KR102107835B1 - Method for dissolving silk fibroin and it's hydrolyzate - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 실크 피브로인 용해방법 및 그 가수분해물의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 염화칼슘을 사용하지 않으면서도 실크 피브로인을 용해할 수 있는 방법과 상기 염화칼슘을 사용하지 않으면서도 용해과정을 진행한 실크 피브로인의 가수분해물의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.The present invention relates to a method for dissolving silk fibroin and a method for producing the hydrolyzate thereof. More specifically, the present invention is to provide a method for dissolving silk fibroin without using calcium chloride and a method for producing a hydrolyzate of silk fibroin that has undergone dissolution without using calcium chloride.
자연계에 존재하는 수많은 다당류 또는 단백질과 같은 천연고분자들은 합성고분자에 비해 고가이고 가공성이 떨어지는 단점을 지니지만 생체적합성과 생분해성이 합성고분자 보다 우수하여 의료용 소재로 이용하기 위한 연구들이 지속되고 있다.Natural polymers, such as many polysaccharides or proteins, exist in nature, have the disadvantage of being expensive and less processable than synthetic polymers, but biocompatibility and biodegradability are superior to synthetic polymers, and studies to use them as medical materials continue.
특히 누에고치로부터 얻어지는 천연단백질인 실크 단백질은 대표적인 천연고분자로 중심부에 두 가닥으로 존재하는 피브로인과 그 주변을 감싸고 있는 세리신으로 구성되어 있다. 이 중 친수성이며 점착성을 갖는 단백질인 세리신은 정련과정을 거쳐 제거되며, 의료용 소재로서, 외용제 또는 식품, 기타 약제 등으로는 일반적으로 피브로인만을 이용하는 것이 일반적이다.In particular, silk protein, a natural protein obtained from cocoon, is a representative natural polymer and consists of fibroin, which exists in two strands in the center, and sericin that surrounds it. Among these, sericin, a hydrophilic and adhesive protein, is removed through a refining process. As a medical material, only fibroin is generally used as an external preparation, food, or other drug.
또한, 최근 실크 단백질의 다양한 기능이 소개되고 있는데, 이러한 실크 단백질을 기능성 식품 또는 약제 등으로 사용하기 위해서는 상술한 바와 같이 실크 단백질로부터 실크 펩타이드를 얻기 위하여 실크에서 세리신을 제거하여 피브로인을 정제한다. 또한 정제된 피브로인을 일정한 효소 또는 산을 사용하여 가수분해하는 과정을 진행하게 된다.In addition, various functions of silk proteins have recently been introduced. In order to use these silk proteins as functional foods or pharmaceuticals, as described above, fibroin is purified by removing sericin from silk to obtain silk peptides from silk proteins. In addition, the process of hydrolyzing the purified fibroin using a certain enzyme or acid will proceed.
세리신을 제거하는 단계는 약 알칼리성의 용액으로 처리하여 진행하는 것이 일반적이다. 한편, 실크 피브로인은 강력한 수소결합과 결정성 구조를 갖는 섬유상 단백질로서, 물이나 용매에 쉽게 용해되지 않기 때문에, 피브로인 단백질의 결합을 끊을 수 있는 유/무기 염, 플르오르화 용매, 이온화 용액, 강산 등을 이용하여 실크단백질을 용해시켜야 한다.The step of removing sericin is usually performed by treating with a weakly alkaline solution. On the other hand, silk fibroin is a fibrous protein having a strong hydrogen bond and a crystalline structure, and because it is not easily soluble in water or a solvent, an organic / inorganic salt capable of breaking the fibroin protein, a fluorinated solvent, an ionization solution, a strong acid, etc. It is necessary to dissolve the silk protein using.
이러한 실크 피브로인을 용해하는데는 염화칼슘을 사용하는 것이 일반적이다. 또한, 식품 소재로서 피브로인 가수분해물을 사용하기 위해서는 순도가 높은 염화칼슘을 사용하여야 한다. 그러나 식품 소재를 생산하는 공정에서 사용할 수 있는 고순도의 염화칼슘은 일본산이 주류를 이루고 있다.Calcium chloride is generally used to dissolve the silk fibroin. In addition, in order to use fibroin hydrolyzate as a food material, calcium chloride with high purity must be used. However, high-purity calcium chloride that can be used in the process of producing food materials is mainly made in Japan.
최근 일본산 소재의 국내 수출 규제에 따라 식품 생산공정에서 사용할 수 있는 고순도의 염화칼슘은 그 수급이 상당히 불안정한 실정이라 할 수 있다. 또한 역시 국내의 다양한 기능성 소재를 개발하여 활용하는데 있어, 일본산 염화칼슘 소재를 필수적으로 사용하는 점은 국내의 기능성 식품 소재 분야의 발전을 저해하는 요인이 될 수 밖에 없다는 문제가 있다.The supply and demand of high-purity calcium chloride, which can be used in the food production process in accordance with the domestic export regulations of Japanese-made materials, is a very unstable situation. In addition, in developing and utilizing various functional materials in Korea, the essential use of calcium chloride material from Japan is a factor that can only hinder the development of the domestic functional food material field.
따라서 본 발명자들은 일본산 소재의 국내 수출 규제가 진행되기 전부터 위와 같은 문제점을 인식하고, 고순도의 염화칼슘을 사용하지 않고 피브로인을 용해할 수 있는 방법을 연구하였다. 특히 식품 공정에 적용될 수 있는 소재만을 사용하여 피브로인을 용해함으로서, 일본산 고순도 염화칼슘을 사용하지 않으면서 실크 피브로인을 용해하여 용해 이후의 피브로인 가공단계가 진행될 수 있는 실크 피브로인 용해방법을 완성하였다. 또한 본 발명에서 개시하는 용해방법으로 처리된 실크 피브로인의 가수분해물이 염화칼슘을 이용하여 용해한 실크 피브로인과 동일한 물성 및 용도상 효과를 가질 수 있다는 점을 확인하였다.Therefore, the present inventors recognized the above problems and studied a method of dissolving fibroin without using high-purity calcium chloride even before the domestic export regulation of Japanese-made materials proceeds. In particular, by dissolving fibroin using only materials that can be applied to the food process, silk fibroin dissolution was completed by dissolving silk fibroin without using high-purity calcium chloride from Japan to process fibroin after dissolution. In addition, it was confirmed that the hydrolyzate of silk fibroin treated by the dissolution method disclosed in the present invention may have the same physical properties and effects as silk fibroin dissolved using calcium chloride.
선행기술 1(WO 2016-159500 A)의 경우 세리신이 제거하여 실크 피브로인을 정제한 뒤 브롬화리튬 또는 염화칼슘으로 용해시키는 방법을 개시하고 있다. 특히 위 선행기술 1은 식품 소재에 대한 것이 아니므로 실크 피브로인을 용해하기 위하여 사용하는 염의 종류가 비교적 다양할 수 있다는 점을 감안하여도 본 발명에서 대체하기 위한 대상으로 특정하고 있는 염화칼슘을 가용화를 위한 필수요소로 개시하고 있다.Prior art 1 (WO 2016-159500 A) discloses a method for purifying silk fibroin by removing sericin and dissolving it with lithium bromide or calcium chloride. In particular, the above prior art 1 is not for food materials, but considering the fact that the types of salts used to dissolve silk fibroin may be relatively diverse, the calcium chloride specified as an object to be replaced in the present invention for solubilization It is disclosed as an essential element.
