KR102112140B1 - shRNA 및 pDNA와 복합체화된 나노입자 전달체 및 이를 이용한 분화방법 - Google Patents

shRNA 및 pDNA와 복합체화된 나노입자 전달체 및 이를 이용한 분화방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102112140B1
KR102112140B1 KR1020180084732A KR20180084732A KR102112140B1 KR 102112140 B1 KR102112140 B1 KR 102112140B1 KR 1020180084732 A KR1020180084732 A KR 1020180084732A KR 20180084732 A KR20180084732 A KR 20180084732A KR 102112140 B1 KR102112140 B1 KR 102112140B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
differentiation
hmscs
complexed
pdna
gene
Prior art date
Application number
KR1020180084732A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20200009820A (ko
Inventor
박근홍
박경순
박지선
김혜진
Original Assignee
차의과학대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 차의과학대학교 산학협력단 filed Critical 차의과학대학교 산학협력단
Priority to KR1020180084732A priority Critical patent/KR102112140B1/ko
Publication of KR20200009820A publication Critical patent/KR20200009820A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102112140B1 publication Critical patent/KR102112140B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Abstract

본 발명은 ATF4 유전자를 표적으로 하는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 포함하는 제1 플라스미드 벡터; 및 SOX9 유전자 또는 C/EBPα 유전자를 포함하는 제2 플라스미드 벡터를 덱사메타손이 컨쥬게이션된 폴리에틸렌이민과 복합체화시켜 얻어진 나노입자 전달체를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 나노입자 전달체를 이용한 줄기세포의 연골세포 또는 지방세포로의 분화방법을 제공한다.

Description

shRNA 및 pDNA와 복합체화된 나노입자 전달체 및 이를 이용한 분화방법{Nanoparticle delivery systems complexed with shRNA and pDNA and methods for differentiation using the same}
본 발명은 shRNA 및 pDNA와 복합체화된 나노입자 전달체 및 이를 이용한 분화방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 ATF4 유전자를 표적으로 하는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 포함하는 제1 플라스미드 벡터; 및 SOX9 유전자 또는 C/EBPα 유전자를 포함하는 제2 플라스미드 벡터를 덱사메타손이 컨쥬게이션된 폴리에틸렌이민과 복합체화시켜 얻어진 나노입자 전달체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 나노입자 전달체를 이용한 줄기세포의 연골세포 또는 지방세포로의 분화방법을 제공한다.
줄기세포 치료(Stem cell therapy)는 줄기세포의 원하지 않는 세포 계통으로의 분화에 의해 제한된다. 다양한 신호전달 경로가 줄기세포 분화를 조절하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 경로에 관여하는 유전자와 결합하는 바이러스성 및 비-바이러스성 벡터가 골세포(osteoblasts) 연골세포(chondrocytes) 및 지방세포(adipocytes)로 줄기세포 분화를 유도하기 위하여 사용되어 왔다(Naito, Y. et al., siRNA Design Software for a Target Gene-Specific RNA Interference. Front Genet. 3 (2012) 102; Schaser, T. et al., RNAi-mediated gene silencing in tumour tissue using replication-competent retroviral vectors. Gene Ther . 18 (2011) 953-60; Tiscornia, G. et al., Design and cloning of lentiviral vectors expressing small interfering RNAs. Nat. Protoc . 1 (2006) 234-40). 이들 벡터는 독성 물질을 함유하지 않아야 하며, 필요로 하는 분화의 종류에 따라 적절한 벡터가 선택된다. 이전의 연구는 이들 벡터를 수송하는데 적합한 시스템에 초점을 두어왔다.
최근, 비-바이러스성 벡터 수송 담체가 암세포, 전구세포 및 줄기세포로 유전자를 수송하기 위하여 연구되고 있다. 이들 중, 약물-컨쥬게이션된 중합체가 유전자 수송 비히클로서 사용된 바 있으며, 덱사메타손은 면역억제를 위한 글루코코르티코이드 약물 중 하나로서 알려져 있다. 또한, 덱사메타손은 줄기세포의 골세포 분화, 연골세포 분화 및 지방세포 분화에 있어서 분화 약물로서 적용된 바 있다. 친수성 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI)과 조합된 소수성 약물인 덱사메타손은 몇가지 종류의 세포에 특정 유전자를 수송하기 위한 나노입자 형성을 가능하게 한다(Ji, M. et al., Sialic Acid-Targeted Nanovectors with Phenylboronic Acid-GrATFed Polyethylenimine Robustly Enhance siRNA-Based Cancer Therapy. ACS Appl . Mater. Interfaces 8(2016) 9565-76; Pan, T. et al., miR-29b-Loaded Gold Nanoparticles Targeting to the Endoplasmic Reticulum for Synergistic Promotion of Osteogenic Differentiation. ACS Appl . Mater. Interfaces 8(2016) 19217-27; Wu, Y. et al., Functional quantum dot-siRNA nanoplexes to regulate chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Acta Biomater . 46(2016) 165-176). 따라서, 많은 연구자들이 줄기세포로의 유전자 수송을 위하여 덱사메타손을 적용한 바 있다.
생분해성 나노입자(nanoparticles, NPs), 나노겔(nanogels) 및 무기 물질을 유전자와 복합체화하여 시험관 내 및 생체내에서 줄기세포 분화를 유도하는 것이 보고된 바 있다(Ma W. et al., Dual Quantification of MicroRNAs and Telomerase in Living Cells. J Am Chem Soc . 34 (2017) 11752-9). 또한, 특정 계통의 세포로의 줄기세포 분화를 촉진하기 위하여, 유전자, 플라스미드 DNAs (pDNAs), 및 간섭 RNA(interference RNA)의 사용이 보고된 다 있다(Cai, J. et al., BMP and TGF-β pathway mediators are critical upstream regulators of Wnt signaling during midbrain dopamine differentiation in human pluripotent stem cells. Dev . Biol . 376 (2013) 62-73; Agarwal, T. et al., Alginate Bead Based Hexagonal Close Packed 3D Implant for Bone Tissue Engineering. ACS Appl . Mater. Interfaces 8(2016) 32132-32145; Sthanam, L. K. et al., Biophysical regulation of mouse embryonic stem cell fate and genomic integrity by feeder derived matrices. Biomaterials 119(2017) 9-22). 이들 연구는 주로 상처 치료를 목적으로 줄기세포 분화를 유도하기 위한 것이다. 특정 pDNAs 또는 짧은 헤어핀 RNAs(small hairpin RNAs, shRNAs)와 결합하는 비-바이러스성 벡터가 상류 경로(upstream pathways)를 활성화함으로써 인간 중간엽 줄기세포의 다양한 계통의 분화를 유도하는 것이 제안된 바 있다.
한편, 골세포 형성에 있어서, ATF4의 전사인자는 줄기세포 분화의 마지막 단계에서 중요한 역할을 한다(Xiangli Y. et al., ATF4 is a substrate of RSK2 and an essential regulator of osteoblasts biology: implication for coffin-lowry syndrome. Cell. 117 (2004) 387-98). ATF4는 전-골세포(pre-osteoblast cell) 형성을 나타내는 제1형 콜라겐 합성에 있어서 중요한 역할을 하며, 따라서, 줄기세포에서 ATF4 발현의 억제는 골세포(osteoblast cell) 형성의 차단을 야기한다(Wang W. et al., ATF4 regulates chondrocytes proliferation and differentiation during endochondral ossification by activating Ihh transcription. Development. 24 (2009) 4143-53; Na L. et al., Vimentin inhibits ATF4-mediated osteocalcin transcription and osteoblasts differentiation. J Biol Chem . 44 (2009) 30518-25).
본 발명자들은 인간 중간엽 줄기세포(human mesenchymal stem cells, hMSCs)를 특정 세포, 예를 들어 골세포, 연골세포 및 지방세포로의 분화를 유도하기 위하여, 다양한 pDNAs 및 shRNA를 제작하였다. 본 발명자들은 2종의 특정 플라스미드 벡터의 조합, 즉 ATF4 유전자를 표적으로 하는 shRNA를 포함하는 제1 플라스미드 벡터 및 SOX9 또는 C/EBPα 유전자를 포함하는 제2 플라스미드 벡터의 조합을 나노입자 전달체로 제조할 경우, 유전자-조절 나노담체(gene-regulated nanocarriers, GRNs)를 생성하며, 이를 hMSCs에 내재화(즉, shRNA 및 SOX9 pDNAs 조합의 동시 수송 또는 shRNA 및 C/EBPα pDNAs 조합의 동시 수송)시킬 경우 각각 연골세포 및 지방세포로의 선택적 분화가 가능하다는 것을 발견하였다. pDNA 및 shRNA의 동시-수송에 의해 hMSCs의 다중 계통 세포 분화가 시도된 바 없다는 것을 감안할 때, 이는 매우 놀라운 것이다.
