KR102109932B1 - Bi-functionalized nanoparticles and use thereof - Google Patents

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KR102109932B1
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오승자
김상헌
이효진
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Abstract

The present invention relates to bi-functionalized nanoparticles and uses thereof. A composition according to an aspect contains a nucleic acid molecule combined with c-Met modified on the surface and a nucleic acid molecule combined with nucleolin, thereby being able to significantly improve the delivery efficiency of nanoparticles in cancer cells, and thus enhancing the cancer cell killing effect by the same. Therefore, the composition can be applied as a core technology in the field of cancer treatment.

Description

이중 기능기화된 나노입자 및 이의 용도{Bi-functionalized nanoparticles and use thereof} Bi-functionalized nanoparticles and use thereof

이중 기능기화된 나노입자 및 이의 용도에 관한 것이다.It relates to a double functionalized nanoparticles and their use.

암은 국소에서 발병하여 전신으로 전이되는 질환으로서, 우리나라 성인의 사망 원인 중 1위 또는 2위를 다투는 중요한 질병이다. 암의 치료에 대한 많은 연구에도 불구하고 암 환자의 약 과반수 가량이 결국에는 사망에 이르고 있는 실정이다. 보건 복지부 중앙암등록 본부의 암 발생률 통계 (2016년)에 따르면, 우리나라에서 연간 21만 4천 여명의 신규 암 환자가 발생하고 있으며, 1999년부터 2015년까지의 암의 유병자수는 161만 여명으로 추정하고 있다. 또한, 식생활의 서구화 및 인구의 급격한 고령화에 따라 암 환자의 발생 및 이에 따른 사망은 증가할 것으로 예상되고 있다. Cancer is a disease that develops locally and metastases to the whole body, and is an important disease to fight the 1st or 2nd cause of death in Korean adults. Despite many studies on the treatment of cancer, about a majority of cancer patients eventually die. According to the cancer incidence statistics of the Central Cancer Registration Headquarters of the Ministry of Health and Welfare (2016), there are about 214,000 new cancer patients annually in Korea, and the number of patients with cancer from 1999 to 2015 is 1.61 million. Estimate. In addition, it is expected that the incidence of cancer patients and the resulting death will increase with the westernization of diet and the rapid aging of the population.

현재까지 널리 이용되고 있는 암의 치료법으로는 항암 화학요법, 외과적 수술이 있다. 항암 화학요법은 악성종양을 치료하기 위해 사용하는 방법들 중 수술이나 방사선 요법을 제외한 화학요법제를 총칭하는 것으로, 주로 핵산의 합성을 저해하여 항암활성을 나타내는 물질이 대부분이다. 그 예로, 파클리탁셀 (paclitaxel), 도세탁셀 (docetaxel) 등의 화합물은 미국 식품의약국의 승인을 받아 실제 임상에서 사용되고 있으며, 세포의 미세소관을 과도하게 안정화하여 정상적인 세포 분열을 억제함으로써 그 효과를 나타낸다. 하지만, 이들 항암제는 암 세포 외에도 정상세포, 특히 세포분열이 활발한 정상 조직에도 손상을 입혀 위장관 점막 손상, 탈모, 복통 등의 부작용을 나타내며, 약물 자체의 심각한 독성뿐만 아니라 수용액 상에서의 낮은 용해도로 인하여 그 치료효능이 반감되는 결과를 가져온다. Cancer treatments that are widely used to date include chemotherapy and surgical surgery. Anti-cancer chemotherapy is a generic term for chemotherapy excluding surgery or radiation therapy among methods used to treat malignant tumors. Most of the substances exhibit anti-cancer activity by inhibiting the synthesis of nucleic acids. For example, paclitaxel (doclitaxel), docetaxel (docetaxel), and the like have been approved by the U.S. Food and Drug Administration in practice and are used in clinical practice, and excessively stabilize the microtubules of cells to suppress normal cell division. However, these anti-cancer agents have side effects such as damage to the gastrointestinal mucosa, hair loss, and abdominal pain by damaging normal cells, particularly normal tissues with active cell division, in addition to cancer cells. The result is that the therapeutic efficacy is halved.

또한, 외과적 수술은 종양을 포함하는 조직을 외과적으로 제거하기 때문에 가장 효과적인 근치적 암의 치료법 중 하나이다. 그러나 외과적 수술에 의해 종양을 제거하는 경우, 종양 주변의 정상 조직, 즉 변연 조직 (Margin tissue)을 함께 절개하고 있으며, 통상적으로 전체 종양 주변의 0.5-2 cm의 변연 조직을 함께 절개한다. 따라서, 상기 치료법은 병변 부위가 조직 또는 장기 전체에 산재해 있는 경우에는 이를 적용함에 무리가 있다. In addition, surgical surgery is one of the most effective treatments for radical cancer because it surgically removes the tissue containing the tumor. However, when the tumor is removed by surgical operation, normal tissues around the tumor, that is, marginal tissue, are incised together, and in general, 0.5-2 cm of marginal tissue around the entire tumor is incised together. Therefore, the above treatment is difficult to apply when the lesion site is scattered throughout the tissue or organ.

이러한 기술적 배경 하에서, 암의 치료법 중 하나로서, 암세포 표적 치료에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있으나 (한국 등록특허 10-1797829), 암세포에 대한 낮은 전달 효율로 인해 임상적으로 적용 가능한 수준에는 이르지 못하고 있는 실정이다. Under these technical backgrounds, as one of the treatment methods for cancer, research into cancer cell targeted treatment is actively being conducted (Korean Patent Registration No. 10-1797829), but due to low delivery efficiency to cancer cells, it cannot reach a clinically applicable level. That is true.

일 양상은 c-Met과 결합하는 핵산 분자, 및 뉴클레오린과 결합하는 핵산 분자로 표면 개질된 입자를 포함하는, 생리활성 조절 물질의 암세포 내 전달용 조성물을 제공하는 것이다.One aspect is to provide a composition for intracellular delivery of a physiological activity modulator, comprising a nucleic acid molecule binding to c-Met and a particle surface-modified with a nucleic acid molecule binding to nucleorin.

다른 양상은 c-Met과 결합하는 핵산 분자, 및 뉴클레오린과 결합하는 핵산 분자로 표면 개질된 나노입자를 포함하는, 암의 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다. Another aspect is to provide a pharmaceutical composition for the treatment of cancer, comprising a nanoparticle surface-modified with a nucleic acid molecule that binds c-Met and a nucleic acid molecule that binds nucleorin.

일 양상은 c-Met과 결합하는 핵산 분자, 및 뉴클레오린과 결합하는 핵산 분자로 표면 개질된 입자를 포함하는, 생리활성 조절 물질의 암세포 내 전달용 조성물을 제공한다. One aspect provides a composition for intracellular delivery of a physiological activity modulator, comprising a nucleic acid molecule that binds c-Met and a particle surface-modified with a nucleic acid molecule that binds nucleorin.

본 명세서에서 사용된 용어, "c-Met"은 tyrosine-protein kinase Met 또는 hepatocyte growth factor receptor (HGFR)로도 지칭되며, 타이로신 키나아제 활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 또한, 비정상적으로 활성화된 c-Met은 종양의 성장, 종양 내 혈관 신생, 및 종양의 전이를 유발하는 것으로 알려져 있다. The term "c-Met", as used herein, is also referred to as tyrosine-protein kinase Met or hepatocyte growth factor receptor (HGFR), and is known to have tyrosine kinase activity. It is also known that abnormally activated c-Met causes tumor growth, angiogenesis in the tumor, and metastasis of the tumor.

본 명세서에서 사용된 용어, "뉴클레오린 (Nucleolin)"은 핵소체에 대량 포함되어 있는 RNA 결합 단백질로서, 다양한 암세포의 표면에 풍부하게 존재하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 상기 c-Met과 뉴클레오린간 상호 관계, 특히, 이들의 이중 표적화를 통한 암세포 내 전달 효율 증진 기술에 대해서는 알려진 바가 없다. As used herein, the term "Nucleolin" is an RNA binding protein contained in a large amount in the nucleolus, and is known to be abundantly present on the surface of various cancer cells. However, there is no known correlation between the c-Met and the nucleorin, in particular, a technique for improving the delivery efficiency in cancer cells through their dual targeting.

본 명세서에서 사용된 용어, "핵산 분자"는 올리고뉴클레오티드 쇄이거나 또는 그에 혼입될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 포함할 수 있다. 핵산은 단일 가닥 (센스 또는 안티센스) 또는 이중 가닥일 수 있다. 상기 핵산 분자는 예를 들어, 짧은 간섭 RNA (siRNA), 이중 가닥 RNA (dsRNA), 마이크로-RNA (miRNA), 소형 핵소체 RNA (sno-RNA), Piwi-상호작용 RNA (piRNA), 및 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 분자를 포함할 수 있다. 또한, 상기 핵산 분자는 리보핵산 (RNA), 전달 RNA (tRNA), 데옥시리보핵산 (DNA), 트레오스 핵산 (TNA), 글리콜 핵산 (GNA), 잠금 핵산 (LNA) 또는 그의 하이브리드를 포함할 수 있다. 아울러, 상기 핵산 분자는 암 세포에 발현되어 있는 c-Met 또는 뉴클레오린과 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 분자라면, 그 종류에 관계없이 모두 포함할 수 있고, 예를 들어, 일 실시예에 따른 핵산 분자는 단일 가닥 DNA로 이루어진 압타머일 수 있다. As used herein, the term “nucleic acid molecule” can include any compound and / or substance that is or can be incorporated into an oligonucleotide chain. The nucleic acid can be single stranded (sense or antisense) or double stranded. The nucleic acid molecule can be, for example, short interfering RNA (siRNA), double stranded RNA (dsRNA), micro-RNA (miRNA), small nucleolus RNA (sno-RNA), Piwi-interacting RNA (piRNA), and short hairpins. RNA (shRNA) molecules. In addition, the nucleic acid molecule may include ribonucleic acid (RNA), transfer RNA (tRNA), deoxyribonucleic acid (DNA), throse nucleic acid (TNA), glycol nucleic acid (GNA), locked nucleic acid (LNA) or hybrids thereof. Can be. In addition, if the nucleic acid molecule is a nucleic acid molecule capable of specifically binding to c-Met or nucleoline expressed in cancer cells, it may include all, regardless of its type, for example, in one embodiment The nucleic acid molecule according to may be an aptamer consisting of single-stranded DNA.

본 명세서에서 사용된 용어, "압타머"는 특정 표적물질에 대해 높은 친화도와 선택성을 가지는 단일가닥 DNA 또는 RNA를 지칭한다. 상대적으로 안정성이 우수하여 실온에서 장기간 보존이 가능하며, 화학적 변형이 용이하여 비교적 간단하고 적은 비용으로 생산할 수 있고, 변성이 되더라도 다시 짧은 시간에 재생 가능한 여러 장점을 갖는다. 일 실시예에 따른 압타머는 c-Met 또는 뉴클레오린과 특이적으로 결합하는 것으로서, 보다 구체적으로, 암 세포에 발현되어 있는 c-Met 또는 뉴클레오린과 특이적으로 결합할 수 있는 압타머를 의미할 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어질 수 있다.As used herein, the term "aptamer" refers to single-stranded DNA or RNA that has high affinity and selectivity for a specific target material. It is relatively stable and can be stored for a long time at room temperature, and it is easy to produce chemically, so it is relatively simple and can be produced at low cost. The aptamer according to an embodiment specifically binds c-Met or nucleorin, and more specifically, an aptamer capable of specifically binding c-Met or nucleorin expressed in cancer cells. It may mean, for example, may consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.

