타내는 사진(상단) 및 상기 웨스턴블랏 분석 결과를 농도계적으로 정량화한 결과를 나타내는 그래프(하단)이다. p-CREB의 상대농도는 CREB로 정규화함으로써 정량적으로 측정되었다. n=20 또는 25/실험군으로, 통계처리를 위해 튜키 다중 비교 사후검증을 사용하였고, 대조군(C) 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01, c는 P < 0.001을 나타내고, 두 그룹 간의 비교를 위해 대응표본 스튜던트 t-검정을 적용한 결과, 대조군(C) 대비, a는 P < 0.05, b는 P < 0.01, c는 P < 0.001를 나타낸다:
L, 학습;
A.U., 임의 단위.
도 4d는 CRE 사이트에 결합된 p-CREB 및 CREB의 웨스턴블랏 분석 결과를 나타내는 사진(상단) 및 상기 웨스턴블랏 분석 결과를 농도계적으로 정량화한 결과를 나타내는 그래프(하단)이다. 제브라피쉬 뇌의 핵 분획물을 준비하고 비오틴화된 CRE-함유 올리고뉴클레오티드와 함께 배양하였다. 상대적 농도계를 정량적으로 측정하고 배수변화를 임의적 단위로 제시하였다. 실험은 3회 반복하였다. n=20 또는 25/실험군; 상기 그래프에서 통계처리를 위해 튜키 다중 비교 사후검증을 사용하였고, 대조군(Cont) 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01, c는 P < 0.001을 나타내고, 두 그룹 간의 비교를 위해 대응표본 스튜던트 t-검정을 적용한 결과, 대조군(C) 대비, a는 P < 0.05, b는 P < 0.01, c는 P < 0.001를 나타낸다:
C, 대조군;
SD, 수면장애;
L, 학습;
A. U., 임의 단위.
도 4e는 대조군(Cont) 및 72 시간 SD 실험군(SD) 제브라피쉬의 종뇌(telencephalon)에서의 DAPI(청색) 염색 및 O-GlcNAc, OGT 및 OGA(녹색) 각각에 대한 면역형광 염색 및 이들을 중첩한 일련의 공초점 형광현미경 이미지(상단, 40배) 및 대조군 대비 표적분자의 형광 정도를 계량화한 결과를 나타내는 그래프(하단)이다. 상단에서 확대된 이미지는 백색 상자에 표시되어 있으며, 실험군당 4두의 실험동물을 사용하였고, 각 실험동물 당 5개의 박편을 제작하였다. 상기 그래프에서 두 그룹사이의 비교를 위해 대응표본 스튜던트 t-검정을 적용하였고, 대조군 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01, c는 P < 0.001을 나타낸다:
Cont: 대조군;
SD: 72시간 SD(수면박탈) 실험군.
도 4f는 72시간 SD 실험군(SD) 또는 대조군(Cont) 제브라피쉬 뇌의 총 용해물로부터 항-GlcNAc 항체를 이용하여 O-연결 N-아세틸글루코사민화(O-GlcNAcylation) 정도를 웨스턴블랏 분석을 통해 관찰한 결과를 나타내는 사진(좌측) 및 상기 웨스턴블랏 분석 결과를 정량화한 결과를 나타내는 그래프(우측)이다. 상대 농도는 GAPDH로 정규화하여 정량적으로 측정하였다. n=5/그룹; 두 그룹 사이의 비교를 위해 대응표본 스튜던트 t-검정을 적용하였고, 대조군(Cont) 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01을 나타낸다. A.U.는 임의적 단위를 나타낸다.
도 4g는 72시간 SD 실험군(SD) 또는 대조군(Cont) 제브라피쉬 뇌의 총 용해물로부터 OGT 및 OGA의 발현을 웨스턴블랏 분석을 통해 관찰한 결과를 나타내는 사진(좌측) 및 상기 웨스턴블랏 분석 결과를 정량화한 결과를 나타내는 그래프(우측)이다. 상대 농도는 GAPDH로 정규화하여 정량적으로 측정하였다. n=5/그룹; 두 그룹 사이의 비교를 위해 대응표본 스튜던트 t-검정을 적용하였고, 대조군 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01을 나타낸다. A.U.는 임의적 단위를 나타낸다.
도 4h는 제브라피쉬 뇌 총 단백질 용해물로부터 OGA 효소 활성을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 흡광도 값은 대조군에 대비 배수 변화로 나타내었다. n=5/그룹; 두 그룹 사이의 비교를 위해 대응표본 스튜던트 t-검정을 적용하였고, 대조군(Cont) 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01을 나타낸다. A.U.는 임의적 단위를 나타낸다.
도 4i는 대조군의 회피 훈련 후 경과시점에서의 총 뇌 용해물로부터의 O-GlcNAc화, OGT, OGA, p-CREB, CREB, c-Fos 및 PKA-cα에 대한 웨스턴블랏 분석결과를 나타내는 이미지이다. α-tubulin(α-Tub)을 내부표준으로 사용하였다.
도 4j는 72 시간 SD 실험군의 회피 훈련 후 경과시점에서의 총 뇌 용해물에서의 O-GlcNAc화, OGT, OGA, p-CREB, CREB, c-Fos 및 PKA-cα에 대한 웨스턴블랏 분석 결과를 나타내는 이미지이다. α-tubulin(α-Tub)을 내부표준으로 사용하였다.
도 4k는 대조군(C) 또는 72시간 SD 실험군(SD) 제브라피쉬의 종뇌에서 DAPI(청색)와 O-GlcNAc화(녹색), OGT(적색) 각각에 대한 면역형광염색 및 이들의 중첩을 나타내는 일련의 공초점 현미경 사진(좌측) 및 상기 사진에서의 면역형광을 농도계적으로 정량한 결과를 나태는 그래프(우측)이다. 각 실험군당 4두의 실험동물을 사용하였고, 각 실험동물당 5개의 박편을 제조하였다. 상기 그래프에서 통계처리를 위해 튜키 다중 비교 사후검증을 사용한 결과, 대조군 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01, c는 P < 0.001을 나타내고, 두 그룹간의 비교를 위해 대응표본 스튜던트 t-검정을 사용하였으며, 대조군 대비 a는 P < 0.05, b 는 P < 0.01을 나타낸다. 스케일 바는 50 μm를 나타낸다:
C, 대조군;
SD, 수면장애;
Dl, 등쪽 종뇌의 측면 구역; 및
A.U., 임의 단위.
도 4l은 대조군(C) 또는 72시간 SD 실험군(SD) 제브라피쉬의 종뇌에서 DAPI(청색)와 O-GlcNAc화(녹색), OGA(적색) 각각에 대한 면역형광염색 및 이들의 중첩을 나타내는 일련의 공초점 현미경 사진(좌측) 및 상기 사진에서의 면역형광을 농도계적으로 정량한 결과를 나태는 그래프(우측)이다. 각 실험군당 4두의 실험동물을 사용하였고, 각 실험동물당 5개의 박편을 제조하였다. 상기 그래프에서 통계처리를 위해 튜키 다중 비교 사후검증을 사용한 결과, 대조군 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01, c는 P < 0.001을 나타내고, 두 그룹간의 비교를 위해 대응표본 스튜던트 t-검정을 사용하였으며, 대조군 대비 a는 P < 0.05, b 는 P < 0.01을 나타낸다. 스케일 바는 50 μm를 나타낸다:
C, 대조군;
SD, 수면장애;
Dl, 등쪽 종뇌의 측면 구역; 및
A.U., 임의 단위.
도 5a는 대조군(C) 및 다양한 농도(0.01, 0.05, 0.1, 0.5 및 1 g/L)의 N-아세틸글루코사민(Glc-N) 처리 실험군에 대한 수동 회피 테스트 결과를 나타내는 그래프로, 학습 훈련시(L) 그리고 기억 테스트시(M)의 교차시간(crossing time)을 측정한 결과를 나타낸다. n=13~18/그룹으로, 상기 그래프에서 통계처리를 위해 스튜던트-뉴만-쿨스 사후검정을 사용한 결과, 1차 훈련(1st trial) 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01, c는 P < 0.001을 나타내고, #는 윌콕슨 순위 합계 검정 결과로 3차 훈련 대비 P > 0.05을 나타낸다.
도 5b는 대조군(Cont) 및 72 시간 SD 실험군(SD) 제브라피쉬를 72시간 동안 0.2 g/L의 GlcN와 함께 또는 GlcN 없이 배양한 후 수동 회피 테스트한 결과를 나타내는 그래프로, 1기 학습 세션이 끝나고 2시간 후에 1차 기억 테스트 세션(M1)이 적용되었고, M1 24시간 경과 후 2기 학습 세션을 수행하고 2시간 경과 후 2차 기억 테스트 세션(M2)이 적용되었으며, M2 24시간 경과 후 별도의 학습 없이 3차 기억 테스트 세션(M3)이 적용되었다. 그래프는 각 시점에서의 평균 교차시간 및 표준오차를 나타낸다. n=13~20/실험군; 상기 그래프에서 통계처리를 위해 스튜던트-뉴만-쿨스 사후검정을 사용한 결과, 1차 학습훈련 대비 c는 P < 0.001을 나타내고, #는 윌콕슨 순위 합계 검정 결과로, 3차 학습훈련 대비 P > 0.05를 나타낸다.
도 5c는 대조군으로 α-tubulin을 사용하여 72시간 동안 0.2 g/L GlcN 처리 유무에 따른 대조군 제브라피쉬의 총 뇌 용해물에서 O-GlcNAc화 OGT, OGA, p-CREB, CREB, c -Fos와 PKA-cα, C/EBP-β 및 C/EBP-δ의 발현을 웨스턴블랏 분석으로 분석한 결과를 나타내는 사진이다. α-tubulin을 내부표준으로 사용하였다. n=5/실험군.
도 5d는 지시된 시점(M1, M2 및 M3)에서의 회피 학습 훈련 후에 제브라피쉬의 총 뇌 용해물에서 O-GlcNAc화, OGT, OGA, PKA-cα, p-CREB, CREB, C/EBP-β 및 C/EBP-δ의 발현을 웨스턴블랏 분석으로 분석한 결과를 나타내는 사진이다. 제브라피쉬를 상기 M1, M2, 및 M3 6시간 경과 후 희생시켜 뇌를 적출하였다. 알파-튜블린을 내부표준으로 사용하였다. n=10/그룹.
도 5e는 대조군(C) 및 72시간 SD 실험군(SD)의 총 뇌 용해액으로부터 OGA의 효소 활성을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 흡광도 값은 대조군과 비교하여 배수 변화로서 나타내었다. 실험은 3번 반복되었다. n=5/실험군; 상기 그래프에서 통계처리를 위해 튜키 다중 비교 사후검정을 사용한 결과, 대조군 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01를 나타내고, 두 그룹간의 비교를 위해 대응표본 스튜던트 t-검정을 사용한 결과 a는 SD 대비 P < 0.05를 나타낸다.
도 5f는 대조군(C) 및 72 시간 SD 실험군(SD)을 GlcN 처리 또는 무처리시 학습시 또는 무학습시 뇌에서 O-GlcNA화, OGT, OGA, p-CREB, CREB, PKA-cα, p-ERK1/2, C/EBP-β 및 C/EBP-δ의 발현을 웨스턴블랏 분석으로 분석한 결과를 나타내는 사진이다. α-tubulin과 HDAC1은 각각 세포질 분획과 핵 분획에 대한 내부표준으로 사용하였다. n = 20/실험군.
도 5g는 대조군(Cont) 및 72시간 SD 실험군(SD)에 대하여 GlcN(0.2 g/L) 처리 또는 무처리시 회피 훈련 후에 제브라피쉬 종뇌에서의 DAPI(blue) 염색 및 p-CREB(녹색)에 대한 면역형광을 공초점 형광현미경으로 각각 촬영한 일련의 이미지 및 DAPI 및 상기 면역형광의 병합 이미지(40배, 상단) 및 상기 형광 정도를 정량화한 결과를 나타내는 그래프(하단)이다. 상단의 병합이미지에서 확대된 부분은 백색 박스로 나타내었다. 그룹당 4두의 실험동물을 사용하였고 실험동물당 5개의 박편을 사용하였다. 상기 그래프에서 통계처리를 위해 튜키 다중 비교 사후검정을 사용한 결과, 대조군 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01, c는 P < 0.001를 나타내고, 두 그룹간의 비교를 위해 대응표본 스튜던트 t-검정을 사용한 결과 SD 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01을 나타내며, 상단의 이미지에서 스케일 바는 50 μm를 나타낸다:
Dl, 등쪽 종뇌의 측면 구역.
도 5h는 대조군(Cont) 및 72시간 SD 실험군(SD)에 대하여 GlcN(0.2 g/L) 처리 또는 무처리시 회피 훈련 후에 제브라피쉬 종뇌에서의 DAPI(blue) 염색 및 PKA-cα(적색), O-GlcNAc(녹색)에 대한 면역형광을 공초점 형광현미경으로 각각 촬영한 일련의 이미지 및 DAPI 및 상기 면역형광의 병합 이미지(40배, 상단) 및 상기 형광 정도를 정량화한 결과를 나타내는 그래프(하단)이다. 상단의 병합이미지에서 확대된 부분은 백색 박스로 나타내었다. 그룹당 4두의 실험동물을 사용하였고 실험동물당 5개의 박편을 사용하였다. 상기 그래프에서 통계처리를 위해 튜키 다중 비교 사후검정을 사용한 결과, 대조군 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01, c는 P < 0.001를 나타내고, 두 그룹간의 비교를 위해 대응표본 스튜던트 t-검정을 사용한 결과 SD 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01을 나타내며, 상단의 이미지에서 스케일 바는 50 μm를 나타낸다:
Dl, 등쪽 종뇌의 측면 구역.
도 5i는 대조군(Cont) 및 72시간 SD 실험군(SD)에 대하여 GlcN(0.2 g/L) 처리 또는 무처리시 회피 훈련 후에 제브라피쉬 종뇌에서의 DAPI(blue) 염색 및 OGT(적색), O-GlcNAc(녹색)에 대한 면역형광을 공초점 형광현미경으로 각각 촬영한 일련의 이미지 및 DAPI 및 상기 면역형광의 병합 이미지(40배, 상단) 및 상기 형광 정도를 정량화한 결과를 나타내는 그래프(하단)이다. 상단의 병합이미지에서 확대된 부분은 백색 박스로 나타내었다. 그룹당 4두의 실험동물을 사용하였고 실험동물당 5개의 박편을 사용하였다. 상기 그래프에서 통계처리를 위해 튜키 다중 비교 사후검정을 사용한 결과, 대조군 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01, c는 P < 0.001를 나타내고, 두 그룹간의 비교를 위해 대응표본 스튜던트 t-검정을 사용한 결과 SD 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01을 나타내며, 상단의 이미지에서 스케일 바는 50 μm를 나타낸다:
Dl, 등쪽 종뇌의 측면 구역.
도 5j는 대조군(Cont) 및 72시간 SD 실험군(SD)에 대하여 GlcN(0.2 g/L) 처리 또는 무처리시 회피 훈련 후에 제브라피쉬 종뇌에서의 DAPI(blue) 염색 및 OGA(적색), O-GlcNAc(녹색)에 대한 면역형광을 공초점 형광현미경으로 각각 촬영한 일련의 이미지 및 DAPI 및 상기 면역형광의 병합 이미지(40배, 상단) 및 상기 형광 정도를 정량화한 결과를 나타내는 그래프(하단)이다. 상단의 병합이미지에서 확대된 부분은 백색 박스로 나타내었다. 그룹당 4두의 실험동물을 사용하였고 실험동물당 5개의 박편을 사용하였다. 상기 그래프에서 통계처리를 위해 튜키 다중 비교 사후검정을 사용한 결과, 대조군 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01, c는 P < 0.001를 나타내고, 두 그룹간의 비교를 위해 대응표본 스튜던트 t-검정을 사용한 결과 SD 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01을 나타내며, 상단의 이미지에서 스케일 바는 50 μm를 나타낸다:
Dl, 등쪽 종뇌의 측면 구역.
도 5k는 대조군 또는 72시간 SD 실험군 동물에 지시된 농도(0.5, 1, 5, 10 및 50 ng/g)의 다아조-5-옥소노르뉴신(DON)을 복강 내 주입한 후 수동 회피 테스트를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다. 교육훈련 및 기억 테스트 세션에서 교차시간을 측정하였다. n=11~18/실험군; 통계처리를 위해 스튜던트-뉴만-쿨스 사후검정을 적용한 결과 1차 훈련 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01, c는 P < 0.001를 나타내고, #는 윌콕슨 순위 합계 검정 결과로, 3차 훈련 대비 P > 0.05를 나타낸다.
도 5l는 대조군(C) 또는 다양한 농도의 DON(1, 5, 10, 50, 100, 및 300 ng/g)을 복강 내 주입한 제브라피쉬의 총 뇌 용해액으로부터 O-GlcNAc화, OGT, OGA, p-CREB, CREB 및 PKA-cα의 학습 유도된 변화를 웨스턴블랏 분석을 통해 분석한 결과를 나타내는 사진이다. α-Tubulin은 내부 표준으로 사용되었다. n=10/그룹
도 5m는 대조군 또는 72시간 SD 실험군 동물에 지시된 농도(0.1, 1, 5, 10 및 20 mg/g)의 아자세린(Aza)을 복강 내 주입한 후 수동 회피 테스트를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다. 교육훈련 및 기억 테스트 세션에서 교차시간을 측정하였다. n=10~17/실험군; 통계처리를 위해 스튜던트-뉴만-쿨스 사후검정을 적용한 결과 1차 훈련 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01, c는 P < 0.001를 나타내고, #는 윌콕슨 순위 합계 검정 결과로, 3차 훈련 대비 P > 0.05를 나타낸다.
도 5n는 대조군(C) 또는 다양한 농도의 아자세린(0.1, 1, 5, 10 및 20 mg/g)을 복강 내 주입한 제브라피쉬의 총 뇌 용해액으로부터 O-GlcNAc화, OGT, OGA, p-CREB, CREB 및 PKA-cα의 학습 유도된 변화를 웨스턴블랏 분석을 통해 분석한 결과를 나타내는 사진이다. α-Tubulin은 내부 표준으로 사용되었다. n=10/그룹
도 6a는 대조군 또는 72시간 SD 실험군 동물에 다양한 농도(5, 20, 40 및 100 μg/g)의 알록산(Alx)을 복강 내 주입한 후 수동 회피 테스트를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다. 교육훈련 및 기억 테스트 세션에서 교차시간을 측정하였다. n=13~17/실험군; 통계처리를 위해 스튜던트-뉴만-쿨스 사후검정을 적용한 결과 1차 훈련 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01, c는 P < 0.001를 나타내고, #는 윌콕슨 순위 합계 검정 결과로, 3차 훈련 대비 P > 0.05를 나타낸다.
도 6b는 대조군 또는 72시간 SD 실험군 동물에 다양한 농도(5, 20, 40 및 100 μg/g)의 OSMI-1를 복강 내 주입한 후 수동 회피 테스트를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다. 교육훈련 및 기억 테스트 세션에서 교차시간을 측정하였다. n=13~17/실험군; 통계처리를 위해 스튜던트-뉴만-쿨스 사후검정을 적용한 결과 1차 훈련 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01, c는 P < 0.001를 나타내고, #는 윌콕슨 순위 합계 검정 결과로, 3차 훈련 대비 P > 0.05를 나타낸다.
도 6c는 대조군(C) 또는 다양한 농도의 OSMI-1(5, 50, 100 및 300 ng/g)을 복강 내 주입한 제브라피쉬의 총 뇌 용해액으로부터 O-GlcNAc화, OGT, OGA, p-CREB, CREB, PKA-cα, C/EBP-β 및 C/EBP-δ의 학습 유도된 변화를 웨스턴블랏 분석을 통해 분석한 결과를 나타내는 사진이다. α-Tubulin은 내부 표준으로 사용되었다. n=5/그룹
도 6d는 대조군(C) 또는 50 μg/g의 Thiamet G를 제브라피쉬의 복강 내에 주입한 후 수동 회피 테스트를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다. 교육훈련 및 기억 테스트 세션에서 교차시간을 측정하였다. n=13~18/실험군; 통계처리를 위해 스튜던트-뉴만-쿨스 사후검정을 적용한 결과 1차 훈련 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01, c는 P < 0.001를 나타내고, #는 윌콕슨 순위 합계 검정 결과로, 3차 훈련 대비 P > 0.05를 나타낸다.
도 6e는 상기 도 6d의 제브라피쉬를 수동 회피 훈련 후 희생시킨 후 적출한 뇌 용해물로부터 O-GlcNAc화, OGT, OGA, p-CREB, CREB, PKA-cα, C/EBP-β, C/EBP-δ의 발현을 웨스턴블랏 분석으로 분석한 결과를 나타내는 사진이다. 뇌 용해물은 1차 훈련 세션 2 시간 후(M1) 또는 2차 훈련 세션 후 2 시간(M2) 및 24 시간(M3) 후에 획득하였다. α-Tubulin(α-Tub)을 대조군으로 사용하였다. n=10/그룹.
도 6f는 대조군(C) 또는 50 μg/g의 PugNAc 또는 5, 20, 또는 50 μg/g의 Thiamet G를 제브라피쉬의 복강 내에 주입한 후 수동 회피 테스트를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다. 교육훈련 및 기억 테스트 세션에서 교차시간을 측정하였다. n=11~19/실험군; 통계처리를 위해 스튜던트-뉴만-쿨스 사후검정을 적용한 결과 1차 훈련 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01, c는 P < 0.001를 나타내고, #는 윌콕슨 순위 합계 검정 결과로, 3차 훈련 대비 P > 0.05를 나타낸다.
도 6g는 상기 도 6f의 제브라피쉬를 수동 회피 훈련 후 희생시킨 후 적출한 뇌 용해물로부터 O-GlcNAc화, OGT, OGA, p-CREB, CREB, PKA-cα, C/EBP-β, C/EBP-δ의 발현을 웨스턴블랏 분석으로 분석한 결과를 나타내는 사진이다. α-Tubulin(α-Tub)을 대조군으로 사용하였다. n=10/그룹.
도 6h는 0.2g/L GlcN으로 매일 처리 또는 무처리한 대조군 및/또는 72 시간 DON(300 ng/g)을 투여하거나 하지 않은 제브라피쉬의 수동 회피 테스트 결과를 나태는 그래프이다. 교차시간은 훈련학습 및 기억 테스트 세션에서 측정되었다. n=14~20/실험군; 통계처리를 위해 스튜던트-뉴만-쿨스 사후검정을 적용한 결과, c는 1차 훈련 대비 P < 0.001을 나타내고, #은 윌콕슨 순위 합계 검정시 P > 0.05을 나타낸다.
도 6i는 상기 도 6h의 제브라피쉬를 수동 회피 테스트 후 희생시켜 적출한 뇌 용해물에서 O-GlcNAc화, OGT, OGA, p-CREB, CREB, PKA-cα, C/EBP-β, C/EBP-δ 및 p-mTOR의 발현 양상을 관찰한 웨스턴블랏 겔 사진이다. 제브라피쉬의 뇌 용해물은 1차 훈련 2 시간(M1) 또는 2차 훈련 2 시간(M2) 및 24 시간(M3) 후에 수득하였다. 액틴을 내부표준으로 사용하였다. n = 10 /실험군.
도 6j는 GlcN(0.2 g/L), Thiamet G(50 μg/g), DON(300 ng/g) 또는 OSMI-1을 24시간 동안 처리 또는 무처리한 제브라피쉬 두뇌에서의 다양한 유전자(HK-1, HK-2, GK, PFKP-α, PFKP-β,PFKL-α, PFKL-β, G6PDH, PKM-α, GFPT-1, GFPT-2, OGT1, OGT2, 및 OGA)의 발현 정도를 확인하기 위한 PCR 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 사진(좌측) 및 개별 유전자의 정량을 위한 RT-PCR 결과를 나타낸 일련의 막대그래프들이다. 상기 그래프에서 막대와 바는 각각 세 번의 독립적인 실험에서 각 유전자의 발현양의 평균 및 표준오차를 나타낸다. 액틴을 내부표준으로 이용하였으며, n=4/실험군이다. 통계처리를 위해 튜키 다중 비교 사후검정을 적용한 결과, 대조군 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01를 나타낸다.
C 또는 Cont, 대조군;
G 또는 GlcN, 글루코사민;
OS, OSMI;
Thia G 또는 TG, Thiamet G;
D 또는 DON, diazo-5-oxonorneucine.
도 6k는 GlcN(0.2 g/L), Thiamet G(50 μg/g), DON(300 ng/g) 또는 OSMI-1을 24시간 동안 처리 또는 무처리한 제브라피쉬 두뇌에서의 다양한 유전자(NMDA, Arc, ubH1, ubH5, NRGN, Homer1, GHRH, egr1, c-fos, BDNF, per-2, 및 bmal-1)의 발현 정도를 확인하기 위한 PCR 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 사진(좌측) 및 개별 유전자의 정량을 위한 RT-PCR 결과를 나타낸 일련의 막대그래프들이다. 상기 그래프에서 막대와 바는 각각 세 번의 독립적인 실험에서 각 유전자의 발현양의 평균 및 표준오차를 나타낸다. 내부표준으로 액틴을 사용하였고, n=4/실험군이다. 통계처리를 위해 튜키 다중 비교 사후검정을 적용한 결과, 대조군 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01를 나타낸다.
C 또는 Cont, 대조군;
G 또는 GlcN, 글루코사민;
OS, OSMI;
Thia G 또는 TG, Thiamet G;
D 또는 DON, diazo-5-oxonorneucine.
도 6l은 GlcN (0.2 g/L)을 투여하거나 하지 않은 제브라피쉬 두뇌에 대한 다양한 유전자(NMDA, Arc, ubH1, ubH5, NRGN, Homer1, GHRH, egr1, c-fos, BDNF, per-2, 및 bmal-1)의 발현 정도를 확인하기 위한 PCR 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 사진(좌측) 및 개별 유전자의 정량을 위한 RT-PCR 결과를 나타낸 일련의 막대그래프들이다. 상기 그래프에서 막대와 바는 각각 세 번의 독립적인 실험에서 각 유전자의 발현양의 평균 및 표준오차를 나타낸다. 내부표준으로 액틴을 사용하였고, n=4/실험군이다. 통계처리를 위해 튜키 다중 비교 사후검정을 적용한 결과, 대조군 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01를 나타내고, 두 그룹 사이의 비교를 위해 대응표본 스튜던트 t-검정을 사용한 결과, SD 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01이다.
도 7a는 제브라피쉬 두뇌에서 β-아밀로이드(Aβ)와 p-Tau와 gliosis의 반복적인 SD-유도 축적에 있어서 GlcN의 효과를 관찰을 위한 실험 일정을 개략적으로 나타낸 개요도이다.
도 7b는 72시간 SD(1X) 및 72시간 SD를 네 번 반복시킨 반복 SD 실험군(4X)에 GlcN을 처리 또는 무처리한 제브라피쉬의 뇌에서 Thioflavin S(녹색, Thio S)을 면역형광 염색한 공초점 형광현미경 사진(40배, 상단) 및 형광을 농도계적으로 정량화한 결과를 나타내는 그래프(하단)이다. 실험군당 4두의 실험동물을 사용하였고, 각 실험동물 당 5 박편을 사용하였다. 통계처리를 위해 튜키 다중 비교 검정을 적용한 결과, 대조군 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01, c는 P < 0.001을 나타내고, 두 그룹 사이의 비교를 위해 대응표본 스튜던트 t-검정을 사용한 결과, SD 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01이며, 스케일바는 50 μm를 나타낸다.
도 7c는 72시간 SD 실험군(1X) 및 반복된 SD 실험군(4X)에 GlcN을 처리 또는 무처리한 제브라피쉬 종뇌에서의 DAPI(파란색) 염색 및 Aβ(적색)에 대한 면역형광 염색 이미지 및 이들 두 이미지에 대한 병합이미지(상단) 및 상기 이미지에서 형광의 정도를 정량화하여 나타낸 그래프(하단)이다. 실험군당 4두의 실험동물을 사용하였고, 각 실험동물 당 5 박편을 사용하였다. 통계처리를 위해 튜키 다중 비교 검정을 적용한 결과, 대조군 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01, c는 P < 0.001을 나타내고, 두 그룹 사이의 비교를 위해 대응표본 스튜던트 t-검정을 사용한 결과, SD 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01이며, 스케일바는 50 μm를 나타낸다.
도 7d는 72시간 SD 실험군(1X) 및 반복된 SD 실험군(4X)에 GlcN을 처리 또는 무처리한 제브라피쉬 종뇌에서의 DAPI(파란색) 염색 및 pTau(녹색)에 대한 면역형광 염색 이미지 및 이들 두 이미지에 대한 병합이미지(상단) 및 상기 이미지에서 형광의 정도를 정량화하여 나타낸 그래프(하단)이다. 실험군당 4두의 실험동물을 사용하였고, 각 실험동물 당 5 박편을 사용하였다. 통계처리를 위해 튜키 다중 비교 검정을 적용한 결과, 대조군 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01, c는 P < 0.001을 나타내고, 두 그룹 사이의 비교를 위해 대응표본 스튜던트 t-검정을 사용한 결과, SD 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01이며, 스케일바는 50 μm를 나타낸다.
도 7e는 GlcN(0.2 g/L)를 처리하거나 처리하지 않은 대조군(Cont) 및 반복 SD 실험군(SD) 제브라피쉬를 수동 회피 테스트 후 희생시켜 적출한 종뇌에 대한 DAPI(청색) 염색 및 O-GlcNAc화(녹색) 및 Aβ(적색) 각각에 대한 일련의 면역형광 염색 이미지 및 이들 이미지들의 병합 이미지(상단) 및 상기 이미지에서 측정된 형광을 이용하여 O-GlcNAc화 정도 및 Aβ 발현 정도를 정량화한 결과를 나타내는 그래프(하단)이다. 실험군당 4두의 실험동물을 사용하였고, 각 실험동물 당 5 박편을 사용하였다. 통계처리를 위해 튜키 다중 비교 검정을 적용한 결과, 대조군 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01, c는 P < 0.001을 나타내고, 두 그룹 사이의 비교를 위해 대응표본 스튜던트 t-검정을 사용한 결과, SD 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01이며, 스케일바는 50 μm를 나타낸다:
Dl, 등쪽 종뇌의 측면 구역.
도 7f는 GlcN(0.2 g/L)를 처리하거나 처리하지 않은 대조군(Cont) 및 반복 SD 실험군(SD) 제브라피쉬를 수동 회피 테스트 후 희생시켜 적출한 종뇌에 대한 DAPI(청색) 염색 및 O-GlcNAc화(녹색) 및 pTau(적색) 각각에 대한 일련의 면역형광 염색 이미지 및 이들 이미지들의 병합 이미지(상단) 및 상기 이미지에서 측정된 형광을 이용하여 O-GlcNAc화 정도 및 Aβ 발현 정도를 정량화한 결과를 나타내는 그래프(하단)이다. 실험군당 4두의 실험동물을 사용하였고, 각 실험동물 당 5 박편을 사용하였다. 통계처리를 위해 튜키 다중 비교 검정을 적용한 결과, 대조군 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01, c는 P < 0.001을 나타내고, 두 그룹 사이의 비교를 위해 대응표본 스튜던트 t-검정을 사용한 결과, SD 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01이며, 스케일바는 50 μm를 나타낸다:
Dl, 등쪽 종뇌의 측면 구역.
도 7g는 GlcN을 처리 또는 무처리한 대조군(Cont), 72시간 SD 실험군(1X) 및 72시간 SD를 네 차례 반복한 반복 SD 실험군(4X) 제브라피쉬를 희생시켜 적출한 뇌의 종뇌 배쪽 지역(Vd)에 대한 DAPI(청색) 염색, 및 GFAP(녹색), S100β(적색) 각각에 대한 면역형광 염색 이미지 및 상기 이미지들에 대한 병합이미지(상단) 및 상기 이미지에서의 GFAP 및 S100β의 형광 정도를 정량화하여 나타낸 그래프(하단)이다. 실험군당 4두의 실험동물을 사용하였고, 각 실험동물 당 5 박편을 사용하였다. 통계처리를 위해 튜키 다중 비교 검정을 적용한 결과, 대조군 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01, c는 P < 0.001을 나타내고, 두 그룹 사이의 비교를 위해 대응표본 스튜던트 t-검정을 사용한 결과, SD 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01이며, 스케일바는 50 μm를 나타낸다.
도 7h는 GlcN을 처리 또는 무처리한 대조군(Cont), 72시간 SD 실험군(1X) 및 72시간 SD를 네 차례 반복한 반복 SD 실험군(4X) 제브라피쉬를 희생시켜 적출한 뇌의 종뇌 등쪽 측면 구역(Dl)에 대한 DAPI(청색) 염색, 및 GFAP(녹색), S100β(적색) 각각에 대한 면역형광 염색 이미지 및 상기 이미지들에 대한 병합이미지(상단) 및 상기 이미지에서의 GFAP 및 S100β의 형광 정도를 정량화하여 나타낸 그래프(하단)이다. 실험군당 4두의 실험동물을 사용하였고, 각 실험동물 당 5 박편을 사용하였다. 통계처리를 위해 튜키 다중 비교 검정을 적용한 결과, 대조군 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01, c는 P < 0.001을 나타내고, 두 그룹 사이의 비교를 위해 대응표본 스튜던트 t-검정을 사용한 결과, SD 대비 a는 P < 0.05, b는 P < 0.01이며, 스케일바는 50 μm를 나타낸다.
Figure 1a is a graph analyzing the typical traces of zebrafish search activity at the indicated time point of SD as observing behavioral and cognitive changes induced by sleep disorder (SD) in adult zebrafish SD. Bars represent the number of swims of the top, middle, and bottom layers during the 1 hour session. n=19-32/experimental group; As a result of Tukey's multiple comparison post-test, P <0.05, b represents P <0.01 and c represents P <0.001. It was induced by exposing zebrafish under extended light stages for 3, 6, 12, 24, 48 and 72 hours with or without recovery for 12 to 144 hours under normal light/dark conditions.
1B is a graph analyzing the results of a novel tank diving test at the indicated time point of the SD. Bars represent the number of swims for the top, middle, and bottom during an hour session. n=9-22/experimental group; As a result of Tukey multiple comparison post-test, a compared to the upper layer P <0.05, b represents P <0.01 and c represents P <0.001.
1C is a schematic diagram showing a schematic form of a passive avoidance test tank of the present invention.
1D is a graph analyzing the results of a representative manual avoidance test at a specified SD time point. The crossing time was measured 3 times in the training session and 1 time in the test session after 2 hour intervals. The graph shows the mean of the crossing times and SEM. n=10-18/experimental group; As a result of the post-test Student-Newman-Keuls test, a compared to primary learning is a P <0.05, b represents P <0.01 and c represents P <0.001, and # represents the third learning P > 0.05 as a result of the Wilcoxon rank sum test.
1E is a graph showing search activity results at a recovery point indicated in a normal contrast cycle after 72 hours SD. n=14-25/experiment group; As a result of Tukey's multiple comparison post-test, a compared to the lower layer P <0.05, b represents P <0.01 and c represents P <0.001.
Figure 1f is a graph analyzing the results of a typical passive avoidance test at a recovery time point indicated under a normal contrast cycle after 72h SD. n=13-19/experimental group; As a result of the Student-Newman-Cools post-test, a compared to the primary learning P <0.05, b indicates P <0.01 and c indicates P <0.001, and # indicates P > 0.05 compared to the 3rd learning as a result of the Wilcoxon rank sum test.
Cont, control;
SD, sleep deprivation;
T, top;
M, medium;
B, bottom;
L, learning;
M, memory;
T, test;
R, recovery.
Figure 2a is a representative PCR and quantitative real-time PCR graph of the selected gene at the SD time point shown to observe the change in the gene involved in L / M zebrafish brain. Bars represent the mean and SEM of three independent experiments. n=4/experiment group; As a result of the Tukey multiple comparison post-test, 0 hours or control group a P <0.05, b represents P <0.01 and c represents P <0.001:
C, control;
SD, sleep deprivation;
Rec, recovery.
Figure 2b is a graph analyzing the recovery time of the 72-hour SD experimental group to observe the change in the gene involved in L / M zebrafish brain.
FIG. 3A shows changes in glucose metabolism pathway enzymes and metabolites of HBP in the brain of the control group and SD zebrafish according to the presence or absence of learning training. Flux maps of glucose HBP.
Figure 3b is a graph analyzing the quantitative analysis of metabolites selected by GC-MS/MS in the brain of a control group or SD zebrafish with or without learning training. The experiment was repeated 7 times. n=31/experiment group, Kruskal-Wallis test result, a is P <0.05, b represents P <0.01 and c represents P <0.001.
3c is a flux map of glycolysis and TCA cycles showing metabolite changes in the brains of SD zebrafish and controls according to the presence or absence of learning tasks.
Figure 3d is a graph showing the results of analyzing the quantitative analysis of metabolites selected by GC-MS/MS in the brain of SD zebrafish and control according to the presence or absence of learning tasks. Each experiment was repeated 7 times, n=31/group, and as a result of applying the Kruskal-Wallis test for statistical processing, a indicates P <0.05 and b indicates P <0.01.
3e shows selected genes (HK-1, HK-2, GK, PFKP-α, PFKP-β, PFKL-α, PFKL-β, G6PDH, PKM-α, according to SD induction time of the sleep deprivation experimental group (SD)) Analysis of agarose gel electrophoresis pictures (left) showing the PCR results of GFPT-1, GFPT-2, OGT1, OGT2, OGA, TK-α, PYGB, GLUT1, GLUT3) and quantitative real-time PCR results for the genes It is a graph showing the result (right). n=4/experiment group; As a result of applying the Tucky multiple comparison post-test for statistical processing, a is < P <0.05, b is P <0.01, c is P <0.001 compared to 0 hours.
Figure 3f is a selected gene (HK-1, HK-2, GK, PFKP-α, PFKP-β, PFKL-α, PFKL-β, G6PDH, PKM-α, GFPT after the recovery time after learning training of the control group) Agarose gel electrophoresis (left) showing PCR results of -1, GFPT-2, OGT1, OGT2, OGA, TK-α, PYGB, GLUT1, GLUT3) and quantitative real-time PCR results for the genes were analyzed It is a graph showing the result (right). n=4/experiment group; As a result of applying the Tucky multiple comparison post-test for statistical processing, a is < P <0.05, b is P <0.01, c is P <0.001 compared to 0 hours.
Figure 3g is a selected gene (HK-1, HK-2, GK, PFKP-α, PFKP-β, PFKL-α, PFKL-β, G6PDH, PKM- after the recovery time after learning training in the 72-hour SD experimental group Agarose gel electrophoresis pictures (left) showing the PCR results of α, GFPT-1, GFPT-2, OGT1, OGT2, OGA, TK-α, PYGB, GLUT1, GLUT3) and quantitative real-time PCR results for the genes It is a graph showing the result of analyzing (right). n=4/experiment group; As a result of applying the Tucky multiple comparison post-test for statistical processing, a is < P <0.05, b is P <0.01, c is P <0.001 compared to 0 hours.
Figure 3h is a graph showing the results of observing changes in the expression of glucose metabolizing enzymes in the brain of the control and SD zebrafish experimental groups in the learning and memory process. Crossing times were measured during training and testing sessions. The first test session (M1) was conducted 2 hours after the first learning session, the second learning session was conducted 24 hours after the first learning session, and the second (M2) after 2 hours and 24 hours after the second learning session, respectively. ) And a third (M3) test session were conducted. As n=11~13/experiment group, as a result of applying the Student-Newman-Cools post-test for statistical processing, c denotes P <0.001 compared to the first learning, and # denotes the Wilcoxon rank sum test result compared to the third learning P > 0.05.
3i is a graph showing the results of analyzing PCR and quantitative real-time PCR results performed at the indicated time points after avoidance training and memory tests in a control or 72-hour SD zebrafish brain. Total mRNA was obtained 2 hours after the first learning session (M1) and 2 hours (M2) and 24 hours after the second learning session (M3). Bars represent mean and standard error (SEM) in three independent experiments. As a result of applying the Tucky multiple comparison post-test for statistical processing with n=4/experiment group, a compared to the control group is P <0.05, b is P < 0.01, c represents P <0.001, and as a result of applying the corresponding sample Student's t-test for comparison between the two groups, a compared to the control group represents P <0.05, b represents P <0.01.
Figure 4a is a schematic diagram (left) schematically showing the structure of the entire brain of the adult zebrafish (left) and the box on the left is an enlarged view of the a-axis section. Dl (lateral region of dorsal midbrain) and Vd (dorsal region of midbrain) are indicated in the left box.
FIG. 4b shows DAPI (blue) staining and PKA taken at a 40-fold magnification using a confocal fluorescence microscope for the brain of a zebrafish sacrificed 6 hours after a passive evasion test in the control group (C) and the 72-hour SD experimental group (SD). (c) (left panel, green) or p-CREB (right panel, green) for each immunofluorescence staining image (x40) and a combined image of the images (top) and a graph showing quantifying the fluorescence immunostaining results ( Bottom). The enlarged image in the right panel is indicated by a white box. The graph shows the result of measuring the concentration of PKA-cα or p-CREB. Four experimental animals were used per experimental group, and five lamellas were used for each experimental animal. As a result of applying the Tucky multiple comparison post-test for statistical processing, a compared to the control group was P <0.05, b was P <0.01, and c represents P <0.001, and as a result of applying the corresponding sample Student's t-test for comparison between the two groups, b compared to the control group represents P <0.01, c represents P <0.001, and the scale bar represents 50 μm.
Figure 4c is a Western blot expression of p-CREB and CREB in the cytosol (Cyt) and nucleus (Nuc) of the brain extracted from the control group (C) and the 72 hour SD experimental group (SD) zebrafish sacrificed 6 hours after the manual evasion test. It is a photograph (top) showing the results analyzed using the analysis and a graph (bottom) showing the results of quantitatively quantifying the results of the Western blot analysis. The relative concentration of p-CREB was measured quantitatively by normalizing to CREB. As n=20 or 25/experimental group, Tukey's multiple comparison post-test was used for statistical processing, compared to control group (C), a for P <0.05, b for P <0.01, c for P <0.001, and between the two groups. As a result of applying the corresponding sample Student's t-test for comparison, compared to the control group (C), a represents P <0.05, b represents P <0.01, and c represents P <0.001:
L, learning;
AU, arbitrary unit.
Figure 4d is a photograph showing the results of Western blot analysis of p-CREB and CREB bound to the CRE site (top) and a graph showing the results of quantitatively quantifying the Western blot analysis results (bottom). The nuclear fraction of zebrafish brain was prepared and cultured with biotinylated CRE-containing oligonucleotide. The relative densitometer was quantitatively measured and the fold change was presented in arbitrary units. The experiment was repeated 3 times. n=20 or 25/experimental group; In the graph, a tukey multiple comparison post-test was used for statistical processing, and a compared to the control (Cont), a < P <0.05, b = P <0.01, c = P <0.001, and a corresponding sample student for comparison between the two groups. As a result of applying the t-test, compared to the control (C), a represents P <0.05, b represents P <0.01, and c represents P <0.001:
C, control;
SD, sleep disorder;
L, learning;
AU, arbitrary unit.
