KR102127480B1 - 그래핀 기반의 인체세포 증식용 스캐폴드 및 그 제조 방법 - Google Patents

Abstract

산화 그래핀과, 상기 산화 그래핀의 표면에 결합된 폴리 L-라이신(L-lysine)을 포함하는 인체세포 적합 조성물이 표면에 코팅된 인체 세포 배양용 스캐폴드(scafold)이 개시된다. 산화 그래핀은 일부가 카르복시 기를 가지는 염에 의해 치환될 수 있다. 카르복시기를 가지는 염은 4-카르복시 벤젠 디아조늄 염(4-carboxy benzene diazonium salt)일 수 있다. 인체 세포 배양용 스캐폴드(scafold)는, 산화 그래핀을 준비하는 단계; 상기 산화 그래핀을 4-아미노벤조 산(4-aminobezoic acid) 및 질산나트륨과 반응시켜 산화그래핀-벤젠 디아조늄 염 복합체를 생성하는 단계; 산화그래핀-벤젠 디아조늄 염 복합체를 폴리-L-라이신(Poly L-lysine, PLL)과 반응시켜 산화그래핀-벤젠 디아조늄염-폴리 L-라이신 복합체(GO-DS-PLL 복합체)를 생성하는 단계; 및 상기 GO-DS-PLL 복합체를 스캐폴드 표면에 스핀-코팅(spin-coating)하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조될 수 있다.

Description

그래핀 기반의 인체세포 증식용 스캐폴드 및 그 제조 방법{A GRAPHENE-BASED SCAFFOLD FOR HUMAN CELL PROLIFERATION AND A METHOD FOR PRODUCTION THEREOF}

본 발명은 인체세포 증식용 스캐폴드 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인체세포 적합성을 가지는 그래핀 기반의 인체세포 증식용 스캐폴드 및 그 제조방법에 관한 것이다.

그래핀은 6각형으로 배열된 sp2-결합 탄소 원자들로 구성된 단원자 두께의 박판이다. 그래핀은 독특한 물리적 특성으로 인해 예컨대, 바이오센서, 바이오칩, 진단기기, 이식 가능한 의료 기기(예컨대, 인공 장기) 및 약물전달 시스템 등의 바이오의료 분야에 응용될 수 있다. 산화 그래핀 및 그 유도체들은, 생명공학에의 사용을 용이하게 하는 활성 산소 작용기들을 일정 범위 함유하고 있다. 이와 같은 산화 그래핀 및 그 유도체들의 용매, 특히 물에 대한 용해도는 생명공학 응용에 있어 굉장히 중요하다. 이러한 물질들의 용매에 대한 최대 용해도는 용매의 극성과 표면 개질의 정도에 모두 의존한다. 최근의 보고에 따르면, 산화 그래핀과 그 유도체들은 제한적인 세포독성을 가진(또는 세포독성이 없는), 인간 또는 포유류의 세포 증식을 촉진하는 우수한 생체 적합성을 가진 물질로 알려져 있다. 이러한 특성은 연구자들이 이러한 물질들을 조직 공학, 조직 이식, 외상 처치, 및 약물 전달 응용 등에 사용하도록 만들고 있다. 최근 몇몇 연구에 의하면, 산화 그래핀은 L-929 세포, 조골세포, 신장 세포 및 배아 세포 등에 대한 부착 및 증식을 촉진하는 것으로 알려졌다.

그러나, 상기와 같은 산화 그래핀의 인체 세포 적합성에도 불구하고, 실제 인체세포의 부착 및 증식의 정도가 종래의 다공성 섬유소재 및 폴리스티렌(polystyrene) 등에 비해 현저히 낮아 실용화가 어려운 문제가 있다.

따라서 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 그래핀 기반의 항균성 소재 및 이러한 항균성 소재를 이용한 항균성 필름을 제공하는 것이다.

이러한 과제를 해결하기 위한 본 발명의 예시적인 일 실시예에 따른 인체 세포 배양용 스캐폴드(scafold)는 산화 그래핀과, 상기 산화 그래핀의 표면에 결합된 폴리 L-라이신(L-lysine)을 포함하는 인체세포 적합 조성물이 표면에 코팅된다.

