KR102119513B1 - OsMYB9 gene improving phosphate uptake efficiency in plant and uses thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 식물의 인산 흡수 효율을 증진시키는 OsMYB9 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 벼 유래의 전자조절 단백질 OsMYB9(Oryza sativa MYB9)를 코딩하는 유전자는 식물체의 인산 흡수 효율을 증진시키므로, 식물체에서 OsMYB9 유전자의 발현 조절을 통해 인산 흡수율이 증진되고 인산 결핍 스트레스를 극복할 수 있는 식물체를 개발하는데 이용될 수 있을 것이다.The present invention relates to the OsMYB9 gene and its use to enhance the phosphate absorption efficiency of plants, the gene encoding the rice-derived electron regulatory protein OsMYB9 ( Oryza sativa MYB9) enhances the phosphate absorption efficiency of plants, so the OsMYB9 gene in plants It can be used to develop a plant capable of improving the absorption rate of phosphate and controlling the stress of phosphate deficiency by regulating the expression of.

Description

식물의 인산 흡수 효율을 증진시키는 OsMYB9 유전자 및 이의 용도{OsMYB9 gene improving phosphate uptake efficiency in plant and uses thereof}OsMYB9 gene improving phosphate uptake efficiency in plant and uses thereof}

본 발명은 식물의 인산 흡수 효율을 증진시키는 OsMYB9 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to the OsMYB9 gene and its use to enhance the phosphate absorption efficiency of plants.

인구의 급속한 증가로 인하여 식량 부족은 전 세계적으로 큰 문제가 되고 있으며, 이를 극복하기 위해 다수성(high yielding ability) 식량 작물의 육성이 요구되고 있다. 다수성 식량 작물을 육성하기 위해서는 작물에 충분한 영양소를 공급해야 한다. 이를 위해 비료를 투입하는데, 비료의 주요 성분 중 하나가 인산이다. 인산은 식물이 필요로 하는 필수 영양소 중 하나로 에너지 전달, 신호 전달, 효소 활성 조절, 대사산물의 생합성, 광합성 및 호흡 등 식물 세포 내에서 일어나는 모든 물질대사 과정에서 중요한 기능을 수행한다. 인산은 또한 인지질 및 핵산의 중요한 구성 성분이기 때문에 질소와 함께 식물체가 가장 많이 필요로 하는 영양원소이다.Due to the rapid increase in population, food shortage is a global problem, and to overcome this, it is required to develop a high yielding ability food crop. In order to cultivate multiple food crops, it is necessary to supply sufficient nutrients to the crops. For this purpose, fertilizer is added. One of the main components of fertilizer is phosphoric acid. Phosphoric acid is one of the essential nutrients required by plants, and it plays an important role in all metabolism processes in plant cells, such as energy transmission, signal transmission, enzyme activity regulation, biosynthesis of metabolites, photosynthesis, and respiration. Phosphoric acid is also an important component of phospholipids and nucleic acids, so it is the nutrient most needed by plants along with nitrogen.

지구의 암석권에는 인산이 많이 존재하지만 대부분의 토양 내 인산은 주로 식물이 이용할 수 없는 유기물 또는 철이나 알루미늄과 같은 금속 이온과 결합한 형태로 존재하기 때문에, 실제 식물이 이용할 수 있는 유효 인산의 양은 토양 속에 극히 적은 양으로 존재하고 있다. 따라서, 인산은 작물의 생산성을 제한하는 인자로 작용한다. 이에 따라 식물체의 성장에 필요한 인산을 비료 형태로 공급하고 있으나, 공급된 대부분의 인산이 토양에 존재하는 유기물 또는 금속 이온과 결합하여 식물이 이용할 수 없는 형태로 고정화되며, 특히, 산성 토양의 경우 과다 축적된 알루미늄 이온으로 인해 더 활발한 인산 고정화가 일어나기 때문에 토양의 인산 유효성이 더욱 낮다.Although there is a lot of phosphoric acid in the earth's lithosphere, most of the phosphoric acid in the soil is mainly in the form of combined with organic matter that is not available to plants or metal ions such as iron or aluminum. It is present in small amounts. Therefore, phosphoric acid acts as a factor limiting crop productivity. Accordingly, the phosphoric acid necessary for the growth of the plant is supplied in the form of fertilizer, but most of the supplied phosphoric acid is immobilized in an unusable form by combining with organic substances or metal ions present in the soil, especially in the case of acidic soil. Because of the accumulated aluminum ions, more active phosphate immobilization occurs, so the phosphate effectiveness of the soil is lower.

이처럼 작물 생장에 필요한 토양의 유효 인산 농도를 증가시키기 위해 처리되는 비료는 농업 생산 비용을 증가시키는 원인이 된다. 뿐만 아니라 비료의 과다 사용으로 인해 미처 흡수되지 못한 비료는 토양에 집적되고 토양 산성화를 일으켜 작물의 생육에 악영향을 미치며, 지하수 오염 및 지표수의 부영양화를 초래한다. 농업 환경의 오염은 농산물 생산에 있어서 양적 및 질적 저하를 가져올 뿐만 아니라, 생활 환경도 오염시켜 국민 건강을 위협하므로 그 오염원의 제거는 매우 중요한 문제이다. 이러한 문제는 투입되는 화학 비료의 양을 줄임으로써 해결할 수 있다. 현재 화학 비료를 대체하기 위한 여러 가지 유기질 비료가 개발되어 사용되고 있으나, 아직 많은 문제점이 남아있다. 이러한 문제의 근본적인 해결 방안은 식물의 인산 흡수력을 향상시킴으로써 비료의 사용량을 줄이는 것이다. 따라서 인산 결핍 조건에서도 효율적으로 생장 가능한 작물의 개발이 요구되고 있다.As such, fertilizers treated to increase the effective phosphate concentration in soil required for crop growth are responsible for increasing agricultural production costs. In addition, fertilizer, which has not been absorbed due to excessive use of fertilizer, accumulates in the soil and causes acidification of the soil, adversely affecting the growth of crops, causing groundwater pollution and eutrophication of surface water. Pollution of agricultural environment not only brings about quantitative and qualitative deterioration in the production of agricultural products, but also pollutes the living environment and threatens people's health. This problem can be solved by reducing the amount of chemical fertilizer added. Currently, various organic fertilizers have been developed and used to replace chemical fertilizers, but many problems remain. The fundamental solution to this problem is to reduce the amount of fertilizer used by improving the phosphate absorption capacity of plants. Therefore, it is required to develop crops that can be efficiently grown even in conditions of phosphoric acid deficiency.