Figure 4e is a control (Cont) and 72 hours SD experimental group (SD) zebrafish DAPI (blue) staining in the brain (telencephalon) and O-GlcNAc, OGT and OGA (green) for immunofluorescence staining and overlapping them respectively It is a series of confocal fluorescence microscopy images (top, 40 times) and a graph showing the results of quantifying the fluorescence of the target molecule compared to the control (bottom). The image enlarged from the top is indicated in a white box, and four experimental animals were used per experimental group, and five flakes were produced for each experimental animal. For comparison between the two groups in the above graph, the corresponding sample Student's t-test was applied, and a compared to the control group, P <0.05, b = P <0.01, c = P <0.001:
Cont: control group;
SD: 72 hours SD (sleep deprivation) experimental group.
FIG. 4f shows the degree of O-linked N-acetylglucosamine (O-GlcNAcylation) using anti-GlcNAc antibodies from total lysates of 72-hour SD experimental group (SD) or control group (Cont) zebrafish brain through Western blot analysis. A photograph showing the observed result (left) and a graph showing the result of quantifying the Western blot analysis result (right). The relative concentration was quantified by normalizing to GAPDH. n=5/group; For comparison between the two groups, the corresponding sample Student's t-test was applied, and a compared to the control (Cont), a < P <0.05, b = P <0.01. AU represents an arbitrary unit.
Figure 4g is a photograph showing the results of observing the expression of OGT and OGA from the total lysate of 72 hours SD experimental group (SD) or control group (Cont) zebrafish brain through Western blot analysis (left) and the Western blot analysis results It is a graph showing the quantified results (right). The relative concentration was quantified by normalizing to GAPDH. n=5/group; For comparison between the two groups, the corresponding sample Student's t-test was applied, and a compared to the control group, P <0.05, b = P <0.01. AU represents an arbitrary unit.
Figure 4h is a graph showing the results of analyzing the OGA enzyme activity from zebrafish brain total protein lysate. The absorbance value was expressed as a fold change compared to the control group. n=5/group; For comparison between the two groups, the corresponding sample Student's t-test was applied, and a compared to the control (Cont), a < P <0.05, b = P <0.01. AU represents an arbitrary unit.
Figure 4i is an image showing the results of Western blot analysis for O-GlcNAcization, OGT, OGA, p-CREB, CREB, c-Fos and PKA-cα from total brain lysate at the time point after the avoidance training of the control group. . α-tubulin (α-Tub) was used as an internal standard.
Figure 4j shows the results of Western blot analysis for O-GlcNAcization, OGT, OGA, p-CREB, CREB, c-Fos and PKA-cα in total brain lysate at the time point after evasion training in the 72 hour SD experimental group. It is an image to show. α-tubulin (α-Tub) was used as an internal standard.
Figure 4k is a control (C) or 72 hours SD experimental group (SD) zebrafish in the brain of the DAPI (blue) and O-GlcNAc (green), OGT (red) for immunofluorescence staining for each and a series of overlap Confocal micrograph of (left) and a graph showing the result of quantitatively quantifying the immunofluorescence in the photo (right). Four experimental animals were used for each experimental group, and five flakes were prepared for each experimental animal. As a result of using the Tukey multiple comparison post-test for statistical processing in the graph, a compared to the control group, P <0.05, b indicates P <0.01, c indicates P <0.001, and the corresponding sample Student's t-test for comparison between the two groups. Was used, compared to the control group, a represents P <0.05, and b represents P <0.01. Scale bars represent 50 μm:
C, control;
SD, sleep disorder;
Dl, lateral section of dorsal longitudinal brain; And
AU, arbitrary unit.
Figure 4l is a series of immunofluorescence staining for DAPI (blue), O-GlcNAcization (green), and OGA (red) in the control brain (C) or the brain of the 72 hour SD experimental group (SD) zebrafish. Confocal micrograph of (left) and a graph showing the result of quantitatively quantifying the immunofluorescence in the photo (right). Four experimental animals were used for each experimental group, and five flakes were prepared for each experimental animal. As a result of using the Tukey multiple comparison post-test for statistical processing in the graph, a compared to the control group, P <0.05, b indicates P <0.01, c indicates P <0.001, and the corresponding sample Student's t-test for comparison between the two groups. Was used, compared to the control group, a represents P <0.05, and b represents P <0.01. Scale bars represent 50 μm:
C, control;
SD, sleep disorder;
Dl, lateral section of dorsal longitudinal brain; And
AU, arbitrary unit.
Figure 5a is a graph showing the results of a manual avoidance test for the control group (C) and N-acetylglucosamine (Glc-N) treatment experimental group of various concentrations (0.01, 0.05, 0.1, 0.5 and 1 g/L), during training training (L) And it shows the result of measuring the crossing time of the memory test (M). As a result of using the Student-Newman-Cools post-test for statistical processing in the graph, n=13~18/group, a is P <0.05, b is P <0.01, c is compared to the 1 st trial P <0.001, and # indicates P > 0.05 compared to the 3rd training as a result of the Wilcoxon rank sum test.
FIG. 5B is a graph showing the results of a manual avoidance test after incubating a control group (Cont) and a 72 hour SD experimental group (SD) zebrafish with or without GlcN of 0.2 g/L for 72 hours. The first memory test session (M1) was applied 2 hours after the end, and the 2nd learning session was performed after the M1 24 hours elapsed and the second memory test session (M2) was applied after the 2 hours elapsed, and the M2 24 hours later. The 3rd memory test session (M3) was applied without learning. The graph shows the mean crossing time and standard error at each time point. n=13-20/experiment group; As a result of using the Student-Newman-Cools post-test for statistical processing in the graph, c denotes P <0.001 compared to the first learning training, and # denotes the Wilcoxon rank total test result, and P> 0.05 compared to the third training training. Shows.
Figure 5c is O-GlcNAc-ized OGT, OGA, p-CREB, CREB, c -Fos in total brain lysates of control zebrafish with and without 0.2 g/L GlcN treatment for 72 hours using α-tubulin as a control. It is a photograph showing the results of analyzing the expression of PKA-cα, C/EBP-β and C/EBP-δ by Western blot analysis. α-tubulin was used as an internal standard. n=5/experimental group.
5D shows O-GlcNAcization, OGT, OGA, PKA-cα, p-CREB, CREB, C/EBP- in total brain lysates of zebrafish after avoidance learning training at indicated time points (M1, M2 and M3). This is a photograph showing the results of analyzing the expression of β and C/EBP-δ by Western blot analysis. The zebrafish was sacrificed after 6 hours of M1, M2, and M3 to extract the brain. Alpha-tubulin was used as an internal standard. n=10/group.
Figure 5e is a graph showing the results of analyzing the enzyme activity of OGA from the total brain lysate of the control group (C) and 72 hours SD experimental group (SD). Absorbance values are expressed as fold change compared to control. The experiment was repeated 3 times. n=5/experiment group; As a result of using the Tukey multiple comparison post-test for statistical processing in the graph, a compared to the control group shows P <0.05, b shows P <0.01, and the result using the corresponding sample Student's t-test for comparison between the two groups a is SD Contrast P <0.05.
FIG. 5F shows O-GlcNAization, OGT, OGA, p-CREB, CREB, PKA-cα, p in the brain when the control group (C) and the 72-hour SD experimental group (SD) are treated with or without GlcN treatment or without learning. -ERK1/2, C/EBP-β and C/EBP-δ are photographs showing the results of Western blot analysis. α-tubulin and HDAC1 were used as internal standards for cytoplasmic fraction and nuclear fraction, respectively. n=20/experimental group.
FIG. 5G shows DAPI (blue) staining and p-CREB (green) in zebrafish brain after avoidance training when GlcN (0.2 g/L) treatment or no treatment was performed for the control group (Cont) and the 72 hour SD experimental group (SD). It is a graph (bottom) showing the result of quantifying the fluorescence degree and the combined image of the DAPI and the immunofluorescence (40 times, top) and the series of images taken by confocal fluorescence microscopy, respectively. The enlarged part of the merged image at the top is indicated by a white box. Four experimental animals were used per group, and five slices were used per experimental animal. As a result of using the Tucky multiple comparison post-test for statistical processing in the graph, a compared to the control group is P <0.05, b is P <0.01, c is P <0.001, and the corresponding sample Student's t-test for comparison between the two groups As a result of using SD, a represents P <0.05, b represents P <0.01, and the scale bar in the image at the top represents 50 μm:
Dl, lateral section of the dorsal longitudinal brain.
5H shows DAPI (blue) staining and PKA-cα (red) in zebrafish brain after avoidance training when GlcN (0.2 g/L) treatment or no treatment was performed for the control group (Cont) and the 72 hour SD experimental group (SD), A series of images of the immunofluorescence for O-GlcNAc (green) taken with a confocal fluorescence microscope and a combined image of DAPI and the immunofluorescence (40 times, top) and a graph showing the results of quantifying the fluorescence level (bottom) )to be. The enlarged part of the merged image at the top is indicated by a white box. Four experimental animals were used per group, and five slices were used per experimental animal. As a result of using the Tucky multiple comparison post-test for statistical processing in the graph, a compared to the control group is P <0.05, b is P <0.01, c is P <0.001, and the corresponding sample Student's t-test for comparison between the two groups As a result of using SD, a represents P <0.05, b represents P <0.01, and the scale bar in the image at the top represents 50 μm:
Dl, lateral section of the dorsal longitudinal brain.
5i shows DAPI (blue) staining and OGT (red) in zebrafish brain after avoidance training when GlcN (0.2 g/L) treatment or no treatment was performed for the control group (Cont) and the 72 hour SD experimental group (SD). This is a graph (bottom) showing the result of quantifying the fluorescence level and the combined image of DAPI and the immunofluorescence (40 times, top) and a series of images respectively taken by confocal fluorescence microscopy for GlcNAc (green). . The enlarged part of the merged image at the top is indicated by a white box. Four experimental animals were used per group, and five slices were used per experimental animal. As a result of using the Tucky multiple comparison post-test for statistical processing in the graph, a compared to the control group is P <0.05, b is P <0.01, c is P <0.001, and the corresponding sample Student's t-test for comparison between the two groups As a result of using SD, a represents P <0.05, b represents P <0.01, and the scale bar in the image at the top represents 50 μm:
Dl, lateral section of the dorsal longitudinal brain.
FIG. 5j shows DAPI (blue) staining and OGA (red) in zebrafish brains after avoidance training when GlcN (0.2 g/L) treatment or no treatment for the control group (Cont) and the 72 hour SD experimental group (SD). This is a graph (bottom) showing the result of quantifying the fluorescence level and the combined image of DAPI and the immunofluorescence (40 times, top) and a series of images respectively taken by confocal fluorescence microscopy for GlcNAc (green). . The enlarged part of the merged image at the top is indicated by a white box. Four experimental animals were used per group, and five slices were used per experimental animal. As a result of using the Tucky multiple comparison post-test for statistical processing in the graph, a compared to the control group is P <0.05, b is P <0.01, c is P <0.001, and the corresponding sample Student's t-test for comparison between the two groups As a result of using SD, a represents P <0.05, b represents P <0.01, and the scale bar in the image at the top represents 50 μm:
Dl, lateral section of the dorsal longitudinal brain.
Figure 5k is a passive avoidance test after intraperitoneal injection of dazo-5-oxonornosine (DON) at the concentrations (0.5, 1, 5, 10 and 50 ng/g) indicated in the control or 72 hour SD experimental group animals. It is a graph showing the results. Crossover times were measured in training and memory testing sessions. n=11-18/experiment group; As a result of applying the Student-Newman-Cools post-test for statistical processing, a is P <0.05, b is P <0.01, c is P <0.001, and # is the result of the Wilcoxon rank sum test compared to the 1st training. P > 0.05 compared to training.
5L shows O-GlcNAcization, OGT, OGA from total brain lysate of zebrafish intraperitoneally injected with control (C) or various concentrations of DON (1, 5, 10, 50, 100, and 300 ng/g). , p-CREB, CREB and PKA-cα are pictures showing the results of the analysis of learning-induced changes through Western blot analysis. α-Tubulin was used as an internal standard. n=10/group
Figure 5m is a graph showing the results of a manual avoidance test after intraperitoneal injection of azaserine (Aza) at the concentrations (0.1, 1, 5, 10 and 20 mg/g) indicated in the control or 72 hour SD experimental group animals to be. Crossover times were measured in training and memory testing sessions. n=10-17/experiment group; As a result of applying the Student-Newman-Cools post-test for statistical processing, a is P <0.05, b is P <0.01, c is P <0.001, and # is the result of the Wilcoxon rank sum test compared to the 1st training. P > 0.05 compared to training.
FIG. 5n shows O-GlcNAcization, OGT, OGA, p from total brain lysate of zebrafish intraperitoneally injected with control group (C) or various concentrations of azaserine (0.1, 1, 5, 10 and 20 mg/g). -CREB, CREB and PKA-cα are pictures showing the results of the analysis of learning-induced changes through Western blot analysis. α-Tubulin was used as an internal standard. n=10/group
FIG. 6A is a graph showing the results of a manual avoidance test after intraperitoneal injection of oxalic acid (Alx) of various concentrations (5, 20, 40 and 100 μg/g) into a control group or a 72-hour SD experimental group animal. Crossover times were measured in training and memory testing sessions. n=13-17/experiment group; As a result of applying the Student-Newman-Cools post-test for statistical processing, a is P <0.05, b is P <0.01, c is P <0.001, and # is the result of the Wilcoxon rank sum test compared to the 1st training. P > 0.05 compared to training.
Figure 6b is a graph showing the results of a manual avoidance test after intraperitoneal injection of OSMI-1 at various concentrations (5, 20, 40 and 100 μg/g) into a control or 72 hour SD experimental group animal. Crossover times were measured in training and memory testing sessions. n=13-17/experiment group; As a result of applying the Student-Newman-Cools post-test for statistical processing, a is P <0.05, b is P <0.01, c is P <0.001, and # is the result of the Wilcoxon rank sum test compared to the 1st training. P > 0.05 compared to training.
6C shows O-GlcNAcization, OGT, OGA, p- from total brain lysate of zebrafish intraperitoneally injected with control group (C) or various concentrations of OSMI-1 (5, 50, 100 and 300 ng/g). This is a photograph showing the results of analyzing the learning-induced changes of CREB, CREB, PKA-cα, C/EBP-β and C/EBP-δ through Western blot analysis. α-Tubulin was used as an internal standard. n=5/group
Figure 6d is a graph showing the results of a manual avoidance test after injecting a control group (C) or Thiamet G of 50 μg/g into the intraperitoneal cavity of zebrafish. Crossover times were measured in training and memory testing sessions. n=13-18/experimental group; As a result of applying the Student-Newman-Cools post-test for statistical processing, a is P <0.05, b is P <0.01, c is P <0.001, and # is the result of the Wilcoxon rank sum test compared to the 1st training. P > 0.05 compared to training.
Figure 6e is O-GlcNAc, OGT, OGA, p-CREB, CREB, PKA-cα, C/EBP-β, C/ from brain lysates extracted after sacrificing the zebrafish of Figure 6d after manual avoidance training. This is a photograph showing the result of analyzing the expression of EBP-δ by Western blot analysis. Brain lysates were obtained 2 hours after the first training session (M1) or 2 hours after the second training session (M2) and 24 hours (M3). α-Tubulin (α-Tub) was used as a control. n=10/group.
Figure 6f is a graph showing the results of a manual avoidance test after injecting the control group (C) or 50 μg/g PugNAc or 5, 20, or 50 μg/g Thiamet G into the intraperitoneal cavity of zebrafish. Crossover times were measured in training and memory testing sessions. n=11~19/experiment group; As a result of applying the Student-Newman-Cools post-test for statistical processing, a is P <0.05, b is P <0.01, c is P <0.001, and # is the result of the Wilcoxon rank sum test compared to the 1st training. P > 0.05 compared to training.
Figure 6g is O-GlcNAc, OGT, OGA, p-CREB, CREB, PKA-cα, C/EBP-β, C/ from brain lysates extracted after sacrifice of the zebrafish of Figure 6f after manual avoidance training This is a photograph showing the result of analyzing the expression of EBP-δ by Western blot analysis. α-Tubulin (α-Tub) was used as a control. n=10/group.
FIG. 6H is a graph showing the results of a manual avoidance test of zebrafish with or without a control and/or 72 hour DON (300 ng/g) daily treated or untreated with 0.2 g/L GlcN. Crossover times were measured during training learning and memory testing sessions. n=14-20/experiment group; As a result of applying the Student-Newman-Cools post-test for statistical processing, c represents P <0.001 compared to the first training, and # represents P > 0.05 in the Wilcoxon rank sum test.
Figure 6i is O-GlcNAc, OGT, OGA, p-CREB, CREB, PKA-cα, C/EBP-β, C/EBP in brain lysates extracted by sacrificing the zebrafish of Figure 6h after manual evasion test This is a picture of Western blot gel observing the expression pattern of -δ and p-mTOR. Brain lysates of zebrafish were obtained after 2 hours of primary training (M1) or 2 hours of secondary training (M2) and 24 hours (M3). Actin was used as an internal standard. n = 10 / experimental group.
Figure 6j shows various genes (HK-) in zebrafish brains treated or untreated with GlcN (0.2 g/L), Thiamet G (50 μg/g), DON (300 ng/g) or OSMI-1 for 24 hours. 1, HK-2, GK, PFKP-α, PFKP-β, PFKL-α, PFKL-β, G6PDH, PKM-α, GFPT-1, GFPT-2, OGT1, OGT2, and OGA) An agarose gel electrophoresis photograph (left) showing the PCR results to be performed and a series of histograms showing RT-PCR results for quantification of individual genes. In the graph, the bars and bars represent the mean and standard error of the expression level of each gene in three independent experiments, respectively. Actin was used as an internal standard, and n=4/experimental group. As a result of applying the Tucky multiple comparison post-test for statistical processing, a shows P <0.05 and b shows P <0.01 compared to the control.
C or Cont, control;
G or GlcN, glucosamine;
OS, OSMI;
Thia G or TG, Thiamet G;
D or DON, diazo-5-oxonorneucine.
6K shows various genes (NMDA, in zebrafish brains treated or untreated with GlcN (0.2 g/L), Thiamet G (50 μg/g), DON (300 ng/g) or OSMI-1 for 24 hours). Arc, ubH1, ubH5, NRGN, Homer1, GHRH, egr1, c-fos, BDNF, per-2, and bmal-1) agarose gel electrophoresis photograph showing the results of PCR to confirm the expression level (left) and A series of histograms showing RT-PCR results for quantification of individual genes. In the graph, the bars and bars represent the mean and standard error of the expression level of each gene in three independent experiments, respectively. Actin was used as an internal standard, and n=4/experimental group. As a result of applying the Tucky multiple comparison post-test for statistical processing, a shows P <0.05 and b shows P <0.01 compared to the control.
C or Cont, control;
G or GlcN, glucosamine;
OS, OSMI;
Thia G or TG, Thiamet G;
D or DON, diazo-5-oxonorneucine.
Figure 6L shows various genes for zebrafish brains with or without GlcN (0.2 g/L) (NMDA, Arc, ubH1, ubH5, NRGN, Homer1, GHRH, egr1, c-fos, BDNF, per-2, and bmal-1) is an agarose gel electrophoresis photograph (left) showing PCR results to confirm the expression level and a series of histograms showing RT-PCR results for quantification of individual genes. In the graph, the bars and bars represent the mean and standard error of the expression level of each gene in three independent experiments, respectively. Actin was used as an internal standard, and n=4/experimental group. As a result of applying the Tukey multiple comparison post-test for statistical processing, a compared to the control group shows P <0.05, b shows P <0.01, and the result of using the corresponding sample Student's t-test for comparison between the two groups, SD compared to a P <0.05, b is P <0.01.
7A is a schematic diagram schematically showing an experimental schedule for observing the effect of GlcN on repeated SD-induced accumulation of β-amyloid (Aβ), p-Tau, and gliosis in the zebrafish brain.
FIG. 7B shows immunofluorescence staining of Thioflavin S (green, Thio S) in the brain of zebrafish treated with or without GlcN in the repeated SD experimental group (4X), which repeated 72 hours SD (1X) and 72 hours SD four times. It is a confocal fluorescence micrograph (40 times, top) and a graph showing the result of fluorescence quantification (bottom). Four experimental animals were used per experimental group, and five slices were used for each experimental animal. As a result of applying the Tukey multiple comparison test for statistical processing, a compared to the control group is P <0.05, b is P <0.01, c is P <0.001, and the result of using the corresponding sample Student's t-test for comparison between the two groups , SD compared to a is P <0.05, b is P <0.01, and the scale bar represents 50 μm.
Figure 7c is an immunofluorescence staining image for DAPI (blue) staining and Aβ (red) staining in zebrafish brains treated with or without GlcN in the 72-hour SD experimental group (1X) and the repeated SD experimental group (4X) and these two. This is a graph (bottom) showing the combined image of the image (top) and quantifying the degree of fluorescence in the image. Four experimental animals were used per experimental group, and five slices were used for each experimental animal. As a result of applying the Tukey multiple comparison test for statistical processing, a compared to the control group is P <0.05, b is P <0.01, c is P <0.001, and the result of using the corresponding sample Student's t-test for comparison between the two groups , SD compared to a is P <0.05, b is P <0.01, and the scale bar represents 50 μm.
7D is an immunofluorescence staining image for DAPI (blue) staining and pTau (green) staining in zebrafish brains treated with or without GlcN in the 72 hour SD experimental group (1X) and the repeated SD experimental group (4X), and these two. This is a graph (bottom) showing the combined image of the image (top) and quantifying the degree of fluorescence in the image. Four experimental animals were used per experimental group, and five slices were used for each experimental animal. As a result of applying the Tukey multiple comparison test for statistical processing, a compared to the control group is P <0.05, b is P <0.01, c is P <0.001, and the result of using the corresponding sample Student's t-test for comparison between the two groups , SD compared to a is P <0.05, b is P <0.01, and the scale bar represents 50 μm.
Figure 7e is a DAPI (blue) staining and O-GlcNAc for the brains that were extracted by sacrificing the control group (Cont) and the repeat SD experiment group (SD) zebrafish after manual avoidance test with or without GlcN (0.2 g/L). A result of quantifying the degree of O-GlcNAc and the degree of Aβ expression using a series of immunofluorescence staining images for each of the (green) and Aβ (red) and the combined image (top) of these images and the fluorescence measured in the image It is a graph (bottom). Four experimental animals were used per experimental group, and five slices were used for each experimental animal. As a result of applying the Tukey multiple comparison test for statistical processing, a compared to the control group is P <0.05, b is P <0.01, c is P <0.001, and the result of using the corresponding sample Student's t-test for comparison between the two groups , SD for a is P <0.05, b is P <0.01, and the scale bar represents 50 μm:
Dl, lateral section of the dorsal longitudinal brain.
Figure 7f is a DAPI (blue) staining and O-GlcNAc for the brains that were extracted by sacrificing the control group (Cont) and the repeat SD experimental group (SD) zebrafish after manual avoidance test with or without GlcN (0.2 g/L). The result of quantifying the degree of O-GlcNAc and the degree of Aβ expression using a series of immunofluorescence staining images for each of the green (green) and pTau (red) and the combined image (top) of these images and the fluorescence measured in the image It is a graph (bottom). Four experimental animals were used per experimental group, and five slices were used for each experimental animal. As a result of applying the Tukey multiple comparison test for statistical processing, a compared to the control group is P <0.05, b is P <0.01, c is P <0.001, and the result of using the corresponding sample Student's t-test for comparison between the two groups , SD for a is P <0.05, b is P <0.01, and the scale bar represents 50 μm:
Dl, lateral section of the dorsal longitudinal brain.
7G is a control group (Cont), treated with or without GlcN, 72 hours SD experimental group (1X) and 72 hours SD repeated SD experiment group (4X) zebrafish sacrificial ventral region of the brain extracted at the expense of the brain ( DAPI (blue) staining for Vd), and immunofluorescence staining images for GFAP (green), S100β (red), and merged images (top) for the images and the fluorescence levels of GFAP and S100β in the images. It is a graph (quantitatively shown) quantified. Four experimental animals were used per experimental group, and five slices were used for each experimental animal. As a result of applying the Tukey multiple comparison test for statistical processing, a compared to the control group is P <0.05, b is P <0.01, c is P <0.001, and the result of using the corresponding sample Student's t-test for comparison between the two groups , SD compared to a is P <0.05, b is P <0.01, and the scale bar represents 50 μm.
Figure 7h is a control section (Cont), treated with or without GlcN, 72 hours SD experimental group (1X) and repeating the SD experimental group (4X) repeating 72 hours SD four times zebrafish at the expense of the cerebral dorsal dorsal side region of the brain DAPI (blue) staining for (Dl), and immunofluorescence staining images for GFAP (green), S100β (red), and merged images (top) for the images and the fluorescence levels of GFAP and S100β in the images It is a graph (bottom) shown by quantifying. Four experimental animals were used per experimental group, and five slices were used for each experimental animal. As a result of applying the Tukey multiple comparison test for statistical processing, a compared to the control group is P <0.05, b is P <0.01, c is P <0.001, and the result of using the corresponding sample Student's t-test for comparison between the two groups , SD compared to a is P <0.05, b is P <0.01, and the scale bar represents 50 μm.

