KR102107826B1 - Composition comprising mesenchymal stem cell or activin A for treating degenerative brain disease - Google Patents
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Abstract
중간엽 줄기세포, 그의 용해물, 또는 그의 추출물, 또는 액티빈 A를 포함하는 약학적 조성물은 뇌 내, 예를 들면 뇌실하구역의 신경줄기세포의 분화를 증가시키고, 퇴행성 뇌질환을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.Pharmaceutical compositions comprising mesenchymal stem cells, lysates thereof, or extracts thereof, or activin A, can be usefully used to increase the differentiation of neuronal stem cells in the brain, for example, the subventricular zone, and to treat degenerative brain diseases You can.
Description
중간엽 줄기세포 또는 액티빈 A(activin A)를 포함하는 신경줄기세포의 분화를 촉진시키고, 퇴행성 뇌질환을 치료하기 위한 조성물에 관한 것이다.It relates to a composition for promoting the differentiation of mesenchymal stem cells or neural stem cells containing activin A, and treating degenerative brain diseases.
알츠하이머 병(alzheimer's disease)은 주로 노년에 발생하는 비가역적인 퇴행성 뇌신경질환으로 뇌신경의 손상으로 인하여 발병한다. 기억력 감퇴와 함께 여러 인지 기능 이상을 동반하며, 신경세포 소실로 인한 뇌피질의 위축 현상이 나타난다. Alzheimer's disease is an irreversible degenerative cranial nerve disease that occurs mainly in old age and is caused by damage to the brain. Along with memory decline, it is accompanied by various cognitive abnormalities and atrophy of the brain cortex due to loss of nerve cells.
신경줄기세포는 성체의 뇌에서 신경생성(neurogenesis) 과정을 통하여 새로운 신경세포로 분화될 수 있으며, 특히 뇌의 뇌실하구역(subventricular zone: SVZ) 및 과립하구역(subgranular zone: SGZ) 두 곳에 집중적으로 존재한다. 하지만 알츠하이머 병을 가진 환자에게서는 신경줄기세포의 성체 신경생성이 저하된다는 보고가 있었다. 이에 최근 알츠하이머 병의 치료방법으로서 신경생성을 증진시키는 방법이 많이 연구되고 있다. 그 중 중간엽 줄기세포를 이용하여 내생 신경생성(endogenous neurogenesis)을 증진시키는 방법으로 알츠하이머 병을 치료하는 것에 관한 많은 연구결과가 보고되고 있다.Neural stem cells can be differentiated into new neurons through the neurogenesis process in the adult brain, especially in the brain's subventricular zone (SVZ) and subgranular zone (SGZ). . However, there have been reports of adult neurogenesis of neural stem cells in patients with Alzheimer's disease. Therefore, recently, a method of improving neurogeneration as a treatment method of Alzheimer's disease has been studied a lot. Among them, a number of studies have been reported on the treatment of Alzheimer's disease by using a mesenchymal stem cell to promote endogenous neurogenesis.
그러나 아직까지 알츠하이머 질환 모델에서 인간 유래 중간엽 줄기세포를 이용하여 뇌실하구역의 신경줄기세포의 분화를 촉진시키는 것에 관한 연구는 진행되지 않았다. However, studies on promoting the differentiation of neural stem cells in the subventricular zone using human-derived mesenchymal stem cells in the Alzheimer's disease model have not been conducted.
일 양상은 중간엽 줄기세포, 그의 용해물, 또는 그의 추출물을 포함하는 퇴행성 뇌질환을 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.One aspect provides a pharmaceutical composition for treating degenerative brain disease, including mesenchymal stem cells, lysates, or extracts thereof.
다른 양상은 액티빈 A를 포함하는 퇴행성 뇌질환을 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.Another aspect provides a pharmaceutical composition for treating degenerative brain disease comprising activin A.
다른 양상은 중간엽 줄기세포, 또는 액티빈 A를 개체에 투여하거나, 또는 인 비트로(in vitro) 상에서 신경줄기세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 신경줄기세포의 분화를 촉진시키는 방법을 제공한다.Another aspect provides a method of promoting differentiation of neural stem cells comprising administering mesenchymal stem cells, or activin A, to a subject, or contacting the neural stem cells in vitro .
일 양상은 중간엽 줄기세포, 그의 용해물, 또는 그의 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.One aspect provides a pharmaceutical composition for preventing or treating degenerative brain disease comprising mesenchymal stem cells, lysates, or extracts thereof as an active ingredient.
용어 "치료"는 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 경감, 진행 억제 또는 예방을 지칭하거나, 그를 포함하며, "유효성분" 또는 "약제학적 유효량"은 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 경감, 진행 억제 또는 예방에 충분한 본원에서 제공되는 발명을 실시하는 과정에서 이용되는 조성물의 임의의 양을 의미할 수 있다.The term "treatment" refers to or includes the reduction, progression or prevention of a disease, disorder or condition, or one or more symptoms thereof, and "active ingredient" or "pharmaceutically effective amount" refers to a disease, disorder or condition, or Any amount of a composition used in the course of practicing the invention provided herein sufficient to alleviate, inhibit or prevent progression of one or more symptoms.
본 명세서에서 용어 "퇴행성 뇌질환(neurodegenerative disease)"은 노화가 진행됨에 따라 뇌조직 또는 뇌세포의 구조 또는 기능이 퇴화되어 발생하는 질병을 의미할 수 있다. 상기 퇴행성 뇌질환의 예로는 알츠하이머병(노인성 치매), 치매, 파킨슨병, 루게릭병, 픽병, 헌팅턴병 또는 타우병증을 포함할 수 있다. As used herein, the term "neurodegenerative disease" may mean a disease caused by deterioration of the structure or function of brain tissue or brain cells as aging progresses. Examples of the degenerative brain disease may include Alzheimer's disease (senile dementia), dementia, Parkinson's disease, Lou Gehrig's disease, Pick disease, Huntington's disease or tauopathy.
본 명세서에서 용어, "알츠하이머 병"이란 노인성 치매와 호환적으로 사용되고, 노인성 플라크, 신경염증 엉킴(tangles), 및 진행성 신경 손실로 특징되는 특정 퇴행성 뇌질환과 관련된 정신적인 퇴화를 수반하는 질병을 의미할 수 있다. As used herein, the term "Alzheimer's disease" refers to a disease that is used interchangeably with senile dementia and involves mental degeneration associated with certain degenerative brain diseases characterized by senile plaques, neuroinflammatory tangles, and progressive neuronal loss. can do.
본 명세서에서 용어 "파킨슨병"이란 종종 운동 기능 및 언어능력을 손상시키는 중추 신경계의 만성 및 진행성 퇴행성 질환을 의미할 수 있다. As used herein, the term "Parkinson's disease" may refer to chronic and progressive degenerative diseases of the central nervous system that often impair motor function and speech ability.
본 명세서에서 용어 "헌팅턴병"이란 헌팅턴 단백질을 암호화하는 유전자 내 3 염기 반복 팽창에 의해 야기되어, 무도증, 정신이상, 치매 등이 수반되는 신경퇴행성 질환을 의미할 수 있다. The term "Huntington's disease" in the present specification may refer to a neurodegenerative disease caused by 3-base repeated expansion in a gene encoding the Huntington protein, and accompanied by chorea, psychosis, and dementia.
본 명세서에서 용어 "루게릭병"이란 운동신경세포만 선택적으로 사멸되는 질환으로 대뇌 피질의 상위운동신경세포와 뇌간 및 척수의 아래운동신경세포 모두가 점차적으로 파괴되는 질환을 의미할 수 있다. As used herein, the term "ALS" is a disease in which only motor neurons are selectively killed, and may mean a disease in which both upper motor neurons of the cerebral cortex and lower motor neurons of the brain stem and spinal cord are gradually destroyed.
본 명에서에서 용어 "픽병(pick's disease)"는 뇌의 신경세포의 진행성 파괴를 나타내는 질환을 의미할 수 있다. As used herein, the term "pick's disease" may mean a disease that indicates progressive destruction of neurons in the brain.
본 발명의 용어 "타우병증"이란 타우 단백질(세포 내 마이크로튜불-관련 단백질과 밀접하게 관련된 패밀리)이 뇌조직에 비정상적으로 축적됨에 의하여 뇌신경이 손상되는 신경퇴행성 질환을 의미할 수 있다. The term "tauopathy" of the present invention may mean a neurodegenerative disease in which cranial nerves are damaged by abnormal accumulation of tau protein (family closely related to microtubule-related proteins in cells) in brain tissue.