한편, 작물의 양분 이용 효율 개선을 위한 연구는 세계적으로 가장 중요한 식량 작물 중 하나인 벼를 대상으로 많이 수행되고 있으며, 벼의 전체 유전자 서열이 밝혀진 이후 유용 유전자를 확보하고 이를 선점하기 위해 많은 노력이 행해지고 있다. 식물의 무기양분 흡수와 관련된 연구는 재배학적 측면의 연구와 식물 생리학적 측면의 연구가 오래전부터 이루어져 왔으나, 최근에는 무기양분 흡수에 대한 분자 수준의 기초 연구를 토대로 무기양분 흡수와 관련한 유전자들을 이용하여 작물의 생육과 수량을 증가시키고, 극도로 양분이 제한된 조건에서도 생장이 가능한 작물을 육종하기 위한 연구들이 세계적으로 활발히 진행되고 있다. 또한, 식물은 인산이 결핍된 조건에서 뿌리의 생장과 뿌리털의 형성을 촉진하여 표면적을 넓히고, 고친화성 인산 운반체, 탈인산화효소 및 유기산 생합성과 분비에 관련된 유전자들의 발현을 유도함으로써 인산 흡수 능력을 향상시키고, 인산 이용성을 증가시키는 것으로 알려져 있다.On the other hand, research to improve the efficiency of nutrient utilization of crops has been carried out on rice, one of the most important food crops in the world, and a lot of efforts have been made to secure and preempt useful genes after the entire gene sequence of rice has been revealed. Is being done. Research on the absorption of inorganic nutrients from plants has been conducted for a long time in the field of cultivation and plant physiology, but recently, based on the molecular-level basic research on the absorption of inorganic nutrients, it uses genes related to absorption of inorganic nutrients. Research is being conducted worldwide to increase crop growth and yield, and to breed crops that can grow even under extremely limited nutrient conditions. In addition, the plant promotes the growth of roots and the formation of root hairs in a condition lacking phosphate, thereby increasing the surface area and improving the ability to absorb phosphate by inducing the expression of genes related to high affinity phosphate transporters, dephosphorylation enzymes and organic acid biosynthesis and secretion. And increase phosphoric acid availability.

이에 본 발명에서는 인산 결핍 조건에서 발현되는 벼 유래의 MYB-CC 타입의 전사 조절 유전자 OsMYB9의 기능을 분석하고, 상기 유전자를 이용하여 식물의 인산 흡수 효율을 증진시킴으로써 인산 결핍 조건에 적응할 수 있는 식물체를 개발하고자 한다.Accordingly, in the present invention, the function of the MYB-CC type transcription control gene OsMYB9 derived from rice expressed in the phosphate deficiency condition is analyzed, and the plant capable of adapting to the phosphate deficiency condition by enhancing the phosphate absorption efficiency of the plant using the gene is analyzed. I want to develop.

한편, 한국등록특허 제1546728호에는 '식물의 인산 흡수 효율을 증진시키는 OgPT 유전자 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1064590호에는 '인산결핍조건에서 발현되는 벼 탈인산화효소 유전자 OsPAP1 및 형질전환 식물체'가 개시되어 있으나, 본 발명의 식물의 인산 흡수 효율을 증진시키는 OsMYB9 유전자 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.Meanwhile, Korea Patent Registration No. 1546728 discloses and "OgPT gene to promote acid-absorbing efficiency of a plant and use thereof, is disclosed, Korea Patent Registration No. 1.06459 million heading" rice dephosphorylation enzyme gene expressed in phosphate deficiency conditions OsPAP1 and Transgenic Plants' have been disclosed, but no description has been made of the OsMYB9 gene and its use to enhance the phosphate absorption efficiency of plants of the invention.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 인산결핍 조건의 벼 식물체 줄기와 뿌리에서 OsMYB9(Oryza sativa MYB9) 유전자가 과발현되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.The present invention was derived by the above-described demands, and in the present invention, the present invention was completed by confirming that the OsMYB9 ( Oryza sativa MYB9) gene is overexpressed in the stem and root of the rice plant under phosphate-deficient conditions.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 벼 유래의 전사조절 단백질 OsMYB9(Oryza sativa MYB9)를 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a transcription control protein OsMYB9 ( Oryza sativa MYB9) derived from rice.

또한, 본 발명은 상기 OsMYB9 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.In addition, the present invention provides a gene encoding the OsMYB9 protein.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.In addition, the present invention provides a recombinant vector containing the gene.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.In addition, the present invention provides a host cell transformed with the recombinant vector.

또한, 본 발명은 OsMYB9 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsMYB9 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체의 인산 흡수 효율을 증가시키는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method of increasing the phosphate absorption efficiency of a plant compared to a wild type comprising the step of overexpressing the OsMYB9 gene by transforming the plant cell with a recombinant vector containing a gene encoding the OsMYB9 protein.

또한, 본 발명은 OsMYB9 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용한 야생형에 비해 인산 흡수 효율이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for producing a transgenic plant with improved phosphate absorption efficiency compared to a wild type using a recombinant vector containing a gene encoding OsMYB9 protein.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 인산 흡수 효율이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.In addition, the present invention provides a transgenic plant with improved phosphate absorption efficiency prepared by the above method and seeds thereof.

또한, 본 발명은 OsMYB9 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 식물체의 인산 흡수 효율 증진용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for enhancing phosphate absorption efficiency of a plant containing a gene encoding OsMYB9 protein.

본 발명의 벼 유래의 전자조절 단백질 OsMYB9(Oryza sativa MYB9)를 코딩하는 유전자는 식물체의 인산 흡수 효율을 증진시키므로, 식물체에서 OsMYB9 유전자의 발현 조절을 통해 인산 흡수율이 증진된 식물체를 개발하는데 이용할 수 있다. 또한, 인산 흡수 능력이 향상된 식물체는 인산 결핍 스트레스를 극복할 수 있으므로, 비료 투입량 절감에 따른 농업 생산 비용 감소 및 환경 오염 방지 효과도 얻을 수 있을 것으로 예상된다.The gene encoding the rice-derived electron-regulating protein OsMYB9 ( Oryza sativa MYB9) enhances the phosphate absorption efficiency of plants, and thus can be used to develop plants with improved phosphate absorption rates through regulation of the expression of OsMYB9 genes in plants. . In addition, plants with improved phosphoric acid absorption capacity can overcome the stress of phosphate deficiency, and thus, it is expected that agricultural production cost reduction and environmental pollution prevention effect can be obtained by reducing fertilizer input.