용어의 정의:Definition of Terms:

본 문서에서 사용되는 "수면박탈(sleep deprivation, SD)"은 실험동물로 하여금 강제로 잠을 못 자게 하는 행위를 의미하며, 임상적으로는 수면장애를 모사함으로써 수면의 생리학적 기능을 알아내는 데 목적을 위해 사용되는 것이다. 즉, 잠을 못 잘때 나타나는 여러 가지 현상을 분석ㅇ종합하면, 수면이 생물체의 생활에서 차지하는 비중이나 생활에 미치는 영향 또는 수면의 역할을 알 수 있다. 수면장애는 이처럼 강제로 잠을 못 자게 함으로써 수면의 기능을 연구할 목적으로 행해지는 강제행위를 말한다. 본 발명에서는 수면장애를 제브라피쉬에 적용한 결과 헥소사민(Hexosamine) 생합성 경로와 O-GlcNAcation을 통해 포도당 대사를 억제함으로써 학습과 기억(learning & memory)에 장애를 주는 것으로 나타났다."Sleep deprivation (SD)", as used in this document, refers to the act of forcibly preventing an experimental animal from sleeping, and clinically simulating sleep disorders to determine the physiological function of sleep. It is used for a purpose. In other words, by analyzing and synthesizing various phenomena that occur when you can't sleep, you can see the role of sleep or its effect on life or the role of sleep. Sleep disorder refers to forced acts that are conducted for the purpose of studying the function of sleep by forcibly preventing sleep. In the present invention, as a result of applying sleep disorders to zebrafish, it was found that hexosamine inhibits glucose metabolism through biosynthetic pathway and O-GlcNAcation, thereby impairing learning and memory.

본 문서에서 사용되는 "OGT(O-linked β-N-acetylglucosamine transferase)"는 세포 내 단백질의 세린(serine) 또는 트레오닌(threonine) 잔기에 O-glycosidic 결합으로 단일 N-아세틸글루코사민을 첨가하는 것을 촉매하는 효소이다. OGT에 의해 단백질에 N-아세틸글루코사민이 부가되는 것을 O-GlcNAcyation(또는 O-GlcNAc화)라고 한다.As used herein, "OGT (O-linked β-N-acetylglucosamine transferase)" catalyzes the addition of a single N-acetylglucosamine by O-glycosidic binding to serine or threonine residues in intracellular proteins. Enzyme. The addition of N-acetylglucosamine to a protein by OGT is called O-GlcNAcyation (or O-GlcNAcation).

본 문서에서 사용되는 "OGA(O-linked β-N-acetylglucosamine hydrolase)"는 단백질로부터 GlcNAc의 제거를 촉매하는 가수분해효소를 의미한다.As used herein, “OGA (O-linked β-N-acetylglucosamine hydrolase)” refers to a hydrolase that catalyzes the removal of GlcNAc from a protein.

발명의 상세한 설명:Detailed description of the invention:

본 발명의 일 관점에 따르면, UDP-GlcNAc, OGT(O-linked GlcNAc transferase) 및 O-GlcNAc화 기질을 포함하는 반응액에 피검 화합물 또는 조성물을 처리하는 단계; 상기 기질의 O-GlcNAc화 정도를 확인하는 단계; 및 피검 화합물 또는 조성물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 기질의 O-GlcNAc화를 유의하게 증가시킨 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는 수면장애에 의해 유발되는 학습 및 기억 장애 치료제 후보물질의 스크리닝 방법이 제공된다.According to an aspect of the present invention, treating a test compound or composition in a reaction solution comprising UDP-GlcNAc, O-linked GlcNAc transferase (OTG) and O-GlcNAc-forming substrate; Confirming the degree of O-GlcNAcization of the substrate; And selecting a test compound or composition that significantly increased O-GlcNAc formation of the substrate compared to a control group not treated with the test compound or composition. A screening method is provided.

상기 방법에 있어서, 상기 기질의 O-GlcNAc화 정도는 O-GlcNAc화 기질 및 항-GlcNAc 항체를 이용한 면역학적 분석방법 또는 질량분석법에 의해 측정될 수 있고, 상기 면역학적 분석방법은 펩타이드 마이크로어레이 분석, 웨스턴블랏 분석, 방사능면역분석(RIA), 또는 ELISA일 수 있다.In the above method, the degree of O-GlcNAcization of the substrate can be measured by an immunological analysis method or mass spectrometry using an O-GlcNAcization substrate and an anti-GlcNAc antibody, and the immunological analysis method is peptide microarray analysis. , Western blot analysis, radioimmunoassay (RIA), or ELISA.

