KR102109852B1 - 뇌전증 동물 모델, 그의 제조방법 및 용도 - Google Patents
뇌전증 동물 모델, 그의 제조방법 및 용도 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102109852B1 KR102109852B1 KR1020180039938A KR20180039938A KR102109852B1 KR 102109852 B1 KR102109852 B1 KR 102109852B1 KR 1020180039938 A KR1020180039938 A KR 1020180039938A KR 20180039938 A KR20180039938 A KR 20180039938A KR 102109852 B1 KR102109852 B1 KR 102109852B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- iqsec3
- animal model
- epilepsy
- expression
- gene
- Prior art date
Links
- 238000011705 epilepsy animal model Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 8
- 101710161775 IQ motif and SEC7 domain-containing protein 3 Proteins 0.000 claims abstract description 152
- 102100025098 IQ motif and SEC7 domain-containing protein 3 Human genes 0.000 claims abstract description 134
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 claims abstract description 51
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 50
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 49
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 27
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 22
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 7
- 101001077638 Homo sapiens IQ motif and SEC7 domain-containing protein 3 Proteins 0.000 claims abstract 7
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 claims description 39
- 238000010171 animal model Methods 0.000 claims description 24
- QCHFTSOMWOSFHM-UHFFFAOYSA-N SJ000285536 Natural products C1OC(=O)C(CC)C1CC1=CN=CN1C QCHFTSOMWOSFHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 229960001416 pilocarpine Drugs 0.000 claims description 23
- QCHFTSOMWOSFHM-WPRPVWTQSA-N (+)-Pilocarpine Chemical compound C1OC(=O)[C@@H](CC)[C@H]1CC1=CN=CN1C QCHFTSOMWOSFHM-WPRPVWTQSA-N 0.000 claims description 22
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 21
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 claims description 18
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 17
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 claims description 16
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 claims description 13
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 claims description 12
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 11
- 210000001947 dentate gyrus Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 10
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 8
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 claims description 7
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 claims description 7
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 6
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 4
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims description 4
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 4
- 241000009328 Perro Species 0.000 claims description 4
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims description 4
- 238000012346 open field test Methods 0.000 claims description 4
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 claims description 3
- 102100035971 Molybdopterin molybdenumtransferase Human genes 0.000 claims description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 210000004513 dentition Anatomy 0.000 claims description 3
- 108010024999 gephyrin Proteins 0.000 claims description 3
- 230000036346 tooth eruption Effects 0.000 claims description 3
- OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N (+/-)-DABA Natural products NCCC(N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 claims 2
- VLSMHEGGTFMBBZ-UHFFFAOYSA-N alpha-Kainic acid Natural products CC(=C)C1CNC(C(O)=O)C1CC(O)=O VLSMHEGGTFMBBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- VLSMHEGGTFMBBZ-OOZYFLPDSA-N kainic acid Chemical compound CC(=C)[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)[C@H]1CC(O)=O VLSMHEGGTFMBBZ-OOZYFLPDSA-N 0.000 claims 1
- 229950006874 kainic acid Drugs 0.000 claims 1
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 9
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 71
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 55
- 101150082200 Npas4 gene Proteins 0.000 description 50
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 29
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 21
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 20
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 19
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 19
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 18
- 210000004295 hippocampal neuron Anatomy 0.000 description 18
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 18
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 18
- 208000002267 Anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis Diseases 0.000 description 16
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 16
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 14
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 13
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 13
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 12
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 12
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 12
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 11
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 11
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 125000003821 2-(trimethylsilyl)ethoxymethyl group Chemical group [H]C([H])([H])[Si](C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C(OC([H])([H])[*])([H])[H] 0.000 description 9
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 9
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 9
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 9
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 8
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 8
- 230000005062 synaptic transmission Effects 0.000 description 8
- 101150014889 Gad1 gene Proteins 0.000 description 7
- 102100035902 Glutamate decarboxylase 1 Human genes 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 7
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 7
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 6
- 238000000585 Mann–Whitney U test Methods 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 210000003618 cortical neuron Anatomy 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 238000012313 Kruskal-Wallis test Methods 0.000 description 5
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 5
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 5
- ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N Phosphorous acid Chemical compound OP(O)=O ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 5
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 5
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 5
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N etoposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 description 5
- 229960005420 etoposide Drugs 0.000 description 5
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 5
- 210000001926 inhibitory interneuron Anatomy 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 5
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- 230000008184 synaptic development Effects 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 210000000857 visual cortex Anatomy 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- UQNAFPHGVPVTAL-UHFFFAOYSA-N 2,3-Dihydroxy-6-nitro-7-sulfamoyl-benzo(f)quinoxaline Chemical compound N1C(=O)C(=O)NC2=C1C=C([N+]([O-])=O)C1=C2C=CC=C1S(=O)(=O)N UQNAFPHGVPVTAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 108091006283 SLC17A7 Proteins 0.000 description 4
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 4
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 4
- 102000046052 Vesicular Glutamate Transport Protein 1 Human genes 0.000 description 4
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 4
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 210000001787 dendrite Anatomy 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 230000028161 membrane depolarization Effects 0.000 description 4
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 230000003238 somatosensory effect Effects 0.000 description 4
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 3
- 101100397123 Mus musculus Iqsec3 gene Proteins 0.000 description 3
- QPGYAMIHXLCFTJ-UHFFFAOYSA-N N-[4-[5-(1,3-benzodioxol-5-yl)-3-methoxy-1,2,4-triazol-1-yl]phenyl]-2-(phenylthio)acetamide Chemical compound N1=C(OC)N=C(C=2C=C3OCOC3=CC=2)N1C(C=C1)=CC=C1NC(=O)CSC1=CC=CC=C1 QPGYAMIHXLCFTJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 3
- CWRVKFFCRWGWCS-UHFFFAOYSA-N Pentrazole Chemical compound C1CCCCC2=NN=NN21 CWRVKFFCRWGWCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 3
- 238000010162 Tukey test Methods 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000002337 electrophoretic mobility shift assay Methods 0.000 description 3
- 230000002964 excitative effect Effects 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 210000004565 granule cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 230000001242 postsynaptic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 206010000117 Abnormal behaviour Diseases 0.000 description 2
- 206010001497 Agitation Diseases 0.000 description 2
- 238000011814 C57BL/6N mouse Methods 0.000 description 2
- 101100115215 Caenorhabditis elegans cul-2 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 206010063629 Hippocampal sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 2
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- CXOFVDLJLONNDW-UHFFFAOYSA-N Phenytoin Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C1(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 CXOFVDLJLONNDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LHNKBXRFNPMIBR-UHFFFAOYSA-N Picrotoxin Natural products CC(C)(O)C1(O)C2OC(=O)C1C3(O)C4OC4C5C(=O)OC2C35C LHNKBXRFNPMIBR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 2
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 2
- KJADKKWYZYXHBB-XBWDGYHZSA-N Topiramic acid Chemical compound C1O[C@@]2(COS(N)(=O)=O)OC(C)(C)O[C@H]2[C@@H]2OC(C)(C)O[C@@H]21 KJADKKWYZYXHBB-XBWDGYHZSA-N 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- NIJJYAXOARWZEE-UHFFFAOYSA-N Valproic acid Chemical compound CCCC(C(O)=O)CCC NIJJYAXOARWZEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710159843 Zinc transporter 3 Proteins 0.000 description 2
- 102100034988 Zinc transporter 3 Human genes 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 2
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000002487 chromatin immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 description 2
- 230000001149 cognitive effect Effects 0.000 description 2
- 230000036461 convulsion Effects 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 208000002925 dental caries Diseases 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 230000001037 epileptic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 2
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 210000001153 interneuron Anatomy 0.000 description 2
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 2
- PYZRQGJRPPTADH-UHFFFAOYSA-N lamotrigine Chemical compound NC1=NC(N)=NN=C1C1=CC=CC(Cl)=C1Cl PYZRQGJRPPTADH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 2
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 2
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 2
- VJKUPQSHOVKBCO-AHMKVGDJSA-N picrotoxin Chemical compound O=C([C@@]12O[C@@H]1C[C@]1(O)[C@@]32C)O[C@@H]3[C@H]2[C@@H](C(=C)C)[C@@H]1C(=O)O2.O=C([C@@]12O[C@@H]1C[C@]1(O)[C@@]32C)O[C@@H]3[C@H]2[C@@H](C(C)(O)C)[C@@H]1C(=O)O2 VJKUPQSHOVKBCO-AHMKVGDJSA-N 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000010149 post-hoc-test Methods 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 2
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 2
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 2
- PJDFLNIOAUIZSL-UHFFFAOYSA-N vigabatrin Chemical compound C=CC(N)CCC(O)=O PJDFLNIOAUIZSL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AAWZDTNXLSGCEK-WYWMIBKRSA-N (-)-quinic acid Chemical compound O[C@@H]1C[C@](O)(C(O)=O)C[C@@H](O)[C@H]1O AAWZDTNXLSGCEK-WYWMIBKRSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930000680 A04AD01 - Scopolamine Natural products 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- IYGYMKDQCDOMRE-QRWMCTBCSA-N Bicculine Chemical compound O([C@H]1C2C3=CC=4OCOC=4C=C3CCN2C)C(=O)C2=C1C=CC1=C2OCO1 IYGYMKDQCDOMRE-QRWMCTBCSA-N 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 238000010196 ChIP-seq analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001353 Chip-sequencing Methods 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 208000001654 Drug Resistant Epilepsy Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 101150114117 EGR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000032274 Encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 1
- 102000005915 GABA Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010005551 GABA Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010070840 Gastrointestinal tract irritation Diseases 0.000 description 1
- 206010018341 Gliosis Diseases 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016285 Guanine Nucleotide Exchange Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010067218 Guanine Nucleotide Exchange Factors Proteins 0.000 description 1
- 101150075063 HOMER1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010019196 Head injury Diseases 0.000 description 1
- 102000010029 Homer Scaffolding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101000589316 Homo sapiens N-cym protein Proteins 0.000 description 1
- STECJAGHUSJQJN-GAUPFVANSA-N Hyoscine Natural products C1([C@H](CO)C(=O)OC2C[C@@H]3N([C@H](C2)[C@@H]2[C@H]3O2)C)=CC=CC=C1 STECJAGHUSJQJN-GAUPFVANSA-N 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 101150101005 Iqsec3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- 101150038732 LRRTM3 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000026139 Memory disease Diseases 0.000 description 1
- STECJAGHUSJQJN-UHFFFAOYSA-N N-Methyl-scopolamin Natural products C1C(C2C3O2)N(C)C3CC1OC(=O)C(CO)C1=CC=CC=C1 STECJAGHUSJQJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100032847 N-cym protein Human genes 0.000 description 1
- 206010060860 Neurological symptom Diseases 0.000 description 1
- 102000004108 Neurotransmitter Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000590 Neurotransmitter Receptors Proteins 0.000 description 1
- 229940123247 Neurotransmitter antagonist Drugs 0.000 description 1
- KNAHARQHSZJURB-UHFFFAOYSA-N Propylthiouracile Chemical compound CCCC1=CC(=O)NC(=S)N1 KNAHARQHSZJURB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 101100397124 Rattus norvegicus Iqsec3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 208000020764 Sensation disease Diseases 0.000 description 1
- 101100174184 Serratia marcescens fosA gene Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 102000007537 Type II DNA Topoisomerases Human genes 0.000 description 1
- 108010046308 Type II DNA Topoisomerases Proteins 0.000 description 1
- 208000003443 Unconsciousness Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000004727 amygdala Anatomy 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000000935 antidepressant agent Substances 0.000 description 1
- 229940005513 antidepressants Drugs 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- AACMFFIUYXGCOC-UHFFFAOYSA-N bicuculline Natural products CN1CCc2cc3OCOc3cc2C1C4OCc5c6OCOc6ccc45 AACMFFIUYXGCOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000006931 brain damage Effects 0.000 description 1
- 231100000874 brain damage Toxicity 0.000 description 1
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 1
- KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N brefeldin A Chemical compound O[C@@H]1\C=C\C(=O)O[C@@H](C)CCC\C=C\[C@@H]2C[C@H](O)C[C@H]21 KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N 0.000 description 1
- JUMGSHROWPPKFX-UHFFFAOYSA-N brefeldin-A Natural products CC1CCCC=CC2(C)CC(O)CC2(C)C(O)C=CC(=O)O1 JUMGSHROWPPKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 229960000623 carbamazepine Drugs 0.000 description 1
- FFGPTBGBLSHEPO-UHFFFAOYSA-N carbamazepine Chemical compound C1=CC2=CC=CC=C2N(C(=O)N)C2=CC=CC=C21 FFGPTBGBLSHEPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000005081 chemiluminescent agent Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009194 climbing Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000003792 cranial nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- IYGYMKDQCDOMRE-UHFFFAOYSA-N d-Bicucullin Natural products CN1CCC2=CC=3OCOC=3C=C2C1C1OC(=O)C2=C1C=CC1=C2OCO1 IYGYMKDQCDOMRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940075925 depakote Drugs 0.000 description 1
- 230000002999 depolarising effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N diazepam Chemical compound N=1CC(=O)N(C)C2=CC=C(Cl)C=C2C=1C1=CC=CC=C1 AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003529 diazepam Drugs 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 229940064790 dilantin Drugs 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- SFCNPIUDAIFHRD-UHFFFAOYSA-N ditert-butyl-[[2-(ditert-butylphosphanylmethyl)phenyl]methyl]phosphane Chemical compound CC(C)(C)P(C(C)(C)C)CC1=CC=CC=C1CP(C(C)(C)C)C(C)(C)C SFCNPIUDAIFHRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002173 dizziness Diseases 0.000 description 1
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 1
- 230000005014 ectopic expression Effects 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 238000000537 electroencephalography Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 208000028329 epileptic seizure Diseases 0.000 description 1
- HAPOVYFOVVWLRS-UHFFFAOYSA-N ethosuximide Chemical compound CCC1(C)CC(=O)NC1=O HAPOVYFOVVWLRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002767 ethosuximide Drugs 0.000 description 1
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 1
- 230000003492 excitotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000063 excitotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 101150078861 fos gene Proteins 0.000 description 1
- 210000001652 frontal lobe Anatomy 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000007387 gliosis Effects 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 239000003825 glutamate receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 229940072170 lamictal Drugs 0.000 description 1
- 229960001848 lamotrigine Drugs 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000003340 mental effect Effects 0.000 description 1
- LZCOQTDXKCNBEE-IKIFYQGPSA-N methscopolamine Chemical compound C1([C@@H](CO)C(=O)O[C@H]2C[C@@H]3[N+]([C@H](C2)[C@@H]2[C@H]3O2)(C)C)=CC=CC=C1 LZCOQTDXKCNBEE-IKIFYQGPSA-N 0.000 description 1
- 229960001383 methylscopolamine Drugs 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007383 nerve stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000004766 neurogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000002610 neuroimaging Methods 0.000 description 1
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000000869 occipital lobe Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- CTRLABGOLIVAIY-UHFFFAOYSA-N oxcarbazepine Chemical compound C1C(=O)C2=CC=CC=C2N(C(=O)N)C2=CC=CC=C21 CTRLABGOLIVAIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001816 oxcarbazepine Drugs 0.000 description 1
- 210000001769 parahippocampal gyrus Anatomy 0.000 description 1
- 210000001152 parietal lobe Anatomy 0.000 description 1
- 229960005152 pentetrazol Drugs 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 1
- DDBREPKUVSBGFI-UHFFFAOYSA-N phenobarbital Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O DDBREPKUVSBGFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002695 phenobarbital Drugs 0.000 description 1
- 229960002036 phenytoin Drugs 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 229960002139 pilocarpine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- RNAICSBVACLLGM-GNAZCLTHSA-N pilocarpine hydrochloride Chemical compound Cl.C1OC(=O)[C@@H](CC)[C@H]1CC1=CN=CN1C RNAICSBVACLLGM-GNAZCLTHSA-N 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000007542 postnatal development Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229940106773 sabril Drugs 0.000 description 1
- STECJAGHUSJQJN-FWXGHANASA-N scopolamine Chemical compound C1([C@@H](CO)C(=O)O[C@H]2C[C@@H]3N([C@H](C2)[C@@H]2[C@H]3O2)C)=CC=CC=C1 STECJAGHUSJQJN-FWXGHANASA-N 0.000 description 1
- 229960002646 scopolamine Drugs 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000007727 signaling mechanism Effects 0.000 description 1
- 231100000046 skin rash Toxicity 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- AEQFSUDEHCCHBT-UHFFFAOYSA-M sodium valproate Chemical compound [Na+].CCCC(C([O-])=O)CCC AEQFSUDEHCCHBT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000004092 somatosensory cortex Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000002672 stereotactic surgery Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 229940090016 tegretol Drugs 0.000 description 1
- 201000008914 temporal lobe epilepsy Diseases 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940035305 topamax Drugs 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 229960004394 topiramate Drugs 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- ACRXLLXANWELLX-UHFFFAOYSA-N tribromomethanol Chemical compound OC(Br)(Br)Br ACRXLLXANWELLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 210000001186 vagus nerve Anatomy 0.000 description 1
- 229940102566 valproate Drugs 0.000 description 1
- 229960005318 vigabatrin Drugs 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0276—Knock-out vertebrates
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
- G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/20—Animals treated with compounds which are neither proteins nor nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
IQSEC3 (IQ motif and Sec7 domain 3) 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성이 억제된 뇌전증 동물 모델, 상기 뇌전증 동물 모델을 제조하는 방법, 및 이를 이용한 뇌전증 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다. 이에 따르면, 뇌전증 치료제의 개발 및 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
뇌전증 동물 모델, 그의 제조방법 및 용도에 관한 것이다.