예를 들어, 상기 실시예에 따른 항균성 조성물은 상기 산화 그래핀은 일부가 카르복시 기를 가지는 염에 의해 치환될 수 있다.

또한 상기 카르복시기를 가지는 염은 4-카르복시 벤젠 디아조늄 염(4-carboxy benzene diazonium salt)일 수 있다.

본 발명의 예시적 일 실시예에 따른 인체 세포 배양용 스캐폴드(scafold)를 제조하는 방법은, 산화 그래핀을 준비하는 단계; 상기 산화 그래핀을 4-아미노벤조 산(4-aminobezoic acid) 및 질산나트륨과 반응시켜 산화그래핀-벤젠 디아조늄 염 복합체를 생성하는 단계; 산화그래핀-벤젠 디아조늄 염 복합체를 폴리-L-라이신(Poly L-lysine, PLL)과 반응시켜 산화그래핀-벤젠 디아조늄염-폴리 L-라이신 복합체(GO-DS-PLL 복합체)를 생성하는 단계; 및 상기 GO-DS-PLL 복합체를 스캐폴드 표면에 스핀-코팅(spin-coating)하는 단계를 포함한다.

예를 들어, 상기 산화그래핀-벤젠 디아조늄 염 복합체를 생성하는 단계는, 상기 산화 그래핀을 상온에서 황산 용액에 첨가하고 약 30분간 초음파로 처리하는 단계; 상기 산화 그래핀-황산 혼합액에 4-아미노벤조 산(4-aminobezoic acid) 및 질산나트륨을 첨가하여 약 60℃에서 1시간 정도 교반하는 단계; 상기 그래핀-황산-4-아미노벤조 산-질산나트륨 용액을 물로 희석하고 2M 농도의 수산화 나트륨(NaOH)으로 중화시키는 단계; 및 상기 희석 및 중화된 혼합물을 물과 에탄올로 세척하고 진공 오븐에서 60℃의 온도로 24시간동안 건조시켜 산화 그래핀-벤젠 디아조늄 염 복합체(GO-DS 복합체) 나노시트를 생성하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 상기 산화그래핀-벤젠 디아조늄염-폴리 L-라이신 복합체(GO-DS-PLL 복합체)를 생성하는 단계는, 상기 건조된 산화 그래핀-벤젠 디아조늄 염 복합체(GO-DS 복합체) 나노시트(nanosheet)를, 상기 그래핀-벤젠 디아조늄 염 복합체의 4배 중량의 폴리-L-라이신(Poly L-lysine, PLL)과 함께 탈이온화된 증류수에 분산시키는 단계; 상기 그래핀-벤젠 디아조늄 염 복합체와 폴리-L-라이신의 혼합물을 4℃에서 24시간 동안 교반하고 상기 교반된 혼합물을 냉각된 100% 에탄올에 넣고 8시간 정도 4℃로 유지하여 침전을 유도하는 단계; 및 상기 침전물을 14,000rpm으로 30분간 원심분리하고, 분리된 펠릿(pellet)을 진공에서 건조시킨 뒤 상기 건조된 펠릿을 초음파에 의해 탈이온화된 증류수에 1mg/mL 농도로 분산시키는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에 의한 그래핀 기반의 인체 세포 증식용 스캐폴드(scafold)는 인체 세포 적합성 및 증식성이 있으므로, 이식된 인공장기가 면역기제에 의해 공격 받음으로써 발생하는 자가면역 등의 부작용을 최소화하는 효과가 있다.