상기 방법에 있어서, 상기 O-GlcNAc화 기질은 OGT에 의해 O-GlcNAc가 부가되는 단백질 또는 상기 단백질에서 O-GlcNAc화가 일어나는 부위를 포함하는 펩타이드일 수 있다. 상기 단백질은 CaMKII, PLN(phospholamban), STIM1(stromal interaction molecule 1), Complex I/III/IV, DRP1(dynamin-1-like protein), VDAC(voltage-dependent anion channel), FXR(farnesyl X receptor), BMAL1(brain and muscle ARNT-like 1), CLOCK(circadian locomotor output cycles kaput), CRTC2(CREB regulated transcription coactivator 2), FOXO1(forkhead box protein O1), PGC-1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha), IRS1(insulin receptor substrate 1), AKT(protein kinase B), ChREBP(carbohydrate-responsive element-binding protein), NFATc1(nuclear factor of activated T-cells, cytoplsmic 1), NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells), TAK1(mitogen-activated protein kinase kinase kinase 7), C/EBP-β(CCAAT/enhancer-binding protein beta ), PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma), IR-β(insulin receptor beta), Sp1(Sp1 transcription factor), RUNX2(Runt-related transcription factor 2), MEF2D(monocyte-specific enhancer factor 2D), CREB(cAMP response element binding protein), Milton, α-synuclein, tau, KCNQ3(potassium voltage-gated channel subfamily Q member 3), GluA2(glutamate transport ATP-bidning protein), periaxin(PRX), c-Myc, FOXM1(forkhead box protein M1), G6PD(glucose-6-phosphate dehyrogenase), PFK1m(phophofructokinase-1), TET1(Tet methylcytosine dioxygenase), OCT4(octamer-binding transcription factor 4), SOX2(sex determining region Y-Box 2), BCKD(Branched chain ketoacid dehydrogenase), GYS2(glycogen synthase 2), KCNB1(potassium voltage-gated channel subfamily B), KPB1(Phosphorylase b kinase regulatory subunit), MYBB(Myb-like protein B), MYPC3(Myosin Binding Protein C), KIF2C(Kinesin Family Member 2C), RBL-2(RB Transcriptional Corepressor Like 2), DHX30(DExH-Box Helicase 30), NCOA2(Nuclear Receptor Coactivator 2), NCOA3(Nuclear Receptor Coactivator 3), NCOA6(Nuclear Receptor Coactivator 6), NRIP1(Nuclear Receptor Interacting Protein 1), MED1(Mediator Complex Subunit 1), NR0B2(Nuclear Receptor Subfamily 0 Group B Member 2), BRD8(Bromodomain Containing 8), NRIP1(Nuclear Receptor Interacting Protein 1), PRGR(progesterone receptor), LCOR(Ligand-dependent corepressor), WIPI1(WD repeat domain phosphoinositide-interacting protein 1), RRP1B(Ribosomal RNA Processing 1B), CDKN2AIP(CDKN2A Interacting Protein), VIM(Vimentins), TPR(Translocated Promoter Region), SPTBN1(Spectrin Beta, Non-Erythrocytic 1), RANBP2(RAN Binding Protein 2), HIST1H3A(Histone Cluster 1 H3 Family Member A), KRT8(keratin-8), NUMA1(Nuclear Mitotic Apparatus Protein 1), PHB(PHB), EMSY(BRCA2 Interacting Transcriptional Repressor), CRTC2(CREB Regulated Transcription Coactivator 2), NUP214(Nucleoporin 214), CAMK4(Calcium/Calmodulin Dependent Protein Kinase IV), BPTF(Bromodomain PHD Finger Transcription Factor), HCFC1(VP16-accessory protein HCF), KRT18(Keratin 18), POM121(POM121 Transmembrane Nucleoporin), RBM14(RNA Binding Motif Protein 14), ATXN2L(Ataxin 2 Like), SNCA(alpha-synuclein), IKBKB(Inhibitor Of Nuclear Factor Kappa B Kinase Subunit Beta), Esr1( Estrogen Receptor 1), Sptbn1(Spectrin Beta, Non-Erythrocytic 1), Ablim1(Actin Binding LIM Protein 1), Skt(KIAA1217), Nos3(Nitric Oxide Synthase 3), Lbr(Lamin B Receptor), Mapt(microtubule-associated protein tau), Prkcb(Protein Kinase C Beta), Prkcd(Protein Kinase C Delta), Prkce(Protein Kinase C Epsilon), Prkcg(Protein Kinase C Gamma), GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), 또는 WIPI1(WD repeat domain phosphoinositide-interacting protein 1)일 수 있다(Yang et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 18(7): 452-465, 2017; Shi et al., PLoS One, 0151085, 2016; Wang et al., BMC Bioinformatics 12: 91, 2011). 상기 펩타이드는 BCKD_45_27(ERSKTVTSFYNQS, 서열번호 65), GYS2_1_13(MLRGRSLSVTSLG, 서열번호 66), KCNB1_489_501(KWTKRTLSETSSS, 서열번호 67), KPB1_1011_1023(QVEFRRLSISAES, 서열번호 68), MYBB_513_525(DNTPHTPTPFKNA, 서열번호 69), MYPC3_266_280(LSAFRRTSLAGGG, 서열번호 70), KIF2C_105_118_S106G(EGLRSRSTRMSTVS, 서열번호 71), RBL-2_410_422(KENSPCVTPVSTA, 서열번호 72), RBL-2_655_667(GLGRSITSPTTLY, 서열번호 73), DHX30_241_262(QFPLPKNLLAKVIQIATSSSTA, 서열번호 74), NCOA2_866_888(SQSTFNNPRPGQLGRLLPNQNLP, 서열번호 75), NCOA3_MOUSE_1029_1051(HGSQNRPLLRNSLDDLLGPPSNA, 서열번호 76), NCOA6_1479_1501(LVSPAMREAPTSLSQLLDNSGAR, 서열번호 77), NRIP1_121_143_P124R(DSVRKGKQDSTLLASLLQSFSSR, 서열번호 78), MED1_591_614(HGEDFSKVSQNPILTSLLQITGNG, 서열번호 79), NR0B2_9_31_C9S/C11S(SPSQGAASRPAILYALLSSSLKA, 서열번호 80), BRD8_254_276(TVAASPAASGAPTLSRLLEAGPT, 서열번호 81), NRIP1_8_30(GSDVHQDSIVLTYLEGLLMHQAA, 서열번호 82), NRIP1_253_275_C263S(PATSPKPSVASSQLALLLSSEAH, 서열번호 83), PRGR_42_64_C64S(SDTLPEVSAIPISLDGLLFPRPS, 서열번호 84), LCOR_40_62(TTSPTAATTQNPVLSKLLMADQD, 서열번호 85) 또는 WIPI1_313_335_C318S(GQRNISTLSTIQKLPRLLVASSS, 서열번호 86)일 수 있다. In the above method, the O-GlcNAc-ized substrate may be a protein to which O-GlcNAc is added by OGT or a peptide including a site where O-GlcNAcization occurs in the protein. The protein is CaMKII, phospholamban (PLN), stromal interaction molecule 1 (STIM1), Complex I/III/IV, dynamin-1-like protein (DRP1), voltage-dependent anion channel (VDAC), farnesyl X receptor (FXR) , BMAL1 (brain and muscle ARNT-like 1), CLOCK (circadian locomotor output cycles kaput), CRTC2 (CREB regulated transcription coactivator 2), FOXO1 (forkhead box protein O1), PGC-1α (peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1 -alpha), IRS1 (insulin receptor substrate 1), AKT (protein kinase B), ChREBP (carbohydrate-responsive element-binding protein), NFATc1 (nuclear factor of activated T-cells, cytoplsmic 1), NF-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells), TAK1 (mitogen-activated protein kinase kinase kinase 7), C/EBP-β (CCAAT/enhancer-binding protein beta), PPARγ (peroxisome proliferator-activated receptor gamma), IR-β (insulin receptor beta), Sp1 (Sp1 transcription factor), RUNX2 (Runt-related transcription factor 2), MEF2D (monocyte-specific enhancer factor 2D), CREB (cAMP r esponse element binding protein), Milton, α-synuclein, tau, potassium voltage-gated channel subfamily Q member 3 (KCNQ3), glutamate transport ATP-bidning protein (GluA2), periaxin (PRX), c-Myc, FOXM1 (forkhead box) protein M1), G6PD (glucose-6-phosphate dehyrogenase), PFK1m (phophofructokinase-1), TET1 (Tet methylcytosine dioxygenase), OCT4 (octamer-binding transcription factor 4), SOX2 (sex determining region Y-Box 2), BCKD (Branched chain ketoacid dehydrogenase), GYS2 (glycogen synthase 2), KCNB1 (potassium voltage-gated channel subfamily B), KPB1 (Phosphorylase b kinase regulatory subunit), MYBB (Myb-like protein B), MYPC3 (Myosin Binding Protein C) , KIF2C(Kinesin Family Member 2C), RBL-2(RB Transcriptional Corepressor Like 2), DHX30(DExH-Box Helicase 30), NCOA2(Nuclear Receptor Coactivator 2), NCOA3(Nuclear Receptor Coactivator 3), NCOA6(Nuclear Receptor Coactivator 6), NRIP1 (Nuclear Receptor Interacting Protein 1), MED1 (Mediator Complex Subunit 1), NR0B2 (Nuclear Receptor Subfamily 0 Group B Membe r 2), BRD8 (Bromodomain Containing 8), NRIP1 (Nuclear Receptor Interacting Protein 1), PRGR (progesterone receptor), LCOR (Ligand-dependent corepressor), WIPI1 (WD repeat domain phosphoinositide-interacting protein 1), RRP1B (Ribosomal RNA Processing 1B), CDKN2A Interaction Protein (CDKN2AIP), Vimentins (VIM), Translocated Promoter Region (TPR), Spectrin Beta, Non-Erythrocytic 1 (SPTBN1), RANBP2 (RAN Binding Protein 2), HIST1H3A (Histone Cluster 1 H3 Family Member) A), KRT8 (keratin-8), NUMA1 (Nuclear Mitotic Apparatus Protein 1), PHB (PHB), EMSY (BRCA2 Interacting Transcriptional Repressor), CRTC2 (CREB Regulated Transcription Coactivator 2), NUP214 (Nucleoporin 214), CAMK4 (Calcium) /Calmodulin Dependent Protein Kinase IV), BPTF (Bromodomain PHD Finger Transcription Factor), HCFC1 (VP16-accessory protein HCF), KRT18 (Keratin 18), POM121 (POM121 Transmembrane Nucleoporin), RBM14 (RNA Binding Motif Protein 14), ATXN2L( Ataxin 2 Like), SNCA (alpha-synuclein), IKBKB (Inhibitor Of Nuclear Factor Kappa B Kinase Subunit Beta), Esr1 (Estrogen Receptor 1), Sptbn1 (Spectrin Beta, Non-Erythrocytic 1), Ablim1 (Actin Binding LIM Protein 1), Skt (KIAA1217), Nos3 (Nitric Oxide Synthase 3), Lbr (Lamin B Receptor), Mapt (microtubule-associated protein tau), Prkcb (Protein Kinase C Beta), Prkcd (Protein Kinase C Delta), Prkce (Protein Kinase C Epsilon), Prkcg (Protein Kinase C Gamma), GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) , Or WIPI1 (WD repeat domain phosphoinositide-interacting protein 1) (Yang et al ., Nat. Rev. Mol. Cell Biol ., 18(7): 452-465, 2017; Shi et al ., PLoS One, 0151085, 2016; Wang et al ., BMC Bioinformatics 12: 91, 2011). The peptides are BCKD_45_27 (ERSKTVTSFYNQS, SEQ ID NO: 65), GYS2_1_13 (MLRGRSLSVTSLG, SEQ ID NO: 66), KCNB1_489_501 (KWTKRTLSETSSS, SEQ ID NO: 67), KPB1_1011_1023 (QVEFRRLSISAES, SEQ ID NO: 68), MYDN_513 LSAFRRTSLAGGG, SEQ ID NO: 70), KIF2C_105_118_S106G (EGLRSRSTRMSTVS, SEQ ID NO: 71), RBL-2_410_422 (KENSPCVTPVSTA, SEQ ID NO: 72), RBL-2_655_667 (GLGRSITSPTTLY, SEQ ID NO: 73), DHX30_241_262 (QFPLPKSQNQLA , SEQ ID NO: 75), NCOA3_MOUSE_1029_1051 (HGSQNRPLLRNSLDDLLGPPSNA, SEQ ID NO: 76), NCOA6_1479_1501 (LVSPAMREAPTSLSQLLDNSGAR, SEQ ID NO: 77), NRIP1_121_143_P124R (DSVRKGKQDSTLLASLLQSFSSR, SEQ ID NO: 78), MED1_591_614 (HGEDFSKVSQNPILTSLLQITGNG, SEQ ID NO: 79), NR0B2_9_31_C9S / C11S (SPSQGAASRPAILYALLSSSLKA, SEQ ID NO: 80), BRD8_254_276 (TVAASPAASGAPTLSRLLEAGPT, SEQ ID NO: 81), NRIP1_8_30 (GSDVHQDSIVLTYLEGLLMHQAA, SEQ ID NO: 82), NRIP1_253_275_C263S (PATSPKPSVASSQLALLLSSEAH, SEQ ID NO: 83), PRGR_42_64_C64S (SDTLPEVSAIPISLDGLLFPRPS, SEQ ID NO: 84), LCOR_40_62 (TTSPTAATTQNPVLSKLLMADQD, SEQ ID NO: 85) or WIPI1_313_335_C318S ( GQRNISTL STIQKLPRLLVASSS, SEQ ID NO: 86).

상기 펩타이드 명칭은 펩타이드가 유래된 단백질명_해당 단백질 서열에서 펩타이드에 상응하는 시작 아미노산 위치_마지막 아미노산 위치로 구성되어 있으며, 일부 펩타이드의 마지막 부분에 표기된 알파벳 대문자-아라비아 숫자-알파벳-대문자는 단백질을 기준으로 해당 위치에서의 아미노산이 치환되었음을 의미한다(즉, C318S는 단백질 기준으로 318번째 아미노산인 시스테인이 세린으로 치환되었음을 의미한다).The peptide name consists of the name of the protein from which the peptide is derived_the starting amino acid position corresponding to the peptide in the protein sequence_the last amino acid position, and the alphabetic capital letter-Arabic number-alphabet-capital letter written at the end of some peptides refers to the protein. As a reference, it means that the amino acid at the corresponding position is substituted (that is, C318S means that the 318th amino acid, cysteine, is substituted with serine).

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 실험동물에 대하여 수면박탈을 수행하는 단계; 상기 수면박탈이 되기 전, 동시에 또는 후에 실험동물에 피검 화합물 또는 조성물을 투여하는 단계; 및 상기 실험동물의 뇌에서의 OGT 발현 또는 활성을 증가시킨 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는 수면장애에 의해 유발되는 학습 및 기억 장애 치료제 후보물질의 스크리닝 방법이 제공된다.According to another aspect of the invention, the step of performing sleep deprivation on the experimental animal; Administering a test compound or composition to the test animal before, simultaneously or after the sleep deprivation; And screening a test compound or composition that increases OGT expression or activity in the brain of the experimental animal.

상기 방법에 있어서, 상기 동물은 마우스, 랫트, 개, 돼지, 기니피크, 햄스터, 또는 제브라피쉬일 수 있으나, 학습 및 기억이 가능한 동물이라면 그 어느 것이라도 사용이 가능하다.In the above method, the animal may be a mouse, rat, dog, pig, guinea peak, hamster, or zebrafish, but any animal capable of learning and memory can be used.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, OGT 활성화제를 유효성분으로 포함하는 수면장애에 의해 유발되는 학습 및 기억 장애 치료용 약학적 조성물이 제공된다.According to another aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for the treatment of learning and memory disorders caused by sleep disorders comprising an OGT activator as an active ingredient.

본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, OGT 활성화제를 유효성분으로 포함하는 수면장애에 의해 유발되는 기억력 및 인지능력 감소 개선용 건강기능식품이 제공된다.According to another aspect of the present invention, there is provided a health functional food for reducing memory and cognitive ability caused by sleep disorders containing OGT activator as an active ingredient.

본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 환부의 종류, 적용부위, 처리회수, 처리시간, 제형, 환자의 상태, 보조제의 종류 등에 따라 변할 수 있다. 사용량은 특별히 한정되지 않지만, 0.01μg/kg/day 내지 10 mg/kg/day일일 수 있다. 상기 1일량은 1일에 1회, 또는 적당한 간격을 두고 하루에 2~3회에 나눠 투여해도 되고, 수일(數日) 간격으로 간헐(間歇)투여해도 된다.The effective amount of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the type of the patient's affected area, the application site, the number of treatments, the treatment time, the formulation, the patient's condition, and the type of adjuvant. The amount of use is not particularly limited, but may be 0.01 μg/kg/day to 10 mg/kg/day. The daily amount may be administered once a day or divided into 2-3 times a day at appropriate intervals, or may be administered intermittently at intervals of several days.

본 발명의 약학적 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 0.1-100 중량%로 함유될 수 있고 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 약학적 조성물의 제조에는 고체 또는 액체의 제제용 첨가물을 사용할 수 있다. 제제용 첨가물은 유기 또는 무기 중 어느 것이어도 된다. 부형제로서는 예를 들면 유당, 자당, 백당, 포도당, 옥수수 전분(cornstarch), 전분, 탈크, 소르비트, 결정 셀룰로오스, 덱스트린, 카올린, 탄산칼슘 및 이산화규소 등을 들 수 있다. 결합제로서는 예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트래거캔스(tragacanth),젤라틴, 셀락(shellac), 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 구연산칼슘, 덱스트린 및 펙틴(pectin) 등을 들 수 있다. 활택제로서는 예를 들면 스테아린산마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 경화식물유 등을 들 수 있다. 착색제로서는 통상 의약품에 첨가하는 것이 허가되어 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 이들의 정제, 과립제에는 당의(糖衣), 젤라틴코팅, 기타 필요에 따라 적절히 코팅할 수 있다. 또한, 필요에 따라 방부제, 항산화제 등을 첨가할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be contained in an amount of 0.1-100% by weight based on the total weight of the composition, and may further include suitable carriers, excipients, and diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions. In addition, additives for the preparation of a solid or liquid may be used in the preparation of the pharmaceutical composition. The additive for formulation may be either organic or inorganic. Examples of the excipients include lactose, sucrose, white sugar, glucose, cornstarch, starch, talc, sorbit, crystalline cellulose, dextrin, kaolin, calcium carbonate, silicon dioxide, and the like. Examples of the binder include polyvinyl alcohol, polyvinyl ether, ethyl cellulose, methyl cellulose, gum arabic, tragacanth, gelatin, shellac, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, calcium citrate, And dextrin and pectin. Examples of the lubricant include magnesium stearate, talc, polyethylene glycol, silica, and cured vegetable oil. Any colorant can be used as long as it is normally permitted to be added to pharmaceuticals. These tablets and granules can be appropriately coated according to sugar content, gelatin coating, or other needs. In addition, preservatives, antioxidants, and the like can be added as necessary.

본 발명의 약학적 조성물은 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며(예: 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 최신판;Mack Publishing Company, Easton PA), 제제의 형태는 특별히 한정되는 것은 아니다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042(Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기술되어 있다. The pharmaceutical composition of the present invention may be prepared in any formulation conventionally prepared in the art (e.g., Remington's Pharmaceutical Science, latest edition; Mack Publishing Company, Easton PA), and the form of the formulation is not particularly limited. . These formulations are described in Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042 (Chapter 87: Blaug, Seymour), a prescription generally known to all pharmaceutical chemistries.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여되는 것이 가능하며, 바람직하게는 비경구 투여로 정맥내 주입, 피하 주입, 뇌실내 주입(intracerebroventricular injection), 뇌척수액내 주입(intracerebrospinal fluid injection), 근육내 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다. The pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, preferably intravenous injection, subcutaneous injection, intracerebroventricular injection, intracerebrospinal fluid injection, intramuscular by parenteral administration It can be administered by infusion and intraperitoneal injection.

본 발명의 건강기능식품은 건강기능식품에 적합한 다양한 제형, 예컨대, 탕제, 드링크제, 산제, 환제, 캡슐, 정제(코팅정, 당의정, 설하정 등), 젤리 등의 제형이 사용될 수 있다.The health functional food of the present invention may be used in various formulations suitable for the health functional food, for example, formulations such as baths, drinks, powders, pills, capsules, tablets (coated tablets, dragees, sublingual tablets), and jelly.

본 발명에서 “건강기능식품”이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.In the present invention, the term "health functional food" refers to food manufactured and processed using raw materials or ingredients having functional properties useful for the human body according to Act 6727 on the Health Functional Food, and it is a nutrient for the structure and function of the human body. It means to ingest for the purpose of obtaining a useful effect for health purposes such as controlling or physiological action.

수면과 L/M 사이의 관계를 결정하는 최적의 접근법은 전체 또는 부분 수면장애(SD)이 L/M에 미치는 영향을 관찰하는 것이고 L/M에 대한 수면의 영향에 관한 대부분의 연구는 설치류 모델을 이용한 행동 및 전기 생리학적 신경과학(electrophysiological neurosciences)에 집중되어왔다. 행동특성 및 수면구조의 복잡성은 수면과 기억 형성 사이의 기본 분자 교차점과 연관성을 해결할 수 있는 간단한 모델 시스템이 필요하다. 제브라피쉬(Danio rerio)는 신경 행동 연구 및 인간에 대한 번역 관련성이 있는 수면 행동 및 L/M을 조절하는 진화적 보존 메커니즘의 명확성 연구를 위한 우수한 척추동물 모델로 주목받고 있다. 제브라피쉬에서의 메모리 평가는 강력하고 안정적이고 진화론적으로 보존된 메모리 트레이스(memory trace)를 밝혀내는 수단으로 회피 작업 패러다임(avoidance tasks paradigm)의 사용과 관련이 있다. 특히 마우스 및 랫(rat)에 비해 약물 투여의 비 침습성(non-invasive nature) 및 대규모 스크리닝 시스템의 용이한 취급으로 인해 약물의 대량 스크리닝을 위한 탁월한 모델 시스템을 제공한다.The optimal approach to determining the relationship between sleep and L/M is to observe the effect of full or partial sleep disorder (SD) on L/M, and most studies on the effect of sleep on L/M have been conducted in rodent models. Has been focused on behavioral and electrophysiological neurosciences. The behavioral characteristics and complexities of sleep structure require a simple model system that can solve the basic molecular intersection and association between sleep and memory formation. The zebrafish (Danio rerio) has attracted attention as an excellent vertebrate model for studying neurobehavior and clarity of evolutionary conservation mechanisms that regulate translational behavior and L/M for humans. Memory evaluation in zebrafish is related to the use of avoidance tasks paradigm as a means to uncover powerful, stable, and evolutionarily conserved memory traces. In particular, the non-invasive nature of drug administration compared to mice and rats and the ease of handling of large-scale screening systems provide an excellent model system for bulk screening of drugs.

포유류의 두뇌는 글루코스(glucose)를 주 에너지 원으로 하며 글루코스 대사를 엄격하게 조절하는 것이 정상적인 뇌 생리학에 중요하다. 최근 글루코스 대사와 신경 퇴행의 변화 사이의 직접 연관성에 대한 축적된 증거가 제시되었다. 예를 들어, 비만이나 2형 당뇨병(type Ⅱ diabetes mellitus)과 같은 대사장애에서 조절되지 않는 글루코스 대사는 알츠하이머 병(Alzheimer's disease, AD)의 진행 및 인지손상과 관련되어 있다. 최근 보고에 따르면 포도당 소비의 결함으로 인해 에너지 대사의 전반적인 손상이나 헥소사민(hexosamine) 생합성 경로(HBP)-의존적 당화(glycosylation)를 비롯한 여러 메커니즘을 통해 신경세포가 손상 받기 쉬운 것으로 나타났다. 소량의 세포 내 글루코스(3-5%)는 O-linked-GlcNAc modification(O-GlcNAcylation) 반응에서 GlcNAc 공여체로 작용하는 UDP-N-아세틸글루코사민(UDP-GlcNAc)으로 전환된다. 상기 O-GlcNAcylation은 뉴런의 정상 기능에 관여하는 것으로 추정되며, 이의 조절 장애는 다양한 신경계 질환의 발병 기전에 영향을 미친다. 상기 과정은 GlcNAc 잔기를 단백질 기질로 이동시키는 O-linked β-N-acetylglucosamine transferase(OGT) 및 GlcNAc의 제거를 촉매하는 O-GlcNAc hydrolase(OGA)에 의해 조절된다. 상기 OGT와 OGA는 모두 시냅스 전 말단(presynaptic terminal)의 시냅스 소포(synaptic vesicle) 근처에서 풍부하고, 시냅스 전후의 많은 단백질들이 O-GlcNAc로 변형된 뉴런에서 특히 풍부하다. 그러나, 시냅스 가소성(synaptic plasticity)에서 O-GlcNAcation의 기능적 역할은 아직 확립되어 있지 않다. 사실, 정상적인 두뇌 기능에서 HBP/O-GlcNAcation의 중요한 역할에 대한 장기적인 징후를 고려할 때, 기억 장애 및 인지기능 장애에 대한 이 신호 전달 체계의 기여를 이해하는 것이 관련된 건강 상태의 효과적인 평가 및 치료에 중요하다.The mammalian brain uses glucose as its main energy source, and strict regulation of glucose metabolism is important for normal brain physiology. Recently, accumulated evidence for the direct link between glucose metabolism and changes in neurodegeneration has been presented. For example, uncontrolled glucose metabolism in metabolic disorders such as obesity or type II diabetes mellitus is associated with the progression and cognitive impairment of Alzheimer's disease (AD). Recent reports indicate that nerve cells are susceptible to damage through a number of mechanisms, including overall impairment of energy metabolism or a hexosamine biosynthetic pathway (HBP)-dependent glycosylation due to impaired glucose consumption. A small amount of intracellular glucose (3-5%) is converted to UDP-N-acetylglucosamine (UDP-GlcNAc), which acts as a GlcNAc donor in an O-linked-GlcNAc modification (O-GlcNAcylation) reaction. The O-GlcNAcylation is presumed to be involved in the normal functioning of neurons, and its dysregulation affects the pathogenesis of various neurological diseases. The process is regulated by O-linked β-N-acetylglucosamine transferase (OGT), which transfers GlcNAc residues to the protein substrate, and O-GlcNAc hydrolase (OGA), which catalyzes the removal of GlcNAc. Both the OGT and OGA are abundant near the synaptic vesicle of the presynaptic terminal, and many proteins before and after the synapse are particularly abundant in neurons modified with O-GlcNAc. However, the functional role of O-GlcNAcation in synaptic plasticity has not been established. In fact, considering the long-term indications of the important role of HBP/O-GlcNAcation in normal brain function, understanding the contribution of this signaling system to memory impairment and cognitive impairment is important for effective assessment and treatment of relevant health conditions. Do.

이에 본 발명자들은 SD 제브라피쉬 실험군에서 상기 경로에 관여하는 유전자의 회피 학습 과제 및 결함에서 HBP/O-GlcNAcylation의 강력한 활성화를 입증함으로써 학습 및 기억(L/M) 과정에서 HBP 변화 및 GlcNAcylation의 중요성을 확인하였다. 반대로, HBP/O-GlcNAcylation의 향상은 제브라피쉬의 SD-유도 L/M 결손을 회복시켰고 이러한 발견은 인지기능에 대한 역동적인 O-GlcNAcation의 중요성을 검증하였으며, 두뇌 내에서 글루코스 조절된 HBP 신호 전달의 중단이 AD의 진행에 기여한다는 이론을 뒷받침한다는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 수면장애로 유발되는 학습 및 기억 장애 치료용 약학적 조성물을 SD 제브라피쉬에 적용한 결과 SD 스트레스 저해효과 및 신경세포 보호능력이 우수하여, 인지기능 또는 기억능력 예방, 개선 또는 치료에 이용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.Therefore, the present inventors demonstrated the strong activation of HBP/O-GlcNAcylation in the task and defect of avoidance of genes involved in the pathway in the SD zebrafish experimental group, thereby highlighting the importance of HBP change and GlcNAcylation in the learning and memory (L/M) process. Confirmed. Conversely, enhancement of HBP/O-GlcNAcylation restored the SD-induced L/M deficiency of zebrafish, and these findings confirmed the importance of dynamic O-GlcNAcation for cognitive function and glucose-regulated HBP signaling in the brain. It was confirmed that the discontinuation of the study supports the theory that it contributes to the progression of AD. Therefore, as a result of applying the pharmaceutical composition for the treatment of learning and memory disorders caused by sleep disorders of the present invention to SD zebrafish, the SD stress inhibitory effect and nerve cell protection ability are excellent, and it is used for prevention, improvement or treatment of cognitive function or memory capacity It was confirmed that it can be completed the present invention.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시 예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시 예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, the present invention is not limited to the embodiments disclosed below, but may be implemented in various different forms, and the following embodiments make the disclosure of the present invention complete, and the scope of the invention to those skilled in the art It is provided to inform you completely.

일반적 실험방법General experiment method

공시 재료Disclosure material

본 발명에서 사용한 제브라피쉬(Danio rerio)는 대한민국의 지침 및 규정에 따라 표준 조건(standard condition)으로 하기와 같이 사육하였다. 6월령의 제브라피쉬 성체(대략 2.5 cm 길이)는 대상라인 아쿠아리움(Seoul, Korea)에서 구매하였고 14시간/10시간 명암 주기 및 28.0ㅁ1.0℃의 조건으로 유지하였다. 그 후, 침전물 필터, 포스트-카본 필터 및 형광 자외선 살균 필터가 장착된 다단 여과 시스템을 통해 여과한 수돗물을 물고기용 수족관 용기에 공급하였다(Zebrafish AutoSystem, Genomic Design, Seoul, South Korea). 상기 용기 내의 물은 연속적으로 폭기(aerated)되어 6.5 내지 7.5의 pH로 유지되었고 하루 두 번 플레이크(flake) 사료(TetraBits, Luzerne, Singapore)를 제브라피쉬에 급이하였으며 실험을 위해 저온 노출(0-4℃) 또는 0.03% 메탄 술포 네이트염(MS-222) 주입 후 참수(decapitation)방법으로 안락사 시켰다.The zebrafish (Danio rerio) used in the present invention was bred as follows in standard conditions according to the guidelines and regulations of the Republic of Korea. The zebrafish adult (approximately 2.5 cm long) of June age was purchased from Daesang Line Aquarium (Seoul, Korea) and maintained under conditions of 14 hours/10 hours contrast and 28.0ㅁ1.0℃. Thereafter, the filtered tap water through a multi-stage filtration system equipped with a sediment filter, a post-carbon filter, and a fluorescent ultraviolet sterilization filter was supplied to an aquarium container for fish (Zebrafish AutoSystem, Genomic Design, Seoul, South Korea). The water in the vessel was continuously aerated and maintained at a pH of 6.5 to 7.5, and twice a day the flake feed (TetraBits, Luzerne, Singapore) was fed to zebrafish for low temperature exposure (0- 4 ℃) or 0.03% methane sulfonate salt (MS-222) was injected and then euthanized by decapitation.

수면장애(SD) 프로토콜 Sleep Disorder (SD) Protocol

본 발명에서 사용된 제브라피쉬는 14:10의 명암주기(오후 10시에 불을 끄고, 오전 8시에 불을 켜기)하에 유지되었다. SD 모델을 생성하기 위해, 다양한 시간 조건에 따른 연장된 명(24:0)조건에 노출되었다.The zebrafish used in the present invention was maintained under a contrast period of 14:10 (turn off the lights at 10 pm and turn on the lights at 8 am). To create the SD model, it was exposed to extended light (24:0) conditions according to various time conditions.