따라서, 본 발명은 ATF4 유전자를 표적으로 하는 shRNA를 포함하는 제1 플라스미드 벡터 및 SOX9 또는 C/EBPα 유전자를 포함하는 제2 플라스미드 벡터와 복합체화된 나노입자 전달체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 나노입자 전달체를 사용한 줄기세포의 연골세포 또는 지방세포로의 분화방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, ATF4 유전자를 표적으로 하는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 포함하는 제1 플라스미드 벡터; 및 SOX9 유전자 또는 C/EBPα 유전자를 포함하는 제2 플라스미드 벡터를 덱사메타손이 컨쥬게이션된 폴리에틸렌이민과 복합체화시켜 얻어진 나노입자 전달체가 제공된다.
본 발명의 나노입자 전달체에 있어서, 상기 ATF4 유전자를 표적으로 하는 shRNA는 AAGCTT (서열번호 1)의 염기서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 덱사메타손이 컨쥬게이션된 폴리에틸렌이민은 N,N-디시클로헥실카르보디이미드 및 N-히드록시숙신이미드의 존재하에서, 덱사메타손을 폴리에틸렌이민과 반응시켜 얻어질 수 있다. 상기 폴리에틸렌이민은 아미노에틸 사슬(aminoethyl branch)을 갖는 사슬구조의 폴리에틸엔이민(branched polyethylenimine)일 수 있다. 또한, 상기 사슬구조의 폴리에틸엔이민은 0.6∼30 kDa의 중량평균분자량을 가질 수 있다.
상기 복합체화는 (i) 수성 매질 중에서 상기 제1 및 제2 플라스미드 벡터를 상기 덱사메타손이 컨쥬게이션된 폴리에틸렌이민과 반응시키는 단계 및 (ii) 단계(i)에서 얻어진 반응 혼합물을 맴브레인 필터로 여과하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 제1 및 제2 플라스미드 벡터는 상기 덱사메타손이 컨쥬게이션된 폴리에틸렌이민 1 μg에 대하여 각각 0.5 ∼ 1.5 ㎍ 및 0.5 ∼ 1.5 ㎍의 비율로 복합체화되는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 태양에 따라, ATF4 유전자를 표적으로 하는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 포함하는 제1 플라스미드 벡터; 및 SOX9 유전자 유전자를 포함하는 제2 플라스미드 벡터를 덱사메타손이 컨쥬게이션된 폴리에틸렌이민과 복합체화시켜 얻어진 나노입자 전달체로 줄기세포를 형질감염시키는 것을 포함하는, 줄기세포의 연골세포로의 분화방법이 제공된다.
본 발명의 또다른 태양에 따라, ATF4 유전자를 표적으로 하는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 포함하는 제1 플라스미드 벡터; 및 C/EBPα 유전자를 포함하는 제2 플라스미드 벡터를 덱사메타손이 컨쥬게이션된 폴리에틸렌이민과 복합체화시켜 얻어진 나노입자 전달체로 줄기세포를 형질감염시키는 것을 포함하는, 줄기세포의 지방세포로의 분화방법이 제공된다.
2종의 특정 플라스미드 벡터의 조합, 즉 ATF4 유전자를 표적으로 하는 shRNA를 포함하는 제1 플라스미드 벡터 및 SOX9 또는 C/EBPα 유전자를 포함하는 제2 플라스미드 벡터의 조합을 나노입자 전달체로 제조할 경우, 유전자-조절 나노담체(gene-regulated nanocarriers, GRNs)를 생성하며, 이를 hMSCs에 내재화(즉, shRNA 및 SOX9 pDNAs 조합의 동시 수송 또는 shRNA 및 C/EBPα pDNAs 조합의 동시 수송)시킬 경우 각각 연골세포 및 지방세포로의 선택적 분화가 가능하다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 즉, ATF4 유전자를 표적으로 하는 shRNA 및 SOX9 pDNA의 동시-수송은 연골세포 분화를 현저하게 증가시킴과 동시에, 골세포 분화를 현저하게 감소시킨다. 또한, ATF4 유전자를 표적으로 하는 shRNA 및 C/EBPα pDNA의 동시-수송은 지방세포 분화를 현저하게 증가시킴과 동시에, 골세포 분화를 현저하게 감소시킨다. 따라서, 상기 나노입자 전달체는 줄기세포의 연골세포 또는 지방세포로의 분화에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 iGRNs 및 kGRNs의 특징분석 및 hMSCs에서 ATF4 발현에 대한 이들의 효과를 나타낸다. 도 1A는 DcP의 화학구조, 및 DLS 및 AFM에 의한 iGRNs 및 kGRNs의 크기 및 형태 분석을 나타낸다. 도 1B는 iGRNs 및 kGRNs으로 처리된 hMSCs에서 ATF4의 mRNA 및 단백질 발현을 나타낸다. 도 1C는 iGRNs (a) 및 kGRNs (b)로 형질감염된 hMSCs에서 ATF4의 시각화를 나타낸다.
도 2는 hMSCs에 의한 GRNs의 유입 및 세포 생존율에 대한 영향을 나타낸다. 도 2A는 다양한 양의 GRNs 처리에 따른 hMSCs의 생존율을 (a) FACS 분석, (b) Live/Dead 분석에 의해 분석한 결과를 나타낸다. 도 2B는 GRNs의 형광 강도를 분석한 결과로서, (a) 다양한 농도의 TRITC의 흡광도 및 (b) GRNs의 흡광도를 나타낸다. 도 2C 및 2D는 (a) 콘트롤 hMSCs 및 (b) GRNs으로 형질감염된 hMSCs의 공초점 레이저 현미경 분석결과를 나타낸다.
도 3은 iGRNs 및 kGRNs으로 형질감염된 hMSCs에서 골분화-관련 유전자의 mRNA 발현을 나타낸다. 도 3A는 hMSCs에서 ATF4 유도 및 넉다운의 효과에 대한 모식적인 설명이다. 도 3B는 iGRNs 및 kGRNs으로 형질감염된 hMSCs에서 (a) β-카테닌, (b) MSX2, (c) DLX5, 및 (d) ddit3의 mRNA 수준에 대한 실시간 qPCR 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 pDNAs와 복합체화된 iGRNs 및 kGRNs의 형질감염에 따른, 2D 배양 시스템에서 hMSCs의 다중 계통 세포 분화를 나타낸다.
도 4A는 본 실험의 모식도이다.
도 4B는 GRNs으로 형질감염된 hMSCs 또는 다양한 pDNAs와 복합체화된 DcP로 형질감염된 hMSCs에서 RUNX2, SOX9, C/EBPα, 및 ATF4 발현의 RT-PCR 및 웨스턴 블럿 분석결과를 나타낸다. (a) 콘트롤 hMSCs, (b) RUNX2로 복합체화된 DcP, (c) RUNX2로 복합체화된 iGRN, (d) SOX9으로 복합체화된 DcP, (e) SOX9으로 복합체화된 kGRN, (f) C/EBPα로 복합체화된 DcP, (g) C/EBPα로 복합체화된 kGRN.
도 4C 내지 도 4E는 (C) 골세포 분화, (D) 연골세포 분화 및 (E) 지방세포 분화와 관련된 단백질의 면역형광 분석을 나타낸다. (a) 콘트롤 hMSCs, (b) DcP로 형질감염된 hMSCs, (c) PEI로 형질감염된 hMSCs, 및 (d) iGRNs 또는 kGRNs으로 형질감염된 hMSCs.
도 4F 내지 도 4H는 (F) 골세포 분화, (G) 연골세포 분화 및 (H) 지방세포 분화와 관련된 단백질의 면역형광분석에 대한 형광강도 그래프이다. (a) 콘트롤 hMSCs, (b) DcP로 형질감염된 hMSCs, (c) PEI로 형질감염된 hMSCs, 및 (d) iGRNs 또는 kGRNs으로 형질감염된 hMSCs.
도 4I는 (a, b) RUNX2 pDNA로 복합체화된 iGRN, (c, d) SOX9 pDNA와 복합체화된 kGRNs, 및 (e, f) C/EBPα pDNA와 복합체화된 kGRNs으로 형질감염된 hMSCs의 조직학적 분석결과이다.