또한 본 발명에 의한 상기와 같은 그래핀 유도체-PLL 복합체는 줄기세포를 이용하여 치료용 조직을 만드는 스캐폴드(scafold) 등으로 사용 가능하다. 본 발명에 의한 그래핀 유도체-PLL 복합체는 세포 독성이 없어 줄기세포 또는 줄기세포로부터 분화한 세포의 사멸 없이 증식을 유도할 수 있는 효과가 있다. 따라서 줄기세포를 이용한 이식용 인공 피부, 인공 모발, 인공 신장 등 다양한 인공 장기의 생산을 위한 스캐폴드로 이용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 인체 세포 증식용 스캐폴드(scafold)의 제조를 위한 인체세포 적합 조성물을 제조하는 방법을 개략적으로 도시한 다이어그램이다.
도 2a는 그래핀 유도체 등이 없는 글래스 커버슬립 상에서의 인체 지방유래 줄기세포(hAdSC)의 부착 및 증식 대조군을 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 2b는 산화 그래핀(GO)이 코팅된 글래스 커버슬립 상에서의 인체 지방유래 줄기세포(hAdSC)의 부착 및 증식을 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 2c는 산화 그래핀-PLL 복합체(GO-PLL 복합체)가 코팅된 글래스 커버슬립 상에서의 인체 지방유래 줄기세포(hAdSC)의 부착 및 증식을 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 2d는 산화 그래핀-벤젠 디아조늄 염-PLL 복합체(GO-DS-PLL 복합체)가 코팅된 글래스 커버슬립 상에서의 인체 지방유래 줄기세포(hAdSC)의 부착 및 증식을 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 2e는 PLL만 코팅된 글래스 커버슬립 상에서의 인체 지방유래 줄기세포(hAdSC)의 부착 및 증식을 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 2f는 환원된 산화 그래핀(rGO)이 코팅된 글래스 커버슬립 상에서의 인체 지방유래 줄기세포(hAdSC)의 부착 및 증식을 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 2g는 환원된 산화 그래핀-PLL 복합체(rGO-PLL 복합체)가 코팅된 글래스 커버슬립 상에서의 인체 지방유래 줄기세포(hAdSC)의 부착 및 증식을 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 2h는 환원된 산화 그래핀-벤젠 디아조늄 염-PLL 복합체(rGO-DS-PLL 복합체)가 코팅된 글래스 커버슬립 상에서의 인체 지방유래 줄기세포(hAdSC)의 부착 및 증식을 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 3a는 그래핀 유도체 등이 없는 글래스 커버슬립 상에서의 인간 비-소세포성 폐암종(A549)의 부착 및 증식 대조군을 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 3b는 산화 그래핀(GO)이 코팅된 글래스 커버슬립 상에서의 인체 지방유래 줄기세포(hAdSC)의 부착 및 증식을 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 3c는 산화 그래핀-PLL 복합체(GO-PLL 복합체)가 코팅된 글래스 커버슬립 상에서의 인간 비-소세포성 폐암종(A549)의 부착 및 증식을 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 3d는 산화 그래핀-벤젠 디아조늄 염-PLL 복합체(GO-DS-PLL 복합체)가 코팅된 글래스 커버슬립 상에서의 인간 비-소세포성 폐암종(A549)의 부착 및 증식을 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 3e는 PLL만 코팅된 글래스 커버슬립 상에서의 인간 비-소세포성 폐암종(A549)의 부착 및 증식을 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 3f는 환원된 산화 그래핀(rGO)이 코팅된 글래스 커버슬립 상에서의 인간 비-소세포성 폐암종(A549)의 부착 및 증식을 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 3g는 환원된 산화 그래핀-PLL 복합체(rGO-PLL 복합체)가 코팅된 글래스 커버슬립 상에서의 인간 비-소세포성 폐암종(A549)의 부착 및 증식을 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 3h는 환원된 산화 그래핀-벤젠 디아조늄 염-PLL 복합체(rGO-DS-PLL 복합체)가 코팅된 글래스 커버슬립 상에서의 인간 비-소세포성 폐암종(A549)의 부착 및 증식을 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 4a는 대조군에 대한 BrdU-양성 hAdSC 세포를 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 4b는 GO-DS-PLL 복합체에 대한 BrdU-양성 hAdSC 세포를 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 4c는 대조군에 대해, BrdU-양성인 세포와 DAPI-양성인 hAdSC 세포를 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 4d는 GO-DS-PLL 복합체에 대해, BrdU-양성인 세포와 hAdSC DAPI-양성인 세포를 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 5a는 대조군에 대한 BrdU-양성인 A549 세포를 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 5b는 GO-DS-PLL 복합체에 대한 BrdU-양성인 A549 세포를 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 5c는 대조군에 대해, BrdU-양성인 A549 세포와 DAPI-양성인 A549 세포를 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 5d는 GO-DS-PLL 복합체에 대해, BrdU-양성인 A549 세포와 DAPI-양성인 A549세포를 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 6은 도 4a 내지 4d 및 도 5a 내지 5d에 도시된 시험 결과를 정량화한 그래프이다.