본 명세서에서, 상기 표면 개질은 입자의 표면 상에 상기 c-Met과 결합하는 압타머, 및 뉴클레오린과 결합하는 압타머를 결합, 중합, 또는 코팅시키는 것을 포함할 수 있으며, 생체에 적용 가능한 입자의 표면에 압타머를 고정화시킬 수 있는 당해 분야에 공지된 다양한 방법이 적용될 수 있다. 일 실시예에 따르면, 입자 표면과 압타머간 결합을 위하여, 압타머의 일 말단에 티올기, 아민기, 카복실기, N-Hydroxysuccinimide (NHS) 가 도입되어 있을 수 있으며, 예를 들어, 5'말단 위치에 티올기, 아민기, 카복실기, 또는 N-Hydroxysuccinimide (NHS)가 도입되어 있을 수 있다. 또한, 상기 c-Met과 결합하는 압타머, 및 뉴클레오린과 결합하는 압타머는 0.5:1 내지 1:0.5 (v/v)의 비율로 입자의 표면 상에 결합되어 있을 수 있으나, 이러한 비율은 적의 변경될 수 있다. In the present specification, the surface modification may include binding, polymerizing, or coating an aptamer binding to the c-Met and an aptamer binding to the nucleoline on the surface of the particle, and applicable to a living body. Various methods known in the art that can immobilize the aptamer on the surface of the particles can be applied. According to an embodiment, a thiol group, an amine group, a carboxyl group, and N-Hydroxysuccinimide (NHS) may be introduced at one end of the aptamer for bonding between the particle surface and the aptamer, for example, at the 5 'end The thiol group, amine group, carboxyl group, or N-Hydroxysuccinimide (NHS) may be introduced at the position. In addition, the aptamer binding to the c-Met, and the aptamer binding to the nucleorin may be bound on the surface of the particle in a ratio of 0.5: 1 to 1: 0.5 (v / v), but this ratio Enemies may change.

본 명세서에서, 상기 입자는 암세포로 전달 가능한 다양한 소재의 물질로 이루어질 수 있다. 일 구체예에서, 상기 입자는 생리활성 조절 물질을 포함하는 전달체를 의미할 수 있으며, 상기 전달체는 지질, 리포좀, 미세입자, 금, 나노입자, 생체 적합성 폴리머로 이루어질 수 있다. 이 경우, 생리활성 조절 물질은 상기 입자에 혼합 또는 봉입되어 있거나, 상기 입자에 결합되어 있을 수 있다. 다른 구체예로서, 상기 입자는 생리활성 조절 물질 그 자체를 의미할 수 있으며, 이 경우, 상기 입자는 전술한 압타머와 결합하여 복합체를 형성하는 형태일 수 있다. In the present specification, the particles may be made of various materials capable of being delivered to cancer cells. In one embodiment, the particles may mean a transporter comprising a bioactive modulator, and the transporter may consist of lipids, liposomes, microparticles, gold, nanoparticles, biocompatible polymers. In this case, the bioactive substance may be mixed or enclosed in the particles, or may be bound to the particles. In another embodiment, the particles may mean the physiological activity regulating substance itself, and in this case, the particles may be in the form of combining with the aforementioned aptamer to form a complex.

본 명세서에서, 상기 생리활성 조절 물질은 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 항체, 화학물질, 바이러스, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. In the present specification, the bioactive substance may be any one selected from the group consisting of nucleic acids, peptides, polypeptides, antibodies, chemicals, viruses, and combinations thereof.

다른 양상은 c-Met과 결합하는 핵산 분자, 및 뉴클레오린과 결합하는 핵산 분자로 표면 개질된 나노입자를 포함하는, 암의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.Another aspect provides a pharmaceutical composition for the treatment of cancer, comprising a nucleic acid molecule that binds c-Met and nanoparticles that are surface-modified with a nucleic acid molecule that binds nucleorin.

본 명세서에서 사용된 용어, "치료"는 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 암에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.As used herein, the term "treatment" refers to any action in which symptoms of cancer are improved or beneficially altered by administration of the pharmaceutical composition.

상기 약학적 조성물에 의한 치료 대상 질병인 "암 (cancer)" 은 세포가 정상적인 성장 한계를 무시하고 분열 및 성장하는 공격적 (aggressive) 특성, 주위 조직에 침투하는 침투적 (invasive) 특성 및 체내의 다른 부위로 퍼지는 전이적 (metastatic) 특성을 갖는 세포에 의한 질병을 총칭하는 의미이다. 본 명세서에서, 암의 종류로는, 예를 들어, 흑색종, 자궁 경부암, 췌장암, 위암, 간암, 대장암, 뇌암, 유방암, 갑상선암, 방광암, 식도암, 자궁암, 또는 폐암일 수 있으며, 예를 들어, HER-2 양성 암으로서, 위암 또는 유방암일 수 있다. The “cancer,” a disease to be treated by the pharmaceutical composition, is an aggressive property in which cells divide and grow, ignoring normal growth limits, an invasive property penetrating surrounding tissues, and other in the body. It is a generic term for diseases caused by cells with metastatic properties spreading to the site. In the present specification, the type of cancer may be, for example, melanoma, cervical cancer, pancreatic cancer, stomach cancer, liver cancer, colon cancer, brain cancer, breast cancer, thyroid cancer, bladder cancer, esophageal cancer, uterine cancer, or lung cancer, for example. , As a HER-2 positive cancer, may be gastric cancer or breast cancer.

일 실시예에 따르면, c-Met과 결합하는 압타머 및 뉴클레오린과 결합하는 압타머를 사용한 이중 표적화, 또는 입자 표면상의 이중-기능기화는, 암세포 내 치료 물질의 전달 효율을 유의적으로 향상시킬 수 있었고, 이에 따라, 치료 물질의 투여 용량 감소, 암세포의 사멸 효과 증진 등을 비롯한 치료 효능을 증진시킴에 기여할 수 있다. According to one embodiment, dual targeting using aptamers that bind c-Met and aptamers that bind nucleorins, or dual-functionalization on the particle surface, significantly improves the delivery efficiency of therapeutic substances in cancer cells Accordingly, it can contribute to enhancing therapeutic efficacy, including reducing the dose of therapeutic substances and enhancing the killing effect of cancer cells.

일 구체예에서, 상기 나노입자는 암의 치료 효과를 갖는 금 나노입자일 수 있다. 상기 금 나노입자의 크기는 20 내지 100nm일 수 있으며, 표면에 복수 개의 돌기를 포함할 수 있다. 이러한 구조는 보다 넓은 표면적을 제공하고, 세포 내 수용체를 인식하는 과정에서 야기될 수 있는 입체적 장애를 감소시킴으로써, 암세포 내로의 전달 효율을 더욱 증가시킬 수 있다.In one embodiment, the nanoparticles may be gold nanoparticles having a therapeutic effect on cancer. The gold nanoparticles may have a size of 20 to 100 nm, and may include a plurality of protrusions on the surface. Such a structure can further increase the efficiency of delivery into cancer cells by providing a larger surface area and reducing steric hindrances that may occur in the process of recognizing intracellular receptors.

상기 약학적 조성물은 콜로이드 현탁액, 분말, 식염수, 지질, 리포좀, 미소구체 (microspheres), 또는 나노 구형입자와 같은 약학적으로 허용될 수 있는 담체에 의해 운반될 수 있다. 이들은 운반 수단과 복합체를 형성하거나 관련될 수 있고, 지질, 리포좀, 미세입자, 폴리머, 축합 반응제, 다당류, 폴리아미노산, 덴드리머, 사포닌, 흡착 증진 물질 또는 지방산과 같은 당업계에 공지된 운반 시스템을 사용하여 생체 내 운반 또는 전달될 수 있다. The pharmaceutical composition can be carried by a pharmaceutically acceptable carrier such as colloidal suspension, powder, saline, lipids, liposomes, microspheres, or nanospherical particles. These can be complexed with or associated with a transport vehicle, and can be used in transport systems known in the art such as lipids, liposomes, microparticles, polymers, condensation reagents, polysaccharides, polyamino acids, dendrimers, saponins, adsorption enhancing substances or fatty acids. Can be transported or delivered in vivo.

이 외에도, 약학적으로 허용되는 담체는 제제시 통상적으로 이용되는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아, 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.In addition to this, pharmaceutically acceptable carriers include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia, rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, Polyvinyl pyridone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propyl hydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil, and the like, but is not limited thereto. In addition, lubricants, wetting agents, sweetening agents, flavoring agents, emulsifying agents, suspending agents, preservatives, etc. may be further included in addition to the above components.

상기 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여 (예를 들어, 근육 내, 정맥 내, 복강 내, 피하, 피내, 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.The pharmaceutical composition may be administered orally or parenterally (e.g., applied intramuscularly, intravenously, subcutaneously, subcutaneously, or topically) according to the desired method, and the dosage is It depends on the body weight, the degree of disease, the type of drug, the route of administration and time, but can be appropriately selected by those skilled in the art.

상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 항암제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 항암제와는 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. The pharmaceutical composition is administered in a pharmaceutically effective amount. In the present invention, "a pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is the type of patient's disease, severity, activity of the drug, Sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and rate of excretion, duration of treatment, factors including co-drugs and other factors well known in the medical arts may be determined. The pharmaceutical composition may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other anti-cancer agents, and may be administered simultaneously, separately, or sequentially with conventional anti-cancer agents, and may be administered in single or multiple doses.

상기 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율, 배설 속도, 질병 종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라 증감될 수 있다The effective amount of the pharmaceutical composition may vary depending on the patient's age, gender, condition, weight, absorption of active ingredients in the body, inactivation rate, excretion rate, disease type, and drugs used in combination, administration route, severity of obesity, May increase or decrease depending on gender, weight, age, etc.

상기 약학적 조성물에서 언급된 용어 또는 요소 중 상기 암세포 내 전달용 조성물에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 상기 조성물에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.It is understood that the terms or elements mentioned in the pharmaceutical composition, such as those mentioned in the description of the composition for delivery in cancer cells, are as mentioned in the description of the composition.

일 양상에 따른 조성물은, 표면 상에 개질되어 있는 c-Met과 결합하는 핵산 분자, 및 뉴클레오린과 결합하는 핵산 분자를 포함함으로써, 나노입자의 암세포 내 전달 효율을 현저하게 향상시킬 수 있었고, 이를 통해 암세포 사멸 효과를 증진시킬 수 있었다. 따라서, 암 치료 분야의 핵심 기술로 응용될 수 있을 것으로 기대된다. The composition according to one aspect, by including a nucleic acid molecule binding to the c-Met modified on the surface, and a nucleic acid molecule binding to nucleorin, it was possible to significantly improve the efficiency of the nanoparticles in cancer cells, Through this, it was possible to enhance the cancer cell killing effect. Therefore, it is expected to be applied as a core technology in the field of cancer treatment.