도 1은 질소(N), 인산(P), 칼륨(K) 및 철(Fe) 결핍 조건에서 OsMYB9 유전자의 발현 양상(A), 벼(Oryza sativa)의 줄기 및 뿌리에서 인산 충분 조건(+P)과 인산 결핍 조건(-P)에서 OsMYB9 유전자의 발현 양상(B) 및 인산 결핍 처리 시간별 OsMYB9 유전자 발현 양상(C)을 나타낸 결과이다.
도 2는 대장균 형질전환체에서 GST 태그 단백질 및 GST-OsMYB9 단백질의 발현정도를 확인한 SDS-PAGE 결과이다.
도 3은 OsMYB9 과발현 형질전환 벼 식물체의 제작과정을 나타낸 사진이다. (A); 동진벼 치상, (B); 캘러스 유도(callus induction), (C) 배발생 캘러스(embryogenic callus) 선발, (d); 최종적으로 선발된 캘러스, (e); 식물체 재분화(regeneration) Ⅰ 및 (f); 식물체 재분화 Ⅱ.
도 4는 OsMYB9 유전자의 도입 여부 확인과 OsMYB9 유전자의 발현량이 강한 형질전환체를 선발하기 위해 수행한 RNA 블랏(RNA blot) 분석 결과이다.
도 5는 야생형 벼(WT) 식물체와 OsMYB9 유전자를 과발현하는 형질전환 벼 식물체(OsMYB9 -OX)를 인산충분(High Pi; A) 및 인산결핍(Low Pi; B) 조건에서 생육시켜 줄기 길이(Shoot length; C), 뿌리 길이(root length; D), 줄기의 인산 함량(Pi in shoot; E) 및 뿌리의 인산 함량(Pi in root; F)을 측정한 결과이다.
1 is a nitrogen (N), phosphoric acid (P), potassium (K), and iron (Fe) deficiency conditions of OsMYB9 gene expression pattern (A), rice ( Oryza sativa ) stem and root phosphate sufficient conditions (+P ) and the results shown phosphate deficiency conditions (-P) expression profile (B) and phosphate deficiency processing time OsMYB9 gene expression pattern (C) of the genes in OsMYB9.
Figure 2 is a SDS-PAGE results confirming the expression level of the GST tag protein and GST-OsMYB9 protein in E. coli transformants.
Figure 3 is a photograph showing the production process of OsMYB9 overexpressed transgenic rice plants. (A); Dongjin Rice Tooth, (B); Callus induction, (C) selection of embryogenic callus, (d); Callus finally selected, (e); Plant regeneration I and (f); Plant regeneration Ⅱ.
4 is a result of RNA blot analysis performed to confirm whether the OsMYB9 gene has been introduced and to select a transformant having a high expression level of the OsMYB9 gene.
Figure 5 is a wild-type rice (WT) plant and OsMYB9 gene overexpressing the transgenic rice plant ( OsMYB9 -OX ) is grown in phosphate sufficiency (High Pi; A) and phosphate deficiency (Low Pi; B) conditions, stem length (Shoot) length; C), root length (D), stem phosphate content (Pi in shoot; E) and root phosphate content (Pi in root; F).

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 벼 유래의 전사조절 단백질 OsMYB9(Oryza sativa MYB9)를 제공한다.In order to achieve the object of the present invention, the present invention provides a transcription control protein OsMYB9 ( Oryza sativa MYB9) derived from rice.

본 발명에 따른 OsMYB9 단백질의 범위는 벼(Oryza sativa)로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. The range of OsMYB9 protein according to the present invention includes a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 isolated from rice ( Oryza sativa ) and a functional equivalent of the protein.

본 발명에 있어서, 용어 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 인산 흡수 효율 증진 활성을 의미한다. 본 발명은 또한 OsMYB9 단백질의 단편, 유도체 및 유사체(analogues)를 포함한다. In the present invention, the term "functional equivalent" as a result of addition, substitution, or deletion of an amino acid, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% As described above, more preferably, it has a sequence homology of 95% or more, and refers to a protein having substantially the same physiological activity as the protein represented by SEQ ID NO: 2. "Substantially homogeneous physiological activity" refers to an activity that enhances the absorption efficiency of phosphate. The present invention also includes fragments, derivatives and analogs of OsMYB9 protein.

본 발명에 있어서, 용어 "단편", "유도체" 및 "유사체"는 본 발명의 OsMYB9 폴리펩티드와 실질적으로 같은 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 말한다.In the present invention, the terms "fragment", "derivative" and "analogue" refer to a polypeptide that has a biological function or activity substantially the same as the OsMYB9 polypeptide of the present invention.

또한, 본 발명은 상기 전사조절 단백질 OsMYB9(Oryza sativa MYB9)를 코딩하는 유전자를 제공한다.In addition, the present invention provides a gene encoding the transcription control protein OsMYB9 ( Oryza sativa MYB9).

본 발명의 유전자는 식물의 인산 흡수 효율을 증진시키는 특징이 있으며, OsMYB9 단백질을 코딩하는 게놈 DNA, cDNA 및 합성 DNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.The gene of the present invention is characterized by enhancing the phosphate absorption efficiency of plants, and includes both genomic DNA, cDNA and synthetic DNA encoding OsMYB9 protein. Preferably, the gene of the present invention may include a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. In addition, homologs of the base sequences are included within the scope of the present invention. Specifically, the gene includes a nucleotide sequence having a sequence homology of 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more, respectively, to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 can do. “% of sequence homology” to a polynucleotide is identified by comparing two optimally aligned sequences, and a portion of the polynucleotide sequence in the comparison region is a reference sequence (not including additions or deletions) to the optimal alignment of the two sequences. Comparison), or additions or deletions (ie, gaps).

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 OsMYB9 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명의 재조합 벡터에서, 상기 OsMYB9 유전자는 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다.In addition, the present invention provides a recombinant vector comprising the OsMYB9 gene according to the present invention. In the recombinant vector of the present invention, the OsMYB9 gene may preferably consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.

본 발명에 있어서, 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.In the present invention, the term “recombinant” refers to a cell in which a cell replicates a heterologous nucleic acid, expresses the nucleic acid, or expresses a peptide, a heterologous peptide or a protein encoded by a heterologous nucleic acid. Recombinant cells can express genes or gene segments not found in the natural form of the cells, either in sense or antisense form. Recombinant cells can also express genes found in natural cells, but the genes have been modified and reintroduced into the cell by artificial means.

본 발명에 있어서, 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. In the present invention, the term "vector" is used to refer to a DNA fragment(s), nucleic acid molecules that are delivered into a cell. Vectors replicate DNA and can be reproduced independently in host cells. The term "carrier" is often used interchangeably with "vector".