뇌전증은 기질적 병변 또는 기능적 장애로 인하여 뇌신경 세포의 발작적인 방전으로 간헐적인 신경계의 장애를 일으키고, 신경증상, 의식상실, 경련, 감각장애 등의 증상을 나타내는 질환이다. 알츠하이머병 (Alzheimer) 및 뇌졸중(Stroke)에 이어 세 번째로 흔한 신경계 질환으로, 전 세계 인구의 약 0.5~2%가 뇌전증을 앓고 있다. 또한, 전 세계적으로는 매년 10만명당 45명 정도로 새로운 환자가 발생하고 있고, 우리나라의 경우 약 30~40만 명의 뇌전증 환자가 있는 것으로 추정되고 있다. 뇌전증 환자의 연령 분포를 살펴보면, 전체 뇌전증의 70%가 소아 청소년 연령에서 시작되고, 특히, 유아기에 발병률이 높은 것으로 알려져 있다. 또한, 발병률과 유병률은 생후 1년 이내에 가장 높았다가 급격히 낮아지고, 60세 이상의 노년층에서 다시 급격히 증가하는 U자 형태를 보이며, 일생동안 발작을 경험하는 유병률은 10~15%에 이른다.
뇌전증은 뇌전증 발작 (epileptic seizure)이 반복적으로 발생하는 만성화된 질환으로서, 그 원인이 매우 다양하며, 이에, 정확한 원인은 밝혀져 있지 않은 실정이다. 다만, 최근 신경영상검사 기술의 발달에 따라 과거에는 관찰할 수 없었던 뇌의 미세한 병리적 변화들을 관찰할 수 있게 되면서 뇌전증의 원인에 대한 규명이 점차 확대되고 있다. 일부 역학 연구에서는 환자의 1/3 이상이 뇌에 생긴 병리적 변화나 뇌손상의 과거 병력이 있는 것으로 보고된 바 있고, 주요한 원인으로는 뇌졸중, 선천기형, 두부외상, 뇌염, 뇌종양, 퇴행성 뇌병증, 유전, 미숙아, 분만 전후의 손상 등으로 알려져 있다.
한편, 뇌전증의 치료는 크게 약물 치료와 약물외 치료, 즉 수술, 케톤식이요법, 미주신경자극술 등으로 분류할 수 있다. 다만, 약물외 치료는 약물에 저항성을 보이는 환자에 대해서만 시행되고 있는바, 뇌전증 치료를 위한 주요한 방법으로 약물 치료가 이용되어왔다. 종래의 약물들로 페니토인 (Phenytoin: Dilantin), 발프로에이트 (Valproate: Orfil, Depakine, Depakote), 카바마제핀 (Carbamazepine: Tegretol), 페노바비탈 (Phenobarbital: Luminal), 에토숙시마이드 (Ethosuximide: Zarontin) 등이 있으며, 최근에는 토피라메이트 (Topiramate: topamax), 라모트리진 (Lamotrigine: Lamictal), 비가바트린 (Vigabatrin: Sabril), 옥스카바제핀(Oxcarbazepine: Trileptal) 등이 개발되어 상용화되어 있다.
다만, 이러한 약물 치료에도 불구하고, 뇌전증 환자의 30% 이상은 여러가지 작용 기전의 약물을 사용해도 발작이 조절되지 않으며, 일부 약물들은 면역 과민 반응에 의한 피부 발진, 약물에 의한 위장 자극, 및 어지럼증 등과 같은 부작용을 나타내고 있는바, 뇌전증의 치료에 어려움을 겪고 있다.
이러한 기술적 배경 하에서, 뇌전증의 효과적인 치료를 위한 동물 모델 및 이를 이용한 새로운 뇌전증 치료제의 개발이 필요한 실정이다.
일 양상은 IQSEC3 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성이 억제된 뇌전증 동물 모델을 제공하는 것이다.
다른 양상은 IQSEC3 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 억제시키는 단계를 포함하는 뇌전증 동물 모델을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 뇌전증 동물 모델에 뇌전증의 치료를 위한 후보약물을 투여하는 단계; 및 뇌전증 증상이 완화되는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 뇌전증 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 IQSEC3 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성이 억제된 뇌전증 동물 모델을 제공한다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "뇌전증"은 뇌의 비정상적인 과흥분과 과동기화로 인해 신경세포 중 일부가 발작적으로 짧은 시간에 과도한 전기를 발생시켜 발작 (seizure)이 반복적으로 발생하는 만성화 질환으로서, 신경생물학적, 정신적, 인지적, 사회적 변화를 수반하는 심각한 뇌신경 질환이다. 또한, 신경세포가 퇴행 또는 사멸하면서 인지 장애, 행동 장애 등을 나타내는 일반적인 뇌신경계 질환과 달리, 뇌전증은 신경세포가 비정상적으로 과도하게 활성화됨에 따라 발생하는 뇌신경계 질환이라는 점에 특징이 있다. 또한, 신경세포의 비정상적 과다흥분성 (hyperexcitability)에 의한 흥분독성 (excitotoxicity)이 유발되어 뇌전증에 의한 병리학적 손상이 잘 나타나는 대뇌 부위 중 해마 (hippocampus) 내에서 해마경화증 (hippocampal sclerosis), 교질화 (gliosis), 비정상적 신경발생 (abnormal neurogenesis)과 치아이랑 과립세포 비정상적 세포구축 (cytoarchitectural abnormality of dentate granule cells) 및 이상시냅스회로 형성 (aberrant synpatic circuit) 등이 나타난다. 위와 같은 해마 내 병리학적 현상들이 진행됨으로써 만성 뇌전증 발작 (chronic epileptic seizure)이 발생되고 인지 및 기억 장애뿐만 아니라 약물 치료에 반응하지 않는 약제불응성 난치성 뇌전증이 발생된다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "IQSEC3 (IQ motif and Sec7 domain 3)"은 Brefeldin A-저항성 ARF 구아닌 뉴클레오타이드 교환 인자 (ARF-GEF) 패밀리에 속하는 단백질로서, "BRAG3" 또는 "SynARFGEF"라고도 명명된다. IQSEC3은 뇌, 특히, 편도체에서 높게 발현되며, 학습 능력에 중요한 역할을 하는 것으로 보고된 바 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, IQSEC3은 Npas4 단백질의 하부 유전자 타겟으로 작용하여, GABA성 시냅스의 저해, 게피린 반점의 밀도의 감소 등을 유도할 수 있다. 따라서, IQSEC3 유전자의 또는 단백질의 발현 또는 활성 조절은 뇌전증의 유발에 효과적임을 알 수 있다.
용어 "IQSEC3 유전자의 또는 단백질의 발현 또는 활성이 억제된"은 IQSEC3 유전자 또는 IQSEC3 단백질의 기능이 저해 또는 방해되는 것을 의미한다. 이와 같은 저해 또는 방해는 IQSEC3 유전자의 전사를 방해하거나, 또는 IQSEC3 유전자의 mRNA의 번역을 저해함으로써 이루어질 수 있다. 또는 IQSEC3 단백질의 활성 부위에 특이적으로 결합하거나, 단백질 구조 변형을 일으킴으로써, IQSEC3 단백질의 활성을 감소 또는 불활성화시킬 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 동물 모델은 해마 치아이랑의 IQSEC3 유전자가 넉다운 (knock-down) 또는 넉아웃 (knock-out)된 것일 수 있다. 여기에서, 용어, "넉아웃"은 유전자의 결손이 유발된 DNA를 외부에서 도입하여 정상 유전자에 완전 불활성화를 유도하는 것을 의미하며, 용어, "넉다운"은 예를 들어, RNAi 등을 이용해서 발현하는 mRNA를 퇴화 (degradation)시켜서 유전자 발현량을 줄이는 것을 의미한다.
다른 구체예에 있어서, 상기 동물 모델은 필로카르핀 또는 카인산이 투여된 것일 수 있다.
상기 방법에서, 상기 필로카르핀 또는 카인산의 투여량은 통상의 기술자에 의하여 뇌전증을 유발시킬 수 있는 수준을 참고하여 결정할 수 있다. 구체적으로, 상기 필로카르핀은 100 내지 500mg/kg, 200 내지 400mg/kg, 250 내지 350mg/kg의 농도로 투여될 수 있고, 상기 카인산은 3 내지 30mg/kg, 5 내지 25mg/kg, 10 내지 20mg/kg의 농도로 투여될 수 있다. 또한 상기 투여는 한 번에 투여되거나 수 회에 나누어 투여될 수 있다.
상기 동물은 인간에게 나타나는 각종 질환을 지닌 동물로, 몇 새대를 요하는 장기간의 유전 연구나 직접 인간을 대상으로 실험이 어려운 장기이식 실험 등 인체 질환 규명과 치료법 개발에 사용되는 동물 모델에 해당할 수 있는 인간을 제외한 동물을 제한 없이 포함한다. 구체적으로, 마우스, 랫트, 모르모트, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 소, 양, 돼지, 및 염소로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 동물 중 마우스는 번식능력, 발육능력, 및 환경 적응능력이 좋고 자손의 수가 많아 실험군에 속하는 개체 수를 많이 확보할 수 있어 믿을만한 결과를 얻을 수 있으며, 조작이 간편한 장점이 있다.
다른 양상은 IQSEC3 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 억제시키는 단계를 포함하는 뇌전증 동물 모델을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 뇌전증, IQSEC3 유전자 또는 단백질, 및 동물의 종류 등에 대해서는 상기한 바와 같다.
상기 단계는 IQSEC3 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 이용하여 이루어질 수 있다. 상기 물질로는 IQSEC3 유전자의 발현 또는 IQSEC3 단백질의 활성을 감소 또는 방해하는 물질이라면, 화합물, 단백질, 아미노산, 펩티드, 바이러스, 탄수화물, 지질, 핵산 등 제한 없이 사용 가능하다.
상기 IQSEC3 유전자의 발현을 억제하는 물질은 상기 mRNA의 번역을 억제하는 물질로서 저분자 화합물, 안티센스 핵산 서열의 제조나 RNAi 테크닉을 이용한 RNA, siRNA 또는 shRNA 등을 이용하는 것일 수 있다. 또한 상기 IQSEC3 유전자의 발현을 억제하는 물질은 상기 IQSEC3 유전자의 전사를 조절한다고 알려져 있는 프로모터, 인핸서 (enhancer), 또는 전사조절인자에 결합하는 단백질 또는 화합물을 이용하는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 물질은 IQSEC3 유전자 또는 그의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA (short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA (short hairpin RNA), 두 가닥 RNA (double strand RNA) 및 마이크로 RNA (miRNA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 또한, 구체적으로 IQSEC3 단백질을 코딩하는 핵산에 대해 안티센스인 뉴클레오티드 분자를 저해제로 사용할 수 있다. '안티센스' 핵산은 IQSEC3을 코딩하는 '센스' 핵산에 상보적인, 예를 들면 두 가닥 사슬 cDNA 분자의 코딩 가닥에 상보적이거나 mRNA 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 안티센스 핵산은 전체 IQSEC3 코딩 가닥 또는 단지 그들의 일부(예: 코딩영역)에 상보적일 수 있다.
IQSEC3 단백질의 활성을 억제하는 물질은 예를 들면 IQSEC3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 그의 항원 결합 특성을 갖는 항체 단편 및 그의 결합 활성을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 또한 상기 물질은 IQSEC3 단백질에 상보적으로 결합하는 앱타머, 화합물, 펩티드, 또는 펩티드 미메틱스를 포함할 수 있다.
상기 항체는 IQSEC3의 주입을 통해 제조된 것 또는 시판되어 구입한 것 모두 사용 가능하다. 또한, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 에피토프와 결합할 수 있는 단편 등을 포함할 수 있다. 다클론 항체는 상기 IQSEC3을 동물에 주사하고 해당 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 종래의 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 당업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서든 정제될 수 있고, 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 만들어질 수 있다. 또한 상기 단클론 항체 또는 에피토프와 결합할 수 있는 단편 모두 당해 기술 분야에서 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 단계는 해마 치아이랑의 IQSEC3 유전자를 넉다운 또는 넉아웃시키는 것일 수 있다. 상기 단계에서는 IQSEC3 유전자의 완전 불활성화 또는 발현량을 줄일 수 있다면, 당업계에 이미 알려져 다양한 기술 또는 방법이 적용될 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 IQSEC3 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성이 억제된 동물 모델에 필로카르핀 또는 카인산을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 "투여"는 동물에 어떠한 형태의 경로를 통해서도 수행될 수 있다. 상기 필로카르핀 또는 카인산이 동물에 투여되어 효과를 나타낼 수 있는 한, 제한없이 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 구체적으로, 주사제로 투여하거나 제제화하여 경구투여하거나 사료에 첨가하여 섭취시키는 방식으로 투여할 수 있다. 상기 필로카르핀 또는 카인산을 주사제로 투여하는 경우, 피하 주사, 복강내 주사, 혈관내 주사, 또는 이들의 조합으로 투여할 수 있다. 또한, 필로카르핀 또는 카인산의 투여량은 상기한 바와 같다.
또 다른 양상은 상기 뇌전증 동물 모델에 뇌전증의 치료를 위한 후보약물을 투여하는 단계; 및 뇌전증 증상이 완화되는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 뇌전증 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서 "후보약물"은 새롭게 합성된 또는 공지된 화합물 등의 물질로서, 뇌전증의 예방 또는 치료에 효과를 나타낼 것으로 기대되는 물질을 제한 없이 포함할 수 있다.
상기 후보약물을 투여하여 뇌전증의 증상의 완화가 관찰된다면 해당 후보약물이 뇌전증의 예방 또는 치료에 효과가 있는 물질로 판단할 수 있다.
상기 후보약물의 "투여"는 적절한 방법으로 개체에 소정의 물질을 도입하는 것을 의미한다. 상기 후보약물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내, 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 스크리닝 방법에서, 뇌전증 증상이 완화되는지 여부를 확인하는 단계는 당업계에 공지된 방법, 예컨대 상기 뇌전증 동물 모델의 혈액 중 뇌전증 관련 표지의 농도의 측정, 뇌파 (EEG, Electroencephalogram) 분석, 개방형 필드 테스트(open field test: OFT), 행동 발작 스코어링 (Behavioral Seizure scoring), 또는 이들의 조합에 의해 수행될 수 있다.