도 5는 다양한 pDNAs와 복합체화된 iGRNs 및 kGRNs의 형질감염에 따라, 생체 내에서 hMSCs의 다중계통 세포 분화의 실시간 qPCR 및 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 도 5A는 본 실험의 모식도이다. 도 5B 내지 도 5D: 골세포 분화, 연골세포 분화 및 지방세포 분화와 관련된 유전자 발현의 실시간 qPCR 분석결과를 나타낸다. 도 5E 내지 도 5G는 골세포 분화, 연골세포 분화 및 지방세포 분화와 관련된 유전자 발현의 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸다.
도 6은 다양한 pDNAs와 복합체화된 iGRNs 및 kGRNs의 형질감염에 따라, 생체 내에서 hMSCs의 다중계통 세포 분화의 조직학적 분석을 나타낸다.
도 6A는 골세포 분화를 나타낸다. (a, e) 콘트롤 hMSCs, (b, f) RUNX2 pDNA와 복합체화된 DcP로 형질감염된 hMSCs, (c, g) RUNX2 및 ATF4 pDNAs와 복합체화된 PEI로 형질감염된 hMSCs, 및 (d, h) RUNX2 pDNA와 복합체화된 iGRNs로 형질감염된 hMSCs.
도 6B는 연골세포 분화를 나타낸다. (a, e) 콘트롤 hMSCs, (b, f) SOX9 pDNA와 복합체화된 DcP로 형질감염된 hMSCs, (c, g) SOX9 및 shATF4 pDNAs와 복합체화된 PEI로 형질감염된 hMSCs, 및 (d, h) SOX9 pDNA와 복합체화된 kGRNs로 형질감염된 hMSCs.
도 6C는 지방세포 분화를 나타낸다. (a, e) 콘트롤 hMSCs, (b, f) C/EBPα pDNA와 복합체화된 DcP로 형질감염된 hMSCs, (c, g) C/EBPα 및 shATF4 pDNAs와 복합체화된 PEI로 형질감염된 hMSCs, 및 (d, h) C/EBPα pDNA와 복합체화된 kGRNs로 형질감염된 hMSCs
도 7은 다양한 pDNAs와 복합체화된 iGRNs 및 kGRNs의 형질감염에 따라, 생체 내에서 hMSCs의 다중계통 세포 분화의 면역형광 분석을 나타낸다. 도 7A 내지 도 7C는 (A) 골세포 분화, (B) 연골세포 분화 및 (C) 지방세포 분화와 관련된 단백질의 공초점 면역형광 현미경 분석결과를 나타낸다. 도 7D 내지 도 7F는 (D) 골세포 분화, (E) 연골세포 분화 및 (F) 지방세포 분화와 관련된 단백질의 형광 강도의 정량분석 결과를 나타낸다.
(A, D) (a) 콘트롤 hMSCs, (b) RUNX2 pDNA와 복합체화된 DcP로 형질감염된 hMSCs, (c) RUNX2 및 ATF4 pDNAs와 복합체화된 PEI로 형질감염된 hMSCs, 및 (d) RUNX2 pDNA와 복합체화된 iGRNs로 형질감염된 hMSCs.
(B, E) (a) 콘트롤 hMSCs, (b) SOX9 pDNA와 복합체화된 DcP로 형질감염된 hMSCs, (c) SOX9 및 shATF4 pDNAs와 복합체화된 PEI로 형질감염된 hMSCs, 및 (d) SOX9 pDNA와 복합체화된 kGRNs로 형질감염된 hMSCs
(C, F) (a) 콘트롤 hMSCs, (b) C/EBPα pDNA와 복합체화된 DcP로 형질감염된 hMSCs, (c) C/EBPα 및 shATF4 pDNAs와 복합체화된 PEI로 형질감염된 hMSCs, 및 (d) C/EBPα pDNA와 복합체화된 kGRNs로 형질감염된 hMSCs.
도 8은 PEI 및 DcP의 표면 전하를 측정한 결과를 나타낸다. a; pDNA, b; PEI, c; pDNA와 복합체화된 PEI, d; DcP, e; pDNA와 복합체화된 DcP.
도 9는 PEI 및 GRN의 세포내 유입을 FACS 분석에 의해 측정한 결과를 나타낸다.
도 10은 골세포 분화 및 연골세포 분화에 대한 덱사메타손의 영향을 평가한 결과를 나타낸다.
도 11은 골세포 분화, 연골세포 분화, 및 지방세포 분화에 대한 면역조직학적 분석 결과를 나타낸다.
도 12는 pDNAs와 복합체화된 iGRNs 및 kGRNs로 형질감염된 hMSCs의 면역염색 결과를 나타낸다.
도 13은 hMSCs의 골세포 분화, 연골세포 분화 및 지방세포 분화를 유도하기 위한 iGRNs 및 kGRNs 형성의 모식도이다.
본 명세서에서, "골세포 형성(osteogenesis)" 및 "골세포로의 분화/골세포 분화(osteogenic differentiation / differentiation to osteoblasts)"는 별도로 표기하지 않는 한 서로 동일한 의미로 사용된다. "연골세포 형성(chondrogenesis)" 및 "연골세포로의 분화/연골세포 분화(chondrogenic differentiation / differentiation to chondrocytes)"도 별도로 표기하지 않는 한 서로 동일한 의미로 사용된다. 또한, "지방세포 형성(chondrogenesis)" 및 "지방세포로의 분화/지방세포 분화(adipogenic differentiation / differentiation to adipocytes)"도 별도로 표기하지 않는 한 서로 동일한 의미로 사용된다.
또한, 용어 "짧은 헤어핀 RNAs(short hairpin RNAs, shRNAs)"는 인위적으로 세포내로 도입시켜 RNA 간섭(RNA interference, RNAi)를 유도하는 이중가닥 RNAs(double-stranded RNAs, dsRNAs)로서, 플라스미드 혹은 벡터-기반의 시스템으로 세포내로 도입되어 세포내에서 짧은 간섭 RNAs(small interfering RNAs, siRNAs)을 제공하는 dsRNAs를 말한다. 상기 siRNA는 RNAi 현상을 유도하는 올리고 형태의 dsRNAs를 말한다. 용어 "ATF4 유전자를 표적으로 하는 shRNAs"는 ATF4 유전자에 대하여 RNAi 현상을 유도하는 shRNAs를 말한다. 상기 ATF4 유전자는 진뱅크(Gene Bank) 등에 공지되어 있다.
본 발명은 ATF4 유전자를 표적으로 하는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 포함하는 제1 플라스미드 벡터; 및 SOX9 유전자 또는 C/EBPα 유전자를 포함하는 제2 플라스미드 벡터를 덱사메타손이 컨쥬게이션된 폴리에틸렌이민과 복합체화시켜 얻어진 나노입자 전달체를 제공한다. 상기 SOX9 유전자 또는 C/EBPα 유전자는 모두 진뱅크(Gene Bank) 등에 공지되어 있다.
본 발명의 나노입자 전달체는 분화 유도 벡터로서 특정 shRNA를 포함하는 플라스미드 벡터 및 특정 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터와 복합체화된 나노입자 형태의 전달체이다. 상기 나노입자 전달체의 형태는 통상 구형 즉, 나노스피어(nanosphere)이나, 특별히 제한되는 것은 아니다. 또한, 나노입자 전달체는 예를 들어, 10∼500 nm의 직경, 바람직하게는 80∼200 nm의 직경을 가질 수 있다.
본 발명의 나노입자 전달체에 있어서, 상기 ATF4 유전자를 표적으로 하는 shRNA는 ATF4 유전자를 넉아웃시킬 수 있는 통상의 shRNAs일 수 있으며, 예를 들어 AAGCTT (서열번호 1)의 염기서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 제1 플라스미드 벡터로서 사용될 수 있는 벡터는 유전공학 분야에서 통상적으로 사용되는 플라스미드를 사용할 수 있으며, 상기 shRNA는 적절한 제한효소를 사용하여 통상의 방법에 따라 삽입(ligation)시킬 수 있다.
