KR102118509B1 - method for the concentration of extracellular vesicles using super absorbent polymer - Google Patents

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Abstract

본 발명은 고흡수성 폴리머(Super absorbent polymer bead, SAP bead)을 이용한 세포 밖 소포체의 농축방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 고흡수성 수지를 이용하여 세포 배양액이나 임상 시료에서 세포 밖 소포체를 짧은 시간 안에, 단일 과정으로 간단하게 농축시킬 수 있다.The present invention relates to a method for concentrating extracellular vesicles using a super absorbent polymer bead (SAP bead), and more specifically, using a super absorbent polymer in a short time within the cell culture medium or clinical sample. , Can be simply concentrated in a single process.

Description

고흡습성 폴리머를 이용한 세포 밖 소포체의 농축방법{method for the concentration of extracellular vesicles using super absorbent polymer}Method for the concentration of extracellular vesicles using super absorbent polymers

본 발명은 고흡수성 폴리머(Super absorbent polymer, SAP)을 이용한 세포 밖 소포체의 농축방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 고흡수성 수지를 이용하여 세포 배양액이나 임상 시료에서 세포 밖 소포체를 짧은 시간 안에, 단일 과정으로 간단하게 농축시킬 수 있다.The present invention relates to a method for concentrating extracellular vesicles using a super absorbent polymer (SAP), and more specifically, using a super absorbent polymer, in a short time, extracellular vesicles in a cell culture solution or a clinical sample. The process can be simply concentrated.

세포 밖 소포체(extracellular vesicle)은 적혈구 세포의 배양액에서 세포막 수용체를 함유한 미세수포로, 1980년대 중반에 처음 발견되었다. 세포 밖 소포체는 유래된 세포에 따라 덱소솜(dexosome, 수지상세포에서 유래), 온코솜(oncosome, 암세포에서 유래), 프로타솜(prostasome, 전립선세포에서 유래), 카르디오솜(cardiosome, 심근세포에서 유래) 등으로 불리며, 세포에서 만들어지는 방법에 따라 엑소솜(exosome), 엑토솜(ectosome), 미세수포(microvesicle), 세포자멸체(apoptotic body) 같은 여러 이름으로 불려진다. 이들은 유래되는 세포나 세포내 소기관에 따라 다양한 표지 단백질을 포함하고 있고, 다양한 명칭의 문제점으로 인해 최근에는 세포 밖 소포체로 통칭하도록 권장하고 있다.Extracellular vesicles, extracellular vesicles, are microvesicles containing cell membrane receptors in the culture of red blood cells, first discovered in the mid-1980s. Extracellular endoplasmic reticulum may be derived from dexosomes (derived from dendritic cells), oncosomes (from cancer cells), prostasomes (from prostate cells), cardiosomes (cardiosomes) Origin), and is called by various names such as exosome, ectosome, microvesicle, and apoptotic body depending on the method made in the cell. These contain various labeled proteins depending on the cell or intracellular organelle from which they are derived, and have recently been recommended to be referred to as extracellular vesicles due to various names.

이러한 세포 밖 소포체는 DNA, 지질, 단백질, mRNA, microRNA 등을 함유하고, 특히 자신이 유래한 세포의 특징적인 단백질이나 RNA 등을 가지고 있어, 생물학적 기능들이 완전히 특정되지는 않았지만 다양한 진단 및 치료적 적용에 활용가능할 것이라 예상되고 있다.These extracellular vesicles contain DNA, lipids, proteins, mRNA, microRNA, etc., and in particular, have specific proteins or RNAs of the cells from which they are derived, and although biological functions are not completely specified, various diagnostic and therapeutic applications It is expected to be usable.

상기 세포 밖 소포체들은 통상적으로 초원심분리(ultra centrifugation), 유세포 분석(flow cytometry), 여과, 크기배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 장 흐름 분획(field flow fractionation) 및 중합체 침전법(polymer base precipitation)과 같은 기술들에 의해 정제된다. 상술한 방법들은 전처리를 통한 분리 및 추출 과정이 필요하고, 크기배제 크로마토그래피와 같은 방법의 경우에는 최종농도가 낮아지는 문제가 존재한다. 이에 세포 밖 소포체을 활용하기 위해 효율적이고 간단한 세포 밖 소포체 농축법에 대한 필요성이 대두되었다. 또한 세포 밖 소포체의 농축방법을 개발하기 위해서는 우선 세포 밖 소포체의 기능에는 영향을 미치지 않으면서, 별다른 장치의 도움없이 단일 과정만으로 세포 밖 소포체를 농축해야하는데, 기존의 세포 배양액 또는 분리된 세포 밖 소포체 수용액에서 세포 밖 소포체가 차지하는 비율은 현저히 낮기 때문에 기존에 사용해오던 농축 방법만으로 개발에 한계가 있다.The extracellular vesicles are usually ultra centrifugation, flow cytometry, filtration, size exclusion chromatography, field flow fractionation and polymer base precipitation ). The above-described methods require separation and extraction through pretreatment, and in the case of methods such as size exclusion chromatography, there is a problem that the final concentration is lowered. Accordingly, the need for an efficient and simple extracellular vesicle concentration method has emerged to utilize the extracellular vesicles. In addition, in order to develop a method for concentrating extracellular vesicles, it is necessary to first concentrate the extracellular vesicles in a single process without the aid of a special device without affecting the function of the extracellular vesicles. Since the ratio of extracellular vesicles in aqueous solution is remarkably low, there is a limit to development using only the concentration method that has been used.

상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 이미 알려진 종래기술에 해당함을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안 될 것이다.The above descriptions as background arts are only for improving understanding of the background of the present invention, and should not be accepted as acknowledging that they correspond to the prior arts already known to those skilled in the art.

특허문헌 1. 대한민국 등록특허공보 제10-1875594호Patent Literature 1. Korea Registered Patent Publication No. 10-1875594

본 발명자들은 낮은 농도로 세포 밖 소포체가 포함되어 있는 세포 배양액으로부터 세포 밖 소포체를 고농도가 되도록 쉽고 빠르면서 효율적으로 농축할 수 있는 새로운 방법을 발굴하고자 예의 노력하였다. 그 결과, 고흡수성 폴리머를 활용한 농축 전략을 고안하였고, 이를 이용하여 세포 밖 소포체를 포함하는 수용액에서의 세포 밖 소포체 농도 변화를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.The present inventors tried diligently to find a new method that can easily and quickly and efficiently concentrate the extracellular vesicles to a high concentration from a cell culture solution containing extracellular vesicles at a low concentration. As a result, a concentration strategy using a superabsorbent polymer was devised, and the present invention was completed by confirming the change in the concentration of the extracellular vesicles in an aqueous solution containing the extracellular vesicles.