본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성 요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성 요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안된다. 상기 용어들은 하나의 구성 요소를 다른 구성 요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성 요소는 제2 구성 요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성 요소도 제1 구성 요소로 명명될 수 있다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예들을 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.

일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

이하, 첨부 도면들을 참조하여 본 발명의 일 실시예에 따른 항균성 조성물에 대하여 보다 상세히 설명한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 항균성 조성물을 제조하는 방법을 개략적으로 도시한 다이어그램이다.

1. 산화그래핀(GO)의 준비

먼저, 황산, 칼륨, 과망간산 염 및 질산나트륨을 이용하는 개량된 허머즈·오픈만 방법(Hummers and Offenman's method)에 의해 천연 흑연 파우더로부터 산화 그래핀을 획득한다.

2. 산화그래핀-벤젠 디아조늄염 복합체(GO-DS 복합체) 및 환원된 산화그래핀-벤젠 디아조늄염(rGO-DS 복합체)의 제조

다음으로, 이전 개량된 허머즈·오픈만 방법에 의해 얻어진 산화 그래핀 또는 환원된 산화 그래핀을 상온에서 황산 용액에 첨가하고 약 30분간 초음파로 처리한다. 혼합액을 플라스크에 투입하고 4-아미노벤조 산(4-aminobezoic acid) 및 질산나트륨을 시린지를 통해 빠르게 첨가한다. 혼합액을 약 60℃에서 1시간 정도 교반한다. 이렇게 만들어진 용액은 강산성이므로, 물에 희석하고 2M 농도의 수산화 나트륨(NaOH)으로 중화시킨다. 희석 및 중화된 최종 산물을 물과 에탄올로 세척하고 진공 오븐에서 60℃의 온도로 24시간동안 건조시킨다.

3. 산화그래핀-벤젠 디아조늄염-폴리 L-라이신 복합체(GO-DS-PLL 복합체) 및 환원된 산화그래핀-벤젠 디아조늄염-폴리 L-라이신 복합체(rGO-DS-PLL 복합체)의 제조

건조된 산화 그래핀-벤젠 디아조늄 염 복합체(GO-DS 복합체) 및 환원된 산화 그래핀-벤젠 디아조늄 염 복합체(rGO-DS 복합체)로 구성된 나노시트(nanosheet)를, GO-DS 복합체 및 rGO-DS 복합체의 4배 중량의 폴리-L-라이신(Poly L-lysine, PLL)과 함께 탈이온화된 증류수에 분산시킨다. 그런 다음, 반응 혼합물을 4℃에서 24시간 동안 교반한다. 상기 혼합물을 냉각된 100% 에탄올에 넣고 침전을 용이하게 하도록 18시간 정도 4℃로 유지시킨다. 시인 가능한 침전물을 14,000rpm으로 30분간 원심분리하고, 분리된 펠릿(pellet)을 진공에서 건조시킨다. 건조된 펠릿을 초음파에 의해 탈이온화된 증류수에 1mg/mL 농도로 분산시킨다.