행동 패러다임(behavioral paradigm)Behavioral paradigm

본 발명자들이 수행한 행동 패러다임은 종래의 방법을 통해 수행하였다(Lee Y, et al., Mol Neurobiol. 55(11):8738-8753. 2018). 먼저, 오픈 탱크 테스트(open tank test)는 탐색활동(exploratory activity)을 분석하기 위해 제브라피쉬를 개별적으로 1 L의 시스템 용수로 채운 홈 탱크(home tank)에 방치하였다. 상기 탱크의 전면은 3개의 가상 층으로 각각 2.5 cm(상단, 중앙 및 하단)로 나뉘어져 있고 순응 1시간 후 물고기를 1시간 동안 촬영하였고 수직 위치를 1시간 동안 매분 기록했다. 또한 신규 탱크 잠수 분석(novel tank diving test)은 불안 수준(anxiety level)을 결정하기 위해 제브라피쉬를 홈 탱크에서 시스템 용수로 채운 1 L 플라스틱 탱크로 개별적으로 이송하였다. 상기 탱크의 전면은 3개의 가상 층으로 각각 2.5 cm(상단, 중앙 및 하단)로 나뉘어져 있고 1시간의 적응 후 1시간 동안 CCD 카메라(JYCOS, Incheon, Korea)로 행동을 추적하였고 수직 위치는 매분마다 기록했다. 아울러, 수동 회피 테스트(passive avoidance test)는 종래의 방법에 따라 암 조건으로 오전 10시 및 오후 5시 사이에 억제 회피 학습(inhibitory avoidance learning)을 평가하였다. The behavioral paradigm performed by the present inventors was performed through a conventional method (Lee Y, et al., Mol Neurobiol. 55(11):8738-8753. 2018). First, in the open tank test, the zebrafish was individually placed in a home tank filled with 1 L of system water to analyze the exploratory activity. The front side of the tank was divided into three virtual layers, each 2.5 cm (top, center, and bottom), and after 1 hour of acclimatization, fish were photographed for 1 hour and vertical positions were recorded every minute for 1 hour. In addition, the novel tank diving test individually transferred zebrafish from the home tank to the 1 L plastic tank filled with system water to determine the anxiety level. The front of the tank is divided into 2.5 virtual layers (top, middle, and bottom), each of three virtual layers, and after 1 hour of adaptation, the behavior is tracked by a CCD camera (JYCOS, Incheon, Korea) for 1 hour. Recorded. In addition, the passive avoidance test evaluated inhibitory avoidance learning between 10 am and 5 pm as cancer conditions according to a conventional method.

Reverse Transcription PCR Reverse Transcription PCR

본 발명자들은 PCR 증폭을 위해 제브라피쉬 뇌의 총 RNA를 TRIzol™(Invitrogen, Carlsbad, CA) 시약으로 추출하였고 제조사의 지침에 따라 GoScript™ Reverse Transcriptase(Promega, Madison, Wisconsin, USA)로 RNA 2 μg에서 cDNA를 합성하였다. 그 후 제브라피쉬의 특이적 프라이머(표 1 참조)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 반응조건은 94℃ 5분, 94℃ 30초, 57℃ 30초, 72℃ 30초, 32사이클 및 72℃ 7분으로 PCR을 수행하였고 증폭 후 PCR 생성물을 전기영동하였으며 1% 아가로즈 겔에서 분석하였다. 정량 실시간(quantitative real-time) PCR을 위해 SYBR Green Real-time PCR Master Mix(Toyobo, Osaka, Japan)로 cDNA를 증폭시켰으며 모든 결과는 β-액틴의 발현에 대해 정상화하였다. 상기 PCR 증폭에 사용한 프라이머의 핵산서열을 하기 표 1에 요약하였다. The present inventors extracted total RNA of zebrafish brains with TRIzol™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) reagent for PCR amplification and from 2 μg of RNA with GoScript™ Reverse Transcriptase (Promega, Madison, Wisconsin, USA) according to the manufacturer's instructions. cDNA was synthesized. Then, PCR was performed using a specific primer of zebrafish (see Table 1). The reaction conditions were PCR at 94°C for 5 minutes, 94°C for 30 seconds, 57°C for 30 seconds, 72°C for 30 seconds, 32 cycles, and 72°C for 7 minutes. After amplification, the PCR product was electrophoresed and analyzed on a 1% agarose gel. Did. For quantitative real-time PCR, cDNA was amplified with SYBR Green Real-time PCR Master Mix (Toyobo, Osaka, Japan), and all results were normalized to the expression of β-actin. The nucleic acid sequence of the primer used for the PCR amplification is summarized in Table 1 below.

프라이머 핵산서열 정보Primer nucleic acid sequence information 명칭designation 핵산서열(5' -> 3')Nucleic acid sequence (5' -> 3') 서열번호Sequence number NMDA FNMDA F TAT CTG GCA TTG GTG AGT GCTAT CTG GCA TTG GTG AGT GC 1One NMDA RNMDA R CAG ACT GGT TCC CAC ATA GCCAG ACT GGT TCC CAC ATA GC 22 Arc FArc F ACA AAC AAG CCT TCG AGT TCACA AAC AAG CCT TCG AGT TC 33 Arc RArc R TCC TTC TTC TTG GAG ACT GCTCC TTC TTC TTG GAG ACT GC 44 ubH1 FubH1 F TAG TAA CGA AAG CAC GGA CATAG TAA CGA AAG CAC GGA CA 55 ubH1 RubH1 R TCT GCT TTC ATC TCC ACT GATCT GCT TTC ATC TCC ACT GA 66 ubH5 FubH5 F TGA TGC TAA ATC AAC GGC TATGA TGC TAA ATC AAC GGC TA 77 ubH5 RubH5 R GAG CTG ATA CTT GGC GAT CTGAG CTG ATA CTT GGC GAT CT 88 NRGN FNRGN F ATG GAC TGT CGA AAC GAA GGATG GAC TGT CGA AAC GAA GG 99 NRGN RNRGN R ACC AGC TTG AAT CTT AGC GGACC AGC TTG AAT CTT AGC GG 1010 Homer1 FHomer1 F CTT GGA TGG ATC GAA GGC AACTT GGA TGG ATC GAA GGC AA 1111 Homer1 RHomer1 R GGC TAT TCT GGC TGC TTC TTGGC TAT TCT GGC TGC TTC TT 1212 GHRH FGHRH F CTT GCT AGT GCT ATG CTG CTCTT GCT AGT GCT ATG CTG CT 1313 GHRH RGHRH R AGC TGT TGG TAA AGA TGG CAAGC TGT TGG TAA AGA TGG CA 1414 egr1 Fegr1 F TCT TCC TCT TCC ACG TCT TCTCT TCC TCT TCC ACG TCT TC 1515 egr1 Regr1 R TCT GGA TGG GTT TCT GAT CTTCT GGA TGG GTT TCT GAT CT 1616 c-fos Fc-fos F CTG AGT GTC TCA AGT GCC TCCTG AGT GTC TCA AGT GCC TC 1717 c-fos Rc-fos R TGG AGG TCT TTG CTC CAG TATGG AGG TCT TTG CTC CAG TA 1818 BDNF FBDNF F GAC ACT TTC GAG CAG GTC ATGAC ACT TTC GAG CAG GTC AT 1919 BDNF RBDNF R GCA TAC AGG TCA ACG TCC TTGCA TAC AGG TCA ACG TCC TT 2020 per-2 Fper-2 F TGT TTC AGG ATG TGG ATG AGTGT TTC AGG ATG TGG ATG AG 2121 per-2 Rper-2 R AGG AGT CTG TGG ATC TGC TCAGG AGT CTG TGG ATC TGC TC 2222 bmal-1 Fbmal-1 F GCT CCA CGA GAG AGA CTC ATGCT CCA CGA GAG AGA CTC AT 2323 bmal-1 Rbmal-1 R TAT TCA GTG GGT TTG ACA CGTAT TCA GTG GGT TTG ACA CG 2424 HK-1 FHK-1 F CGG GAA ATG GAG AAC GGA TTCGG GAA ATG GAG AAC GGA TT 2525 HK-1 RHK-1 R GTC CAT GTC AGC AAA ACA GCGTC CAT GTC AGC AAA ACA GC 2626 HK-2 FHK-2 F ACC AAT TTT CGG GTT CTG CTACC AAT TTT CGG GTT CTG CT 2727 HK-2 RHK-2 R ACA GGC TCA CGA CAT CTT TCACA GGC TCA CGA CAT CTT TC 2828 GK FGK F AGG CTG CAA TGC GTG TTA TAAGG CTG CAA TGC GTG TTA TA 2929 GK RGK R GAT CTG CTT TCT GTC CCC TGGAT CTG CTT TCT GTC CCC TG 3030 TK-αFTK-αF TGG TGT GCC AGA GTA AAG AATGG TGT GCC AGA GTA AAG AA 3131 TK-αRTK-αR AGA TTT TCA GCA GGT CGT TCAGA TTT TCA GCA GGT CGT TC 3232 PYGB FPYGB F CCC AAA GAG GAT AAA CAT GGCCC AAA GAG GAT AAA CAT GG 3333 PYGB RPYGB R TGA CCT GGA TGT CAA AGA TGTGA CCT GGA TGT CAA AGA TG 3434 GLUT1 FGLUT1 F TAA CGC TCC ACA GAA GAT CATAA CGC TCC ACA GAA GAT CA 3535 GLUT1 RGLUT1 R GGG CAA TTT CTC CAA CAT ACGGG CAA TTT CTC CAA CAT AC 3636 GLUT3 FGLUT3 F GCT CCT CCT TCG AGA TGA TAGCT CCT CCT TCG AGA TGA TA 3737 GLUT3 RGLUT3 R CTT CCC CAC ATC CTC ATA ACCTT CCC CAC ATC CTC ATA AC 3838 PFKP-α FPFKP-α F TAT CTG GCA TTG GTG AGT GCTAT CTG GCA TTG GTG AGT GC 3939 PFKP-α RPFKP-α R CAG ACT GGT TCC CAC ATA GCCAG ACT GGT TCC CAC ATA GC 4040 PFKP-β FPFKP-β F AGG AAC AAA ACG AAC CCT CCAGG AAC AAA ACG AAC CCT CC 4141 PFKP-β RPFKP-β R CGG TTG CCA GAT ATC CAC AACGG TTG CCA GAT ATC CAC AA 4242 PFKL-α FPFKL-α F ATT CCC ATG TGC ATC ATC CCATT CCC ATG TGC ATC ATC CC 4343 PFKL-α RPFKL-α R GTG CTC ATG ACA CTT CTC GTGTG CTC ATG ACA CTT CTC GT 4444 PFKL-β FPFKL-β F AGA GCA TCG TGG ACA ACA TCAGA GCA TCG TGG ACA ACA TC 4545 PFKL-β RPFKL-β R CCT CAT AGA TGT ACA CCG CGCCT CAT AGA TGT ACA CCG CG 4646 G6PDH FG6PDH F ACT GAG GAG CAA ATC TAC CGACT GAG GAG CAA ATC TAC CG 4747 G6PDH RG6PDH R TCA ATG CAC TTC AGC ACT TTTCA ATG CAC TTC AGC ACT TT 4848 PKM-α FPKM-α F TGC AGT CTC AGA GAA GGA CATGC AGT CTC AGA GAA GGA CA 4949 PKM-α RPKM-α R CCT TGT TGC AAC GAC CAA TCCCT TGT TGC AAC GAC CAA TC 5050 GFPT-1 FGFPT-1 F CTG GGA AAG CAA CTC CAA GTCTG GGA AAG CAA CTC CAA GT 5151 GFPT-1 RGFPT-1 R ACT TCA CCA GCT TAG CGA TGACT TCA CCA GCT TAG CGA TG 5252 GFPT-2 FGFPT-2 F GTT GCT GTA GTG ATG GAG GGGTT GCT GTA GTG ATG GAG GG 5353 GFPT-2 RGFPT-2 R TGC GAT CCA GGA AAT CAC TGTGC GAT CCA GGA AAT CAC TG 5454 OGT-1 FOGT-1 F AGC CAT TGA CAC ATA CCG TCAGC CAT TGA CAC ATA CCG TC 5555 OGT-1 ROGT-1 R CTT GAA GCT TTC CTT GCT GCCTT GAA GCT TTC CTT GCT GC 5656 OGT-2 FOGT-2 F GCA TTG TGC TGA ATG GCA TTGCA TTG TGC TGA ATG GCA TT 5757 OGT-2 ROGT-2 R AGA GCT GGT TGA AGT TGC AAAGA GCT GGT TGA AGT TGC AA 5858 OGA FOGA F GCT TGA GGA TGA GGA AGG TGGCT TGA GGA TGA GGA AGG TG 5959 OGA ROGA R AGC ACC ATG TGA GCC ATT AGAGC ACC ATG TGA GCC ATT AG 6060 Actin FActin F GTG CCC ATC TAC GAG GGT TAGTG CCC ATC TAC GAG GGT TA 6161 Actin RActin R TCT CAG CTG TGG TGG TGA AGTCT CAG CTG TGG TGG TGA AG 6262 CRE FCRE F CAG TCA TTTGCTACACATGGGCTTGGCAG TCA TTTGCTACACATGGGCTTGG 6363 CRE RCRE R CCA AGC CCA TGT GAC GAA ATG ACTCCA AGC CCA TGT GAC GAA ATG ACT 6464

웨스턴블랏 분석Western blot analysis

본 발명자들은 제브라피쉬 뇌의 총 조직 용해물을 Nonidet P-40(NP-40) 용해 완충액[150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 프로테아제를 포함하는 0.5 % NP-40, 포스파타아제 억제제 및 20 μM streptozotocin(STZ)]을 이용하여 수득하였고 이를 웨스턴블랏 분석에 사용하였다. 우선, 핵 및 세포질 분획물의 분리를 위해, 제브라피쉬 뇌를 완충액[150 mM NaCl, 300 mM sucrose, 프로테아제, 포스파타아제 억제제 및 STZ를 함유한 1 mM EDTA(pH 8.0)]에서 용해시켰다. 그 후 핵 분획물을 3,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛화하였고 고장액(1 mM EDTA, pH 8.0)에서 배양하여 수득한 단백질 용해물을 수득하였다. 단백질 농도는 Bradford 분석을 사용하여 결정하였고 단백질(40 μg의)을 SDS-PAGE로 분리하였으며, 니트로 셀룰로오스 멤브레인(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)에 3% 소 혈청 알부민(BSA) 또는 5% 탈지 우유를 1시간 동안 처리하였다. 그 후 상기 멤브레인을 4℃의 조건으로 각각 O-GlcNAc CTD110.6, OGT, phospho-CREB, CREB, c-Fos, C/EBP-β, C/EBP-δ, HDAC1, Actin(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), OGA (Proteintech, Chicago, IL), PKA-cα, phospho-ERK1/2, α-Tubulin, 또는 GAPDH(Cell signaling Technology, Danvers, MA)에 특이적인 항체와 함께 밤새 배양하였다. 이어서 TBS-T로 세척 후, 상기 멤브레인을 퍼옥시다아제(HRP)-결합 2차 항체(Amersham Biosciences, TBS-T 중의 1:10,000 희석)와 함께 배양하였고, 화학발광(ECL) 검출 시스템(Amersham Biosciences)으로 시각화하였으며 단백질 밴드의 농도 측정을 ImageJ(NIH)를 사용하여 분석하였다.We present a total tissue lysate of zebrafish brain in Nonidet P-40 (NP-40) lysis buffer [150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5% NP-40 with protease, phosphata Azeide inhibitor and 20 μM streptozotocin (STZ)] were used for Western blot analysis. First, for separation of the nuclear and cytoplasmic fractions, zebrafish brains were lysed in buffer [150 mM NaCl, 300 mM sucrose, protease, phosphatase inhibitor and 1 mM EDTA with STZ (pH 8.0)]. Thereafter, the nuclear fraction was pelleted by centrifugation at 3,000 rpm for 5 minutes, and the protein lysate obtained by culturing in hypertonic solution (1 mM EDTA, pH 8.0) was obtained. Protein concentration was determined using the Bradford assay and proteins (40 μg) were separated by SDS-PAGE, and 3% bovine serum albumin (BSA) or 5% skim on nitrocellulose membrane (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA). Milk was treated for 1 hour. Thereafter, the membrane was subjected to O-GlcNAc CTD110.6, OGT, phospho-CREB, CREB, c-Fos, C/EBP-β, C/EBP-δ, HDAC1, Actin (Santa Cruz Biotechnology, Incubated overnight with antibodies specific to Santa Cruz, CA), OGA (Proteintech, Chicago, IL), PKA-cα, phospho-ERK1/2, α-Tubulin, or Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Then, after washing with TBS-T, the membrane was incubated with a peroxidase (HRP)-binding secondary antibody (Amersham Biosciences, 1:10,000 dilution in TBS-T), and chemiluminescence (ECL) detection system (Amersham Biosciences). It was visualized as and the concentration measurement of the protein band was analyzed using ImageJ (NIH).

Streptavidin-Agarose 풀다운 분석Streptavidin-Agarose pulldown analysis

본 발명자들은 비오틴 풀다운 분석을 종래의 방법으로 수행하였다(Hwang SY, et al., Br J Pharmacol. 169(7):1551-1560. 2013). 상기 과정은 특정 프로브에 특이적인 전사 인자의 정량적 결합을 허용한다 : CREB 프로모터의 -42/-66 위치에서 CRE 결합 부위를 함유하는 25개의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 63 및 64).The present inventors performed biotin pulldown analysis by a conventional method (Hwang SY, et al., Br J Pharmacol. 169(7):1551-1560. 2013). This process allows quantitative binding of transcription factors specific to a particular probe: 25 nucleotide sequences (SEQ ID NOs: 63 and 64) containing the CRE binding site at the -42/-66 position of the CREB promoter.

OGA 활동 분석OGA Activity Analysis

본 발명자들은 OGA 활동 분석을 위해 제브라피쉬 두뇌를 용해 완충액 A(150 mM NaCl, 50mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5% NP-40 containing protease, phosphatase inhibitors, 20 μM streptozotocin (STZ))로 용해시킨 후 샘플(100 μg)을 활성 분석 완충액(50 mM cacodylate, pH 6.4, 50 mM N-GalNAc, 0.3 % BSA, 1 mM FD-GlcNAc)과 혼합하였다. 그 후 37℃에서 3시간 동안 배양하였고 500 mM Na2CO3를 첨가하여 반응을 종결시켰으며 흡광도는 485 nm의 여기 파장 및 535 nm의 방사 파장에서 측정하였다.We analyzed zebrafish brains with lysis buffer A (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5% NP-40 containing protease, phosphatase inhibitors, 20 μM streptozotocin (STZ)) for OGA activity analysis. The post sample (100 μg) was mixed with an activity assay buffer (50 mM cacodylate, pH 6.4, 50 mM N-GalNAc, 0.3% BSA, 1 mM FD-GlcNAc). Then, the mixture was incubated at 37° C. for 3 hours, and the reaction was terminated by adding 500 mM Na 2 CO 3 .

면역형광 염색 Immunofluorescence staining

본 발명자들은 면역형광 염색을 위해 0.1% PBS-T로 두뇌 절편을 세척하였고 0.1 % PBS-T에서 일반 염소 혈청(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA)으로 차단하였다. 상기 절편을 0.1% PBS-T로 세척 후 각각 O-GlcNAc, phospho-CREB, OGT, GFAP(Santa Cruz Biotechnology), OGA(Proteintech), PKA-cα, β-아밀로이드 (Cell signaling technology, S100β USA) 또는 p-Tau (Abcam, Cambridge, MA, USA)에 대해 특이적인 항체를 포함하는 수용액에서 배양하였고 Alexa Flour 488 또는 568(Molecular Probes)에 염소 항-마우스 IgG 컨쥬게이트를 포함하는 2차 항체의 혼합물과 배양하였다. 그 후 상기 세포를 DAPI(Sigma-Aldrich)로 대조 염색하여 핵을 시각화하였다. 또한 Thioflavin S 염색을 위해, 두뇌 절편을 1% Thioflavin S(Sigma-Aldrich) 용액과 함께 실온에서 8분 동안 배양하였고, 80 및 95% EtOH 및 D.W 순으로 각각 3분간 세척하였으며 박편을 공초점 LSM 510 META 현미경(Carl Zeiss, Jena, Germany)으로 관찰 후 ZEN 라이트 에디션 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.The inventors washed brain sections with 0.1% PBS-T for immunofluorescence staining and blocked with normal goat serum (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) in 0.1% PBS-T. After washing the sections with 0.1% PBS-T, O-GlcNAc, phospho-CREB, OGT, GFAP (Santa Cruz Biotechnology), OGA (Proteintech), PKA-cα, β-amyloid (Cell signaling technology, S100β USA) or Incubated in an aqueous solution containing antibodies specific for p-Tau (Abcam, Cambridge, MA, USA) and a mixture of secondary antibodies containing goat anti-mouse IgG conjugate to Alexa Flour 488 or 568 (Molecular Probes) Cultured. Then, the cells were counter stained with DAPI (Sigma-Aldrich) to visualize the nuclei. In addition, for Thioflavin S staining, brain sections were incubated with 1% Thioflavin S (Sigma-Aldrich) solution for 8 minutes at room temperature, washed for 3 minutes in order of 80 and 95% EtOH and DW, respectively, and the flakes were confocal LSM 510 After observation with a META microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany), it was analyzed using ZEN Lite Edition software.

두뇌 조직의 대사물질 추출 Extraction of metabolites from brain tissue

본 발명자들은 제브라피쉬 두뇌 조직의 대사물질을 추출하기 위해 두뇌 조직을 부피비 7:3:5의 메탄올/물/클로로포름 혼합액으로 균질화 하였고 상기 조직 용해물을 4℃에서 10분간 배양한 후 20분 동안 원심분리 하였다. 그 후 상등액을 질소 기류(stream of nitrogen) 하에서 증발시키고 피리딘에 40 mg/ml의 농도로 용해된 메톡시아민 하이드로클로라이드 용액 40 ㎕를 가한 후 60℃에서 90분 동안 가열한 후 70℃에서 50 ㎕의 N-Methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide로 30분 동안 처리함으로써 유도체화(derivatized)하였다. 그 다음, 10 ㎕의 250 nM Mirex-13C8(Cambridge Isotope Laboratories, USA)을 내부 표준(internal standard) 물질로 첨가하였다.The present inventors homogenized the brain tissue with a mixture of methanol/water/chloroform in a volume ratio of 7:3:5 to extract metabolites of zebrafish brain tissue, and incubated the tissue lysate at 4°C for 10 minutes and centrifuged for 20 minutes. Separated. Thereafter, the supernatant was evaporated under a stream of nitrogen, and 40 μl of a solution of methoxyamine hydrochloride dissolved in pyridine at a concentration of 40 mg/ml was added, followed by heating at 60° C. for 90 minutes, followed by 50 μl at 70° C. Derivatized by treatment with N-Methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide for 30 minutes. Then, 10 μl of 250 nM Mirex-13C8 (Cambridge Isotope Laboratories, USA) was added as an internal standard material.

가스 크로마토그래피 질량 분석(GC-MS)/MS 분석Gas chromatography mass spectrometry (GC-MS)/MS analysis

본 발명자들은 대사산물(metabolites)의 정량분석을 위해 7010 질량 선택형 TQ(Triple Quadrupole) 질량 분석기 시스템(Palo Alto, CA, USA)이 장착된 Agilent 7890B 가스 크로마토그래프를 이용하여 가스 크로마토그래프/텐덤(tandem) 질량 분석을 수행하였다. 그 후 J&W Scientific(Santa Clara, CA, USA) 모세관 컬럼의 DB-5MS UI(30 m×0.25 mm I. D; 0.25 μm 필름 두께)를 사용하여 크로마토그래피 분리를 수행하였다. 인젝터 온도는 270℃, 오븐 온도는 하기와 같이 프로그램 되었다: 초기 오븐 온도는 5분 동안 60℃, 10℃/분의 가열 속도로 300℃로 증가되었으며 상기 최종 온도는 10분 동안 일정하게 유지되었다. 또한 전달 라인(transfer line)은 280℃로 유지되었다. 헬륨은 1 mL/분의 일정한 유량에서 캐리어 가스로 사용되었고 이온 소스(ion source) 온도는 230℃로 설정하였다. 각각의 유도체화된 샘플 1 마이크로 리터를 분할 모드(1:10)로 주입하였다. 그 후 질소를 충돌 가스(collision gas)로서 1.5 mL/분의 유속으로 사용하였고, 헬륨을 2.25 mL/분의 유속으로 급냉 가스(quenching gas)로서 사용하였다. 이온 소스는 230℃로 유지하였고 질량 분석기는 다중 반응 모니터링 모드(MRM)에서 70 eV의 전자 충격 이온화(EI)를 통해 조정되었다.The present inventors used a gas chromatograph/tandem (tandem) using an Agilent 7890B gas chromatograph equipped with a 7010 mass selective triple quadrupole (TQ) mass spectrometer system (Palo Alto, CA, USA) for quantitative analysis of metabolites. ) Mass spectrometry was performed. Chromatographic separation was then performed using a DB-5MS UI (30 m×0.25 mm I. D; 0.25 μm film thickness) of a J&W Scientific (Santa Clara, CA, USA) capillary column. The injector temperature was 270° C. and the oven temperature was programmed as follows: the initial oven temperature was increased to 60° C. for 5 minutes and 300° C. at a heating rate of 10° C./min, and the final temperature was kept constant for 10 minutes. In addition, the transfer line was maintained at 280°C. Helium was used as the carrier gas at a constant flow rate of 1 mL/min and the ion source temperature was set at 230°C. One microliter of each derivatized sample was injected in split mode (1:10). Nitrogen was then used as a collision gas at a flow rate of 1.5 mL/min, and helium was used as a quenching gas at a flow rate of 2.25 mL/min. The ion source was maintained at 230° C. and the mass spectrometer was adjusted through electron impact ionization (EI) of 70 eV in multiple reaction monitoring mode (MRM).