따라서 본 발명의 목적은 고흡수성 폴리머를 활용하여 세포 밖 소포체를 포함하는 용액에서 세포 밖 소포체를 효율적으로 농축시킬 수 있는 방법을 제공하는데 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a method capable of efficiently concentrating extracellular vesicles in a solution containing extracellular vesicles by utilizing a super absorbent polymer.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 세포 밖 소포체를 포함하는 용액에 고흡수성 폴리머를 혼합하여, 세포 밖 소포체를 농축하는 단계;를 포함하는 세포 밖 소포체의 농축방법을 제공한다.According to an aspect of the present invention, the present invention provides a method for concentrating extracellular vesicles comprising; mixing a superabsorbent polymer in a solution containing extracellular vesicles to concentrate the extracellular vesicles.

세포 밖 소포체는 대부분의 세포에 존재하는 30~1000 ㎚ 크기를 갖는 작은 소포체(membrane vesicle)이다. 이는 혈액, 소변 등 체액에 존재하며 특히, 엑소좀 내부에는 그 세포에서 유래된 다양한 종류의 단백질, 유전물질(DNA, mRNA, miRNA), 지질 등을 포함한다. 세포 밖 소포체는 약한 음성의 표면 전하를 띄고 있다. 세포 밖 소포체는 다양한 연구를 통해 여러 질병의 진단과 치료제로써의 활용가능성이 밝혀지고 있어, 해당 분야에서 점차 중요성이 높아지고 있는 실정이다.Extracellular vesicles are small vesicles with a size of 30-1000 nm present in most cells. It is present in body fluids such as blood and urine, and in particular, exosomes contain various kinds of proteins, genetic materials (DNA, mRNA, miRNA), lipids, etc. derived from the cells. Extracellular vesicles carry a weak negative surface charge. Extracellular endoplasmic reticulum has been found to be useful as a diagnostic and therapeutic agent for various diseases through various studies, and thus, its importance is gradually increasing in the field.

현재, 생물학적 시료로부터 세포 밖 소포체를 분리하는 다양한 기술들이 존재하나, 이로부터 분리된 세포 밖 소포체 용액은 낮은 농도의 세포 밖 소포체를 포함하고 있어, 추가적인 정제 및 농축과정이 필수적이다.Currently, there are various techniques for separating extracellular vesicles from biological samples, but the extracellular vesicle solution isolated therefrom contains low concentrations of extracellular vesicles, which requires further purification and concentration.

허나 저농도의 세포 밖 소포체 용액을 간단하고 빠르며 효율적으로 고농축시킬 수 있는 농축방법으로는 초원심분리, 유세포 분석, 여과, 크로마토그래프와 같이 장비나 장치가 필요하고, 복잡하며 시간이 오래 걸리고, 정제하는 과정에서 오히려 농도가 낮아지게 되므로, 새로운 농축기술의 개발이 절실히 요구되고 있다. 이에 고흡수성 폴리머를 활용하여 상술한 문제점을 해결하고자 노력하였고, 그 결과 본 발명을 완성하기에 이르렀다.However, a simple, fast and efficient high concentration of extracellular endoplasmic reticulum solution requires equipment or devices such as ultracentrifugation, flow cytometry, filtration, and chromatograph, and is complicated, time consuming, and purified. Since the concentration is lowered in the process, the development of new concentration technology is urgently required. Accordingly, efforts have been made to solve the above-mentioned problems by utilizing a super absorbent polymer, and as a result, the present invention has been completed.

본 발명의 일 측면은 세포 밖 소포체를 포함하는 용액에 고흡수성 폴리머를 혼합하여, 세포 밖 소포체를 농축하는 단계;를 포함하는 세포 밖 소포체의 농축방법에 관한 것이다.One aspect of the present invention relates to a method for concentrating extracellular vesicles comprising; mixing a superabsorbent polymer with a solution containing extracellular vesicles to concentrate the extracellular vesicles.

본 발명은 세포 밖 소포체의 농축을 위한 것으로, 생물학적 시료로부터 세포 밖 소포체 분리용 키트 또는 종래의 방법을 통해 세포 밖 소포체를 분리한 후, 이를 분석하거나 사용하기 위해 원심분리, 한외여과 등을 이용하여 농축하는 기존의 방법들과 달리, 소요시간이 적고 별도의 장비나 장치 및 기술이 요구되지 않으면서도 효율적인 고농도 세포 밖 소포체를 얻기 위한 방법이다.The present invention is for the concentration of extracellular vesicles, and after separating the extracellular vesicles from a biological sample through a kit for extracellular vesicles or a conventional method, centrifugation, ultrafiltration, etc. are used to analyze or use it. Unlike conventional methods of concentrating, it is a method for obtaining efficient high-concentration extracellular vesicles with less time required and without requiring additional equipment, devices, and technologies.

따라서 상기 세포 밖 소포체를 포함하는 용액은 생물학적 시료로부터 세포 밖 소포체 분리용 키트를 사용하여 얻어진 저농도의 세포 밖 소포체를 포함하는 용액일 수 있다. Therefore, the solution containing the extracellular vesicles may be a solution containing a low concentration of extracellular vesicles obtained using a kit for separating extracellular vesicles from a biological sample.

상기 세포 밖 소포체 분리용 키트로는 세포 배양액으로부터 세포 밖 소포체를 분리하는데 중점이 맞춰진 제품이면 특별히 제한되지 않으며, 일 예로 Exoquick, Exo-spin 등 세포 밖 소포체 분리용 키트들일 수 있다.The kit for separating extracellular vesicles is not particularly limited as long as it is a product focused on separating extracellular vesicles from the cell culture medium, and for example, kits for separating extracellular vesicles such as Exoquick and Exo-spin.

상기 생물학적 시료는 액체 중에 세포 밖 소포체를 함유하거나 함유할 가능성이 있는 것이라면 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 원핵세포, 진핵세포, 박테리아, 진균, 효모, 줄기세포 및 식물, 동물로부터 분리된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 배양한 배양액이거나, 혈액, 타액, 소변, 유즙, 양수, 복수 등의 체액 또는 이를 배양한 배양액일 수 있다.The biological sample is not particularly limited as long as it contains or is likely to contain extracellular vesicles in the liquid, but is preferably composed of prokaryotic cells, eukaryotic cells, bacteria, fungi, yeast, stem cells and cells isolated from plants and animals. It may be a culture medium in which any one or more selected from the group is cultured, or a body fluid such as blood, saliva, urine, milk, amniotic fluid, ascites, or a culture medium in which it is cultured.