4. 산화그래핀-벤젠 디아조늄염-폴리 L-라이신 복합체(GO-DS-PLL 복합체) 및 환원된 산화그래핀-벤젠 디아조늄염-폴리 L-라이신 복합체(rGO-DS-PLL 복합체)으로 글래스 커버슬립을 코팅

3의 과정에 의해 분산된 용액 100㎕를 마이크로 시린지를 사용하여 글래스 커버슬립에 떨어뜨리고, 글래스 커버슬립을 4,000rpm으로 약 30초간 회전시켜 스핀코팅시킨다. 다음으로, 용액이 스핀 코팅된 글래스 커버슬립을 흄후드(fume hood)에서 건조시킨다. 건조된 글래스 커버슬립을 10cm 직경의 배양접시에 넣고 자외선으로 약 30분간 처리한다.

5. 인체 세포의 배양

비-소세포성 폐암종(A549) 세포를 10% 소태아혈청(FBS : Fetal Bovine Serum)및 1% 항생제가 보충된 RPMI 미디움 1640(Roswell Park Memorial Institute medium 1640) 배지에서 배양한다. 세포는 2차 배양 전에 95% 습도 및 5% 이산화탄소를 가진 대기 중에서 37℃로 약 48시간동안 배양된다. 실험을 위해, 12×10⁴개의 세포가 복합체 필름을 가지는 글래스 슬라이드를 포함하는 35mm 배양접시에 이식되어 세포들이 글래스 커버슬립상에 부착되고 성장할 수 있도록 배양된다. 36시간 경과 후, 세포 성장의 형태를 카메라가 장착된 현미경을 통해 관찰하였다.

6. 산화그래핀-벤젠 디아조늄염-폴리 L-라이신 복합체(GO-DS-PLL 복합체) 및 환원된 산화그래핀-벤젠 디아조늄염-폴리 L-라이신 복합체(rGO-DS-PLL 복합체)의 인체세포 적합성 검증

인체 지방유래 줄기세포(human adipose-derived stem cell, hAdSCs) 및 비-소세포성 폐암종(A549) 세포를 이용하여 GO-DS-PLL 복합체 및 rGO-DS-PLL 복합체가 인체 세포 부착 및 증식에 미치는 영향을 판정하였다. 다양한 복합체들이 상기 4 및 5에서 기술된 바와 같이, 1mg/mL 용액 100㎕으로 시료들을 스핀-캐스팅(spin-casting)됨으로써 글래스 커버슬립 상에 코팅되어 배양된다.

세포들은 글래스 커버슬립 상에 부착되거나 그 위에서 증식될 수 있다. 세포 부착 상이한 시간에서 광학 현미경을 통해 관찰되었다. 도 2a 내지 2h 및 도 3a 내지 3h는 각각 hAdCS 및 A549를 24시간동안 배양한 후의 상이한 세포형태들을 촬영한 사진이다.

도 2a 내지 2h 및 도 3a 내지 3h를 참조하면, 두 종류의 인체 세포 모두 산화 그래핀 또는 PLL만 코팅된 커버슬립 보다 PLL 복합체가 코팅된 커버슬립 상에서 더 효과적으로 부착되었음을 알 수 있다.

또한, rGO-PLL 복합체(도 2g) 상에서의 인체 세포의 부착성 및 증식성은 GO-PLL 복합체(도 2c), GO-DS-PLL 복합체(도 2d), 및 rGO-DS-PLL 복합체(도 2h)에 비하여 낮은 것으로 확인되었다.

글래스 커버슬립만 가지는 대조군 실험에서는 극소수의 세포만 부착되었으며, 이는 hAdSC 및 A549 세포들의 확대 및 성장이 결여되었음을 나타낸다.

그래핀 유도체와 PLL의 복합체의 세포 증식 능력은 BrdU(bromodeoxyuridine)으로 형광 염색하는 것에 의해 확인될 수 있다.

세포핵은 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(4',6-diamidino-2-phenylindole) 디하이드로클로라이드(DAPI, Roche)로 염색함으로써 시각적으로 확인된다. 따라서, DAPI-양성인 세포의 수가 전체 세포의 수와 같아진다. BrdU는 DNA 조합 중에 DNA 가닥에 축적되므로 세포의 증식 중에만 관찰된다. 따라서, BrdU-양성 세포들은 증식 중인 세포로 간주된다.