본 발명의 벡터는 전형적으로 발현 또는 클로닝을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들면, pLλ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보솜 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(Escherichia coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ 프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.Vectors of the invention can typically be constructed as vectors for expression or cloning. In addition, the vector of the present invention can be constructed using prokaryotic or eukaryotic cells as hosts. For example, when the vector of the present invention is an expression vector, and a prokaryotic cell is used as a host, a strong promoter (for example, pLλ promoter, trp promoter, lac promoter, T7 promoter, tac promoter, etc.) that can progress transcription ), a ribosome binding site for initiation of translation and a transcription/detox termination sequence. When Escherichia coli is used as a host cell, a promoter and an operator site of the E. coli tryptophan biosynthetic pathway, and a leftward promoter (pLλ promoter) of phage λ can be used as a regulatory site.

본 발명의 재조합 벡터에서, 상기 프로모터는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터 또는 히스톤 프로모터일 수 있으며, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. In the recombinant vector of the present invention, the promoters are suitable for transformation, and may be a CaMV 35S promoter, an actin promoter, a ubiquitin promoter, a pEMU promoter, a MAS promoter, or a histone promoter, preferably a CaMV 35S promoter. However, it is not limited thereto.

본 발명에 있어서, "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 항시성 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.In the present invention, the term "promoter" refers to the region of the DNA upstream from the structural gene and refers to a DNA molecule to which RNA polymerase binds to initiate transcription. "Plant promoter" is a promoter capable of initiating transcription in plant cells. A "constitutive promoter" is a promoter that is active under most environmental conditions and developmental status or cell differentiation. Constitutive promoters may be preferred in the present invention because selection of transformants can be made by various tissues at various stages. Thus, the constitutive promoter does not limit the possibility of selection.

본 발명의 재조합 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.The recombinant vector of the present invention can be constructed by methods well known to those skilled in the art. Such methods include in vitro recombinant DNA technology, DNA synthesis technology, and in vivo recombinant technology. The DNA sequence can be effectively linked to a suitable promoter in the expression vector to direct mRNA synthesis. In addition, the vector may include a ribosome binding site and a transcription terminator as a translation start site.

재조합 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 상기 마커 유전자는 항생제 내성 유전자(dominant drug resistance gene) 또는 영양요구 마커 유전자(auxotrophic marker gene)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The recombinant expression vector may preferably contain one or more selectable markers. The marker is a nucleic acid sequence having a property that can be selected by a chemical method, and all genes capable of distinguishing transformed cells from non-transformed cells correspond to this. The marker gene may be an antibiotic resistance gene or an axotrophic marker gene, but is not limited thereto.

또한, 본 발명의 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 원핵세포의 예로는, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다. In addition, a host cell transformed with the recombinant vector of the present invention is provided. As the host cell capable of continuously cloning and expressing the vector of the present invention stably, any host cell known in the art can be used. Examples of prokaryotic cells include E. coli JM109, E. coli BL21, and E. coli. Bacillus strains such as RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, and Salmonella typhimurium, Serratia marsensons, and various others Intestinal bacteria and strains such as Pseudomonas species.

본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모 (Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.When transforming the vector of the present invention into eukaryotic cells, as a host cell, yeast ( Saccharomyce cerevisiae ), insect cells, human cells (e.g., CHO cell line (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN and MDCK cell lines) and plant cells and the like can be used. The host cell is preferably a plant cell.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., 1983 J. Mol. Biol. 166, 557-580) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.The method for transporting the vector of the present invention into a host cell includes, when the host cell is a prokaryotic cell, a CaCl 2 method, one method (Hanahan, D., 1983 J. Mol. Biol. 166, 557-580) and electroporation. It can be carried out by a method or the like. In addition, when the host cell is a eukaryotic cell, the vector is injected into the host cell by microinjection, calcium phosphate precipitation, electroporation, liposome-mediated transfection, DEAE-dextran treatment, and gene balm treatment. Can be.

또한, 본 발명은 벼 유래의 전사조절 단백질 OsMYB9(Oryza sativa MYB9)을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsMYB9 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체의 인산 흡수 효율을 증가시키는 방법을 제공한다.In addition, the present invention transforms plant cells with a recombinant vector containing a gene encoding a transcription-derived protein OsMYB9 ( Oryza sativa MYB9) derived from rice and over-expresses the OsMYB9 gene, thereby phosphate absorption efficiency of plants compared to the wild type. It provides a way to increase.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 OsMYB9 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the OsMYB9 protein may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.

본 발명의 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 경우에 숙주세포는 바람직하게는 벼과(Poaceae) 식물세포일 수 있으며, 더 바람직하게는 벼 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 식물세포를 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같다.When transforming the vector of the present invention into a plant cell, the host cell may preferably be a plant cell of Poaceae , more preferably a rice cell, but is not limited thereto. The method for transforming the plant cells is as described above.

또한, 본 발명은 벼 유래의 전사조절 단백질 OsMYB9(Oryza sativa MYB9)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및In addition, the present invention comprises the steps of transforming plant cells with a recombinant vector containing a gene encoding a transcription control protein OsMYB9 ( Oryza sativa MYB9) derived from rice; And

상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 인산 흡수 효율이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다. Provided is a method for producing a transformed plant with increased phosphate absorption efficiency compared to a wild type comprising the step of re-differentiating the transformed plant from the transformed plant cell.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 OsMYB9 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the OsMYB9 protein may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.

상기 식물세포를 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같으며, 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.The method for transforming the plant cell is as described above, and the method for re-differentiating the transformed plant from the transformed plant cell can use any method known in the art.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 인산 흡수 효율이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.In addition, the present invention provides a transgenic plant with improved phosphate absorption efficiency prepared by the above method and seeds thereof.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명에 이용되는 식물은 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수 수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물 또는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 단자엽 식물일 수 있고, 더욱 바람직하게는 벼과(Poaceae) 식물일 수 있으며, 더 더욱 바람직하게는 벼(Oryza sativa)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the plant used in the present invention is a monocotyledonous plant such as rice, barley, wheat, rye, corn, sugar cane, oat, onion, or Arabidopsis thaliana, potato, eggplant, tobacco, pepper, tomato , Burdock, garland chrysanthemum, lettuce, bellflower, spinach, beetroot, sweet potato, celery, carrot, buttercup, parsley, cabbage, cabbage, radish, watermelon, melon, cucumber, pumpkin, gourd, strawberry, soybean, mung bean, kidney bean, pea, etc. It may be a dicotyledonous plant, preferably a monocotyledonous plant, more preferably a Poaceae plant, and even more preferably a rice plant ( Oryza sativa ), but is not limited thereto.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 벼 유래의 전사조절 단백질 OsMYB9(Oryza sativa MYB9)를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 인산 흡수 효율 증가용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for increasing the phosphate absorption efficiency of a plant comprising a gene encoding the transcription control protein OsMYB9 ( Oryza sativa MYB9) derived from rice as an active ingredient, consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 포함하며, 상기 유전자를 식물에 형질전환함으로써 식물체의 인산 흡수 효율을 증가시킬 수 있는 것이다.The composition includes a gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as an active ingredient or a recombinant vector containing the gene, and is capable of increasing the phosphate absorption efficiency of a plant by transforming the gene into a plant.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by examples. However, the following examples are merely illustrative of the present invention, and the contents of the present invention are not limited to the following examples.