본 명세서에서 용어 "중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cell: MSC)는 자기재생능력(self-renewal)과 줄기세포능(stemness maintenance)을 유지하고 다양한 간엽 조직으로 분화할 수 있는 세포를 의미할 수 있고, 포유류, 예를 들면 인간을 포함한 동물의 중간엽 줄기세포를 포함할 수 있다. 또한, 상기 중간엽 줄기세포는 탯줄 유래, 제대혈 유래, 골수 유래, 태반 유래, 또는 지방 유래 중간엽 줄기세포인 것일 수 있다. 상기 탯줄은 포유류의 태아가 태반에서 성장할 수 있도록 모체와 배를 연결해주는 줄을 의미할 수 있으며, 일반적으로 와튼 젤리(Wharton's Jelly)로 둘러싸인 3개의 혈관, 즉, 2개의 배꼽 동맥과 1개의 배꼽 정맥으로 구성된 조직을 의미할 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 상기 중간엽 줄기세포는 제대 또는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다. 중간엽 줄기세포의 분리는 통상의 당업자에게 자명한 방법으로 수행될 수 있으며, 예를 들면, Pittenger 등(Science 284: 143, 1997)와 van 등(J. Clin. Invest., 58: 699, 1976)의 문헌들에 개시되어 있다. 상기 중간엽 줄기세포는 액티빈 A(activin A) 또는 그의 활성 단편을 분비하거나, 또는 이를 분비하도록 유전적으로 조작된 것일 수 있다. As used herein, the term "Mesenchymal Stem Cell (MSC)" may mean a cell capable of maintaining self-renewal and stem cell maintenance and differentiating into various mesenchymal tissues. , May include mesenchymal stem cells of mammals, eg, animals, including humans, wherein the mesenchymal stem cells are umbilical cord-derived, cord blood-derived, bone marrow-derived, placenta-derived, or fat-derived mesenchymal stem cells. The umbilical cord may mean a line connecting the mother and the belly so that the mammalian fetus can grow in the placenta, and is generally 3 blood vessels surrounded by Wharton's Jelly, that is, 2 belly arteries and 1 It may mean a tissue composed of a umbilical vein of a dog Thus, in the present specification, the mesenchymal stem cells may be mesenchymal stem cells derived from umbilical cord or umbilical cord blood. Separation of the cells can be carried out in a manner obvious to those skilled in the art, for example, Pittenger et al. (Science 284: 143, 1997) and van et al. (J. Clin. Invest., 58: 699, 1976). The mesenchymal stem cells may secrete activin A or an active fragment thereof, or may be genetically engineered to secrete it.
본 명세서에서 용어 "액티빈 A(activin A)"는 뇌하수체의 FSH의 생합성 및 분비를 활성화하는 호르몬의 일종으로, 세포 증식, 분화, 세포사멸, 면역 반응, 및 상처 복구 등에 관여하는 것으로 알려져 있는 단백질을 의미한다. 액티빈은 3종으로 분류될 수 있는데, 그 중 액티빈 A는 두 개의 인히빈 βA 서브유닛의 이합체를 의미한다. 상기 인히빈 βA 서브유닛은 인간의 경우 426 aa 길이의 펩티드일 수 있다. 액티빈 A는 전장 단백질뿐만 아니라 그의 활성 단편이 대안적으로 이용될 수 있다. 또한 상기 액티빈 A 또는 그의 활성 단편은 그를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전적으로 조작된 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 즉, 상기 액티빈 A 또는 그의 활성 단편은 전달 시스템에 탑재되어 있는 것일 수 잇으며, 예를 들면, 액티빈 A 또는 그의 활성 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주 세포 중 포함되어 있는 것일 수 있다. 상기 전달 시스템의 예로는 (ⅰ) 내이키드(naked) 재조합 DNA 분자, (ⅱ) 플라스미드, (ⅲ) 바이러스 벡터, 그리고, (ⅳ) 상기 내이키드 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드를 내포하는 리포좀 또는 니오좀을 포함할 수 있다. The term "activin A" in this specification is a type of hormone that activates biosynthesis and secretion of FSH of the pituitary gland, a protein known to be involved in cell proliferation, differentiation, apoptosis, immune response, and wound repair. Means Activin can be classified into three types, of which activin A refers to a dimer of two inhibin β A subunits. The inhibin β A subunit may be a 426 aa peptide in humans. Activin A may alternatively utilize full-length proteins as well as active fragments thereof. In addition, the activin A or an active fragment thereof can be used as a genetically engineered host cell comprising a nucleotide sequence encoding it. That is, the activin A or the active fragment thereof may be mounted on a delivery system, for example, may be contained in a host cell including a nucleotide sequence encoding activin A or an active fragment thereof. . Examples of the delivery system include (i) a naked DNA molecule, (ii) a plasmid, (i) a viral vector, and (iii) a liposome or a niosome containing the said naked recombinant DNA molecule or plasmid. It can contain.
또한, 본 명세서에서 용어 "유전자 조작 (genetic engineering)" 또는 "유전적으로 조작 (genetically engineered)"은 세포에 대하여 하나 이상의 유전적 변형 (genetic modification)을 도입하는 행위 또는 그에 의하여 만들어진 세포를 나타낸다. 예를 들면, 상기 중간엽 줄기세포 또는 숙주 세포는 액티빈 A 또는 그의 활성 단편의 발현 또는 활성이 증가되도록 유전적으로 조작된 것, 예를 들면, 액티빈 A 또는 그의 활성 단편을 코딩하는 외인성 유전자를 포함하는 것일 수 있다. 상기 활성 증가는 주어진 유전적으로 조작되지 않은 모세포(예, 야생형)가 갖지 않는 또는 갖는 내재적 단백질 또는 효소의 활성에 비해, 동일한 타입의 단백질 또는 효소의 활성이 보다 더 높은 활성을 갖는 것을 의미할 수 있다. 상기 외인성 유전자는, 상기 중간엽 줄기세포 또는 숙주 세포에서 그 모세포에 비하여 언급된 단백질의 활성이 증가되기에 충분한 양으로 발현된 것일 수 있다. 상기 외인성 유전자는 발현 벡터를 통하여 모세포 내로 도입된 것일 수 있다. 또한, 상기 외인성 유전자는 선형 폴리뉴클레오티드 형태로 모세포 내로 도입된 것일 수 있다. 또한, 상기 외인성 유전자는 세포 내에서 발현 벡터 (예, 플라스미드)로부터 발현되는 것일 수 있다. 또한, 상기 외인성 유전자는 안정적인 발현을 위하여 세포 내의 유전물질 (예, 염색체)에 삽입되어 발현되는 것일 수 있다. In addition, the terms "genetic engineering" or "genetically engineered" herein refer to the act of introducing one or more genetic modifications to a cell or a cell made thereby. For example, the mesenchymal stem cell or host cell is genetically engineered to increase the expression or activity of activin A or an active fragment thereof, for example, an exogenous gene encoding activin A or an active fragment thereof It may be included. The increase in activity may mean that the activity of a protein or enzyme of the same type has a higher activity compared to the activity of an intrinsic protein or enzyme possessed or not possessed by a given genetically engineered parental cell (eg, wild type). . The exogenous gene may be expressed in an amount sufficient to increase the activity of the aforementioned protein in the mesenchymal stem cell or host cell compared to the parent cell. The exogenous gene may be introduced into the parent cell through an expression vector. In addition, the exogenous gene may be introduced into the parent cell in the form of a linear polynucleotide. In addition, the exogenous gene may be expressed from an expression vector (eg, plasmid) in cells. In addition, the exogenous gene may be expressed by being inserted into a genetic material (eg, chromosome) in a cell for stable expression.
상기 중간엽 줄기세포는 대안적으로 그의 용해물 또는 그의 추출물이 이용될 수 있다. 상기 용해물 또는 추출물은 세포 그대로를 이용하기 어려운 경우 유용한 대안이 될 수 있으며, 단백질 등을 포함한 세포의 구성 성분을 포함하고 있으므로 본래 세포와 유사하거나 동등한 생물학적 활성을 나타낼 수 있다. 상기 용해물 또는 추출물은 상업적으로 이용가능한 세포 용해 키트, 또는 추출 키트 등을 이용하여 얻을 수 있으며, 또한 액티빈 A를 포함하는 것일 수 있다.The mesenchymal stem cells may alternatively use lysates or extracts thereof. The lysate or extract may be a useful alternative when it is difficult to use the cell as it is, and since it contains components of cells including proteins, etc., it may exhibit similar or equivalent biological activity to the original cell. The lysate or extract may be obtained using a commercially available cell lysis kit, an extraction kit, or the like, and may also include activin A.