선행기술 2(10-2018-0101802)의 경우 역시 실크 피브로인을 가용화 하기 위하여 브롬화리튬 또는 염화칼슘을 사용하는 점을 알 수 있다. 이 경우 역시 본 발명이 해결하기 위한 종래의 기술의 범주에 있으며, 실크 피브로인을 용해시키기 위하여 브롬화리튬 또는 염화칼슘을 사용하는 점을 확인할 수 있다.In the case of prior art 2 (10-2018-0101802), it can also be seen that lithium bromide or calcium chloride is used to solubilize the silk fibroin. In this case, it is also within the scope of the prior art for solving the present invention, and it can be confirmed that lithium bromide or calcium chloride is used to dissolve the silk fibroin.
따라서 상술한 바와 같이 염화칼슘, 특히 식품 소재로 사용되는 경우 고순도 염화칼슘을 사용하지 않으면서도 실크 피브로인을 가용화할 수 있는 방법의 개발이 필요하다.Therefore, as described above, it is necessary to develop a method capable of solubilizing silk fibroin without using high-purity calcium chloride when used as a food material.
본 발명의 목적은 실크 피브로인을 가용화 하는 방법 및 상기 실크 피브로인을 가수분해하는 방법을 제공하기 위한 것이다.An object of the present invention is to provide a method for solubilizing silk fibroin and a method for hydrolyzing the silk fibroin.
본 발명의 목적은 실크 피브로인의 가용화에 사용되는 염화칼슘을 사용하지 않고 실크 피브로인을 가용화 할 수 있는 방법을 제공하기 위한 것이다. 특히, 본 발명에서 개시하는 실크 피브로인을 가용화 하는 방법에 의하는 경우 고순도 염화칼슘을 사용하지 않으면서도 실크 피브로인이 염화칼슘으로 가용화 된 경우와 동일한 물성 및 성상의 최종 생산물을 얻을 수 있다.An object of the present invention is to provide a method for solubilizing silk fibroin without using calcium chloride used for solubilizing silk fibroin. In particular, in the case of using the method for solubilizing the silk fibroin disclosed in the present invention, the final product of the same physical properties and properties as in the case where the silk fibroin is solubilized with calcium chloride can be obtained without using high-purity calcium chloride.
본 발명은 고순도 실크 피브로인의 가용화에 고순도 염화칼슘을 대체함으로서 국내 소재응용 분야에 있어 일본산 소재의 의존도를 줄일 수 있도록 하기 위한 것이다.The present invention is to replace the high-purity calcium chloride in the solubilization of high-purity silk fibroin to reduce the dependence of Japanese-made materials in the domestic material application field.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 실크 피브로인 가용화 방법은 누에고치와 정제수를 혼합하고 열처리하여 세리신(sericin)이 제거하고 실크 피브로인을 수득하는 세리신 제거단계; 실크 피브로인을 탄산수소칼슘을 포함하는 혼합 용액에 용해하는 가용화 단계; 및 상기 용해물에서 혼합용액을 제거하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.In order to achieve the above object, the method for solubilizing silk fibroin according to an embodiment of the present invention includes a step of removing sericin by mixing and heat-treating cocoon and purified water to remove sericin and obtain silk fibroin; A solubilizing step of dissolving the silk fibroin in a mixed solution containing calcium hydrogen carbonate; And removing the mixed solution from the lysate.
상기 실크 피브로인 가용화 방법에 있어서, 상기 혼합용액은 수산화 암모늄을 더 포함하는 것일 수 있다.In the silk fibroin solubilization method, the mixed solution may further include ammonium hydroxide.
상기 실크 피브로인 가용화 방법에 있어서, 상기 혼합용액은 자일나아제, 소르비톨, 만니톨, 칼락토오스 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 더 포함하는 것일 수 있다.In the silk fibroin solubilization method, the mixed solution may further include any one selected from the group consisting of xylase, sorbitol, mannitol, calactose, and mixtures thereof.
상기 실크 피브로인 가용화 방법에 있어서, 상기 가용화 단계는 상기 실크 피브로인, 탄산수소칼슘을 포함하고 상기 탄산수소칼슘 100 중량부에 대하여 수산화 암모늄 1 내지 100 중량부; 및 자일나아제, 소르비톨, 만니톨, 칼락토오스 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 1 내지 10 중량부가 포함된 혼합용액이 혼합되는 가용화 제1 단계; 실크 피브로인과 혼합용액의 혼합물을 교반하면서, 상기 혼합물에 대한 점도를 높이는 가용화 제2 단계; 및 상기 혼합물의 점도가 5 내지 300 cP가 되면, 방치하는 가용화 제3 단계; 상기 혼합물에 물을 혼합하는 가용화 제4 단계를 포함하는 것일 수 있다.In the method of solubilizing the silk fibroin, the solubilizing step includes the silk fibroin, calcium hydrogen carbonate, and 1 to 100 parts by weight of ammonium hydroxide with respect to 100 parts by weight of the calcium hydrogen carbonate; And xylase, sorbitol, mannitol, calactose and a mixture solution containing 1 to 10 parts by weight of any one selected from the group consisting of solubilization; A second solubilization step of increasing the viscosity for the mixture while stirring the mixture of the silk fibroin and the mixed solution; And a third step of solubilization when the viscosity of the mixture becomes 5 to 300 cP; It may be to include a fourth step of solubilizing the water in the mixture.
상기 실크 피브로인 가용화 방법에 있어서, 상기 가용화 제1 단계 이전에 상기 실크 피브로인에 대하여 에탄올을 혼합하는 전처리 단계를 포함하는 것일 수 있다.In the silk fibroin solubilization method, it may be a pretreatment step of mixing ethanol with respect to the silk fibroin before the first step of solubilization.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 실크 피브로인 가수분해물의 제조방법은 누에고치와 정제수를 혼합하고 열처리하여 세리신(sericin)이 제거하고 실크 피브로인을 수득하는 세리신 제거단계; 실크 피브로인을 탄산수소칼슘을 포함하는 혼합 용액에 용해하는 가용화 단계; 상기 용해물에서 혼합용액을 제거하는 정제단계; 및 상기 정제단계에서 얻어진 실크 피브로인 용해물을 단백질 가수분해 효소 또는 산으로 가수분해 하는 단계;를 포함하는 것일 수 있다.Method for producing a silk fibroin hydrolyzate according to another embodiment of the present invention is a sericin removal step of mixing the cocoon and purified water and heat treatment to remove sericin and obtain silk fibroin; A solubilizing step of dissolving the silk fibroin in a mixed solution containing calcium hydrogen carbonate; A purification step of removing the mixed solution from the lysate; And hydrolyzing the silk fibroin lysate obtained in the purification step with a proteolytic enzyme or acid.
본 발명의 실크 피브로인은 가수분해를 통하여 실크 펩타이드를 생산하기 위한 것일 수 있다.The silk fibroin of the present invention may be for producing silk peptides through hydrolysis.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 식품은 상기 실크 피브로인 또는 상기 실크 피브로인 가수분해물을 포함하는 것일 수 있다.The food product according to another embodiment of the present invention may include the silk fibroin or the hydrolyzate of the silk fibroin.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 인지기능장애 예방 또는 개선용 의약품은 상기 실크 피브로인 또는 상기 실크 피브로인 가수분해물을 포함하는 것일 수 있다.The pharmaceutical product for preventing or improving cognitive dysfunction according to another embodiment of the present invention may include the silk fibroin or the hydrolyzate of the silk fibroin.