도 1은 일 실시예에 따른 나노 구조체 (AuNS-C, AuNS-N, 및 AuNS-CN)의 세포 내 흡수 과정을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 2의 A는 일 실시예에 따른 나노 구조체의 투과 전자 현미경 이미지와, 각각의 나노 구조체 (AuNS-C, AuNS-N, 및 AuNS-H)에 의한 표면 플라즈몬 공명의 변화를 확인한 결과이다.
도 2의 B는 일 실시예에 따른 나노 구조체 (AuNS-C, AuNS-N, 및 AuNS-H)에서, 로딩된 압타머의 양 및 제타 전위를 측정한 결과이다.
도 2의 C는 MKN-45, A549, 및 SKBR-3 세포주에서, 일 실시예에 따른 나노 구조체 (AuNS-C, AuNS-N, 및 AuNS-H)를 처리한 후, 세포 당 금 나노입자의 함량을 측정한 결과이다.
도 3의 A는 일 실시예에 따른 나노 구조체 (AuNS-C, AuNS-N, 및 AuNS-H)의 세포 내 흡수 (도입) 여부를 형광 염색을 통해 확인한 결과이다.
도 3의 B는 MKN-45, 및 SKBR-3 세포주에서, 일 실시예에 따른 나노 구조체 (AuNS-C, AuNS-N, 및 AuNS-H)의 처리에 의한 생존율 변화를 확인한 결과이다.
도 3의 C는 MKN-45, A549, 및 SKBR-3 세포주에서, 일 실시예에 따른 나노 구조체 (AuNS-C, AuNS-N, 및 AuNS-H)의 처리 농도별 생존율 변화를 확인한 결과이다.
도 4는 일 실시예에 따른 나노 구조체 (AuNS-C, AuNS-N, 및 AuNS-H)의 처리에 의한 MKN-45 세포의 전체적 유전자 발현을 프로파일링한 결과이다.
도 5의 A는 일 실시예에 따른 이중 기능기화된 나노 구조체 (Nucleolin+c-Met, Nucleolin+Her2, c-Met+Her2)의 처리에 따른 MKN-45 세포의 생존율 변화를 확인한 결과이다.
도 5의 B는 일 실시예에 따른 이중 기능기화된 나노 구조체 (AuNS-CN)와 자유 압타머 또는 자유 압타머 혼합물을 사용하여, 각각의 처리에 따른 생존율 변화를 비교한 결과이다.
도 5의 C는 일 실시예에 따른 이중 기능기화된 나노 구조체 (AuNS-CN)를 MKN-45 세포에 처리한 후, 세포 내 존재하는 압타머의 위치를 형광 염색을 통해 확인한 결과이다.
도 6의 A는 일 실시예에 따른 나노 구조체와 이들의 표적 수용체간 결합을 면역 블롯팅 방법으로 확인한 결과이다.
도 6의 B는 항-뉴클레오린 항체를 자성 입자의 표면에 고정화시킨 뒤, 상기와 c-Met간 특이적 결합을 면역 블롯팅 방법으로 확인한 결과이다.
도 6의 C는 일 실시예에 따른 이중 기능기화된 나노 구조체 (AuNS-CN)를 처리한 경우와, AuNS-C 및 AuNS-N을 순차적으로 또는 동시에 처리한 경우간 각각의 처리에 따른 생존율 변화를 비교한 결과이다.
도 7의 A는 일 실시예에 따른 나노 구조체 (단일의 압타머-AuNS 또는 AuNS-CN)를 처리한 후, 세포의 유전자 클러스터링 결과를 나타낸 것이다.
도 7의 B는 일 실시예에 따른 나노 구조체 (AuNS-CN)를 처리한 후, 세포 주기와 관련된 유전자 농축 패턴을 확인한 결과이다.
도 8은 일 실시예에 따른 나노 구조체 (AuNS-CN)를 처리한 후, 상기 유전자 농축 패턴과 관련된 상위 50개의 바이오 마커의 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 9는 일 실시예에 따른 나노 구조체 (AuNS-CN)를 처리한 후, 형광-활성화 세포 분류 (FACS)를 통해 MKN-45 세포의 세포 주기를 분석한 결과이다.
도 10의 A는 MKN-45 이종 이식 마우스 모델에 일 실시예에 따른 이중 기능기화된 나노 구조체 (AuNS-CN)를 종양 내 주사한 후, 시간의 경과에 따라 종양의 부피 변화를 비교한 결과이다.
도 10의 B는 MKN-45 이종 이식 마우스 모델에 일 실시예에 따른 이중 기능기화된 나노 구조체 (AuNS-CN)를 종양 내 주사한 지 14일째, 종양 조직을 육안으로 관찰한 결과이다.
도 10의 C는 MKN-45 이종 이식 마우스 모델에 일 실시예에 따른 이중 기능기화된 나노 구조체 (AuNS-CN)를 종양 내 주사한 지 14일째, 종양 조직을 현미경으로 관찰한 결과이다. 1 is a schematic diagram schematically showing the intracellular uptake process of nanostructures (AuNS-C, AuNS-N, and AuNS-CN) according to an embodiment.
2A is a result of confirming a change in surface plasmon resonance by a transmission electron microscope image of a nanostructure according to an embodiment and each nanostructure (AuNS-C, AuNS-N, and AuNS-H).
2B is a result of measuring the amount and zeta potential of the loaded aptamer in the nanostructures (AuNS-C, AuNS-N, and AuNS-H) according to an embodiment.
C of FIG. 2 shows the nanostructures (AuNS-C, AuNS-N, and AuNS-H) according to an embodiment of the MKN-45, A549, and SKBR-3 cell lines, and then the gold nanoparticles per cell. It is the result of measuring the content.
3A is a result of confirming whether the nanostructures (AuNS-C, AuNS-N, and AuNS-H) of the nanostructures according to an embodiment are absorbed (introduced) through fluorescence staining.
3B is a result of confirming a change in survival rate by treatment of nanostructures (AuNS-C, AuNS-N, and AuNS-H) according to an embodiment in the MKN-45 and SKBR-3 cell lines.
3C is a result of confirming the change in viability according to the treatment concentration of nanostructures (AuNS-C, AuNS-N, and AuNS-H) according to an embodiment in the MKN-45, A549, and SKBR-3 cell lines.
4 is a result of profiling the overall gene expression of MKN-45 cells by treatment of nanostructures (AuNS-C, AuNS-N, and AuNS-H) according to an embodiment.
5A is a result of confirming a change in the survival rate of MKN-45 cells according to the treatment of a dual-functionalized nanostructure (Nucleolin + c-Met, Nucleolin + Her2, c-Met + Her2) according to an embodiment.
5B is a result of comparing the survival rate change according to each treatment, using a double-functionalized nanostructure (AuNS-CN) and a free aptamer or free aptamer mixture according to an embodiment.
5C is a result of confirming the position of the aptamer present in the cell through fluorescence staining after treating the double-functionalized nanostructure (AuNS-CN) according to an embodiment with MKN-45 cells.
6A is a result of confirming the binding between the nanostructures and their target receptors according to an embodiment by an immunoblotting method.
6B is a result of confirming the specific binding between the c-Met and the c-Met after immobilizing the anti-nucleorin antibody on the surface of the magnetic particle.
C of FIG. 6 shows a change in the survival rate according to each treatment between a case in which a dual-functionalized nanostructure (AuNS-CN) is treated and an AuNS-C and AuNS-N are sequentially or simultaneously treated according to an embodiment. It is the result of comparing.
7A shows the results of gene clustering of cells after treatment with a nanostructure (single aptamer-AuNS or AuNS-CN) according to an embodiment.
7B is a result of confirming a gene enrichment pattern related to a cell cycle after processing a nanostructure (AuNS-CN) according to an embodiment.
8 is a result of confirming the expression change of the top 50 biomarkers related to the gene enrichment pattern after processing the nanostructure (AuNS-CN) according to an embodiment.
9 is a result of analyzing the cell cycle of MKN-45 cells through fluorescence-activated cell sorting (FACS) after processing a nanostructure (AuNS-CN) according to an embodiment.
10A is a result of comparing the volume change of a tumor over time after injecting a bifunctionalized nanostructure (AuNS-CN) according to an embodiment into an MKN-45 xenograft mouse model in an tumor. .
FIG. 10B is a result of visually observing tumor tissue on the 14th day after intra-tumoral injection of the dual functionalized nanostructure (AuNS-CN) according to an embodiment to the MKN-45 xenograft mouse model.
FIG. 10C shows the results of observing tumor tissues under a microscope on the 14th day after intra-tumoral injection of a dual functionalized nanostructure (AuNS-CN) according to an embodiment to an MKN-45 xenograft mouse model.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

실시예 1. 실험 과정 및 실험재료Example 1. Experimental process and experimental materials

1-1. 실험재료 1-1. Experimental material

Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 (Invitrogen, Carlsbad, California, USA), 우태아 혈청 (FBS, Invitrogen), 1% 항생제 (antibiotic-antimycotic (AA)) 용액 (Invitrogen), Dulbecco's modified Eagle's 배지 (DMEM; Gibco, Invitrogen), 1,4-디티오트레이톨 (DTT) (Sigma-Aldrich, St. Louise, USA), 방사면역침전분석 (RIPA) 완충액 (89900, Pierce), 비신코닌 산 분석 (23225, ThermoFisher, Massachusetts, USA), 샘플 완충액 (125mM Tris, pH 6.8, 4% 소듐도데실 설페이트 [SDS], 10% 글리세롤, 0.006% 브로모페놀 블루, 및 1.8% 머캅토 에탄올), 프리캐스트 단백질 겔 (4561094, Bio-Rad, Hercules, CA, USA), 일차 항체, 항-c-Met (ab51067, Abcam, Cambridge, England, 4560, Cell Signaling, Massachusetts, USA), 항-뉴클레오린 (Abcam ab22578 /ab13541), 항-HER2 (SC-08, Santa Cruz, Texas, USA), 항-GAPDH (SC-47724, Santa Cruz), MTS 어세이 용액 (G3585, Promega, Wisconsin, USA), μ-Slide 8 웰 (ibid Mchen, Germany), 4',6-디아미디노-2-페닐인돌이 첨가된 벡타쉴드마운팅 배지, 메트리겔 (BD Biosciences, New Jersey, USA) 뉴저지, 미국)이 본 실시예에서 사용되었다.Roswell Park Memorial Institute (RPMI) -1640 (Invitrogen, Carlsbad, California, USA), fetal bovine serum (FBS, Invitrogen), 1% antibiotic (antibiotic-antimycotic (AA)) solution (Invitrogen), Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) ; Gibco, Invitrogen), 1,4-dithiothreitol (DTT) (Sigma-Aldrich, St. Louise, USA), radioimmunoprecipitation analysis (RIPA) buffer (89900, Pierce), bicinconin acid analysis (23225) , ThermoFisher, Massachusetts, USA), sample buffer (125 mM Tris, pH 6.8, 4% sodium dodecyl sulfate [SDS], 10% glycerol, 0.006% bromophenol blue, and 1.8% mercapto ethanol), precast protein gel (4561094, Bio-Rad, Hercules, CA, USA), primary antibody, anti-c-Met (ab51067, Abcam, Cambridge, England, 4560, Cell Signaling, Massachusetts, USA), anti-nucleoline (Abcam ab22578 / ab13541), anti-HER2 (SC-08, Santa Cruz, Texas, USA), anti-GAPDH (SC-47724, Santa Cruz), MTS assay solution (G3585, Promega, Wisconsin, USA), μ-Slide 8 well (ibid Mchen, Germany), 4 ', 6-diami No-2-phenyl indole are added to the vectors shield mounting medium meth matrigel (BD Biosciences, New Jersey, USA), New Jersey, USA) was used in this embodiment.

　

1-2. 세포 배양 1-2. Cell culture

모든 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, Virginia, USA). Manassas, Virginia, USA)으로부터 구매하였다. MKN-45 및 SKBR-3 세포주는 10% 우태아 혈청 (FBS, Invitrogen), 1% 항생제 (antibiotic-antimycotic (AA)) 용액 (Invitrogen)이 첨가된, Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 (Invitrogen, Carlsbad, California, USA)에서 성장시켰다. A549 세포주는 10% FBS 및 1% AA가 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's 배지 (DMEM; Gibco, Invitrogen)에서 성장시켰다. 모든 세포주는 37℃, 5%의 CO2 조건에서 성장시켰다. All cell lines are American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, Virginia, USA). Manassas, Virginia, USA). MKN-45 and SKBR-3 cell lines are Roswell Park Memorial Institute (RPMI) -1640 (Invitrogen) with 10% fetal calf serum (FBS, Invitrogen), 1% antibiotic (antibiotic-antimycotic (AA)) solution (Invitrogen) , Carlsbad, California, USA). The A549 cell line was grown in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Gibco, Invitrogen) supplemented with 10% FBS and 1% AA. All cell lines were grown at 37 ° C., 5% CO 2 conditions.