세포 증식과 관련된 실험은 GO-DS-PLL 복합체로 코팅된 커버슬립과 PLL로만 코팅된 커버슬립(대조군)에 대해서만 실시되었다.

도 4a는 대조군에 대한 BrdU-양성 hAdSC 세포를 현미경으로 관찰한 사진이다. 도 4b는 GO-DS-PLL 복합체에 대한 BrdU-양성 hAdSC 세포를 현미경으로 관찰한 사진이다. 도 4c는 대조군에 대해, BrdU-양성인 세포와 DAPI-양성인 hAdSC 세포를 현미경으로 관찰한 사진이다. 도 4d는 GO-DS-PLL 복합체에 대해, BrdU-양성인 세포와 hAdSC DAPI-양성인 세포를 현미경으로 관찰한 사진이다.

또한, 도 5a는 대조군에 대한 BrdU-양성인 A549 세포를 현미경으로 관찰한 사진이다. 도 5b는 GO-DS-PLL 복합체에 대한 BrdU-양성인 A549 세포를 현미경으로 관찰한 사진이다. 도 5c는 대조군에 대해, BrdU-양성인 A549 세포와 DAPI-양성인 A549 세포를 현미경으로 관찰한 사진이다. 도 5d는 GO-DS-PLL 복합체에 대해, BrdU-양성인 A549 세포와 DAPI-양성인 A549세포를 현미경으로 관찰한 사진이다.

한편, 도 6은 도 4a 내지 4d 및 도 5a 내지 5d에 도시된 시험 결과를 정량화한 그래프이다.

도 4a 내지 도 6을 참조하면, 대조군인 PLL로만 코팅된 커버슬립에서는 약 11%에서 13% 정도의 BrdU-양성 세포들이 관찰되었음에 반하여, GO-DS-PLL 복합체로 코팅된 커버슬립에서는 약 25%에서 29%의 세포가 BrdU 양성인 것으로 관찰되었다. 이 데이터들을 두 조건, 즉 대조군과 GO-DS-PLL 코팅된 시료 각각에 대하여 총 세포수와 증식 중인 세포 수의 비를 취하여 정량화하였다. t-검정을 사용하여 대조군과 GO-DS-PLL 코팅된 시료에 대한 퍼센트율(percentage) 사이의 차이가 통계적으로 유의미하다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 이러한 데이터들은 PLL만을 함유한 경우보다 그래핀 유도체-PLL 복합체를 함유한 경우가 인체 세포를 효율적으로 증식시키는 데 적합하다는 것을 나타내며, 이는 곧 이러한 소재가 인체 세포에 대한 세포 독성을 가지지 않는다는 사실을 나타낸다.

7. 응용

본 발명에 의한 상기와 같은 그래핀 유도체-PLL 복합체는 인공장기, 예컨대 인공관절 등의 표면에 코팅되어 사용될 수 있다. 이와 같은 사용은 이식된 인공장기가 면역기제에 의해 공격 받음으로써 발생하는 자가면역 등의 부작용을 최소화하는 효과가 있다.

또한 본 발명에 의한 상기와 같은 그래핀 유도체-PLL 복합체는 줄기세포를 이용하여 치료용 조직을 만드는 스캐폴드(scafold) 등으로 사용 가능하다. 본 발명에 의한 그래핀 유도체-PLL 복합체는 세포 독성이 없어 줄기세포 또는 줄기세포로부터 분화한 세포의 사멸 없이 증식을 유도할 수 있다. 따라서 줄기세포를 이용한 이식용 인공 피부, 인공 모발, 인공 신장 등 다양한 인공 장기의 생산을 위한 스캐폴드로 이용할 수 있다.