또 다른 양상은 IQSEC3 유전자 또는 이의 단백질의 발현 또는 활성을 측정하는 제제를 포함하는 뇌전증 진단용 조성물, 그를 포함하는 뇌전증 진단용 키트, 및 뇌전증의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며, 뇌전증의 발병 여부 또는 발병 가능성 여부를 확인하는 것을 포함하는 의미일 수 있다.
일 양상에 따른 뇌전증 동물 모델은 GABA성 시냅스의 저해에 통하여, 급격하게 뇌전증 증상을 유발시킬 수 있었으므로, 뇌전증 치료제의 개발 및 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 생체 내 GABA성 시냅스 전달과 IQSEC3간 관련성을 확인한 것이다.
(A-C)는 배양된 해마 뉴런에서 억제성 시냅스 전달에 대한 IQSEC3의 효과를 확인한 것으로, 대조군 또는 IQSEC3-KD로 형질전환되거나, IQSEC3-KD 및 IQSEC3로 공동 형질전환되어 구제된 (+IQSEC3 res.) 해마 뉴런에서, mIPSCs의 (A) 대표적인 트레이스 (traces), (B) 진동수, 및 (C) 진폭을 요약한 그래프를 나타낸 것이다.
(D-F) 흥분성 시냅스 전달에 대한 IQSEC3의 효과를 확인한 것으로서, 대조군 또는 IQSEC3-KD로 형질전환되거나, IQSEC3-KD 및 IQSEC3로 공동 형질전환되어 구제된 (+IQSEC3 res.) 해마 뉴런에서, mIPSCs의 (D) 대표적인 트레이스, (E) 진동수, 및 (F) 진폭을 요약한 그래프를 나타낸 것이다. 실험 데이터는 평균 ± SEMs (p < 0.05; Tukey's 테스트를 이용한 분산분석)로 나타내었고; “n"은 기록된 뉴런의 총 수를 나타내며, 다음의 값을 갖는다 (mIPSCs/Control, n = 10; mIPSCs/IQSEC3-KD, n = 13; mIPSCs/IQSEC3-KD (+ rescue), n = 9; mEPSCs/Control, n = 8; 및 mEPSCs/IQSEC3-KD, n = 9).
(G-I) 체성감각 층 II/III 피질 뉴런에서 억제성 시냅스 전달에 대한 IQSEC3의 효과를 확인한 것으로서, 대조군 또는 IQSEC3-KD로 형질전환되거나, IQSEC3-KD 및 IQSEC3로 공동 형질전환되어 구제된 (+IQSEC3 res.) 해마 뉴런에서, mIPSCs의 (G) 대표적인 트레이스, (H) 진동수, 및 (CI) 진폭을 요약한 그래프를 나타낸 것이다.
(J-L) 체성감각층 II/III 피질 뉴런에서 흥분성 시냅스 전달에 대한 IQSEC3의 효과를 확인한 것으로서, 대조군 또는 IQSEC3-KD로 형질전환되거나, IQSEC3-KD 및 IQSEC3로 공동 형질전환되어 구제된 (+IQSEC3 res.) 해마 뉴런에서, mIPSCs의 (J) 대표적인 트레이스, (K) 진동수, 및 (L) 진폭을 요약한 그래프를 나타낸 것이다.
(M-N) PPR에 대한 IQSEC3의 효과 (두번째 IPSC의 진폭을 첫번째 IPSC의 진폭으로 나눈 값)를 확인한 것으로서, (M) 대표적인 트레이스, 및 (N) 50 ms의 자극 사이의 간격에서 측정된 PPR을 요약한 그래프를 나타낸 것이다. 실험 데이터는 평균 ± SEMs (Student's 테스트를 사용한 *p < 0.05)로 나타내었고; 'n'은 기록된 뉴런의 수를 나타내고, 하기와 같은 값을 갖는다: mIPSCs/Control, n = 9; mIPSCs/IQSEC3-KD, n = 9; mEPSCs/Control, n = 9; mEPSCs/IQSEC3-KD, n = 9; IPSC-PPR/Control, n = 8; 및 IPSC-PPR/IQSEC3-KD, n = 8).
(O-Q) 치아이랑 과립 세포층 (GCL; O), 치아이랑 문 (P), 체성감각 층 II/III 피질 (Q)에서, 시냅스 반점에 대한 IQSEC3의 효과를 확인한 것으로서, 대표적인 공초점 이미지는 IQSEC3-KD 뉴런의 치아이랑 문 (체성감각 피질은 제외)에서 GAD67 반점 강도가 감소됨을 나타내었다. 뇌 절편은 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylinodole; 분석된 뇌 영역의 세포 핵을 나타내기 위함: 푸른색) 및 EGFP (AAV에 형질감염된 뉴런; 녹색)으로 염색되었다. 치아이랑 GCL에서 GAD67 반점 강도는 통계적으로 유의성을 나타내지는 않으나, 감소하는 경향을 보였고, VGLUT1 반점 강도는 IQSEC3-KD 뉴런에서 증가되었다.
(R-S) 조직 당 (R) GAD67 및 (S) VGLUT1 반점 강도의 정량화 결과로서, 실험데이터는 3-5회의 독립적인 실험으로부터 얻어진 평균 ± SEMs로 나타내었고: 통계적 유의성은 Tukey's 테스트를 이용한 분산분석을 사용하여 여러 조건을 대조군과 비교함으로서 평가되었다 (모든 조건에서, *p < 0.05; n = 5 마우스).
도 2는 시냅스성 활성-의존 방식으로 게피린의 클러스터링 촉진하는 IQSEC3의 작용 기작을 확인한 것이다.
(A) DIV8에서, EGFP (대조군), IQSEC3, 또는 IQSEC3 shRNA vector (IQSEC3-KD)를 코딩하는 발현 플라스미드로 형질감염된 배양 해마 뉴런의 대표적인 이미지, 및 DIV14에서 게피린 (붉은색) 및 EGFP (푸른색)의 항체를 사용한 이중 면역형광법으로 분석한 결과를 나타낸 것이다. DMSO (대조군) 또는 신경전달 수용체 차단제 (50μM 비쿠쿨린 단독 또는 100μM APV/20μM NBQX와 함께)는 형질감염 시, 시냅스 활성을 차단하기 위하여 첨가되었다. 스케일 바, 5㎛ (모든 이미지에 적용).
(B) 형질감염된 뉴런에서 게피린 반점의 밀도, 면적, 및 강도에 대한 시냅스 활성 차단제의 효과를 요약한 그래프이다. 점선은 다른 실험 조건과의 비교를 위한 대조군의 수준을 나타낸다. 실험 데이터는 평균 ± SEMs로 나타내었다 (*p < 0.05; 3*p < 0.001 vs. DMSO-처리된 대조군; Mann-Whitney U 테스트).
도 3은 IQSEC3에 의한 게피란 반점의 밀도 및 면적 증가 효과가 ARF 단백질 활성에 의존적임을 확인한 것이다.
(A) DIV8에서, EGFP (대조군), 또는 IQSEC3을 발현하는 플라스미드로 형질감염된 배양 해마 뉴런의 대표적인 이미지, 및 DIV14에서 GAD67 (붉은색) 및 EGFP (푸른색)의 항체를 사용한 이중 면역형광법으로 분석한 결과를 나타낸 것이다. ARF 단백질 활성을 억제하는 SecinH3 혹은 QS11 약물을 처리할 경우 IQSEC3에 의한 효과가 사라진다. 스케일 바, 5㎛ (모든 이미지에 적용).
(B) 형질감염된 뉴런에서 GAD67 반점의 밀도 및 면적에 대한 ARF 단백질 활성 차단 약물효과를 요약한 그래프이다. 점선은 다른 실험 조건과의 비교를 위한 대조군의 수준을 나타낸다. 실험 데이터는 평균 ± SEMs으로 나타내었다 (*p < 0.05; 2*p < 0.01 vs. DMSO-처리된 대조군; Mann-Whitney U 테스트).
(C) DIV8에서, EGFP (대조군), 또는 IQSEC3을 발현하는 플라스미드로 형질감염된 배양 해마 뉴런의 대표적인 이미지, 및 DIV14에서 게피린 (붉은색) 및 EGFP (푸른색)의 항체를 사용한 이중 면역형광법으로 분석한 결과를 나타낸 것이다. ARF 단백질 활성을 억제하는 SecinH3 혹은 QS11 약물을 처리할 경우 IQSEC3에 의한 효과가 사라진다. 스케일 바, 5㎛ (모든 이미지에 적용).
(D) 형질감염된 뉴런에서 게피린 반점의 밀도 및 면적에 대한 ARF 단백질 활성 차단 약물효과를 요약한 그래프이다. 점선은 다른 실험 조건과의 비교를 위한 대조군의 수준을 나타낸다. 실험 데이터는 평균 ± SEMs로 나타내었다 (3*p < 0.001 vs. DMSO-처리된 대조군; Mann-Whitney U 테스트).
도 4는 IQSEC3의 프로모터와 Npas4간 결합을 확인한 것이다.
(A) 실시간 PCR에 사용되는 3개의 amplicon을 나타내는 IQSEC3 유전자좌를 도식화한 것으로서, ChIP-seq 분석에 의해 확인된 Npas4-결합성 자리는 Npas-4 반응적 요소로서 나타내었다.
(B) HEK 세포를 Npas4 (40ng)를 발현하는 벡터와 함께, IQSEC3 인접 프로모터 영역 (-280부터 +36)을 함유하는 루시퍼라제 리포터 컨스트럭트 (100ng)로 동시 형질감염시켰다. MT는 공통적인 Npas4-결합 서열에서, 돌연변이를 포함하는 프로모터-리포터 컨스트럭트를 나타낸다. 루시퍼라제 활성은 세포 추출물에서 분석하였고, WT IQSEC3 프로모터 영역을 함유하는 루시퍼라제 리포터로 형질전환된 세포에서 상대적인 루시퍼라제 활성을 평가하였다 (1로 정의됨). 값은 세 번의 독립적인 실험 (*p < 0.001 vs. 비형질감염된 대조군; Mann-Whitney U 테스트)으로부터 평균 ± SEMs로 나타내었다.
(C) EMSA는 정제된 FLAG 태그 Npas4 단백질 (10-90ng) 및 IQSEC3 인접 프로모터 내 뉴클레오타이드 -110 내지 -69에 해당하는 프로브로 실시되었다. Inset은 실험에서 사용한 정제된 FLAG-Npas4 단백질의 SDS PAGE/쿠마시 블루-염색의 이미지를 보여준다.
(D) KCl-처리된 마우스의 피질 뉴런 내 IQSEC3 좌위에서 Npas4에 대한 ChIP-seq 결합성 프로파일이다. 실험 결과는 GEO 접속 번호 GSE21161로, GEO 웹 사이트로부터 다운로드하였다. 전체 태그의 수는 해당 입력값에 의해 정규화되었다.
도 5는 Npas4 표적으로서 IQSEC3의 기능성 확인한 것이다.
(A 및 C) DIV3에서, EGFP 단독 (대조군), IQSEC3-KD 또는 BDNF-KD를 발현하는 렌티바이러스로 형질감염된 해마 뉴런, 및 DIV10에서, EGFP 단독으로 발현하거나 (대조군), EGFP 및 Npas4를 발현하는 렌티바이러스로 형질감염된 해마 뉴런의 대표적인 이미지이다. DIV14에서, 형질감염된 뉴런의 수상 돌기 (A) 또는 신경세포체 (C)는 게피린 (붉은색), 및 EGFP (푸른색)으로 표지된 이중 면역형광법으로 분석되었다. 스케일 바, 10㎛ (모든 이미지에 적용).
(B 및 D), 억제성 후시냅스의 밀도 (왼쪽), 억제성 후시냅스의 크기 (가운데), 및 억제성 후시냅스의 강도 (오른쪽)에 대한 Npas4-발현 뉴런에서 IQSEC3-KD 또는 BDNF-KD의 효과를 요약한 그래프이다. 수상 돌기 (B) 또는 신경세포체 (D)는 개별적으로 정량화하였다. 수상 돌기의 분석을 위하여, 형질감염된 뉴런 당 둘 또는 세 개의 수상 돌기가 선택되었고, 그룹-평균화되었다; "n"은 분석된 뉴런의 총 수를 나타낸다. 실험결과는 평균 ± SEMs로 나타내었다 (p < 0.05; Tukey's 테스트를 이용한 분산분석).
(E) DIV8에서, EGFP (Control), Npas4 shRNA 벡터 (NPAS4-KD), IQSEC3, 또는 IQSEC3+NPAS4-KD (NPAS4-KD+IQSEC3)를 코딩하는 발현 플라스미드로 형질감염된 해마 뉴런의 대표적인 이미지, 및 DIV14에서 게피린 (붉은색) 및 EGFP (푸른색)의 항체를 사용한 이중 면역형광법으로 분석된 결과이다. 형질감염시, 50μM 비쿠쿨린이 배양된 뉴런에 함께 첨가되었다. 스케일 바, 5㎛ (모든 이미지에 적용).
(F) Npas4 -결핍성 뉴런에서 게피린 반점의 밀도, 면적, 및 강도에 대한 IQSEC3 과발현의 효과를 요약한 그래프이다. 점선은 다른 실험 조건과의 비교를 위한 대조군의 수준을 나타낸다. 실험 데이터는 평균 ± SEMs으로 나타내었다 (*p < 0.05; **p < 0.001 vs. DMSO-처리된 대조군; Mann-Whitney U 테스트).
도 6은 뉴런성 활동에 의한 IQSEC3의 발현 조절을 확인한 것이다.
(A) IQSEC3 수준은 WT 뉴런에 비해, Npas4-KD 뉴런 (Npas4-KD)에서 감소되었다. BDNF 수준은 이전에 보고된 바와 같이, Npas4-KD 뉴런에서 감소되었다. DIV8에서, 대조 바이러스 (대조군) 또는 Npas4 KD 바이러스 (Npas4-KD)로 감염된 피질 배양물은 55 mM의 KCl을 처리하여 자극되었고, mRNA 수준이 qRT-PCR으로 측정되었다.
(B) IQSEC3 수준은 활성-유도된 DNA 파괴, 또는 시냅스성 활동 차단에 의해 변화하지 않는다. DIV11에서, 배양된 피질 뉴런에 DMSO (대조군), 5μM의 etoposide 20분, 또는 신경전달 물질 길항제의 칵테일 (50μM의 피크로톡신, 100μM APV 및 20μM의 NBQX; APV/NBQX/Picrotoxin)을 처리하여 4일 동안 시냅스 활성을 차단하였고, 이후, RNA를 추출하고, 표시된 유전자의 발현을 qRT-PCR을 사용하여 평가하였다. Npas4의 수준은 etoposide에 의해 증가되었던 반면, 게피린 수준은 현저하게 감소되었다. 수용체 길항제를 사용한 시냅스 활성의 감소는, Npas4, BDNF, 또는 Gephyrin 수준을 변화시키지 않았다. 실험 결과는 평균 ± SEMs로 나타내었다 (*p < 0.05; 2*p < 0.01 vs. DMSO-처리된 대조군; Kruskal-Wallis 테스트를 사용한 비모수의 일원분산분석 ; n = 3 내지 5의 독립적인 배양물).
(C, D) 마우스의 시각 피질의 IQSEC3 또는 게피린 수준은 감각적 경험에 의해 조절된다. (C) 실험 절차에 대한 프로토콜을 도식화 한 것으로서, WT 마우스는 정상 12/12시간 낮/밤 주기로 26일 동안 사육되었고, 실험군 (DR)은 P21에서 P26까지 5일 동안 암실 사육되었다. DR+2hL는 암실 사육이후, 2시간 동안 빛에 노출된 마우스 군을 나타낸다. (D) mRNA 수준을 측정하기 위하여 qRT-PCR이 수행되었고, 실험 결과는 평균 ± SEMs로 나타내었다 (*p < 0.05; 2*p < 0.01 vs. DMSO-처리된 대조군; Kruskal-Wallis 테스트를 사용한 비모수의 일원분산분석; n = 5 마리의 마우스).