상기 세포 밖 소포체는 고세균(Archaea), 원핵생물(Prokarya) 또는 진핵생물(Eukarya)의 세포로부터 유래한 생체 나노입자를 통칭하며, 엑소좀(exosome), 아그로좀(argosomes), 덱소좀(dexosomes), 엑토좀(ectosomes), 엑소베지클(exovesicle), 온코좀(oncosome), 프로미노좀(prominosome), 프로스타좀(prostasome), 톨레로좀(tolerosome), 미세입자(microparticle), 미세소포(microvesicle), 나노소포(nanovesicle), 수포성 소포(blebbing vesicle), 출아성 소포(budding vesicle), 세포밖 소포체-유사 소포(exosome-like vesicle), 매트릭스 소포(matrix vesicle), 막 소포(membrane vesicle), 탈피성 소포(shedding vesicle), 막 입자(membrane particle), 탈피성 미세소포(shedding microvesicle), 막 수포(membrane bleb), 에피디디모좀(epididimosome), 프로미니노좀(promininosome), 텍소좀(texosome) 또는 아키오좀(archeosome)을 포함할 수 있고, 바람직하게는 엑소좀(exosome), 미세소포(microvesicle) 및 미세입자(microparticle)일 수 있고, 가장 바람직하게는 엑소좀(exosome)일 수 있다.The extracellular endoplasmic reticulum refers to biological nanoparticles derived from cells of archaea, prokarya, or eukarya, and exosomes, agrosomes, and dexosomes , Ectosomes, exovesicles, oncosomes, prominosomes, prostasomes, tolerosomes, microparticles, microvesicles microvesicles, nanovesicles, blebing vesicles, budding vesicles, extracellular-like vesicles, matrix vesicles, membrane vesicles, membrane vesicles ), shedding vesicles, membrane particles, shedding microvesicles, membrane blebs, epididimosomes, promininosomes, texososomes texosome) or achiosomes (archeosomes), preferably exosomes (exosomes), microvesicles (microvesicles) and microparticles (microparticles), and most preferably exosomes (exosomes). .

상기 고흡수성 폴리머(SAP)는 자기 무게보다 수십배에서 수백 배(최대 300배)까지의 물을 흡수하는 수지로, 재료 자체가 물을 빨아들이므로 탈지면이나 무명천 같은 것보다 흡수량이 많으며 웬만한 압력에는 물을 방출하지 않아, 유아용, 성인용 및 동물용 기저귀에 가장 많이 사용되고 있다. The super absorbent polymer (SAP) is a resin that absorbs water from tens to hundreds of times (up to 300 times) than its own weight, so the material itself sucks water, so it absorbs more than cotton wool or cotton cloth, and at moderate pressure Because it does not release, it is most used in diapers for infants, adults and animals.

상기 고흡수성 폴리머는 이동통로 크기(water channel size)가 2.6 내지 5 ㎚이다. 이에 반해 본 발명에서 농축하고자 하는 대상인 세포 밖 소포체 바람직하게는 엑소좀의 평균 직경은 10~200 ㎚인 것으로 알려져 있고, 후술하는 실험예에서 엑소좀의 평균직경이 약 80 ㎚인 것을 확인하였는 바, 세포 밖 소포체는 고흡수성 폴리머(SAP)의 기공 내로 유입되지 않고, 외부에 잔존할 것으로 예상되며, 이는 후술하는 실험예를 통해서도 확인할 수 있다.The superabsorbent polymer has a water channel size of 2.6 to 5 nm. On the other hand, in the present invention, it is known that the average diameter of the extracellular vesicles to be concentrated in the present invention, preferably exosomes is 10 to 200 nm, and in the experimental examples described below, it was confirmed that the average diameter of the exosomes is about 80 nm. The extracellular vesicles do not flow into the pores of the superabsorbent polymer (SAP), and are expected to remain outside, which can also be confirmed through experimental examples described later.

게다가 고흡수성 폴리머(SAP)가 물을 흡수하는 원리는 물리적 원리인 가교들이 이루고 있는 water channel의 모세관현상과 화학적 원리인 가교 사이사이에 갇혀있는 나트륨 이온의 전기적 인력에 의하여 물을 흡수하게 되는 2가지 원리가 있다. 따라서 흡수할 용액의 전해질 이온의 강도가 작으며, pH가 5~11일 경우 용액의 흡수가 잘 된다. 따라서, 본 발명에서의 세포 밖 소포체를 포함하는 용액이나 여기에 더 첨가될 수 있는 용매는 pH 7 내지 9의 것이면 특별히 이에 제한되지 않는다 예를 들어 상기 용매로는 정제수, 예를 들어 pH 7.0 ∼ 8.0, 바람직하게는 pH 7.2 ∼ 7.6 에 완충 작용을 갖는 완충액(예를 들어 PBS, TBS, HBS 등) 을 들 수 있다. 또, 이들 완충액 중의 완충제 농도로는, 통상 5.0 ∼ 50 mM, 바람직하게는 10 ∼ 30 mM 의 범위로부터 적절히 선택되고, NaCl 농도는 통상 100 ∼ 200 mM, 바람직하게는 140 ∼ 160 mM 의 범위로부터 적절히 선택될 수 있다. 전해질 이온의 강도와 pH를 고려하면 PBS 완충액(pH 7.4)을 사용하는 것이 가장 바람직하다.In addition, the principle of superabsorbent polymer (SAP) to absorb water is to absorb water by the electric attraction of sodium ions trapped between the capillary phenomenon of the water channel formed by the crosslinking, which is a physical principle, and the crosslinking, which is a chemical principle. There is a principle. Therefore, the strength of the electrolyte ions of the solution to be absorbed is small, and when the pH is 5 to 11, the solution is well absorbed. Therefore, the solution containing the extracellular vesicles in the present invention or a solvent that can be further added thereto is not particularly limited as long as it has a pH of 7 to 9. For example, the solvent includes purified water, for example, pH 7.0 to 8.0 , Preferably, a buffer (for example, PBS, TBS, HBS, etc.) having a buffering action at pH 7.2 to 7.6 is mentioned. Moreover, the buffer concentration in these buffers is usually suitably selected from 5.0 to 50 mM, preferably from 10 to 30 mM, and the NaCl concentration is usually from 100 to 200 mM, preferably from 140 to 160 mM. Can be selected. Considering the strength and pH of the electrolyte ions, it is most preferable to use PBS buffer (pH 7.4).