실시예 1. 벼 유래의 전사조절 유전자(Example 1. A transcription control gene derived from rice ( OsMYB9OsMYB9 )의 분리)

본 발명에서는 우리나라 재배 품종인 동진벼(Oryza sativa cv. Dongjin)를 사용하였다. 동진벼의 잎에서 게놈 DNA를 분리하여 벼의 전체 유전체 염기서열을 토대로 벼 유래의 MYB-CC 타입 전사조절 유전자(OsMYB9)에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머(정방향 프라이머, 5'-CACCATGTATGAACCAAAGCC-3'(서열번호 3) 및 역방향 프라이머, 5'-TCAATCATCACTGCCTGAACC-3'(서열번호 4))를 제작하였으며, PCR 방법을 이용하여 유전자의 코딩 영역을 증폭하였다. 증폭된 산물은 pEntr 벡터에 클로닝한 후 염기서열 분석을 통해 유전자의 염기서열을 확인하였다. 인산결핍 조건에서 발현되는 전사조절 유전자인 OsMYB9는 기존에 밝혀지지 않은 새로운 유전자로 전체 990bp의 염기서열을 가지고 있으며, 329개의 아미노산을 코딩한다. OsMYB9 유전자의 cDNA 염기서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호 1 및 서열번호 2로 표기하였다. 본 발명에서 분리된 OsMYB9 유전자와, 기존에 보고되어진 MYB-CC의 OsPHR1 및 벼 유래의 OsPHR2 전사조절 유전자들 간의 상동성을 비교한 결과, 이들 유전자들 간에는 각각 59%, 54%의 상동성을 갖는 것으로 확인되었다(데이터 미제시).In the present invention, Dongjin rice ( Oryza sativa cv. Dongjin ), a cultivar of Korea, was used. Oligonucleotide primer (forward primer, 5'-CACCATGTATGAACCAAAGCC-3') (specific sequence number) specific to the MYB-CC type transcription control gene ( OsMYB9 ) derived from rice based on the whole genomic base sequence of rice by separating genomic DNA from the leaves of Dongjin rice 3) and reverse primer, 5'-TCAATCATCACTGCCTGAACC-3' (SEQ ID NO: 4)) were prepared, and the coding region of the gene was amplified using PCR method. After the amplified product was cloned into the pEntr vector, the nucleotide sequence of the gene was confirmed through sequencing. OsMYB9 , a transcriptional regulatory gene expressed under phosphate-deficient conditions, is a new gene that has not been previously identified. It has a base sequence of 990 bp in total and encodes 329 amino acids. The cDNA nucleotide sequence and amino acid sequence of the OsMYB9 gene are denoted by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively. As a result of comparing the homology between the OsMYB9 gene isolated in the present invention and the previously reported OsPHR1 and rice-derived OsPHR2 transcription control genes of MYB-CC, these genes had a homology of 59% and 54%, respectively. Was confirmed (data not shown).

실시예 2. 인산 결핍 조건에서 벼 식물체의 Example 2. Paddy plants under conditions of phosphoric acid deficiency OsMYB9OsMYB9 유전자의 발현 양상 Gene expression patterns

일반적으로 유사기능을 하는 유전자의 발현은 조직 특이적 또는 유도인자 특이적으로 조절되므로 분리된 전사조절 유전자의 발현 양상을 RNA 블롯 방법을 이용하여 분석하였다. 이때 OsMYB9 유전자 전사조절 유전자 특이적인 염기서열을 가진 프라이머를 프로브로 사용하였다.In general, since the expression of a gene having a similar function is regulated by tissue-specific or inducer-specific, the expression pattern of the isolated transcription control gene was analyzed using an RNA blot method. At this time, a primer having a specific nucleotide sequence of OsMYB9 gene transcription control gene was used as a probe.

동진벼 종자를 2주간 증류수에서 수경재배하고, 벼의 생육에 영향을 미치는 질소(0.25mM (NH4)2SO4, KNO3), 인산(0.0125mM KH2PO4), 칼륨(0.01mM KNO3) 및 철(0.01mM Fe-EDTA) 성분이 결핍된 호글랜드 용액(Hogland solution; 200mM Ca(NO3)2·4H2O, 2.5mM K2SO4, 2mM MgSO4·7H2O, 1.25mM KH2PO4, 9mM KCl, 0.25mM MnSO4, 0.25mM H3BO3, 0.25mM ZnSO4, 0.25mM CuSO4, 0.25mM Na2MoO4, 20mM Fe-Sequestrate 및 0.5mM K2SO4, pH 5.5)에서 1주일 동안 배양하였다. Nitrogen affects the growth of hydroponic cultivation, the rice seeds in the dongjinbyeo two weeks distilled water (0.25mM (NH 4) 2 SO 4, KNO 3), phosphoric acid (0.0125mM KH 2 PO 4), potassium (0.01mM KNO 3 ) And iron (0.01mM Fe-EDTA) component-deficient Hogland solution (200mM Ca(NO 3 ) 2 ·4H 2 O, 2.5mM K 2 SO 4 , 2mM MgSO 4 ·7H 2 O, 1.25mM KH 2 PO 4 , 9 mM KCl, 0.25 mM MnSO 4 , 0.25 mM H 3 BO 3 , 0.25 mM ZnSO 4 , 0.25 mM CuSO 4 , 0.25 mM Na 2 MoO 4 , 20 mM Fe-Sequestrate and 0.5 mM K 2 SO 4 , pH 5.5) for 1 week.