앞서 설명한 본 발명의 상세한 설명에서는 본 발명의 바람직한 실시예들을 참조하여 설명하였지만, 해당 기술분야의 숙련된 당업자 또는 해당 기술분야에 통상의 지식을 갖는 자라면 후술될 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 기술 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

DS : 벤젠 디아조늄 염(benzene diazonium salt)
PLL : 폴리 L-라이신(poly L-lysine)

Claims (6)

1. 산화 그래핀과, 상기 산화 그래핀의 표면에 결합된 폴리 L-라이신(L-lysine)을 포함하는, 인체세포 적합 조성물이 표면에 코팅된 인체 세포 배양용 스캐폴드(scafold)로서,
   상기 산화 그래핀은 카르복시기를 가지는 염에 의해 일부 치환되고,
   상기 일부 치환에 의해 상기 산화 그래핀의 표면에 카르복시기가 도입됨으로써 상기 폴리 L-라이신이 상기 산화 그래핀의 표면에 결합되는 사이트가 증가되는 것인,
   인체 세포 배양용 스캐폴드.
   
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 카르복시기를 가지는 염은 4-카르복시 벤젠 디아조늄 염(4-carboxy benzene diazonium salt)인, 인체 세포 배양용 스캐폴드.
   
4. 산화 그래핀을 준비하는 단계;
   상기 산화 그래핀을 4-아미노벤조 산(4-aminobezoic acid) 및 질산나트륨과 반응시켜 산화 그래핀-벤젠 디아조늄 염 복합체를 생성하는 단계;
   상기 산화 그래핀-벤젠 디아조늄 염 복합체를 폴리-L-라이신(Poly L-lysine, PLL)과 반응시켜 산화 그래핀-벤젠 디아조늄염-폴리 L-라이신 복합체(GO-DS-PLL 복합체)를 생성하는 단계; 및
   상기 GO-DS-PLL 복합체를 스캐폴드 표면에 스핀-코팅(spin-coating)하는 단계
   를 포함하는, 인체 세포 배양용 스캐폴드를 제조하는 방법.
   
5. 제 4 항에 있어서,
   상기 산화 그래핀-벤젠 디아조늄 염 복합체를 생성하는 단계는,
   상기 산화 그래핀을 상온에서 황산 용액에 첨가하고 30분간 초음파로 처리하는 단계;
   상기 산화 그래핀-황산 혼합액에 4-아미노벤조 산(4-aminobezoic acid) 및 질산나트륨을 첨가하여 60℃에서 1시간 동안 교반하는 단계;
   상기 산화 그래핀-황산-4-아미노벤조 산-질산나트륨 용액을 물로 희석하고 2 M 농도의 수산화 나트륨(NaOH)으로 중화시키는 단계; 및
   상기 희석 및 중화된 혼합물을 물과 에탄올로 세척하고 진공 오븐에서 60℃의 온도로 24시간 동안 건조시켜 산화 그래핀-벤젠 디아조늄 염 복합체(GO-DS 복합체) 나노시트를 생성하는 단계
   를 포함하는, 인체 세포 배양용 스캐폴드를 제조하는 방법.
   
6. 제 5 항에 있어서,
   상기 산화 그래핀-벤젠 디아조늄염-폴리 L-라이신 복합체(GO-DS-PLL 복합체)를 생성하는 단계는,
   상기 건조된 산화 그래핀-벤젠 디아조늄 염 복합체(GO-DS 복합체) 나노시트를, 상기 그래핀-벤젠 디아조늄 염 복합체의 4배 중량의 폴리-L-라이신(Poly L-lysine, PLL)과 함께 탈이온화된 증류수에 분산시키는 단계;
   상기 산화 그래핀-벤젠 디아조늄 염 복합체와 폴리-L-라이신의 혼합물을 4℃에서 24시간 동안 교반하고, 상기 교반된 혼합물을 냉각된 100% 에탄올에 넣고 8시간 동안 4℃로 유지하여 침전을 유도하는 단계; 및
   상기 침전물을 14,000 rpm으로 30분간 원심분리하고, 분리된 펠릿(pellet)을 진공에서 건조시킨 뒤, 상기 건조된 펠릿을 초음파에 의해 탈이온화된 증류수에 1 mg/mL 농도로 분산시키는 단계
   를 포함하는, 인체 세포 배양용 스캐폴드를 제조하는 방법.
   

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