(E, G) 표시된 조건 하에서 사육된 성체 마우스에서, IQSEC3 (붉은색), pan- IQSEC3 (녹색), 및 게피린(흰색) mRNAs의 발현을 RNAscope 기술을 사용한 in situ 혼성화에 의해 시각화한 결과이다. DAPI (푸른색)로 핵이 염색되었고, 본 실험에서의 대표적인 이미지를 나타내었다. (E) 시각적 피질 및 (G) 해마성 부분체는 아래에 확대되어, 단일 뉴런 수준에서 mRNA 발현 프로파일을 보여주었다. 스케일 바: 200 ㎛ (왼쪽의 가장 큰 이미지), 50 ㎛ (병합(merged) 이미지), 및 10 ㎛ (나머지 이미지들).
(F, H) (F) 시각적 피질 또는 (H) 해마에서 IQSEC3 (붉은색), pan- IQSEC3 (녹색), 및 게피린 (검은색) mRNA 발현을 측정한 RNAscope 실험 데이터의 정량적인 분석 결과이다. 실험 결과는 평균 ± SEMs로 나타내었다 (3*p < 0.001,; Kruskal-Wallis 테스트를 사용한 비모수의 일원분산분석; n = 3 내지 5 마리의 마우스).
(I) 표준 환경 (SE) 또는 농축 환경 (EE) 하에서 사육된 성체 마우스에서 IQSEC3 (붉은색), pan- IQSEC3 (녹색), 및 게피린 (흰색) mRNAs의 발현을 RNAscope 기술을 사용한 in situ 혼성화에 의해 시각화한 결과이다. DAPI (푸른색)으로 핵이 염색되었고, 본 실험에서의 대표적인 이미지를 나타내었다. 나타낸 해마성 부분체는 아래에 확대되어, 단일 뉴런 수준에서 mRNA 발현 프로파일을 보여주었다. 스케일 바: 200 ㎛ (왼쪽의 가장 큰 이미지), 50 ㎛ (병합(merged) 이미지), 및 10 ㎛ (나머지 이미지들).
(J) 해마 부분체에서 IQSEC3 (붉은색), pan-IQSEC3 (녹색), 및 게피린 (검은색) mRNA 발현을 측정한 RNAscope 실험 데이터의 정량적인 분석 결과이다. 실험 결과는 평균 ± SEM으로 나타내었다 (*p < 0.05; 2*p < 0.01; 3*p < 0.001 vs. SE 군; Kruskal-Wallis 테스트를 사용한 비모수의 일원분산분석; n = 5 마리의 마우스).
도 7은 다양한 뇌자극 실험 프로토콜에 의해 IQSEC3 mRNA 및 단백질 수준이 변화함을 분석한 것이다.
(A) 전기자극을 준 마우스 해마 영역에서 IQSEC3 및 게피린 mRNA 수준 변화를 RNAscope 기술로 분석한 대표 이미지이다. Sham은 전기자극을 주지 않은 마우스 그룹을 지칭한다.
(B) 상기 (A) 데이터들을 해마 CA1, CA3, 치아이랑 영역에서 시간별로 분석한 것이다.
(C) 전기자극을 준 마우스 해마 및 피질 영역에서 IQSEC3 및 게피린 단백질 수준 변화를 웨스턴 기술로 분석한 것이다.
(D) 위 (C) 실험결과를 정량적으로 분석한 것이다. 실험 결과는 평균 ± SEM으로 나타내었다 (*p < 0.05 vs. Sham 군; Kruskal-Wallis 테스트를 사용한 비모수의 일원분산분석; n = 4 마리의 마우스).
(E) PTZ를 마우스에 투여한 뒤 30분, 3시간 뒤에 각각 마우스 피질 및 해마 영역에서의 IQSEC3 및 게피린 단백질 수준 변화를 분석한 것이다.
(F) 위 (E) 실험결과를 정량적으로 분석한 것이다. 실험 결과는 평균 ± SEM으로 나타내었다.
도 8은 IQSEC3의 발현 억제를 통한 뇌전증 동물 모델 구축을 확인한 것이다.
(A) 일 양상에 따른 뇌전증 동물 모델의 구축 과정을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
(B) sh-대조군 (Control), sh-IQSEC3 (IQSEC3 KD), sh-IQSEC3+IQSEC3-WT (IQSEC3-WT rescue.), 또는 sh-IQSEC3+IQSEC3-E749A (IQSEC3-DN rescue.)를 발현하는 AAV가 주입된 마우스에 필로카르핀 (pilocarpine)의 주사 (100 mg/kg)에 의해 유도된 발작을 시간의 경과에 따라 스코어링한 결과이다. 실험 결과는 평균 ± SEM으로 나타내었다 (대조군, n = 5 마우스; IQSEC3-KD, n = 5 마우스; rescue [+IQSEC3-WT], n = 5 마우스; rescue [+IQSEC3 E749A], n = 5 마우스; *p < 0.05, 2*p < 0.01, 3*p < 0.001; Kruskal-Wallis 분산분석 테스트).
(C-D) 각 조건에서 최초 30분 및 이후 30분 동안 평균 스코어링 값을 정량화한 결과이다 (Kruskal-Wallis, n = 5 마리 마우스 /조건).
(E-F) 치아이랑에서 뇌파 기록에 의해 측정된, 필로카르핀 주입 후 발작 개시 시간을 나타낸 것이다. 대표적인 EEG 트레이스, 대조군, IQSEC3-KD, 및 두 종류의 다른 구제 마우스 (AAV-IQSEC3-WT 또는 AAV-IQSEC3-E749A 주사됨)에 대한 정량적인 분석 결과이다.
도 9은 IQSEC3의 발현 억제를 뇌전증 동물 모델 구축을 도 8과는 다른 실험 프로토콜로 확인한 것이다.
(A) 일 양상에 따른 뇌전증 동물 모델의 구축 과정을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
(B) sh-대조군 (Control), sh-IQSEC3 (IQSEC3 KD), sh-IQSEC3+IQSEC3-WT (IQSEC3-WT rescue.), 또는 sh-IQSEC3+IQSEC3-E749A (IQSEC3-DN rescue.)를 발현하는 AAV가 주입된 마우스에 카인산 (KA)의 주사 (15 mg/kg)에 의해 유도된 발작을 시간의 경과에 따라 스코어링한 결과이다. 실험 결과는 평균 ± SEM으로 나타내었다 (대조군, n = 8 마우스; IQSEC3-KD, n = 11 마우스; rescue [+IQSEC3-WT], n = 5 마우스; rescue [+IQSEC3 E749A], n = 8 마우스; IQSEC3-WT, n = 7 마우스; 및 IQSEC3-DN, n = 9 마우스; 2*p < 0.01, Kruskal-Wallis 분산분석 테스트).
(C-D) 각 조건에서 최초 30분 및 이후 30분 동안 평균 스코어링 값을 정량화한 결과이다 (Kruskal-Wallis, n = 5-16 마리 마우스 /조건).
(E-F) 치아이랑에서 뇌파 기록에 의해 측정된, KA 주입 후 발작 개시 시간을 나타낸 것이다. 대표적인 EEG 트레이스, 대조군, IQSEC3-KD, 및 두 종류의 다른 구제 마우스 (AAV-IQSEC3-WT 또는 AAV-IQSEC3-E749A 주사됨)에 대한 정량적인 분석 결과이다. 실험 결과는 평균 ± SEM으로 나타내었다 (대조군, n = 8 마우스; Npas4-KD, n = 5 마우스; rescue [+IQSEC3-WT], n = 9 마우스; 및 rescue [+IQSEC3-E749A], n = 9 마우스; *p < 0.05 및 2*p < 0.01, Kruskal-Wallis 분산분석 테스트).
(G-K) Npas4에 대한 shRNA를 발현하는 AAVs를 주사한 것을 제외하고, 상기와 동일하게 실험을 실시한 결과이다. 실험 결과는 평균 ± SEM으로 나타내었다 (대조군, n = 8 마우스; Npas4-KD, n = 5 마우스; rescue [+IQSEC3-WT], n = 9 마우스; 및 rescue [+IQSEC3-E749A], n = 9 마우스; *p < 0.05 및 2*p < 0.01, Kruskal-Wallis 분산분석 테스트).
도 9는 IQSEC3의 발현 억제를 통한 뇌전증 동물 모델 구축을 도8과는 다른 실험 프로토콜로 확인한 것이다.
(A) 일 양상에 따른 뇌전증 동물 모델의 구축 과정을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
(B) sh-대조군 (Control), sh-IQSEC3 (IQSEC3 KD), sh-IQSEC3+IQSEC3-WT (IQSEC3-WT rescue.), 또는 sh-IQSEC3+IQSEC3-E749A (IQSEC3-DN rescue.)를 발현하는 AAV가 주입된 마우스에 필로카르핀 (pilocarpine)의 주사 (100 mg/kg)에 의해 유도된 발작을 시간의 경과에 따라 스코어링한 결과이다. 실험 결과는 평균 ± SEM으로 나타내었다 (대조군, n = 5 마우스; IQSEC3-KD, n = 5 마우스; rescue [+IQSEC3-WT], n = 5 마우스; rescue [+IQSEC3 E749A], n = 5 마우스; *p < 0.05, 2*p < 0.01, 3*p < 0.001; Kruskal-Wallis 분산분석 테스트).
(C-D) 각 조건에서 최초 30분 및 이후 30분 동안 평균 스코어링 값을 정량화한 결과이다 (Kruskal-Wallis, n = 5 마리 마우스 /조건).
(E-F) 각 조건에서 전조현상을 보인 평균 시간과 첫 전조현상을 나타낸 평균 시간을 정량화한 결과이다 (Kruskal-Wallis, n = 5 마리 마우스 /조건).
도 10은 IQSEC3 단백질이 억제성 인터뉴런에서 발현하고 있으며, IQSEC3 단백질이 결핍시 선택적 억제성 인터뉴런의 수가 변화함을 분석한 것이다.
(A-B) IQSEC3 단백질이 파브알부민 및 소마토스타틴 억제성 인터뉴런에서 발현하고 있음을 면역염색법으로 분석한 이미지이다.
(C-E) sh-대조군 (Control) 혹은 sh-IQSEC3 (IQSEC3 KD)를 발현하는 AAV가 주입된 마우스에서의 다양한 억제성 인터뉴런들을 보여준 이미지이다.
(F) IQSEC3 단백질 낙다운 조건에서 해마 치아이랑 및 피질에서 억제성 인터뉴런 숫자를 정량적 분석한 결과이다. 실험 결과는 평균 ± SEM으로 나타내었다 (대조군, n = 5 마우스; IQSEC3-KD, n = 5 마우스; *p < 0.05, 2*p < 0.01; Kruskal-Wallis 분산분석 테스트).
(A-C)는 배양된 해마 뉴런에서 억제성 시냅스 전달에 대한 IQSEC3의 효과를 확인한 것으로, 대조군 또는 IQSEC3-KD로 형질전환되거나, IQSEC3-KD 및 IQSEC3로 공동 형질전환되어 구제된 (+IQSEC3 res.) 해마 뉴런에서, mIPSCs의 (A) 대표적인 트레이스 (traces), (B) 진동수, 및 (C) 진폭을 요약한 그래프를 나타낸 것이다.
(D-F) 흥분성 시냅스 전달에 대한 IQSEC3의 효과를 확인한 것으로서, 대조군 또는 IQSEC3-KD로 형질전환되거나, IQSEC3-KD 및 IQSEC3로 공동 형질전환되어 구제된 (+IQSEC3 res.) 해마 뉴런에서, mIPSCs의 (D) 대표적인 트레이스, (E) 진동수, 및 (F) 진폭을 요약한 그래프를 나타낸 것이다. 실험 데이터는 평균 ± SEMs (p < 0.05; Tukey's 테스트를 이용한 분산분석)로 나타내었고; “n"은 기록된 뉴런의 총 수를 나타내며, 다음의 값을 갖는다 (mIPSCs/Control, n = 10; mIPSCs/IQSEC3-KD, n = 13; mIPSCs/IQSEC3-KD (+ rescue), n = 9; mEPSCs/Control, n = 8; 및 mEPSCs/IQSEC3-KD, n = 9).
(G-I) 체성감각 층 II/III 피질 뉴런에서 억제성 시냅스 전달에 대한 IQSEC3의 효과를 확인한 것으로서, 대조군 또는 IQSEC3-KD로 형질전환되거나, IQSEC3-KD 및 IQSEC3로 공동 형질전환되어 구제된 (+IQSEC3 res.) 해마 뉴런에서, mIPSCs의 (G) 대표적인 트레이스, (H) 진동수, 및 (CI) 진폭을 요약한 그래프를 나타낸 것이다.
(J-L) 체성감각층 II/III 피질 뉴런에서 흥분성 시냅스 전달에 대한 IQSEC3의 효과를 확인한 것으로서, 대조군 또는 IQSEC3-KD로 형질전환되거나, IQSEC3-KD 및 IQSEC3로 공동 형질전환되어 구제된 (+IQSEC3 res.) 해마 뉴런에서, mIPSCs의 (J) 대표적인 트레이스, (K) 진동수, 및 (L) 진폭을 요약한 그래프를 나타낸 것이다.
(M-N) PPR에 대한 IQSEC3의 효과 (두번째 IPSC의 진폭을 첫번째 IPSC의 진폭으로 나눈 값)를 확인한 것으로서, (M) 대표적인 트레이스, 및 (N) 50 ms의 자극 사이의 간격에서 측정된 PPR을 요약한 그래프를 나타낸 것이다. 실험 데이터는 평균 ± SEMs (Student's 테스트를 사용한 *p < 0.05)로 나타내었고; 'n'은 기록된 뉴런의 수를 나타내고, 하기와 같은 값을 갖는다: mIPSCs/Control, n = 9; mIPSCs/IQSEC3-KD, n = 9; mEPSCs/Control, n = 9; mEPSCs/IQSEC3-KD, n = 9; IPSC-PPR/Control, n = 8; 및 IPSC-PPR/IQSEC3-KD, n = 8).
(O-Q) 치아이랑 과립 세포층 (GCL; O), 치아이랑 문 (P), 체성감각 층 II/III 피질 (Q)에서, 시냅스 반점에 대한 IQSEC3의 효과를 확인한 것으로서, 대표적인 공초점 이미지는 IQSEC3-KD 뉴런의 치아이랑 문 (체성감각 피질은 제외)에서 GAD67 반점 강도가 감소됨을 나타내었다. 뇌 절편은 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylinodole; 분석된 뇌 영역의 세포 핵을 나타내기 위함: 푸른색) 및 EGFP (AAV에 형질감염된 뉴런; 녹색)으로 염색되었다. 치아이랑 GCL에서 GAD67 반점 강도는 통계적으로 유의성을 나타내지는 않으나, 감소하는 경향을 보였고, VGLUT1 반점 강도는 IQSEC3-KD 뉴런에서 증가되었다.
(R-S) 조직 당 (R) GAD67 및 (S) VGLUT1 반점 강도의 정량화 결과로서, 실험데이터는 3-5회의 독립적인 실험으로부터 얻어진 평균 ± SEMs로 나타내었고: 통계적 유의성은 Tukey's 테스트를 이용한 분산분석을 사용하여 여러 조건을 대조군과 비교함으로서 평가되었다 (모든 조건에서, *p < 0.05; n = 5 마우스).
도 2는 시냅스성 활성-의존 방식으로 게피린의 클러스터링 촉진하는 IQSEC3의 작용 기작을 확인한 것이다.
(A) DIV8에서, EGFP (대조군), IQSEC3, 또는 IQSEC3 shRNA vector (IQSEC3-KD)를 코딩하는 발현 플라스미드로 형질감염된 배양 해마 뉴런의 대표적인 이미지, 및 DIV14에서 게피린 (붉은색) 및 EGFP (푸른색)의 항체를 사용한 이중 면역형광법으로 분석한 결과를 나타낸 것이다. DMSO (대조군) 또는 신경전달 수용체 차단제 (50μM 비쿠쿨린 단독 또는 100μM APV/20μM NBQX와 함께)는 형질감염 시, 시냅스 활성을 차단하기 위하여 첨가되었다. 스케일 바, 5㎛ (모든 이미지에 적용).