상기 고흡수성 폴리머(SAP : super absorbed polymer)는 통상 백색의 분말 또는 구형의 비드이고, 물을 흡수하고 팽윤되어 겔화되는 성질을 갖고 있다. 상기 전분(starch)에 아크릴로니트릴(acrylonitrile), 아크릴산(acrylic acid), 아크릴아미드(acrylamide) 또는 메타크릴레이트(methacrylate)의 모노머를 공중합시킨 전분계 고분자; 카르복시메틸셀룰로오스(CMC)에 상기의 모노머를 공중합시킨 셀룰로오스계 고분자; 및 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol)-메타아크릴산(methacrylic acid) 블록공중합체, 스티렌(stryene)-무수말레인산(maleic anhydride) 공중합체, 폴리아크릴아미드계(polyacryl amide) 또는 폴리옥시에틸렌계(polyoxyethylene)를 포함하는 합성수지계 고분자;로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 것일 수 있다. The super absorbent polymer (SAP) is usually a white powder or a spherical bead and absorbs water and swells and gels. A starch-based polymer obtained by copolymerizing the starch with monomers of acrylonitrile, acrylic acid, acrylamide or methacrylate; A cellulose-based polymer obtained by copolymerizing the above monomer with carboxymethyl cellulose (CMC); And polyvinyl alcohol-methacrylic acid block copolymer, styrene-maleic anhydride copolymer, polyacryl amide or polyoxyethylene. It may be any one selected from the group consisting of; synthetic resin-based polymer containing.

상기 고흡수성 폴리머의 일예로는 폴리아크릴 아마이드, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리에틸렌 옥사이드, 젤라틴, 폴리사카라이드, 셀룰로오스 또는 이의 유도체, 및 키토산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 것일 수 있고, 바람직하게는 폴리메타크릴산 또는 폴리에틸렌옥사이드일 수 있다.Examples of the superabsorbent polymer may be any one selected from the group consisting of polyacrylamide, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polyethylene oxide, gelatin, polysaccharide, cellulose or derivatives thereof, and chitosan, It may be polymethacrylic acid or polyethylene oxide.

본 발명에서는 입자크기가 1 내지 2 ㎜인 것을 사용하였고, 담지효율(expansion coefficient, g/g, D.I. water)이 자체 중량 대비 100~250배에 이르는 "고흡수성 수지"를 상아사이언스로부터 구입하여 사용하였다. 상기 고흡수성 폴리머는 0~100℃의 범위에서 빠르게 물을 흡수하며 팽윤겔이 된 후에도 외부의 압력 등에 의해 쉽게 물을 방출하지 않는 특성을 가진다. 또한 물을 흡수한 후, 송풍, 가열 등의 간단한 조작에 의해 쉽게 고체상의 고흡수성 고분자를 회수하여 재사용할 수 있다.In the present invention, a particle size of 1 to 2 mm was used, and a “super absorbent polymer” having an expansion coefficient (expansion coefficient, g/g, DI water) of 100 to 250 times its own weight was purchased from Ivory Science and used. Did. The superabsorbent polymer rapidly absorbs water in a range of 0 to 100°C and does not easily release water due to external pressure even after it becomes a swelling gel. In addition, after absorbing water, a solid superabsorbent polymer can be easily recovered and reused by simple manipulation such as blowing and heating.

본 발명의 농축방법은 세포 밖 소포체를 분리하고, 이를 농축하는 과정에 적용하고자 한 것으로, 세포 밖 소포체를 농축하기 위해서는 세포 밖 소포체를 포함하는 용액 1 중량부에 대하여 고흡수성 폴리머가 0.05 내지 0.5 중량부 혼합될 수 있고, 더욱 바람직하게는 0.09 내지 0.2 중량부로 혼합될 수 있으며, 가장 바람직하게는 0.12 중량부일 수 있다.The concentration method of the present invention is intended to be applied to the process of separating the extracellular vesicles, and concentrating the extracellular vesicles, in order to concentrate the extracellular vesicles, the superabsorbent polymer is 0.05 to 0.5 weight per 1 part by weight of the solution containing the extracellular vesicles It may be admixed, more preferably 0.09 to 0.2 parts by weight, and most preferably 0.12 parts by weight.

만약 세포 밖 소포체를 포함하는 용액 1 중량부(약 220㎎)에 대하여 고흡수성 폴리머가 0.09 중량부(3개 비드 약 19.9㎎) 미만이면 충분히 농축되지 못해 여러 단계로 농축을 진행해야 하므로, 농축시간이 길어지고 세포 밖 소포체의 유실과 활성이 저하되는 등의 문제가 발생한다. 세포 밖 소포체를 포함하는 용액 1 중량부(약 220㎎)에 대하여 고흡수성 폴리머가 0.2 중량부(7개 비드 약 45.8㎎)를 초과하면 농축이 과도하게 이루어져 고흡수성 폴리머와 세포 밖 소포체의 분리가 용이하지 않아, 농축된 세포 밖 소포체의 활용이 어려워지는 문제가 있다. If the superabsorbent polymer is less than 0.09 parts by weight (about 19.9 mg of 3 beads) per 1 part by weight of the solution containing extracellular vesicles (about 220 mg), concentration cannot be sufficiently concentrated, so concentration must be performed in several steps. Problems such as lengthening and loss of extracellular vesicles and decreased activity occur. When the superabsorbent polymer exceeds 0.2 parts by weight (approximately 45.8 mg of 7 beads) with respect to 1 part by weight of the solution containing the extracellular vesicles (about 220 mg), concentration is excessive and separation of the superabsorbent polymer from the extracellular vesicles It is not easy, and there is a problem that it is difficult to utilize concentrated extracellular vesicles.

또한 상기 고흡수성 폴리머는 water channel의 크기가 세포 밖 소포체의 크기인 30~1000 ㎚보다 작고, 흡습성이 고흡수성 폴리머 중량의 10배 이상 흡수가능한 것이면 특별히 이에 제한되지 않는다. 고흡수성 폴리머는 인체에 대하여 독성이 없으므로, 생체물질에 대한 사용에 제한되지 않는다.In addition, the superabsorbent polymer is not particularly limited as long as the size of the water channel is less than 30-1000 nm, which is the size of the extracellular vesicles, and the hygroscopicity is capable of absorbing 10 times or more of the superabsorbent polymer weight. Since the superabsorbent polymer is not toxic to the human body, it is not limited to use for biomaterials.

또한 상기 고흡수성 폴리머는 평균 입경이 작을수록 흡수 효율이 좋아지는 장점이 있으나, 과도하게 평균입경이 작아 가루 형태인 것은 너무 과도하게 농축되므로, 고흡수성 폴리머와 세포 밖 소포체의 분리가 용이하지 않아, 농축된 세포 밖 소포체의 활용이 어려워지는 단점이 발생할 수 있다.In addition, the superabsorbent polymer has the advantage that the smaller the average particle diameter is, the better the absorption efficiency is, but the excessively small average particle diameter is so excessively concentrated that the superabsorbent polymer and the extracellular vesicles are not easily separated and concentrated. A disadvantage may arise that makes it difficult to utilize extracellular vesicles.