실시예 1: 본능적인 행동 탐색Example 1: Instinctive behavior search

본 발명자들은 익숙하고 안전한 장소를 찾기 위한 제브라피쉬의 본능적인 행동을 탐색하기 위해 3 내지 72시간의 장기간 수면박탈시(SD), 상기 일반적 실험방법에 기재된 바와 같이, 오픈 탱크 테스트 및 신규 탱크 잠수 테스트를 수행하였다.The present inventors conducted a long-term sleep deprivation (SD) of 3 to 72 hours to explore the instinctive behavior of zebrafish to find a familiar and safe place, as described in the general test method, open tank test and new tank dive test Was performed.

오픈 탱크 테스트를 통해 탐색활동을 분석한 결과, 수면박탈시 6시간 경과시부터 대조군과 비교하여 상층에 머무르는 시간이 감소하는 것으로 나타났고, 72시간 수면박탈시에는 매우 제한적인 시간동안만 상층에 머물렀다(도 1a). 신규 탱크 잠수 테스트 결과 역시 상기 오픈 탱크 테스트와 상응하게 수면박탈 시간이 길어질수록 대조군과 비교하여 상층에 더 짧은 시간동안 머물렀고 하층에 더 긴 시간동안 머물렀으며, 이는 증가된 불안 행동을 나타내는 것이다(도 1b). As a result of analyzing the exploration activity through the open tank test, it was found that the time to stay in the upper floor decreased from 6 hours after the sleep deprivation, and stayed in the upper floor for a very limited time during the 72 hour sleep deprivation. (FIG. 1A). The results of the new tank dive test also corresponded to the open tank test, the longer the sleep deprivation time was, the shorter the stay in the upper layer and the longer in the lower layer compared to the control group, indicating increased anxiety behavior (FIG. 1b).

아울러, 수동 회피(passive avoidance)는 제브라피쉬에서 학습과 단기간 또는 장기간 기억을 평가하기 위해 전통적으로 사용되는 공포-동기(fear-motivated) 분석방법이다(Lee, Y. et al., Mol Neurobiol. 55(11): 8738-8753, 2018). 본 발명자들은 도 1c에 도시된 방법을 이용하여 제브라피쉬에 대한 수동 회피 분석을 수행하였다. 제브라피쉬를 훈련학습 및 기억(L/M) 테스트 동안 빛으로부터 가장 멀리 떨어진 챔버에 위치시키고 돌이 광원에 가장 가까운 챔버의 위에서 떨어졌을 때 다른 챔버로 이동하는데 소요되는 시간을 측정하였다. 단기기억(short-term memory)은 3회 연속 훈련 시험 후 2시간 경과시점에서 측정하였다. 본 발명자들은 학습/기억 세션 동안 교차시간이 대조군에 비해 점진적으로 감소하여 SD의 시간 경과에 따라 학습/기억 능력이 손상됨을 확인하였다(도 1d). 그 후 72시간 동안 SD 제브라피쉬를 정상 명/암 주기 하에서 12-144 시간 동안 회복시켰고, 그 결과 탐색 활동의 SD-유발 손상은 SD 후 48 시간이 지나 회복됨을 확인하였다(도 1e). 72시간의 SD-유도 기억 손상, 특히 SD 후 부분적으로 회복하기 위해서는 적어도 72시간, L/M 능력을 완전히 회복하려면 144시간의 더 긴 회복시간이 필요한 것으로 나타났다(도 1f).In addition, passive avoidance is a fear-motivated analytical method that is traditionally used in zebrafish to evaluate learning and short-term or long-term memory (Lee, Y. et al., Mol Neurobiol. 55 (11): 8738-8753, 2018). The inventors performed a manual avoidance analysis on zebrafish using the method shown in FIG. 1C. The zebrafish was placed in the chamber farthest from the light during the training and memory (L/M) test and the time taken to move to another chamber when the stone fell on top of the chamber closest to the light source was measured. Short-term memory was measured 2 hours after 3 consecutive training tests. The present inventors confirmed that during the learning/memory session, the crossing time gradually decreased compared to the control group, thereby impairing the learning/memory ability over time of the SD (FIG. Thereafter, SD zebrafish was recovered for 12-144 hours under a normal light/dark cycle for 72 hours, and as a result, it was confirmed that SD-induced damage of the search activity was recovered 48 hours after SD (FIG. 1E ). SD-induced memory impairment at 72 hours, particularly at least 72 hours to partially recover after SD, and a longer recovery time of 144 hours was required to fully recover L/M capacity (FIG. 1F).

실험예 2: L/M과 관련된 유전자의 발현Experimental Example 2: L/M related gene expression

본 발명자들은 SD-유발 인지기능 저하의 근본적인 분자 메커니즘을 연구를 위해, 제브라피쉬의 뇌에서의 신경 전달물질(neurotransmitters), 생물학적 주기(circadian) 조절 단백질 및 뉴런의 가소성과 관련된 유전자들의 3~72 시간 SD 적용 후 시간의 경과에 따른 전사의 변화를 PCR 및 상술한 바와 같은 방법을 이용하여 정량적 실시간 PCR(q-PCR)을 통해 조사하였다. 그 결과, NMDA와 BDNF 유전자는 3시간 경과시점 부터 감소하기 시작하여 시간의 경과에 따라 점진적으로 감소하였다. 또한 Arc, Homer1, GHRH, eger1 및 c-fos의 유전자 발현은 3시간에서 24 시간으로 점차적으로 증가하였으나, 24시간 후에 급격히 감소하였고, 48-72 시간에서 기저 수준(basal levels)을 회복하였다. 유비퀴틴 카복시-말단 가수분해효소 1(ubiquitin carboxy-terminal hydrolase 1, ubH1) 및 5(ubH5)와 뉴로그라닌(neurogranin, NRGN)은 반대 패턴을 보였으며, 초기 감소와 48-72 시간에 대조군 수준으로 서서히 증가하는 경향을 나타내었다. SD 기간 동안 per-2 및 Bmal-1의 mRNA 수준은 변화하지 않았다(도 2a). The present inventors studied the fundamental molecular mechanisms of SD-induced cognitive decline, 3 to 72 hours of genes related to the plasticity of neurotransmitters, biological circadian regulatory proteins and neurons in the zebrafish brain. The change in transcription over time after SD was applied was investigated by quantitative real-time PCR (q-PCR) using PCR and the method as described above. As a result, the NMDA and BDNF genes began to decrease from the time of 3 hours and gradually decreased over time. In addition, the gene expression of Arc, Homer1, GHRH, eger1 and c-fos gradually increased from 3 hours to 24 hours, but decreased rapidly after 24 hours, and restored basal levels at 48-72 hours. Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase 1 (ubiquitin carboxy-terminal hydrolase 1, ubH1) and 5 (ubH5) and neurogranin (neurogranin, NRGN) showed opposite patterns, with initial reduction and control levels at 48-72 hours It showed a tendency to gradually increase. MRNA levels of per-2 and Bmal-1 did not change during the SD period (FIG. 2A ).

또한 본 발명자들은 12~120시간 동안 회복된 72 시간 SD 제브라피쉬에서의 신경 가소성(neuronal plasticity)에 관여하는 유전자의 시간의 경과에 따른 전사 변화를 조사하였다. 그 결과, NMDA, Arc 및 BDNF 유전자의 SD-유도된 하향 조절은 72 시간 후에 회복하기 시작하였고, SD 후 120시간에서 완전히 대조군 수준으로 회복하였다. 또한 Homer1 및 GHRH mRNA 수준은 24-72 시간에서 증가하였고 회복 120 시간에 대조군 수준으로 복귀하였다(도 2b).In addition, the present inventors investigated changes in transcription over time of genes involved in neuroplasticity in 72-hour SD zebrafish recovered for 12-120 hours. As a result, SD-induced down-regulation of NMDA, Arc and BDNF genes began to recover after 72 hours and completely recovered to control levels at 120 hours after SD. In addition, Homer1 and GHRH mRNA levels increased at 24-72 hours and returned to control levels at 120 hours of recovery (Figure 2B).

실험예 3: L/M 과정 동안 효소 및 대사 변화Experimental Example 3: Enzyme and metabolic changes during L/M process

본 발명자들은 수동 회피(passive-avoidance) 테스트의 학습 전후에 있어서, 대조군 및 SD 제브라피쉬의 뇌에서 헥소사민 생합성 경로(hexosamine biosynthetic pathway, 이하, 'HBP'로 약칭힘)에서의 몇몇 포도당 중간 대사산물(glucose intermediate metabolites)과 비교하였다. 세포로 흡수된 포도당 중 2~5%는 HBP 대사 경로를 따르며 O-연결 N-아세틸글루코사민화(0-GlcNAcyation)를 위한 기질인 UDP-GlcNAc를 생성한다(도 3a). 본 발명자들은 신경 대사산물 농도를 상술한 바와 같이 가스 크로마토그래피-질량 분석기(GC-MS)를 이용하여 분석하였다. 대사산물의 농도를 정량화하기 위해 MRM 모드에서 GC-TQ-MS를 사용하여 표적 분석(targeted analysis)을 수행하였다. 포도당 대사에 속하는 18가지 대사산물을 단일 분석으로 수행하였고 정통 표준(authentic standard)을 보정에 사용하였다. 뇌 조직의 대사산물 수준은 검량선(calibration curves)을 사용하여 계산한 결과, 모든 표적 화합물에 대한 선형 상관 계수(R2)는 0.99 보다 높았고 선형성(linearity)이 양호하였다. 특히, 글루코스, 글루코스-6-인산염(G-6-P) 및 과당-6-인산염(F-6-P)은 대조군의 뇌에서 학습시 명백하게 증가하였지만 SD 제브라피쉬에서는 증가하지 않았다(도 3b). 증가된 G-6-P와 F-6-P는 중간 대사산물 또는 해당과정(glycolysis)의 유전자 및 TCA 주기의 변화를 수반하지 않았다(도 3c 및 3d). 그 대신, HBP의 핵심 중간체인 GlcNAc-6-P는 정상 제브라피쉬의 두뇌에서는 학습에 의해 활성화되었으나, SD 제브라피쉬에서는 그렇지 아니하였다(도 3b).We have some glucose intermediate metabolism in the hexosamine biosynthetic pathway (hereinafter abbreviated as'HBP') in the brains of the control and SD zebrafish before and after learning of the passive-avoidance test. Compared to products (glucose intermediate metabolites). 2-5% of the glucose absorbed into the cell follows the HBP metabolic pathway and produces UDP-GlcNAc, a substrate for O-linked N-acetylglucosamineization (0-GlcNAcyation) (FIG. 3A). The present inventors analyzed the concentration of nerve metabolites using gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) as described above. To quantify the concentration of metabolites, targeted analysis was performed using GC-TQ-MS in MRM mode. Eighteen metabolites belonging to glucose metabolism were performed in a single analysis and an authentic standard was used for calibration. The metabolite level of brain tissue was calculated using calibration curves. As a result, the linear correlation coefficient (R 2 ) for all target compounds was higher than 0.99 and linearity was good. In particular, glucose, glucose-6-phosphate (G-6-P) and fructose-6-phosphate (F-6-P) were clearly increased upon learning in the control brain but not in SD zebrafish (FIG. 3B ). . Increased G-6-P and F-6-P did not involve changes in the gene and TCA cycle of intermediate metabolites or glycolysis (Figures 3c and 3d). Instead, the core intermediate of HBP, GlcNAc-6-P, was activated by learning in the brain of normal zebrafish, but not in SD zebrafish (FIG. 3B).

다음으로, RT-PCR 및 q-PCR에 의한 학습과제의 유무에 관계없이 대조군 및 SD 제브라피쉬 두뇌에서의 당분해성(glycolytic) 및 HBP 경로의 유전자 발현 양상을 조사하였다. 그 결과 헥소카이네이즈 1(HK1), HK2, 글루코카이네이즈(GK), 글루타민:과당-6-포스페이트 아미도트랜스퍼레이즈(glutamine:fructose-6-phosphate amidotransferase 1, GFPT1), GFPT2, OGT1, OGT2, 뇌글리코겐 인산분해효소(brain glycogen phosphorylase, PYGB) 및 포도당 수송체 3(glucose transporter 3, GLUT3)는 SD 시간이 증가함에 따라 지속적으로 하향조절 되었다(도 3e). 흥미롭게도, OGA mRNA 발현은 SD 동안 시간이 경과함에 따라 점진적으로 증가하였으며, OGT 및 OGA의 발현 양상은 SD 조건 하에서 역으로 조절되었다. 본 발명자들은 대조군 및 SD 제브라피쉬 실험군에서 학습훈련 후의 포도당 대사효소의 전사수준을 추가로 조사하였다. 그 결과, 학습자극에 의해 특징적으로 대조군에서는 HKs, GK, GFPTs, OGTs, PYGB, GLUT1 및 GLUT3의 mRNA 발현이 유의하게 증가되었으나(도 3f 및 3g), 72시간 SD 실험군(SD)에서는 이들 유전자들이 6시간 까지 높은 발현을 나타내다가 감소하는 양상을 나타냈다(도 3e). OGA 유전자는 대조군과 SD 실험군 모두에서 학습 과제에 의해 유의한 변화를 나타내지 않았다.Next, the gene expression patterns of glycolytic and HBP pathways in the control and SD zebrafish brains were examined regardless of the presence or absence of learning tasks by RT-PCR and q-PCR. As a result, hexokinase 1 (HK1), HK2, glucokinase (GK), glutamine:fructose-6-phosphate amidotransferase (glutamine:fructose-6-phosphate amidotransferase 1, GFPT1), GFPT2, OGT1, OGT2, brain glycogen Phosphatase (brain glycogen phosphorylase, PYGB) and glucose transporter 3 (glucose transporter 3, GLUT3) were continuously downregulated as SD time increased (FIG. 3e). Interestingly, OGA mRNA expression gradually increased over time during SD, and the expression patterns of OGT and OGA were reversely regulated under SD conditions. The present inventors further investigated the transcription level of glucose metabolizing enzyme after learning training in the control group and the SD zebrafish experimental group. As a result, mRNA expressions of HKs, GK, GFPTs, OGTs, PYGB, GLUT1 and GLUT3 were significantly increased in the control group characteristically by learning stimulation (FIGS. 3F and 3G), but these genes were in the 72 hour SD experiment group (SD). It showed high expression up to 6 hours and then decreased (FIG. 3E). The OGA gene did not show a significant change by the learning task in both the control and SD experimental groups.

또한 본 발명자들은 단기 및 장기 기억 및 학습 강화에 대한 SD의 효과를 평가하였다. 학습 강화 이후의 장기 기억은 24시간의 휴식 기간 후에 두 번째 동일한 일련의 세 가지 훈련 시험과 단일 기억 시험을 통해 측정되었다. 그 결과, 대조군과 비교하여, SD 실험군에서 단기 및 장기기억뿐만 아니라 학습기능도 현저하게 손상된 것을 확인하였다(도 3h). 또한 학습훈련 중 증가된 HK, GK, GFPT, OGT, PYGB, GLUT1 및 GLUT3 mRNA 수준은 두 번째 훈련학습 및 장기기억 기간 동안 유지되었다(도 3i).In addition, the present inventors evaluated the effect of SD on short-term and long-term memory and learning reinforcement. Long-term memory after reinforcement of learning was measured through a second identical series of three training tests and a single memory test after a 24-hour rest period. As a result, compared with the control group, it was confirmed that the learning function as well as short-term and long-term memory were significantly impaired in the SD experimental group (FIG. In addition, increased HK, GK, GFPT, OGT, PYGB, GLUT1 and GLUT3 mRNA levels during training were maintained during the second training and long term memory period (FIG. 3i).

실험예 4: PKAcα 및 p-CREB의 발현 분석Experimental Example 4: Expression analysis of PKAcα and p-CREB

본 발명자들은 PKA 신호 조절의 기초가 되는 조절 경로(regulatory pathways)를 조사하기 위해, 수동 회피 훈련(passive avoidance training) 후에 대조군과 SD 제브라피쉬 간에 PKAcα 및 p-CREB의 발현 양상을 비교했다. 그 결과, 면역형광 염색법을 통해 대조군과 비교하여 SD 제브라피쉬의 종뇌(telencephalon) 영역에서 PKAcα의 감소를 나타냈고 학습 훈련에 의해 대조군 제브라피쉬의 PKAcα 및 p-CREB가 현저히 증가하였으나 SD 제브라피쉬의 두뇌에서는 증가하지 않았음을 확인하였다(도 4a 및 4b). 또한, 대조군에서의 학습훈련은 SD 제브라피쉬에서 둔화되었던 p-CREB의 핵 전좌(nuclear translocation)를 증가시켰다(도 4b). 이는 핵 및 세포질 분획에서 p-CREB에 대한 웨스턴블랏 분석 결과 대조군의 뇌에서 학습훈련 이후에 p-CREB의 핵 전좌가 확인되었으나 SD 실험군에서 관찰되지 않은 결과와 일치하는 것이다(도 4c). CREB의 향상된 전사활성은 대조군 제브라피쉬의 뇌에서 학습훈련 후에 CREB 및 p-CREB의 DNA 결합 활성 증가에 기반하는 것으로 추정되나 비교대상인 SD 실험군에서는 그렇지 않았다(도 4d).The present inventors compared the expression patterns of PKAcα and p-CREB between the control group and SD zebrafish after passive avoidance training to investigate the regulatory pathways underlying PKA signal regulation. As a result, the immunofluorescence staining method showed a decrease in PKAcα in the telencephalon region of the SD zebrafish compared to the control group, and PKAcα and p-CREB of the control zebrafish were significantly increased by learning training, but the brain of the SD zebrafish was significantly increased. It was confirmed that was not increased in (Fig. 4a and 4b). In addition, learning training in the control group increased the nuclear translocation of p-CREB, which was slowed in SD zebrafish (FIG. 4B). This is consistent with the results of Western blot analysis of p-CREB in the nuclear and cytoplasmic fractions, where nuclear translocation of p-CREB was confirmed after learning training in the control brain but not observed in the SD experiment group (FIG. 4C ). The enhanced transcriptional activity of CREB is estimated to be based on the increased DNA binding activity of CREB and p-CREB after training in the brain of the control zebrafish, but not in the SD group of comparison (FIG. 4D).

또한 SD에 의한 HBP/O-GlcNAc 대사 경로의 감소의 징후를 고려하여, 본 발명자들은 대조군 및 SD 제브라피쉬의 뇌에서의 O-GlcNAc화의 변화를 추가로 조사하였다. 그 결과, 면역형광 및 웨스턴블랏 분석 실험 모두 대조군과 비교하여 SD 제브라피쉬 뇌에서 OGA 수준의 증가를 보였고 반대로 O-GlcNAc화 및 OGT 수준의 감소를 나타내었다(도 4e, 4f 및 4g). OGA 효소 활성은 대조군과 비교하여 SD 제브라피쉬 뇌에서 추가로 증가하였다(도 4h).Also considering the signs of a decrease in the HBP/O-GlcNAc metabolic pathway by SD, we further investigated changes in O-GlcNAcization in the brains of the control and SD zebrafish. As a result, both immunofluorescence and western blot analysis experiments showed an increase in OGA levels in the SD zebrafish brain compared to the control group, and conversely, O-GlcNAcization and a decrease in OGT levels (FIGS. 4E, 4F and 4G). OGA enzyme activity was further increased in the SD zebrafish brain compared to the control group (FIG. 4H ).

아울러, 본 발명자들은 학습훈련 이후의 대조군 및 SD 제브라피쉬의 뇌에서의 시간의 경과에 따른 O-GlcNAc화의 변화 및 OGT, OGA, p-CREB, c-fos 및 PKAcα의 발현의 변화를 조사하였다. 그 결과, 대조군에서는 학습훈련 직후 O-GlcNAc화가 증가하기 시작하여 서서히 2 ~ 24 시간까지 유지되고 48 시간에 기저 수준으로 감소하였다(도 4i). OGT, p-CREB, c-fos 및 PKAcα의 단백질 수준은 시간의 경과에 따른 O-GlcNAc화과 유사한 패턴을 나타냈으나, SD 실험군에서는 그러한 변화가 관찰되지 않았다(도 4j). 또한 면역형광 염색 결과 OGT와 O-GlcNAc화 수준이 대조군의 종뇌(telencephalon)에서 학습훈련에 의해 증가 되었으나, SD 실험군에서는 증가하지 않았음을 보여 주었다. 반면 OGA는 학습훈련의 유무에 관계없이 SD에서 증가하였다(도 4k 및 4l).In addition, the present inventors investigated changes in O-GlcNAc formation and expression of OGT, OGA, p-CREB, c-fos, and PKAcα over time in the brain of the control group and SD zebrafish after learning training. . As a result, in the control group, O-GlcNAcization began to increase immediately after learning training, gradually maintained until 2 to 24 hours, and decreased to a baseline level at 48 hours (FIG. 4i ). The protein levels of OGT, p-CREB, c-fos and PKAcα showed a pattern similar to O-GlcNAcization over time, but no such change was observed in the SD experimental group (Fig. 4j). In addition, the results of immunofluorescence staining showed that OGT and O-GlcNAc levels were increased by learning training in the control telencephalon, but not in the SD experiment group. On the other hand, OGA increased in SD with or without learning training (Figs. 4K and 4L).

실험예 5: L/M, HBP/O-GlcNAcation 및 PKA/CREB 활성화Experimental Example 5: L/M, HBP/O-GlcNAcation and PKA/CREB activation

본 발명자들은 L/M의 GlcN에 의한 증가된 HBP 유입의 효과를 조사하기 위해, 대조군 및 72시간 SD 제브라피쉬를 2 시간 동안 다양한 농도(0.01, 0.05, 0.1, 0.5 및 1 mg/L)의 GlcN으로 배양하고 학습 및 단기기억을 평가하였다. 그 결과, 0.05 및 0.1 mg/L의 농도의 GlcN 처리시 L/M 능력의 약하지만 유의한 증가를 확인할 수 있었다(도 5a). 다음으로, 단기간 및 장기간의 기억 및 학습 강화를 조사하여 SD-유도된 L/M 손상에 대한 GlcN의 효과를 측정한 결과 24시간의 회복 기간 후에 평가된 장기기억의 유지는 SD 실험군에서 손상되었으며 GlcN에 의해 유의하게 회복되었다(도 5b).In order to investigate the effect of increased HBP influx by GlcN in L/M, the present inventors used control and 72-hour SD zebrafish at various concentrations (0.01, 0.05, 0.1, 0.5 and 1 mg/L) of GlcN for 2 hours. Incubated with and evaluated learning and short-term memory. As a result, a weak but significant increase in L/M capacity was observed when GlcN was treated at concentrations of 0.05 and 0.1 mg/L (FIG. 5A ). Next, short-term and long-term memory and learning reinforcement were investigated to measure the effect of GlcN on SD-induced L/M damage. As a result, maintenance of long-term memory evaluated after the 24-hour recovery period was impaired in the SD experimental group and GlcN It was significantly recovered by (Fig. 5b).

또한 GlcN이 O-GlcNAc화 및 OGT 또는 OGA의 수준에 미치는 영향을 조사하기 위해 웨스턴블랏 분석을 수행한 결과 GlcN이 제브라피쉬의 두뇌에서 O-GlcNAc화, OGT, p-CREB, c-fos 및 PKAcα 뿐만 아니라 C/EBPβ 및 C/EBPδ의 단백질 수준을 증가시킨다는 것을 확인하였다(도 5c). O-GlcNAc화 및 PKA/CREB 신호 전달에 관여하는 분자는 대조군에서 L/M 과정에 의해 급격히 증가하였지만 SD 군에서는 증가하지 않았다(도 5d). SD에서 인지기능의 회복과 일관되게, GlcN 처리는 SD 제브라피쉬의 뇌에서 학습과 단기 및 장기기억 과정 후에 O-GlcNAc화, OGT, p-CREB, c-fos 및 PKAcα, C/EBPβ 및 C/EBPδ를 회복시켰다(도 5d). 또한, SD에서 관찰된 OGA 발현의 증가는 L/M 과정 동안 GlcN에 의해 억제되었다. OGA의 효소활성은 GlcN에 의해 저해되었지만 대조군보다 높게 유지된 SD 제브라피쉬의 뇌에서 증가되었다(도 5e). 대조군 제브라피쉬에서 학습한 후에 O-GlcNAc화, OGT, PKAcα, p-CREB 및 C/EBPβ 및 C/EBPβ의 전반적인 수준이 증가되었지만, 세포질 및 핵 사이의 p-CREB를 제외하고는 상기 단백질의 상대적 세포 내 위치에는 유의한 차이가 없었다(도 5f). p-ERK1/2 단백질 발현은 SD 및/또는 학습 과제에 의해 유의한 영향을 받지 않았다. 면역형광 실험은 SD 제브라피쉬의 뇌에서 GlcN이 학습훈련(learning task) 후에 OGA 수준을 감소시키면서 p-CREB, PKA-cα, OGT 및 O-GlcNAc화 수준 및 p-CREB 핵 전좌를 촉진한다는 것을 추가로 증명하였다(도 5g 내지 5j).In addition, Western blot analysis was performed to investigate the effect of GlcN on O-GlcNAcization and the level of OGT or OGA. As a result, GlcN O-GlcNAcization, OGT, p-CREB, c-fos and PKAcα in zebrafish brain In addition, it was confirmed that C/EBPβ and C/EBPδ increase protein levels (FIG. 5C ). Molecules involved in O-GlcNAcization and PKA/CREB signaling increased rapidly by the L/M process in the control group, but not in the SD group (FIG. 5D ). Consistent with recovery of cognitive function in SD, GlcN treatment is O-GlcNAcization, OGT, p-CREB, c-fos and PKAcα, C/EBPβ and C/ after learning and short and long term memory processes in the brain of SD zebrafish. EBPδ was restored (FIG. 5D ). In addition, the increase in OGA expression observed in SD was inhibited by GlcN during the L/M process. The enzyme activity of OGA was inhibited by GlcN but increased in the brain of SD zebrafish, which remained higher than the control (FIG. 5e). Overall levels of O-GlcNAcation, OGT, PKAcα, p-CREB and C/EBPβ and C/EBPβ increased after learning in the control zebrafish, but relative to the protein except for p-CREB between the cytoplasm and nucleus There was no significant difference in the intracellular location (FIG. 5F). p-ERK1/2 protein expression was not significantly affected by SD and/or learning tasks. Immunofluorescence experiments add that GlcN in the SD zebrafish brain promotes p-CREB, PKA-cα, OGT and O-GlcNAcization levels and p-CREB nuclear translocation while reducing OGA levels after a learning task. It was verified as (Fig. 5g to 5j).