(B) 형질감염된 뉴런에서 게피린 반점의 밀도, 면적, 및 강도에 대한 시냅스 활성 차단제의 효과를 요약한 그래프이다. 점선은 다른 실험 조건과의 비교를 위한 대조군의 수준을 나타낸다. 실험 데이터는 평균 ± SEMs로 나타내었다 (*p < 0.05; 3*p < 0.001 vs. DMSO-처리된 대조군; Mann-Whitney U 테스트).
도 3은 IQSEC3에 의한 게피란 반점의 밀도 및 면적 증가 효과가 ARF 단백질 활성에 의존적임을 확인한 것이다.
(A) DIV8에서, EGFP (대조군), 또는 IQSEC3을 발현하는 플라스미드로 형질감염된 배양 해마 뉴런의 대표적인 이미지, 및 DIV14에서 GAD67 (붉은색) 및 EGFP (푸른색)의 항체를 사용한 이중 면역형광법으로 분석한 결과를 나타낸 것이다. ARF 단백질 활성을 억제하는 SecinH3 혹은 QS11 약물을 처리할 경우 IQSEC3에 의한 효과가 사라진다. 스케일 바, 5㎛ (모든 이미지에 적용).
(B) 형질감염된 뉴런에서 GAD67 반점의 밀도 및 면적에 대한 ARF 단백질 활성 차단 약물효과를 요약한 그래프이다. 점선은 다른 실험 조건과의 비교를 위한 대조군의 수준을 나타낸다. 실험 데이터는 평균 ± SEMs으로 나타내었다 (*p < 0.05; 2*p < 0.01 vs. DMSO-처리된 대조군; Mann-Whitney U 테스트).
(C) DIV8에서, EGFP (대조군), 또는 IQSEC3을 발현하는 플라스미드로 형질감염된 배양 해마 뉴런의 대표적인 이미지, 및 DIV14에서 게피린 (붉은색) 및 EGFP (푸른색)의 항체를 사용한 이중 면역형광법으로 분석한 결과를 나타낸 것이다. ARF 단백질 활성을 억제하는 SecinH3 혹은 QS11 약물을 처리할 경우 IQSEC3에 의한 효과가 사라진다. 스케일 바, 5㎛ (모든 이미지에 적용).
(D) 형질감염된 뉴런에서 게피린 반점의 밀도 및 면적에 대한 ARF 단백질 활성 차단 약물효과를 요약한 그래프이다. 점선은 다른 실험 조건과의 비교를 위한 대조군의 수준을 나타낸다. 실험 데이터는 평균 ± SEMs로 나타내었다 (3*p < 0.001 vs. DMSO-처리된 대조군; Mann-Whitney U 테스트).
도 4는 IQSEC3의 프로모터와 Npas4간 결합을 확인한 것이다.
(A) 실시간 PCR에 사용되는 3개의 amplicon을 나타내는 IQSEC3 유전자좌를 도식화한 것으로서, ChIP-seq 분석에 의해 확인된 Npas4-결합성 자리는 Npas-4 반응적 요소로서 나타내었다.
(B) HEK 세포를 Npas4 (40ng)를 발현하는 벡터와 함께, IQSEC3 인접 프로모터 영역 (-280부터 +36)을 함유하는 루시퍼라제 리포터 컨스트럭트 (100ng)로 동시 형질감염시켰다. MT는 공통적인 Npas4-결합 서열에서, 돌연변이를 포함하는 프로모터-리포터 컨스트럭트를 나타낸다. 루시퍼라제 활성은 세포 추출물에서 분석하였고, WT IQSEC3 프로모터 영역을 함유하는 루시퍼라제 리포터로 형질전환된 세포에서 상대적인 루시퍼라제 활성을 평가하였다 (1로 정의됨). 값은 세 번의 독립적인 실험 (*p < 0.001 vs. 비형질감염된 대조군; Mann-Whitney U 테스트)으로부터 평균 ± SEMs로 나타내었다.
(C) EMSA는 정제된 FLAG 태그 Npas4 단백질 (10-90ng) 및 IQSEC3 인접 프로모터 내 뉴클레오타이드 -110 내지 -69에 해당하는 프로브로 실시되었다. Inset은 실험에서 사용한 정제된 FLAG-Npas4 단백질의 SDS PAGE/쿠마시 블루-염색의 이미지를 보여준다.
(D) KCl-처리된 마우스의 피질 뉴런 내 IQSEC3 좌위에서 Npas4에 대한 ChIP-seq 결합성 프로파일이다. 실험 결과는 GEO 접속 번호 GSE21161로, GEO 웹 사이트로부터 다운로드하였다. 전체 태그의 수는 해당 입력값에 의해 정규화되었다.
도 5는 Npas4 표적으로서 IQSEC3의 기능성 확인한 것이다.
(A 및 C) DIV3에서, EGFP 단독 (대조군), IQSEC3-KD 또는 BDNF-KD를 발현하는 렌티바이러스로 형질감염된 해마 뉴런, 및 DIV10에서, EGFP 단독으로 발현하거나 (대조군), EGFP 및 Npas4를 발현하는 렌티바이러스로 형질감염된 해마 뉴런의 대표적인 이미지이다. DIV14에서, 형질감염된 뉴런의 수상 돌기 (A) 또는 신경세포체 (C)는 게피린 (붉은색), 및 EGFP (푸른색)으로 표지된 이중 면역형광법으로 분석되었다. 스케일 바, 10㎛ (모든 이미지에 적용).
(B 및 D), 억제성 후시냅스의 밀도 (왼쪽), 억제성 후시냅스의 크기 (가운데), 및 억제성 후시냅스의 강도 (오른쪽)에 대한 Npas4-발현 뉴런에서 IQSEC3-KD 또는 BDNF-KD의 효과를 요약한 그래프이다. 수상 돌기 (B) 또는 신경세포체 (D)는 개별적으로 정량화하였다. 수상 돌기의 분석을 위하여, 형질감염된 뉴런 당 둘 또는 세 개의 수상 돌기가 선택되었고, 그룹-평균화되었다; "n"은 분석된 뉴런의 총 수를 나타낸다. 실험결과는 평균 ± SEMs로 나타내었다 (p < 0.05; Tukey's 테스트를 이용한 분산분석).
(E) DIV8에서, EGFP (Control), Npas4 shRNA 벡터 (NPAS4-KD), IQSEC3, 또는 IQSEC3+NPAS4-KD (NPAS4-KD+IQSEC3)를 코딩하는 발현 플라스미드로 형질감염된 해마 뉴런의 대표적인 이미지, 및 DIV14에서 게피린 (붉은색) 및 EGFP (푸른색)의 항체를 사용한 이중 면역형광법으로 분석된 결과이다. 형질감염시, 50μM 비쿠쿨린이 배양된 뉴런에 함께 첨가되었다. 스케일 바, 5㎛ (모든 이미지에 적용).
(F) Npas4 -결핍성 뉴런에서 게피린 반점의 밀도, 면적, 및 강도에 대한 IQSEC3 과발현의 효과를 요약한 그래프이다. 점선은 다른 실험 조건과의 비교를 위한 대조군의 수준을 나타낸다. 실험 데이터는 평균 ± SEMs으로 나타내었다 (*p < 0.05; **p < 0.001 vs. DMSO-처리된 대조군; Mann-Whitney U 테스트).
도 6은 뉴런성 활동에 의한 IQSEC3의 발현 조절을 확인한 것이다.
(A) IQSEC3 수준은 WT 뉴런에 비해, Npas4-KD 뉴런 (Npas4-KD)에서 감소되었다. BDNF 수준은 이전에 보고된 바와 같이, Npas4-KD 뉴런에서 감소되었다. DIV8에서, 대조 바이러스 (대조군) 또는 Npas4 KD 바이러스 (Npas4-KD)로 감염된 피질 배양물은 55 mM의 KCl을 처리하여 자극되었고, mRNA 수준이 qRT-PCR으로 측정되었다.
(B) IQSEC3 수준은 활성-유도된 DNA 파괴, 또는 시냅스성 활동 차단에 의해 변화하지 않는다. DIV11에서, 배양된 피질 뉴런에 DMSO (대조군), 5μM의 etoposide 20분, 또는 신경전달 물질 길항제의 칵테일 (50μM의 피크로톡신, 100μM APV 및 20μM의 NBQX; APV/NBQX/Picrotoxin)을 처리하여 4일 동안 시냅스 활성을 차단하였고, 이후, RNA를 추출하고, 표시된 유전자의 발현을 qRT-PCR을 사용하여 평가하였다. Npas4의 수준은 etoposide에 의해 증가되었던 반면, 게피린 수준은 현저하게 감소되었다. 수용체 길항제를 사용한 시냅스 활성의 감소는, Npas4, BDNF, 또는 Gephyrin 수준을 변화시키지 않았다. 실험 결과는 평균 ± SEMs로 나타내었다 (*p < 0.05; 2*p < 0.01 vs. DMSO-처리된 대조군; Kruskal-Wallis 테스트를 사용한 비모수의 일원분산분석 ; n = 3 내지 5의 독립적인 배양물).
(C, D) 마우스의 시각 피질의 IQSEC3 또는 게피린 수준은 감각적 경험에 의해 조절된다. (C) 실험 절차에 대한 프로토콜을 도식화 한 것으로서, WT 마우스는 정상 12/12시간 낮/밤 주기로 26일 동안 사육되었고, 실험군 (DR)은 P21에서 P26까지 5일 동안 암실 사육되었다. DR+2hL는 암실 사육이후, 2시간 동안 빛에 노출된 마우스 군을 나타낸다. (D) mRNA 수준을 측정하기 위하여 qRT-PCR이 수행되었고, 실험 결과는 평균 ± SEMs로 나타내었다 (*p < 0.05; 2*p < 0.01 vs. DMSO-처리된 대조군; Kruskal-Wallis 테스트를 사용한 비모수의 일원분산분석; n = 5 마리의 마우스).
(E, G) 표시된 조건 하에서 사육된 성체 마우스에서, IQSEC3 (붉은색), pan- IQSEC3 (녹색), 및 게피린(흰색) mRNAs의 발현을 RNAscope 기술을 사용한 in situ 혼성화에 의해 시각화한 결과이다. DAPI (푸른색)로 핵이 염색되었고, 본 실험에서의 대표적인 이미지를 나타내었다. (E) 시각적 피질 및 (G) 해마성 부분체는 아래에 확대되어, 단일 뉴런 수준에서 mRNA 발현 프로파일을 보여주었다. 스케일 바: 200 ㎛ (왼쪽의 가장 큰 이미지), 50 ㎛ (병합(merged) 이미지), 및 10 ㎛ (나머지 이미지들).
(F, H) (F) 시각적 피질 또는 (H) 해마에서 IQSEC3 (붉은색), pan- IQSEC3 (녹색), 및 게피린 (검은색) mRNA 발현을 측정한 RNAscope 실험 데이터의 정량적인 분석 결과이다. 실험 결과는 평균 ± SEMs로 나타내었다 (3*p < 0.001,; Kruskal-Wallis 테스트를 사용한 비모수의 일원분산분석; n = 3 내지 5 마리의 마우스).
(I) 표준 환경 (SE) 또는 농축 환경 (EE) 하에서 사육된 성체 마우스에서 IQSEC3 (붉은색), pan- IQSEC3 (녹색), 및 게피린 (흰색) mRNAs의 발현을 RNAscope 기술을 사용한 in situ 혼성화에 의해 시각화한 결과이다. DAPI (푸른색)으로 핵이 염색되었고, 본 실험에서의 대표적인 이미지를 나타내었다. 나타낸 해마성 부분체는 아래에 확대되어, 단일 뉴런 수준에서 mRNA 발현 프로파일을 보여주었다. 스케일 바: 200 ㎛ (왼쪽의 가장 큰 이미지), 50 ㎛ (병합(merged) 이미지), 및 10 ㎛ (나머지 이미지들).
(J) 해마 부분체에서 IQSEC3 (붉은색), pan-IQSEC3 (녹색), 및 게피린 (검은색) mRNA 발현을 측정한 RNAscope 실험 데이터의 정량적인 분석 결과이다. 실험 결과는 평균 ± SEM으로 나타내었다 (*p < 0.05; 2*p < 0.01; 3*p < 0.001 vs. SE 군; Kruskal-Wallis 테스트를 사용한 비모수의 일원분산분석; n = 5 마리의 마우스).
도 7은 다양한 뇌자극 실험 프로토콜에 의해 IQSEC3 mRNA 및 단백질 수준이 변화함을 분석한 것이다.
(A) 전기자극을 준 마우스 해마 영역에서 IQSEC3 및 게피린 mRNA 수준 변화를 RNAscope 기술로 분석한 대표 이미지이다. Sham은 전기자극을 주지 않은 마우스 그룹을 지칭한다.
(B) 상기 (A) 데이터들을 해마 CA1, CA3, 치아이랑 영역에서 시간별로 분석한 것이다.
(C) 전기자극을 준 마우스 해마 및 피질 영역에서 IQSEC3 및 게피린 단백질 수준 변화를 웨스턴 기술로 분석한 것이다.
(D) 위 (C) 실험결과를 정량적으로 분석한 것이다. 실험 결과는 평균 ± SEM으로 나타내었다 (*p < 0.05 vs. Sham 군; Kruskal-Wallis 테스트를 사용한 비모수의 일원분산분석; n = 4 마리의 마우스).
(E) PTZ를 마우스에 투여한 뒤 30분, 3시간 뒤에 각각 마우스 피질 및 해마 영역에서의 IQSEC3 및 게피린 단백질 수준 변화를 분석한 것이다.
(F) 위 (E) 실험결과를 정량적으로 분석한 것이다. 실험 결과는 평균 ± SEM으로 나타내었다.
도 8은 IQSEC3의 발현 억제를 통한 뇌전증 동물 모델 구축을 확인한 것이다.
(A) 일 양상에 따른 뇌전증 동물 모델의 구축 과정을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
(B) sh-대조군 (Control), sh-IQSEC3 (IQSEC3 KD), sh-IQSEC3+IQSEC3-WT (IQSEC3-WT rescue.), 또는 sh-IQSEC3+IQSEC3-E749A (IQSEC3-DN rescue.)를 발현하는 AAV가 주입된 마우스에 필로카르핀 (pilocarpine)의 주사 (100 mg/kg)에 의해 유도된 발작을 시간의 경과에 따라 스코어링한 결과이다. 실험 결과는 평균 ± SEM으로 나타내었다 (대조군, n = 5 마우스; IQSEC3-KD, n = 5 마우스; rescue [+IQSEC3-WT], n = 5 마우스; rescue [+IQSEC3 E749A], n = 5 마우스; *p < 0.05, 2*p < 0.01, 3*p < 0.001; Kruskal-Wallis 분산분석 테스트).
(C-D) 각 조건에서 최초 30분 및 이후 30분 동안 평균 스코어링 값을 정량화한 결과이다 (Kruskal-Wallis, n = 5 마리 마우스 /조건).
(E-F) 치아이랑에서 뇌파 기록에 의해 측정된, 필로카르핀 주입 후 발작 개시 시간을 나타낸 것이다. 대표적인 EEG 트레이스, 대조군, IQSEC3-KD, 및 두 종류의 다른 구제 마우스 (AAV-IQSEC3-WT 또는 AAV-IQSEC3-E749A 주사됨)에 대한 정량적인 분석 결과이다.
도 9은 IQSEC3의 발현 억제를 뇌전증 동물 모델 구축을 도 8과는 다른 실험 프로토콜로 확인한 것이다.