따라서, 고흡수성 수지가 비드형태인 것이 바람직하고, 하나당 중량이 2~40 ㎎, 더 바람직하게는 5~10 ㎎일 수 있다.Therefore, it is preferable that the superabsorbent polymer is in the form of beads, and the weight per one may be 2 to 40 mg, more preferably 5 to 10 mg.

본 발명의 농축방법을 이용하여 세포 밖 소포체를 농축할 경우에는 정량의 고흡수성 폴리머를 혼합하는 10 내지 30 분의 단일 공정만으로 0.99~1.3 x 1010 농도까지 농축이 가능하며, 농축률(%)은 최대 719 ~ 814%인 것으로 확인되었다. 즉, 상술한 조건으로 농축공정을 진행한다면 수차례 반복하여 농축을 진행하거나 농축 시간을 30 분 이상 배분하지 않아도 단일 공정으로 현저히 높은 농축률을 얻을 수 있다.When the extracellular vesicles are concentrated using the concentration method of the present invention, concentration can be achieved to a concentration of 0.99 to 1.3 x 10 10 in only a single process of 10 to 30 minutes for mixing a high-absorbent polymer in a quantitative amount, and the concentration (%) Was found to be up to 719 to 814%. That is, if the concentration process is performed under the above-described conditions, it is possible to obtain a remarkably high concentration rate in a single process without repeating the concentration several times or distributing the concentration time for 30 minutes or more.

또한 본 발명은 장소에 구애받지 않고, 세포 밖 소포체를 포함하는 용액을 농축할 수 있도록, 고흡수성 폴리머를 포함하는 농축용 키트를 제공할 수 있다. 상기 키트에서 고흡수성 폴리머는 공기 중의 수분에 노출되지 않도록 밀봉되어 있을 수 있다. 일부 경우에는 용액에 따라 적정량의 고흡수성 폴리머의 혼합을 돕기 위해 용량별로 밀봉되어 있을 수 있다.In addition, the present invention can provide a kit for concentration containing a superabsorbent polymer so that a solution containing extracellular vesicles can be concentrated, regardless of the location. The superabsorbent polymer in the kit may be sealed to prevent exposure to moisture in the air. In some cases, depending on the solution, it may be sealed by volume to help mix the appropriate amount of superabsorbent polymer.

상기 키트는 생물학적 시료로부터 세포 밖 소포체를 분리할 수 있는 제품을 더 포함할 수 있고, 예를 들어 Exoquick, Exo-spin 등 세포 밖 소포체 분리용 제품일 수 있다.The kit may further include a product capable of separating extracellular vesicles from a biological sample, and may be, for example, a product for separating extracellular vesicles such as Exoquick and Exo-spin.

본 발명의 "키트"는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용설명서를 추가로 포함할 수 있다. 사용설명서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함할 수 있다.The "kit" of the present invention may further include an instruction manual describing optimal conditions for performing the reaction. Instructions for use include brochures in the form of brochures or leaflets, labels attached to the kit, and instructions on the surface of the package containing the kit. In addition, the handbook may include information disclosed or provided through an electric medium such as the Internet.

본 발명의 키트를 이용하여, 낮은 농도로 세포 밖 소포체가 존재하는 용액를 고농도로 농축할 수 있다.Using the kit of the present invention, a solution in which extracellular vesicles are present at a low concentration can be concentrated at a high concentration.

상기 키트는 건조된 고흡수성 폴리머가 밀봉되어 포함되어 있는 키트일 수 있다. 상기 키트를 이용하는 방법은 생물학적 시료로부터 세포 밖 소포체를 분리하고, 분리된 세포 밖 소포체를 포함하는 용액에 상기 고흡수성 폴리머를 혼합하여 농축하는 것일 수 있다.The kit may be a kit in which a dried superabsorbent polymer is sealed and included. The method using the kit may be to separate the extracellular vesicles from the biological sample, and to mix and concentrate the superabsorbent polymer in a solution containing the separated extracellular vesicles.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(ⅰ) 본 발명은 세포 배양액이나 임상 시료로부터 키트 또는 별도의 처리과정을 통해 세포 밖 소포체를 분리하고, 여기에 고흡수성 폴리머를 이용하여 고농도의 세포 밖 소포체를 얻는, 농축방법을 제공한다.(Iii) The present invention provides a concentration method for separating extracellular vesicles from a cell culture solution or clinical sample through a kit or a separate treatment process, and obtaining a high concentration of extracellular vesicles using a superabsorbent polymer.

(ⅱ) 본 발명의 세포 밖 소포체의 농축방법은 별도의 장치나 장비없이 장소에 구애받지 않고 쉽고 간단하게 활용할 수 있으며, 이 방법을 통해 고농도의 세포 밖 소포체를 얻을 수 있으며, 이 기능을 이용하여 얻어진 세포 밖 소포체는 다양한 연구에 활용될 수 있다.(Ii) The method for concentrating the extracellular vesicles of the present invention can be easily and simply utilized without regard to a place without a separate device or equipment, and a high concentration of extracellular vesicles can be obtained through this method. The extracellular vesicles obtained can be utilized in various studies.

도 1은 실시예 1로부터 제조된 세포 밖 소포체 농축용액의 초기 부피 대비 남아있는 부피량(%)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 실시예 1로부터 제조된 세포 밖 소포체 농축용액에 대한 농축률(%)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 실시예 1로부터 제조된 세포 밖 소포체 농축용액에서의 세포 밖 소포체(exosome) 크기를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 실시예 1로부터 제조된 세포 밖 소포체 농축용액에서의 세포 밖 소포체(exosome) 크기분포를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 실시예 2로부터 제조된 세포 밖 소포체 농축용액의 초기 부피 대비 남아있는 부피량(%)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 실시예 2로부터 제조된 세포 밖 소포체 농축용액에 대한 농축률(%)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 실시예 2로부터 제조된 세포 밖 소포체 농축용액에서의 세포 밖 소포체(exosome) 크기를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 8은 실시예 2로부터 제조된 세포 밖 소포체 농축용액에서의 세포 밖 소포체(exosome) 크기분포를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 9는 실시예 3으로부터 제조된 세포 밖 소포체 농축용액의 초기 부피 대비 남아있는 부피량(%)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 10은 실시예 3으로부터 제조된 세포 밖 소포체 농축용액에 대한 농축률(%)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 11은 실시예 3으로부터 제조된 세포 밖 소포체 농축용액에서의 세포 밖 소포체(exosome) 크기를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 12는 실시예 3으로부터 제조된 세포 밖 소포체 농축용액에서의 세포 밖 소포체(exosome) 크기분포를 측정하여 나타낸 그래프이다.1 is a graph showing the remaining volume (%) compared to the initial volume of the extracellular vesicle concentrate solution prepared from Example 1.
2 is a graph showing the concentration (%) of the extracellular vesicle concentrate solution prepared from Example 1.
Figure 3 is a graph showing the measurement of the extracellular vesicle (exosome) size in the extracellular vesicle concentrate solution prepared from Example 1.
Figure 4 is a graph showing the measurement of the extracellular vesicle (exosome) size distribution in the extracellular vesicle concentrate solution prepared from Example 1.
5 is a graph showing the remaining volume (%) compared to the initial volume of the extracellular vesicle concentrate solution prepared from Example 2.
6 is a graph showing the concentration (%) of the extracellular vesicle concentrate solution prepared from Example 2.
7 is a graph showing the measurement of the extracellular vesicle (exosome) size in the extracellular vesicle concentrate solution prepared from Example 2.
8 is a graph showing the measurement of the extracellular exosome (exosome) size distribution in the extracellular vesicle concentrate solution prepared from Example 2.
9 is a graph showing the remaining volume (%) compared to the initial volume of the extracellular vesicle concentrate solution prepared from Example 3.
10 is a graph showing the concentration rate (%) for the extracellular vesicle concentrate solution prepared from Example 3.
11 is a graph showing the measurement of the extracellular vesicle (exosome) size in the extracellular vesicle concentrate solution prepared from Example 3.
12 is a graph showing the measurement of the extracellular exosome (exosome) size distribution in the extracellular vesicle concentrate solution prepared from Example 3.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only intended to illustrate the present invention in more detail, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. .