또한, 줄기 및 뿌리에 대한 인산 결핍 시간별 유전자의 발현 양상을 확인하기 위해 인산 충분 조건(1.25mM KH2PO4) 및 인산 결핍 조건(0.0125mM KH2PO4)으로 처리된 호글랜드 용액에서 각각 1주일 동안 배양한 후 줄기 및 뿌리 샘플을 수집하였으며, Trizol 시약(Sigma)을 이용하여 상기 수집된 줄기 및 뿌리 샘플에서 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA 10 ㎍을 각각 1.2%(w/v) 변성(denaturing) 포름알데하이드 아가로스 겔에 로딩하여 전기영동한 후, 나일론 막(Amersham)에 RNA를 부착시켰다. 상기 RNA가 부착된 나일론 막은 [32P] dCTP로 표지된 프로브와 함께 20%(w/v) SDS, 20×SSPE, 100 g/L PEG (8,000 mwt), 250 mg/L 헤파린 및 10 ml/L 청어 정자(Herring sperm) DNA(10 mg/ml)를 포함하는 용액과 함께 65℃에서 밤새 반응시켜 OsMYB9 유전자의 발현 양상을 확인하였다.In addition, in order to confirm the expression pattern of the phosphate deficiency time-dependent gene for the stem and root, 1 in each of the Hogland solution treated with a sufficient phosphate condition (1.25 mM KH 2 PO 4 ) and a phosphate deficiency condition (0.0125 mM KH 2 PO 4 ). After incubation for a week, stem and root samples were collected, and RNA was isolated from the collected stem and root samples using Trizol reagent (Sigma). 10 µg of the separated RNA was loaded onto a 1.2% (w/v) denaturing formaldehyde agarose gel and electrophoresed, and then RNA was attached to a nylon membrane (Amersham). The RNA-attached nylon membrane was [ 32 P] dCTP labeled with 20% (w/v) SDS, 20×SSPE, 100 g/L PEG (8,000 mwt), 250 mg/L heparin and 10 ml/ The expression pattern of the OsMYB9 gene was confirmed by reacting with a solution containing L herring sperm DNA (10 mg/ml) overnight at 65°C.

그 결과, 질소 또는 칼륨이 결핍된 경우에서는 OsMYB9 유전자가 발현되지 않고 인산과 철이 결핍된 경우에만 OsMYB9 유전자의 발현이 현저하게 증가되는 것을 관찰하였으며, 특히 인산이 결핍된 경우에 OsMYB9 유전자의 발현이 더 증가하는 것을 확인하였다(도 1A). 또한, 줄기와 뿌리 모두에서 인산 충분 조건에서는 OsMYB9 유전자의 발현 수준이 높지 않았으나, 인산 결핍 조건에서는 OsMYB9 유전자의 발현양이 증가된 것을 알 수 있었다(도 1B). 그리고, 인산 결핍 처리 시간별(0, 1, 3, 5 및 7일)로 OsMYB9 유전자 발현 수준을 줄기와 뿌리에서 확인한 결과, OsMYB9 유전자는 인산 결핍 초기부터 발현되기 시작하여 시간이 지남에 따라 발현량이 증가되는 것이 확인되었다(도 1C).As a result, when the nitrogen or potassium deficiency in was observed to be only significantly increased the expression of OsMYB9 gene if not OsMYB9 not gene is expressed phosphate and iron deficiency, particularly if phosphoric acid is deficient in more expression of the OsMYB9 gene It was confirmed to increase (Fig. 1A). In addition, the expression level of OsMYB9 gene was not high in both stalk and root conditions under sufficient phosphate, but it was found that the expression level of OsMYB9 gene was increased in phosphate deficiency condition (FIG. 1B ). And phosphate deficiency processing time (0, 1, 3, 5 and 7) as a result of confirming the OsMYB9 gene expression level in stems and roots, OsMYB9 genes increase the amount of expression over time and started to express from phosphate deficiency initial It was confirmed (Fig. 1C).

실시예 3. 벼 식물체의 Example 3. Rice plant OsMYB9OsMYB9 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용한 OsMYB9 단백질 발현 분석 OsMYB9 protein expression analysis using recombinant vector containing gene

OsMYB9 유전자를 pGEM-T easy 벡터에 클로닝하고 제한효소인 HindⅢ와 XhoI을 각각 처리하여 나타난 DNA 단편을 단백질 발현 벡터인 peT42a 벡터의 GST 태그의 하류에 연결하여 제조합 벡터를 제작하였다. 제조된 제조합 벡터로 대장균 BL21(DE3)을 형질전환한 후 IPTG(Isopropyl-β-D-thio-galactoside)를 1 mM이 되도록 첨가하고 37℃에서 3시간 동안 배양하여 단백질의 발현을 유도하였으며, SDS-PAGE 겔에서 전기영동하여 재조합 단백질의 발현 여부를 확인하였다. The OsMYB9 gene was cloned into the pGEM-T easy vector, and the DNA fragments shown by treating the restriction enzymes Hind III and Xho I, respectively, were linked downstream of the GST tag of the protein expression vector peT42a vector to prepare a preparation vector. After transforming E. coli BL21 (DE3) with the prepared vector, IPTG (Isopropyl-β-D-thio-galactoside) was added to 1 mM and cultured at 37° C. for 3 hours to induce protein expression. Electrophoresis was performed on the SDS-PAGE gel to confirm the expression of the recombinant protein.

그 결과, GST 태그 단백질과 OGST-sMYB9 단백질이 발현되는 것이 확인되었으며, 이를 통해 대장균 형질전환체에서의 목적 단백질인 OsMYB9 단백질이 성공적으로 발현됨을 확인하였다(도 2). As a result, it was confirmed that the GST tag protein and the OGST-sMYB9 protein were expressed, and through this, it was confirmed that the target protein OsMYB9 protein in E. coli transformants was successfully expressed (FIG. 2).

실시예Example 4. 4. OsMYB9OsMYB9 유전자를 과발현시킨 형질전환 벼 식물체의 인산 함량 분석 Analysis of phosphate content in transgenic rice plants overexpressing genes

OsMYB9 유전자를 과발현하는 형질전환 벼 식물체를 제작하기 위해 OsMYB9 유전자의 코딩 영역을 데스티네이션 벡터(destination vector; pH7WG2D,1)에 클로닝하여 OsMYB9 유전자가 강하게 발현하는 CaMV 35S 프로모터에 의해 조절되는 컨스트럭트(construct)를 만들었고, 삼친 교배(triparental mating) 방법으로 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) EHA105으로 옮겼다. 동진벼 캘러스에 컨스트럭트가 포함된 아그로박테리움 튜머파시엔스 EHA105를 사용하여 형질전환 식물체를 제작하였고(도 3), OsMYB9 유전자의 도입 여부와 OsMYB9 유전자의 발현량을 RNA 블랏 방법으로 확인한 후 발현량이 강한 형질전환체를 선발하였다(도 4).The coding region of the OsMYB9 gene to produce a transgenic rice plants overexpressing OsMYB9 gene destination vector; construct was cloned in (destination vector pH7WG2D, 1) is controlled by the CaMV 35S promoter which is OsMYB9 gene strongly expressed truck site ( It made a construct), samchin mating (triparental mating) method with Agrobacterium tyumeo Pacific Enschede (Agrobacterium tumefaciens ) EHA105. A transgenic plant was produced using Agrobacterium tumefaciens EHA105 containing a construct in Dongjin rice callus (FIG. 3), and the amount of expression after confirming whether the OsMYB9 gene was introduced and the amount of OsMYB9 gene was expressed by RNA blot method Strong transformants were selected (Figure 4).