1-3. 압타머로 기능기화된 AuNS의 합성 1-3. Synthesis of AuNS functionalized with aptamers

5' 말단에 디설파이드 변형을 갖는 항-뉴클레오린, 항-HER2, 및 항-c-Met 압타머는 IDT DNA Inc (IDT, Iowa, USA). 아이오와, 미국)으로부터 구매하였다. 구체적인 서열은 다음과 같다: 항-뉴클레오린 (5'- (C6-S-S-C6)-TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTG-3′); 항-HER2 (5'-(C6-S-S-C6)-GCAGCGGTGTGGGGGCAGCGGTGTGGGGGCAGCGGTGTGGGG-3'); 및 항-c-Met (5'-(C6-S-S-C6)-ATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGAT-3). 고성능 액체크로마토그래피 (HPLC)-정제된 압타머를 Millipore water (18.2MΩcm)에 용해시켜 100μM의 용액을 수득하였다. 이후, 상기 100μL의 압타머 용액에 100μL의 100mM 1,4-디티오트레이톨 (DTT) (Sigma-Aldrich, St. Louise, USA)을 첨가하여 이황화 결합을 절단하였다. DTT 시약을 통해 환원된 이황화 결합 (S-S)은 각각 티올기 (-SH)를 형성하였으며, 상기 티올기는 추후 금 나노입자의 표면과 금-티올 결합(gold-thiol bond)을 형성하였다. 이로부터 1시간 후, DTT가 제거되고, 티올기화된 압타머는 Nap-5 컬럼을 사용하여 분리되었다. 상기 티올기화된 DNA의 농도는 260nm 파장에서의 흡광도 측정에 의해 산출되었다. 25mM의 시트르산 완충액 (pH 3) 내에서, 상기 압타머 용액에 0.3nM AuNS를 첨가하고 (DNA: AuNS의 최종 농도비=1.600:1), 밤새도록 인큐베이션시켜 나노 구조체를 형성하였다 (항-뉴클레오린-AuNS, 항-HER2-AuNS, 및 항-c-Met-AuNS, 일 실시예에 따른 나노 구조체는 본원의 나노입자와 대응됨). 또한, 이중-기능기화된 나노 구조체를 제조하기 위하여, 2 가지 유형의 환원형 압타머를 1:1의 비율 (v/v)로 혼합하고, 상기 혼합물을 AuNS에 첨가하였다. 이 경우, 금 나노입자의 표면에 결합되어 있는 압타머간 비율(c-Met 압타머: nucleolin 압타머) 은 약 2:1 가량으로 관찰되었다 (미도시).Anti-nucleorin, anti-HER2, and anti-c-Met aptamers with disulfide modifications at the 5 'end are IDT DNA Inc (IDT, Iowa, USA). Iowa, USA). The specific sequence is as follows: anti-nucleorin (5'- (C6-S-S-C6) -TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTG-3 '); Anti-HER2 (5 '-(C6-S-S-C6) -GCAGCGGTGTGGGGGCAGCGGTGTGGGGGCAGCGGTGTGGGG-3'); And anti-c-Met (5 '-(C6-S-S-C6) -ATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGAT-3). High performance liquid chromatography (HPLC) -purified aptamer was dissolved in Millipore water (18.2 MΩcm) to obtain a solution of 100 μM. Thereafter, 100 μL of 100 mM 1,4-dithiothreitol (DTT) (Sigma-Aldrich, St. Louise, USA) was added to the 100 μL aptamer solution to cut disulfide bonds. The disulfide bonds (S-S) reduced through the DTT reagent each formed a thiol group (-SH), and the thiol group later formed a gold-thiol bond with the surface of the gold nanoparticles. After 1 hour from this, DTT was removed and the thiolated aptamer was separated using a Nap-5 column. The concentration of the thiolated DNA was calculated by absorbance measurement at 260 nm wavelength. In 25 mM citric acid buffer (pH 3), 0.3 nM AuNS was added to the aptamer solution (DNA: final concentration ratio of AuNS = 1.600: 1) and incubated overnight to form a nanostructure (anti-nucleoline -AuNS, anti-HER2-AuNS, and anti-c-Met-AuNS, nanostructures according to one embodiment correspond to nanoparticles herein). In addition, to prepare a double-functionalized nanostructure, two types of reduced aptamers were mixed in a ratio of 1: 1 (v / v), and the mixture was added to AuNS. In this case, the ratio of aptamers bound to the surface of the gold nanoparticles (c-Met aptamer: nucleolin aptamer) was observed at about 2: 1 (not shown).

1-4. AuNS의 압타머-로딩 용량의 정량화1-4. Quantification of the aptamer-loading capacity of AuNS

Cy3로 표지된 뉴클레오닌 압타머 (5′-(C6-S-S-C6)-Cy3-TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTG-3'), 및 Cy5로 표지된 c-Met 압타머(5′-(C6-S-S-C6)-Cy5-ATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGG TGGGTTGGCAAGTCTGAT-3′를 사용하여, 각각의 AuNS 입자 상에 존재하는 압타머의 수를 추산하였다. AuNS에 대한 Cy3-뉴클레오닌 및 Cy5-c-Met의 결합은 종전에 기술된 방식으로 수행되었다. 총 500μL의 형광물질-표지된 압타머-AuNS를 13,500rpm에서 11분 동안 원심분리하였다. 이후, 상등액을 제거하고, 나노 구조체를 1mL를 50mM의 HEPES 완충액 상에 부유시켰다. 이러한 과정을 2회 반복하여 비결합된 압타머를 제거하였다. 형광된-표지된 나노 구조체 펠렛에 50 μL의 25mM 시안화 칼륨 (KCN)을 밤새도록 처리하여, 나노 구조체와 Au 코어를 분리시키고, Cy3-압타머, 또는 Cy5-압타머를 방출시켰다. 이후, NanoDrop 분광 광도계를 사용하여 KCN 용액의 형광 강도를 측정하고, 표준 곡선 신호의 강도에 따라 압타머의 농도를 측정하였다. Cy3 labeled nucleonin aptamer (5 '-(C6-SS-C6) -Cy3-TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTG-3'), and Cy5 labeled c-Met aptamer (5 '-(C6-SS-C6) The number of aptamers present on each AuNS particle was estimated using -Cy5-ATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGG TGGGTTGGCAAGTCTGAT-3 'The binding of Cy3-nucleonin and Cy5-c-Met to AuNS was previously described A total of 500 μL of fluorescence-labeled aptamer-AuNS was centrifuged at 13,500 rpm for 11 minutes, after which the supernatant was removed and 1 mL of the nanostructures were suspended in 50 mM HEPES buffer. The unbound aptamer was removed by repeating 2 times. The fluorescently-labeled nanostructure pellet was treated with 50 μL of 25 mM potassium cyanide (KCN) overnight to separate the nanostructure from the Au core, and Cy3-pressure. The Tamer, or Cy5-aptamer was released, and then for KCN using a NanoDrop spectrophotometer. Measuring the fluorescence intensity, and measured the concentration of aptamer in accordance with the intensity of the standard curve signal.

1-5. 웨스턴 블롯 1-5. Western blot

세포 (5×105 세포/㎖)는6-웰 플레이트 내 완전 배지에서 24시간 동안 배양되었다. 여기에 나노 구조체를 처리한 후, 세포를 수집하고, 이를 미세 원심 분리 관으로 옮겼다. 세포의 용해를 위해, 방사면역침전 분석 (RIPA) 완충액 (89900, Pierce)을 첨가하고, 상기 세포를 아이스 상에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 단백질의 양은 비신코닌 산 분석 (23225, ThermoFisher, Massachusetts, USA)에 의해 추산되었다. 동일한 부피의 샘플 완충액 (125mM Tris, pH 6.8, 4% 소듐 도데실 설페이트 [SDS], 10% 글리세롤, 0.006% 브로모페놀 블루, 및 1.8% 머캅토 에탄올)을 모든 샘플에 첨가하고, 상기 용액을 5분 동안 끓였다. 세포로부터 유래한 15μg의 총 단백질은 프리캐스트 단백질 겔 (4561094, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)의 각 웰에 로딩되었다. 120 V 에서 60분 동안 전기 영동을 실시한 후, 단백질은 1A의 정전류로 1시간 동안, 전달 완충액에서, 겔로부터 폴리비닐리덴 플루오라이드 (polyvinylidene fluoride, PVDF) 멤브레인으로 옮겨졌다. 블롯은 전달 기기로부터 제거되었고, 이는 즉시 차단 완충액 (5 % 탈지 건조유, 10mM Tris, pH 7.5, 100 mM 염화나트륨[NaCl], 및 0.1% Tween-20)으로 옮겨졌다. 실온에서 1 시간 동안 차단시킨 후, 상기 멤브레인은 일차 항체, 항-c-Met (ab51067, Abcam, Cambridge, England, 4560, Cell Signaling, Massachusetts, USA), 항-뉴클레오린 (Abcam ab22578/ab13541), 항-HER2 (SC-08, Santa Cruz, Texas, USA), 및 항-GAPDH (SC-47724, Santa Cruz)와 함께 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 상기 일차 항체 용액과 함께 인큐베이션시킨 후, 멤브레인을 2 회 세척하고 (10mM Tris pH 7.5, 100 mM NaCl, and 0.1% Tween-20), 5% 탈지 건조유로 희석된 고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP)-접합 항-마우스 IgG (2차 항체) 용액과 함께 실온에서 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 1 시간 후, 항체 용액을 제거하고, 0.1% 멤브레인을 세척 완충액 (10 mM Tris pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.1 % Tween-20)으로 3회 세척하였다. 상기 단백질 밴드는 강화된 화학 형광 기질로 검출되었다 (Atto, Tokyo, Japan). 블롯 내 각 단백질의 양은 ImageJ를 사용하여 각 밴드의 총 픽셀 수 (집적 밀도 값)를 산출함으로써 측정되었다.Cells (5 × 10 5 cells / ml) were cultured in complete medium in 6-well plates for 24 hours. After processing the nanostructures, cells were collected and transferred to a microcentrifuge tube. For lysis of cells, radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer (89900, Pierce) was added and the cells were incubated on ice for 30 minutes. The amount of protein was estimated by bicinconic acid analysis (23225, ThermoFisher, Massachusetts, USA). Equal volume of sample buffer (125 mM Tris, pH 6.8, 4% sodium dodecyl sulfate [SDS], 10% glycerol, 0.006% bromophenol blue, and 1.8% mercapto ethanol) was added to all samples and the solution Boil for 5 minutes. 15 μg of total protein from cells were loaded into each well of a precast protein gel (4561094, Bio-Rad, Hercules, CA, USA). After electrophoresis at 120 V for 60 minutes, the protein was transferred from the gel to the polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane in a transfer buffer for 1 hour at a constant current of 1A. The blot was removed from the delivery instrument, which was immediately transferred to blocking buffer (5% skim dry oil, 10 mM Tris, pH 7.5, 100 mM sodium chloride [NaCl], and 0.1% Tween-20). After blocking at room temperature for 1 hour, the membrane was primary antibody, anti-c-Met (ab51067, Abcam, Cambridge, England, 4560, Cell Signaling, Massachusetts, USA), anti-nucleoline (Abcam ab22578 / ab13541) , Incubated with anti-HER2 (SC-08, Santa Cruz, Texas, USA), and anti-GAPDH (SC-47724, Santa Cruz) overnight at 4 ° C. After incubation with the primary antibody solution, the membrane was washed twice (10 mM Tris pH 7.5, 100 mM NaCl, and 0.1% Tween-20) and wasabi peroxidase (HRP) -conjugated diluted with 5% skim dry oil. Incubated with anti-mouse IgG (secondary antibody) solution at room temperature. After 1 hour of incubation, the antibody solution was removed and the 0.1% membrane was washed 3 times with wash buffer (10 mM Tris pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20). The protein band was detected with an enhanced chemiluminescent fluorescent substrate (Atto, Tokyo, Japan). The amount of each protein in the blot was measured by using ImageJ to calculate the total number of pixels (integrated density value) for each band.

1-6. MTS 분석을 통한 세포 생존력 분석 1-6. Cell viability analysis through MTS analysis

96-웰 플레이트에서 나노 구조체와 함께 세포를 배양한 후 (1×104 세포/mL), 세포 생존력을 MTS 분석 용액 (G3585, Promega, Wisconsin, USA)을 사용하여 측정하였다. 490nm의 파장에서 상기 용액의 흡광도를 96-웰 플레이트 판독기 (Infinite 200 Pro, Tecan, Mnedorf, Switzerland)를 사용하여 기록하였다.After culturing the cells with nanostructures in a 96-well plate (1 × 10 4 cells / mL), cell viability was measured using MTS assay solution (G3585, Promega, Wisconsin, USA). The absorbance of the solution at a wavelength of 490 nm was recorded using a 96-well plate reader (Infinite 200 Pro, Tecan, Mnedorf, Switzerland).