(A) 일 양상에 따른 뇌전증 동물 모델의 구축 과정을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
(B) sh-대조군 (Control), sh-IQSEC3 (IQSEC3 KD), sh-IQSEC3+IQSEC3-WT (IQSEC3-WT rescue.), 또는 sh-IQSEC3+IQSEC3-E749A (IQSEC3-DN rescue.)를 발현하는 AAV가 주입된 마우스에 카인산 (KA)의 주사 (15 mg/kg)에 의해 유도된 발작을 시간의 경과에 따라 스코어링한 결과이다. 실험 결과는 평균 ± SEM으로 나타내었다 (대조군, n = 8 마우스; IQSEC3-KD, n = 11 마우스; rescue [+IQSEC3-WT], n = 5 마우스; rescue [+IQSEC3 E749A], n = 8 마우스; IQSEC3-WT, n = 7 마우스; 및 IQSEC3-DN, n = 9 마우스; 2*p < 0.01, Kruskal-Wallis 분산분석 테스트).
(C-D) 각 조건에서 최초 30분 및 이후 30분 동안 평균 스코어링 값을 정량화한 결과이다 (Kruskal-Wallis, n = 5-16 마리 마우스 /조건).
(E-F) 치아이랑에서 뇌파 기록에 의해 측정된, KA 주입 후 발작 개시 시간을 나타낸 것이다. 대표적인 EEG 트레이스, 대조군, IQSEC3-KD, 및 두 종류의 다른 구제 마우스 (AAV-IQSEC3-WT 또는 AAV-IQSEC3-E749A 주사됨)에 대한 정량적인 분석 결과이다. 실험 결과는 평균 ± SEM으로 나타내었다 (대조군, n = 8 마우스; Npas4-KD, n = 5 마우스; rescue [+IQSEC3-WT], n = 9 마우스; 및 rescue [+IQSEC3-E749A], n = 9 마우스; *p < 0.05 및 2*p < 0.01, Kruskal-Wallis 분산분석 테스트).
(G-K) Npas4에 대한 shRNA를 발현하는 AAVs를 주사한 것을 제외하고, 상기와 동일하게 실험을 실시한 결과이다. 실험 결과는 평균 ± SEM으로 나타내었다 (대조군, n = 8 마우스; Npas4-KD, n = 5 마우스; rescue [+IQSEC3-WT], n = 9 마우스; 및 rescue [+IQSEC3-E749A], n = 9 마우스; *p < 0.05 및 2*p < 0.01, Kruskal-Wallis 분산분석 테스트).
도 9는 IQSEC3의 발현 억제를 통한 뇌전증 동물 모델 구축을 도8과는 다른 실험 프로토콜로 확인한 것이다.
(A) 일 양상에 따른 뇌전증 동물 모델의 구축 과정을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
(B) sh-대조군 (Control), sh-IQSEC3 (IQSEC3 KD), sh-IQSEC3+IQSEC3-WT (IQSEC3-WT rescue.), 또는 sh-IQSEC3+IQSEC3-E749A (IQSEC3-DN rescue.)를 발현하는 AAV가 주입된 마우스에 필로카르핀 (pilocarpine)의 주사 (100 mg/kg)에 의해 유도된 발작을 시간의 경과에 따라 스코어링한 결과이다. 실험 결과는 평균 ± SEM으로 나타내었다 (대조군, n = 5 마우스; IQSEC3-KD, n = 5 마우스; rescue [+IQSEC3-WT], n = 5 마우스; rescue [+IQSEC3 E749A], n = 5 마우스; *p < 0.05, 2*p < 0.01, 3*p < 0.001; Kruskal-Wallis 분산분석 테스트).
(C-D) 각 조건에서 최초 30분 및 이후 30분 동안 평균 스코어링 값을 정량화한 결과이다 (Kruskal-Wallis, n = 5 마리 마우스 /조건).
(E-F) 각 조건에서 전조현상을 보인 평균 시간과 첫 전조현상을 나타낸 평균 시간을 정량화한 결과이다 (Kruskal-Wallis, n = 5 마리 마우스 /조건).
도 10은 IQSEC3 단백질이 억제성 인터뉴런에서 발현하고 있으며, IQSEC3 단백질이 결핍시 선택적 억제성 인터뉴런의 수가 변화함을 분석한 것이다.
(A-B) IQSEC3 단백질이 파브알부민 및 소마토스타틴 억제성 인터뉴런에서 발현하고 있음을 면역염색법으로 분석한 이미지이다.
(C-E) sh-대조군 (Control) 혹은 sh-IQSEC3 (IQSEC3 KD)를 발현하는 AAV가 주입된 마우스에서의 다양한 억제성 인터뉴런들을 보여준 이미지이다.
(F) IQSEC3 단백질 낙다운 조건에서 해마 치아이랑 및 피질에서 억제성 인터뉴런 숫자를 정량적 분석한 결과이다. 실험 결과는 평균 ± SEM으로 나타내었다 (대조군, n = 5 마우스; IQSEC3-KD, n = 5 마우스; *p < 0.05, 2*p < 0.01; Kruskal-Wallis 분산분석 테스트).
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 실험 재료 및 실험 준비
1-1. 세포의 배양
HEK293T 세포는 10% 우태아 혈청 (FBS, TISSUE CULTURE BIOLOGICALS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 (Gibco)이 첨가된 DEME (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, WELGENE)에서 37℃의 5% CO2 가습 조건에서 배양되었다. 배양된 일차 해마 뉴런은 배아기 18일된 (E18) Sprague-Dawley 렛트의 뇌로부터 준비하였다 (KOATECK). 뉴런은 25-mm 폴리-L-라이신이 코팅된 커버 슬립 상에 씨딩되었고, 2%의 B-27 (Gibco), 0.5%의 우태아 혈청 (Hyclone)이 첨가된, 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 Neurobasal 배지 (Gibco)에서 배양되었다. 모든 실험 절차는 DGIST의 동물실험 윤리위원회에 의해 제공되는 설치류 실험 지침 및 프로토콜에 따라 수행되었다.
1-2. 동물모델
모든 마우스는 표준 온도 조절, 실험실 조건, 또는 착색된 터널, 미로, 등산 재료, 러닝 휠에 자유롭게 접근할 수 있는 조건 하에서, DGIST의 동물 관리 윤리 위원회의 승인을 받은 프로토콜에 따라 유지, 및 관리되었다. 마우스에 대하여 12/12시간 낮/밤 사이클이 유지되었고, 보상 교대 테스트의 경우를 제외하고, 물과 음식을 자유롭게 제공하였다. NPAS4-KO (Npas4-/-) 마우스는 이전에 기술된 바와 같이 제조되었다 (Lin et al., 2008). 모든 실험 과정은 수컷 마우스에서 수행되었다. 대한바이오링크로부터 구매한 임신된 렛트는 해마성 뉴론의 in vitro 분리 배양에 사용되었다.
1-3. 발현 벡터
(1) IQSEC3 발현 벡터
마우스 IQSEC3에 대한 shRNA 렌티바이러스 발현 벡터는 어닐링, 인산화, 및 L-315 벡터의 XhoI 및 XbaI 자리에 마우스 IQSEC3을 표적화하는 올리고뉴클레오타이드 (5′-ACA TCA GAC CAT CGG CCA CGA CATT A-3′)를 클로닝함으로써 구축되었다 ((Ko et al., 2011) 참조). 마우스 IQSEC3에 대한 상기 shRNA AAV는 BamHI 및 EcoRI 자리를 사용하여 pAAV-U6-GFP 벡터 (Cell BioLabs, Inc.) 에 서브클로닝하기 위하여 사용된 것과 동일한 올리고뉴클레오타이드를 클로닝함으로써 구축되었다. 전장 렛트 IQSEC3 야생형 (WT) 및 E749A 점 돌연변이체를 코딩하는 AAVs는 PCR에 의한 전장 영역의 증폭, 및 XbaI 및 BamHI 자리에 pAAV-2A-tdTomato 벡터를 서브클로닝하여 제조되었다.
(2) 그 밖의 벡터
BDNF에 대한 shRNA 렌티바이러스 발현 벡터는 어닐링, 인산화, 및 L-309 벡터의 XhoI 및 XbaI 자리에 BDNF를 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드 (5′-ACA TCA GAC CAT CGG CCA CGA CATT A-3′)를 클로닝함으로써 구축되었다. Npas4에 대한 shRNA 렌티바이러스 발현 벡터는 어닐링, 인산화, 및 L-309 벡터의 XhoI 및 XbaI 자리에 Npas4를 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드 (5′-GGT TGA CCC TGA TAA TTT A-3′)를 클로닝함으로써 구축되었다.
(3) 시약
다음과 같은 구조물은 이전에 기술된 바 있다: myc-Npas4 (a gift from Yingxi Lin; (Lin et al., 2008); L-315 rat sh-IQSEC3, pcDNA3.1-Myc-IQSEC3 (shRNA-resistant) WT 및 E749A (Um et al., 2016).
1-4. 항체
다음과 같이 상업적으로 이용 가능한 항체들이 사용되었다: 염소 다클론 anti-EGFP (Rockland), 염소 다클론 anti-Npas4 (Abcam), 마우스 단일클론 anti-GAD67 (clone 1G10.2; Millipore), 기니피크 다클론 anti-VGLUT1 (Millipore), 마우스 단일클론 anti-Gephyrin (clone 3B11; Synaptic Systems), 마우스 단일클론 anti-PSD-95 (clone 7E3-1B8; ThermoFischer Scientific), 마우스 단일클론 anti-β-actin (clone C4; Santa Cruz Biotechnology), 마우스 단일클론 anti-Parvalbumin (clone PARV-19; Swant), 및 마우스 단일클론 anti-Somatostatin (clone YC7; Millipore).
또한, 다음과 같은 항체들은 이전에 기술된 바 있다: 토끼 다클론 anti-IQSEC3 (JK079; Um et al., 2016); 및 토끼 다클론 anti-Npas4 (Michael Greenberg; Bloodgood et al., 2013).
1-5. 뉴런 배양, 형질감염, 이미지화, 및 정량화
배양된 해마 뉴런은 이전에 기술된 바와 같이, 배아기 18일된 렛트의 뇌로부터 준비하였고 (Ko et al., 2003b; Ko et al., 2006), 폴리-L-라이신이 코팅된 커버슬립 상에 배양하였으며, B-27 (Invitrogen), 0.5% 우태아혈청, 0.5mM Glutamax(Invitrogen), 및 소튬 피루베이트 (Invitrogen)가 첨가된 Nuerobasl 배지에서 성장시켰다. 배양된 뉴런에서 IQSEC3의 과발현 또는 넉다운을 위하여, DIV8-10에서, CalPhos 키트 (Clontech)를 사용하여 해마 뉴런은 개별 도면에 표시된 발현 벡터 또는 EGFP (대조군)으로 형질감염되었다. 면역세포화학 분석을 위해, 배양된 뉴런을 4% 파라포름알데히드/4% 수크로스로 고정하고, PBS에 녹인 0.2% Triton X-100으로 투과시키고, 일차 항체를 사용하여 면역 염색한 다음, Cy3- 및 FITC-결합된 이차 항체 (Jackson ImmunoResearch)로 탐지하였다. 63x 대물 렌즈를 구비한 공초첨 현미경 (LSM710, Carl Zeiss)을 사용하여 이미지를 수득하였다. 모든 이미지 설정은 일정하게 유지되었다. Z-적층 이미지는 최대 투영으로 변환되었고, 마커 단백질으로부터 유래된 반점 면역 반응의 크기, 강도, 및 밀도가 분석되었다. 정량화는 MetaMorph 소프트웨어를 사용한 맹검 방식으로 수행되었다.
1-6. AAV 생산, 정위수술, 바이러스 주입
재조합 AAV (혈청형 2/9)는 고효율화를 위하여 AAV-DJ 캡시드와 패키징되었다. HEK293 세포는 pAAV-U6-GFP 단독 (대조군), pAAV-U6-shNpas4 (Npas4 KD), pAAV-U6-sh-IQSEC3 (IQSEC3 KD), pAAV-IQSEC3-WT-2A-tdTomato (+IQSEC3-WT res.), 또는 pAAV-IQSEC3 E749A-2A-tdTomato (+IQSEC3-DN res.)와 함께, pHelper 및 pRC-DJ으로 동시 형질감염되었다. 감염 72 내지 108 시간 후, 세포를 수득하였고, 이를 용해시킨뒤, 100,000xg에서 2시간 동안 아오딕사놀 (iodixanol) 농도 구배로 초원심분리하였다. AAVs를 함유하는 40% 아오딕사놀 분획은 수집, 농축되었고, 100K 분자량 컷-오프 울트라콘 필터를 사용하여 세척되었다. 바이러스의 감염 역가는 RT-PCR에 의해 정량적으로 평가되었고, 1 × 109-1010 감염 단위/㎕로 감염되었다. 재조합 AAVs의 정위 전달을 위하여, 6-8 주령 C57BL/6N 마우스를 이소플루란 (3-4%)으로 흡입 마취시켰고, 이후, 정위 장치 상에 고정시켰다. 바이러스 용액은 Nanoliter 2010 인젝터 (World Precision Instruments)를 사용하여, 유리 피펫으로 1.2㎕/min의 유속으로 주사되었다 (주사 부피, 0.5㎕). 해마 치아이랑에 대한 주사를 위해 사용된 좌표는 -2.2 mm, ML ± 1.5 mm, 및 DV 2.0 mm (경질로부터)였다. 주입된 마우스 각각은 원래의 케이지로 되돌려 보내진 뒤, 2주 후, 발작과 같은 행동적 스코어링 또는 전기생리학적 기록이 실시되었다.
1-7. 관류 및 면역 조직 화학
마우스에 이소플루란 (제품명: 이소트로이 100)을 복강 내 주사하고, PBS, 및 뒤이어 파라포름알데이드 (PFA)가 포함된 PBS로 심근 관류를 실시하여 깊게 마취시켰다. 이후, 뇌를 절개한 뒤, 이를 4℃에서 1일 동안 고정화시키고, 4℃에서 밤새도록 sucrose-PBS 용액으로 동결 보호 처리하였다. 이후, 상기 조직은 슬라이딩 마이크로톰 (Leica) 상에서 40㎛로 절편화되었다. 이후, 이를 1시간 동안 PBS 상에서 0.2% Triton X-100과 함께 인큐베이팅하여, 부유 뇌 절편을 삼투화 처리하였고, 3시간 동안 0.3% Triton X-100, 1% 정상 염소 혈청 및 5% BSA로 차단되었다. 이후, 실온에서 0.3 % Triton X-100, 1% 정상 염소 혈청 및 2% BSA와 제1차 항원과 함께 인큐베이션한 뒤, PBS로 세척하고, 다시 DAPI와 함께 인큐베이션되었다.
상기 실험에서 다음과 같은 일차 항체가 사용되었다: 마우스 항-파르브알부빈 (1:200, Sigma), 항-소마토스타틴 (1:200), 항-IQSEC3 (2 μg/ml), 항-GAD67 (1 μg/ml).
1-8. 뇌파 검사 및 뇌 국소 전위 (LFP)
9주령 수컷 마우스를 트리브로모메탄올 (20 mL/kg, 복강 내 주사)으로 마취시키고, 상기 마우스를 정위 장치 (David Kopf Instruments) 상에 고정시켰다. 표시된 AAV를 치아이랑으로 양측 주사한 후 (bilateral injection), 뇌파 기록은 다음과 같이 수행되었다. 표면 스크류 EEG 전극을 전두엽 (전후방 +1.1mm; 외측 -0.8mm), 두정엽 (전후방 -1.9mm; 외측 +1.6mm) 영역의 마우스 뇌의 표면에 삽입하고, 접지 전극을 후두엽 부근에 이식하였다. 외과적 클램프는 두개골 표면의 스크류를 고정하고 이식하는데 사용되었다. 치아 교정 파우더 및 레진은 두개골 상에 전극을 단단히 고정시키고, 이를 보호하는데 사용되었다. 외과적 수술을 실시한 지 2주 후, EEG 신호를 아날로그 증폭기 (QP511 Quad AC Amplifier System, Grass Technologies)를 사용하여 기록하였고, 이들은 아날로그-디지털 변환기 (Axon Digidata 1440A, Molecular Devices)에 의해 디지털화되었다. 모든 군에 대한 EEG 신호는 비디오 녹화에 따라 실시간으로 기록되었다.