형질전환 식물체로부터 수확한 종자 및 야생형(대조구) 종자를 2주간 수경재배한 후 인산결핍(0.0125 mM KH2PO4)과 인산충분(1.25 mM KH2PO4) 조건으로 1주간 처리하고 배양하면서 식물생육 상태를 비교·분석하였다(도 5A 및 5B). 야생형과 OsMYB9 유전자를 과발현시킨 형질전환 벼의 줄기 및 뿌리 길이를 측정한 결과, 인산충분 조건에서의 줄기 길이는 형질전환체에 비해 야생형에서 증가하였고 뿌리 길이는 야생형에 비해 형질전환체에서 증가하였으며, 인산결핍 조건에서의 줄기 길이는 야생형에 비해 형질전환체에서 증가하였고 뿌리 길이는 형질전환체에 비해 야생형에서 증가하였으나, 야생형과 형질전환체 간의 유의적 차이는 없었다(도 5C 및 5D). Seeds harvested from transgenic plants and wild-type (control) seeds were hydroponic for 2 weeks, then treated with phosphate deficiency (0.0125 mM KH 2 PO 4 ) and phosphate deficiency (1.25 mM KH 2 PO 4 ) for 1 week and cultured Growth status was compared and analyzed (FIGS. 5A and 5B). As a result of measuring the stem and root length of transgenic rice overexpressing the wild type and OsMYB9 gene, the stem length in phosphate- rich conditions was increased in the wild type compared to the transformant, and the root length was increased in the transformant compared to the wild type, In the phosphate-deficient condition, the stem length was increased in the transformant compared to the wild type, and the root length was increased in the wild type compared to the transformant, but there was no significant difference between the wild type and the transformant (FIGS. 5C and 5D ).

또한, 야생형과 OsMYB9 유전자를 과발현시킨 형질전환 벼의 줄기 및 뿌리의 인산 함량을 측정한 결과, 인산충분 및 인산결핍 조건 모두에서 과발현 형질전환체의 인산 함량이 야생형에 비해 30% 이상 증가된 것을 확인하였다(도 5E 및 5F).In addition, as a result of measuring the phosphate content of the stem and root of the transgenic rice overexpressing the wild-type and OsMYB9 gene, it was confirmed that the phosphate content of the over-expressing transformant was increased by 30% or more compared to the wild-type in both phosphate-rich and phosphate-deficient conditions. (Figs. 5E and 5F).