1-7. 면역형광 염색법1-7. Immunofluorescence staining

MKN-45 세포를 μ-Slide 8 웰 (ibid, Mchen, Germany)에 2×104 세포/웰의 밀도로 씨딩하였다. 상기 세포에 AuNS-압타머를 37℃에서 8시간 또는 18시간 동안 처리한 다음, 이를 PBS 내 4% 파라포름알데하이드로 10분 동안 고정시켰다. 상기 세포를 PBS 내 0.1% 트리톤 X-100에 투과시키고, 실온에서 PBS 내 5% 소 혈청 알부민 (BSA)으로 차단시킨 뒤, 이를 일차 항체와 함께, 4 ℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 상기 세포는 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션되었고, 이를 4', 6-디아미디노-2-페닐 인돌이 첨가된 벡타쉴드마운팅 배지에 두었다. 이미지는 공 초점 레이져 스캐닝 현미경 (LSM700, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)에 의해 수득되었다. C-Met에 대한 일차 항체 (NBP2-44306, Novous, Vancouver, Canada) 및 뉴클레오닌 (ab22758, Abcam)이 사용되었다.MKN-45 cells were seeded in μ-Slide 8 wells (ibid, Mchen, Germany) at a density of 2 × 10 4 cells / well. The cells were treated with AuNS-aptamers at 37 ° C. for 8 or 18 hours, and then fixed with 4% paraformaldehyde in PBS for 10 minutes. The cells were permeated to 0.1% Triton X-100 in PBS, blocked with 5% bovine serum albumin (BSA) in PBS at room temperature, and then incubated overnight at 4 ° C. with primary antibody. The cells were incubated with the secondary antibody for 1 hour at room temperature, and placed in a 4 ', 6-diamidino-2-phenyl indole added vector shield mounting medium. Images were obtained by a confocal laser scanning microscope (LSM700, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany). Primary antibodies against C-Met (NBP2-44306, Novous, Vancouver, Canada) and nucleonins (ab22758, Abcam) were used.

　

1-8. 면역 침전법1-8. Immunoprecipitation

1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC) 시약을 사용한 카르복시산과 아민간 커플링 반응에 의하여, 항-뉴클레오린 항체를 자성 입자의 표면에 고정시켰다. 이들 항체-자성 입자는 MKN-45 세포와 함께 4 ℃에서 밤새도록 인큐베이션되었다. 입자의 비-특이적 단백질 결합을 결정하기 위하여, 비결합된 (bare) 자성 입자 (카르복실레이트)을 상기 용해물과 함께 인큐베이션시켰다. 상기 인큐베이션 이후, 상기 입자는 1 × PBS로 2회 세척되었다. 웨스턴 블롯을 위하여, 항-뉴클레오틴 자성 입자로 포획된 단백질은 DTT를 함유하는 로딩 완충액을 사용하여 95℃에서 변성되었다. 겔 전기 영동 후, 각각의 타겟 단백질은 특정 항체를 사용하여 검출되었다. 동일한 농도의 세포 용해물이 대조군으로 사용되었다.The anti-nucleolin antibody was immobilized on the surface of magnetic particles by a coupling reaction between carboxylic acid and amine using 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) reagent. These antibody-magnetic particles were incubated with MKN-45 cells overnight at 4 ° C. To determine non-specific protein binding of the particles, unbound (bare) magnetic particles (carboxylates) were incubated with the lysate. After the incubation, the particles were washed twice with 1 × PBS. For Western blot, proteins captured with anti-nucleotide magnetic particles were denatured at 95 ° C. using a loading buffer containing DTT. After gel electrophoresis, each target protein was detected using a specific antibody. Cell lysates of the same concentration were used as controls.

1-9. 유전자 분석1-9. Gene analysis

MKN-45 세포에 AuNS-압타머를 37℃ 에서 24 시간 동안 처리하였다. 인큐베이션 후, 1 × PBS로 세척하고, 상기 세포를 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)을 사용하여 수집하였다. 이후, 총 RNA를 추출하고, 이에 대한 cDNA를 합성하였다. 상기 샘플들을 Agilent 44K Whole Human Genome 마이크로어레이 (Agilent Technologies, Amstelveen, Netherlands) 상에 적용시키고, 제조사의 지침에 따라 혼성화시키고 세척하였다. 상기 칩은 Agilent 마이크로어레이 스캐너 (Agilent Technologies, Amstelveen, The Netherlands)를 사용하여 분석되었다.  AuNS-aptamer was treated with MKN-45 cells at 37 ° C. for 24 hours. After incubation, washed with 1 × PBS, and the cells were collected using trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). Then, total RNA was extracted, and cDNA was synthesized. The samples were applied on an Agilent 44K Whole Human Genome microarray (Agilent Technologies, Amstelveen, Netherlands), hybridized and washed according to the manufacturer's instructions. The chip was analyzed using an Agilent microarray scanner (Agilent Technologies, Amstelveen, The Netherlands).

1-10. MKN-45 종양의 이종 이식1-10. Xenograft of MKN-45 tumor

모든 동물의 유지 및 생체 내 실험 (in vivo)은 한국과학기술연구원의 동물실험윤리위원회의 규정에 따라 실시되었다. MKN-45 이종 이식편은 MKN-46 세포를 50 % 메트리겔 (BD Biosciences, New Jersey, USA)과 함께, 암컷 Balb/C 누드 마우스의 왼쪽 옆구리에 피하 주사함으로써 제조되었다. 종양 크기가 대략 0.1 cm3에 도달한 경우, 관련 실험을 개시하였다. 생체 내 항암 효과를 평가하기 위해, 250nM의 AuNS-압타머는 3 일마다 총 4 회 종양 내 주사되었다. 개별적인 종양의 부피 (V)를 3 일마다 2주에 걸쳐 모니터링하였고, 식 (V) = (길이 × 너비2)에 따라 산출되었다. 상기 종양 내 주사 후 14 일째, 마우스를 희생시키고, 추가적인 조사를 위해 종양 조직을 적출하였다.All animal maintenance and in vivo experiments were conducted in accordance with the regulations of the Korea Institute of Science and Technology's Animal Experiment Ethics Committee. MKN-45 xenografts were prepared by subcutaneous injection of MKN-46 cells into the left flank of female Balb / C nude mice with 50% metrigel (BD Biosciences, New Jersey, USA). When the tumor size reached approximately 0.1 cm 3 , relevant experiments were initiated. To evaluate the anti-cancer effect in vivo, 250 nM AuNS-aptamer was injected intratumorally in total 4 times every 3 days. The volume (V) of individual tumors was monitored every 2 days over 2 weeks and calculated according to equation (V) = (length × width 2 ). Fourteen days after the intratumoral injection, mice were sacrificed and tumor tissue was removed for further investigation.

　

1-11. Hematoxylin & eosin (H & E) 염색1-11. Hematoxylin & eosin (H & E) staining

조직학적 관찰을 위하여, 종양 조직을 4% 파라포름알데히드에서 밤새도록 고정시키고, 파라핀에 임배딩시킨 뒤, 마이크로톰 (Leica, Wetzlar, Germany)으로 6μm 단면의 절편을 제조하였다. 상기 절편에 자일렌을 처리하여 탈파라핀화한 뒤, 에탄올을 사용하여 재수화시켰다. 상기 종양 절편을 H & E로 염색하고, 이를 광학 현미경 (Olympus, Tokyo, Japan) 하에서 관찰하였다.For histological observations, tumor tissues were fixed overnight in 4% paraformaldehyde, embedded in paraffin, and 6 μm sections were prepared with a microtome (Leica, Wetzlar, Germany). The sections were treated with xylene to deparaffinize, and then rehydrated with ethanol. The tumor sections were stained with H & E, and observed under an optical microscope (Olympus, Tokyo, Japan).

실시예 2. 모델 시스템의 결정 Example 2. Determination of model system

도 1은 나노 구조체, 즉, AuNS-C 및 AuNS-N의 세포 내 흡수를 위하여 제안된 경로를 묘사한 것이다. c-Met 및 뉴클레오린은 종종 암 세포에서 과발현되며, c-Met 또는 뉴클레오린을 표적으로 하는 압타머-AuNS는 세포의 표면 수용체를 인식하는 경향을 나타낸다. c-Met은 수용체-매개 endocytosis를 통해 AuNS-C의 내재화를 유도하는 반면, 뉴클레오린은 macropinocytosis를 통해 세포로 AuNS-N을 전달한다. 이에, 상기 나노 구조체에 대한 세포의 반응을 테스트하기 위하여, 위암 세포주인 MKN-45가 사용되었다. 또한, MKN-45 세포주는 AGS, MKN-74, MKN-1.4와 같은 다른 위암 세포주에 비해 뉴클레오린 압타머에 대하여 유의적인 반응을 보이므로, 상기 MKN-45 세포주는 c-Met과 뉴클레오닌 압타머의 조합 처리에 따른 상승 효과를 확인하기 위하여 사용되었다. FIG. 1 depicts the proposed pathway for intracellular uptake of nanostructures, namely AuNS-C and AuNS-N. c-Met and nucleorin are often overexpressed in cancer cells, and aptamer-AuNS targeting c-Met or nucleorin tends to recognize the cell's surface receptors. c-Met induces the internalization of AuNS-C through receptor-mediated endocytosis, while nucleorin delivers AuNS-N to cells through macropinocytosis. Thus, in order to test the response of cells to the nanostructures, gastric cancer cell line MKN-45 was used. In addition, since the MKN-45 cell line shows a significant response to the nucleoline aptamer compared to other gastric cancer cell lines such as AGS, MKN-74, and MKN-1.4, the MKN-45 cell line c-Met and nucleonin It was used to confirm the synergistic effect of the combination treatment of aptamers.

나노 구조체의 특이성과 치료적 반응을 테스트하기 위하여, 상기 MKN-45 세포주뿐만 아니라, 그 밖의 다른 세포주들을 이용하였다. 즉, MKN45 세포주와 비교하여, 세포 표면에서 c-Met과 뉴클레오닌을 다른 수준으로 발현하는 A549 (폐암) 세포주를 이용하였다. 또한, 항-HER2 압타머를 이용하여, 다른 RTK 구성원인 HER2에 대한 추가적인 실험을 수행함으로써, 보다 강력한 치료 효능을 갖은 타겟 수용체의 조합을 확인하고자 하였다. SKBR-3 세포주는 대표적인 HER2-양성 암 세포주로서, 상기 세포주를 항-HER2 모델 시스템으로 사용하였다. In addition to the MKN-45 cell line, other cell lines were used to test the specificity and therapeutic response of the nanostructure. That is, compared to the MKN45 cell line, an A549 (lung cancer) cell line expressing c-Met and nucleonin at different levels on the cell surface was used. In addition, by using an anti-HER2 aptamer, additional experiments were performed on HER2, another RTK member, to identify a combination of target receptors having more potent therapeutic efficacy. The SKBR-3 cell line is a representative HER2-positive cancer cell line, and the cell line was used as an anti-HER2 model system.