상기 덱사메타손이 컨쥬게이션된 폴리에틸렌이민은 카보디이미드 반응을 통하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 상기 덱사메타손이 컨쥬게이션된 폴리에틸렌이민은 N,N-디시클로헥실카르보디이미드 및 N-히드록시숙신이미드의 존재하에서, 덱사메타손을 폴리에틸렌이민과 반응시켜 얻어질 수 있다. 상기 반응은 디메틸 술폭사이드 등의 유기 용매 중에서 약 24시간 동안 실온에서 수행될 수 있다. 반응 완료 후, 필요에 따라 적절한 투석막(예를 들어, MWCO 1,000 Da)을 통하여 투석함으로써 미반응 물질 등을 제거할 수 있다. 얻어진 덱사메타손이 컨쥬게이션된 폴리에틸렌이민은 동결건조 등의 통상의 방법에 따라 건조될 수 있다. 바람직하게는 상기 폴리에틸렌이민은 아미노에틸 사슬(aminoethyl branch)을 갖는 사슬구조의 폴리에틸엔이민(branched polyethylenimine, bPEI)일 수 있다. 또한, 상기 사슬구조의 폴리에틸엔이민은 0.6∼30 kDa, 예를 들어 약 25 kDa의 중량평균분자량을 가질 수 있다.
상기 복합체화는 수성 매질(예를 들어, 증류수 등)에서 상기 제1 및 제2 플라스미드 벡터를 덱사메타손이 컨쥬게이션된 폴리에틸렌이민을 반응시킴으로써, 음이온성의 플라스미드 벡터와 양이온성의 중합체와의 정전기적 인력에 의해 자가 조립 나노입자(self-assembly nanoparticles)를 형성시킬 수 있다. 또한, 적절한 망목 크기(pore size)의 맴브레인 필터(예를 들어, 0.2 μm 멤브레인 필터)로 여과함으로써, 나노입자의 크기를 원하는 크기로 조절할 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 상기 복합체화는 (i) 수성 매질 중에서 상기 제1 및 제2 플라스미드 벡터를 상기 덱사메타손이 컨쥬게이션된 폴리에틸렌이민과 반응시키는 단계 및 (ii) 단계(i)에서 얻어진 반응 혼합물을 맴브레인 필터로 여과하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 복합체화에 있어서, 상기 제1 및 제2 플라스미드 벡터는 상기 덱사메타손이 컨쥬게이션된 폴리에틸렌이민 1 μg에 대하여 각각 0.5 ∼ 1.5 ㎍ 및 0.5 ∼ 1.5 ㎍의 비율로 반응시킬 수 있다.
본 발명에 따른 나노입자 전달체는 엔도사이토시스에 의해 효과적으로 줄기세포 내로 유입되고, 엔도좀을 빠져나와, 세포기질(cytosol)로 내재화되어 줄기세포의 분화를 유도할 수 있다. 이를 모식 다이어그램으로 나타내면 도 13과 같다. 따라서, 본 발명에 따른 나노입자 전달체는 줄기세포의 연골세포 분화 또는 지방세포 분화유도를 위한 나노입자 전달 수송체로서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 따라, ATF4 유전자를 표적으로 하는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 포함하는 제1 플라스미드 벡터; 및 SOX9 유전자 유전자를 포함하는 제2 플라스미드 벡터를 덱사메타손이 컨쥬게이션된 폴리에틸렌이민과 복합체화시켜 얻어진 나노입자 전달체로 줄기세포를 형질감염시키는 것을 포함하는, 줄기세포의 연골세포로의 분화방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따라, ATF4 유전자를 표적으로 하는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 포함하는 제1 플라스미드 벡터; 및 C/EBPα 유전자를 포함하는 제2 플라스미드 벡터를 덱사메타손이 컨쥬게이션된 폴리에틸렌이민과 복합체화시켜 얻어진 나노입자 전달체로 줄기세포를 형질감염시키는 것을 포함하는, 줄기세포의 지방세포로의 분화방법이 제공된다.
본 발명의 분화방법에 있어서, 상기 나노입자 전달체는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 분화방법에 있어서, 상기 줄기세포는 인간 중간엽 줄기세포일 수 있다. 또한, 상기 형질감염은 상기 나노입자 전달체를 포함하는 무혈청 배지 중에서 상기 줄기세포를 배양함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 나노입자 전달체를 포함하는 무혈청 배지 중에서 줄기세포를 약 4시간 동안 배양하여 나노입자 전달체의 세포 내 유입을 유도함으로써 수행될 수 있다. 또한, 상기 배양으로부터 얻어진 세포 즉, 나노입자 전달체로 형질감염된 세포는 통상의 방법에 따라 2차원 또는 3차원 배양을 통하여 배양될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니다.
1. 재료 및 시험방법
(1) 재료
사슬구조의 폴리에틸엔이민(branched polyethyleneimine, bPEI, 25,000 Da), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine, TRITC), 디시클로헥실카르보디이미드(dicyclohexylcarbodiimide, DCC), N-히드록시숙신이미드(hydroxysuccinimide, NHS), Hoechst 33342, 및 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)는 시그마-알드리치(St Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 덱사메타손 헤미숙시네이트(dexamethasone hemisuccinate, DEX hemisuccinate)는 스테랄로이드(Steraloids, Newport, RI, USA)에서 구입하였다. 투석막(분자량 컷-오프(MWCO), 1,000 Da)은 스펙트럽 래버러토리스(Spectrum Laboratories Inc., Rancho Dominguez, CA, USA)에서 구입하였다. 둘베코 포스페이트-완충 식염수(Dulbecco's phosphate-buffered saline, DPBS), 우태혈청(fetal bovine serum, FBS), 알파 최소 필수 배지(alpha minimum essential medium), 항생제, 및 트립신-EDTA는 써모 피셔 사이언티픽사(Thermo Fisher Scientific Incorporation, Waltham, USA)에서 구입하였다.
(2) 덱사메타손 컨쥬게이티드 TRITC -사슬구조의 폴리에틸렌이민( Dexamethasone conjugated TRITC-branched polyethyleneimine, DcP)의 합성
사슬구조의 폴리에틸엔이민과 컨쥬게이션된 TRITC-덱사메타손(TRITC-DcP)은 종래의 카르보디이미드 반응을 통하여 합성하였다. PEI(250 mg, 10 mol)를 DMSO 10 mL에 가하여 완전히 용해될 때까지 교반하였다. 이후, DMSO 5mL 중의 덱사메타손(25 mg, 50.76mol), DCC (16 mg, 77.55mol), 및 NHS (16mg, 139.02mol)의 혼합물을 상기에서 제조된 PEI 용액에 가하고, 실온에서 24시간 동안 반응시켰다. DMSO 3 mL에 용해시킨 TRITC(1 mg)을 상기 용액에 실온에서 12시간 동안 적가하였다. 최종 용액을 투석막(MWCO 1,000 Da)을 사용하여 3일 동안 증류수에 대하여 투석한 다음, 동결건조하였다.
ATF4-유도 유전자-조절 나노입자(ATF4-inducible gene-regulated nanoparticles, iGRN) 및 ATF4-넉다운 유전자-조절(ATF4-knockdown gene-regulated nanoparticles, kGRN)은 ATF4 pDNA 및 ATF4-표적 shRNA를 DcP에 결합시켜 제조하였다. 구체적으로, DcP 2.5 mg에 대하여 각각 ATF4 1 mg과 RUNX2 유전자 1 mg을 동시에 결합(자기 조립 성질)시켜 iGRNs을 제조하였다. 또한, DcP 2.5 mg에 대하여 각각 SOX9 유전자 1 mg과 ATF4-표적 shRNA 1 mg, DcP 2.5 mg에 대하여 각각 c/EBPa 1 mg과 ATF4-표적 shRNA 1 mg을 동시에 결합(자기 조립 성질)시켜 kGRNs를 제조하였다.
(3) 벡터의 제작
본 연구에서 사용되는 벡터는 재조합 PCR 방법에 의해 제작하였으며, 뉴클레오티드 서열분석을 통해 확인하였다. ATF4 cDNAs는 배양된 SW1353 세포(연골육종(chondrosarcoma) 세포, ATCC HTB-94)로부터 RT-PCR에 의해 얻었다. EGFP-표지된 ATF4가 삽입된 벡터는 인간 ATF4 오픈 리딩 프레임(human ATF4 open reading frame)을 pEGFP-C1 (Clontech Laboratories, Inc., CA, USA)의 다중 클로닝 부위에 삽입하여 얻었다.