기준 진폭을 측정하기 위하여, 우선, EEG를 기록한지 10분 후 메틸 스코폴아민 (1mg/kg, i.p)을 주사하여 필로카르핀의 말초 효과를 차단하였다. 스코폴아민을 주사하여 급성 발작을 유도한 지 30분 후, 단일 용량의 필로카르핀 하이드로클로라이드(290 mg/kg, i.p.)를 주사하였다. 최대 기록 시간은 필로카르핀 주입 후 80분이었고, 이 사이의 발작 활동이 분석에 사용되었다. 만일 마우스가 기록한지 80분 후에도 여전히 생존하고 있다면, 디아제팜 (5 mg/kg, i.p.)을 주사하여 기록 종료 시점에 발작을 정지시켰다. 만일 마우스가 기록한지 80분 이내, 발작에 의해 사망하였다면, 기록을 종료하고, 추가 분석을 위하여 뇌를 적출하였다.
1-9. 행동학적 발작 스코어링 (Behavioral Seizure Scoring)
표시된 재조합 AAV 바이러스를 6주령 C57BL/6N 마우스에 정위적으로 주입하여 치아이랑에 타겟팅시켰다. 2주 후, 스코폴아민 메틸 니트레이트 (1mg/kg, Sigma)를 필로카르핀 주사 전에 30분 동안 주입하였다. 이후, 필로카르핀 (290 mg/kg, Sigma)을 각각의 마우스 (실험군 당 5 마리)에 복강 내 주사하여, 급성 발작을 촉진시켰다. 필로카르핀의 주사 후, 만일 마우스가 생존하고 있다면, 상기 처리된 마우스의 행동을 최대 1시간 동안 3분마다 기록하고 관찰하였다. 각각의 마우스에게는 Racine's scale (Racine, 1972a, b)에 따라 0-5 점으로 발작 행동 점수가 부여되었으며, 구체적으로, 상기 점수는 0 (비정상 행동 없음) 1 (감소된 운동성 및 엎드린 자세), 2 (약간의 간헐성 경련), 3 (사지를 포함하는 전신의 간헐성 경련), 4 (경직된 발의 신장을 지닌 강직간대발작), 5 (사망)를 나타낸다. 통계적 분석은 Kruskal-Wallis 분산분석, 뒤이은 Dunn's pairwise post-hoc 테스트를 사용하여 수행되었다.
1-10. 기타 실험
전기 생리학적 실험 (Um et al., 2014)와 루시퍼라제-프로모터 분석, 전기영동 이동성 이동 분석, 및 크로마틴 면역침강 어세이는 이전에 기술된 바와 같이 수행되었다 (Kim et al., 2009).
1-11. 통계적 분석
모든 실험 데이터는 평군 ± SEM으로 표시되었다. 모든 실험은 적어도 3개의 독립적인 배양물을 사용하여 반복되었고, 실험 데이터는 Mann-Whitney U 테스트 또는 Kruskal-Wallis 분산분석 이후, Dunn's pairwise post-hoc 테스트를 실시하여 통계적으로 분석되었다.
실시예 2. 생체 내 GABA성 시냅스 전달과 IQSEC3간 관련성 확인
우선, 본 발명자들은 IQSEC3가 GABA성 시냅스 전달에 필요한지 여부를 조사하고자 하였다. IQSEC3의 KD (knock down)는 배양된 해마의 뉴런에서 축소형 억제성 후시냅스 전류 (miniature inhibitory postsynaptic currents: mIPSCs)의 진동수를 현저하게 감소시켰던 반면, 이들의 진폭에는 영향을 미치지 않았고, IQSEC3-KD 뉴런에서 IQSEC3의 재발현은 이러한 GABA성 시냅스 전달의 손상을 회복시켰다 (도 1의 A 내지 C). 대조적으로, IQSEC3-KD는 축소형 흥분성 후시냅스 전류 (miniature excitatory postsynaptic currents: mEPSCs)의 전달에는 아무런 영향을 미치지 않음을 보여준다 (도 1의 D 내지 F). 또한, 이러한 생체 내 뉴런에서 관찰된 변화를 확장 적용하기 위하여, 마우스의 체성감각층 II/III 피질 뉴런에서 패치-클램프 기록을 실시하였다. IQSEC3을 표적화하는 짧은 헤어핀 RNAs를 사용한 In utero 전기천공에서, IQSEC3은 mEPSCs의 진동수 및 진폭의 변동없이, 특이적으로 mIPSCs의 진동수만을 감소시키는 것으로 나타났다 (도 1의 G 내지 1의 I). 중요한 것으로, IQSEC3-KD은 IPSCs의 쌍펄스 비율을 변화시키지 않았다는 점이고 (도 1의 M 및 N), 이는 IQSEC3-KD에 의해 유도된, GABA성 시냅스 전달의 억제는 주로 후시냅스와 관련하여 발생하는 것임을 시사한다.
이후, 본 발명자들은 전기 생리학적 실험을 통해 이러한 사실을 검증하고자 하였다. 해마 치아이랑 (DG)에 sh-IQSEC3 (IQSEC3-KD) 또는 sh-control (대조군)을 발현하는 아데노-관련 바이러스 (AAVs)를 정위적으로 마우스에 주입하였고, IQSEC3-KD이 GABA성 시냅스의 구조적 측면에서 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위하여 면역조직화학을 수행하였다. 정량적인 면역형광 분석 결과, DG 과립 세포층 및 치아이랑 문 (hilus)에서는 GABA성 시냅스 마커 GAD67 반점(puncta)의 강도가 유의하게 감소하였으나, 피질에서는 이러한 변화가 관찰되지 않았다 (도 1의 O 내지 R). 특히, 글루탐산 시냅스 마커 VGLUT1의 반점의 강도는 치아이랑 과립 세포 층 (GCL)에서 변화되었으나, 치아이랑 문 및 피질에서는 거의 변화가 없었다 (도 1의 O 내지 Q, 및 S). 또한, IQSEC3-KD의 치아이랑의 GCL에서 GAD67 및 VGLUT1의 상반된 변화는 IQSEC3 야생형 (WT)의 발현에 의해 완벽하게 반전되었으나, IQSEC3 ARF-GEF 활성 돌연변이체에서는 그러하지 않았다. 종합적으로, 이러한 결과는 IQSEC3의 발현은 생체 내 GABA성 시냅스 구조 및 전달에 중요한 역할을 함을 나타내는 것이다.
실시예 3. IQSEC3의 GABA성 시냅스 조절 기전 확인
GABA성 시냅스의 발달은 신경 활동 및 경험의 영향을 받는 것으로 잘 알려져 있으므로, 본 발명자들은 IQSEC3에 의해 매개되는 GABA성 시냅스의 발달의 촉진 역시 GABA 수용체-관련 신호 전달 기작에 의존하는지 확인하고자 하였다. 구체적으로, IQSEC3-WT 또는 IQSEC3-KD 발현 벡터를 사용하여, 배양된 해마 뉴런에 대하여 형질감염을 실시하였다. 상기 뉴런에 100μM의 APV 및 20μM의 NBQX와 함께, 또는 단독으로 50μM의 비쿠쿨린 (bicuculline)을 만성적으로 처리하여, 글루타메이트 및 GABAA 수용체의 활성을 차단하였다. 대조 뉴런에서, 비쿠쿨린 처리는 GABA성 시냅스의 밀도를 증가시켰으며, 이는 Npas4의 상향 조절에 의해 유도되는 것으로 추측해 볼 수 있었다. 그러나, 이러한 효과는 IQSEC3-과발현 뉴런에서는 더디게 나타났다 (도 2의 A). 놀랍게도, IQSEC3-KD에 의한 효과는 GABA성 시냅스에 대한 비쿠쿨린의 효과를 완전히 뛰어 넘는 것이었다. 더욱이, 글루타메이트 수용체 길항제를 사용한 처리는 GABA성 후시냅스 마커 게피린의 반점 밀도에 대한 비쿠쿨린 및 IQSEC3-과발현에 대한 효과를 상쇄시키게 하였다 (도 2의 A 및 B). 더욱이, 게피린 반점 밀도에 대한 IQSEC3-과발현의 효과는 SecinH3 (사이토신 ARF-GEF 계열의 억제제) 또는 QS11 (ARF-GAP[GTPase-활성 단백질]의 억제제)의 처리에 의해 소멸되었다 (도 3의 A 내지 D). 이러한 실험 결과는 IQSEC3가 시냅스 활동-의존성 방식으로, GABA성 시냅스의 발달에 기여하고, 이 과정에서 ARF의 GDP-결합 비활성화 및 GTP-결합 활성화 구조 사이의 상호 순환이 결정적인 역할을 함을 알 수 있다.
실시예 4. IQSEC3의 프로모터와 Npas4간 결합 확인
상기 실시예 2에서 확인한 IQSEC3의 기전은 IQSEC3가 GABA성 시냅스 특이적 전사 인자의 하류 타겟임을 밝힘으로써 증명할 수 있을 것이다. 이러한 가설을 뒷받침할 수 있는 주요한 후보 전사 인자는 Npas4이다. Npas4는 특히, GABA성 시냅스 발달을 조절하여 세포 유형에 따른 도메인-특이적 억제를 매개하는 BDNF를 포함하는 다양한 표적 유전자의 발현을 조절한다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 이러한 Npa4 피크는 단일 Npas4 공통 모티프,'CACG'를 함유하고 있었다 (도 4의 A). 따라서, 본 발명자들은 IQSEC3도, 상기 BDNF와 마찬가지로, Npas4의 표적으로서, GABA성 시냅스 발달을 촉진시할 수 있는지 확인하고자 하였다. 이를 위하여, 본 발명자들은 IQSEC3 프로모터-루시퍼라제 리포터 구조체 및 Npas4 발현 벡터를 HEK293T에 동시 감염시켰다. Npas4의 이소성 발현은 루시퍼라제의 발현을 3배 가량 증가시켰으며, 특히, 이러한 증가는 IQSEC3 프로모터 영역의 Npas4 공통 자리의 돌연변이에 의해 소멸되었다 (도 4의 B). EMSA (Electrophoretic mobility shift assay)에서는 정제된 Npas4 단백질을 함유하는 방사 표지된 WT 올리고듀플랙스 프로브는 단일의 결합-복합체 생성을 보여주었고, 프로모터-리포터 어세이에서도 마찬가지로, DNA-단백질 상호작용은 Npas4 공통 자리의 돌연변이에 의해 소멸되었다 (도 4의 C). 크로마틴면역침강 (ChIP) 어세이는 Npas4가 55mM의 KCl이 처리된 일차 해마 배양 뉴런의 프로모터에 결합하여 막의 탈분극을 촉진함을 보여주었고, 미처리된 해마 배양 뉴런에서는 Npas4와의 결합이 검출되지 않았다 (도 4의 D). 종합하면, 이러한 결과는 Npas4가 IQSEC3의 DNA-결합성 전사적 활성자로서 기능할 수 있음을 시사하는 것이다.
실시예 5. Npas4 표적으로서 IQSEC3의 기능성 확인
IQSEC3가 GABA성 시냅스 발달과 관련하여 Npas4에 작용하는지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 배양된 뉴런에 IQSEC3, 또는 BDNF에 대한 shRNA, 또는 대조 shRNA를 발현하는 렌티바이러스를 3일 동안 시험관 내에서 감염시켰다 (DIV3). 이후, 상기 뉴런에 DIV10에서, EGFP 단독, 또는 EGFP 및 myc-Npas4을 감염시킨 후, DIV14에서 게피린에 대한 면역 염색을 실시하였다. Npas4의 과발현은 게피린 반점 밀도를 수상 돌기 및 신경세포체 모두에서 현저하게 증가시켰다 (도 5의 A 내지 D). 이러한 효과는 이전에 보고된 Npas4 미니 유전자의 BDNF-KD 효과와 구별되는 것으로, 이는 GABA성 시냅스 전달을 수상 돌기 구획이 아닌, 특이적으로 신경세포체에서 변형시켰다 (도 5의 A 내지 D).
다음으로, 본 발명자들은 IQSEC3가 Npas4의 하류 영역에서 기능화함을 명확히 하고자, IQSEC3의 과발현이, Npas4의 결핍에 의해 활동-유도된 GABA성 시냅스 발달 뉴런의 저해를 구제할 수 있는지 여부를 테스트하였다. 우선, 비쿠쿨린을 각각 Npas4-KD, IQSEC3-WT, Npas4-KD+IQSEC3-WT으로 형질감염된 배양 세포에 처리하여, 내인성 Npas4 발현을 자극하였다 (도 5의 E 및 F). Npas4-KD는 게피린 반점의 밀도를 현저하게 감소시켰던 반면, Npas4-KD에서 IQSEC3의 과발현은 대조군 수준으로 이러한 감소를 구제하였다 (도 5의 E 및 F). 이전의 실험 결과들과 종합해 볼 때, 이러한 결과는 IQSEC3가 Npas4의 하류 표적으로서 작용하여, 배양 해마 뉴런의 활동-의존 GABA성 시냅스의 발달을 조절함을 나타내는 것이다.
실시예 5. 뉴런성 활동에 의한 IQSEC3의 발현 조절 확인
Npas4 및 BDNF mRNA와 유사하게, IQSEC3 mRNA 발현이 뉴런성 탈분극에 반응하여 변화되는지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은, 55mM KCl과 함께 2시간 동안 인큐베이션함으로써 대조군 또는 Npas4-KD 렌티바이스에 감염된, 배양 뉴런을 탈분극시킨 뒤, 정량적인 RT-PCR을 수행하였다. 탈분극화가 유도된 후, Npas4, BDNF, 및 IQSEC3의 발현은 대조 뉴런과 비교하여, Npas4-KD에서 모두 감소하였다 (도 6의 A). 뉴런성 활동-유도된 DNA 이중-가닥의 절단 (DSBs)는 최근에 Npas4, Fos, 및 Egr1을 포함하는 초기-반응 유전자 발현의 증가를 자극하지만, BDNF 또는 Homer1에 대해서는 자극하지 않는 것으로 밝혀졌다. 아울러, 뉴런성 활동-유도된 DSB는 주로 토포이소머라자제 IIβ (Topo IIβ)에 의해 주로 생성되며, 이는 분열 후 뉴런에서 강하게 발현된다. 따라서, 본 발명자들은 topo II 이소머라제의 억제인 5μM etoposide (4,6-O-ethylidene-beta-D-glucopyranoside)를 2분 동안 배양 뉴런에 처리하였다. 이후, IQSEC3 mRNA가 Topo IIβ유도된 DSB에 반응하여 상향 조절되는지 여부를 확인하기 위하여, 정량적 RT-PCR을 수행하였다. 종전 보고와 마찬가지로, Npas4는 etoposide의 처리 후 20분 이내에 상향조절되었다. 그러나, 이와 함께 진행된 실험에서 IQSEC3 및 BDNF의 mRNA 수준은 전혀 변화되지 않았다 (도 6의 A 및 B). 특히, etoposide에 의해 유도된 Npas4 mRNA의 증가는, KCl에 의한 탈분극화에 의해 야기된 것보다 현저하게 낮은 수준이었다 (도 6의 A 및 B). 이에 더하여, 다양한 수용체 길항제를 사용하여 시냅스성 활성을 차단한 경우에도, 배양된 피질 뉴런의 Npas4, IQSEC3, BDNF, 또는 게피린의 mRNA 수준을 변화시키지 않았다 (도 6의 B).