<110> Dong-A University Research Foundation For Industry-Academy Cooperation <120> OsMYB9 gene improving phosphate uptake efficiency in plant and uses thereof <130> PN18341 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 990 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atgtatgaac caaagccctt ctcaagcatt gtactagctc acaacgatcc agtttcccac 60 aatcaacaaa ttgaacgtat taacaacaat gtagtatcta atagtggtgg gaacagctca 120 aacagcaact ttgccgccag acagcgctta cggtggactg atgacctcca tgatcgtttt 180 gtggatgctg taacacagct tggtggaccc gacagggcaa ctccgaaggg aattcttaga 240 ataatgggtg ttcaagggtt gaccatctat catgtcaaaa gccatctgca aaaatatcgg 300 cttgctaaat acattccaga tcccacagct gatggtgcca agtctgacaa gaaagatctc 360 ggagatttgc ttgctgacat tgaaagctcc tcgggaatgg aaatagggga ggctttaaag 420 ttgcagatgg aggtgcaaaa gcggctacat gaacaattag aggtgcaaag gcagctacag 480 ctccggatag aagcccaagg aaggtacctc cagaagatca ttgaggagca gcagcggctc 540 agtggtgtgc tgggtgaatc aggcaagtta ggcgccctgg gaccagctcc aggggagcca 600 taccaggatt ccaacaaaac cgacccctcg accccggtac cgacttccga atccccaatc 660 cgcgacaagg ctggaagcgg cttgttcaag accatttctt cgcacgacga ctgccgcgag 720 cctttgacac cggactccag ctgccgtgcc ggctcccctt tggagagccc ccccagggct 780 agcaagagga tccgggtcag cagcgacatt gatcatcgtg ggaacaatga gttcccccct 840 cctctcaaag ttccggagcc aagttcaggt tcagatttcc gacaggaaag ctcagtgtta 900 ttatcatcca gcgcagtgca cttcgattct ttggagagcc tggatgcaga tgaaaatgtc 960 ttcaccaatg gttcaggcag tgatgattga 990 <210> 2 <211> 329 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Met Tyr Glu Pro Lys Pro Phe Ser Ser Ile Val Leu Ala His Asn Asp 1 5 10 15 Pro Val Ser His Asn Gln Gln Ile Glu Arg Ile Asn Asn Asn Val Val 20 25 30 Ser Asn Ser Gly Gly Asn Ser Ser Asn Ser Asn Phe Ala Ala Arg Gln 35 40 45 Arg Leu Arg Trp Thr Asp Asp Leu His Asp Arg Phe Val Asp Ala Val 50 55 60 Thr Gln Leu Gly Gly Pro Asp Arg Ala Thr Pro Lys Gly Ile Leu Arg 65 70 75 80 Ile Met Gly Val Gln Gly Leu Thr Ile Tyr His Val Lys Ser His Leu 85 90 95 Gln Lys Tyr Arg Leu Ala Lys Tyr Ile Pro Asp Pro Thr Ala Asp Gly 100 105 110 Ala Lys Ser Asp Lys Lys Asp Leu Gly Asp Leu Leu Ala Asp Ile Glu 115 120 125 Ser Ser Ser Gly Met Glu Ile Gly Glu Ala Leu Lys Leu Gln Met Glu 130 135 140 Val Gln Lys Arg Leu His Glu Gln Leu Glu Val Gln Arg Gln Leu Gln 145 150 155 160 Leu Arg Ile Glu Ala Gln Gly Arg Tyr Leu Gln Lys Ile Ile Glu Glu 165 170 175 Gln Gln Arg Leu Ser Gly Val Leu Gly Glu Ser Gly Lys Leu Gly Ala 180 185 190 Leu Gly Pro Ala Pro Gly Glu Pro Tyr Gln Asp Ser Asn Lys Thr Asp 195 200 205 Pro Ser Thr Pro Val Pro Thr Ser Glu Ser Pro Ile Arg Asp Lys Ala 210 215 220 Gly Ser Gly Leu Phe Lys Thr Ile Ser Ser His Asp Asp Cys Arg Glu 225 230 235 240 Pro Leu Thr Pro Asp Ser Ser Cys Arg Ala Gly Ser Pro Leu Glu Ser 245 250 255 Pro Pro Arg Ala Ser Lys Arg Ile Arg Val Ser Ser Asp Ile Asp His 260 265 270 Arg Gly Asn Asn Glu Phe Pro Pro Pro Leu Lys Val Pro Glu Pro Ser 275 280 285 Ser Gly Ser Asp Phe Arg Gln Glu Ser Ser Val Leu Leu Ser Ser Ser 290 295 300 Ala Val His Phe Asp Ser Leu Glu Ser Leu Asp Ala Asp Glu Asn Val 305 310 315 320 Phe Thr Asn Gly Ser Gly Ser Asp Asp 325 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 caccatgtat gaaccaaagc c 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tcaatcatca ctgcctgaac c 21 <110> Dong-A University Research Foundation For Industry-Academy Cooperation <120> OsMYB9 gene improving phosphate uptake efficiency in plant and uses thereof <130> PN18341 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 990 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atgtatgaac caaagccctt ctcaagcatt gtactagctc acaacgatcc agtttcccac 60 aatcaacaaa ttgaacgtat taacaacaat gtagtatcta atagtggtgg gaacagctca 120 aacagcaact ttgccgccag acagcgctta cggtggactg atgacctcca tgatcgtttt 180 gtggatgctg taacacagct tggtggaccc gacagggcaa ctccgaaggg aattcttaga 240 ataatgggtg ttcaagggtt gaccatctat catgtcaaaa gccatctgca aaaatatcgg 300 cttgctaaat acattccaga tcccacagct gatggtgcca agtctgacaa gaaagatctc 360 ggagatttgc ttgctgacat tgaaagctcc tcgggaatgg aaatagggga ggctttaaag 420 ttgcagatgg 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60 Thr Gln Leu Gly Gly Pro Asp Arg Ala Thr Pro Lys Gly Ile Leu Arg 65 70 75 80 Ile Met Gly Val Gln Gly Leu Thr Ile Tyr His Val Lys Ser His Leu 85 90 95 Gln Lys Tyr Arg Leu Ala Lys Tyr Ile Pro Asp Pro Thr Ala Asp Gly 100 105 110 Ala Lys Ser Asp Lys Lys Asp Leu Gly Asp Leu Leu Ala Asp Ile Glu 115 120 125 Ser Ser Ser Gly Met Glu Ile Gly Glu Ala Leu Lys Leu Gln Met Glu 130 135 140 Val Gln Lys Arg Leu His Glu Gln Leu Glu Val Gln Arg Gln Leu Gln 145 150 155 160 Leu Arg Ile Glu Ala Gln Gly Arg Tyr Leu Gln Lys Ile Ile Glu Glu 165 170 175 Gln Gln Arg Leu Ser Gly Val Leu Gly Glu Ser Gly Lys Leu Gly Ala 180 185 190 Leu Gly Pro Ala Pro Gly Glu Pro Tyr Gln Asp Ser Asn Lys Thr Asp 195 200 205 Pro Ser Thr Pro Val Pro Thr Ser Glu Ser Pro Ile Arg Asp Lys Ala 210 215 220 Gly Ser Gly Leu Phe Lys Thr Ile Ser Ser His Asp Asp Cys Arg Glu 225 230 235 240 Pro Leu Thr Pro Asp Ser Ser Cys Arg Ala Gly Ser Pro Leu Glu Ser 245 250 255 Pro Pro Arg Ala Ser Lys Arg Ile Arg Val Ser Ser Asp Ile Asp His 260 265 270 Arg Gly Asn Asn Glu Phe Pro Pro Pro Leu Lys Val Pro Glu Pro Ser 275 280 285 Ser Gly Ser Asp Phe Arg Gln Glu Ser Ser Val Leu Leu Ser Ser Ser 290 295 300 Ala Val His Phe Asp Ser Leu Glu Ser Leu Asp Ala Asp Glu Asn Val 305 310 315 320 Phe Thr Asn Gly Ser Gly Ser Asp Asp 325 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 caccatgtat gaaccaaagc c 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tcaatcatca ctgcctgaac c 21

Claims (13)

삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 전사조절 단백질 OsMYB9(Oryza sativa MYB9)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 벼 식물세포를 형질전환시켜 OsMYB9 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 벼 식물체의 인산 흡수 효율을 증가시키는 방법.Transcriptional control of a rice plant origin comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 protein OsMYB9 (Oryza sativa MYB9) the by transforming a rice plant cell with a recombinant vector comprising a gene encoding the rice compared to the wild type comprises the step of overexpressing OsMYB9 gene Method for increasing the efficiency of absorption of phosphoric acid in plants. 삭제delete 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 전사조절 단백질 OsMYB9(Oryza sativa MYB9)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 벼 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 벼 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 인산 흡수 효율이 증가된 형질전환 벼 식물체의 제조 방법.Transforming rice plant cells with a recombinant vector comprising a gene encoding a transcription-derived protein OsMYB9 ( Oryza sativa MYB9) derived from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; And re-differentiating transformed plants from the transformed rice plant cells. 삭제delete 제8항의 방법에 의해 제조된 인산 흡수 효율이 증가된 형질전환 벼 식물체.A transgenic rice plant with increased phosphate absorption efficiency prepared by the method of claim 8. 삭제delete 제10항에 따른 벼 식물체의 형질전환된 종자.A transformed seed of the rice plant according to claim 10. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 벼 유래의 전사조절 단백질 OsMYB9(Oryza sativa MYB9)를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 벼 식물체의 인산 흡수 효율 증가용 조성물.A composition for increasing the phosphate absorption efficiency of a rice plant comprising a gene encoding the transcription-regulating protein OsMYB9 ( Oryza sativa MYB9) derived from rice, consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, as an active ingredient.
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GenBank: AK071731.1
Plant Physiology, April 2008, Vol. 146, p. 1673-1686
Zhou J. et al, Plant Physiology, 146:pp.1673-1686 (2008. 4)*

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