상기 약학적 조성물은 뇌실하구역에 투여하기 위한 것일 수 있다. 용어, "투여하는," "도입하는" 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 구체예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체내로의 일 구체예에 따른 조성물의 배치를 의미할 수 있다. 일 구체예에 따른 조성물의 세포 또는 세포 성분의 적어도 일부를 생존하는 개체내에서 원하는 위치로 전달하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 개체 투여 후 세포의 생존 기간은 짧으면 수 시간, 예를 들면 24시간 내지 수일 내지 길면 수년일 수 있다. The pharmaceutical composition may be for administration to the subventricular zone. The terms “administering,” “introducing” and “transplanting” are used interchangeably and in one embodiment into a subject by a method or route that results in at least partial localization of the composition to a desired site according to one embodiment. It may mean the arrangement of the composition according to. It can be administered by any suitable route to deliver at least a portion of a cell or cellular component of a composition according to one embodiment to a desired location in a living individual. The survival period of cells after administration of a subject can be several hours if short, for example 24 hours to several days to several years.
본 발명자들은 알츠하이머 병 동물 모델에서 신경줄기세포의 분화가 감소하는 것을 확인하였고, 중간엽 줄기세포를 신경줄기세포와 공동배양한 결과, 줄어든 신경줄기세포의 분화가 촉진되는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 일 양상에 따른 중간엽 줄기세포를 포함하는 약학적 조성물은 신경 세포의 손상으로 인한 퇴행성 뇌질환을 예방 또는 치료하는데 이용될 수 있다.The present inventors confirmed that the differentiation of neural stem cells in the Alzheimer's disease animal model was reduced, and as a result of co-culturing the mesenchymal stem cells with the neural stem cells, the differentiation of the reduced neural stem cells was promoted. Therefore, the pharmaceutical composition comprising mesenchymal stem cells according to an aspect of the present invention may be used to prevent or treat degenerative brain diseases caused by damage to nerve cells.
다른 양상은 액티빈 A 또는 이의 활성 단편을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환을 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.Another aspect provides a pharmaceutical composition for treating degenerative brain disease comprising activin A or an active fragment thereof as an active ingredient.
상기 액티빈 A 또는 이의 활성 단편은 중간엽 줄기세포로부터 유래하거나, 당업계의 통상적인 방법에 따라 합성된 것일 수 있다. 일반적인 합성 방법은 "Peptide Synthesis", Interscience, New York, 1966; "The Proteins", Vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976; "Peptide Synthesis(Peptide Gosei)", Maruzen, 1975; "Fundamentals and Experiments of Peptide Synthesis(Peptide Gosei no Kiso to Jikken)", Maruzen, 1985; 및 "The sequel of Development of Pharmaceuticals(Zoku Iyakuhin no Kaihatsu)", Vol. 14, Peptide Synthesis(Peptide Gosei), Hirokawa Shoten, 1991과 같은 문헌, 및 국제공개 번호 WO 99/67288와 같은 국제공개특허에 기재되어 있다. 또한 단백질 또는 펩티드는 알려진 유전 공학 방법에 의해 합성될 수 있다. 예를 들면, 액티빈 A 또는 그의 활성 단편을 암호화하고 있는 DNA가 삽입된 벡터는 형질전환된 세포(transformed cells)를 생산하기 위해 적합한 숙주 세포에 도입(introduced into)하고, 이렇게 형질전환된 세포들에서 생산되는 펩타이드들을 수집함으로써 얻어질 수 있다. 또한 본 발명의 펩타이드는 처음에 펩타이드를 얻기 위해 그 다음에 적절한 프로테아제(protease)를 이용해 잘리는 융합 단백질(fusion protein)로서 만들어질 수 있다. 이들은 그 자체로서 약학적 조성물에 사용될 수도 있다. The activin A or an active fragment thereof may be derived from mesenchymal stem cells, or may be synthesized according to a conventional method in the art. Common synthetic methods are "Peptide Synthesis", Interscience, New York, 1966; "The Proteins", Vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976; "Peptide Synthesis (Peptide Gosei)", Maruzen, 1975; "Fundamentals and Experiments of Peptide Synthesis (Peptide Gosei no Kiso to Jikken)", Maruzen, 1985; And "The sequel of Development of Pharmaceuticals (Zoku Iyakuhin no Kaihatsu)", Vol. 14, Peptide Synthesis (Peptide Gosei), Hirokawa Shoten, 1991, and international publication patents such as International Publication No. WO 99/67288. Proteins or peptides can also be synthesized by known genetic engineering methods. For example, a vector into which DNA encoding the activin A or an active fragment thereof is inserted is introduced into a suitable host cell to produce transformed cells, and the cells thus transformed It can be obtained by collecting the peptides produced in the. In addition, the peptides of the present invention can be made as a fusion protein that is first cut to obtain a peptide and then using an appropriate protease. They may themselves be used in pharmaceutical compositions.
융합 단백질을 제조하기 위한 방법에서, 액티빈 A 또는 그의 활성 단편을 암호화하고 있는 폴리뉴클레오티드는 다른 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 프레임(frame)에 연결(ligate)될 수 있으며, 이것은 숙주(host)에서의 발현(expression)을 위해 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 당업계에 알려진 기술들은 이런 목적을 위해 이용될 수 있다. 액티빈 A와 융합된 펩타이드들을 위해, FLAG(Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210), 6개의 히스티딘(His)으로 이루어진 6x His 잔기들(residues), 10x His, influenza hemagglutinin(HA), 인간 c-myc 단편, VSV-GP 단편, p18HIV 단편(fragments), T7-태그(tag), HSV-태그, E-태그, SV40T 항원 단편, lck 태크, 알파-튜블린(alpha-tubulin) 단편, B-태그, 및 Protein C 단편과 같이 알려진 펩타이드를 사용할 수 있다. 또한, 융합 단백질을 만들기 위해 액티빈 A 또는 그의 활성 단편을 글루타치온-S-트랜스퍼라아제(glutathione-S-transferase, GST), influenza hemagglutinin(HA), immunoglobulin constant regions, 베타-갈락토시다아제(beta-galactosidase), 또는 말토즈-결합 단백질(maltose-binding protein, MBP) 등을 연결하는 것이 가능하다. In a method for preparing a fusion protein, a polynucleotide encoding activin A or an active fragment thereof may be linked to a frame with a polynucleotide encoding another protein or peptide, which is a host. ) Can be inserted into an expression vector for expression. Techniques known in the art can be used for this purpose. For peptides fused with activin A, FLAG (Hopp, TP et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210), 6x His residues consisting of 6 histidines, 10x His, influenza hemagglutinin (HA), human c-myc fragment, VSV-GP fragment, p18HIV fragment, T7-tag, HSV-tag, E-tag, SV40T antigen fragment, lck tag, alpha-tubulin (alpha) Known peptides such as -tubulin) fragments, B-tags, and Protein C fragments can be used. In addition, to make a fusion protein, activin A or its active fragment is glutathione-S-transferase (GST), influenza hemagglutinin (HA), immunoglobulin constant regions, beta-galactosidase (beta) It is possible to link -galactosidase), or maltose-binding protein (MBP).
따라서, 다른 구체예에 있어서, 상기 액티빈 A 또는 그의 활성 단편을 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포가 제공될 수 있다. Thus, in another embodiment, a polynucleotide encoding the activin A or an active fragment thereof, a recombinant vector comprising the polynucleotide, and a recombinant cell comprising the recombinant vector can be provided.
용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들명, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.The term "vector" means a means for expressing a gene of interest in a host cell. For example, viral vectors such as plasmid vectors, cosmid vectors and bacteriophage vectors, adenovirus vectors, retroviral vectors and adeno-associated virus vectors. Vectors that can be used as the recombinant vector are plasmids often used in the art (e.g. pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8 / 9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14) , pGEX series, pET series and pUC19, etc.), phages (e.g., λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 and M13, etc.) or viruses (e.g., name, SV40, etc.).
상기 재조합 벡터에서 상기 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오타이드 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오타이드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 조절 서열은 "작동 가능하게 연결(operatively linked)"됨으로써 다른 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.In the recombinant vector, the polynucleotide encoding the protein complex can be operably linked to a promoter. The term “operatively linked” refers to a functional binding between a nucleotide expression control sequence (eg, promoter sequence) and another nucleotide sequence. The regulatory sequence can be “operatively linked” to control transcription and / or translation of other nucleotide sequences.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.The recombinant vector can typically be constructed as a vector for cloning or for expression. The expression vector can be used in the art, conventional ones used to express foreign proteins in plants, animals or microorganisms. The recombinant vector can be constructed through various methods known in the art.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pLλ 프로모터, CMV 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.The recombinant vector can be constructed using prokaryotic or eukaryotic cells as hosts. For example, when the vector used is an expression vector and a prokaryotic cell is used as a host, a strong promoter (eg, pLλ promoter, CMV promoter, trp promoter, lac promoter, tac promoter, T7) that can progress transcription Promoter, etc.), a ribosome binding site for initiation of translation and a transcription / detox termination sequence. When eukaryotic cells are used as hosts, replication origins that operate on eukaryotic cells included in vectors include f1 replication origin, SV40 replication origin, pMB1 replication origin, adeno replication origin, AAV replication origin, and BBV replication origin, etc. It is not limited. In addition, a promoter derived from the genome of a mammalian cell (eg, a metallothionine promoter) or a promoter derived from a mammalian virus (eg, adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, Cytomegalovirus promoter and HSV's tk promoter) can be used and generally have a polyadenylation sequence as the transcription termination sequence.
상기 재조합 세포는 상기 재조합 벡터를 적절한 숙주 세포에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coliJM109, E. coliBL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다. The recombinant cell may be obtained by introducing the recombinant vector into an appropriate host cell. The host cell can be any host cell known in the art as a cell capable of continuously cloning or expressing the recombinant vector while being stable. As a prokaryotic cell, for example, E. coliJM109, E. coliBL21, Bacillus strains such as E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, and Salmonella typhimurium, Serratia Marse Intestinal bacteria and strains such as Sose and various Pseudomonas species, and when transformed into eukaryotic cells, as host cells, yeast (Saccharomyce cerevisiae), insect cells, plant cells and animal cells, such as Sp2 / 0, CHO (Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK cell line, etc. can be used.
일 구체예에 있어서, 상기 액티빈 A는 중간엽줄기세포로부터 분비되는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 약학적 조성물은 중간엽줄기세포를 개체에 투여함으로써, 이로부터 분비된 액티빈 A가 개체에 작용하는 것을 포함할 수 있다. In one embodiment, the activin A may be secreted from mesenchymal stem cells. For example, the pharmaceutical composition may include activin A secreted therefrom by administering mesenchymal stem cells to an individual.
또한, 상기 중간엽줄기세포, 액티빈 A 또는 그의 활성 단편은 신경줄기세포의 신경세포로의 분화를 증가시키는 것일 수 있다. In addition, the mesenchymal stem cells, activin A or an active fragment thereof may be to increase the differentiation of neural stem cells into neurons.
상기 신경줄기세포의 분화 증가 방법에 있어서, 상기 투여는 중간엽 줄기세포, 액티빈 A 또는 그의 활성 단편을 신경줄기세포에 처리, 또는 접촉시키는 단계를 의미할 수 있다. 상기 처리 또는 접촉은 중간엽 줄기세포를 신경줄기세포와 공배양하거나, 또는 중간엽 줄기세포, 액티빈 A 또는 그의 활성 단편을 실험 동물, 예를 들면 동물의 뇌, 해마, 또는 뇌실하구역에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 상기 처리 또는 접촉은 액티빈 A 또는 그의 활성 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주 세포와 신경 세포와 접촉시키거나, 예를 들면, 공배양하거나, 또는 상기 숙주 세포를 실험 동물, 예를 들면, 동물의 뇌, 해마, 또는 뇌실하구역에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 상기 공배양 및 투여는 통상의 당업자가 목적하는 효과, 예를 들면, 중간엽줄기세포 또는 액티빈 A 또는 그의 활성 단편이 신경줄기세포에 영향을 미칠 수 있도록 하는 방법 및 기간 동안 수행될 수 있다. In the method for increasing the differentiation of the neural stem cells, the administration may mean a step of treating or contacting mesenchymal stem cells, activin A or an active fragment thereof with the neural stem cells. The treatment or contact may include co-culturing mesenchymal stem cells with neural stem cells, or administering mesenchymal stem cells, activin A, or an active fragment thereof to experimental brains, such as the brain, hippocampus, or subventricular zone of an animal. It can contain. In addition, the treatment or contact is in contact with, for example, co-culture with a host cell comprising a nucleotide sequence encoding activin A or an active fragment thereof, or the host cell, or the host cell is an experimental animal, for example For example, administration to an animal's brain, hippocampus, or subventricular zone. The co-cultivation and administration can be carried out during a method and a period of time for a person skilled in the art to effect the desired effect, for example, mesenchymal stem cells or activin A or an active fragment thereof can affect neuronal stem cells.
다른 구체예에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포, 액티빈 A 또는 그의 활성 단편을 포함하는 약학적 조성물은 신경줄기세포를 더 포함하는 것일 수 있다. In another embodiment, the pharmaceutical composition comprising the mesenchymal stem cell, activin A or an active fragment thereof may further include neural stem cells.
일 구체예에 따른 상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 80 중량%의 액티빈 A 또는 그의 활성 단편을 포함할 수 있다. 또한, 액티빈 A 또는 그의 활성 단편의 투여 용량은 0.01mg 내지 10,000mg, 0.1mg 내지 1000mg, 1mg 내지 100mg, 0.01mg 내지 1000mg, 0.01mg 내지 100mg, 0.01mg 내지 10mg, 또는 0.01mg 내지 1mg일 수 있다. 또한, 중간엽 줄기세포의 투여 용량은 1.0× 105 내지 1.0× 108 세포/kg(체중)일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1회 또는 임상적으로 용인 가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다. 가능한 투여 경로에는 경구, 설하, 비경구 (예를 들어, 피하, 근육내, 동맥내, 복강내, 경막내, 또는 정맥내), 직장, 국소 (경피 포함), 흡입, 및 주사, 또는 이식성 장치 또는 물질의 삽입을 포함할 수 있다. 일 구체예에 따른 치료의 대상동물로서는, 인간 및 그 밖의 목적으로 하는 포유동물을 예로 들 수 있고, 구체적으로는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 개, 말, 돼지 등이 포함된다. The composition according to an embodiment may include 0.001% to 80% by weight of activin A or an active fragment thereof based on the total weight of the composition. In addition, the administered dose of activin A or an active fragment thereof may be 0.01 mg to 10,000 mg, 0.1 mg to 1000 mg, 1 mg to 100 mg, 0.01 mg to 1000 mg, 0.01 mg to 100 mg, 0.01 mg to 10 mg, or 0.01 mg to 1 mg have. In addition, the dose of mesenchymal stem cells may be 1.0 × 10 5 to 1.0 × 10 8 cells / kg (weight). However, the dosage may be variously prescribed by factors such as the formulation method, the administration method, the patient's age, weight, sex, morbidity, food, administration time, administration route, excretion rate, and response sensitivity, and those skilled in the art Taking these factors into consideration, the dosage can be appropriately adjusted. The number of times of administration may be one or two or more times within the range of clinically acceptable side effects, and the administration site may be administered at one place or two or more places. For animals other than humans, the dose is the same as human per kg, or the above dose is converted, for example, by the volume ratio (e.g., average value) of the target animal and human organ (heart). One amount may be administered. Possible routes of administration include oral, sublingual, parenteral (e.g. subcutaneous, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, intrathecal, or intravenous), rectal, topical (including transdermal), inhalation, and injection, or implantable devices. Or inserting a substance. As a target animal for treatment according to an embodiment, humans and other target mammals can be exemplified, and specifically, humans, monkeys, mice, rats, rabbits, sheep, cows, dogs, horses, pigs, etc. Is included.
일 구체예에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 첨가물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 멸균수, 생리식염수, 관용의 완충제(인산, 구연산, 그 밖의 유기산 등), 안정제, 염, 산화방지제(아스코르브산 등), 계면활성제, 현탁제, 등장화제, 또는 보존제 등을 포함할 수 있다. 국소 투여를 위해, 생체고분자(biopolymer) 등의 유기물, 하이드록시아파타이트 등의 무기물, 구체적으로는 콜라겐 매트릭스, 폴리락트산 중합체 또는 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 중합체 또는 공중합체 및 그의 화학적 유도체 등과 조합시키는 것도 포함할 수 있다. 일 구체예에 따른 약학적 조성물이 주사에 적당한 제형으로 조제되는 경우에는, 중간엽줄기세포 또는 액티빈 A가 약학적으로 허용가능한 담체 중에 용해되어 있거나 또는 용해되어 있는 용액상태로 동결된 것일 수 있다. The pharmaceutical composition according to one embodiment may include a pharmaceutically acceptable carrier and / or additives. Examples include sterile water, physiological saline, conventional buffers (phosphoric acid, citric acid, other organic acids, etc.), stabilizers, salts, antioxidants (ascorbic acid, etc.), surfactants, suspending agents, isotonic agents, or preservatives. can do. For topical administration, it may also include combination with organic substances such as biopolymers, inorganic substances such as hydroxyapatite, specifically collagen matrices, polylactic acid polymers or copolymers, polyethylene glycol polymers or copolymers and chemical derivatives thereof, etc. You can. When the pharmaceutical composition according to one embodiment is prepared in a dosage form suitable for injection, mesenchymal stem cells or activin A may be dissolved in a pharmaceutically acceptable carrier or frozen in a dissolved solution. .
일 구체예에 따른 약학적 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 환원제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995]에 상세히 기재되어 있다. 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 분말, 과립, 정제 또는 캡슐 형태일 수 있다. The pharmaceutical composition according to one embodiment, if necessary depending on the method of administration or formulation, suspending agent, solubilizing agent, stabilizer, isotonic agent, preservative, adsorption inhibitor, surfactant, diluent, excipient, pH adjuster, painless agent, Buffers, reducing agents, antioxidants, and the like. Pharmaceutically acceptable carriers and formulations suitable for the present invention, including those exemplified above, are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995. The pharmaceutical composition according to an embodiment is a unit dose form by formulating using a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method that can be easily carried out by those skilled in the art to which the present invention pertains. Or by incorporating it into a multi-dose container. The formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or aqueous medium, or in powder, granule, tablet or capsule form.
다른 양상은 중간엽 줄기세포, 이의 용해물, 또는 추출물 또는 액티빈 A 또는 그의 활성 단편을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 개선 또는 예방용 건강기능식품을 제공한다. Another aspect provides a health functional food for improving or preventing degenerative brain disease containing mesenchymal stem cells, a lysate thereof, or an extract or activin A or an active fragment thereof as an active ingredient.
상기 건강식품 조성물은 액티빈 A 또는 그의 활성 단편 이외에 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품의 제조시에 본 명세서의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. The health food composition may be used with other foods or food ingredients other than activin A or an active fragment thereof, and may be appropriately used according to conventional methods. The mixing amount of the active ingredient can be appropriately determined according to the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment). Generally, the composition of the present specification may be added in an amount of 15 parts by weight or less based on the raw material at the time of manufacturing the health functional food. There are no particular restrictions on the type of health food.
다른 양상은 중간엽 줄기세포, 이의 용해물, 또는 추출물, 또는 액티빈 A 또는 이의 활성 단편을 인간을 제외한 개체에 투여하거나, 또는 인 비트로(in vitro) 상에서 신경줄기세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 신경줄기세포의 분화를 촉진시키는 방법을 제공한다.Other aspects are mesenchymal stem cells, lysates, or extracts thereof, or activin A or an active fragment thereof administered to an individual other than a human, or in vitro ( in In vitro ) provides a method for promoting the differentiation of neural stem cells, including the step of contacting the neural stem cells.
상기 설명에서 이미 언급된 용어 또는 요소에 대해서는 따로 언급하는 것이 없는한 이미 상술한 바와 같다.The terms or elements already mentioned in the above description are as described above unless otherwise specified.
일 양상에 따른 중간엽 줄기세포, 그의 용해물, 또는 그의 추출물을 포함하는 약학적 조성물은 퇴행성 뇌질환을 치료하기 위해 유용하게 사용될 수 있다.Pharmaceutical compositions comprising mesenchymal stem cells, lysates, or extracts thereof according to one aspect may be useful for treating degenerative brain disease.
다른 양상에 따른 액티빈 A를 포함하는 약학적 조성물은 퇴행성 뇌질환을 치료하기 위해 유용하게 사용될 수 있다.The pharmaceutical composition comprising activin A according to another aspect may be usefully used to treat degenerative brain disease.
다른 양상에 따른 방법에 의하면, 중간엽 줄기세포, 또는 액티빈 A를 개체에 투여하거나, 또는 인 비트로(in vitro) 상에서 신경줄기세포에 접촉시켜 신경줄기세포의 분화를 촉진시킬 수 있다.According to the method in accordance with another aspect, the mesenchymal stem cell, or administration of the activin A solution on the object, or in vitro (in In vitro ), it can promote differentiation of neural stem cells by contacting them.
도 1a는 5XFAD 알츠하이머 형질전환 마우스와 정상 마우스의 SVZ를 비교했을 때, 신경줄기세포의 마커인 SOX2/GFAP와, 신경세포의 마커인 DCX/Neun를 염색하여 관찰한 이미지이고, 도 1b는 도 1a의 이미지의 각각 마커들의 세기를 정량화한 결과이다.
도 1c는 5XFAD 알츠하이머 형질전환 마우스와 정상 마우스의 SVZ에서 신경줄기세포를 분리 배양하고, 신경으로 분화 유도시 신경세포의 마커인 MAP2/GFAP를 염색하여 관찰한 이미지이고, 도 1d는 도 1c 이미지의 각각 마커들의 세기를 정량화한 결과이다.
도 2a는 5XFAD 알츠하이머 형질전환 마우스와 정상 마우스의 SVZ에서 분리한 신경줄기세포를 인간 유래 중간엽 줄기세포와 배양했을 때의 MAP2/GFAP를 염색하여 비교한 이미지이고, 도 2b는 도 2a 이미지의 각각 마커들의 세기를 정량화한 결과이다.
도 2c는 5XFAD 알츠하이머 형질전환 마우스와 정상 마우스의 SVZ에서 분리한 신경줄기세포를 인간 유래 중간엽 줄기세포와 배양했을 때의 신경세포 길이를 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 5XFAD 알츠하이머 형질전환 마우스의 신경줄기세포와 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포 또는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 공동배양시키고, 항체 어레이를 통해 공통적으로 분비되는 물질을 탐색한 결과이다.
도 4a는 5XFAD 알츠하이머 형질전환 마우스와 정상 마우스의 SVZ에서의 액티빈 A 및 액티빈 수용체 Ⅰ, Ⅱ의 양을 역전사 중합 효소 연쇄 반응을 통해 발현량을 측정한 결과이고, 도 4b는 도 4a의 발현량을 정령화한 결과이다..
도 4c는 5XFAD 알츠하이머 형질전환 마우스와 정상 마우스의 신경줄기세포와 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 공동배양시킬 때, 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포의 액티빈 A의 발현량이 증가하는 것을 역전사 중합 효소 연쇄 반응을 통해 확인한 결과이다.
도 4d는 5XFAD 알츠하이머 형질전환 마우스와 정상 마우스의 신경줄기세포와 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 공동배양시킬 때, 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포의 액티빈 A의 농도를 ELISA로 측정한 것을 나타낸다.
도 5a는 5XFAD 알츠하이머 형질전환 마우스의 SVZ에서 분리한 신경줄기세포를 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포와 배양했을 때의 MAP2/GFAP를 염색하여 비교한 이미지이고, 도 5b는 도 5a 이미지의 각각 마커들의 세기를 정량화한 결과이다.
도 5c는 5XFAD 알츠하이머 형질전환 마우스의 SVZ에서 분리한 신경줄기세포를 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포와 배양했을 때의 신경세포 길이를 비교하여 나타낸 그래프이다.Figure 1a is an image observed by staining 5XFAD Alzheimer's transgenic mice and SVZ of normal mice, staining SOX2 / GFAP, a marker of neural stem cells, and DCX / Neun, a marker of neurons, and Figure 1b. This is the result of quantifying the intensity of each marker in the image.
Figure 1c is a 5XFAD Alzheimer's transgenic mouse and normal mouse SVZ in the separate culture and culture, and neuronal differentiation induced by neuron marker MAP2 / GFAP staining image observed in Figure 1d, each of Figure 1c image This is the result of quantifying the intensity of the markers.
Figure 2a is a 5XFAD Alzheimer's transgenic mouse and normal mouse SVZ isolated from the SVZ and human-derived mesenchymal stem cells when cultured with MAP2 / GFAP stained image compared to Figure 2a, each marker of Figure 2a image It is the result of quantifying the intensity of the field.
Figure 2c is a graph showing the comparison of the length of nerve cells when cultured with human-derived mesenchymal stem cells isolated from SVZ of 5XFAD Alzheimer's transgenic mice and normal mice.
FIG. 3 shows the results of co-cultivation of neural stem cells and human umbilical cord mesenchymal stem cells or human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells of 5XFAD Alzheimer's transgenic mice, and finding a substance secreted in common through an antibody array.
Figure 4a is a 5XFAD Alzheimer's transgenic mouse and normal mouse SVZ in the amount of activin A and activin receptors I, II is the result of measuring the expression level through a reverse transcriptase chain reaction, Figure 4b is the expression of Figure 4a It is the result of the spirit of quantity.
Figure 4c is a 5XFAD Alzheimer's transgenic mouse and normal mouse neural stem cells and human umbilical cord stem cells derived from human umbilical cord, reverse transcription polymerase chain reaction that increases the expression level of activin A in human umbilical cord derived mesenchymal stem cells It is the result confirmed through.
Figure 4d shows that when the 5XFAD Alzheimer's transgenic mouse and normal mouse neural stem cells and human umbilical cord stem cells are co-cultured, the concentration of activin A in human umbilical cord stem cells is measured by ELISA.
Figure 5a is an image comparing and staining MAP2 / GFAP when cultured with mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord from neural stem cells isolated from SVZ of a 5XFAD Alzheimer's transgenic mouse, and Figure 5b is the intensity of each marker in the image of Figure 5a It is the result of quantifying.
Figure 5c is a graph showing the comparison of the length of nerve cells when cultured with mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord from neural stem cells isolated from SVZ of 5XFAD Alzheimer's transgenic mice.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
1. 실험 방법1. Experimental method
1) 면역세포화학(1) Immunocytochemistry ( ImmunocytochemistryImmunocytochemistry : : ICCICC ) 및 면역조직화학(immunohistochemistry: ) And immunohistochemistry (immunohistochemistry: IHCIHC ))
면역 조직학적 분석은 SOX2 (1:2000; Abcam plc, Cambridge, UK), Nestin (1:200; Abcam plc, Cambridge, UK), DCX (1:2000; Abcam plc, Cambridge, UK), Neun (1:200; EMD Millipore, Billerica, MA, USA), MAP2 (1:200; Abcam plc, Cambridge, UK), GFAP (1:1000; Abcam plc, Cambridge, UK), Alexa Fluor 488 (1:500; Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, UK), Cy3 (1:500; Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, UK) 항체를 이용하여 진행하였다. 이미지는 LSM 780 confocal microscope (Carl Zeiss AG, Jena, Germany)을 사용하여 얻었다. 이미지 분석은 ImageJ software (http://rsb.info.nih.gov/ij/)를 이용하였으며, 신경 돌기(Neurite) 길이 분석은 ImageJ software (http://rsb.info.nih.gov/ij/) 와 플러그 인을 이용하였다 (Pool et al. 2008).Immunohistochemical analysis includes SOX2 (1: 2000; Abcam plc, Cambridge, UK), Nestin (1: 200; Abcam plc, Cambridge, UK), DCX (1: 2000; Abcam plc, Cambridge, UK), Neun (1 : 200; EMD Millipore, Billerica, MA, USA), MAP2 (1: 200; Abcam plc, Cambridge, UK), GFAP (1: 1000; Abcam plc, Cambridge, UK), Alexa Fluor 488 (1: 500; Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, UK), Cy3 (1: 500; Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, UK) antibodies were used. Images were obtained using an LSM 780 confocal microscope (Carl Zeiss AG, Jena, Germany). For image analysis, ImageJ software (http://rsb.info.nih.gov/ij/) was used, and for neurite length analysis, ImageJ software (http://rsb.info.nih.gov/ij/) ) And plug-in (Pool et al. 2008).
2) 2) 웨스턴Western 블롯Blot 및 ELISA And ELISA
면역 블롯 분석을 위하여, NuPAGE 12 %(Invitrogen, CA, USA) 젤을 사용하였다. 또한 항체 분석을 위하여 anti-Ab42 (1:200, Novus Biologicals, LLC, CO, USA) 와 항-β-액틴(1:5,000; Sigma-Aldrich Co. LLC, MO, USA)를 사용하였다. 또한 액티빈 A의 분비량 및 발현량의 확인을 위하여 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 방법을 이용하였으며, Activin A ELISA kit (Abcam plc, Cambridge, UK)을 사용하였다. For immunoblot analysis, NuPAGE 12% (Invitrogen, CA, USA) gel was used. In addition, anti-Ab42 (1: 200, Novus Biologicals, LLC, CO, USA) and anti-β-actin (1: 5,000; Sigma-Aldrich Co. LLC, MO, USA) were used for antibody analysis. In addition, an Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method was used to confirm the secretion and expression levels of activin A, and an Activin A ELISA kit (Abcam plc, Cambridge, UK) was used.
3) 3) 역전사Reverse warrior 중합 효소 연쇄 반응( Polymerase chain reaction ( ReverseReverse transcriptasetranscriptase polymerasepolymerase chainchain reaction: RT- reaction: RT- PCRPCR ))
조직 내 혹은 인간 중간엽 줄기세포의 액티빈 A 및 액티빈 A 수용체의 발현량 비교를 위해 TRIzol(Invitrogen, CA, USA)을 이용하여 RNA 추출 후 SuperScript III polymerase(Invitrogen, CA, USA)와 oligo(dT) primers(Invitrogen, CA, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성 후 발현량 확인을 위하여 β-액틴, 인간 액티빈 A, 마우스 액티빈 A, ActRI, ActRII, 네스틴(nestin), SOX2 프라이머를 이용하여 RT-PCR를 진행하였다. 사용된 프라이머들은 아래 표 1과 같다.SuperScript III polymerase (Invitrogen, CA, USA) and oligo (RNA) after RNA extraction using TRIzol (Invitrogen, CA, USA) to compare the expression levels of activin A and activin A receptors in tissue or human mesenchymal stem cells cDNA was synthesized using dT) primers (Invitrogen, CA, USA). To confirm the expression level after synthesis, RT-PCR was performed using β-actin, human activin A, mouse activin A, ActRI, ActRII, nestin, and SOX2 primers. The primers used are shown in Table 1 below.
<표 1> PCR 프라이머 서열<Table 1> PCR primer sequence
4) 통계적 분석4) Statistical analysis
데이터는 평균 ± SE로 나타냈으며, t-test 및 one-way ANOVA test를 사용하여 비교 분석하였으며, P<0.05를 유의미한 결과로 고려하였다. 통계 프로그램은 Excel 2010 소프트웨어와 SPSS 소프트웨어(ver 18.0, SPSS Inc., Chicago, USA)를 사용하였다. Data were expressed as mean ± SE, and compared and analyzed using t-test and one-way ANOVA test, P <0.05 was considered as a significant result. The statistical program used Excel 2010 software and SPSS software (ver 18.0, SPSS Inc., Chicago, USA).
2. 알츠하이머 형질전환 마우스와 정상 마우스의 2. Alzheimer's transgenic and normal mice SVZ의SVZ 신경세포분화 비율 비교 Nerve cell differentiation ratio comparison
In vivo 알츠하이머 질환 모델의 뇌실하구역(subventricular zone: SVZ)의 신경줄기세포의 활성을 확인하기 위하여, 알츠하이머 질환 모델로서 4개월령의 5XFAD 마우스 모델(The Jackson Laboratory, http://jaxmice.jax.org/strain/008730.html)을 사용하였으며, 대조군인 정상 모델은 5XFAD의 한배 새끼(littermate)를 사용 하였다. 이들 마우스의 SVZ의 신경줄기세포 및 신경세포의 비율을 측정하였다. In order to confirm the activity of neural stem cells in the subventricular zone (SVZ) of the Alzheimer's disease model in vivo, the Alzheimer's disease model is a 4 month old 5XFAD mouse model (The Jackson Laboratory, http://jaxmice.jax.org/strain) /008730.html), and a normal model, a control group, used a littermate of 5XFAD. The ratio of the neural stem cells and neurons of SVZ of these mice was measured.
그 결과, 도 1a 및 1b와 같이 신경줄기세포의 마커인 SOX2 및 GFAP는 두 마우스에서 유사하게 측정되었으나, 신경세포의 마커인 DCX 및 Neun은 정상 마우스의 SVZ에서 더 높게 나타났다. 따라서, 알츠하이머 형질전환 마우스는 신경줄기세포의 비율은 정상 대조군과 유사하나 신경세포의 분화 비율은 적은 것으로 확인되었다.As a result, as shown in Figs. 1A and 1B, the markers of neural stem cells, SOX2 and GFAP, were similarly measured in both mice, but the markers of neurons, DCX and Neun, were higher in SVZ of normal mice. Therefore, in the Alzheimer's transgenic mouse, the ratio of neural stem cells was similar to that of the normal control group, but it was confirmed that the rate of differentiation of neurons was small.
3. 알츠하이머 형질전환 마우스와 정상 마우스의 3. Alzheimer's transgenic and normal mice SVZ의SVZ 신경줄기세포의Neural stem cell 분화differentiation 능 비교Ability comparison
알츠하이머 모델 마우스와 정상 마우스의 SVZ로부터 분리한 신경줄기세포의 분화능을 확인하였다. 구체적인 실험방법은 다음과 같다.The differentiation ability of neural stem cells isolated from SVZ of Alzheimer's model mice and normal mice was confirmed. The specific experimental method is as follows.