DsRed1-표지된 SOX9이 삽입된 벡터는 hSOX9 오픈 리딩 프레임을 pDsRed1-C1 (Clontech, Mountain View, CA, USA)에 삽입한 다음, SV40 nuclear localization signal (NLS, PKKKRKV)을 SOX9의 N-말단에 삽입함으로써 생성시켰다. EGFP-표지된 C/EBP-α가 삽입된 벡터는 C/EBP-α 오픈 리딩 프레임을 pEGFP-C1 (Clontech, Palo Alto, CA, USA)의 다중 클로닝 부위에 삽입함으로써 생성시켰다. C/EBP-α의 오픈 리딩 프레임은 N-말단 부위에서 FLAG 에피토프로 표지하고, pcDNA3.1/hygro (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 삽입하였다.
shRNA ATF4 벡터는 Gene Link shRNA Design Guidelines 웹사이트(http://www.genelink.com/sirna/shrnai.asp)를 사용하여 얻었다. 즉, 정방향 5'-GATCCGCAGTGAAGTGGATATCACGAAGCTTGGTGATATCCACTTCACTGCTTTTTTGGAAGC-3' (서열번호 2) 및 역방향 5'-GGCCGCTTCCAAAAAAGCAGTGAAGTGGATATCACCAAGCTTCGTGATATCCACTTCACTGCG-3' (서열번호 3)을 어닐링하여 RUNX2 shRNA을 제조함으로써 두개의 이중-가닥 올리고뉴클레오티드를 생성시켰다. ATF4 센스 및 안티센스 서열은 밑줄로 표기하였다. 상기 각각의 염기서열은 HindIII 제한 부위를 포함하며 루프영역에 의해 회문적으로 연결되어 헤어핀 구조를 형성할 수 있으며, 얻어진 이중-가닥 올리고뉴클레오티드를, 제한효소 BamHI 및 NotI로 절단하여 pGSH1-GFP shRNA 벡터(Genlantis, San Diego, CA, USA)에 삽입하였다.
(4) GRN의 크기 및 표면 전하의 측정
GRN의 크기 및 표면 전하는 Zetasizer Nano ZS apparatus (Malvern,UK)를 사용하여 측정하였다. 샘플당 30회 측정하였다. NPs의 평균 직경, 형태(morphology) 및 크기 분포를 평가하였다. GRN의 표면은 원자력 현미경(atomic force microscope, AFM)(NanoWizard ULTRA speed, JPK, San Francisco, USA)를 사용하여 관찰하였다.
(5) 세포 원(Cell source) 및 배양
골수-유래 hMSCs(PT-2501; Lonza, Walkersville, MD, USA)은 고관절 치환 수술 과정에서 얻어진 22세 남성의 근위 대퇴부(proximal femur) 샘플로부터 얻었다. 환자는 설명후 동의(informed consent)를 제공하였으며, 윤리위원회(Ethical Committee)는 연구를 위한 샘플의 사용을 승인하였다. hMSCs는 10% FBS 및 1% 항생물질(antibiotics-antimycotics, AA)을 함유하는 알파 최소 필수 배지에서 배양하였다.
(6) GRN의 세포독성 평가
(6.1) Live/dead 분석
2×105 hMSCs를 6-웰 플레이트의 각 웰에 파종하고, pDNA와 함께 GRN으로 4시간 동안 처리하였다. 이들 나노담체들을 제거한 후, hMSCs를 밤새 배양하고, (살아있는 세포 염색을 위한) 2 μM 칼세인 AM(calcein AM) 및 (죽은 세포 염색을 위한) 4 μM EthD-1을 함유하는 용액에서 10분 동안 인큐베이션한 다음, EVOS Fl (Thermo Fisher ScientificIncorporation, Waltham, USA)을 사용하여 시각화하였다. 처리된 세포에 대하여, 살아있는 세포 및 죽은 세포의 수를 계수하였다.
(6.2) GRN의 양에 따른 hMSCs의 세포독성
2×105 hMSCs를 0.5, 1.5, 2.5, 및 3.5 μg의 GRNs으로 4 시간 동안 처리하고, 형광-활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting, FACS)로 분석하였다. 사이드 분산(side scatter) 및 포워드 분산(forward scatter)은 각각 세포 조건 및 세포 크기를 나타낸다. 포워드 분산값이 높을수록 죽은 세포의 수가 높다는 것을 나타낸다.
(7) TRITC 양 및 세포 유입 평가
GRNs의 농도를 특정하였다. 표준물질로서, TRITC를 0 ∼ 5 ng/μL의 농도로 제조하고, 각각의 용액 200 μl를 96-웰 플레이트에 가하여 표준곡선을 작성하였다. 그 후, 실험에 사용한 2.5 mg 의 GRNs에 들어있는 TRITC양을 TECAN 기기(Infinite M200 Pro)를 사용하여 수득하였다(도 2B (b)).
GRNs의 세포 유입을 평가하기 위하여, 2×105 hMSCs를 현미경 커버글래스(18 mmØ, 0111580, Marienfeld, Germany) 상에 파종하고, pDNAs와 복합체화된 GRNs로 4 시간 동안 처리하고, Cell Light® Reagent BacMam 2.0 (2 μL per 10,000 cells)과 함께 16시간 동안 37℃에서 인큐베이션하여 초기 엔도좀(early endosomes)을 염색한 다음, 형광 공초점 현미경(LSM 880 META, Zeiss)으로 시각화하였다.
(8) 2차원 배양 시스템에서 hMSCs의 분화 평가
3×105 hMSCs를 6-웰 플레이트에 파종하고, 1) RUNX2 pDNA로 복합체화된 iGRNs, 2) RUNX2 pDNA, ATF4 pDNA로 복합체된 PEI, 혹은 3) RUNX2 pDNA로 복합체화된 DcP와 함께 4시간 동안 처리하여 골세포 분화를 유도하였다. 또한, 3×105 hMSCs를 6-웰 플레이트에 파종하고, 1) SOX9 pDNA로 복합체화된 kGRNs, 2) SOX9 pDNA, shATF pDNA로 복합체화된 PEI, 혹은 3) SOX9 pDNA로 복합체화된 DcP와 함께 4시간 동안 처리하여 연골세포 분화를 유도하였다. 또한, 3×105 hMSCs를 6-웰 플레이트에 파종하고, 1) C/EBPα pDNA로 복합체화된 kGRNs, 2) C/EBPα pDNA, shATF pDNA로 복합체화된 PEI, 혹은 3) C/EBPα pDNA DcP와 함께 4시간 동안 처리하여 지방세포 분화를 유도하였다. 세포는 3주 동안 배양하였고, 배지(DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)는 2-3일 마다 교체하였다. 분화는 RT-PCR, 웨스턴 블럿팅, 조직학(histology), 및 면역형광(immunofluorescence)으로 확인하였다.
(9) 생체내에서 hMSCs의 분화 평가
hMSCs를 15mL 코니컬 튜브에서 1,300 rpm으로 3분 동안 원심분리하여 펠렛화하였다. 얻어진 펠렛을 24시간 동안 피브린 겔에 넣어 구를 형성시켰다. 이들 구를 7 주령의 balb/c 누드 마우스에 피하 이식하고, 3주 후에 제거하였다. 본 실험은 5회 반복하였다. 분화는 실시간 qPCR, 웨스턴 블럿팅, 조직학, 및 면역형광으로 확인하였다.
(10) 조직학 및 면역형광
2차원(2D) 또는 3차원(3D) 시스템에서 배양된 hMSCs를 DPBS로 세척하고, 4% 파라포름알데히드로 1시간 동안 고정하였다. 3D 시스템에서 배양된 샘플에 대하여, 펠렛을 최적 절단 온도 물질(optimum cutting temperature material)(TISSUE-TEK 4583; Sakura Finetek USA)에 끼워넣고(embeded), -80℃에서 냉동시켰다. 냉동된 샘플을 80 μm 두께의 조각으로 cryotome (HM 525, MICROM)을 사용하여 -28℃에서 잘랐다. 본 코사(von Kossa) (26212-01, Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA) 및 알리자린 레드 S(Alizarin Red S) (26205-01, Electron Microscopy Sciences)를 사용한 염색을 수행하여 골세포 분화를 평가하였다. 알시안 블루(Alcian blue) (A3157, Sigma Aldrich, USA) 및 사프라닌 O(Safranin O) (HT90432, Sigma Aldrich) 염색을 수행하여 연골세포 분화를 평가하였다. 또한, 수단 블랙 B(Sudan black B) (21610, Electron Microscopy Sciences) 및 오일 레드 O(oil red O) (26503-02, Electron Microscopy Sciences) 염색을 수행하여 지방세포 분화를 평가하였다. OCN, type 1 콜라겐(COLI), SOX9, type 2 콜라겐(COLII), LPL, C/EBPa에 대한 1차 항체를 사용하여 가습 조건에서 면역형광을 수행하였다. 이후, 샘플을 형광으로 표지된 2차 항체(1:500; Thermo Scientific)로 염색하고, 4,6-디아미디노-2-페닐인돌(4,6-diamidino-2-phenylindole)과 함께 10분 동안 인큐베이션하여 핵을 염색하고, 형광 공초점 현미경(LSM 880 META, Zeiss)으로 시각화하였다.