실시예 Example

<실시예 1> 고흡수성 폴리머를 이용한 Hela 세포로부터 분리된 세포 밖 소포체의 농축<Example 1> Concentration of extracellular vesicles isolated from Hela cells using a super absorbent polymer

1-1. Hela 세포로부터 세포 밖 소포체 분리1-1. Separation of extracellular vesicles from Hela cells

먼저, 세포 밖 소포체를 포함하는 용액(시료)를 확보하기 위하여 Exo-Quick exosome 분리 키트(Invitrogen)를 사용하여 HeLa 세포의 배양액으로부터 세포 밖 소포체(exosome)을 분리하였다. 구체적으로 HeLa 세포를 10% FBS(소태아혈청, Biowest, France) 및 페니실린/스트렙토마이신(Life Technologes, USA)을 함유하는 DMEM(Dulbecco's `modified Eagle's medium, Biowest, France) 배지에 배양하였다. HeLa 세포는 100 ㎜ 배양접시로 37 ℃, 5% CO2 조건 하에서 배양되었다. 50 ㎖ FALCON 튜브(SPL)에 상기 세포 배양액 10 ㎖를 넣고 15 분간 3,000 G force(Centrifuge, 한일과학산업, Combi-514R)로 원심분리하여 세포 파괴물(cell debris)을 제거하고, 상등액만 분리하였다. 상기 세포 상등액 10 ㎖에 Exo-Quick solution 2 ㎖(5 : 1 부피비)를 혼합한 후, 4 ℃에서 16 시간 동안 배양하였다. 상기 세포 상등액과 Exo-Quick가 혼합된 혼합액을 다시 30분 간 1,500 G force로 원심분리 한 다음 상층액은 버리고, 남아있는 펠렛(pellet)에 33 ㎕의 N.F.PBS(nuclease free phosphate buffered saline)를 첨가하여 피펫팅을 통해 pellet을 현탁하여 세포 밖 소포체(exosome)를 포함하는 용액을 제조하였다.First, in order to secure a solution (sample) containing the extracellular vesicles, an extracellular exosome was separated from the culture of HeLa cells using an Exo-Quick exosome separation kit (Invitrogen). Specifically, HeLa cells were cultured in DMEM (Dulbecco's `modified Eagle's medium, Biowest, France) medium containing 10% FBS (fetal bovine serum, Biowest, France) and penicillin/streptomycin (Life Technologes, USA). HeLa cells were cultured in a 100 mm culture dish under 37 °C and 5% CO 2 conditions. 10 ml of the cell culture was added to a 50 ml FALCON tube (SPL) and centrifuged with 3,000 G force (Centrifuge, Hanil Science Industry, Combi-514R) for 15 minutes to remove cell debris, and only the supernatant was separated. . After mixing 2 ml (5:1 volume ratio) of Exo-Quick solution with 10 ml of the cell supernatant, the cells were incubated at 4° C. for 16 hours. The cell supernatant and the mixture of Exo-Quick were centrifuged again at 1,500 G force for 30 minutes, then the supernatant was discarded, and 33 μl of NFPBS (nuclease free phosphate buffered saline) was added to the remaining pellet. The pellet was suspended through pipetting to prepare a solution containing extracellular exosomes.

1-2. 세포 밖 소포체(exosome) 농축1-2. Extracellular exosome concentration

실시예 1-1로부터 얻은 세포 밖 소포체를 포함하는 용액에 고흡수성 폴리머(super absorbent polymer, SAP) 비드(2 ㎜ 지름의 비드, 4개)(상아사이언스)를 혼합하여 농축시킴으로써 세포 밖 소포체 농축용액을 얻었다.The superabsorbent polymer (SAP) beads (2 mm diameter beads, 4) (ivory science) were mixed with a solution containing the extracellular vesicles obtained from Example 1-1 to concentrate the extracellular vesicle concentrate solution Got

농축조건으로 1 x 109 par/㎕ 세포 밖 소포체(exosome) 용액 200 ㎕와 2 ㎜ 지름을 갖는 SAP 비드 4 개(약 28.2 ㎎) 를 첨가하여 4 ℃에서 40분간 혼합하였다. 이때 마이크로튜브(Microtube)(AXYGEN)를 사용하였다. 농축이 완료된 후, 회수한 세포 밖 소포체 농축용액을 Micro Centrifuge Tube(SPL)에 분리하고, 농축용액의 부피를 피펫을 사용하여 측정하였다.200 μl of 1 x 10 9 par/µl extracellular exosome solution and 4 SAP beads (approximately 28.2 mg) with a diameter of 2 mm were added under concentrated conditions and mixed at 4° C. for 40 minutes. At this time, Microtube (AXYGEN) was used. After concentration was completed, the recovered extracellular vesicle concentrate solution was separated into a Micro Centrifuge Tube (SPL), and the volume of the concentrated solution was measured using a pipette.

<실시예 2> 고흡수성 폴리머를 이용한 Hela 세포로부터 분리된 세포 밖 소포체의 농축<Example 2> Concentration of extracellular vesicles isolated from Hela cells using a super absorbent polymer

2 ㎜ 지름의 SAP 비드 5개(약 34.3㎎)를 사용하여 30 분간 농축하였다는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 모두 동일하게 수행하여 세포 밖 소포체 농축용액을 얻었다.The same procedure as in Example 1 was performed to obtain an extracellular vesicle concentrate solution except that 5 SAP beads of 2 mm diameter (about 34.3 mg) were concentrated for 30 minutes.

<실시예 2> 고흡수성 폴리머를 이용한 Hela 세포로부터 분리된 세포 밖 소포체의 농축<Example 2> Concentration of extracellular vesicles isolated from Hela cells using a super absorbent polymer

500 ㎕의 세포 밖 소포체(exosome)를 포함하는 용액과 2 ㎜ 지름의 SAP 비드 12개(약 81.2㎎)를 사용하였다는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 모두 동일하게 수행하여 세포 밖 소포체 농축용액을 얻었다. 이때, 마이크로튜브(Microtube)(AXYGEN) 대신 50 ㎖ FALCON 튜브를 사용하였다.A solution containing 500 µl of extracellular vesicles (exosome) and 12 SAP beads with a diameter of 2 mm (about 81.2 mg) were used in the same manner as in Example 1, except that the extracellular vesicle concentrate solution was used. Got At this time, a 50 ml FALCON tube was used instead of the Microtube (AXYGEN).

<실험예 1> 고흡수성 폴리머의 존재 유무에 따른 농축 정도 분석<Experimental Example 1> Analysis of the degree of concentration depending on the presence or absence of a super absorbent polymer

고흡수성 수지를 통해 세포 밖 소포체의 농축이 효율적으로 이루어지고 있음을 확인하기 위해, 고흡수성 수지로 농축한 실시예 1-3의 농축용액과 농축되기 전 용액(대조군)을 다양하게 분석하여 비교하였다.In order to confirm that the concentration of extracellular vesicles through the superabsorbent polymer is efficiently carried out, the concentrated solution of Example 1-3 concentrated with the superabsorbent polymer and the solution before concentration (control) were variously analyzed and compared. .

상기 대조군(W/O SAP, 'without SAP')은 실시예 1-1의 농축되기 전 세포 밖 소포체를 포함하는 용액을 사용하였다.The control (W/O SAP,'without SAP') was used as a solution containing extracellular vesicles before being concentrated in Example 1-1.

1) 농축 정도 분석1) Concentration analysis

세포 밖 소포체의 농도(exosome concentration(par/㎕))는 실시예 1 내지 3의 세포 밖 소포체 농축용액과 대조군을 각각 Nano sight(Malvern사, NS300)을 사용한 NTA(nano particle tracking anaylsis) 방법으로 분석하여 하기 표 1, 도 1, 2, 5, 6, 9, 10에 나타내었다. 이때, nano sight 기기 사용시 camera level은 16으로 30 초간 3번 측정하였고, threshold 4로 분석하였다.The concentration of extracellular vesicles (exosome concentration (par/μl)) was analyzed by the nanoparticle (Nal particle tracking anaylsis) method using Nano sight (Malvern, NS300) for the extracellular vesicle concentration solutions of Examples 1 to 3, respectively. It is shown in Table 1 below, Figure 1, 2, 5, 6, 9, 10. At this time, when using a nano sight device, the camera level was measured 16 times 3 times for 30 seconds and analyzed with a threshold of 4.

도 1, 2, 5, 6, 9, 10은 실시예 1 내지 3에서와 같이 세포 밖 소포체 용액과 고흡수성 폴리머를 혼합한 후, 남아있는 용액의 부피량(%)과 농축률(%)을 측정하여 나타낸 그래프이다.1, 2, 5, 6, 9, and 10, after mixing the superabsorbent polymer with the extracellular vesicle solution as in Examples 1 to 3, the volume (%) and concentration (%) of the remaining solution It is a graph that is measured and shown.

구분division 용액 상에 엑소좀 농도
(par/㎕)Exosome concentration in solution
(par/μl) 용액 부피
(㎕)Solution volume
(Μl) 농축 후 남아있는 용액의 부피량(%)b Volume of solution remaining after concentration (%) b 농축률(%)c Concentration rate (%) c 대조군Control 1.1~1.6 x 109 1.1~1.6 x 10 9 200~500a 200~500 a -- -- 실시예 1Example 1 1.07 x 1010 1.07 x 10 10 19 19 1010 814814 실시예 2Example 2 1.3 x 1010 1.3 x 10 10 19.8319.83 9.99.9 719.3719.3 실시예 3Example 3 9.9 x 109 9.9 x 10 9 5050 1010 753753

a: 실시예 1, 2의 대조군은 200 ㎕을 사용하였고, 실시예 3의 대조군은 500 ㎕를 사용하였다.a: 200 µl was used as a control in Examples 1 and 2, and 500 µl was used as a control in Example 3.

b: 초기 부피(대조군) 대비 농축 후 남아있는 용액의 부피를 백분율(%)로 나타낸 값이다.b: The value of the volume of the solution remaining after concentration compared to the initial volume (control) as a percentage (%).

c: 초기 세포 밖 소포체의 농도(대조군)에 대한 농축 후 세포 밖 소포체의 농도를 백분율(%)로 나타낸 것이다.c: The concentration of the extracellular vesicles after concentration relative to the concentration of the initial extracellular vesicles (control), expressed as a percentage (%).

도 1, 2, 5, 6, 9, 10와 표 1에 나타난 바와 같이, 고흡수성 폴리머를 사용하여 얻은 실시예 1 내지 3의 세포 밖 소포체 농축용액은 대조군에 비해 부피가 90% 감소하였으며, 이에 따라 용액에서 세포 밖 소포체의 농도도 1.1 x 109 particle/㎕에서 1.07 x 1010 particle/㎕로 증가하였음을 확인하였다. 즉 고흡수성 폴리머를 이용하여 농축할 경우 719~814%로 농축되는 것을 알 수 있다. 이를 통해 고흡수성 폴리머를 사용하면 세포 밖 소포체의 기능이나 구조에 영향을 거의 주지않으면서 30~40분의 짧은 시간에, 장치나 장비 및 기술없이도 700% 이상으로 농도가 농축되므로, 세포 밖 소포체를 농축하기 위한 새로운 농축방법으로 활용될 수 있음을 확인하였다.As shown in Figures 1, 2, 5, 6, 9, 10 and Table 1, the extracellular vesicle concentration solutions of Examples 1 to 3 obtained using superabsorbent polymers had a 90% reduction in volume compared to the control group. Accordingly, it was confirmed that the concentration of extracellular vesicles in the solution also increased from 1.1 x 10 9 particles/µl to 1.07 x 10 10 particles/µl. That is, when concentrated using a super absorbent polymer, it can be seen that it is concentrated to 719 to 814%. Through this, if superabsorbent polymer is used, the concentration of the extracellular vesicles is concentrated to over 700% without a device, equipment, and technology in a short time of 30-40 minutes with little effect on the function or structure of the extracellular vesicles. It was confirmed that it can be utilized as a new concentration method for concentration.

2) 크기 분석2) Size analysis

도 3, 4, 7, 8, 11, 12는 실시예 1 내지 3으로부터 제조된 세포 밖 소포체 농축용액에서의 세포 밖 소포체(exosome) 크기와 크기분포를 측정하여 나타낸 그래프이다.3, 4, 7, 8, 11, 12 are graphs obtained by measuring the extracellular exosome size and size distribution in the extracellular vesicle concentrate solution prepared from Examples 1 to 3.

도 3, 4, 7, 8, 11, 12에 나타난 바와 같이, 대조군에서의 세포 밖 소포체(exosome)의 평균 크기는 101.1 ㎚였다. 한편 실시예 1 내지 3의 세포 밖 소포체 농축용액에서의 세포 밖 소포체의 평균 크기는 104.5 ㎚였다. 3, 4, 7, 8, 11, 12, the average size of the extracellular exosomes in the control group was 101.1 nm. On the other hand, the average size of the extracellular vesicles in the concentrated solution of extracellular vesicles of Examples 1 to 3 was 104.5 nm.

나아가, 대조군에서의 크기 분포와 실시예 1 내지 3에서의 크기 분포 역시 차이가 거의 없으므로, 고흡수성 폴리머를 이용한 농축과정에서 대조군과 실시예 1 내지 3에서의 세포 밖 소포체는 물리적 특성에 변화가 없음을 알 수 있다.Furthermore, since the size distribution in the control group and the size distribution in Examples 1 to 3 also have little difference, the control and the extracellular vesicles in Examples 1 to 3 did not change in physical properties during the concentration process using the superabsorbent polymer. Can be seen.

상술한 결과를 종합하면, 고흡수성 폴리머를 사용하여 세포 밖 소포체를 포함하는 용액을 효율적으로 농축할 수 있음을 알 수 있다. 구체적으로 즉 본 발명의 농축방법은 세포 밖 소포체를 분리한 후 세포 밖 소포체에 물리적 화학적 변형을 야기하지 않으면서, 장치나 장비가 요구되지 않으므로 장소에 상관없이 단일공정으로 고농도의 세포 밖 소포체를 갖는 농축용액을 얻을 수 있다는 장점이 있음을 확인하였다. 특히 상술한 농축과정은 종래 농축방법들과 달리 세포 밖 소포체의 소실이 거의 야기되지 않는다는 장점이 있다.Summarizing the above results, it can be seen that the solution containing the extracellular vesicles can be efficiently concentrated using a superabsorbent polymer. Specifically, the concentration method of the present invention, after separating the extracellular vesicles, does not cause physical and chemical modification to the extracellular vesicles, and thus does not require a device or equipment, and thus has a high concentration of extracellular vesicles in a single process regardless of the location. It was confirmed that there is an advantage that a solution can be obtained. In particular, the above-described concentration process has an advantage that, unlike conventional concentration methods, almost no loss of extracellular vesicles is caused.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.Since the specific parts of the present invention have been described in detail above, it is clear that for those skilled in the art, these specific technologies are only preferred embodiments, and the scope of the present invention is not limited thereto. Accordingly, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

Claims (6)

세포 밖 소포체를 포함하는 용액에 2 mm 지름을 갖는 비드 형태의 고흡수성 폴리머(super absorbent polymer, SAP)를 혼합하여, 세포 밖 소포체를 농축하는 단계;를 포함하고,
상기 세포 밖 소포체를 포함하는 용액은 생물학적 시료로부터 세포 밖 소포체 분리용 키트를 사용하여 얻어진 저농도의 세포 밖 소포체를 포함하는 용액이며,
상기 세포 밖 소포체는 엑소좀(exosome)인 것을 특징으로 하는 세포 밖 소포체의 농축방법..Concentrating the extracellular vesicles by mixing the solution containing the extracellular vesicles with a super absorbent polymer (SAP) in the form of beads having a diameter of 2 mm;
The solution containing the extracellular vesicles is a solution containing a low concentration of extracellular vesicles obtained using a kit for separating extracellular vesicles from a biological sample,
The extracellular vesicles are exosomes (exosome) characterized in that the extracellular vesicles concentration method.. 삭제delete 제1항에 있어서,
상기 고흡수성 폴리머(SAP)는 전분(starch)에 아크릴로니트릴(acrylonitrile), 아크릴산(acrylic acid), 아크릴아미드(acrylamide) 또는 메타크릴레이트(methacrylate)의 모노머를 공중합시킨 전분계 고분자; 카르복시메틸셀룰로오스(CMC)에 상기의 모노머를 공중합시킨 셀룰로오스계 고분자; 및 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol)-메타아크릴산(methacrylic acid) 블록공중합체, 스티렌(stryene)-무수말레인산(maleic anhydride) 공중합체, 폴리아크릴아미드계(polyacryl amide) 또는 폴리옥시에틸렌계(polyoxyethylene)를 포함하는 합성수지계 고분자;로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 것을 특징으로 하는 세포 밖 소포체의 농축방법.According to claim 1,
The super absorbent polymer (SAP) is a starch-based polymer obtained by copolymerizing monomers of acrylonitrile, acrylic acid, acrylamide or methacrylate with starch; A cellulose-based polymer obtained by copolymerizing the above monomer with carboxymethyl cellulose (CMC); And polyvinyl alcohol-methacrylic acid block copolymers, styrene-maleic anhydride copolymers, polyacryl amides or polyoxyethylenes. Synthetic resin-based polymer containing; any method selected from the group consisting of extracellular vesicles concentration method. 제1항에 있어서,
상기 고흡수성 폴리머(SAP)는 상아사이언스로부터 구입한 2 ㎜ 지름을 갖는 비드 형태의 고흡수성 폴리머(super absorbent polymer, SAP)인 것을 특징으로 하는 세포 밖 소포체의 농축방법.According to claim 1,
The super absorbent polymer (SAP) is a super absorbent polymer (SAP) in the form of a bead having a diameter of 2 mm purchased from Ivory Science. 제1항에 있어서,
상기 세포 밖 소포체를 포함하는 용액은 pH 7.0 내지 8.0인 것을 특징으로 하는, 세포 밖 소포체의 농축방법.According to claim 1,
The solution containing the extracellular vesicles is characterized in that the pH of 7.0 to 8.0, the method for concentration of extracellular vesicles. 2 ㎜ 지름을 갖는 비드 형태의 고흡수성 폴리머(super absorbent polymer, SAP)를 포함하는 엑소좀(exosome)의 농축용 키트.Kit for concentration of exosomes containing a super absorbent polymer (SAP) in the form of beads having a diameter of 2 mm.
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