신경줄기세포를 분리하기 위해, 논문(Walker TL et al., One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. Journal of visualized experiments : JoVE 2014: e51225)에 기재된 방법에 따랐다. 먼저 알츠하이머 모델 마우스 및 정상 마우스를 안락사시키고 뇌조직을 분리하였다. 시신경 교차(Optic chiasm)를 중심으로 관상면으로 절개 후 SVZ 주변의 조직을 잘라서 모았다. 모은 후 accutase(Gibco, NY, USA)를 이용하여 신경줄기세포를 분리하였다. 분리 후 신경 기본 배지(neurobasal medium)(Gibco, NY, USA)에, B-27 (2%; Gibco, NY, USA), N-2 supplement (1%; Gibco, NY, USA), L-glutamine (2 mM; Gibco, NY, USA), penicillin/streptomycin (1%; Gibco, NY, USA), 20 ng/mL epidermal growth factor (EGF) (Sigma-Aldrich Co. LLC, MO, USA), 및 20 ng/mL basic fibroblast growth factor (bFGF) (Sigma-Aldrich Co. LLC, MO, USA)를 포함시킨 완전 배지(Complete medium)를 이용하여 구형 배양(sphere culture)해주었다. 이후 분화를 유도하기 위해, 분화 유도 하루 전에 1 mg/mL poly-d-lysine(Sigma-Aldrich Co. LLC, MO, USA)과 1 mg/mL laminin(Sigma-Aldrich Co. LLC, MO, USA)을 이용하여 플레이트를 코팅하였다. 배양한 구형 신경줄기세포를 15 ml 튜브에 모으고, 원심분리 후 상층액은 버리고 accutase® 처리를 통해 구형 신경줄기세포를 단일 세포로 분리하였다. 단일 세포(single cell)로 분화 후 신경 기본 배지(Gibco, NY, USA)에 B-27 (2%; Gibco, NY, USA), N-2 supplement (1%; Gibco, NY, USA), L-glutamine (2 mM; Gibco, NY, USA), 및 penicillin/streptomycin (1%; Gibco, NY, USA)을 포함시킨 배지를 이용하여 분화 유도를 하였다.To isolate neural stem cells, described in the paper (Walker TL et al., One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice.Journal of visualized experiments: JoVE 2014: e51225) I followed the method. First, Alzheimer's model mice and normal mice were euthanized and brain tissues were separated. After incision into the coronal plane around the optic nerve cross (Optic chiasm), the tissue around the SVZ was cut and collected. After collection, neural stem cells were isolated using accutase (Gibco, NY, USA). After separation in neurobasal medium (Gibco, NY, USA), B-27 (2%; Gibco, NY, USA), N-2 supplement (1%; Gibco, NY, USA), L-glutamine (2 mM; Gibco, NY, USA), penicillin / streptomycin (1%; Gibco, NY, USA), 20 ng / mL epidermal growth factor (EGF) (Sigma-Aldrich Co. LLC, MO, USA), and 20 Sphere culture was performed using a complete medium containing ng / mL basic fibroblast growth factor (bFGF) (Sigma-Aldrich Co. LLC, MO, USA). To induce differentiation thereafter, 1 mg / mL poly-d-lysine (Sigma-Aldrich Co. LLC, MO, USA) and 1 mg / mL laminin (Sigma-Aldrich Co. LLC, MO, USA) one day before induction of differentiation. Plates were coated with. The cultured spherical neural stem cells were collected in a 15 ml tube, the supernatant was discarded after centrifugation, and the spherical neural stem cells were separated into single cells through accutase® treatment. B-27 (2%; Gibco, NY, USA), N-2 supplement (1%; Gibco, NY, USA), L in neuronal basal medium (Gibco, NY, USA) after differentiation into single cells Differentiation was induced using a medium containing -glutamine (2 mM; Gibco, NY, USA), and penicillin / streptomycin (1%; Gibco, NY, USA).
그 결과, 도 1c 및 1d와 같이 정상 마우스로부터 분리된 신경줄기세포는 분화 유도 이후 MAP2 등 성숙한 신경 세포의 마커가 높게 나타난 반면, 5XFAD 마우스로부터 분리된 신경줄기세포는 MAP2 등 신경 세포 마커의 신호가 현저히 낮게 나타나, 알츠하이머 형질전환 마우스의 신경줄기세포가 정상 마우스에 비하여 신경으로의 분화가 잘 진행되지 않음을 확인하였다.As a result, as shown in Figures 1c and 1d, the neural stem cells isolated from normal mice showed high markers of mature neurons such as MAP2 after induction of differentiation, whereas the neural stem cells isolated from 5XFAD mice had significantly lower signals of nerve cell markers such as MAP2. It appeared, and it was confirmed that the neural stem cells of Alzheimer's transgenic mice did not proceed to differentiation into nerves better than normal mice.
4. 인간 유래 4. Human origin 중간엽Mesenchyme 줄기세포의 Stem cell 신경줄기세포의Neural stem cell 분화를 촉진하는 효과 확인 Confirm the effect of promoting differentiation
알츠하이머 형질전환 마우스의 신경줄기세포에 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포 혹은 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 공동배양시켜, 분화 촉진 효과를 확인하였다. The neural stem cells of Alzheimer's transgenic mice were co-cultured with mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord or mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood to confirm the effect of promoting differentiation.
이를 위해, 알츠하이머 형질전환 마우스 또는 정상 마우스의 SVZ에서 신경줄기세포를 분리하였다. 분리 후 부착 배양이 아닌 플로팅(floating) 배양을 진행하였다. 상기 분리된 신경줄기세포는 공동배양 챔버의 하부챔버에 부착을 유도해주고, 상부 챔버에 인간 유래 중간엽 줄기세포를 배양하여, 37℃, 5% CO2 조건에서 7일간 신경줄기세포의 분화 유도를 하였다. 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포는 삼성서울병원 IRB 승인하에 삼성서울병원 산부인과로부터 탯줄을 제공 받고, 그로부터 중간엽 줄기세포를 분리하여 얻었다. 분리 배양한 중간엽 줄기세포에 대하여 형광 활성 세포 분리(fluorescence activated cell sorter: FACS)를 통한 표면 마커 분석을 통해 중간엽 줄기세포를 확인 하였다. 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포는 메디포스트로부터 제공 받아 사용하였다. 또한, 신경 세포의 길이는 ImageJ software (http://rsb.info.nih.gov/ij/) 와 플러그인을 이용하여 수동적으로(manually) 측정하였다.To this end, neural stem cells were isolated from SVZ of Alzheimer's transgenic mice or normal mice. After separation, floating culture was performed rather than adhesion culture. The separated neural stem cells induced adhesion to the lower chamber of the co-culture chamber, and cultured human-derived mesenchymal stem cells in the upper chamber to induce differentiation of neural stem cells at 37 ° C and 5% CO 2 for 7 days. The mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord were obtained from umbilical cord stem cells obtained from the obstetrics and gynecology department of Samsung Seoul Hospital under the IRB approval of Samsung Seoul Hospital, and obtained by separating mesenchymal stem cells. For mesenchymal stem cells cultured separately, mesenchymal stem cells were confirmed by surface marker analysis through fluorescence activated cell sorter (FACS). Mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood were provided by Medipost and used. In addition, the length of the nerve cells was manually measured using ImageJ software (http://rsb.info.nih.gov/ij/) and a plug-in.
그 결과, 도 2a 및 2b와 같이 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포 및 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 모두가 알츠하이머 형질전환 마우스 및 정상 마우스 모두의 SVZ로부터 분리된 신경줄기세포의 신경으로의 분화를 촉진시키는 것을 확인하였다. 또한, 도 2c와 같이 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포 및 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 모두가 알츠하이머 형질전환 마우스 및 정상 마우스 모두의 SVZ로부터 분리된 신경줄기세포가 분화한 신경세포의 길이도 더 길게 형성시키는 효과를 가짐을 확인하였다. As a result, as shown in Figures 2a and 2b, both human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells and human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells promote the differentiation of neural stem cells isolated from SVZ in both Alzheimer's transgenic mice and normal mice into nerves. Confirmed. In addition, as shown in Figure 2c, both the human umbilical cord stem cell and the human umbilical cord blood mesenchymal stem cell are formed by the neural stem cells differentiated from the SVZ of both Alzheimer's transgenic mice and normal mice. It was confirmed to have an effect.