　

실시예 3. 압타머로 기능기화된 AuNS의 합성 및 이의 특성Example 3. Synthesis of AuNS functionalized with aptamer and properties thereof

도 2의 A는 이방성 AuNS의 투과 전자 현미경 (TEM) 이미지를 나타낸 것으로, 이들의 평균 크기 (말단-말단)는 50nm였다. 이방성 구조체가 등방성 구조체에 비해 보다 넓은 표면적을 가지고 있기 때문에, 이러한 나노입자 구조체는 효과적인 약물 전달에 이점이 있다. 또한, 날카로운 말단 구조는 수용체가 이들의 리간드를 인식하는 과정에서 야기될 수 있는 입체적 장애를 감소시킨다. 티올기화된 압타머를 AuNS에 부착시키기 위하여, 낮은 pH를 갖는 시트릭산 완충액을 이용한 접합 방법이 사용되었다. 본 발명자들은 3가지 압타머, 항-c-Met, 항-뉴클레오린, 및 항-HER2의 5'말단을 디티올로 변형시킴으로써, 이들을 AuNS의 표면 상에 이들을 그래프트화시켰다. 2A shows a transmission electron microscope (TEM) image of the anisotropic AuNS, and their average size (end-end) was 50 nm. Since the anisotropic structure has a larger surface area than the isotropic structure, such a nanoparticle structure has an advantage in effective drug delivery. In addition, the sharp terminal structures reduce the steric hindrance that can be caused by the receptors recognizing their ligands. To attach the thiolated aptamer to AuNS, a conjugation method with citric acid buffer with low pH was used. The inventors grafted them on the surface of the AuNS by modifying the 5 'ends of the three aptamers, anti-c-Met, anti-nucleoline, and anti-HER2 with dithiol.

이중 기능기화된 나노 구조체를 합성하기 위하여, 동일한 농도를 갖는 2 개의 압타머 혼합물을 제조한 다음, AuNS와 함께 인큐베이션시켰다. AuNS 상에 로딩된 고밀도의 리간드를 측정하는 동안, 국부적인 표면 플라스몬 공명은 합성된 AuNS에 비해 압타머-AuNS에서 상대적으로 긴 파장으로 이동됨을 확인하였다 (도 2의 A). To synthesize a double functionalized nanostructure, two aptamer mixtures with the same concentration were prepared and then incubated with AuNS. While measuring the high-density ligand loaded on the AuNS, it was confirmed that the local surface plasmon resonance shifted to a relatively long wavelength in the aptamer-AuNS compared to the synthesized AuNS (FIG. 2A).

AuNS 상에 로딩된 압타머의 양을 산출하기 위하여, 압타머는 시아닌-3 또는 시아닌-5 (Cy3 및 Cy5) 형광물질로 표지되었다. 도 2의 B에 나타낸 바와 같이, 상기 항-c-Met 압타머의 로딩 양은 222.2±11.4로서, 항-뉴클레오린 압타머 (402.6±65.9), 및 항-HER2 압타머 (570±18.6)에 비해 낮은 수준을 나타내었다. 항-c-Met 압타머는 42-mer의 항-Her2 압타머에 비해 단지 8-mer 길이의 차이를 나타낼 뿐이나, 압타머의 로딩 양은 2.5배 가량 낮게 관찰되었다. 이러한 결과는 표면에 고정화된 압타머 분자가 차지하는 공간 (footprint)이 압타머의 로딩 밀도에 영향을 미친다고 추론할 수 있다. 즉, 항-HER2 압타머는 선형의 구조를 갖는 반면 (theoretical footprint = 1.07nm), 항-c-Met 압타머는 스템-루프의 2차 구조를 갖는다 (theoretical footprint= 4nm). 따라서, c-Met 압타머의 구조적 특성이 나노 구조체 표면 상의 로딩 용량을 감소시킨다. 또한, 상기 압타머-AuNS의 제타 전위는 PBS 내에서 약 -15mV로서, 비결합된 AuNS (-30mV)에 비해 증가됨을 확인하였다. To calculate the amount of aptamer loaded on AuNS, the aptamer was labeled with cyanine-3 or cyanine-5 (Cy3 and Cy5) fluorescent materials. 2B, the loading amount of the anti-c-Met aptamer is 222.2 ± 11.4, which is anti-nucleorin aptamer (402.6 ± 65.9), and anti-HER2 aptamer (570 ± 18.6). Compared to the lower level. The anti-c-Met aptamer only showed a difference of 8-mer length compared to the 42-mer anti-Her2 aptamer, but the loading amount of the aptamer was observed about 2.5 times lower. These results can be inferred that the footprint occupied by the aptamer molecule immobilized on the surface affects the loading density of the aptamer. That is, the anti-HER2 aptamer has a linear structure (theoretical footprint = 1.07nm), while the anti-c-Met aptamer has a stem-loop secondary structure (theoretical footprint = 4nm). Therefore, the structural properties of the c-Met aptamer decrease the loading capacity on the surface of the nanostructure. In addition, it was confirmed that the zeta potential of the aptamer-AuNS was about -15 mV in PBS, compared to unbound AuNS (-30 mV).

나노 구조체의 특성을 분석한 후, 유도 결합 플라즈마 질량 분광계 분석을 실시하여, 동일한 농도를 갖는 세 종류의 각기 다른 나노 구조체를 처리한 세포 내 금의 양을 조사하였다. 도 2의 C에 나타낸 바와 같이, SKBR-3 세포는 항-HER2-AuNS와 현격한 반응을 보이는 반면, MKN-45 세포에서는 세 종류의 나노 구조체 모두에 대하여 유의적으로 높은 흡수 활성을 나타냄을 보여주었다. A549 세포는 MKN-45 세포에 비해 AuNS-C의 세포 내 흡수가 낮은 수준이었다. 이러한 결과는 세포 흡수가 표적 수용체의 발현 수준에 의존함을 나타내는 것이며, 이러한 나노 구조체는 압타머와 수용체간 상호작용으로 인해 수용체 특이성을 지님을 제시하는 것이다. After analyzing the properties of the nanostructures, an inductively coupled plasma mass spectrometer analysis was performed to investigate the amount of gold in cells treated with three different nanostructures having the same concentration. As shown in FIG. 2C, SKBR-3 cells show a marked response with anti-HER2-AuNS, whereas MKN-45 cells show significantly high uptake activity for all three types of nanostructures. gave. A549 cells had lower levels of AuNS-C uptake than MKN-45 cells. These results indicate that cell uptake is dependent on the expression level of the target receptor, suggesting that these nanostructures have receptor specificity due to the interaction between the aptamer and the receptor.

실시예 4. 압타머-AuNS에 의한 치료 효과Example 4. Treatment effect by aptamer-AuNS

압타머-AuNS를 형광물질로 표지함으로써, 상기 나노 구조체가 세포 내로 효율적으로 도입 및 분포됨을 확인하였다 (도 3의 A). MKN-45 세포에서, AuNS-C 및 AuNS-N은 핵 주위의 질량 중심에 위치하였던 반면, AuNS-H는 클러스터링된 세포의 원형질 막 근처에 위치하였다. 각각의 나노 구조체들은 MKN-45 세포 내에서 뚜렷하게 다른 분포 패턴을 보여주고 있었으므로, 이들 나노 구조체는 차별적인 치료 효능 및 거동을 갖는 것으로 추론해 볼 수 있었다. By labeling the aptamer-AuNS with a fluorescent material, it was confirmed that the nanostructure was efficiently introduced and distributed into the cells (A in FIG. 3). In MKN-45 cells, AuNS-C and AuNS-N were located at the center of mass around the nucleus, while AuNS-H was located near the plasma membrane of clustered cells. Since each nanostructure showed a distinctly different distribution pattern in MKN-45 cells, it could be inferred that these nanostructures had differential therapeutic efficacy and behavior.

따라서, 암세포에 압타머로 기능기화된 단일의 AuNS를 처리한 후, 이들에 대한 생존력 테스트를 실시하였다. 또한, AuNS와의 접합에 의한 효과를 확인하기 위하여, 압타머-AuNS와 자유 분자 (Free-cMet, Free-nucleolin, Free-HER2)에 의한 치료적 효능을 비교하였다. 그 결과, 도 3의 B에 나타낸 바와 같이, MKN-45 및 SKBR3 세포주의 생존율은 각각의 나노 구조체를 처리한 경우 현저하게 감소된 반면, 압타머의 자유 분자를 처리한 경우, 동일한 농도의 압타머를 처리하였음에도 불구하고 세포 생존율을 감소시키지 못하였다. 흥미롭게도, MKN-45 세포는 SKBR-3 세포에 비해 AuNS-C 또는 AuNS-N (1000nM의 압타머 농도)에 대하여 보다 민감한 반응을 나타내었다. 보다 세부적으로 치료 효능을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 각 나노 구조체의 다양한 농도에서 각 수용체의 독특한 발현 수준과 함께, 3 종류의 독립적인 세포주, 즉, MKN-45, SKBR-3, 및 A549 세포주를 대상으로 생존력 테스트를 실시하였다. 나노 구조체를 처리한 지 24시간 후, 세포의 생존율은 c-Met, 및 뉴클레오닌 압타머-AuNS의 농도가 증가함에 따라 감소되었으며, 전형적인 농도 의존적인 경향을 보여주었다. A549는 HER-2 음성 세포주이기 때문에, HER-AuNS는 A549 세포에 대한 검출 가능할 정도의 성장 저해 효과를 보여주지 못하였다. 상기 결과는, 이들 압타머에 의해 나노 구조체의 표면이 기능기화된 후에도, 표적 분자에 대한 특이성을 유지하고 있음을 나타내는 결과이다. Therefore, after treating a single AuNS functionalized with aptamers to cancer cells, a viability test was performed for them. In addition, in order to confirm the effect by conjugation with AuNS, the therapeutic efficacy by aptamer-AuNS and free molecules (Free-cMet, Free-nucleolin, Free-HER2) was compared. As a result, as shown in B of FIG. 3, the survival rate of the MKN-45 and SKBR3 cell lines was significantly reduced when each nanostructure was treated, whereas when the free molecule of the aptamer was treated, the same concentration of the aptamer Cell treatment did not decrease cell viability. Interestingly, MKN-45 cells showed a more sensitive response to AuNS-C or AuNS-N (an aptamer concentration of 1000 nM) compared to SKBR-3 cells. In order to confirm the treatment efficacy in more detail, the present inventors developed three independent cell lines, namely MKN-45, SKBR-3, and A549 cell lines, with unique expression levels of each receptor at various concentrations of each nanostructure. Subjects were tested for viability. 24 hours after treatment with the nanostructure, the viability of the cells decreased with increasing concentrations of c-Met, and nucleonin aptamer-AuNS, showing a typical concentration-dependent tendency. Since A549 is a HER-2 negative cell line, HER-AuNS did not show a detectable growth inhibitory effect on A549 cells. The above results show that the specificity of the target molecule is maintained even after the surface of the nanostructure is functionalized by these aptamers.

개별적인 표적에 대한 단일의 압타머-AuNS를 처리한 후, 감소된 생존율의 기작을 추가적으로 조사하기 위하여, 본 발명자들은 상기 세 종류의 압타머-AuNS 의 처리에 반응하여 변화된 MKN-45 세포의 전체적 유전자 발현 (Agilent, SurePrint Human Gene Expression)을 프로파일링하였다. 압타머와 접합되지 않은 AuNS를 처리한 군을 대조군으로 사용하여 유전자 발현의 배수 변화를 산출하였다. 1.3배 이상으로 상향 또는 하향 조절된 유전자의 유전자 온톨로지 분석은 성장 억제와 관련된 유전자가 현저한 것으로 나타났으며, 이는 단일의 압타머-AuNS의 처리는 유전자 발현 네트워크를 교란시킴으로써 세포 사멸을 유도한다는 것을 제시한다. 흥미롭게도, 성장을 저해하는 인자들이 세 종류 각각의 단일 치료에서 높게 관찰되었으나, 그 유전자 세트는 동일하지 않았다. 예를 들어, BBC3 (BCL2 Binding Component 3)는 세 종류의 처리 모두에서 높게 관찰된 반면, ING5 (Inhibitor Of Growth Family Member 5) 및 GPC3 (Glypican 3)은 오직 AuNS-H에서만 변화되었다. 이러한 결과는 압타머-AuNS 치료에 있어서, 이들간의 조합 또는 병용에 의한 표적화는 특정 메커니즘에 의한 상승 효과를 나타낼 수 있음을 시사한다. 그 결과, 본 발명에 따른 나노 구조체는 약물을 세포 내로 효과적으로 전달함으로써 자유 분자에 비해 치료 효과를 향상시킨다. 보다 구체적으로, 이러한 나노 구조체는 압타머의 기능기화에 따라 특정 경로로 유도되고, 이를 통해 암세포의 성장 억제를 야기할 수 있다. In order to further investigate the mechanism of reduced survival rate after treatment of a single aptamer-AuNS for individual targets, the inventors of the present invention, the overall gene of MKN-45 cells changed in response to the treatment of the three types of aptamer-AuNS Expression (Agilent, SurePrint Human Gene Expression) was profiled. The group treated with AuNS that was not conjugated with aptamer was used as a control to calculate the fold change in gene expression. Gene ontology analysis of genes up or down regulated by 1.3 times or more showed that the genes related to growth inhibition were prominent, suggesting that treatment of a single aptamer-AuNS induces cell death by disrupting the gene expression network. do. Interestingly, growth-inhibiting factors were highly observed in each of the three treatments, but the gene set was not identical. For example, BBC3 (BCL2 Binding Component 3) was highly observed in all three treatments, while ING5 (Inhibitor Of Growth Family Member 5) and GPC3 (Glypican 3) were only changed in AuNS-H. These results suggest that in the treatment of aptamer-AuNS, targeting by combination or combination between them may have a synergistic effect by a specific mechanism. As a result, the nanostructure according to the present invention effectively delivers the drug into cells, thereby improving the therapeutic effect compared to free molecules. More specifically, these nanostructures are induced by a specific pathway according to the functionalization of the aptamer, and through this, may cause growth inhibition of cancer cells.

실시예 5. 기능기화된 압타머의 조합에 의한 상승 효과Example 5. Synergistic effect by combination of functionalized aptamer

본 실시예에서는 2 종류의 압타머로 이중-기능기화된 AuNS를 사용하여 암세포의 성장 억제 효과를 관찰함으로써, 이들의 조합에 의한 상승 효과를 확인하고자 하였다 그 결과, 도 5의 A에 나타낸 바와 같이, 저 농도의 조건에서, 오직 MKN-45 세포에 AUNS-CN을 처리한 경우에만 유의적인 상승 효과가 관찰되었다. 250nM의 이중-기능기화된 AuNS-CN (총 압타머, c-Met+뉴클레오린)으로 처리된 암 세포의 성장 억제율은 1000nM의 단일의 압타머-AuNS 처리에 따른 결과와 유사하였다. 또한, 도 5의 B에 나타낸 바와 같이, 2 종류의 자유 압타머 혼합물의 처리에 따른 결과는 동일한 농도 (250nM)에서 거의 무시할 만한 수준에 불과하였다. 따라서, 임상적으로 적용할 수 있는 저 농도에서, 뉴클레오린-압타머 및 c-Met-압타머가 나노 구조체의 표면 상에 조합되어 있는 AuNS는, 단일 압타머를 포함하는 AuNS에 비해, 치료 효능이 4배 가량 증가함을 확인하였다. AuNS-CN의 상승 효과를 평가 및 확인한 후, 상기 세포 내에 존재하는 압타머의 위치를 확인하였다. 그 결과, 도 5의 C에 나타낸 바와 같이, 형광 신호는 세포 내 부에 클러스터링되어 있었고, 뉴클레오린에 대한 녹색 신호와 c-Met에 대한 적색 신호가 겹쳐 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 상기 두 압타머가 세포 내 동일한 위치에서 작용할 수 있음을 암시하는 것이다. In this example, by using two types of aptamer double-functionalized AuNS to observe the growth inhibitory effect of cancer cells, it was intended to confirm the synergistic effect by the combination of these results, as shown in Fig. 5A, At low concentration conditions, a significant synergistic effect was observed only when AUNS-CN was treated with MKN-45 cells. The growth inhibition rate of cancer cells treated with 250 nM of double-functionalized AuNS-CN (total aptamer, c-Met + nucleoline) was similar to the result of a single aptamer-AuNS treatment of 1000 nM. In addition, as shown in Fig. 5B, the result of treatment of the two free aptamer mixtures was only negligible at the same concentration (250 nM). Therefore, at low concentrations that can be clinically applied, AuNS in which nucleoline-aptamer and c-Met-aptamer are combined on the surface of a nanostructure, has therapeutic efficacy compared to AuNS containing a single aptamer. It was confirmed that the increase was about 4 times. After evaluating and confirming the synergistic effect of AuNS-CN, the position of the aptamer present in the cells was confirmed. As a result, as shown in C of FIG. 5, it was confirmed that the fluorescent signal was clustered inside the cell, and the green signal for nucleorin and the red signal for c-Met overlapped. These results suggest that the two aptamers can act at the same location in the cell.

한편, AuNS의 표면에서 기능기화된 압타머가 여전히 이들 고유의 결합 특성을 보유하고 있는지 조사하기 위하여, 나노 구조체와 이들의 표적 수용체간 결합 테스트를 면역블롯팅 방법을 사용하여 실시하였다. 또한, c-Met이 항-뉴클레오린 압타머 또는 뉴클레오린 단백질과 상호 작용하는지 여부를 명확히 확인하고자, 항-뉴클레오린 항체를 자성 입자의 표면에 고정화시킨 뒤, 면역침전 실험을 위하여, MKN-45 세포 용해물과 상기 항체 자성 비드를 4℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 분리 및 세척을 실시한 후, 자석 비드에 의해 포획된 단백질을 변성시킨 다음, 면역블롯팅 방법을 사용하여 이를 검출하였다. 각각의 압타머-AuNS와 MKN-45 세포 용해물을 함께 배양한 후 확인한 결과, 도 6의 A에 나타낸 바와 같이, c-Met 수용체는 AuNS-C 및 AuNS-N 모두로부터 검출된 반면, 뉴클레오린은 오직 AuNS-N에서만 검출되었다. 또한, 도 6의 B에 나타낸 바와 같이, 뉴클레오린 항체로 c-Met을 검출할 수 있었던 반면, 그 밖의 단백질은 항-뉴클레오린 압타머와 어떠한 상호작용도 나타내지 않았다. 따라서, 이러한 결과는, c-Met과 뉴클레오닌 사이에는 특이적인 상호작용이 존재하며, 상기 2개의 압타머의 조합은 암의 치료 효과 향상에 기여할 수 있음을 나타내는 것이다. On the other hand, in order to investigate whether the aptamer functionalized on the surface of AuNS still retains these unique binding properties, a binding test between the nanostructures and their target receptors was performed using an immunoblotting method. In addition, in order to clearly confirm whether c-Met interacts with an anti-nucleorin aptamer or nucleorin protein, after immobilizing the anti-nucleorin antibody on the surface of magnetic particles, for immunoprecipitation experiments, MKN-45 cell lysate and the antibody magnetic beads were incubated overnight at 4 ° C. After separation and washing, the protein captured by the magnetic beads was denatured, and then detected using an immunoblotting method. As a result of confirming after culturing each aptamer-AuNS and MKN-45 cell lysate together, as shown in Fig. 6A, c-Met receptor was detected from both AuNS-C and AuNS-N, while nucleo Lean was only detected in AuNS-N. In addition, as shown in B of FIG. 6, c-Met could be detected with a nucleorin antibody, while other proteins showed no interaction with the anti-nucleorin aptamer. Therefore, these results indicate that there is a specific interaction between c-Met and nucleonin, and the combination of the two aptamers may contribute to improving the therapeutic effect of cancer.

이러한 실험 결과를 바탕으로, 본 발명자들은, c-Met은 플라스마 막 상에 존재하는 뉴클레오닌과 상호 작용하고, 이와 함께 세포 내로 내재화될 수 있다고 가정하였다. 이러한 가정에 기초하여, 본 발명자들은 AuNS-C와 AuNS-N의 순차적인 처리는 AuNS-CN의 처리에 비해 상대적으로 낮은 치료 효과를 나타낼 것으로 예상하였다. 따라서, 앞서 언급한 가정을 검증하기 위하여, MKN-45 세포주를 AuNS-C 또는 AuNS-N과 인큐베이션한 다음, 순차적으로 AuNS-N 또는 AuNS-C를 첨가하였다. 그 결과, 도 6의 C에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은, 상기의 가정과 부합하게, 이러한 순차적 처리는 이중-기능기화된 AuNS 처리 (AuNS-CN)에 비해 암세포 생존율의 감소에 미치는 효과가 미미함을 확인하였다, 또한, AuNS-C 및 AuNS-N의 혼합물의 처리는, AuNS-CN의 처리에 비해 상대적으로 낮은 암세포 생존율 감소 효과를 나타내었고, ICP-MS 분석에서 AuNS의 세포 내 흡수가 AuNS-C 및 AuNS-N의 혼합물 처리에 비해 약 2배 가량 높게 관찰되었다. 이러한 결과는 압타머-AuNS 상의 결합부위에 c-Met과 뉴클레오린은 경쟁적인 관계에 있으며, 이에 따라, 이들의 순차적인 처리는 치료 효능 향상에 기여하지 못함을 나타내는 것이다. Based on the results of these experiments, the present inventors assumed that c-Met can interact with the nucleonin present on the plasma membrane and be internalized into the cells with it. Based on this assumption, the present inventors expected that the sequential treatment of AuNS-C and AuNS-N would show a relatively low therapeutic effect compared to the treatment of AuNS-CN. Therefore, in order to verify the above-mentioned assumption, the MKN-45 cell line was incubated with AuNS-C or AuNS-N, and then AuNS-N or AuNS-C was sequentially added. As a result, as shown in Fig. 6C, the present inventors, in accordance with the above assumption, this sequential treatment has a small effect on the reduction in cancer cell survival rate compared to the double-functionalized AuNS treatment (AuNS-CN). In addition, the treatment of the mixture of AuNS-C and AuNS-N showed a relatively low cancer cell viability reduction effect compared to the treatment of AuNS-CN, and the intracellular uptake of AuNS in ICP-MS analysis was AuNS- It was observed about 2 times higher than the mixture treatment of C and AuNS-N. These results indicate that c-Met and nucleorin are in a competitive relationship to the binding site on the aptamer-AuNS, and accordingly, their sequential treatment does not contribute to improving treatment efficacy.

실시예 6. 기능기화된 압타머의 조합에 의한 상승 효과의 작용 기작Example 6. Mechanism of action of synergistic effect by combination of functionalized aptamer

단일의 압타머-AuNS 또는 AuNS-CN을 처리한 후 전체적 유전자 발현을 프로파일링함으로써, 치료적 상승 효과에 근원이 되는 전사 기작을 조사하였다. 전사적 프로파일들간 유사성을 비교하기 위하여, 본 발명자들은 자율적인 계층적 클러스터링 (unsupervised hierarchical clustering)을 실시하였다. 2개 대조군의 밀집된 클러스터링은 AuNS 단독 처리 만으로는 전사적 변화에 거의 영향을 미치지 않음을 보여주었다 (도 7의 A). 흥미롭게도, AuNS-CN은 단일 처리들 중에서도 클러스터의 응집 트리와 함께 클러스터링되었고, 이는 상기의 조합이 치료를 위한 추가적인 작용 기작을 유도함을 시사하는 것이다 (도 7의 A). By processing a single aptamer-AuNS or AuNS-CN and then profiling overall gene expression, the transcriptional mechanism underlying the therapeutic synergistic effect was investigated. In order to compare the similarities between enterprise profiles, the present inventors performed unsupervised hierarchical clustering. Dense clustering of the two control groups showed that treatment with AuNS alone had little effect on transcriptional changes (A in FIG. 7). Interestingly, AuNS-CN was clustered together with the cluster's aggregation tree among single treatments, suggesting that the combination induces additional mechanisms of action for treatment (FIG. 7A).

이러한 처리 군들 중에서 차별적으로 발현된 유전자 (DEG)를 비교하기 위해, 정규화된 프로브 강도를 AuNS에서 상응하는 프로브 강도로 나눈 후, 1.3 배 변화 컷-오프를 적용하였다. 4-way Venn-다이아그램은 AuNS-CN는 가장 다수의 고유 DEG를 가지고 있음을 보여주었으며, 이는 조합에 의한 고유의 전사적 변화로 인해 더욱 활발한 클러스터링을 나타냄을 지지하는 결과이다. 본 발명자들은 단일 및 조합 처리에 의해 단계적으로 하향조절되는 유전자는, 조합 처리에 의한 상승 효과와 관련된 작용 기작을 설명 가능하게 할 것으로 가정하였다. 본 발명자들은 Mock : AuNS : AuNS-H : AuNS-C : AuNS-N : AuNS-CN = 5 : 5 : 4.5 : 4.5 :4.5 : 4와 같이 단계적인 추세를 정의하였다. 이러한 비율은 BCL2의 프로브 강도로부터 유래하고 변형되었으며, 유전자 세트 농축 분석 (GSEA)의 표현형 표지로서 사용되었다. 즉, 유전자 발현 프로브는 상기의 비율과의 상관관계에 따라 내림차 순으로 순위가 매겨졌으며; 상기의 단계적 추세를 갖는 유전자는 상위 순위로 매겨졌다. 도 7의 B에 나타낸 바와 같이, GSEA 및 Molecular Signatures Database (MSigDB)는 AuNS-CN이 세포 주기 (세포주기 G1-S 파지 전이, 핵 염색체 분리, DNA 복제 및 RNA 안정성 조절)과 연관된 유전자 특성에 대한 농축 패턴을 유도됨을 보여 주였다. 도 8은 각각에 대하여 상위 50개의 농축된 유전자 세트를 나열한 것이다. 즉, 조합 처리를 통해 보다 하향 조절된 상기의 유전자들은 치료적 상승 효과의 작용 기작을 설명 가능하게 하였으며, 즉, 세포 주기와 관련된 유전자가 독특하고 강력한 병용 치료의 간접적인 타겟이 될 수 있음을 나타내는 것이다. To compare the differentially expressed gene (DEG) among these treatment groups, the normalized probe intensity was divided by the corresponding probe intensity in AuNS, and a 1.3-fold change cut-off was applied. The 4-way Venn-diagram showed that AuNS-CN has the most number of intrinsic DEGs, which is a result supporting the more active clustering due to the intrinsic transcriptional change by the combination. The present inventors assumed that genes down-regulated by single and combination treatments will be able to explain the mechanism of action associated with synergistic effects by combination treatments. The present inventors have defined stepwise trends such as Mock: AuNS: AuNS-H: AuNS-C: AuNS-N: AuNS-CN = 5: 5: 4.5: 4.5: 4.5: 4. This ratio was derived and modified from the probe strength of BCL2 and was used as a phenotypic marker of gene set enrichment analysis (GSEA). That is, the gene expression probes were ranked in descending order according to the correlation with the above ratio; Genes with the above phased trend were ranked in the top rank. As shown in B of FIG. 7, GSEA and Molecular Signatures Database (MSigDB) show that AuNS-CN is related to the cell cycle (cell cycle G1-S phage metastasis, nuclear chromosome separation, DNA replication and RNA stability regulation). It was shown that the enrichment pattern was induced. Figure 8 lists the top 50 enriched gene sets for each. In other words, the above genes, which are further down-regulated through combinatorial treatment, have been able to explain the mechanism of action of the therapeutic synergistic effect, that is, the genes related to the cell cycle can be indirect targets of unique and powerful combination therapy will be.

또한, 기능기화된 AuNS의 향상된 치료 효능에 근원이 되는 기작을 평가하기 위하여 형광-활성화 세포 분류 (FACS)를 통해 세포 주기를 분석하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이, AuNS-C, AuNS-N, 및 AuNS-CN은 자유 압타머에 비해 암세포의 세포자멸을 뚜렷하게 강화시켰으며, c-Met 또는 뉴클레오린을 타겟팅하는 자유 압타머가 처리된 세포와 비교하여, 명백하게 구분되는 S1기의 세포 개체 패턴을 나타내었다. 이러한 실험결과는 기능기화된 AuNS는 기존의 자유 압타머와는 전혀 다른 작용 기작을 통해 향상된 치료 효능을 유도할 수 있음을 나타내는 것이다. In addition, the cell cycle was analyzed by fluorescence-activated cell sorting (FACS) to evaluate the mechanisms underlying the improved therapeutic efficacy of functionalized AuNS. As shown in FIG. 9, AuNS-C, AuNS-N, and AuNS-CN significantly enhanced apoptosis of cancer cells compared to free aptamer, and treated with free aptamer targeting c-Met or nucleorin. Compared to the cells, the distinct cell pattern of the S1 phase is clearly distinguished. These experimental results indicate that functionalized AuNS can induce improved therapeutic efficacy through a completely different mechanism of action than the existing free aptamer.

실시예 7. 종양 동물 모델을 이용한 암 치료 효과 검증Example 7. Validation of cancer treatment effect using tumor animal model

본 실시예에서는 생체 내에서 이중-기능기화된 AuNS의 치료적 효능을 확인하고자 하였다 이을 위하여, MKN-45 이종 이식 마우스 모델에 AuNS-CN을 종양 내 주사하고, 최초 종양 내 주사 후 14일째, 상기 마우스를 희생시키고, 종양 조직을 적출하여 이들의 부피를 분석하였다. 그 결과, 도 10의 A 및 B에 나타낸 바와 같이, AuNS-CN 처리군에서 종양의 증식은 대조군에 비해 유의적으로 저하됨을 확인할 수 있었다. 또한, 도 10의 C에 나타낸 바와 같이, H&E 염색에 의한 조직학적 표현형 분석에서도 AuNS-CN이 처리된 MKN-45 이종 이식 모델은 PBS를 처리한 대조군에서 관찰된 결과와 명백하게 구분되는 세포 사멸의 조직학적 특성을 보였다. In this example, in order to confirm the therapeutic efficacy of a double-functionalized AuNS in vivo, for this purpose, the MNSN-45 xenograft mouse model was injected with AuNS-CN intratumorally, 14 days after the initial intratumoral injection, the Mice were sacrificed and tumor tissues were removed to analyze their volume. As a result, as shown in A and B of FIG. 10, it was confirmed that the proliferation of tumors in the AuNS-CN treated group was significantly lower than that of the control group. In addition, as shown in FIG. 10C, in the histological phenotyping analysis by H & E staining, the AuNS-CN-treated MKN-45 xenograft model clearly shows the cell death tissue distinct from the results observed in the PBS-treated control group. Showed academic characteristics.

<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Bi-functionalized nanoparticles and use thereof <130> PN121598 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Met aptamer <400> 1 atcaggctgg atggtggtag ctcggtcggg gtgggtgggt tggcaagtct gat 53 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleolin aptamer <400> 2 tttggtggtg gtggttgtgg tggtggtg 28 <210> 3 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HER2 aptamer <400> 3 gcagcggtgt gggggcagcg gtgtgggggc agcggtgtgg gg 42 <110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Bi-functionalized nanoparticles and use thereof <130> PN121598 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Met aptamer <400> 1 atcaggctgg atggtggtag ctcggtcggg gtgggtgggt tggcaagtct gat 53 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleolin aptamer <400> 2 tttggtggtg gtggttgtgg tggtggtg 28 <210> 3 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HER2 aptamer <400> 3 gcagcggtgt gggggcagcg gtgtgggggc agcggtgtgg gg 42

Claims (13)

c-Met과 결합하는 핵산 분자, 및 뉴클레오린 (Nucleolin)과 결합하는 핵산 분자로 표면 개질된 입자를 포함하는, 생리활성 조절 물질의 암세포 내 전달용 조성물.
A composition for delivery in a cancer cell of a bioactive substance, comprising a nucleic acid molecule binding to c-Met, and a particle surface-modified with a nucleic acid molecule binding to Nucleolin.
청구항 1에 있어서, 상기 c-Met과 결합하는 핵산 분자, 및 뉴클레오린과 결합하는 핵산 분자는 0.5:1 내지 1:0.5 (v/v)의 비율로 입자의 표면 상에 결합되어 있는 것인, 생리활성 조절 물질의 암세포 내 전달용 조성물.
The method according to claim 1, wherein the nucleic acid molecule that binds to the c-Met, and the nucleic acid molecule that binds to the nucleorin is bound to the surface of the particle in a ratio of 0.5: 1 to 1: 0.5 (v / v). , Composition for the delivery of physiological activity regulating substances in cancer cells.
청구항 1에 있어서, 상기 c-Met과 결합하는 핵산 분자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 압타머인 것인, 생리활성 조절 물질의 암세포 내 전달용 조성물.
The method according to claim 1, The nucleic acid molecule binding to the c-Met is an aptamer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, a composition for delivery in a cancer cell of a bioactive substance.
청구항 1에 있어서, 상기 뉴클레오린과 결합하는 핵산 분자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 압타머인 것인, 생리활성 조절 물질의 암세포 내 전달용 조성물.
The method according to claim 1, wherein the nucleic acid molecule binding to the nucleorin is an aptamer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, a composition for delivery in a cancer cell of a bioactive substance.
청구항 1에 있어서, 상기 생리활성 조절 물질은 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 항체, 화학물질, 바이러스, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 생리활성 조절 물질의 암세포 내 전달용 조성물.
The method according to claim 1, The physiological activity modulator is any one selected from the group consisting of nucleic acids, peptides, polypeptides, antibodies, chemicals, viruses, and combinations thereof, compositions for delivery of physiological activity modulators in cancer cells .
c-Met과 결합하는 핵산 분자, 및 뉴클레오린 (Nucleolin)과 결합하는 핵산 분자로 표면 개질된 나노입자를 포함하는, 암의 치료용 약학적 조성물.
A pharmaceutical composition for the treatment of cancer, comprising a nanoparticle surface-modified with a nucleic acid molecule that binds c-Met and a nucleic acid molecule that binds to Nucleolin.
청구항 6에 있어서, 상기 c-Met과 결합하는 핵산 분자, 및 뉴클레오린과 결합하는 핵산 분자는 0.5:1 내지 1:0.5 (v/v)의 비율로 입자의 표면 상에 결합되어 있는 것인, 암의 치료용 약학적 조성물.
The method according to claim 6, wherein the nucleic acid molecule that binds to the c-Met, and the nucleic acid molecule that binds to the nucleorin is bound on the surface of the particle in a ratio of 0.5: 1 to 1: 0.5 (v / v). , Pharmaceutical composition for the treatment of cancer.
청구항 6에 있어서, c-Met과 결합하는 핵산 분자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 압타머인 것인, 암의 치료용 약학적 조성물.
The method according to claim 6, c-Met nucleic acid molecule binding is an aptamer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, the pharmaceutical composition for the treatment of cancer.
청구항 6에 있어서, 상기 뉴클레오린과 결합하는 핵산 분자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 압타머인 것인, 암의 치료용 약학적 조성물.
The method according to claim 6, wherein the nucleic acid molecule binding to the nucleorin is an aptamer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, the pharmaceutical composition for the treatment of cancer.
청구항 6에 있어서, 상기 나노입자는 금 나노입자인 것인, 암의 치료용 약학 조성물.
The method according to claim 6, The nanoparticles will be gold nanoparticles, pharmaceutical composition for the treatment of cancer.
청구항 10에 있어서, 상기 금 나노입자의 크기는 20 내지 100nm인 것인, 암의 치료용 약학적 조성물.
The method according to claim 10, The size of the gold nanoparticles will be 20 to 100nm, the pharmaceutical composition for the treatment of cancer.
청구항 10에 있어서, 상기 금 나노입자는 표면에 복수 개의 돌기를 포함하는 것인, 암의 치료용 약학적 조성물.
The method according to claim 10, The gold nanoparticles will include a plurality of projections on the surface, the pharmaceutical composition for the treatment of cancer.
청구항 6에 있어서, 상기 조성물은 암의 치료를 위한 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 항체, 화학물질, 바이러스, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 생리활성 조절 물질을 추가로 포함하는 것인, 암의 치료용 약학적 조성물.The method according to claim 6, wherein the composition is a nucleic acid for the treatment of cancer, peptides, polypeptides, antibodies, chemicals, viruses, and any one selected from the group consisting of a combination of physiologically active substances selected from the group further comprises , Pharmaceutical composition for the treatment of cancer.
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