본 발명자들은 뉴런 생성 및 시냅스 생성을 촉진하는 것으로 알려있고, 일반화된 경련의 유도를 통해 항우울증 치료에 사용되는 전기경련 치료의 형태로 사용되는, 전기경련적 발작 (ECS)에 반응하여 성체 마우스 내 IQSEC3 mRNA 및 단백질 발현의 변화를 조사하였다. 단일 뉴런 해상도에서 여러 mRNA를 동시적으로 표지하는, 다중 RNAscope ISH (in situ hybridization)를 사용하여, 본 발명자들은 ECS는 해마 형성의 CA1-CA3 및 DG 영역에서 강력하게 IQSEC3 mRNA를 유도함을 확인하였고, 기준 수준으로 돌아오기 전, 3시간 동안 높은 수준으로 유지되었다 (도 7의 A 및 B). 이와 마찬가지로, 피질 및 해마 모두에서, 반-정량적인 면역블롯팅 분석을 사용하여 6시간째 측정되었을 때, IQSEC3 및 게피린의 단백질 수준은 ECS에 의해 현저하게 증가되었다 (도 7의 C 및 D).그러나, 펜틸렌테트라졸 (PTZ; 가장 일반적으로 사용되는 화학 발광제)를 적용한 발작 유도 프로토콜에서는 IQSEC3의 발현 수준에 영향을 미치지 않았다 (도 7의 E 및 F).
또한, 본 발명자들은 IQSEC3의 발현이 출생 후 발달 기간 동안 감각적 자극에 의해 조절될 수 있는지를 확인하고자 하였다. 이러한 목적으로, 본 발명자들은 P21부터 P26까지 5일 동안 마우스를 암실 사육하였고, 이 기간 동안 시각적 피질 회로 내 뇌의 가소성이 높아지고, 이후, 짧은 기간 동안 (2h) 빛에 다시 노출되었다. (도 6의 C 내지 도 H). 이러한 암실 사육과 2시간 동안의 노출된 빛의 패러다임은 시각 피질에서 시냅스의 빠른 리모델링을 유도하고, 이는 광범위한 분자, 기능 및 구조적 시냅스 변화를 야기하였다. 정량적 RT-PCR (도 6의 D) 및 RNAscope ISH (도 6의 E 내지 H)에 의해 측정하였을 때, 5일 동안의 암실 사육 후, 2 시간 동안 빛에 재노출이 된 경우, 암실에서만 사육된 군에 비해 마우스의 시각적 피질에서 Npas4 mRNA 수준이 현저하게 증가되었고, 이와 동시에, IQSEC3과 게피린 mRNA 발현이 상향 조절되었다 (Lrrtm3 mRNA 발현의 제외). 이와 대조적으로, 마우스의 해마에서 Npas4, Iqsec3 및 게피린 mRNA 수준은 변화되지 않았다 (도 6의 D, G 및 H). DR+2hL 군에서 관찰된 IQSEC3 단백질의 변화는 암실 사육 군과 유사하였다 (도 6의 G 및 H). 흥미롭게, 농축된 환경 (EE)에 마우스를 노출시키면, 기존에 보고된 EE 반응에 대한 Npas4 발현 증가와 부합하게, IQSEC3, 게피린 mRNA 발현 수준의 상향 조절이 유도되었다 (도 6의 I 및 G).
종합적으로, 이러한 실험 결과들은 생체 내에서 뉴런성 활동의 유도에 따라, IQSEC3의 발현이 증가함을 나타내는 것이며, IQSEC3 수준은 억제성 톤의 감소에 대한 보상을 반영하는, 구별되는 실험 프로토콜에 의해 유도된 간질 동물모델에 따라 IQSEC3 수준이 선택적으로, 그리고 구별적으로 변화됨을 나타내는 것이다.
실시예 6. IQSEC3의 발현 억제를 통한 뇌전증 동물 모델 구축
본 발명자들은 IQSEC3의 발현 억제를 통해, 손상된 GABA성 시냅스 형성 및 기능과 종종 연관되어 있는 다양한 신경장애, 뇌전증 동물 모델을 구축하고자 하였다. 뇌전증성 발작의 감수성에 대한 IQSEC3-KD의 효과를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 급성 필로카르핀 또는 카인산 유도 간질 모델을 이용하여, 정상 뉴런성 네트워크를 과-흥분성 네트워크로 변형시키는 초기 간질 발생 사건의 기초가 되는 분자적 메커니즘을 밝히고자 하였다. 이를 위하여, 빈 AAVs (대조군), IQSEC3-KD-AAVs가 치아이랑의 다형성 층에 주사되었거나, IQSEC3-KD-AAVs 및 IQSEC3-WT-발현 AAVs (+IQSEC3-WT 구제군), 또는 IQSEC3-KD-AAVs 및 IQSEC3-E749A-발현 AAVs (+IQSEC3-DN 구제군)가 DG의 다형성 층에 함께 주사된 마우스에 필로카르핀을 복강 내 투여하였다. 이후, 비정상적인 동물 행동, 또는 뇌 국소 전위 (LFP)의 기록을 통한 국소 간질성 발작을 모니터링하였다 (도 8). 필로카르핀-유도된 경련 발작의 중증도는 개정된 Racine's 척도를 사용하여, 0 (비정상 행동 없음) 부터 5 (사망)까지의 척도로 스코어링하여 평가하였다. KA 주입 후 초기 30분 동안 평균 발작 점수는 대조군 (1.87 ± 0.25)에 비해 IQSEC3-KD 마우스 (2.68 ± 0.40)에서 1.4배 높았다 (도 8). IQSEC3-KD 마우스에서 이후 30분 동안 평균 발작 점수는 4.71 ± 0.03이었고, 대조군 마우스에서는 3.12 ± 0.08였으며, 이는 발작 행동의 중증도는 이들 마우스에서 유지됨을 시사한다. 중요한 것으로, IQSEC3-KD 마우스에서 관찰된 증가된 발작 감수성은 IQSEC3-WT의 재발현에 의해서 정상화되었지만 (2.28 ± 0.27), IQSEC3-E749A의 재발현에 의해서는 정상화되지 않았다(4.23 ± 0.09) (도 8). 주목할 점으로, IQSEC3-WT의 과발현은 발작 저항성을 향상시키지 못하였다 (IQSEC3-WT, 4.37 ± 0.16; IQSEC3-E749A, 4.56 ± 0.15). 상기와 동일한 방식으로 제조된, 카인산-유도된 간질성 마우스 모델에서도 상기 필로카르핀-유도된 IQSEC3-KD 마우스와 유사한 행동적 프로파일이 관찰되었으며, 이를 통해, 생체 내 GABA성 시냅스 발달을 조절함에 있어서 IQSEC3의 중요성을 확인할 수 있었다 (도 9).
치아이랑 문에서 소마토스타틴을 발현하는 많은 GABA성 개재 뉴런 (인터뉴런, Ins)은 종종 측두엽 간질 환자 및 이러한 조건을 갖는 동물모델에서 소실되므로, 본 발명자들은 치아이랑 문에서 소마토스타틴 (SOM)-양성 (SOM+) 개재 뉴런, 파브알부민 (PV)-양성 (PV+), 칼레티닌 (CAL)-양성 (CAL+) 개재 뉴런의 수를 정량화하였다 (도 10). 본 발명자들은 IQSEC3-KD 마우스에서 치아이랑 문의 GABA성 개재 뉴런의 수 (피질 개재 뉴런 수는 제외)가 대조군 마우스에 비해 크게 감소하였다는 점을 발견하였다. 비록 IQSEC3 단백질은 PV+ 및 SOM+ 개재 뉴런은 모두에서 발현되었지만, PV+ 또는 CAL+이 아닌, SOM+ 개재 뉴런이 특이적으로 IQSEC3-KD 마우스에서 소실되었다. 놀랍게도, IQSEC3 WT의 재발현은 SOM+ 개재 뉴런의 소실을 완전하게 구제하였다 (도 10). 더욱이, IQSEC3-KD 마우스에서 zinc transporter-3 (ZnT3) 염색에 의해 모니터링된 DG 과립 세포 축색 돌기 (즉, 태상 섬유)를 발아는 대조군 마우스와도 비견할만 하였다 (도 10). 종합적으로, 이러한 실험 결과들은 IQSEC3의 소실은 발작의 발병을 촉진하고, 기능적 GABA 성 시냅스의 수와 GABA성 개재 뉴런 중 일부 (SOM + Ins)를 감소시킴으로써, 자발성 발작을 유도할 수 있음을 시사하는 것이다.
Claims (16)
- IQSEC3 (IQ motif and Sec7 domain 3) 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성이 억제된 뇌전증 동물 모델로서,
상기 동물 모델은 필로카르핀 (pilocarpine) 또는 카인산 (kainic acid)이 투여된 것이며,
상기 동물은 마우스, 햄스터, 랫트, 모르모트, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 소, 양, 돼지, 및 염소로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 동물 모델.
- 삭제
- 청구항 1에 있어서, 상기 동물 모델은 해마 치아이랑의 IQSEC3 유전자가 넉다운 또는 넉아웃된 것인, 동물 모델.
- 삭제
- 청구항 1에 있어서, 상기 필로카르핀은 200 내지 400mg/kg의 농도로 투여되는 것인, 동물 모델.
- 청구항 1에 있어서, 상기 카인산은 5 내지 25mg/kg의 농도로 투여되는 것인, 동물 모델.
- 청구항 1에 있어서, 상기 동물 모델은 GABA (Gamma-aminobutyric acid)성 시냅스가 저해되어 있는 것인, 동물 모델.
- 청구항 1에 있어서, 상기 모델은 게피린 반점 (Gephyrin puncta)의 밀도가 감소되어 있는 것인, 동물 모델.
- 동물로부터 해마 치아이랑의 IQSEC3 (IQ motif and Sec7 domain 3) 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 억제시키는 단계; 및
상기 IQSEC3 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성이 억제된 동물에 필로카르핀 또는 카인산을 투여하는 단계를 포함하며,
상기 동물은 마우스, 햄스터, 랫트, 모르모트, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 소, 양, 돼지, 및 염소로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 뇌전증 동물 모델을 제조하는 방법.
- 청구항 9에 있어서, 상기 IQSEC3 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성이 억제시키는 단계는 해마 치아이랑의 IQSEC3 유전자를 넉다운 또는 넉아웃시키는 것인, 방법.
- 삭제
- 삭제
- 청구항 9에 있어서, 상기 필로카르핀은 200 내지 400mg/kg의 농도로 투여되는 것인, 방법.
- 청구항 9에 있어서, 상기 카인산은 5 내지 25mg/kg의 농도로 투여되는 것인, 방법.
- 청구항 1의 뇌전증 동물 모델에 뇌전증의 치료를 위한 후보약물을 투여하는 단계; 및
뇌전증 증상이 완화되는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 뇌전증 치료제의 스크리닝 방법.
- 청구항 15에 있어서, 상기 확인하는 단계는 상기 동물 모델의 혈액 중 뇌전증 관련 표지의 농도의 측정, 뇌파 (EEG, Electroencephalogram) 분석, 개방형 필드 테스트 (open field test: OFT), 행동 발작 스코어링 (Behavioral Seizure scoring), 또는 이들의 조합에 의해 수행되는 것인 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180039938A KR102109852B1 (ko) | 2018-04-05 | 2018-04-05 | 뇌전증 동물 모델, 그의 제조방법 및 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180039938A KR102109852B1 (ko) | 2018-04-05 | 2018-04-05 | 뇌전증 동물 모델, 그의 제조방법 및 용도 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20190116844A KR20190116844A (ko) | 2019-10-15 |
| KR102109852B1 true KR102109852B1 (ko) | 2020-05-13 |
Family
ID=68209490
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020180039938A KR102109852B1 (ko) | 2018-04-05 | 2018-04-05 | 뇌전증 동물 모델, 그의 제조방법 및 용도 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102109852B1 (ko) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101750893B1 (ko) | 2015-06-04 | 2017-07-12 | 충남대학교산학협력단 | Zc4h2 유전자를 녹아웃시킨 형질전환 동물모델 및 이의 용도 |
| KR101771168B1 (ko) | 2017-05-17 | 2017-08-24 | 한국과학기술원 | 뇌전증 관련 뇌 체성 유전 변이 및 이의 이용 |
-
2018
- 2018-04-05 KR KR1020180039938A patent/KR102109852B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101750893B1 (ko) | 2015-06-04 | 2017-07-12 | 충남대학교산학협력단 | Zc4h2 유전자를 녹아웃시킨 형질전환 동물모델 및 이의 용도 |
| KR101771168B1 (ko) | 2017-05-17 | 2017-08-24 | 한국과학기술원 | 뇌전증 관련 뇌 체성 유전 변이 및 이의 이용 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Cell Reports, vol.30, pp..1995-2005(2020.02.11.) |
| Covolan L 등, Epilepsy Res vol.39 no.2 pp.133-152(2000년 공개)* |
| Um JW 등, J Biol Chem vol.291 no.19 pp.10119-10130(2016.05.06. 공개)* |
| Um JW, Neurosci Res. vol.116 pp.54-59(2016.06.28. 공개)* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20190116844A (ko) | 2019-10-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Carballo-Carbajal et al. | Brain tyrosinase overexpression implicates age-dependent neuromelanin production in Parkinson’s disease pathogenesis | |
| Bøttger et al. | Glutamate-system defects behind psychiatric manifestations in a familial hemiplegic migraine type 2 disease-mutation mouse model | |
| Ip et al. | Rett syndrome: insights into genetic, molecular and circuit mechanisms | |
| Fuhrer et al. | Impaired expression of GABA transporters in the human Alzheimer’s disease hippocampus, subiculum, entorhinal cortex and superior temporal gyrus | |
| Levenga et al. | Tau pathology induces loss of GABAergic interneurons leading to altered synaptic plasticity and behavioral impairments | |
| Cho et al. | Nasal placode development, GnRH neuronal migration and Kallmann syndrome | |
| Minami et al. | Progranulin protects against amyloid β deposition and toxicity in Alzheimer's disease mouse models | |
| Shimizu et al. | Advanced glycation end-products disrupt the blood–brain barrier by stimulating the release of transforming growth factor–β by pericytes and vascular endothelial growth factor and matrix metalloproteinase–2 by endothelial cells in vitro | |
| Lin et al. | Running exercise delays neurodegeneration in amygdala and hippocampus of Alzheimer’s disease (APP/PS1) transgenic mice | |
| Zhu et al. | Loss of ARHGEF6 causes hair cell stereocilia deficits and hearing loss in mice | |
| Nakamura et al. | PX-RICS-deficient mice mimic autism spectrum disorder in Jacobsen syndrome through impaired GABAA receptor trafficking | |
| Tsai et al. | Functional and structural deficits of the dentate gyrus network coincide with emerging spontaneous seizures in an Scn1a mutant Dravet Syndrome model during development | |
| Zuko et al. | Contactins: structural aspects in relation to developmental functions in brain disease | |
| Stil et al. | Contribution of the potassium–chloride co‐transporter KCC2 to the modulation of lumbar spinal networks in mice | |
| Schuh et al. | Mitochondrial oxygen consumption deficits in skeletal muscle isolated from an Alzheimer’s disease-relevant murine model | |
| Liu et al. | Disruption of neurogenesis and cortical development in transgenic mice misexpressing Olig2, a gene in the Down syndrome critical region | |
| Peterson et al. | Targeted overexpression of glutamate transporter-1 reduces seizures and attenuates pathological changes in a mouse model of epilepsy | |
| Jiang et al. | Reduction of NgR in perforant path decreases amyloid-β peptide production and ameliorates synaptic and cognitive deficits in APP/PS1 mice | |
| Yu et al. | Endophilin A1 mediates seizure activity via regulation of AMPARs in a PTZ-kindled epileptic mouse model | |
| Xiao et al. | ERG3 potassium channel‐mediated suppression of neuronal intrinsic excitability and prevention of seizure generation in mice | |
| Savvaki et al. | Neuronal, but not glial, Contactin 2 negatively regulates axon regeneration in the injured adult optic nerve | |
| Kurasawa et al. | Loss of synaptic ribbons is an early cause in ROS-induced acquired sensorineural hearing loss | |
| Lu et al. | Cholinergic Grb2-associated-binding protein 1 regulates cognitive function | |
| Hernández-Ortega et al. | S100B actions on glial and neuronal cells in the developing brain: An overview | |
| Li et al. | Upregulation of Cdh1 in the trigeminal spinal subnucleus caudalis attenuates trigeminal neuropathic pain via inhibiting GABAergic neuronal apoptosis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right |