5. 인간 탯줄 유래 5. From human umbilical cord 중간엽Mesenchyme 줄기세포 및 인간 제대혈 유래 Stem cells and human cord blood 중간엽Mesenchyme 줄기세포의 cDNA 마이크로어레이에 의한 공통적으로 발현되는 유전자 발현 확인 Confirmation of gene expression commonly expressed by stem cell cDNA microarray
알츠하이머 형질전환 마우스의 신경줄기세포와 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포 또는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 공동배양시 공통적으로 분비하여 신경세포로 분화를 촉진시키는 분비 물질을 찾기 위하여 항체 어레이를 진행하였다. 구체적으로 단백질 분석을 위해 RayBio Biotin Label-based Human Antibody Array (#AAH-BLG-1-4, RayBiotech, Inc., GA, USA)를 이용하여 실험을 진행하였으며, Axon GenePix 4000B scanner (Molecular Devices, CA, USA)로 슬라이드를 스캔하고 GenePix Pro 6.0 (Molecular Devices, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. 그 결과를 두 인간 유래 중간엽 줄기세포가 알츠하이머 질환 모델 신경줄기세포와 공동배양시 분비하는 단백질을 MeV (MultExperiment Viewer)을 이용하여 수동적 히트맵(manually heat map) 분석을 진행하였다. 히트맵 분석에서 증가하는 단백질은 빨간색으로, 감소하는 단백질은 초록색으로 나타난다.When co-cultured with neural stem cells of human Alzheimer's transgenic mice and human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells or human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells, antibody arrays were performed to find secretory substances that secrete and promote differentiation into neurons. Specifically, for protein analysis, an experiment was performed using RayBio Biotin Label-based Human Antibody Array (# AAH-BLG-1-4, RayBiotech, Inc., GA, USA), and Axon GenePix 4000B scanner (Molecular Devices, CA) , USA) and analyzed using GenePix Pro 6.0 (Molecular Devices, CA, USA). As a result, two human-derived mesenchymal stem cells were co-cultured with Alzheimer's disease model neural stem cells, and a manual heat map analysis was performed using a MeV (MultExperiment Viewer). In the heat map analysis, increasing protein is shown in red and decreasing protein is shown in green.
상기와 같은 히트맵 분석에서, 두 인간 유래 중간엽 줄기세포에서 알츠하이머 질환모델 신경줄기세포와 공동배양시 액티빈 A가 공통적으로 발현되는 것을 확인하였다.In the heat map analysis as described above, it was confirmed that activin A is commonly expressed when co-cultured with Alzheimer's disease model neuron stem cells in two human-derived mesenchymal stem cells.
6. 알츠하이머 형질전환 마우스 및 정상 마우스의 6. Alzheimer's transgenic and normal mice
SVZ에서의In SVZ
액티빈Activin
A, A,
액티Acti
빈 수용체 1,2의 발현 비교Comparison of expression of
알츠하이머 형질전환 마우스와 정상 대조군 마우스의 SVZ에서의 액티빈 A 및 액티빈 수용체의 발현량을 비교하였다. The expression levels of activin A and activin receptors in SVZ of Alzheimer's transgenic mice and normal control mice were compared.
그 결과, 도 4a 및 4b와 같이 알츠하이머 형질전환 생쥐의 SVZ에서 정상생쥐의 SVZ에 비하여 액티빈 A, 및 액티빈 수용체 1,2의 발현이 감소되어 있는 것을 확인하였다. As a result, it was confirmed that the expression of activin A and
7. 알츠하이머 형질전환 마우스로부터 분리한 7. Isolated from Alzheimer's transgenic mice 신경줄기세포의Neural stem cell 인간 유래 Human origin 중간엽Mesenchyme 줄기세포와 공동배양시 When co-cultured with stem cells 액티빈Activin A의 발현량의 변화 확인 Confirmation of change in expression level of A
인간 유래 중간엽 줄기세포의 액티빈 A의 발현량이 알츠하이머 형질전환 생쥐의 신경줄기세포와의 공동배양에 따라 변화하는지를 확인하였다.It was confirmed whether the expression level of activin A in human-derived mesenchymal stem cells changes with co-culture with neural stem cells in Alzheimer's transgenic mice.
그 결과, 도 4c와 같이 알츠하이머 형질전환 생쥐의 신경줄기세포와 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포의 공동배양시 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포의 액티빈 A의 발현량이 증가한 것을 확인하였다. As a result, it was confirmed that the expression level of activin A of human umbilical cord mesenchymal stem cells increased when co-cultured with neural stem cells and human umbilical cord stem cells of Alzheimer's transformed mice as shown in FIG. 4C.
또한, 탯줄 중간엽 줄기세포 배양액 내의 액티빈 A의 발현량을 확인하기 위하여 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay, enzyme-linked immunospecific assay)로 측정하였으며, 도 4d와 같이 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포가 알츠하이머 형질전환 생쥐의 신경줄기세포와 공동배양시 공동배양하기 전보다 액티빈 A를 더 많이 분비하는 것을 확인하였다.In addition, in order to confirm the expression level of activin A in the umbilical cord mesenchymal stem cell culture medium, it was measured by an ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay, enzyme-linked immunospecific assay), and the human umbilical cord mesenchymal stem cells as shown in FIG. 4D are Alzheimer's. When co-cultured with neural stem cells of transgenic mice, it was confirmed that activin A secreted more than before co-culture.
8. 8. 액티빈Activin A의 A's 신경줄기세포의Neural stem cell 분화 촉진 효과 확인 Confirm the effect of promoting differentiation
신경으로의 분화가 잘 안되는 알츠하이머 형질전환 생쥐의 신경줄기세포에 액티빈 A를 첨가하거나 또는 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 공동배양시키고, 신경세포로의 분화를 확인하였다.Activin A was added to the neural stem cells of Alzheimer's transgenic mice, which are not well differentiated into nerves, or co-cultured with mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord was confirmed to differentiate into neurons.
그 결과, 도 5a 및 5b와 같이 액티빈 A 및 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포 모두가 알츠하이머 형질전환 생쥐의 신경줄기세포의 분화를 촉진시키는 것을 확인하였다. 또한 도 5c와 같이 신경세포의 길이 또한 길게 형성되었다.As a result, it was confirmed that both activin A and human umbilical cord mesenchymal stem cells promote differentiation of neural stem cells in Alzheimer's transgenic mice as shown in FIGS. 5A and 5B. In addition, as shown in Figure 5c, the length of the nerve cells was also formed long.
<110> Samsung Life Public Welfare Foundation <120> Composition comprising mesenchymal stem cell or activin A for treating degenerative brain disease <130> PN115049 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 1 atgcaccgct acgacgtga 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 cttttgcacc cctcccattt 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 cagcgttgga acagaggttg g 21 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 tggcacaggt gtctcaaggg tag 23 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 5 atcacctttg ccgagtcagg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 6 acttctgcac gctccactac 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 7 tggttcccaa tgacccaagt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 8 ttcatcagct tcgccagaga 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 9 tactcaagac ccaggaccac 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 10 ggctttccag acacaaccaa 20 <110> Samsung Life Public Welfare Foundation <120> Composition comprising mesenchymal stem cell or activin A for treating degenerative brain disease <130> PN115049 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 1 atgcaccgct acgacgtga 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 cttttgcacc cctcccattt 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 cagcgttgga acagaggttg g 21 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 tggcacaggt gtctcaaggg tag 23 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 5 atcacctttg ccgagtcagg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 6 acttctgcac gctccactac 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 7 tggttcccaa tgacccaagt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 8 ttcatcagct tcgccagaga 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 9 tactcaagac ccaggaccac 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 10 ggctttccag acacaaccaa 20
Claims (10)
상기 알츠하이머병은 흥분독성(excitotoxic) 물질로부터 유발된 것이 아니고, 뇌실하구역 내 신경세포의 감소, 뇌실하구역 내 신경줄기세포의 신경세포로의 분화능 저하 또는 뇌실하구역 내 액티빈 A 수용체의 발현량 저하로부터 유발된 것인 조성물.
A pharmaceutical composition for administration of a subventricular zone for preventing or treating Alzheimer's disease, comprising mesenchymal stem cells secreting activin A as an active ingredient,
The Alzheimer's disease is not caused by an excitotoxic substance, but is caused by a decrease in neurons in the subventricular zone, a decrease in the differentiation ability of nerve stem cells in the subventricular zone into neurons, or a decrease in the expression level of the activin A receptor in the subventricular zone. Composition.
The method according to claim 1, wherein the prevention or treatment is a pharmaceutical composition by promoting the differentiation of nerve stem cells into neurons in the subventricular zone.
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| Debanjana Chatterjee et al., Frontiers in Immunology, 2014년, 5권, 662호, 페이지 1-8. (2014.12.29.공개)* |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| AMND | Amendment | ||
| X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
| GRNT | Written decision to grant |