(11) 통계 분석
통계분석은 ANOVA t-테스트(ANOVA t-test)를 사용하여 수행하였다. *P < 0.05 및 **P < 0.01 을 통계적으로 유의성있는 것으로 간주하였다. 또한, 정량 데이터(예를 들어, qPCR)은 5회 반복하였다.
2. 결과 및 고찰
(1) iGRNs 및 kGRNs의 특성분석
ATF4 pDNA 및 shATF4는 각각 DcP와 복합체화되어 ATF4-유도 GRNs(iGRNs) 및 ATF4-넉다운 GRNs(kGRNs)을 형성하였다(도 1). DcP는 형광 마커 TRITC를 함유하므로 세포에서 검출될 수 있다. 도 1A는 DcP의 화학 구조와 이에 대한 구체적인 설명 및 iGRNs와 kGRNs 형성의 모식도를 나타낸다. AFM 및 동적 광 산란(dynamic light scattering, DLS) 분석 결과, DcP는 357 nm의 직경을 가졌으며, ATF4 pDNA 또는 shATF4와의 복합체화에 따라 그 크기가 감소되었다. 음으로 하전된 pDNA 또는 shATF4의 결합은 PEI 및 DcP의 표면 전하를 감소시켰다(도 8). iGRNs 및 kGRNs으로 처리된 hMSCs에 대하여 RT-PCR 및 웨스턴 블럿팅 분석을 수행하였다. ATF4의 mRNA 및 단백질 발현은, 콘트롤 hMSCs 및 kGRNs로 처리된 hMSCs 보다, iGRNs로 처리된 hMSCs에서 더 높았다(도 1B). iGRNs 및 kGRNs로 처리된 hMSCs의 세포질 및 핵에서 EGFP가 검출되었으며, 이는 각각 iGRNs과 결합되어 있는 GFP-RUNX2로 인한 EGFP 및 kGRNs과 결합되어있는 GFP-shATF로 인한 EGFP이다(도 1C). ATF4는 iGRNs로 처리된 hMSCs에서 높게 발현되었다. kGRNs로 처리된 hMSCs는, 각각 GRNs 및 shATF4를 나타내는, TRITC 및 EGFP를 높게 발현하였으나, ATF4를 발현하지 않았다. 이는 shATF4가 hMSCs에서 ATF4를 고갈시켰음을 나타낸다.
(2) hMSCs에 의한 GRNs의 유입 및 생존율
PEI 및 GRNs의 처리에 따른 hMSCs의 생존율을 FACS(도 2A, a) 및 Live/Dead 분석(도 2A, b)으로 측정하였다. 측정 결과, 고 농도로 사용했을 때에도, PEI 및 GRNs은 세포독성을 나타내지 않았다. 이는 PEI 및 GRNs이 해로운 영향을 나타냄이 없이 hMSCs에 의해 내재화된다는 것을 나타낸다. PEI 및 GRNs의 세포 유입을 FACS로 측정하였다(도 9). hMSCs는 상대적으로 높은 농도로 적용했을 때에도 PEI 및 GRNs을 쉽게 내재화하였다. 가장 높은 농도의 PEI 및 GRNs을 처리하였을 때, 75% 이상의 hMSCs가 이들 시약들을 내재화하였다. 이는 PEI가 DEX와 컨쥬게이션되었을 때 부정적인 영향을 나타내지 않는다는 것을 나타낸다.
세포 유입 이미지를 얻기 위하여, TRITC와 컨쥬게이션된 PEI로 구성된 GRN을 사용하였다. GRNs의 최적 농도를 결정하기 위하여, hMSCs에서 형광 강도를 측정하였다(도 2B). 형광 강도 및 세포 생존율로부터, 세포독성 없이 hMSCs에 적용되는 GRN의 최적 농도를 관찰하였다(도 2B). 이는 GRNs의 형광이 검출가능하며 또한 이러한 농도는 처리된 hMSCs에 대하여 세포독성을 야기하지 않음을 의미한다(도 2A). TRITC와 컨쥬게이션된 GRNs로 처리된 hMSCs를 공초점 레이저 현미경을 통하여 이미지화하였다(도 2C 및 2D). 적색 형광이 GRN-처리된 hMSCs의 핵 주변부(peri-nuclear regions)에서 명확하게 검출되었다(도 2D, b). 이러한 결과는 GRNs이 hMSCs로 쉽게 들어가며, 핵 가까이 위치한다는 것을 나타낸다.
(3) iGRNs 및 kGRNs에 의한 하류(downstream) 평가
iGRNs 및 kGRNs의 형질감염이, 골분화에 있어서 핵심 인자인 β-카테닌을 조절함으로써, 각각 hMSCs의 골분화를 증가 및 감소시키는지를 평가하였다(도 3A). β-카테닌의 하류 전사인자인 DLX5 , MSX2, 및 ddit3의 mRNA 발현은, 콘트롤 hMSCs에서 보다, iGRNs으로 처리된 hMSCs에서 더 높았다. 그러나, β-카테닌의 mRNA 발현은, 콘트롤 hMSCs 및 iGRNs으로 처리된 hMSCs에서 보다, kGRNs으로 처리된 hMSCs에서 훨씬 더 낮았다(도 3B). 이러한 결과는 iGRNs 및 kGRNs의 형질감염이 각각 β-카테닌의 하류 골분화 인자의 발현을 각각 증가 및 감소시킴을 나타낸다. 따라서, hMSCs의 골분화는 ATF4 발현을 조절함으로써 조절될 수 있다.
(4) 2D 배양 시스템에서의 분화 평가
2D 배양 시스템에서 다양한 pDNAs와 kGRNs를 복합체화하여 hMSCs의 분화를 평가하였다(도 4A). 구체적으로, iGRNs를 RUNX2 pDNA와 복합체화하여 골분화 유도를 평가하였으며, kGRNs를 SOX9 pDNAs 및 C/EBPα pDNAs와 각각 복합체화하여 연골분화 및 지방세포 분화 유도를 평가하였다. 이들의 다양한 GRNs로 형질감염시킨 hMSCs에 대하여 RT-PCR 및 웨스턴 블럿팅을 수행하였다(도 4B). RUNX2, SOX9, 및 C/EBPα의 mRNA 및 단백질 발현은 각각 RUNX2, SOX9, 및 C/EBPα로 형질감염된 hMSCs에서 높았다(도 4B 및 S5). 또한, ATF4 pDNA로 형질감염된 hMSCs에서 ATF4의 mRNA 및 단백질이 높게 발현되었으나, shATF4로 형질감염된 hMSCs에서는 검출되지 않았다(도 4B). 이는 pDNAs로 복합체화된 GRNs의 형질감염이 hMSCs의 골분화, 연골분화 및 지방세포 분화를 유도하는 인자들의 mRNA 및 단백질 발현 수준을 변화시킨다는 것을 나타낸다.
다양한 단백질들이 면역형광 염색 및 형광강도 그래프에서 검출되었다(도 4C-4H). RUNX2 pDNA와 복합체화된 iGRNs로 형질감염된 hMSCs는 골분화-관련 단백질인 COLI (녹색) 및 OCN (적색)을 높게 발현하였다(도 4C & 4F, e). SOX9 pDNA와 복합체화된 kGRNs로 형질감염된 hMSCs는 라쿠내(lacunae)를 나타내었으며, 연골세포-관련 단백질인 COLII (녹색) 및 SOX9 (적색)을 높게 발현하였다(도 4D & 4G, e). 대조적으로, SOX9 pDNA로 복합체화된 PEI, SOX9 pDNA/shATF4로 복합체화된 PEI, 및 SOX9 pDNA로 복합체화된 DcP로 각각 형질감염된 hMSCs에서는 이들 단백질이 강하게 표지되지 않았다(도 4D, b-d). C/EBPα pDNA와 복합체화된 kGRNs으로 형질감염된 hMSCs는 지방세포-관련 단백질인 LPL (녹색) 및 C/EBPα (적색)를 높게 발현하였다(도 4E & 4H, e). 대조적으로, C/EBPα pDNA로 복합체화된 PEI, C/EBPαpDNA/shATF4로 복합체화된 PEI, 및 C/EBPα pDNA로 복합체화된 DcP로 각각 형질감염된 hMSCs에서는 이들 단백질이 강하게 표지되지 않았다(도 4E, b-d). 이러한 결과는 다양한 pDNAs와 복합체화된 kGRN의 수송이 hMSCs의 분화를 조절한다는 것을 나타낸다.