GlcN에 의한 HBP 경로 활성화가 SD-유도 기억결손의 회복을 유도하기 때문에, 본 발명자들은 HBP의 약리학적 억제가 기억기능에 영향을 미치는지 조사하였다. 그 결과 GFPT 억제제인 diazo-5-oxonorneucine(DON)을 복강 내 투여한 제브라피쉬에서는 L/M이 농도 의존적으로 손상되었다(도 5k). 동시에, 학습 유도 O-GlcNAc화, OGT 및 PKA/CREB 활성화는 DON에 의해 농도 의존적으로 하향 조절되었다(도 5l). 대조적으로 다른 GFPT 저해제인 아자세린(azaserine)은 상기 분자가 혈뇌장벽(BBB)을 통과하지 못해 L/M에 아무런 영향을 미치지 않았고 O-GlcNAc화 및 PKA/CREB 신호전달 경로에도 영향을 미치지 않았다(도 5m 및 5n).Since HBP pathway activation by GlcN induces recovery of SD-induced memory deficits, we investigated whether pharmacological inhibition of HBP affects memory function. As a result, in the zebrafish administered intraperitoneally with the GFPT inhibitor diazo-5-oxonorneucine (DON), L/M was concentration-dependently damaged (FIG. 5K ). At the same time, learning-induced O-GlcNAcization, OGT, and PKA/CREB activation were down-regulated in a concentration-dependent manner by DON (FIG. 5L ). In contrast, the other GFPT inhibitor, azaserine, did not affect the L/M because the molecule did not cross the blood brain barrier (BBB) and did not affect the O-GlcNAc and PKA/CREB signaling pathways ( 5m and 5n).

실험예 6: OGA 억제제 투여에 따른 L/M 손상 회복Experimental Example 6: Recovery of L/M damage following administration of OGA inhibitor

본 발명자들은 OGA 억제제 투여에 따른 SD 제브라피쉬에서 L/M 손상의 회복 여부를 조사하였다. 구체적으로 제브라피쉬에 OGT 억제제인 알록산(alloxan, Sigma-Aldrich) 또는 OSMI-1(Sigma-Aldrich, USA)를 복강 내 주입하고, L/M을 조사하였다. 그 결과 알록산이 아닌 OSMI-1는 농도의존적으로 L/M(도 6a 및 6b), 학습 유도 O-GlcNAc화 및 PKA/CREB 신호 활성화의 감소를 유도하였다(도 6c). L/M에 대한 알록산 효과의 결핍은 알록산이 BBB를 통과하지 못하는 것과 관련이 있는 것으로 추정된다. 이어, 본 발명자들은 OGA 억제제인 PugNAc 및 Thiamet G가 SD-유도 L/M 손상에 미치는 영향을 조사하였다. PugNAc는 L/M 또는 PKA/CREB 신호전달의 SD 유발 결함에는 영향을 미치지 않았으며, 이 역시 PugNAc가 BBB를 통과하지 못했기 때문인 것으로 사료된다(도 6f 및 6g). 그러나, Thiamet G는 제브라피쉬 뇌에서의 C/EBPβ, C/EBPδ 및 O-GlcNAcylation, OGT, p-CREB, c-fos 및 PKAcα의 학습 유도된 활성화에서의 SD 매개 결함(도 6e) 뿐만 아니라 학습, 단기 및 장기기억 손상도 회복시켰다(도 6f), 한편, GlcN은 처리된 제브라피쉬의 두뇌에서 L/M의 DON-매개 결함을 회복시키고 GlcNAcylation, OGT, p-CREB, c-fos 및 PKAcα 수준을 자극하였다(도 6h 및 6i).The present inventors investigated whether recovery of L/M damage in SD zebrafish following OGA inhibitor administration. Specifically, zebrafish was injected intraperitoneally with an OGT inhibitor, alloxan (Sigma-Aldrich) or OSMI-1 (Sigma-Aldrich, USA), and L/M was examined. As a result, OSMI-1 other than alloxane induced concentration-dependent L/M (FIGS. 6A and 6B), learning-induced O-GlcNAcization, and reduction of PKA/CREB signal activation (FIG. 6C). It is presumed that the deficiency of the alloxic effect on L/M is related to the inability of alloxane to pass the BBB. Subsequently, the present inventors investigated the effects of OGA inhibitors PugNAc and Thiamet G on SD-induced L/M damage. PugNAc did not affect SD-induced defects in L/M or PKA/CREB signaling, and this is also believed to be because PugNAc did not pass BBB (FIGS. 6F and 6G ). However, Thiamet G learns not only SD-mediated defects in learning-induced activation of C/EBPβ, C/EBPδ and O-GlcNAcylation, OGT, p-CREB, c-fos and PKAcα in zebrafish brains (Figure 6E), but also learning , Short-term and long-term memory damage was also restored (FIG. 6f ), while GlcN restored DON-mediated defects of L/M in the brain of treated zebrafish and GlcNAcylation, OGT, p-CREB, c-fos and PKAcα levels. Was stimulated (FIGS. 6H and 6I ).

아울러 본 발명자들은 HBP/O-GlcNAc화에 관여하는 유전자뿐만 아니라 특이적 억제제 또는 GlcN으로 시냅스 가소성을 조절하는 유전자들에 대한 HBP의 효과를 조사하였다. 그 결과 DON 또는 OSMI-1에 의한 HBP의 억제는 HBP 효소의 mRNA를 하향 조절하는 SD 유사 효과를 나타내었지만, GlcN은 HBP 효소의 전사수준을 상향 조절했다(도 6j). OGA mRNA는 Thiamet G에 의해 억제되었고 DON과 OSMI-1는 Arc, Homer1, GHRH, egr1 및 c-fos의 발현을 향상시켰으며 24시간에 NMDA, ubH1, ubH5, NGRN 및 BDNF mRNA 수준을 억제하였다(도 6k). 또한 DON과 OSMI-1의 상기 효과는 24시간 SD에서의 유전자 발현 변화와 거의 일치하였고 GlcN은 이러한 유전자의 SD-유도 감소를 기본 수준으로 회복시켰다(도 6l).In addition, the present inventors investigated the effect of HBP on genes involved in HBP/O-GlcNAcization, as well as genes that regulate synaptic plasticity with specific inhibitors or GlcN. As a result, inhibition of HBP by DON or OSMI-1 showed an SD-like effect of down-regulating the mRNA of the HBP enzyme, but GlcN up-regulated the transcription level of the HBP enzyme (Fig. 6j). OGA mRNA was inhibited by Thiamet G, DON and OSMI-1 improved the expression of Arc, Homer1, GHRH, egr1 and c-fos and inhibited NMDA, ubH1, ubH5, NGRN and BDNF mRNA levels at 24 hours ( Fig. 6k). In addition, the effects of DON and OSMI-1 were almost identical to the changes in gene expression in SD at 24 hours, and GlcN restored SD-induced reduction of these genes to a basic level (FIG. 6L ).

실험예 7: 베타-아밀로이드 및 p-타우의 축적Experimental Example 7: Accumulation of beta-amyloid and p-tau

반복된 SD는 베타-아밀로이드 및 인산화 타우(p-Tau)의 축적을 증가시키고 제브라피쉬의 뇌에서 성상세포(astrocyte)의 아교세포 증가증(gliosis)을 유도한다. 최근 SD는 β-아밀로이드(Aβ)와 p-Tau 단백질의 응집과 관련하여 알츠하이머 병(AD)과 관련이 있는 것으로 보고되고 있다. 따라서 본 발명자들은 SD에 의한 아밀로이드 플라크(amyloid plaque)의 변화를 조사하기 위해, 티오플라빈(thioflavin) S 및 Aβ 및 p-Tau에 대한 항체를 사용하여 제브라피쉬의 뇌에서 종양 영역의 복부(Vd) 및 지느러미(DI)를 면역염색하였다(도 7a). 제브라피쉬 단일 SD 실험군은 72시간(3일) 동안 SD를 처리 후(1X SD) 실험에 이용하였고 반복 SD 실험군은 72시간(3일) 동안 SD를 처리 후 6일 동안 정상 회복기간을 적용하였으며 이를 4번 반복한 후(4X SD) 실험에 이용하였다(도 7b).Repeated SD increases the accumulation of beta-amyloid and phosphorylated tau (p-Tau) and induces gliosis of astrocytes in the zebrafish brain. SD has recently been reported to be associated with Alzheimer's disease (AD) in relation to aggregation of β-amyloid (Aβ) and p-Tau proteins. Therefore, the present inventors used antibodies against thioflavin S and Aβ and p-Tau to investigate changes in amyloid plaques caused by SD. ) And fins (DI) were immunostained (FIG. 7A ). The zebrafish single SD group used SD for 72 hours (3 days) (1X SD), and the repeated SD group treated SD for 72 hours (3 days) and applied a normal recovery period for 6 days. After repeated 4 times (4X SD) was used for the experiment (Fig. 7b).

한 차례 수면박탈을 실시한 실험군에서 티오플라빈 S, Aβ 및 p-Tau 면역형광에는 유의한 변화가 없었다. 그러나 반복된 SD 실험군에서 종뇌(telencephalon) 부위의 등쪽 측면 지역(Dl)에서 면역형광성이 유의하게 증가하였고, 상기 증가는 GlcN 처리에 의해 억제되었다(도 7c 내지 7e).There was no significant change in thioflavin S, Aβ and p-Tau immunofluorescence in the experimental group with one sleep deprivation. However, in the repeated SD experiment group, immunofluorescence was significantly increased in the dorsal lateral region (Dl) of the telencephalon region, and the increase was suppressed by GlcN treatment (FIGS. 7C to 7E ).

또한 본 발명자들은 대조군과 반복 SD 실험군에서 학습-유도 O-GlcNAc 변화 및 p-Tau/Aβ 침착(deposition) 사이의 상관관계를 조사하였다. GlcN 처리된 SD 실험군에서 O-GlcNAc는 학습 후 증가되었으나 대조군의 경우보다 낮은 반면, 반복된 SD 실험군에서는 학습훈련에 의해 O-GlcNAc의 증가가 관찰되지 않았다. 이 때 O-GlcNAc는 주로 세포질에서 관찰되었으나 Aβ는 핵에서 주로 염색되었고 일부 p-Tau는 O-GlcNAc와 함께 세포질에서 공-염색되었다(도 7f 및 7g).In addition, the present inventors investigated the correlation between learning-induced O-GlcNAc change and p-Tau/Aβ deposition in the control and repeated SD experiment groups. In the GlcN-treated SD experimental group, O-GlcNAc increased after learning, but lower than in the control group, whereas in the repeated SD experimental group, no increase in O-GlcNAc was observed by learning training. At this time, O-GlcNAc was mainly observed in the cytoplasm, but Aβ was mainly stained in the nucleus and some p-Tau was co-stained in the cytoplasm with O-GlcNAc (FIGS. 7F and 7G ).

아울러, 아밀로이드 플라크는 AD의 초기 단계에서 반응성 성상 세포로 둘러싸여 있으며, 섬유소 GFAP 발현은 플라크 부하와 관련이 있다. 성상 세포 활성화에 대한 GlcN의 유무에 따른 SD의 효과를 평가하기 위해, 본 발명자들은 제브라피쉬 두뇌에서 S100β와 GFAP의 발현을 검사하였다. 그 결과, 단일 수면박탈을 시행한 실험군(1X SD)에서는 GFAP 및 S100β 수준의 유의한 변화는 없었으나 반복 SD 실험군에서는 제브라피쉬 뇌의 Vd 및 Dl에서의 GFAP 및 S100β 면역반응 세포의 수가 유의하게 증가하였고, 이는 GlcN 사전 처리(preincubation)에 의해 현저하게 억제되었다(도 7h 및 7i).In addition, amyloid plaques are surrounded by reactive astrocytes in the early stages of AD, and fibrin GFAP expression is associated with plaque load. To evaluate the effect of SD with or without GlcN on astrocyte activation, the inventors examined the expression of S100β and GFAP in the zebrafish brain. As a result, there was no significant change in the level of GFAP and S100β in the experimental group (1X SD) that performed single sleep deprivation, but the number of GFAP and S100β immune-reactive cells in Vd and Dl of the zebrafish brain was significantly increased in the repeated SD experiment group. And was significantly inhibited by GlcN preincubation (FIGS. 7H and 7I ).

결론적으로 본 발명의 수면장애에 의해 유발되는 학습 및 기억 장애 치료용 약학적 조성물은 뇌신경 스트레스 저해효과 및 신경세포 보호능력이 우수하여, 인지기능 또는 기억능력 예방, 개선 또는 치료에 이용될 수 있음을 확인함으로써, 학습/기억(L/M) 과정에서 HBP의 역할을 강조하고 알츠하이머 병의 인지결핍(cognitive defects)에 대한 잠재적 치료 후보물질로 활용가능하다. In conclusion, the pharmaceutical composition for the treatment of learning and memory disorders caused by sleep disorders of the present invention has excellent brain nerve stress inhibitory effect and nerve cell protection ability, and thus can be used to prevent, improve or treat cognitive function or memory ability. By confirming, it highlights the role of HBP in the learning/memory (L/M) process and can be used as a potential treatment candidate for cognitive defects in Alzheimer's disease.

본 발명은 상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예 및 실험예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.The present invention has been described with reference to the above-described Examples and Experimental Examples, but these are merely exemplary, and various modifications and equivalent other Examples and Experimental Examples are possible from those skilled in the art. Will understand. Therefore, the true technical protection scope of the present invention should be determined by the technical spirit of the appended claims.

<110> INHA-INDUSTRY PARTNERSHIP INSTITUTE <120> Pharmaceutical composition for treating learning and memory disorder induced by sleep disturbance <130> PD18-5684 <160> 86 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NMDA F <400> 1 tatctggcat tggtgagtgc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NMDA R <400> 2 cagactggtt cccacatagc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Arc F <400> 3 acaaacaagc cttcgagttc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Arc R <400> 4 tccttcttct tggagactgc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ubH1 F <400> 5 tagtaacgaa agcacggaca 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ubH1 R <400> 6 tctgctttca tctccactga 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ubH5 F <400> 7 tgatgctaaa tcaacggcta 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ubH5 R <400> 8 gagctgatac ttggcgatct 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NRGN F <400> 9 atggactgtc gaaacgaagg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NRGN R <400> 10 accagcttga atcttagcgg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homer1 F <400> 11 cttggatgga tcgaaggcaa 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homer1 R <400> 12 ggctattctg gctgcttctt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GHRH F <400> 13 cttgctagtg ctatgctgct 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GHRH R <400> 14 agctgttggt aaagatggca 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> egr1 F <400> 15 tcttcctctt ccacgtcttc 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> egr1 R <400> 16 tctggatggg tttctgatct 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-fos F <400> 17 ctgagtgtct caagtgcctc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-fos R <400> 18 tggaggtctt tgctccagta 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BDNF F <400> 19 gacactttcg agcaggtcat 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BDNF R <400> 20 gcatacaggt caacgtcctt 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> per-2 F <400> 21 tgtttcagga tgtggatgag 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> per-2 R <400> 22 aggagtctgt ggatctgctc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bmal-1 F <400> 23 gctccacgag agagactcat 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bmal-1 R <400> 24 tattcagtgg gtttgacacg 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HK-1 F <400> 25 cgggaaatgg agaacggatt 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HK-1 R <400> 26 gtccatgtca gcaaaacagc 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HK-2 F <400> 27 accaattttc gggttctgct 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HK-2 R <400> 28 acaggctcac gacatctttc 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GK F <400> 29 aggctgcaat gcgtgttata 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GK R <400> 30 gatctgcttt ctgtcccctg 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TK-alpha F <400> 31 tggtgtgcca gagtaaagaa 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TK-alpha R <400> 32 agattttcag caggtcgttc 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PYGB F <400> 33 cccaaagagg ataaacatgg 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PYGB R <400> 34 tgacctggat gtcaaagatg 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLUT1 F <400> 35 taacgctcca cagaagatca 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLUT1 R <400> 36 gggcaatttc tccaacatac 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLUT3 F <400> 37 gctcctcctt cgagatgata 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLUT3 R <400> 38 cttccccaca tcctcataac 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PFKP-alpha F <400> 39 tatctggcat tggtgagtgc 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PFKP-alpha R <400> 40 cagactggtt cccacatagc 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PFKP-beta F <400> 41 aggaacaaaa cgaaccctcc 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PFKP-beta R <400> 42 cggttgccag atatccacaa 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PFKL-alpha F <400> 43 attcccatgt gcatcatccc 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PFKL-alpha R <400> 44 gtgctcatga cacttctcgt 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PFKL-beta F <400> 45 agagcatcgt ggacaacatc 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PFKL-beta R <400> 46 cctcatagat gtacaccgcg 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G6PDH F <400> 47 actgaggagc aaatctaccg 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G6PDH R <400> 48 tcaatgcact tcagcacttt 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PKM-alpha F <400> 49 tgcagtctca gagaaggaca 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PKM-alpha R <400> 50 ccttgttgca acgaccaatc 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFPT-1 F <400> 51 ctgggaaagc aactccaagt 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFPT-1 R <400> 52 acttcaccag cttagcgatg 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFPT-2 F <400> 53 gttgctgtag tgatggaggg 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFPT-2 R <400> 54 tgcgatccag gaaatcactg 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OGT-1 F <400> 55 agccattgac acataccgtc 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OGT-1 R <400> 56 cttgaagctt tccttgctgc 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OGT-2 F <400> 57 gcattgtgct gaatggcatt 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OGT-2 R <400> 58 agagctggtt gaagttgcaa 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OGA F <400> 59 gcttgaggat gaggaaggtg 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OGA R <400> 60 agcaccatgt gagccattag 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin F <400> 61 gtgcccatct acgagggtta 20 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin R <400> 62 tctcagctgt ggtggtgaag 20 <210> 63 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRE F <400> 63 cagtcatttg ctacacatgg gcttgg 26 <210> 64 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRE R <400> 64 ccaagcccat gtgacgaaat gact 24 <210> 65 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCKD_45_27 <400> 65 Glu Arg Ser Lys Thr Val Thr Ser Phe Tyr Asn Gln Ser 1 5 10 <210> 66 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GYS2_1_13 <400> 66 Met Leu Arg Gly Arg Ser Leu Ser Val Thr Ser Leu Gly 1 5 10 <210> 67 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KCNB1_489_501 <400> 67 Lys Trp Thr Lys Arg Thr Leu Ser Glu Thr Ser Ser Ser 1 5 10 <210> 68 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KPB1_1011_1023 <400> 68 Gln Val Glu Phe Arg Arg Leu Ser Ile Ser Ala Glu Ser 1 5 10 <210> 69 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MYBB_513_525 <400> 69 Asp Asn Thr Pro His Thr Pro Thr Pro Phe Lys Asn Ala 1 5 10 <210> 70 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MYPC3_266_280 <400> 70 Leu Ser Ala Phe Arg Arg Thr Ser Leu Ala Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 71 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KIF2C_105_118_S106G <400> 71 Glu Gly Leu Arg Ser Arg Ser Thr Arg Met Ser Thr Val Ser 1 5 10 <210> 72 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RBL-2_410_422 <400> 72 Lys Glu Asn Ser Pro Cys Val Thr Pro Val Ser Thr Ala 1 5 10 <210> 73 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RBL-2_655_667 <400> 73 Gly Leu Gly Arg Ser Ile Thr Ser Pro Thr Thr Leu Tyr 1 5 10 <210> 74 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DHX30_241_262 <400> 74 Gln Phe Pro Leu Pro Lys Asn Leu Leu Ala Lys Val Ile Gln Ile Ala 1 5 10 15 Thr Ser Ser Ser Thr Ala 20 <210> 75 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NCOA2_866_888 <400> 75 Ser Gln Ser Thr Phe Asn Asn Pro Arg Pro Gly Gln Leu Gly Arg Leu 1 5 10 15 Leu Pro Asn Gln Asn Leu Pro 20 <210> 76 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NCOA3_MOUSE_1029_1051 <400> 76 His Gly Ser Gln Asn Arg Pro Leu Leu Arg Asn Ser Leu Asp Asp Leu 1 5 10 15 Leu Gly Pro Pro Ser Asn Ala 20 <210> 77 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NCOA6_1479_1501 <400> 77 Leu Val Ser Pro Ala Met Arg Glu Ala Pro Thr Ser Leu Ser Gln Leu 1 5 10 15 Leu Asp Asn Ser Gly Ala Arg 20 <210> 78 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NRIP1_121_143_P124R <400> 78 Asp Ser Val Arg Lys Gly Lys Gln Asp Ser Thr Leu Leu Ala Ser Leu 1 5 10 15 Leu Gln Ser Phe Ser Ser Arg 20 <210> 79 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MED1_591_614 <400> 79 His Gly Glu Asp Phe Ser Lys Val Ser Gln Asn Pro Ile Leu Thr Ser 1 5 10 15 Leu Leu Gln Ile Thr Gly Asn Gly 20 <210> 80 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NR0B2_9_31_C9S/C11S <400> 80 Ser Pro Ser Gln Gly Ala Ala Ser Arg Pro Ala Ile Leu Tyr Ala Leu 1 5 10 15 Leu Ser Ser Ser Leu Lys Ala 20 <210> 81 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BRD8_254_276 <400> 81 Thr Val Ala Ala Ser Pro Ala Ala Ser Gly Ala Pro Thr Leu Ser Arg 1 5 10 15 Leu Leu Glu Ala Gly Pro Thr 20 <210> 82 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NRIP1_8_30 <400> 82 Gly Ser Asp Val His Gln Asp Ser Ile Val Leu Thr Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Leu Leu Met His Gln Ala Ala 20 <210> 83 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NRIP1_253_275_C263S <400> 83 Pro Ala Thr Ser Pro Lys Pro Ser Val Ala Ser Ser Gln Leu Ala Leu 1 5 10 15 Leu Leu Ser Ser Glu Ala His 20 <210> 84 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PRGR_42_64_C64S <400> 84 Ser Asp Thr Leu Pro Glu Val Ser Ala Ile Pro Ile Ser Leu Asp Gly 1 5 10 15 Leu Leu Phe Pro Arg Pro Ser 20 <210> 85 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCOR_40_62 <400> 85 Thr Thr Ser Pro Thr Ala Ala Thr Thr Gln Asn Pro Val Leu Ser Lys 1 5 10 15 Leu Leu Met Ala Asp Gln Asp 20 <210> 86 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> WIPI1_313_335_C318S <400> 86 Gly Gln Arg Asn Ile Ser Thr Leu Ser Thr Ile Gln Lys Leu Pro Arg 1 5 10 15 Leu Leu Val Ala Ser Ser Ser 20 <110> INHA-INDUSTRY PARTNERSHIP INSTITUTE <120> Pharmaceutical composition for treating learning and memory disorder induced by sleep disturbance <130> PD18-5684 <160> 86 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NMDA F <400> 1 tatctggcat tggtgagtgc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NMDA R <400> 2 cagactggtt cccacatagc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Arc F <400> 3 acaaacaagc cttcgagttc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Arc R <400> 4 tccttcttct tggagactgc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ubH1 F <400> 5 tagtaacgaa agcacggaca 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ubH1 R <400> 6 tctgctttca tctccactga 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ubH5 F <400> 7 tgatgctaaa tcaacggcta 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ubH5 R <400> 8 gagctgatac ttggcgatct 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NRGN F <400> 9 atggactgtc gaaacgaagg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NRGN R <400> 10 accagcttga atcttagcgg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homer1 F <400> 11 cttggatgga tcgaaggcaa 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homer1 R <400> 12 ggctattctg gctgcttctt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GHRH F <400> 13 cttgctagtg ctatgctgct 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GHRH R <400> 14 agctgttggt aaagatggca 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> egr1 F <400> 15 tcttcctctt ccacgtcttc 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> egr1 R <400> 16 tctggatggg tttctgatct 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-fos F <400> 17 ctgagtgtct caagtgcctc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-fos R <400> 18 tggaggtctt tgctccagta 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BDNF F <400> 19 gacactttcg agcaggtcat 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BDNF R <400> 20 gcatacaggt caacgtcctt 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> per-2 F <400> 21 tgtttcagga tgtggatgag 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> per-2 R <400> 22 aggagtctgt ggatctgctc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bmal-1 F <400> 23 gctccacgag agagactcat 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bmal-1 R <400> 24 tattcagtgg gtttgacacg 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HK-1 F <400> 25 cgggaaatgg agaacggatt 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HK-1 R <400> 26 gtccatgtca gcaaaacagc 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HK-2 F <400> 27 accaattttc gggttctgct 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HK-2 R <400> 28 acaggctcac gacatctttc 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GK F <400> 29 aggctgcaat gcgtgttata 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GK R <400> 30 gatctgcttt ctgtcccctg 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TK-alpha F <400> 31 tggtgtgcca gagtaaagaa 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TK-alpha R <400> 32 agattttcag caggtcgttc 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PYGB F <400> 33 cccaaagagg ataaacatgg 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PYGB R <400> 34 tgacctggat gtcaaagatg 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLUT1 F <400> 35 taacgctcca cagaagatca 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLUT1 R <400> 36 gggcaatttc tccaacatac 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLUT3 F <400> 37 gctcctcctt cgagatgata 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLUT3 R <400> 38 cttccccaca tcctcataac 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PFKP-alpha F <400> 39 tatctggcat tggtgagtgc 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PFKP-alpha R <400> 40 cagactggtt cccacatagc 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PFKP-beta F <400> 41 aggaacaaaa cgaaccctcc 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PFKP-beta R <400> 42 cggttgccag atatccacaa 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PFKL-alpha F <400> 43 attcccatgt gcatcatccc 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PFKL-alpha R <400> 44 gtgctcatga cacttctcgt 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PFKL-beta F <400> 45 agagcatcgt ggacaacatc 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PFKL-beta R <400> 46 cctcatagat gtacaccgcg 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G6PDH F <400> 47 actgaggagc aaatctaccg 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G6PDH R <400> 48 tcaatgcact tcagcacttt 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PKM-alpha F <400> 49 tgcagtctca gagaaggaca 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PKM-alpha R <400> 50 ccttgttgca acgaccaatc 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFPT-1 F <400> 51 ctgggaaagc aactccaagt 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFPT-1 R <400> 52 acttcaccag cttagcgatg 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFPT-2 F <400> 53 gttgctgtag tgatggaggg 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFPT-2 R <400> 54 tgcgatccag gaaatcactg 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OGT-1 F <400> 55 agccattgac acataccgtc 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OGT-1 R <400> 56 cttgaagctt tccttgctgc 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OGT-2 F <400> 57 gcattgtgct gaatggcatt 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OGT-2 R <400> 58 agagctggtt gaagttgcaa 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OGA F <400> 59 gcttgaggat gaggaaggtg 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OGA R <400> 60 agcaccatgt gagccattag 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin F <400> 61 gtgcccatct acgagggtta 20 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin R <400> 62 tctcagctgt ggtggtgaag 20 <210> 63 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRE F <400> 63 cagtcatttg ctacacatgg gcttgg 26 <210> 64 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRE R <400> 64 ccaagcccat gtgacgaaat gact 24 <210> 65 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCKD_45_27 <400> 65 Glu Arg Ser Lys Thr Val Thr Ser Phe Tyr Asn Gln Ser 1 5 10 <210> 66 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GYS2_1_13 <400> 66 Met Leu Arg Gly Arg Ser Leu Ser Val Thr Ser Leu Gly 1 5 10 <210> 67 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KCNB1_489_501 <400> 67 Lys Trp Thr Lys Arg Thr Leu Ser Glu Thr Ser Ser Ser 1 5 10 <210> 68 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KPB1_1011_1023 <400> 68 Gln Val Glu Phe Arg Arg Leu Ser Ile Ser Ala Glu Ser 1 5 10 <210> 69 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MYBB_513_525 <400> 69 Asp Asn Thr Pro His Thr Pro Thr Pro Phe Lys Asn Ala 1 5 10 <210> 70 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MYPC3_266_280 <400> 70 Leu Ser Ala Phe Arg Arg Thr Ser Leu Ala Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 71 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KIF2C_105_118_S106G <400> 71 Glu Gly Leu Arg Ser Arg Ser Thr Arg Met Ser Thr Val Ser 1 5 10 <210> 72 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RBL-2_410_422 <400> 72 Lys Glu Asn Ser Pro Cys Val Thr Pro Val Ser Thr Ala 1 5 10 <210> 73 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RBL-2_655_667 <400> 73 Gly Leu Gly Arg Ser Ile Thr Ser Pro Thr Thr Leu Tyr 1 5 10 <210> 74 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DHX30_241_262 <400> 74 Gln Phe Pro Leu Pro Lys Asn Leu Leu Ala Lys Val Ile Gln Ile Ala 1 5 10 15 Thr Ser Ser Ser Thr Ala 20 <210> 75 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NCOA2_866_888 <400> 75 Ser Gln Ser Thr Phe Asn Asn Pro Arg Pro Gly Gln Leu Gly Arg Leu 1 5 10 15 Leu Pro Asn Gln Asn Leu Pro 20 <210> 76 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NCOA3_MOUSE_1029_1051 <400> 76 His Gly Ser Gln Asn Arg Pro Leu Leu Arg Asn Ser Leu Asp Asp Leu 1 5 10 15 Leu Gly Pro Pro Ser Asn Ala 20 <210> 77 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NCOA6_1479_1501 <400> 77 Leu Val Ser Pro Ala Met Arg Glu Ala Pro Thr Ser Leu Ser Gln Leu 1 5 10 15 Leu Asp Asn Ser Gly Ala Arg 20 <210> 78 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NRIP1_121_143_P124R <400> 78 Asp Ser Val Arg Lys Gly Lys Gln Asp Ser Thr Leu Leu Ala Ser Leu 1 5 10 15 Leu Gln Ser Phe Ser Ser Arg 20 <210> 79 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MED1_591_614 <400> 79 His Gly Glu Asp Phe Ser Lys Val Ser Gln Asn Pro Ile Leu Thr Ser 1 5 10 15 Leu Leu Gln Ile Thr Gly Asn Gly 20 <210> 80 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NR0B2_9_31_C9S/C11S <400> 80 Ser Pro Ser Gln Gly Ala Ala Ser Arg Pro Ala Ile Leu Tyr Ala Leu 1 5 10 15 Leu Ser Ser Ser Leu Lys Ala 20 <210> 81 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BRD8_254_276 <400> 81 Thr Val Ala Ala Ser Pro Ala Ala Ser Gly Ala Pro Thr Leu Ser Arg 1 5 10 15 Leu Leu Glu Ala Gly Pro Thr 20 <210> 82 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NRIP1_8_30 <400> 82 Gly Ser Asp Val His Gln Asp Ser Ile Val Leu Thr Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Leu Leu Met His Gln Ala Ala 20 <210> 83 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NRIP1_253_275_C263S <400> 83 Pro Ala Thr Ser Pro Lys Pro Ser Val Ala Ser Ser Gln Leu Ala Leu 1 5 10 15 Leu Leu Ser Ser Glu Ala His 20 <210> 84 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PRGR_42_64_C64S <400> 84 Ser Asp Thr Leu Pro Glu Val Ser Ala Ile Pro Ile Ser Leu Asp Gly 1 5 10 15 Leu Leu Phe Pro Arg Pro Ser 20 <210> 85 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCOR_40_62 <400> 85 Thr Thr Ser Pro Thr Ala Ala Thr Thr Gln Asn Pro Val Leu Ser Lys 1 5 10 15 Leu Leu Met Ala Asp Gln Asp 20 <210> 86 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> WIPI1_313_335_C318S <400> 86 Gly Gln Arg Asn Ile Ser Thr Leu Ser Thr Ile Gln Lys Leu Pro Arg 1 5 10 15 Leu Leu Val Ala Ser Ser Ser 20