상기 인지기능장애는 치매, 학습장애, 실인증, 건망증, 실어증, 실행증, 섬망, AIDS 유발 치매, 빈스완거 병, 루이소체 치매, 전두측두엽성 치매, 경도 인지 장애, 다발성 경색성 치매, 픽병, 의미치매, 알츠하이머성 치매 또는 혈관성 치매로 구성된 군으로부터 선택된 것일 수 있다.The cognitive dysfunction is dementia, learning disability, real certification, forgetfulness, aphasia, agonism, delirium, AIDS-induced dementia, Vincewaner's disease, Lewy body dementia, frontotemporal dementia, mild cognitive impairment, multiple infarct dementia, pick disease, meaning It may be selected from the group consisting of dementia, Alzheimer's dementia or vascular dementia.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명의 일 실시예에 따른 실크 피브로인 가용화 방법은 누에고치와 정제수를 혼합하고 열처리하여 세리신(sericin)이 제거하고 실크 피브로인을 수득하는 세리신 제거단계; 실크 피브로인을 탄산수소칼슘을 포함하는 혼합 용액에 용해하는 가용화 단계; 및 상기 용해물에서 혼합용액을 제거하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.Silk fibroin solubilization method according to an embodiment of the present invention is a sericin removal step of mixing the cocoon and purified water and heat treatment to remove sericin and obtain silk fibroin; A solubilizing step of dissolving the silk fibroin in a mixed solution containing calcium hydrogen carbonate; And removing the mixed solution from the lysate.
실크(silk)란 누에가 만든 고치로부터 얻어지는 섬유를 말하며, 이것을 원료로 한 견사로 제조한 제품을 총칭한다. 넓은 뜻으로는 작잠사 등의 야잠사, 견 방사를 원료한 견 제품을 포함하여 가리키기도 한다. 보통 견이라고 부르는 가잠견(true silk)은 사육 견(cultivated or domestic silk)이라고도 한다.Silk (silk) refers to the fibers obtained from cocoons made by silkworms, and collectively refers to products made from silk yarns made from these. In a broad sense, it also refers to Yajamsa, such as Yakjamsa, and silk products from raw silk. The true silk, commonly called the dog, is also called the cultivated or domestic silk.
본 발명에서 말하는 누에고치는 실크를 포함하는 개념으로 정의한다.The cocoon in the present invention is defined as a concept including silk.
실크 섬유는 피브로인과 세리신으로 구성되어 있으며, 그 밖에 소량의 뇌질, 지방질 및 무기염류를 함유하고 있다.Silk fibers are composed of fibroin and sericin, and contain a small amount of brain, fat and inorganic salts.
실크의 구성성분은 피브로인과 세리신이고 이들은 섬유모양의 단백질이다. 이것은 천연의 상태에서는 생체 고분자로 구성되어 있다. 보통 분자량이 10,000이상인 화합물은 섬유, 막(membrance) 또는 덩이모양이다. 실크는 고분자의 단백질이고, 단백질은 아미노산으로 되어있으며, 아미노산은 탄소에 아미노기(-NH2)와 카르복실기(-COOH)가 결합되어 단순한 알파 아미노산으로 구성된다. Silk consists of fibroin and sericin, which are fibrous proteins. It is composed of biopolymers in its natural state. Compounds with a molecular weight of more than 10,000 are usually fibers, membranes or tubers. Silk is a high-molecular protein, the protein is made of amino acids, and the amino acid is composed of simple alpha amino acids by combining amino groups (-NH2) and carboxyl groups (-COOH) on carbon.
그리고 수많은 아미노산들이 사슬고리를 가지고 염주모양으로 연결된 고분자를 폴리펩타이드라 한다. 결국 두 개의 아미노산의 -NH2와 -COOH가 반응하여 물(H2O)이 빠져나가게 되고 평행으로 배열하여 섬유화가 이루어진다In addition, a polymer is a polypeptide in which numerous amino acids have chains and are linked in the shape of beads. Eventually, -NH 2 and -COOH of the two amino acids react and water (H 2 O) escapes and is arranged in parallel to form fiber.
피브로인을 이루는 아미노산은 글라이신(측쇄 -H), 알라닌(-CH3)이 많은데 이들 아미노산은 분자의 측쇄가 짧은 것이 특색이다. 그리고 세린(측쇄 -CH2OH), 티로신(측쇄-CH(OH)CH2)를 합하면 90% 이상이다. 그리고 산성 아미노산(아스파르트산, 글루탐산)과 여기성 아미노산(라이신, 알라닌, 히스디틴)의 함량이 적은 것이 세리신의 아미노산 조성과의 차이이다. 이들 아미노산을 서로 다른 연결조합으로 결합하면 폴리펩타이드를 형성한다. 피브로인을 가수분해시키면 아미노산이 되고, 분자량이 30 내지 50만으로부터 3,000 내지 3,500의 알파 아미노산이 결합하여 한 가닥의 분자를 구성한다.The amino acids that make up fibroin have many glycine (side chain -H) and alanine (-CH 3 ). These amino acids are characterized by a short side chain of the molecule. And the sum of serine (side chain -CH 2 OH) and tyrosine (side chain -CH (OH) CH 2 ) is more than 90%. The difference between the amino acid composition of sericin is that the content of acidic amino acids (aspartic acid, glutamic acid) and excitatory amino acids (lysine, alanine, histitin) is low. When these amino acids are combined in different linkage combinations, a polypeptide is formed. When hydrolyzed fibroin, it becomes an amino acid, and an alpha amino acid having a molecular weight of from 300 to 500,000 to 3,000 to 3,500 forms a single molecule.
한편, 체내에 흡수될 수 있는 정도의 크기로 상기 실크에서 유래한 실크 피브로인을 일정한 아미노산 서열을 가지는 것으로 가수분해하여 가공한 것을 실크 피브로인 유래 펩타이드 또는 실크 피브로인 단백질로 말할 수 있다.Meanwhile, a silk fibroin-derived peptide or silk fibroin protein may be referred to as a product obtained by hydrolyzing the silk fibroin derived from the silk to have a certain amino acid sequence in a size sufficient to be absorbed into the body.
또한 본 발명에서 말하는 실크 유래 펩타이드는 실크 단백질로도 표현될 수 있고 같은 의미로 사용될 수 있다.In addition, the peptide derived from silk referred to in the present invention can also be expressed as a silk protein and can be used in the same sense.
상기 세리신 제거단계는 실크를 알칼리로 처리하여 제거하는 방법이 가장 일반적으로 사용된다. 다만 본 발명은 위 방법에 한정하는 것은 아니며 상기 세리신 제거단계는 해당분야에서 통상의 지식을 가진 자가 세리신을 제거하고 피브로인을 수득하는 사용할 수 있는 모든 수단을 포함하는 것으로 본다.In the sericin removal step, a method of removing silk by alkali treatment is most commonly used. However, the present invention is not limited to the above method, and the sericin removal step is considered to include all means that can be used by a person of ordinary skill in the art to remove sericin and obtain fibroin.
상기 가용화 단계는 실크피브로인을 탄산수소칼슘을 포함하는 혼합용액에 용해하는 것일 수 있다.The solubilization step may be to dissolve the silk fibroin in a mixed solution containing calcium hydrogen carbonate.
상기 혼합 용액은 상기 혼합용액은 수산화 암모늄을 더 포함하는 것일 수 있다.In the mixed solution, the mixed solution may further include ammonium hydroxide.
상기 혼합 용액은 자일나아제, 소르비톨, 만니톨, 칼락토오스 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 더 포함하는 것일 수 있다.The mixed solution may further include any one selected from the group consisting of xylase, sorbitol, mannitol, calactose, and mixtures thereof.
바람직하게 상기 가용화 단계에 있어서 상기 혼합용액은 탄산수소칼슘을 포함하고, 상기 탄산수소칼슘 100 중량부에 대하여 수산화 암모늄 1 내지 100 중량부; 및 자일나아제, 소르비톨, 만니톨, 칼락토오스 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 1 내지 10 중량부가 포함된 것일 수 있다.Preferably, in the solubilization step, the mixed solution includes calcium hydrogen carbonate, and 1 to 100 parts by weight of ammonium hydroxide with respect to 100 parts by weight of the calcium hydrogen carbonate; And xylase, sorbitol, mannitol, calactose and any one selected from the group consisting of mixtures of 1 to 10 parts by weight may be included.
일반적으로 염화칼슘이 아닌 용액을 사용하는 경우 실크 피브로인이 완전히 용해되지 않는다. 즉 탄산수소칼슘을 사용하는 경우, 물의 함량을 실크피브로인 질량에 대비하여 50 배 이상으로 하고, 상당량의 탄산수소칼슘을 사용하여도 실크 피브로인이 효과적으로 용해되지 않는 문제가 있다.In general, when a solution other than calcium chloride is used, silk fibroin is not completely dissolved. That is, when using calcium hydrogen carbonate, the content of water is 50 times or more compared to the mass of the silk fibroin, and even when a significant amount of calcium hydrogen carbonate is used, there is a problem that the silk fibroin is not effectively dissolved.
따라서 탄산수소칼슘, 수산화 암모늄을 혼합하고, 추가적으로 자일나아제, 소르비톨, 만니톨, 칼락토오스 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 포함되게 하는 경우 실크 피브로인에 대한 용해도를 높일 수 있다.Therefore, when the calcium hydrogen carbonate and ammonium hydroxide are mixed and additionally selected from the group consisting of xylase, sorbitol, mannitol, calactose, and mixtures thereof, solubility in silk fibroin can be increased.
실크 피브로인의 용해물에 사용되는 용매의 양은 무엇보다 중요하다. 용매의 양이 증가하면 공정의 크기가 커질 수 밖에 없고, 이후 단계에서 처리하는 양에 비하여 수득되는 최종 생성물의 양이 작아질 수 밖에 없다. 상기 범위에 의하는 경우 실크 피브로인에 대하여 3 내지 6 배의 질량부의 용매를 사용하여도 실크 피브로인이 가용화 되도록 할 수 있다.The amount of solvent used in the lysate of silk fibroin is of paramount importance. When the amount of the solvent is increased, the size of the process is inevitably increased, and the amount of the final product obtained is inevitably smaller than the amount processed in the subsequent step. In the case of the above range, it is possible to make the silk fibroin solubilize even when a solvent of 3 to 6 times the mass of the silk fibroin is used.
구체적으로 실크 피브로인의 상기 가용화 단계는 상기 가용화 단계는 상기 실크 피브로인, 탄산수소칼슘을 포함하고 상기 탄산수소칼슘 100 중량부에 대하여 수산화 암모늄 1 내지 100 중량부; 및 자일나아제, 소르비톨, 만니톨, 칼락토오스 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 1 내지 10 중량부가 포함된 혼합용액이 혼합되는 가용화 제1 단계; 실크 피브로인과 혼합용액의 혼합물을 교반하면서, 상기 혼합물에 대한 점도를 높이는 가용화 제2 단계; 및 상기 혼합물의 점도가 5 내지 300 cP가 되면, 방치하는 가용화 제3 단계; 상기 혼합물에 물을 혼합하는 가용화 제4 단계를 포함하는 것일 수 있다.Specifically, the solubilizing step of the silk fibroin, the solubilizing step includes the silk fibroin, calcium hydrogen carbonate and 1 to 100 parts by weight of ammonium hydroxide with respect to 100 parts by weight of the calcium hydrogen carbonate; And xylase, sorbitol, mannitol, calactose and a mixture solution containing 1 to 10 parts by weight of any one selected from the group consisting of solubilization; A second solubilization step of increasing the viscosity for the mixture while stirring the mixture of the silk fibroin and the mixed solution; And a third step of solubilization when the viscosity of the mixture becomes 5 to 300 cP; It may be to include a fourth step of solubilizing the water in the mixture.
특히 상기 가용화 단계에 의하는 경우 염화칼슘을 사용하지 않으면서 실크 피브로인을 완전히 용해시킬 수 있다. 특히, 위 단계에 의하는 경우 실크 피브로인을 용해하기 위해 사용하는 용매의 양을 적게 할 수 있기 때문에 공정효율을 증진시킬 수 있다.Particularly in the case of the solubilization step, silk fibroin can be completely dissolved without using calcium chloride. In particular, in the case of the above step, since the amount of the solvent used to dissolve the silk fibroin can be reduced, process efficiency can be improved.
상기 제1 가용화 단계에 의하는 경우 단순히 탄산수소칼슘, 수산화 암모늄을 용해하여 용매로 사용하는 경우에 비하여 높은 가용화 효과를 나타낸다. 그러나 가용화 제1 단계에 의하는 경우 실크 피브로인이 완전히 용해되지 않는 문제가 있다.In the case of the first solubilization step, the solubilization effect is higher than that in the case of simply dissolving calcium hydrogen carbonate and ammonium hydroxide and using it as a solvent. However, in the first step of solubilization, there is a problem that the silk fibroin is not completely dissolved.
본 발명자들은 혼합용매를 변경하면 다양한 반복실험을 진행하였는데, 그 과정에서 우연히 실수로 고점도의 용액이 제조 되었고, 이 경우 추가적인 가용화가 진행될 수 있다는 점을 발견하게 되었다. 이에 따라 점도를 조절하는 공정을 정량화 하여 가용화 가용화 제2 단계 이후의 세부 공정을 완성하였다.The present inventors conducted various repetition experiments when the mixed solvent was changed, and in the process, a high-viscosity solution was accidentally prepared, and in this case, it was discovered that additional solubilization may proceed. Accordingly, the process of adjusting the viscosity was quantified to complete the detailed process after the second step of solubilization solubilization.
한편, 상기 제1 가용화 단계 이후에 상기 제2 가용화 단계에 따라 혼합용액 및 실크 피브로인 혼합물의 점도를 높이고, 상기 제3 가용화 단계에 따라 일정한 수준의 점도 범위에 도달하면, 일정 시간을 방치하여 고점도의 피브로인 혼합물의 구조가 안정화 및 수화될 수 있도록 한다.On the other hand, after the first solubilization step, the viscosity of the mixture solution and the silk fibroin mixture is increased according to the second solubilization step, and when a certain level of viscosity range is reached according to the third solubilization step, a certain period of time is left to stand for high viscosity. Allows the structure of the fibroin mixture to stabilize and hydrate.
상기 점도를 높이는 방법은 점증제를 사용하거나, 열처리 또는 압력, 온도 조절 등의 방법으로 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 사용할 수 있는 방법을 모두 포함한다. The method for increasing the viscosity includes all methods that can be used by a person having ordinary knowledge in the field by using a thickener, heat treatment or pressure, temperature control, or the like.
바람직하게 상기 점도 조절은 혼합용액 및 실크 피브로인 혼합물을 가열 및 감압한 뒤 온도를 낮추는 방법으로 점도를 높이는 것일 수 있다. 이 경우 실크 피브로인이 적은 량의 용매와 충분히 수화되면서 안정화 될 수 있다.Preferably, the viscosity control may be to increase the viscosity by heating and depressurizing the mixture solution and the silk fibroin mixture, and then lowering the temperature. In this case, the silk fibroin can be stabilized while being sufficiently hydrated with a small amount of solvent.
바람직하게 가용화 제3 단계에 있어서 상기 점도는 30 내지 80 cP인 것일 수 있다. 30 cP 미만인 경우 충분한 수화가 진행되지 않아 가용화 제4 단계를 진행하여도 용해되지 않은 피브로인이 남는다는 문제가 있고, 80cP를 초과하는 경우 피브로인끼리 엉겨 붙으면서 수화되지 않고 오히려 딱딱하게 굳어지는 부분이 생기기 때문에 가용화 제4 단계를 진행하여도 용해되지 않는 잔유물이 상당히 발생한다는 문제가 있다.Preferably, in the third step of solubilization, the viscosity may be 30 to 80 cP. If it is less than 30 cP, there is a problem that sufficient hydration does not proceed and solubilization of fibroin remains even when the solubilization is performed in the fourth step. There is a problem in that the residue that does not dissolve is significantly generated even in the fourth step of solubilization.
바람직하게 상기 실크 피브로인 가용화 방법에 있어서, 상기 가용화 단계는 상기 실크 피브로인, 탄산수소칼슘을 포함하고 상기 탄산수소칼슘 100 중량부에 대하여 수산화 암모늄 10 내지 50 중량부; 및 자일나아제, 소르비톨, 만니톨의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 1 내지 5 중량부가 포함된 혼합용액이 혼합되는 가용화 제1 단계; 실크 피브로인과 혼합용액의 혼합물을 교반하면서, 상기 혼합물에 열처리 후 온도 조절을 하여 상기 혼합물의 점도를 높이는 가용화 제2 단계; 및 상기 혼합물의 점도가 30 내지 80 cP가 되면, 방치하는 가용화 제3 단계; 상기 혼합물에 물을 혼합하는 가용화 제4 단계를 포함하는 것일 수 있다. 이에 의하는 경우 가용화 단계에서 잔유물 없이 실크 피브로인이 용해될 수 있을 뿐만 아니라, 실크 피브로인에 상대적으로 적은 량의 용매를 사용하여도 상기 실크 피브로인이 용해되게 할 수 있다.Preferably in the method for solubilizing the silk fibroin, the solubilizing step includes the silk fibroin, calcium hydrogen carbonate, and 10 to 50 parts by weight of ammonium hydroxide with respect to 100 parts by weight of the calcium hydrogen carbonate; And xylase, sorbitol, and a first step of solubilizing the mixed solution containing 1 to 5 parts by weight of any one selected from the group consisting of mannitol; A second solubilization step of increasing the viscosity of the mixture by stirring the mixture of silk fibroin and the mixed solution and adjusting the temperature after heat treatment to the mixture; And a third step of solubilization when the viscosity of the mixture becomes 30 to 80 cP; It may be to include a fourth step of solubilizing the water in the mixture. In this case, silk fibroin can be dissolved without residue in the solubilization step, and the silk fibroin can be dissolved even when a relatively small amount of solvent is used for the silk fibroin.
바람직하게 상기 실크 피브로인 가용화 방법에 있어서, 상기 가용화 제1 단계 이전에 상기 실크 피브로인에 대하여 에탄올을 혼합하는 전처리 단계를 포함하는 것일 수 있다.Preferably, in the method for solubilizing the silk fibroin, the solubilizing step may include a pretreatment step of mixing ethanol with respect to the silk fibroin.
상기 전처리 단계를 진행하는 경우 상기 가용화 제 2단계에서 피브로인 끼지 들러붙지 않고 적은 량의 용매와 접촉되면서 효과적으로 수화될 수 있게 된다. 이에 따라 제4 단계에서 석출 등의 문제 없이 공정 재현성을 안정적으로 유지하게 할 수 있게 된다.When the pretreatment step is performed, the solubilization in the second step can be effectively hydrated while being in contact with a small amount of solvent without sticking fibroin. Accordingly, in the fourth step, process reproducibility can be stably maintained without problems such as precipitation.
더 바람직하게 상기 전처리 단계는 상기 실크 피브로인에 대하여 에탄올 및 레시틴을 포함하는 전처리제를 혼합하는 것일 수 있다. 이 경우 가용화 단계에서 고 점도에 의한 수화가 효과적으로 진행될 수 있을 뿐만 아니라. 에탄올에 의하여 직접적으로 분해되는 실크 피브로인을 최소화 할 수 있다. 이에 따라 동일한 가수분해 과정을 진행한 경우 최종 생성물이 염화칼슘을 사용하여 실크 피브로인을 용해한 경우와 같은 성상 및 물성이 되게 할 수 있다.More preferably, the pre-treatment step may be to mix the pre-treatment agent containing ethanol and lecithin with respect to the silk fibroin. In this case, not only can the hydration by high viscosity be effectively performed in the solubilization step. It is possible to minimize silk fibroin, which is directly decomposed by ethanol. Accordingly, when the same hydrolysis process is performed, the final product may have properties and properties as in the case of dissolving silk fibroin using calcium chloride.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 실크 피브로인 가수분해물의 제조방법은 누에고치와 정제수를 혼합하고 열처리하여 세리신(sericin)이 제거하고 실크 피브로인을 수득하는 세리신 제거단계; 실크 피브로인을 탄산수소칼슘을 포함하는 혼합 용액에 용해하는 가용화 단계; 상기 용해물에서 혼합용액을 제거하는 정제단계; 및 상기 정제단계에서 얻어진 실크 피브로인 용해물을 단백질 가수분해 효소 또는 산으로 가수분해 하는 단계;를 포함하는 것일 수 있다.Method for producing a silk fibroin hydrolyzate according to another embodiment of the present invention is a sericin removal step of mixing the cocoon and purified water and heat treatment to remove sericin and obtain silk fibroin; A solubilizing step of dissolving the silk fibroin in a mixed solution containing calcium hydrogen carbonate; A purification step of removing the mixed solution from the lysate; And hydrolyzing the silk fibroin lysate obtained in the purification step with a proteolytic enzyme or acid.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 식품은 상기 실크 피브로인 또는 상기 실크 피브로인 가수분해물을 포함하는 것일 수 있다.The food product according to another embodiment of the present invention may include the silk fibroin or the hydrolyzate of the silk fibroin.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 인지기능장애 예방 또는 개선용 의약품은 상기 실크 피브로인 또는 상기 실크 피브로인 가수분해물을 포함하는 것일 수 있다.The pharmaceutical product for preventing or improving cognitive dysfunction according to another embodiment of the present invention may include the silk fibroin or the hydrolyzate of the silk fibroin.
상기 인지기능장애는 치매, 학습장애, 실인증, 건망증, 실어증, 실행증, 섬망, AIDS 유발 치매, 빈스완거 병, 루이소체 치매, 전두측두엽성 치매, 경도 인지 장애, 다발성 경색성 치매, 픽병, 의미치매, 알츠하이머성 치매 또는 혈관성 치매로 구성된 군으로부터 선택된 것일 수 있다.The cognitive dysfunction is dementia, learning disability, real certification, forgetfulness, aphasia, agonism, delirium, AIDS-induced dementia, Vincewaner's disease, Lewy body dementia, frontotemporal dementia, mild cognitive impairment, multiple infarct dementia, pick disease, meaning It may be selected from the group consisting of dementia, Alzheimer's dementia or vascular dementia.
본 발명은 실크 피브로인을 가용화 하는 방법 및 상기 실크 피브로인을 가수분해하는 방법을 제공한다.The present invention provides a method for solubilizing silk fibroin and a method for hydrolyzing the silk fibroin.
본 발명은 실크 피브로인의 가용화에 사용되는 염화칼슘을 사용하지 않고 실크 피브로인을 가용화 할 수 있는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명에서 개시하는 실크 피브로인을 가용화 하는 방법에 의하는 경우 고순도 염화칼슘을 사용하지 않으면서도 실크 피브로인이 염화칼슘으로 가용화 된 경우와 동일한 물성 및 성상의 최종 생산물을 얻을 수 있다.The present invention provides a method for solubilizing silk fibroin without using calcium chloride used for solubilizing silk fibroin. In particular, in the case of using the method for solubilizing the silk fibroin disclosed in the present invention, the final product of the same physical properties and properties as in the case where the silk fibroin is solubilized with calcium chloride can be obtained without using high-purity calcium chloride.
본 발명은 고순도 실크 피브로인의 가용화에 고순도 염화칼슘을 대체함으로서 국내 소재응용 분야에 있어 일본산 소재의 의존도를 줄일 수 있도록 할 수 있다.The present invention can reduce the dependence of Japanese materials in the field of domestic material application by replacing high-purity calcium chloride in solubilization of high-purity silk fibroin.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 흐름도에 관한 것이다.
도 2은 본 발명의 일 실시예에 따른 흐름도에 관한 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 실크 펩타이드의 인지기능 및 기억력 개선효과 실험에 관한 것이다.1 is related to a flow chart according to an embodiment of the present invention.
2 relates to a flow chart according to an embodiment of the present invention.
Figure 3 relates to the experiment of improving the cognitive function and memory of the silk peptide according to an embodiment of the present invention.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail so that those skilled in the art to which the present invention pertains can easily practice. However, the present invention can be implemented in many different forms and is not limited to the embodiments described herein.
[제조예 1: 혼합용액의 제조][Production Example 1: Preparation of mixed solution]
가용화 제1 단계에서 사용할 수 있는 혼합용액을 평가하기 위하여 세리신이 제거된 실크 피브로인을 하기의 표 1과 같은 혼합용매를 사용하여 용해과정을 진행하였다. 동일한 온도로 열처리를 진행하면서 실크피브로인의 5배의 질량비가 되도록 용매로 사용되는 혼합용액을 혼합하였다.In order to evaluate the mixed solution that can be used in the first step of solubilization, the dissolution process was performed by using the mixed solvent shown in Table 1 below for silk fibroin with sericin removed. While the heat treatment was performed at the same temperature, a mixed solution used as a solvent was mixed so as to have a mass ratio of 5 times that of silk fibroin.
(단위: 중량부)(Unit: parts by weight)
- W1: 염화칼슘-W1: calcium chloride
- W2: 탄산수소칼슘-W2: calcium hydrogen carbonate
- W3: 수산화 암모늄-W3: Ammonium hydroxide
- W4: 자일나아제, 소르비톨, 만니톨 혼합물-W4: xylase, sorbitol, mannitol mixture
[실험예 1: 혼합용액의 평가][Experimental Example 1: Evaluation of mixed solution]
가용화 제1 단계로서, 혼합용을 사용한 경우로서 각 혼합용액의 사용한 결과를 유관으로 평가하여 그 용해되는 정도를 평가하였다. 객관적인 비교를 위하여 일반적으로 사용되는 T1의 값을 100으로 하고, 이와 비교하여 용해된 정도(수화된 정도)를 5인의 관찰자가 지수로 평가하고 그 결과 값을 평균으로 나타내었다. 하기의 지수는 100에 가까울수록 수화 정도가 우수한 것이다.As the first step of solubilization, when a mixed solution was used, the result of using each mixed solution was evaluated by duct to evaluate the degree of dissolution. For objective comparison, the value of T1, which is generally used, is set to 100, and the degree of dissolution (dehydration) is evaluated by an index of 5 observers and the result is averaged. The following index is closer to 100, the better the degree of hydration.
상기 [표 2]를 참조하면, 위 Q1 내지 Q2에 의하는 경우 다른 실험에서 염화나트륨과 탄산나트륨을 사용한 경우에 비하여 용해 정도가 우수하다는 사실을 확인할 수 있었다. 또한 Q2 내지 Q4에 의하는 경우 수화되는 정도가 소폭 상승한다는 사실을 확인할 수 있다, 특히 다른 실험에서 염화나트륨과 탄산나트륨을 사용한 경우와 마찬가지로 Q7에 의하는 경우 추가적인 상승효과를 낼 수 있다는 점을 확인할 수 있다.Referring to [Table 2] above, it was confirmed that in the case of Q1 to Q2 above, the degree of dissolution was superior to that of sodium chloride and sodium carbonate in other experiments. In addition, it can be confirmed that the degree of hydration is slightly increased in the case of Q2 to Q4. In particular, it can be confirmed that, in the other experiments, as in the case of using sodium chloride and sodium carbonate, Q7 can have an additional synergistic effect. .
위의 공정에 있어서, Q7이 가장 우수하고, 위 혼합용매로를 사용하는 경우 염화나트륨과 탄산나트륨을 사용한 경우에 비하여 상대적으로 우수하다고 볼 수 있으나, 염화칼슘을 충분히 대체하는데 다소 부족한 정도의 효과가 나타나다는 점을 확인할 수 있다.In the above process, Q7 is the best, and when using the above mixed solvent furnace, it can be regarded as relatively superior compared to the case where sodium chloride and sodium carbonate are used, but it has a somewhat insufficient effect to sufficiently replace calcium chloride. can confirm.
따라서 혼합되는 혼합용매의 용량을 그대로 유지하고, 가용화 제2 단계 이후의 공정단계를 추가적으로 진행하였다.Therefore, the capacity of the mixed solvent to be mixed was maintained, and the process step after the second step of solubilization was further performed.
[제조예 2: 가용화 공정][Production Example 2: Solubilization Process]
하기의 가용화 공정에 있어, 전처리 단계 S0, 가용화 제 1단계는 S1, 가용화 제 2단계는 S2, 가용화 제3 단계는 S3, 가용화 제4 단계는 S4로 표기하였다.In the following solubilization process, the pretreatment step S0, the first solubilization step S1, the second solubilization step S2, the third solubilization step S3, and the fourth solubilization step were designated as S4.
각 가용화 제2 내지 제3단계의 공정조건의 변경에 따라 실크 피브로인의 가용화 정도를 평가하였다.The degree of solubilization of silk fibroin was evaluated by changing the process conditions in each of the second to third solubilization steps.
- S0A: 실크피브로인에 에탄올 혼합-S0A: Mix ethanol with silk fibroin
- S0B: 실크피브로인에 에탄올 및 레시틴 혼합-S0B: Silk fibroin mixed with ethanol and lecithin
- S1A: Q7을 용매로 사용하고, 용매 : 실크 피브로인 = 5 : 1의 질량비로 혼합.-S1A: Q7 is used as a solvent, and mixed in a mass ratio of solvent: silk fibroin = 5: 1.
- S2A: 실크 피브로인 및 용매 혼합물을 교반하면서 가열 후 감압하면서, 온도를 낮추면서 점도를 조절.-S2A: heating the silk fibroin and solvent mixture while stirring, and then reducing the pressure while controlling the viscosity while reducing the temperature.
- S3A: 실크 피브로인 및 용매 혼합물의 점도를 5cP로 조절하고, 1시간 동안 방치함.-S3A: the viscosity of the silk fibroin and solvent mixture was adjusted to 5 cP and left for 1 hour.
- S3B: 실크 피브로인 및 용매 혼합물의 점도를 30cP로 조절하고, 1시간 동안 방치함.-S3B: the viscosity of the silk fibroin and solvent mixture was adjusted to 30 cP and left for 1 hour.
- S3C: 실크 피브로인 및 용매 혼합물의 점도를 50cP로 조절하고, 1시간 동안 방치함.-S3C: The viscosity of the silk fibroin and solvent mixture was adjusted to 50 cP and left for 1 hour.
- S3D: 실크 피브로인 및 용매 혼합물의 점도를 80cP로 조절하고, 1시간 동안 방치함.-S3D: the viscosity of the silk fibroin and solvent mixture was adjusted to 80 cP and left for 1 hour.
- S3E: 실크 피브로인 및 용매 혼합물의 점도를 300cP로 조절하고, 1시간 동안 방치함.-S3E: The viscosity of the silk fibroin and solvent mixture was adjusted to 300 cP and left for 1 hour.
- S4A: 점도가 조절된 혼합물에 물을 혼합하여 교반하여 가용화 진행.-S4A: Solubilization proceeds by mixing and stirring water in a mixture having a controlled viscosity.
[실험예 2-1: 용해도 평가] [Experimental Example 2-1: Solubility Evaluation]
상기 [표 3]에 따른 공정별 실크피브로인의 용해 정도를 평가하였다. 객관적인 평가를 위하여 염화칼슘으로 용해시킨 경우(T1)와 비교하여 용해 정도, 잔유물을 유관으로 평가하여 하기의 [표 4]에 나타내었다. 객관적인 비교를 위하여 5인의 시험자가 관찰한 결과값을 평균으로 나타내었으며, T1을 100으로 하고 용해 정도가 우수할수록 높은 수치로 평가되게 하였다.The degree of dissolution of silk fibroin by process according to [Table 3] was evaluated. For objective evaluation, the degree of dissolution and the residue were evaluated in relation to the case of dissolving with calcium chloride (T1) and shown in Table 4 below. For objective comparison, the results observed by five testers were shown as the average, and T1 was set to 100 and the higher the dissolution degree, the higher the evaluation value.
상기 [표 4]를 참조하면, R1에 의하는 경우 점도 조절에 의한 효과가 나타나지 않는다는 점을 확인할 수 있다. 반면, R2 내지 R4에 의하는 경우에는 혼합물을 일정한 점도범위로 상승시킨 뒤 일정하게 방치하는 경우 고점도에 의한 수화 및 안정화의 진행으로 이후 용해되지 않던 실크 피브로인이 용해된다는 사실을 확인할 수 있다. 한편, R5에 의하는 경우 굳어진 실크 피브로인이 생성되어 물을 혼합하여도 풀어지지 않아 용해 정도를 평가할 수가 없었다.Referring to [Table 4] above, it can be confirmed that the effect by the viscosity control does not appear in the case of R1. On the other hand, in the case of R2 to R4, it can be confirmed that the silk fibroin, which was not dissolved afterwards, is dissolved due to the progress of hydration and stabilization by high viscosity when the mixture is raised to a certain viscosity range and then left constant. On the other hand, in the case of R5, a hardened silk fibroin was produced, and it was not released even when water was mixed, so that the degree of dissolution could not be evaluated.
또한 R6, R7에 의하는 경우 사실상 염화칼슘을 대체할 정도의 효과를 낼 수 있다는 점을 확인할 수 있었다. 또한 고점도 상태에서 교반이 보다 원활히 진행될 수 있었기 때문에 해당 공정을 스케일 업하여 대형화 하는 경우 우수한 공정효율을 나타낼 수 있을 것으로 예상된다.In addition, it was confirmed that in the case of R6 and R7, the effect of replacing calcium chloride can be effectively achieved. In addition, since the agitation could proceed more smoothly in a high-viscosity state, it is expected to show excellent process efficiency when the process is scaled up and enlarged.
특히 R7의 경우 염화칼슘과 동일한 정도의 용해능을 나타내는 것을 확인할 수 있었으며, 최종적으로 생성된 용해물이 T1와 거의 유사하여 실질적으로 T1을 대체할 수 있을 것으로 예상된다. 또한 대량 생산 공정을 목적으로 한 스케일 업 단계에서도 높은 공정 효율을 보여줄 수 있을 것으로 예상된다. Particularly, in the case of R7, it was confirmed that it exhibits the same dissolving ability as calcium chloride, and it is expected that the finally produced lysate is almost similar to T1 and can substantially replace T1. It is also expected to show high process efficiency in the scale-up stage aimed at mass production processes.
[실험예 2-2: 실크 펩타이드의 효과 실험] [Experimental Example 2-2: Effect test of silk peptide]
염화칼슘이 없이 가용화 단계를 진행한 경우 가수분해단계를 거쳐 최종적으로 생산된 실크 펩타이드가 종래의 염화칼슘으로 가용화를 진행한 경우와 동일한 효과를 나타내는지 확인하기 위하여 하기의 [표 5]와 같은 가수분해효소로 상기 T1, R3, R7에 의하여 제조된 실크 피브로인을 가수분해 하여 실크 펩타이드를 제조하였다.When the solubilization step is performed without calcium chloride, the hydrolyzase as shown in [Table 5] below is used to confirm that the silk peptide finally produced through the hydrolysis step has the same effect as the conventional solubilization with calcium chloride. The silk fibroin produced by T1, R3, and R7 was hydrolyzed to prepare a silk peptide.
- 가수분해 효소 A: 브로멜라인 + 징지바인 혼합효소-Hydrolase A: Bromelain + Genjibine mixed enzyme
- 가수분해 효소 B: 브로멜라인 + 징지바인 + 칼파인 + 우마미자임 혼합효소-Hydrolase B: Bromelain + Zingzivine + Calpine + Umamizyme Mixed Enzyme
인지기능 개선에 대한 동물 모델 실험Animal model experiment for cognitive improvement
A. 실험 동물의 준비A. Preparation of experimental animals
실험 동물은 웅성 백서 (Sprague Dawley, 140 내지 180 g, 대한실험동물센터)로서, 이들은 일정한 환경 (실내온도 25±1℃, 상대습도 60±10%)에서 일주일 동안 하나의 사육 상자 당 4 마리씩 넣어 물은 제한 없이 제공하였으며, 이때, 몸무게의 80%를 유지하도록 제한 급식을 실시하였다. 본 실험에서는 총 50 마리를 사용하였다. 훈련 3일 전부터 5분씩 미로에 적응시켜 검사를 진행하였다.The experimental animals are male white paper (Sprague Dawley, 140-180 g, Korea Laboratory Animal Center), and they are put in 4 animals per breeding box for a week in a constant environment (room temperature 25 ± 1 ℃,
B. 교대 지연 검사(delayed alternation test)B. delayed alternation test
총 세 개의 통로(왼쪽, 오른쪽, 중앙부)가 있으며, 각 통로 입구는 실험자가 동물의 출입을 통제할 수 있도록 칸막이를 설치한 T자 모양의 미로를 준비하였다.There are a total of three passages (left, right, and center), and each passage entrance is prepared with a T-shaped labyrinth with partitions to allow the experimenter to control the entry and exit of animals.
첫 시행에서는 출발 상자에 1분간 적응시켰다. 첫 시행은 '강제 선택 시행'으로, 칸막이로 한쪽 통로를 막아놓고 반대편 통로에 동물이 들어가면 칸막이로 후방을 막았다. 동물의 사지가 통로 입구를 통과하면 동물이 들어간 것으로 간주하였다. 60초간 동물이 해당 통로에서 먹이를 먹도록 하였다.In the first trial, the starting box was adapted for 1 minute. The first trial was a 'forced selection trial', where one passage was blocked with a partition and the back was blocked with a partition when an animal entered the other passage. Animals were considered to have entered when the limbs of the animals had passed through the entrance to the passage. Animals were fed for 60 seconds in the passage.
다음 시행부터는 '자유 선택 시행'으로 동물이 출발상자에서 출발하여 자유롭게 통로의 방향(왼쪽 혹은 오른쪽)을 선택하도록 하였다. 동물은 바로 이전의 시행에서 들어갔던 통로와 반대편 통로로 들어갔을 경우에만 먹이 보상을 하였다.From the next trial, the 'free selection trial' allowed the animals to freely select the direction of the passage (left or right) starting from the starting box. Animals were compensated for prey only when they entered the passage from the previous trial and into the other.
시행 간격은 5초 및 20초로 지연 시간(delay)를 두고 구성되며, 매 시행의 제한시간(cut-off time)은 60초로 하였다. 동물이 강화가 주어지는 통로에 정확하게 들어간 횟수와 통로까지 들어가는데 걸린 시간을 측정하였다. 하루에 10 시행식 9일 동안 동일한 절차를 수행하여 평가하였다.The interval between trials was 5 seconds and 20 seconds with a delay, and the cut-off time for each trial was 60 seconds. The number of times the animal entered the passage through which the reinforcement was given and the time taken to enter the passage were measured. The same procedure was performed for 9 days of 10 trials a day to evaluate.
C. 투여 방법C. Method of administration
본 발명의 제조방법에 따라 제조된 실크 펩타이드 B1 내지 B3, C1 내지 C3를 100 ㎎/㎖의 용액으로 제조하여 구강 투여하였다. 모든 시료들은 증류수에 용해하여 구강 투여하였다.Silk peptides B1 to B3, C1 to C3 prepared according to the preparation method of the present invention were prepared as a solution of 100 mg / ml and administered orally. All samples were dissolved in distilled water and administered orally.
D. 인지 기억 평가 결과D. Results of cognitive memory evaluation
실크 펩타이드 B1 내지 B3, C1 내지 C3을 투여한 군에 대해 T-maze 실험을 진행한 결과를 하기의 [도 3]에 나타내었다. 도 3은 시행 간격을 5초로 구성하여 실험을 진행한 것으로, 9일 간의 훈련 기간 동안 성능이 점차적으로 향상되었다.The results of the T-maze experiment for the groups to which the silk peptides B1 to B3 and C1 to C3 were administered are shown in [Fig. 3] below. 3, the experiment was conducted by configuring the trial interval as 5 seconds, and the performance gradually improved during the training period of 9 days.
하기의 [도 3]을 참조하면, 본 발명에 따라 제조된 실크 펩타이드는 염화칼슘으로 용해 및 가수분해한 경우와 동일한 정도의 활성을 나타낸다는 점을 확인할 수 있다. Referring to [FIG. 3] below, it can be confirmed that the silk peptide prepared according to the present invention exhibits the same level of activity as when dissolved and hydrolyzed with calcium chloride.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.Although the preferred embodiments of the present invention have been described in detail above, the scope of the present invention is not limited thereto, and various modifications and improvements of those skilled in the art using the basic concept of the present invention defined in the following claims are also provided. It belongs to the scope of rights.
Claims (5)
실크 피브로인을 염화나트륨을 포함하는 혼합 용액에 용해하는 가용화 단계; 및
상기 용해물에서 혼합용액을 제거하는 단계를 포함하는 것이고,
상기 가용화 단계는,
실크 피브로인에 탄산수소칼슘을 포함하고 상기 탄산수소칼슘 100 중량부에 대하여 수산화 암모늄 10 내지 50 중량부; 및 자일나아제, 소르비톨, 만니톨의 혼합물 1 내지 5 중량부가 포함된 혼합용액이 혼합되는 가용화 제1 단계;
실크 피브로인과 혼합용액의 혼합물을 교반하면서, 상기 혼합물에 열처리 후 온도 조절을 하여 상기 혼합물의 점도를 높이는 가용화 제2 단계;
및 상기 혼합물의 점도가 30 내지 80 cP가 되면, 방치하는 가용화 제3 단계; 및
상기 혼합물에 물을 혼합하는 가용화 제4 단계를 포함하고
상기 실크 피브로인은 식품용인 것인
실크 피브로인 가용화 방법.A sericin removal step of mixing cocoon and purified water and heat-treating to remove sericin and obtaining silk fibroin;
Solubilizing the silk fibroin in a mixed solution containing sodium chloride; And
And removing the mixed solution from the lysate.
The solubilization step,
A silk fibroin containing calcium hydrogen carbonate and 10 to 50 parts by weight of ammonium hydroxide relative to 100 parts by weight of the calcium hydrogen carbonate; And a solubilizing first step in which a mixed solution containing 1 to 5 parts by weight of a mixture of xylase, sorbitol, and mannitol is mixed;
A second solubilization step of increasing the viscosity of the mixture by stirring the mixture of silk fibroin and the mixed solution and adjusting the temperature after heat treatment to the mixture;
And a third step of solubilization when the viscosity of the mixture becomes 30 to 80 cP; And
A fourth step of solubilizing water in the mixture,
The silk fibroin is for food
Silk fibroin solubilization method.
실크 피브로인을 염화나트륨을 포함하는 혼합 용액에 용해하는 가용화 단계;
상기 용해물에서 혼합용액을 제거하는 정제단계; 및
상기 정제단계에서 얻어진 실크 피브로인 용해물을 단백질 가수분해 효소 또는 산으로 가수분해 하는 단계;를 포함하는 것이고,
상기 가용화 단계는,
실크 피브로인에 탄산수소칼슘을 포함하고 상기 탄산수소칼슘 100 중량부에 대하여 수산화 암모늄 10 내지 50 중량부; 및 자일나아제, 소르비톨, 만니톨의 혼합물 1 내지 5 중량부가 포함된 혼합용액이 혼합되는 가용화 제1 단계;
실크 피브로인과 혼합용액의 혼합물을 교반하면서, 상기 혼합물에 열처리 후 온도 조절을 하여 상기 혼합물의 점도를 높이는 가용화 제2 단계;
및 상기 혼합물의 점도가 30 내지 80 cP가 되면, 방치하는 가용화 제3 단계; 및
상기 혼합물에 물을 혼합하는 가용화 제4 단계를 포함하고
가수분해된 실크 피브로인은 기억력 및 인지기능 개선용 식품인 것인
실크 피브로인 가용화 방법.A sericin removal step of mixing cocoon and purified water and heat-treating to remove sericin and obtaining silk fibroin;
Solubilizing the silk fibroin in a mixed solution containing sodium chloride;
A purification step of removing the mixed solution from the lysate; And
Including the step of hydrolyzing the lysate silk fibroin obtained in the purification step with a proteolytic enzyme or acid;
The solubilization step,
A silk fibroin containing calcium hydrogen carbonate and 10 to 50 parts by weight of ammonium hydroxide relative to 100 parts by weight of the calcium hydrogen carbonate; And a solubilizing first step in which a mixed solution containing 1 to 5 parts by weight of a mixture of xylase, sorbitol, and mannitol is mixed;
A second solubilization step of increasing the viscosity of the mixture by stirring the mixture of silk fibroin and the mixed solution and adjusting the temperature after heat treatment to the mixture;
And a third step of solubilization when the viscosity of the mixture becomes 30 to 80 cP; And
A fourth step of solubilizing water in the mixture,
Hydrolyzed silk fibroin is a food for improving memory and cognitive function
Silk fibroin solubilization method.
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