다양한 GRNs의 형질감염에 따른 hMSCs의 클러스터에서 본 코사 염색, 알시안 블루 염색, 수단 블랙 B 염색을 검출하였다(도 4I). RUNX2 pDNA와 복합체화된 iGRNs로 hMSCs을 형질감염시킴에 따라, 칼슘 축적(calcium deposits)을 표지하는 본 코사 염색이 관찰되었다(도 4I, a 및 b). SOX9 pDNA와 복합체화된 kGRNs로 hMSCs을 형질감염시킴에 따라, 연골세포에서 발견되는 당단백질을 표지하는 알시안 블루 염색이 관찰되었다(도 4I, c 및 d). C/EBPα pDNA와 복합체화된 kGRNs로 hMSCs을 형질감염시킴에 따라, 지질을 표지하는 수단 블랙 B 염색이 관찰되었다(도 4I, e 및 f). 이러한 결과는 다양한 pDNAs와 복합체화된 GRNs의 형질감염이 hMSCs의 클러스터에서 특정 세포외 매트릭스 성분의 수준을 증가시킨다는 것을 나타낸다.
(5) 3D 배양 시스템에서의 분화 평가
3D 배양 시스템에서 다양한 GRNs로 형질감염시킨 hMSCs를 배양하고(도 5A), 3주 후에 실시간 qPCR 및 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다(도 5B 및 5C). RUNX2 pDNA와 복합체화된 iGRNs로 형질감염된 hMSCs에서 RUNX2 및 COLI의 mRNA 및 단백질 발현이 현저히 증가되었으나, RUNX2 및 ATF4 pDNAs로 복합체화된 PEI 또는 RUNX2 pDNA로 복합체화된 DcP로 형질감염된 hMSCs 에서는 그렇지 않았다(도 5B 및 5E). SOX9 pDNA와 복합체화된 kGRNs로 형질감염된 hMSCs에서 SOX9 및 COLII의 mRNA 및 단백질 발현이 현저히 증가되었으나, SOX9 pDNA와 shATF4로 복합체화된 PEI 또는 SOX9 pDNA로 복합체화된 DcP로 형질감염된 hMSCs 에서는 그렇지 않았다(도 5C 및 F). 또한 연골세포 분화에 미치는 덱사메타손의 영향이 확인되었다(도 10). 또한, C/EBPα pDNA와 복합체화된 kGRNs로 형질감염시킨 hMSCs에서 LPL 및 PPARγ의 mRNA 및 단백질 발현이 현저히 증가되었으나, C/EBPα pDNA와 shATF4로 복합체화된 PEI 또는 C/EBPα pDNA로 복합체화된 DcP로 형질감염된 hMSCs 에서는 그렇지 않았다(도 5D 및 도G). 이러한 결과는 pDNAs와 복합체화된 GRNs의 형질감염이 줄기세포 분화를 조절할 수 있음을 명백히 나타낸다.
조직학적 및 면역조직학적 분석을 수행하여, 생체내에서 hMSCs의 분화를 평가하였다(도 6 및 도 7). 본 코사 및 알리자린 레드 S 염색을 통하여 골세포 분화를 평가하였다(도 6A). RUNX2 pDNA와 복합체화된 iGRNs로 형질감염된 hMSCs의 집합체(aggregates)에서, 칼슘 축적을 나타내는 흑색 및 적색 표지가 관찰되었다(도 6A, d 및 h). 그러나, RUNX2 및 ATF4 pDNAs로 복합체화된 PEI 또는 RUNX2 pDNA로 복합체화된 DcP로 형질감염된 hMSCs 에서는 칼슘 축적이 검출되지 않았다(도 6A, a-c 및 e-g).
알시안 블루 및 사프라닌 O 염색을 통하여 연골세포 분화를 평가하였다(도 6B). SOX9 pDNA로 복합체화된 kGRNs로 형질감염된 hMSCs의 집합체(aggregates)에서, 다당류 및 당단백질을 나타내는 강한 청색 및 오렌지색 표지가 관찰되었다(도 6B, d 및 h). 그러나, SOX9 pDNA와 shATF4로 복합체화된 PEI 또는 SOX9 pDNA로 복합체화된 DcP로 형질감염된 hMSCs 에서는 어떠한 표지도 검출되지 않았다.
오일 레드 O 및 수단 블랙 B 염색을 통하여 지방세포 분화를 평가하였다(도 6C). C/EBPα pDNA로 복합체화된 kGRNs로 형질감염된 hMSCs의 집합체(aggregates)에서, 다당류 및 당단백질을 나타내는 강한 흑색 및 적색 표지가 관찰되었다(도 6C, d 및 h). 대조적으로, C/EBPα pDNA와 shATF4로 복합체화된 PEI 또는 C/EBPα pDNA로 복합체화된 DcP로 형질감염된 hMSCs 에서는 어떠한 표지도 검출되지 않았다. 또한, C/EBPα pDNA로 복합체화된 kGRNs로 형질감염된 hMSCs에서 오일 액적(oil droplets)이 형성되었다(도 6C, h). 이는 DcP로 구성된 GRNs을 사용한 C/EBPα pDNA 및 shATF4의 동시 수송(co-delivery)이 hMSCs의 지방세포 분화를 유도하였음을 보여준다. 또한, RUNX2 pDNA와 복합체화된 iGRNs, SOX9 pDNA로 복합체화된 kGRNs, 및 C/EBPα pDNA로 복합체화된 kGRNs로 각각 형질감염된 hMSCs 사이에서 알리자린 레드 S, 알시안 블루, 및 오일 레드 O 염색은 명백하게 상이하였다(도 11). 이러한 결과는 다양한 pDNAs와 복합체화된 GRNs의 형질감염이 hMSCs의 골세포 분화, 연골세포 분화 및 지방세포 분화를 조절할 수 있음을 나타낸다.
이식된 세포 집합체(aggregates)를 분리하고, 조각내어, 면역조직학적 분석을 수행하였다(도 7). RUNX2 pDNA와 복합체화된 iGRNs로 형질감염된 hMSCs에서 COLI (녹색) 및 OCN (적색)의 염색이 검출되었다(도 7A). SOX9 pDNA로 복합체화된 kGRNs로 형질감염된 hMSCs의 집합체(aggregates)에서 SOX9 (녹색) 및 COLII (적색)가 검출되었다(도 7B, d). C/EBPα pDNA로 복합체화된 kGRNs로 형질감염된 hMSCs의 집합체(aggregates)에서 LPL (녹색) 및 C/EBPα (적색)이 염색되었다(도 7C, d). 두개의 pDNAs 즉 PEI를 사용한 pDNA와 shATF4로 형질감염된 hMSCs에서, 혹은 DcP를 사용한 하나의 pDNA로 형질감염된 hMSCs에서는 이러한 다양한 단백질들이 명확히 검출되지 않았다(도 7A-C, a-c). 이러한 결과는 pDNAs와 복화체화된 GRNs이, pDNAs와 shRNAs로 복합체화된 PEI 및 DcP 보다, 더 큰 정도로 hMSCs의 분화를 유도한다는 것을 나타낸다. 또한, 골세포, 연골세포 및 지방세포의 마커인 COLI (녹색), COLII (핑크색) 및 LPL (적색) 염색 결과는 도 12와 같다.
RUNX2, SOX9, 및 C/EBPα pDNA와 ATF4 pDNA 또는 ATF4 shRNA를 수송함으로써, hMSCs의 골세포, 연골세포 및 지방세포 분화가 확인되었다. pDNAs와 복합체화된 GRNs은, 다른 비-바이러스성 벡터 시스템과 비교할 때, 줄기세포 분화에 유용하게 사용될 수 있다는 것이 입증되었다. 따라서, GRNs 및 이들이 결합하는 유전자들은 hMSCs에서 특정 단백질의 생성에 영향을 미치며, 이는 원하는 계통의 세포로의 분화를 야기한다.