Claims (10)

UDP-GlcNAc, OGT(O-linked GlcNAc transferase) 및 O-GlcNAc화 기질을 포함하는 반응액에 피검 화합물 또는 조성물을 처리하는 단계;
상기 기질의 O-GlcNAc화 정도를 확인하는 단계; 및
피검 화합물 또는 조성물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 기질의 O-GlcNAc화를 유의하게 증가시킨 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는 수면장애에 의해 유발되는 학습 및 기억 장애 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
Treating the test compound or composition in a reaction solution comprising UDP-GlcNAc, OGT (O-linked GlcNAc transferase) and O-GlcNAc-forming substrate;
Confirming the degree of O-GlcNAcization of the substrate; And
Screening for candidates for treatment and learning disorders caused by sleep disorders comprising selecting a test compound or composition that significantly increased O-GlcNAc of the substrate compared to a control group not treated with the test compound or composition. Way.
제1항에 있어서,
상기 O-GlcNAc화 기질의 O-GlcNAc화 정도는 항-GlcNAc 항체를 이용한 면역학적 분석방법 또는 질량분석법에 의해 측정되는, 방법.
According to claim 1,
The degree of O-GlcNAcization of the O-GlcNAc-ized substrate is measured by an immunological analysis method or mass spectrometry using an anti-GlcNAc antibody.
제1항에 있어서,
상기 O-GlcNAc화 기질은 OGT에 의해 O-GlcNAc가 부가되는 단백질 또는 상기 단백질에서 O-GlcNAc화가 일어나는 부위를 포함하는 펩타이드인, 방법.
According to claim 1,
The O-GlcNAc-ized substrate is a protein containing O-GlcNAc by OGT or a peptide containing a site where O-GlcNAcization occurs in the protein.
제3항에 있어서,
상기 단백질은 CaMKII, PLN(phospholamban), STIM1(stromal interaction molecule 1), Complex I/III/IV, DRP1(dynamin-1-like protein), VDAC(voltage-dependent anion channel), FXR(farnesyl X receptor), BMAL1(brain and muscle ARNT-like 1), CLOCK(circadian locomotor output cycles kaput), CRTC2(CREB regulated transcription coactivator 2), FOXO1(forkhead box protein O1), PGC-1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha), IRS1(insulin receptor substrate 1), AKT(protein kinase B), ChREBP(carbohydrate-responsive element-binding protein), NFATc1(nuclear factor of activated T-cells, cytoplsmic 1), NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells), TAK1(mitogen-activated protein kinase kinase kinase 7), C/EBP-β(CCAAT/enhancer-binding protein beta ), PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma), IR-β(insulin receptor beta), Sp1(Sp1 transcription factor), RUNX2(Runt-related transcription factor 2), MEF2D(monocyte-specific enhancer factor 2D), CREB(cAMP response element binding protein), Milton, α-synuclein, tau, KCNQ3(potassium voltage-gated channel subfamily Q member 3), GluA2(glutamate transport ATP-bidning protein), periaxin(PRX), c-Myc, FOXM1(forkhead box protein M1), G6PD(glucose-6-phosphate dehyrogenase), PFK1m(phophofructokinase-1), TET1(Tet methylcytosine dioxygenase), OCT4(octamer-binding transcription factor 4), SOX2(sex determining region Y-Box 2), BCKD(Branched chain ketoacid dehydrogenase), GYS2(glycogen synthase 2), KCNB1(potassium voltage-gated channel subfamily B), KPB1(Phosphorylase b kinase regulatory subunit), MYBB(Myb-like protein B), MYPC3(Myosin Binding Protein C), KIF2C(Kinesin Family Member 2C), RBL-2(RB Transcriptional Corepressor Like 2), DHX30(DExH-Box Helicase 30), NCOA2(Nuclear Receptor Coactivator 2), NCOA3(Nuclear Receptor Coactivator 3), NCOA6(Nuclear Receptor Coactivator 6), NRIP1(Nuclear Receptor Interacting Protein 1), MED1(Mediator Complex Subunit 1), NR0B2(Nuclear Receptor Subfamily 0 Group B Member 2), BRD8(Bromodomain Containing 8), NRIP1(Nuclear Receptor Interacting Protein 1), PRGR(progesterone receptor), LCOR(Ligand-dependent corepressor), WIPI1(WD repeat domain phosphoinositide-interacting protein 1), RRP1B(Ribosomal RNA Processing 1B), CDKN2AIP(CDKN2A Interacting Protein), VIM(Vimentins), TPR(Translocated Promoter Region), SPTBN1(Spectrin Beta, Non-Erythrocytic 1), RANBP2(RAN Binding Protein 2), HIST1H3A(Histone Cluster 1 H3 Family Member A), KRT8(keratin-8), NUMA1(Nuclear Mitotic Apparatus Protein 1), PHB(PHB), EMSY(BRCA2 Interacting Transcriptional Repressor), CRTC2(CREB Regulated Transcription Coactivator 2), NUP214(Nucleoporin 214), CAMK4(Calcium/Calmodulin Dependent Protein Kinase IV), BPTF(Bromodomain PHD Finger Transcription Factor), HCFC1(VP16-accessory protein HCF), KRT18(Keratin 18), POM121(POM121 Transmembrane Nucleoporin), RBM14(RNA Binding Motif Protein 14), ATXN2L(Ataxin 2 Like), SNCA(alpha-synuclein), IKBKB(Inhibitor Of Nuclear Factor Kappa B Kinase Subunit Beta), Esr1( Estrogen Receptor 1), Sptbn1(Spectrin Beta, Non-Erythrocytic 1), Ablim1(Actin Binding LIM Protein 1), Skt(KIAA1217), Nos3(Nitric Oxide Synthase 3), Lbr(Lamin B Receptor), Mapt(microtubule-associated protein tau), Prkcb(Protein Kinase C Beta), Prkcd(Protein Kinase C Delta), Prkce(Protein Kinase C Epsilon), Prkcg(Protein Kinase C Gamma), GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), 또는 WIPI1(WD repeat domain phosphoinositide-interacting protein 1)인, 방법.
According to claim 3,
The protein is CaMKII, phospholamban (PLN), stromal interaction molecule 1 (STIM1), Complex I/III/IV, dynamin-1-like protein (DRP1), voltage-dependent anion channel (VDAC), farnesyl X receptor (FXR) , BMAL1 (brain and muscle ARNT-like 1), CLOCK (circadian locomotor output cycles kaput), CRTC2 (CREB regulated transcription coactivator 2), FOXO1 (forkhead box protein O1), PGC-1α (peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1 -alpha), IRS1 (insulin receptor substrate 1), AKT (protein kinase B), ChREBP (carbohydrate-responsive element-binding protein), NFATc1 (nuclear factor of activated T-cells, cytoplsmic 1), NF-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells), TAK1 (mitogen-activated protein kinase kinase kinase 7), C/EBP-β (CCAAT/enhancer-binding protein beta), PPARγ (peroxisome proliferator-activated receptor gamma), IR-β (insulin receptor beta), Sp1 (Sp1 transcription factor), RUNX2 (Runt-related transcription factor 2), MEF2D (monocyte-specific enhancer factor 2D), CREB (cAMP r esponse element binding protein), Milton, α-synuclein, tau, potassium voltage-gated channel subfamily Q member 3 (KCNQ3), glutamate transport ATP-bidning protein (GluA2), periaxin (PRX), c-Myc, FOXM1 (forkhead box) protein M1), G6PD (glucose-6-phosphate dehyrogenase), PFK1m (phophofructokinase-1), TET1 (Tet methylcytosine dioxygenase), OCT4 (octamer-binding transcription factor 4), SOX2 (sex determining region Y-Box 2), BCKD (Branched chain ketoacid dehydrogenase), GYS2 (glycogen synthase 2), KCNB1 (potassium voltage-gated channel subfamily B), KPB1 (Phosphorylase b kinase regulatory subunit), MYBB (Myb-like protein B), MYPC3 (Myosin Binding Protein C) , KIF2C(Kinesin Family Member 2C), RBL-2(RB Transcriptional Corepressor Like 2), DHX30(DExH-Box Helicase 30), NCOA2(Nuclear Receptor Coactivator 2), NCOA3(Nuclear Receptor Coactivator 3), NCOA6(Nuclear Receptor Coactivator 6), NRIP1 (Nuclear Receptor Interacting Protein 1), MED1 (Mediator Complex Subunit 1), NR0B2 (Nuclear Receptor Subfamily 0 Group B Membe r 2), BRD8 (Bromodomain Containing 8), NRIP1 (Nuclear Receptor Interacting Protein 1), PRGR (progesterone receptor), LCOR (Ligand-dependent corepressor), WIPI1 (WD repeat domain phosphoinositide-interacting protein 1), RRP1B (Ribosomal RNA Processing 1B), CDKN2A Interaction Protein (CDKN2AIP), Vimentins (VIM), Translocated Promoter Region (TPR), Spectrin Beta, Non-Erythrocytic 1 (SPTBN1), RANBP2 (RAN Binding Protein 2), HIST1H3A (Histone Cluster 1 H3 Family Member) A), KRT8 (keratin-8), NUMA1 (Nuclear Mitotic Apparatus Protein 1), PHB (PHB), EMSY (BRCA2 Interacting Transcriptional Repressor), CRTC2 (CREB Regulated Transcription Coactivator 2), NUP214 (Nucleoporin 214), CAMK4 (Calcium) /Calmodulin Dependent Protein Kinase IV), BPTF (Bromodomain PHD Finger Transcription Factor), HCFC1 (VP16-accessory protein HCF), KRT18 (Keratin 18), POM121 (POM121 Transmembrane Nucleoporin), RBM14 (RNA Binding Motif Protein 14), ATXN2L( Ataxin 2 Like), SNCA (alpha-synuclein), IKBKB (Inhibitor Of Nuclear Factor Kappa B Kinase Subunit Beta), Esr1 (Estrogen Receptor 1), Sptbn1 (Spectrin Beta, Non-Erythrocytic 1), Ablim1 (Actin Binding LIM Protein 1), Skt (KIAA1217), Nos3 (Nitric Oxide Synthase 3), Lbr (Lamin B Receptor), Mapt (microtubule-associated protein tau), Prkcb (Protein Kinase C Beta), Prkcd (Protein Kinase C Delta), Prkce (Protein Kinase C Epsilon), Prkcg (Protein Kinase C Gamma), GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) , Or WIPI1 (WD repeat domain phosphoinositide-interacting protein 1).
제3항에 있어서,
상기 펩타이드는 BCKD_45_27(ERSKTVTSFYNQS, 서열번호 65), GYS2_1_13(MLRGRSLSVTSLG, 서열번호 66), KCNB1_489_501(KWTKRTLSETSSS, 서열번호 67), KPB1_1011_1023(QVEFRRLSISAES, 서열번호 68), MYBB_513_525(DNTPHTPTPFKNA, 서열번호 69), MYPC3_266_280(LSAFRRTSLAGGG, 서열번호 70), KIF2C_105_118_S106G(EGLRSRSTRMSTVS, 서열번호 71), RBL-2_410_422(KENSPCVTPVSTA, 서열번호 72), RBL-2_655_667(GLGRSITSPTTLY, 서열번호 73), DHX30_241_262(QFPLPKNLLAKVIQIATSSSTA, 서열번호 74), NCOA2_866_888(SQSTFNNPRPGQLGRLLPNQNLP, 서열번호 75), NCOA3_MOUSE_1029_1051(HGSQNRPLLRNSLDDLLGPPSNA, 서열번호 76), NCOA6_1479_1501(LVSPAMREAPTSLSQLLDNSGAR, 서열번호 77), NRIP1_121_143_P124R(DSVRKGKQDSTLLASLLQSFSSR, 서열번호 78), MED1_591_614(HGEDFSKVSQNPILTSLLQITGNG, 서열번호 79), NR0B2_9_31_C9S/C11S(SPSQGAASRPAILYALLSSSLKA, 서열번호 80), BRD8_254_276(TVAASPAASGAPTLSRLLEAGPT, 서열번호 81), NRIP1_8_30(GSDVHQDSIVLTYLEGLLMHQAA, 서열번호 82), NRIP1_253_275_C263S(PATSPKPSVASSQLALLLSSEAH, 서열번호 83), PRGR_42_64_C64S(SDTLPEVSAIPISLDGLLFPRPS, 서열번호 84), LCOR_40_62(TTSPTAATTQNPVLSKLLMADQD, 서열번호 85) 또는 WIPI1_313_335_C318S(GQRNISTLSTIQKLPRLLVASSS, 서열번호 86)인, 방법.
According to claim 3,
The peptides are BCKD_45_27 (ERSKTVTSFYNQS, SEQ ID NO: 65), GYS2_1_13 (MLRGRSLSVTSLG, SEQ ID NO: 66), KCNB1_489_501 (KWTKRTLSETSSS, SEQ ID NO: 67), KPB1_1011_1023 (QVEFRRLSISAES, SEQ ID NO: 68), MYDN_513 LSAFRRTSLAGGG, SEQ ID NO: 70), KIF2C_105_118_S106G (EGLRSRSTRMSTVS, SEQ ID NO: 71), RBL-2_410_422 (KENSPCVTPVSTA, SEQ ID NO: 72), RBL-2_655_667 (GLGRSITSPTTLY, SEQ ID NO: 73), DHX30_241_262 (QFPLPKSQNQLA , SEQ ID NO: 75), NCOA3_MOUSE_1029_1051 (HGSQNRPLLRNSLDDLLGPPSNA, SEQ ID NO: 76), NCOA6_1479_1501 (LVSPAMREAPTSLSQLLDNSGAR, SEQ ID NO: 77), NRIP1_121_143_P124R (DSVRKGKQDSTLLASLLQSFSSR, SEQ ID NO: 78), MED1_591_614 (HGEDFSKVSQNPILTSLLQITGNG, SEQ ID NO: 79), NR0B2_9_31_C9S / C11S (SPSQGAASRPAILYALLSSSLKA, SEQ ID NO: 80), BRD8_254_276 (TVAASPAASGAPTLSRLLEAGPT, SEQ ID NO: 81), NRIP1_8_30 (GSDVHQDSIVLTYLEGLLMHQAA, SEQ ID NO: 82), NRIP1_253_275_C263S (PATSPKPSVASSQLALLLSSEAH, SEQ ID NO: 83), PRGR_42_64_C64S (SDTLPEVSAIPISLDGLLFPRPS, SEQ ID NO: 84), LCOR_40_62 (TTSPTAATTQNPVLSKLLMADQD, SEQ ID NO: 85) or WIPI1_313_335_C318S ( GQRNISTL STIQKLPRLLVASSS, SEQ ID NO: 86).
실험동물에 대하여 수면박탈을 수행하는 단계;
상기 수면박탈이 되기 전, 동시에 또는 후에 실험동물에 피검 화합물 또는 조성물을 투여하는 단계; 및
상기 실험동물의 뇌에서의 OGT 발현 또는 활성을 증가시킨 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는, 수면장애에 의해 유발되는 학습 및 기억 장애 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
Performing sleep deprivation on the experimental animal;
Administering a test compound or composition to the test animal before, simultaneously or after the sleep deprivation; And
A method for screening candidates for learning and memory disorder therapeutic agents caused by sleep disorders, comprising selecting a test compound or composition that has increased OGT expression or activity in the brain of the experimental animal.
제6항에 있어서,
상기 실험동물은 마우스, 랫트, 개, 돼지, 기니피크, 햄스터, 또는 제브라피쉬인, 방법.
The method of claim 6,
The experimental animal is a mouse, rat, dog, pig, guinea-peak, hamster, or zebrafish.
제6항에 있어서,
상기 뇌는 종뇌(telencephalon)인, 방법.
The method of claim 6,
The method, wherein the brain is a teleencephalon.
삭제delete 삭제delete
KR1020180150549A 2018-11-29 2018-11-29 Pharmaceutical composition for treating learning and memory disorder induced by sleep disturbance KR102129007B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180150549A KR102129007B1 (en) 2018-11-29 2018-11-29 Pharmaceutical composition for treating learning and memory disorder induced by sleep disturbance

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180150549A KR102129007B1 (en) 2018-11-29 2018-11-29 Pharmaceutical composition for treating learning and memory disorder induced by sleep disturbance

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200064430A KR20200064430A (en) 2020-06-08
KR102129007B1 true KR102129007B1 (en) 2020-07-02

Family

ID=71089581

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180150549A KR102129007B1 (en) 2018-11-29 2018-11-29 Pharmaceutical composition for treating learning and memory disorder induced by sleep disturbance

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102129007B1 (en)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230004979A (en) 2021-06-30 2023-01-09 (주)비엠에스 Granular fluid media and a method of manufacturing the same
CN116421605A (en) * 2022-01-04 2023-07-14 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心 Use of ISX-9 in the treatment of circadian amplitude decline and sleep disorders associated with aging
CN114807224B (en) * 2022-04-25 2023-09-29 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 Construction method and application of visual zebra fish bile acid metabolism model

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Dong Woo Kang et al., 'Role of Sleep Disturbance in the Trajectory of Alzheimer's Disease', Clinical Psychopharmacology and Neuroscience, 2017, Vol. 15, pp 89-99. 1부.*
Jie Shi et al., 'Activity Based High-Throughput Screening for Novel O-GlcNAc Transferase Substrates Using a Dynamic Peptide Microarray', PLoS ONE, 2016, Vol. 11, pp 1-14. 1부.*
WANI, Willayat Y. et al., 'O-GlcNAcylation and neurodegeneration’, Brain Research Bulletin, 2017, Vol. 133, pp 80-87. 1부.*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20200064430A (en) 2020-06-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wang et al. Concomitant memantine and Lactobacillus plantarum treatment attenuates cognitive impairments in APP/PS1 mice
Jin et al. Icariin, a phoshphodiesterase-5 inhibitor, improves learning and memory in APP/PS1 transgenic mice by stimulation of NO/cGMP signalling
Warner-Schmidt et al. A role for p11 in the antidepressant action of brain-derived neurotrophic factor
KR102129007B1 (en) Pharmaceutical composition for treating learning and memory disorder induced by sleep disturbance
Hou et al. Anti-depressant natural flavonols modulate BDNF and beta amyloid in neurons and hippocampus of double TgAD mice
Schiavone et al. Severe life stress and oxidative stress in the brain: from animal models to human pathology
Ito et al. Icv administration of orexin-A induces an antidepressive-like effect through hippocampal cell proliferation
Kelleher et al. REDD2 expression in rat skeletal muscle correlates with nutrient-induced activation of mTORC1: responses to aging, immobilization, and remobilization
Hernandes et al. Microglial cells are involved in the susceptibility of NADPH oxidase knockout mice to 6-hydroxy-dopamine-induced neurodegeneration
KR102129006B1 (en) Pharmaceutical composition for treating learning and memory disorder induced by sleep disturbance
Qiu et al. Positive association between plasma amylin and cognition in a homebound elderly population
WO2019182191A1 (en) Pharmaceutical composition for prevention or treatment of neurodegenerative disease and comprising cox2-acetylating agent as active ingredient
Tian et al. 919 syrup alleviates postpartum depression by modulating the structure and metabolism of gut microbes and affecting the function of the hippocampal GABA/glutamate system
Zhang et al. 3, 4-Dimethoxychalcone, a caloric restriction mimetic, enhances TFEB-mediated autophagy and alleviates pyroptosis and necroptosis after spinal cord injury
Fan et al. Bilateral intracerebroventricular injection of streptozotocin induces AD-like behavioral impairments and neuropathological features in mice: involved with the fundamental role of neuroinflammation
Song et al. Insulin-like growth factor-1 alleviates expression of Aβ 1–40 and α-, β-, and γ-secretases in the cortex and hippocampus of APP/PS1 double transgenic mice
Prvulovic et al. Calorie restriction changes the anxiety-like behaviour of ageing male Wistar rats in an onset-and duration-dependent manner
Dorigatti et al. Beta-guanidinopropionic acid has age-specific effects on markers of health and function in mice
López et al. TIGAR inclusion pathology is specific for Lewy body diseases
KR20200064432A (en) A preparation method for animal model of alzheimer&#39;s disease and animal model of alzheimer&#39;s disease using the same
KR20180067313A (en) Biomarker GCN5 for diagnosing neurodegenerative disease and use thereof
TWI814760B (en) Lipocalin-type prostaglandin d2 synthase production promoter
Molteni et al. Basal and stress-induced modulation of activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc) in the rat brain following duloxetine treatment
KR102276059B1 (en) A preparation method for animal model of alzheimer&#39;s disease and animal model of alzheimer&#39;s disease using the same
Nakamura-Maruyama et al. Ryanodine receptors are involved in the improvement of depression-like behaviors through electroconvulsive shock in stressed mice

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right