4. 결론
본 연구에 의하여, pDNAs 및 shRNA와 복합체화된 GRNs이 줄기세포의 다양한 분화를 조절한다는 것이 밝혀졌다. ATF4의 과발현 및 넉다운은 각각 hMSCs의 골세포 분화를 증가 및 감소시킨다. 골세포 분화의 저해는 연골세포 분화 및 지방세포 분화를 촉진시킨다. 이러한 결과는 ATF4가 줄기세포 분화에 있어서 핵심 인자임을 보여준다.
<110> CHA University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Nanoparticle delivery systems complexed with shRNA and pDNA and methods for differentiation using the same <130> PN0857 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 6 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA <400> 1 aagctt 6 <210> 2 <211> 63 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF4 sense sequence <400> 2 gatccgcagt gaagtggata tcacgaagct tggtgatatc cacttcactg cttttttgga 60 agc 63 <210> 3 <211> 63 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF4 anti-sense sequence <400> 3 ggccgcttcc aaaaaagcag tgaagtggat atcaccaagc ttcgtgatat ccacttcact 60 gcg 63

Claims (17)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. ATF4 유전자를 표적으로 하는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 포함하는 제1 플라스미드 벡터; 및 C/EBPα 유전자를 포함하는 제2 플라스미드 벡터를 덱사메타손이 컨쥬게이션된 폴리에틸렌이민과 복합체화시켜 얻어진 나노입자 전달체를 포함하는 무혈청 배지 중에서 줄기세포를 배양함으로써 형질감염시키는 것을 포함하는, 줄기세포의 지방세포로의 분화방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 줄기세포가 인간 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 분화방법.
  11. 삭제
  12. 제9항에 있어서, 상기 ATF4 유전자를 표적으로 하는 shRNA가 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 분화방법.
  13. 제9항에 있어서, 상기 덱사메타손이 컨쥬게이션된 폴리에틸렌이민이 N,N-디시클로헥실카르보디이미드 및 N-히드록시숙신이미드의 존재하에서, 덱사메타손을 폴리에틸렌이민과 반응시켜 얻어지는 것을 특징으로 하는 분화방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 폴리에틸렌이민이 아미노에틸 사슬(aminoethyl branch)을 갖는 사슬구조의 폴리에틸엔이민(branched polyethylenimine)인 것을 특징으로 하는 분화방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 사슬구조의 폴리에틸엔이민이 0.6∼30 kDa의 중량평균분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 분화방법.
  16. 제9항에 있어서, 상기 복합체화가 (i) 수성 매질 중에서 상기 제1 및 제2 플라스미드 벡터를 상기 덱사메타손이 컨쥬게이션된 폴리에틸렌이민과 반응시키는 단계 및 (ii) 단계(i)에서 얻어진 반응 혼합물을 맴브레인 필터로 여과하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분화방법.
  17. 제9항에 있어서, 상기 제1 및 제2 플라스미드 벡터가 상기 덱사메타손이 컨쥬게이션된 폴리에틸렌이민 1 μg에 대하여 각각 0.5 ∼ 1.5 ㎍ 및 0.5 ∼ 1.5 ㎍의 비율로 복합체화되는 것을 특징으로 하는 분화방법.
KR1020180084732A 2018-07-20 2018-07-20 shRNA 및 pDNA와 복합체화된 나노입자 전달체 및 이를 이용한 분화방법 KR102112140B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180084732A KR102112140B1 (ko) 2018-07-20 2018-07-20 shRNA 및 pDNA와 복합체화된 나노입자 전달체 및 이를 이용한 분화방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180084732A KR102112140B1 (ko) 2018-07-20 2018-07-20 shRNA 및 pDNA와 복합체화된 나노입자 전달체 및 이를 이용한 분화방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200009820A KR20200009820A (ko) 2020-01-30
KR102112140B1 true KR102112140B1 (ko) 2020-05-18

Family

ID=69321850

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180084732A KR102112140B1 (ko) 2018-07-20 2018-07-20 shRNA 및 pDNA와 복합체화된 나노입자 전달체 및 이를 이용한 분화방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102112140B1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102657906B1 (ko) * 2021-06-09 2024-04-15 차의과학대학교 산학협력단 3층 구조를 갖는 다중 유전자 전달체의 제조방법 및 이를 이용한 분화방법

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102461933B1 (ko) * 2016-09-09 2022-10-31 차의과학대학교 산학협력단 연골조직 재건 또는 재생을 위한 유전자 전달체 및 이를 이용한 연골세포로의 분화방법

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cohen, DM. et al., eLIFE, 2016, 4:e06821
Kaifan, Y. et al., the FEBS Journal, 2014, 281:2399-2409
Kim, HJ. et al., Biomaterials, 2018, 177:1-13 (2018.05.29. 공개)*
Yu, S. et al., International Journal of Biological Sciences, 2013, 9(3):256-266*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20200009820A (ko) 2020-01-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Tao et al. Chitosan wound dressings incorporating exosomes derived from microRNA-126-overexpressing synovium mesenchymal stem cells provide sustained release of exosomes and heal full-thickness skin defects in a diabetic rat model
Nguyen et al. Sustained localized presentation of RNA interfering molecules from in situ forming hydrogels to guide stem cell osteogenic differentiation
Rong et al. Hypoxic pretreatment of small extracellular vesicles mediates cartilage repair in osteoarthritis by delivering miR-216a-5p
Jeon et al. Co-delivery of SOX9 genes and anti-Cbfa-1 siRNA coated onto PLGA nanoparticles for chondrogenesis of human MSCs
Choi et al. Efficient mRNA delivery with graphene oxide-polyethylenimine for generation of footprint-free human induced pluripotent stem cells
Pan et al. miR-29b-loaded gold nanoparticles targeting to the endoplasmic reticulum for synergistic promotion of osteogenic differentiation
Peng et al. TAT conjugated cationic noble metal nanoparticles for gene delivery to epidermal stem cells
Park et al. Receptor-mediated gene delivery into human mesenchymal stem cells using hyaluronic acid-shielded polyethylenimine/pDNA nanogels
Choi et al. Glutamine-chitosan modified calcium phosphate nanoparticles for efficient siRNA delivery and osteogenic differentiation
Xia et al. Mechanical stimulation of Schwann cells promote peripheral nerve regeneration via extracellular vesicle-mediated transfer of microRNA 23b-3p
Lin et al. Quantum dots-siRNA nanoplexes for gene silencing in central nervous system tumor cells
Yi et al. Gene expression profiling of chondrogenic differentiation by dexamethasone-conjugated polyethyleneimine with SOX trio genes in stem cells
KR101447901B1 (ko) 지방세포 표적 비바이러스성 유전자 전달체
Xu et al. Nanocarrier‐mediated codelivery of small molecular drugs and siRNA to enhance chondrogenic differentiation and suppress hypertrophy of human mesenchymal stem cells
Jeon et al. Co-delivery of Cbfa-1-targeting siRNA and SOX9 protein using PLGA nanoparticles to induce chondrogenesis of human mesenchymal stem cells
Muroski et al. A gold nanoparticle pentapeptide: gene fusion to induce therapeutic gene expression in mesenchymal stem cells
Okuda et al. Oct-3/4 repression accelerates differentiation of neural progenitor cells in vitro and in vivo
Kim et al. Transfection of gene regulation nanoparticles complexed with pDNA and shRNA controls multilineage differentiation of hMSCs
JP2013518587A (ja) 神経学的障害を治療するために遺伝子改変を伴わずに細胞を再プログラミングするための組成物および方法
Park et al. Construction of PLGA nanoparticles coated with polycistronic SOX5, SOX6, and SOX9 genes for chondrogenesis of human mesenchymal stem cells
JP2012513218A (ja) 遺伝子改変を伴わずに細胞を再プログラミングするための組成物および方法
Liu et al. Bioconjugated carbon dots for delivery of si Tnfα to enhance chondrogenesis of mesenchymal stem cells by suppression of inflammation
Park et al. SOX9 gene plus heparinized TGF-β 3 coated dexamethasone loaded PLGA microspheres for inducement of chondrogenesis of hMSCs
Pan et al. Magnetofection based on superparamagnetic iron oxide nanoparticles weakens glioma stem cell proliferation and invasion by mediating high expression of microRNA-374a
US11957794B2 (en) Biodegradable multilayer nanocapsules for the delivery of biologically active agents in target cells

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant