KR102102174B1 - Blood analyzer and method for blood analysis using the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 혈액 분석 장치 및 이를 포함하는 혈액 분석 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 적혈구의 농도 및 용적을 측정하는 혈액 분석 장치에 관한 것이고, 이를 이용하여 빈혈의 유무를 용이하게 판단할 수 있는 혈액 분석 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 혈액 분석 장치는 시료 내의 단일세포, 특히, 적혈구가 작업전극의 표면에 충돌 또는 흡착함으로써 발생하는 전류의 세기 변화를 통하여 적혈구의 농도 및 용적을 용이하게 측정할 수 있다.
특히, 적혈구의 농도 및 용적을 측정함으로써, 빈혈 또는 빈혈과 관련된 질병 등을 용이하게 진단할 수 있는 효과가 있다.The present invention relates to a blood analysis device and a blood analysis method comprising the same. More specifically, the present invention relates to a blood analysis device that measures the concentration and volume of red blood cells, and relates to a blood analysis method that can easily determine the presence or absence of anemia.
The blood analysis device according to an embodiment of the present invention can easily measure the concentration and volume of red blood cells through a change in the intensity of current generated by a single cell in a sample, particularly, red blood cells colliding or adsorbing on the surface of a working electrode. .
In particular, by measuring the concentration and volume of red blood cells, there is an effect that can easily diagnose anemia or diseases associated with anemia.
Description
본 발명은 혈액 분석 장치 및 이를 포함하는 혈액 분석 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 적혈구의 농도 및 용적을 측정하는 혈액 분석 장치에 관한 것이고, 이를 이용하여 빈혈의 유무를 용이하게 판단할 수 있는 혈액 분석 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a blood analysis device and a blood analysis method comprising the same. More specifically, the present invention relates to a blood analysis device that measures the concentration and volume of red blood cells, and relates to a blood analysis method that can easily determine the presence or absence of anemia.
적혈구(Red blood cell, RBCs)는 혈액세포 중에서 수적으로 가장 큰 비중을 차지하는 세포로 붉은 색의 납작한 원반 모양을 하고 있으며, 혈관을 통해 우리 몸의 조직에 산소를 공급하고 이산화탄소를 제거하는 역할을 한다.Red blood cells (RBCs) are cells that occupy the largest number among blood cells, and have a red flat disk shape, supplying oxygen to the tissues of our body through blood vessels and removing carbon dioxide. .
한편, 적혈구의 비정상적인 사이즈 및 양과 관련된 질병을 빈혈이라 한다. 보다 구체적으로, 빈혈은 다량의 출혈, 방사선 피폭, 철분 결핍, 비타민 결핍, 암, 항암제 투여, 당뇨병 및 골수 이상 등으로 인하여 발생할 수 있다. 빈혈은 그 자체로 심각한 건강 문제를 일으킬 수 있으며, 뿐만 아니라 다른 복잡한 질병 등의 원인 되기도 한다. 그러나, 대부분의 빈혈과 관련된 질병은 일찍 발견하기 어렵기 때문에 치료 가능한 단계를 지나서야 발견하게 되는 경우가 대다수이다.Meanwhile, anemia associated with an abnormal size and amount of red blood cells is called anemia. More specifically, anemia can occur due to large amounts of bleeding, radiation exposure, iron deficiency, vitamin deficiency, cancer, anticancer drug administration, diabetes and bone marrow abnormalities. Anemia itself can cause serious health problems, as well as other complex diseases. However, most anemia-related diseases are difficult to detect early, so they are often found only after a treatable stage.
이에 따라, 빈혈의 조기 발견과 즉각적인 치료는 빈혈과 관련된 질병의 위험을 상당히 감소시킬 수 있어, 혈액 검사는 임상 진단을 위한 중요한 정보를 제공하고, 질병 진행 및 치료 중 환자 건강의 변화를 모니터링 함으로써 질병 예방에 도움이 될 수 있다.Accordingly, early detection and immediate treatment of anemia can significantly reduce the risk of diseases associated with anemia, so blood tests provide important information for clinical diagnosis and monitor disease progression and changes in patient health during treatment. It can help prevent.
병원에서는 혈액 분석기를 이용하여 혈액 분석을 수행하며, 혈액 분석을 통하여 CBC(complete blood count)를 제공한다. 예를 들어, CBC는 적혈구 수, 적혈구 용적률(HCT), Hb 수치, 평균적혈구혈용적(mean corpuscular volume, MCV), 평균적혈구혈색소량(mean corpuscular hemoglobin, MCH) 및 평균적혈구혈색소량농도(mean corpuscular hemoglobin concentration, MCHC)를 제공한다.The hospital performs blood analysis using a blood analyzer, and provides a complete blood count (CBC) through blood analysis. For example, CBC is the number of erythrocytes, erythrocyte volume ratio (HCT), Hb level, mean corpuscular volume (MCV), mean corpuscular hemoglobin (MCH) and mean erythrocyte hemoglobin (mean corpuscular) hemoglobin concentration (MCHC).
그 중에서도 적혈구의 수, 적혈구의 용적 및 헤모글로빈 수치는 직접 측정할 수 있으며, MCV, MCH, MCHC는 적혈구의 수, 적혈구의 용적, 헤모글로빈 수치를 이용하여 계산되며, 특히, 적혈구의 수와 적혈구의 용적은 특정 빈혈진단의 주요지표로 사용될 수 있다.Among them, the number of red blood cells, the volume of red blood cells, and the hemoglobin level can be directly measured. MCV, MCH, and MCHC are calculated using the number of red blood cells, the volume of red blood cells, and the hemoglobin level. In particular, the number of red blood cells and the volume of red blood cells Can be used as a key indicator of specific anemia diagnosis.
그러나, 상술한 적혈구의 수, 적혈구의 용적 등을 측정하기 위한 장비(CBC는 장비)는 부피가 크고 비싸며, 숙련된 전문가만이 처리할 수 있는 문제가 있다. 아울러, 상술한 적혈구 수, 적혈구의 용적을 측정하기 위해서는 많은 양의 혈액(~10mL)이 필요하기 때문에, 정맥 주사를 통해 많은 양의 혈액을 얻는 과정은 환자에게 불편을 줄 수 있다.However, the above-described equipment for measuring the number of red blood cells, the volume of red blood cells (CBC equipment) is bulky and expensive, and there is a problem that only an expert can handle. In addition, since a large amount of blood (~ 10 mL) is required to measure the number of red blood cells and the volume of red blood cells, the process of obtaining a large amount of blood through intravenous injection may cause inconvenience to the patient.
따라서, 빈혈의 진단, 즉, 적혈구의 수와 용적을 용이하게 측정할 수 있는 현장진단(point of care) 장치가 필요한 실정이다.Therefore, there is a need for a diagnosis of anemia, that is, a point of care device capable of easily measuring the number and volume of red blood cells.
지금까지 개발된 현장진단(point of care)용 혈액 검사 센서는 대략 광학센서 및 전기 화학센서로 분류할 수 있다. 이 중, 광학센서는 환자들이 사용하기 용이하며, 신속하게 측정가능하나, 헤모글로빈(Hb) 농도만 모니터링 할 수 있다. 따라서, 광학센서는 철 결핍으로 인한 빈혈의 유형을 예측하는 것은 이상적이지만 다른 유형의 빈혈에는 적합하지 않다. The blood test sensors for point of care developed so far can be roughly classified into optical sensors and electrochemical sensors. Of these, the optical sensor is easy for patients to use and can be quickly measured, but can monitor only hemoglobin (Hb) concentration. Therefore, the optical sensor is ideal for predicting the type of anemia due to iron deficiency, but it is not suitable for other types of anemia.
아울러, 전기화학적 센서는 헤모글로빈(Hb)을 측정하기 위하여 두 가지 방법(철 또는 임피던스 측정)을 사용한다. 그러나, 이러한 방법으로는 적혈구와 관련된 빈혈(비정상적인 적혈구의 크기와 양)을 검출할 수 없는 문제가 발생하였다.In addition, the electrochemical sensor uses two methods (iron or impedance measurement) to measure hemoglobin (Hb). However, with this method, a problem in which anemia associated with red blood cells (the size and amount of abnormal red blood cells) cannot be detected has occurred.
따라서, 종래의 빈혈센서(광학센서 및 전기화학적 센서)에서 제공하지 않는 적혈구의 농도와 용적에 직접 측정하고 이에 대한 정보를 제공할 수 있는 빈혈센서의 개발이 필요한 실정이다.Therefore, there is a need to develop an anemia sensor that can directly measure and provide information on the concentration and volume of red blood cells that are not provided by conventional anemia sensors (optical sensor and electrochemical sensor).
본 발명은 전술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 초미세전극 표면에 대한 단일입자 충돌법을 활용하여 혈액 내의 적혈구의 농도 및 용적을 전기화학적으로 검출할 수 있는 혈액 분석 장치를 제공하고자 한다.The present invention is to solve the above-mentioned problems, and to provide a blood analysis device capable of electrochemically detecting the concentration and volume of red blood cells in the blood by utilizing a single particle collision method on the ultrafine electrode surface.
아울러, 본 발명은 상술한 혈액 분석 장치를 이용하여 빈혈을 유무를 용이하게 판단할 수 있는 혈액 분석 방법을 제공하고자 한다.In addition, the present invention is to provide a blood analysis method that can easily determine the presence or absence of anemia using the above-described blood analysis device.
상기 목적을 달성하기 위하여,In order to achieve the above object,
본 발명의 일 실시예에서,In one embodiment of the invention,
산화환원종을 포함하는 반응 용액 및 시료가 포함되는 반응부;A reaction unit containing a reaction solution and a sample containing redox species;
반응부 내에 위치하며, 상대전극, 기준전극, 및 작업전극을 포함하는 전극부; 및An electrode unit positioned in the reaction unit and including a counter electrode, a reference electrode, and a working electrode; And
시료 내의 단일 세포가 작업전극의 표면에 충돌 또는 흡착시 발생하는 전류의 세기 변화를 통하여 단일세포의 농도 및 용적을 측정하는 측정부; 를 포함하는 혈액 분석 장치를 제공한다.A measuring unit for measuring the concentration and volume of a single cell through a change in intensity of a current generated when a single cell in a sample collides or adsorbs on the surface of a working electrode; It provides a blood analysis device comprising a.
또한, 본 발명의 다른 일 실시예에서,In addition, in another embodiment of the present invention,
산화환원종을 포함하는 반응 용액 및 시료를 상기 혈액 분석 장치의 반응부에 주입하는 단계; 및Injecting a reaction solution and a sample containing redox species into a reaction portion of the blood analysis device; And
시료 내의 단일 세포가 작업전극의 표면에 충돌 또는 흡착시 발생하는 전류의 세기 변화를 통하여 단일세포의 농도 및 용적을 측정하는 단계; 를 포함하는 혈액 분석 방법을 제공한다.Measuring the concentration and volume of a single cell through a change in intensity of a current generated when a single cell in a sample collides or adsorbs on the surface of a working electrode; It provides a blood analysis method comprising a.
본 발명의 일 실시예에 따른 혈액 분석 장치는 시료 내의 단일세포, 특히, 적혈구가 작업전극의 표면에 충돌 또는 흡착함으로써 발생하는 전류의 세기 변화를 통하여 적혈구의 농도 및 용적을 용이하게 측정할 수 있다. The blood analysis device according to an embodiment of the present invention can easily measure the concentration and volume of red blood cells through a change in the intensity of current generated by a single cell in a sample, particularly, red blood cells colliding or adsorbing on the surface of a working electrode. .
특히, 적혈구의 농도 및 용적을 측정함으로써, 빈혈 또는 빈혈과 관련된 질병 등을 용이하게 진단할 수 있으며, 특히, 적혈구의 용적을 측정함으로써, 종래의 방법으로는 가능하지 않은 비정상적인 적혈구 크기와 관련된 다양한 유형의 빈혈을 감지할 수 있다.In particular, by measuring the concentration and volume of red blood cells, anemia or diseases associated with anemia can be easily diagnosed, and in particular, by measuring the volume of red blood cells, various types associated with abnormal red blood cell sizes not possible with conventional methods Can detect anemia.
이에 따라, 이러한 방법은 여러 종류의 빈혈을 용이하게 진단하고 빈혈 관련 질환의 진행을 모니터링하기 위한 POC(point-of-care) 빈혈 센서에 적용될 수 있다.Accordingly, this method can be applied to a point-of-care (POC) anemia sensor for easily diagnosing various types of anemia and monitoring the progress of anemia-related diseases.
도 1은 본 발명에 따른 혈액 분석 장치의 일 실시예를 도식적으로 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 혈액 분석 장치를 나타내는 블록도이다.
도 3은 K2EDTA가 처리된 적혈구 및 K2EDTA가 처리되지 않은 적혈구의 현미경 사진이다(K2EDTA가 처리된 PBS 용액 내의 적혈구; (A) 0시간, (B) 3시간 후, 미처리된 PBS 용액 내의 적혈구; (C) 0시간, (D) 3시간 후).
도 4는 50mV/s 의 스캔 속도에서 Pt UME (직경 25㎛)를 포함하는 PBS 용액 중의 400mM 페로시안화합물의 순환 전압-전류곡선(cyclic voltammogram)을 나타내는 그래프이다.
도 5는 초미세전극 표면에서의 산화환원종(페로시안화 이온)의 산화 모식도, 및 적혈구 충돌에 의한 산화환원종의 산화 중단 및 그에 의한 전류의 변화 개요를 나타낸다.
도 6은 초미세전극의 표면에서 적혈구 충돌의 전류-시간(i-t) 곡선을 나타낸다((A) 혈장, (B) 3.3fM 적혈구, (C) 8.3fM 적혈구, (D) 41fM 적혈구 및 (E) 79fM 적혈구).
도 7의 (a)는 다양한 적혈구 농도에서의 충돌 빈도, (b)는 충돌 빈도에 따른 RBC(적혈구) 수/㎕의 회귀 도표를 나타낸다(오차 막대는 적어도 세 번의 측정에 대한 표준 편차를 나타냄).
도 8의 (a)는 UME 에서 적혈구 충돌에 의한 계단 전류 감소 분석 시뮬레이션 이미지이고, (b)는 UME 에서 적혈구의 착지점(landing position)에 따른 전류 감소 정도(■: 6.0㎛, △: 7.5㎛, ▼: 8.5㎛, ○: 10.0㎛, 및 ●: 12.0㎛의 직경을 갖는 적혈구가 사용됨)를 나타낸 그래프이며, (c)는 UME 에서 적혈구가 충돌한 후 예상된 평균 전류 감소 정도를 나타낸 그래프이고, (d)는 직경이 증가함에 따른 적혈구의 부피를 나타낸 그래프이며, 및 (e)는 계단 전류 감소 정도에 기반한 적혈구의 부피를 나타내는 그래프이다.
도 9는 6개의 정상 혈액 샘플로부터 계산된 MCVc 를 나타내는 도표이다(Δi 는 CA 가 측정한 전류 감소 정도를 나타내며(세번째 열), 하나의 RBC 의 부피는 Δi의 값을 삽입함으로써 얻어진다(네번째 열). 아울러, 네번째열의 빨간색 수직선은 적혈구가 해당 부피를 기준으로 정렬될 때 충돌의 50%를 나타낸다. MCVC는 적혈구의 상위 50% 부피의 평균을 나타낸다(다섯번째 열)).
도 10은 UME와 적혈구 충돌의 3D 시뮬레이션 결과를 나타내는 그래프이다.1 is a diagram schematically showing an embodiment of a blood analysis device according to the present invention.
2 is a block diagram showing a blood analysis device according to the present invention.
3 is a photomicrograph of red blood cells treated with K2EDTA and red blood cells not treated with K2EDTA (red blood cells in PBS solution treated with K2EDTA; (A) 0 hours, (B) after 3 hours, red blood cells in untreated PBS solution; ( C) 0 hours, (D) 3 hours later).
4 is a graph showing a cyclic voltammogram of a 400 mM ferrocyanide compound in a PBS solution containing Pt UME (25 μm in diameter) at a scan speed of 50 mV / s.
5 shows a schematic diagram of oxidation of a redox species (ferrocyanide ion) on the surface of an ultrafine electrode, and an overview of changes in the current of the redox species due to redox collision and the change in current.
Figure 6 shows the current-time (it) curve of red blood cell collision at the surface of the ultrafine electrode ((A) plasma, (B) 3.3fM red blood cells, (C) 8.3fM red blood cells, (D) 41fM red blood cells and (E) 79fM red blood cells).
(A) of FIG. 7 shows the regression chart of the number / µl of RBC (red blood cells) according to the collision frequency at various erythrocyte concentrations, and (b) the collision frequency (error bars represent standard deviation for at least three measurements) .
8 (a) is a simulation image of a step-down current reduction due to a red blood cell collision in the UME, and (b) a current reduction degree according to a landing position of the red blood cells in the UME (■: 6.0 μm, Δ: 7.5 μm, ▼: 8.5㎛, ○: 10.0㎛, and ●: is a graph showing the red blood cells having a diameter of 12.0㎛), (c) is a graph showing the expected average current reduction after the red blood cells collide in the UME, (d) is a graph showing the volume of red blood cells as the diameter increases, and (e) is a graph showing the volume of red blood cells based on the degree of step current reduction.
FIG. 9 is a chart showing MCVc calculated from six normal blood samples (Δi represents the amount of current reduction measured by CA (third column), and the volume of one RBC is obtained by inserting the value of Δi (fourth column) In addition, the vertical red line in the fourth column represents 50% of the collision when the red blood cells are aligned by their volume, MCV C represents the average of the top 50% volume of the red blood cells (column 5)).
10 is a graph showing 3D simulation results of UME and red blood cell collision.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세하게 설명하고자 한다.The present invention can be applied to various changes and can have various embodiments, and specific embodiments will be illustrated in the drawings and described in detail.
그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.However, this is not intended to limit the present invention to specific embodiments, and should be understood to include all modifications, equivalents, and substitutes included in the spirit and scope of the present invention. In the description of the present invention, when it is determined that a detailed description of known technologies related to the present invention may obscure the subject matter of the present invention, the detailed description will be omitted.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.The terms used in this application are only used to describe specific embodiments, and are not intended to limit the present invention. Singular expressions include plural expressions unless the context clearly indicates otherwise.
본 발명에서, "포함한다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.In the present invention, terms such as “comprises” or “have” are intended to indicate that there are features, numbers, steps, operations, components, parts, or combinations thereof described in the specification, and one or more other features. It should be understood that the existence or addition possibilities of fields or numbers, steps, actions, components, parts or combinations thereof are not excluded in advance.
본 발명은 혈액 분석 장치 및 이를 포함하는 혈액 분석 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 적혈구의 농도 및 용적을 측정하는 혈액 분석 장치에 관한 것이고, 이를 이용하여 빈혈의 유무를 용이하게 판단할 수 있는 혈액 분석 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a blood analysis device and a blood analysis method comprising the same. More specifically, the present invention relates to a blood analysis device that measures the concentration and volume of red blood cells, and relates to a blood analysis method that can easily determine the presence or absence of anemia.
본 발명의 일 실시예에 따른 혈액 분석 장치는 시료 내의 단일세포, 특히, 적혈구가 작업전극의 표면에 충돌 또는 흡착함으로써 발생하는 전류의 세기 변화를 통하여 적혈구의 농도 및 용적을 용이하게 측정할 수 있다. The blood analysis device according to an embodiment of the present invention can easily measure the concentration and volume of red blood cells through a change in the intensity of current generated by a single cell in a sample, particularly, red blood cells colliding or adsorbing on the surface of a working electrode. .
특히, 적혈구의 농도 및 용적을 측정함으로써, 빈혈 또는 빈혈과 관련된 질병 등을 용이하게 진단할 수 있는 효과가 있다.In particular, by measuring the concentration and volume of red blood cells, there is an effect that can easily diagnose anemia or diseases associated with anemia.
본 명세서에서 사용되는 용어 "세포"는 생명체를 구성하는 구조적인 기본단위로, 본 발명에서 농도 및 용적 측정의 대상이 되는 대상을 의미하며, 적혈구(RBC)를 의미할 수 있다.As used herein, the term "cell" is a structural basic unit constituting a living organism, and in the present invention, refers to an object that is an object of concentration and volume measurement, and may mean red blood cells (RBC).
본 명세서에서 사용되는 용어 "시료"는 상기 세포인 함유하는 것이라면 어떠한 유형도 가능하나, 적혈구를 함유하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 시료는 본 발명에 따른 반응부에 투입되기 전에 정제 또는 농축되지 않은 상태로 사용할 수 있으며, 시료에 따라 입자가 지나치게 큰 경우, 예를 들어 수 십 또는 수 백㎛이상의 크기를 가지는 입자가 포함되어 있는 경우, 적절한 필터를 여과함으로써 큰 입자를 제거할 수 있다.As used herein, the term "sample" may be of any type as long as it contains the above-mentioned cells, but preferably contains red blood cells. In addition, the sample may be used in a purified or unconcentrated state before being introduced into the reaction unit according to the present invention, and if the particles are too large depending on the sample, for example, particles having a size of tens or hundreds of µm or more may be used. If so, large particles can be removed by filtering the appropriate filter.
본 발명에서, 단일입자 충돌법을 이용한 적혈구의 검출은 1) 전기영동적 이동 및 2) 전기활성화 영역의 차단이라는 두 순차적 전략에 따라 수행된다. 용액 중의 산화환원종인 페로시안화 이온이 작업전극 표면에 산화되는 경우, 정상 상태 전류 흐름에 의하여 작업전극 표면 근처의 양의 전기장이 발생하므로, 음으로 하전된 적혈구 개체는 전기영동적 이동을 통하여 작업전극 표면으로 끌려간다. 전류 수준은 충돌 사건이 일어날 때까지 방사상 확산에 의하여 유지된다. 적혈구 개체가 활성전극 표면에 충돌하여 부착되면, 산화환원종의 흐름이 부착된 적혈구에 의하여 차단되기 때문에, 정상 상태 전류의 수준은 즉시 감소된다.In the present invention, detection of red blood cells using a single particle collision method is performed according to two sequential strategies: 1) electrophoretic movement and 2) blocking of the electroactive region. When ferrocyanide, a redox species in solution, is oxidized on the surface of the working electrode, a positive electric field near the surface of the working electrode is generated by the steady-state current flow, so the negatively charged red blood cells are subject to the working electrode surface through electrophoretic movement. Being dragged into. The current level is maintained by radial diffusion until a collision event occurs. When the erythrocyte individual attaches to the surface of the active electrode, the level of steady-state current is immediately reduced because the flow of redox species is blocked by the attached erythrocyte.
아울러, 본 발명에서 헤모글로빈 농도 측정수단은 헤모글로빈의 햄(HEME) 기에 포함된 Fe2+의 가역적 산화환원반응(Reversible Redox)에 의해 형성된 상기 작업전극과 보조전극 사이의 전류측정을 통해 헤모글로빈 농도를 측정할 수 있으며, 구체적으로, 헤모글로빈의 햄(HEME)기에 포함된 Fe2+와 전자전달 매개체에 혼합된 Fe3+ 와의 가역적 산화, 환원 반응에 의해 두 전극 사이에 흐른 전류의 크기로 헤모글로빈 농도를 측정할 수 있다.In addition, in the present invention, the hemoglobin concentration measuring means measures the hemoglobin concentration by measuring the current between the working electrode and the auxiliary electrode formed by the reversible redox reaction of Fe 2+ contained in the heme group of hemoglobin (HEME). Specifically, hemoglobin concentration is measured by the magnitude of the current flowing between the two electrodes by reversible oxidation and reduction reaction between Fe 2+ contained in a heme group of hemoglobin and Fe 3+ mixed in an electron transport medium. can do.
본 발명은 일 실시예에에서,The present invention in one embodiment,
산화환원종을 포함하는 반응 용액 및 시료가 포함되는 반응부;A reaction unit containing a reaction solution and a sample containing redox species;
반응부 내에 위치하며, 상대전극, 기준전극, 및 작업전극을 포함하는 전극부; 및An electrode unit positioned in the reaction unit and including a counter electrode, a reference electrode, and a working electrode; And
시료 내의 단일 세포가 작업전극의 표면에 충돌 또는 흡착함으로써 발생하는 전류의 세기 변화를 통하여 단일세포의 농도 및 용적을 측정하는 측정부; 를 포함하는 혈액 분석 장치를 제공한다.A measurement unit for measuring the concentration and volume of a single cell through a change in intensity of a current generated by a single cell colliding or adsorbing on the surface of a working electrode; It provides a blood analysis device comprising a.
도 1은 본 발명에 따른 혈액 분석 장치의 일 실시예를 도식적으로 나타낸 도면이며, 도 2는 본 발명에 따른 혈액 분석 장치를 나타내는 블록도이다.1 is a diagram schematically showing an embodiment of a blood analysis device according to the present invention, and FIG. 2 is a block diagram showing a blood analysis device according to the present invention.
도 1 및 도 2를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 혈액 분석 장치는 반응부(100), 전극부(110), 측정부(200) 및 분석부(300)를 포함하여 구성된다.1 and 2, the blood analysis device according to an embodiment of the present invention includes a
반응부(100)는 본 발명에서 활용하는 사건인 작업전극(113)과 시료 중의 단일입자 간의 충돌이 발생하는 곳으로, 검출 대상인 단일 세포가 일정 기간 동안 반응부(100) 내의 반응 용액 중에 저장되면서 작업전극(113)과 충돌을 일으키는 공간을 제공한다. 상기 반응부(100)의 형상은 원통, 플레이트, 정육면체, 직육면체, 정다면체, 다각기둥, 구일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 원통, 다각기둥인 것이 바람직하다. 상기 반응부(100)의 크기에는 제한이 없으나, 한 면의 길이가 0.5cm 이상인 것이 바람직하다.The
작업전극(113)은 전극 반응에 직접 참가하여 반응을 일으키는 전극을 의미하며, 본 발명에서 사용되는 작업전극(113)은 반응 용액 중의 산화환원종이 산화 반응을 일으키는 전극을 의미한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 초미세전극(UME)은 탄소 섬유, 인듐 산화주석, 불소도핑 산화주석, 보론도핑 다이아몬드, 금, 은, 백금, 구리, 니켈 등 금속 및 비금속 전도성 물질로 구성될 수 있다. The working
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 작업전극(113) 표면의 형상은 원형, 타원형, 삼각형, 사각형, 오각형 등 다각형, 구형, 반구형 또는 비정형일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 원형, 구형, 반구형인 것이 바람직하다. 이는 원형이 전극 중심으로부터 전극 가장자리까지의 최대거리가 일정한 것에 기인한다. According to an embodiment of the present invention, the shape of the surface of the working
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 작업전극(113)은 초미세전극으로 이루어질 수 있으며, 전극 표면의 최대 대각선 길이가 10 내지 500μm인 것이 바람직하다. 일 예로, 25μm일 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the working
본 발명의 일 실시예에 따르면, 반응부(100)에 장착되는 작업전극(113)은 1개, 또는 작업전극(113)의 표면의 최대대각선 길이가 상이한 2개 이상일 수 있으며, 작업전극(113)의 최대대각선 길이를 달리 하는 2개 이상의 작업전극(113)을 장착함으로써 상이한 크기를 갖는 적혈구의 존재 여부, 그의 농도 또는 부피를 동시에 검출할 수 있다. According to an embodiment of the present invention, the working
기준전극(112)은 전위 측정 시 단극전위가 일정하여 기준이 될 수 있는 전극을 의미한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 기준전극(112)은 은(Ag)으로 이루어질 수 있으며, Ag/AgCl(3M KCl)일 수 있다. The
상대전극(111)은 작업전극(113) 또는 기준전극(112)과 짝지어 전극반응을 일으키는 전극을 의미한다. 본 발명의 일 실시예 에 따르면, 상기 상대전극(111)은 백금(Pt), 금(Au) 산화이리듐(IrO2) 등으로 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 작업전극의 면적보다 5배 이상 큰 면적을 가지는 다양한 형태의 전극일 수 있다. The
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상대전극(111) 및 기준전극(112)은 작업전극(113)의 형상 및 크기와 동일하거나 다르게 형성될 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the
본 발명의 일 실시예에 따르면, 작업전극(113), 상대전극(111) 및/또는 기준전극(112)이 반응부(100) 내에 장착되는 위치에는 제한이 없으나, 반응부(100) 벽에 부착되는 것보다는 반응부(100) 벽과 이격되어 장착된 것이 바람직하다. 또한, 기준전극(112)과 작업전극(113) 간의 거리에는 제한이 없으나, 1cm 이내에 배치되는 것이 바람직하다.According to an embodiment of the present invention, the working
이에 더하여, 본 발명의 측정부(200)는 시료 내의 단일 세포가 작업전극(113)의 표면에 충돌 또는 흡착시 발생하는 전류의 세기 변화를 통하여 단일세포의 농도, 용적 또는 농도와 용적 모두를 측정하기 위한 것으로, 단일세포의 농도를 측정하는 농도측정수단(210)과 단일세포의 용적을 측정하는 용적측정수단(220)을 포함할 수 있다.In addition, the measuring
구체적으로, 상기 단일세포가 작업전극(113) 표면에 충돌 또는 흡착함으로써 발생하는 전류의 세기 변화값을 측정부(200)로 전달하여 단일세포의 농도 또는 용적을 측정할 수 있다.Specifically, the concentration or volume of a single cell can be measured by transferring the intensity change value of the current generated by the single cell colliding or adsorbing on the surface of the working
한편, 적혈구의 수(적혈구의 농도)를 측정할 때, 하기의 계산식 1에 의해서 ㎕당 적혈구의 수를 도출할 수 있다.On the other hand, when measuring the number of red blood cells (concentration of red blood cells), it is possible to derive the number of red blood cells per µl by the following equation (1).
[계산식 1][Calculation formula 1]
여기서, NRBC는 ㎕당 적혈구의 수이고, NC는 충돌 빈도를 나타낸다.Here, N RBC is the number of red blood cells per µl, and N C represents the collision frequency.
즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 혈액 분석 장치를 이용하여 단일세포(적혈구)가 작업전극(113) 표면에 충돌 또는 흡착함으로써 발생하는 전류의 세기 변화값을 측정하여 충돌빈도를 측정하고, 상기 적혈구의 충돌 빈도를 이용하여, 상기 계산식 1에서 적혈구의 수(적혈구 농도)를 용이하게 도출할 수 있다.That is, by using a blood analysis device according to an embodiment of the present invention, a single cell (erythrocyte) is measured by changing the intensity of the current generated by collision or adsorption on the surface of the working
아울러, 적혈구의 부피는 하기의 계산식 2에 의해서 적혈구의 부피를 도출할 수 있다:In addition, the volume of red blood cells can be derived from the following formula 2:
[계산식 2][Calculation formula 2]
여기서, VRBC는 전류 감소로부터 계산된 적혈구의 부피이며, Δi는 전류 감소의 크기를 나타낸다.Here, V RBC is the volume of red blood cells calculated from the current reduction, and Δi represents the magnitude of the current reduction.
한편, 농도측정수단에서 도출된 적혈구의 농도값을 이용하여 빈혈을 진단할 수 있으나, 적혈구의 수(농도)만으로 빈혈을 진단하는 경우, 비정상적인 적혈구의 용적(부피)에 의해서 발생하는 빈혈을 진단 할 수 없게 된다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 혈액 분석 장치는 상기 농도측정수단에서 측정한 적혈구의 농도와 용적측정수단에서 측정한 적혈구의 용적값을 이용하여 혈액을 분석함으로써, 보다 정확한 빈혈을 진단할 수 있다.On the other hand, anemia can be diagnosed using the concentration value of red blood cells derived from the concentration measurement means, but when anemia is diagnosed only by the number (concentration) of red blood cells, anemia caused by abnormal volume of red blood cells (volume) can be diagnosed. It becomes impossible. Therefore, the blood analysis apparatus according to an embodiment of the present invention can diagnose more accurate anemia by analyzing blood using the concentration of red blood cells measured by the concentration measuring means and the volume of red blood cells measured by the volume measuring means. have.
이와 관련하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 혈액 분석 장치는 분석부(300)를 포함하며, 상기 분석부(300)는 각각의 농도측정수단(210) 및 용적측정수단(220)에서 측정한 단일세포의 농도 및 용적을 비교하고, 측정 대상 단일세포의 평균 개별 용적을 도출하여, 상기 단일세포의 농도에 따른 개별 용적을 분석하기 위한 비교분석수단(310)을 포함한다.In this regard, the blood analysis device according to an embodiment of the present invention includes an
일 예로, 비교분석수단(310) 에서는 용적측정수단(220)에서 각각 측정한 개별 단일세포의 용적을 측정할 수 있고, 이를 평균값으로 도출하여 단일세포의 개별 용적을 도출할 수 있다.As an example, the comparative analysis means 310 may measure the volume of each single cell measured by the volume measurement means 220, and derive the average value to derive the individual volume of a single cell.
한편, 적혈구의 농도(적혈구의 수)는 농도측정수단(210)에서 측정되고, 적혈구의 용적(부피)는 용적측정수단(220)에서 측정되지만, 이는 하나의 전극, 작업전극(113)에서 상기 단일세포의 충돌에 따른 전류 변화에 따라 측정될 수 있다On the other hand, the concentration of red blood cells (the number of red blood cells) is measured by the concentration measuring means 210, and the volume (volume) of the red blood cells is measured by the volume measuring means 220, which is the electrode, the working
이에 더하여, 본 발명의 다른 실시예에서는 보다 정확한 빈혈진단을 하기 위하여, 측정부에 적혈구 내의 헤모글로빈의 농도를 측정할 수 있는 헤모글로빈 농도 측정수단을 더 포함할 수 있다. 헤모글로빈 농도 측정 수단은 통상적인 헤모글로빈의 수치를 측정하기 위한 장치일 수 있으며, 헤모글로빈의 헴(HEME)기에 포함된 Fe2+와 산화환원 반응 물질의 가역적 산화환원 반응에 의해 형성된 상기 작업전극과 보조전극 사이의 전류를 측정하여 헤모글로빈 수치를 측정할 수 있다. 일 예로, 헤모글로빈 농도 측정수단은 전압전류법을 이용하여, 작업전극과 보조전극간의 헤모글로빈의 산화환원에 의해 발생된 전류값을 측정할 수 있다. In addition, in another embodiment of the present invention, in order to more accurately diagnose anemia, the measuring unit may further include a hemoglobin concentration measuring means capable of measuring the concentration of hemoglobin in the red blood cells. The means for measuring hemoglobin concentration may be a device for measuring the level of hemoglobin, and the working electrode and the auxiliary electrode formed by the reversible redox reaction of Fe 2+ and a redox reactant contained in the heme group of hemoglobin Hemoglobin levels can be measured by measuring the current between them. As an example, the hemoglobin concentration measurement means may measure a current value generated by oxidation and reduction of hemoglobin between a working electrode and an auxiliary electrode using a voltage current method.
이때, 헤모글로빈의 수치를 측정하기 위하여, 상술한 전극부(단일세포의 농도 및 용적 측정시 사용되는 전극부)와는 별도로 추가의 반응부(미도시, 작업전극 및 보조전극)를 포함할 수 있다.At this time, in order to measure the value of hemoglobin, it may include an additional reaction unit (not shown, working electrode and auxiliary electrode) separately from the above-described electrode unit (electrode unit used to measure the concentration and volume of a single cell).
아울러, 헤모글로빈 농도 측정 수단에서 측정한 헤모글로빈의 농도값은 상술한 단일세포의 농도 및 용적값, 구체적으로 적혈구의 농도 및 용적값과 비교될 수 있다. 이 또한, 상기의 비교분석수단(310)의 분석부(300)에서 이루어질 수 있으며, 각각의 측정한 값을 서로 비교함으로써, 빈혈여부를 측정할 수 있다.In addition, the concentration value of hemoglobin measured by the hemoglobin concentration measurement means may be compared with the concentration and volume value of the single cell described above, specifically, the concentration and volume value of red blood cells. This can also be made in the
결론적으로, 본 발명의 혈액 분석 장치는 적혈구의 농도, 평균 혈구 용적 및 헤모글로빈의 농도(수치)를 측정하고, 이들의 조합에 의해서 정확한 빈혈을 진단할 수 있다.In conclusion, the blood analysis device of the present invention can measure the concentration of red blood cells, the average blood cell volume, and the concentration (number) of hemoglobin and diagnose anemia accurately by a combination of these.
전극부(110) 내의 세 전극은 연속적인 전해질 수용액 속에 담겨있어 전기적으로 연결되어 있어야 하며, 각 전극이 오염되는 것을 방지하기 위하여 분리막을 통해 전해질로 연결되어 사용할 수 있다.The three electrodes in the electrode unit 110 are contained in a continuous aqueous electrolyte solution and must be electrically connected, and can be used by being connected to the electrolyte through a separator to prevent contamination of each electrode.
아울러, 반응 용액은 전극 반응을 수행하기 위한 각종 이온 등 물질을 제공하는 역할을 하며, 측정하고자 하는 시료를 포함할 수 있고, 산화환원종을 포함할 수 있다. 한편, 상기 시료는 반응부 내에서 작업전극과의 충돌과정을 일으키는 동안 일정 시간 저장됨에 기인하여 추가의 저장부 내에 저장될 수 있으며, 검출대상인 적혈구에 알맞은 조건인 온도(예를 들어, 37℃) 또는 시간을 결정할 수 있다.In addition, the reaction solution serves to provide a material such as various ions for performing an electrode reaction, may include a sample to be measured, and may include redox species. Meanwhile, the sample may be stored in an additional storage unit due to being stored for a certain period of time while causing a collision process with a working electrode in the reaction unit, and a temperature (for example, 37 ° C) which is a condition suitable for red blood cells to be detected. Or you can decide the time.
한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 시료는 적혈구를 포함하는 용액으로, 혈액 세포를 안정적으로 유지하고 형태를 유지하기 위하여 항응고제를 포함할 수 있다. 혈액에 첨가함으로써 응고를 저지하는 옥살산염, 시트르산과 같은 항응혈제를 첨가할 수 있으며, 일 예로, K2EDTA를 함유하는 완충용액에 측정하고자 하는 혈액을 첨가하여 사용할 수 있다.Meanwhile, the sample according to an embodiment of the present invention is a solution containing red blood cells, and may include an anticoagulant to stably maintain blood cells and maintain morphology. Anticoagulants such as oxalate and citric acid, which block clotting, can be added by adding to blood, and for example, blood to be measured can be added to a buffer solution containing K2EDTA.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 반응 용액은 산화환원종으로서 페로시안화(ferrocyanide) 이온, 페리시안화(ferricyanide) 이온, 육아민화 루테늄(ruthenium, Ru) 이온, 하이드로퀴논(hydronquinone), 아스코르브산(ascorbic acid), 도파민(dopamine), 페로센메탄올(ferrocenemethanol), 페로센(ferrocene), 페로센다이메탄올(ferrocenedimethanol), α-메틸페로센메탄올, 페로센카복시산(ferrocene carboxylic acid), 페로센다이카복시산(ferrocene dicarboxylic acid), 페로센알데하이드(ferrocene aldehyde) 등으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the reaction solution is a redox species of ferrocyanide (ferrocyanide) ions, ferricyanide (ferricyanide) ions, ruthenium hexamide (ruthenium, Ru) ions, hydroquinone (hydronquinone), ascorbic acid ( ascorbic acid, dopamine, ferrocenemethanol, ferrocene, ferrocenedimethanol, α-methylferrocenemethanol, ferrocene carboxylic acid, ferrocene dicarboxylic acid ), Ferrocene aldehyde (ferrocene aldehyde), or the like.
이에 더하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 혈액 분석 장치는 작업전극에서의 시간의 흐름에 따른 전류의 세기 변화를 표시하는 출력부를 더 포함할 수 있다.In addition to this, the blood analysis apparatus according to an embodiment of the present invention may further include an output unit for displaying a change in the intensity of the current over time in the working electrode.
이하, 초미세전극(ultra-microelectrode, UME)에서 적혈구의 전기 화학적 충돌을 이용하여, 적혈구의 수를 검출할 뿐만 아니라, 인간 혈액 내의 개별 적혈구의 용적(즉, 적혈구의 MCV)를 측정하기 위한 실시예 및 실험예를 상세히 설명한다.Hereinafter, by using an electrochemical collision of red blood cells in an ultra-microelectrode (UME), not only to detect the number of red blood cells, but also to measure the volume of individual red blood cells in human blood (ie, MCV of red blood cells) Examples and experimental examples will be described in detail.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples and experimental examples are merely illustrative of the present invention, and the contents of the present invention are not limited to the following examples and experimental examples.
<제조예><Production Example>
제조예 1. 작업전극의 제조Manufacturing Example 1. Preparation of working electrode
작업전극을 제조하기 위하여 Pt-UME 를 통상적인 절차에 따라 제조하였다. 보다 구체적으로, 유리 모세관을 아세톤, 에탄올 및 증류수로 세척한 후, 직경 25㎛의 Pt 와이어를 모세관에 밀봉하였다. 그 후, 상기 전극을 경면(mirror finish)과 같이 되도록 다이아몬드 막(0.1㎛, Allied High Tech Products, Inc.)과 알루미나 분말(0.05㎛, Allied High Tech Products, Inc.)로 연마하였다.To prepare the working electrode, Pt-UME was prepared according to a conventional procedure. More specifically, after washing the glass capillary with acetone, ethanol and distilled water, a Pt wire having a diameter of 25 μm was sealed in the capillary. Thereafter, the electrode was polished with a diamond film (0.1 μm, Allied High Tech Products, Inc.) and alumina powder (0.05 μm, Allied High Tech Products, Inc.) so as to have a mirror finish.
그리고, Pt-UME 를 제조한 후, 상기 전극을 20mM 페로센 메탄올 용액 중의 표준 산화환원 전기화학으로 테스트 하였다.Then, after preparing Pt-UME, the electrode was tested by standard redox electrochemistry in a 20 mM ferrocene methanol solution.
각각의 실험 전에, 제조한 작업전극은 경면과 같은 표면이 관찰될 때까지 순차적으로 3㎛와 0.1㎛의 다이아몬드 래핑막으로 연마되었다.Before each experiment, the prepared working electrode was sequentially polished with a diamond wrapping film of 3 µm and 0.1 µm until a mirror-like surface was observed.
<실험준비><Preparation for Experiment>
1. 시료준비1. Sample preparation
혈액 샘플은 익명의 기증자로부터 얻었다. 상기 혈액(약 150㎕)은 일회용 혈액 주사기를 사용하여 인덱스 또는 중지로부터 수집되었다.Blood samples were obtained from anonymous donors. The blood (approximately 150 μl) was collected from index or middle finger using a disposable blood syringe.
아울러, 페로시안칼륨(Potassium ferrocyanide, 99.5%), 에틸렌디아민테트라아세트산 디칼륨염(ethylenediaminetetraacetic acid dipotassium salt dehydrate)(K2EDTA)(≥99.0%) 및 인산완충생리식염수(phosphate buffered saline)(PBS; 0.01 M, pH 7.4)를 시그마 알드리치(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)에서 구입하였으며, 추가의 정제 없이 사용하였다.In addition, potassium ferrocyanide (99.5%), ethylenediaminetetraacetic acid dipotassium salt dehydrate (K2EDTA) (≥99.0%) and phosphate buffered saline (PBS; 0.01 M , pH 7.4) were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) and used without further purification.
상기 완충액은 밀리포어(Millipore) 수로 제조하였으며, Pt 와이어는 Goodfellow(Devon, PA)에 의해 공급되었다.The buffer was prepared with Millipore water, and the Pt wire was supplied by Goodfellow (Devon, PA).
2. 전기화학적 측정장치2. Electrochemical measuring device
전기화학적 실험은 작업전극으로 25㎛ 직경의 백금 초미세전극(Pt UME), 상대전극으로 백금 와이어(Pt wire) 및 기준전극으로 Ag/AgCl 전극을 포함하는 3전극 셀로 구성된 CHI617B 퍼텐쇼스택(CH Instrument Inc., Austin, TX)의 전위차계로 수행되었다.The electrochemical experiment is a CHI617B potential stack (CH) consisting of a three-electrode cell comprising a platinum microfine electrode (Pt UME) with a diameter of 25 μm as a working electrode, a platinum wire (Pt wire) as a counter electrode, and an Ag / AgCl electrode as a reference electrode. Instrument Inc., Austin, TX).
그리고, 각각의 요소들은 페러데이 케이지(Wuhan Corrtest Instrument Co., Ltd, Wuhan, China)에 넣었으며, 현미경 이미지는 Nikon Eclipse LV100ND 현미경(Nikon Imaging Korea, Seoul, Korea)을 사용하여 촬영하였다.Then, each element was placed in a Faraday cage (Wuhan Corrtest Instrument Co., Ltd, Wuhan, China), and the microscope image was taken using a Nikon Eclipse LV100ND microscope (Nikon Imaging Korea, Seoul, Korea).
또한, 단일 적혈구 충돌의 이론적 전류 응답은 COMSOL Multiphysics® 5.2a를 사용하여 3D 시뮬레이션을 수행하였다.In addition, the theoretical current response of a single erythrocyte collision was performed by 3D simulation using COMSOL Multiphysics® 5.2a.
3. 혈액샘플 준비3. Blood sample preparation
먼저, 사람의 혈액(150㎕)을 2.0㎖ 미세 원심 분리 튜브에 수집하였으며, 혈액의 응고를 방지하기 위하여, K2EDTA(2.0㎎/㎖ blood)를 함유하는 0.6㎖의 PBS 용액(pH 7)을 첨가하였다. 이때, 희석 계수는 5였다.First, human blood (150 µl) was collected in a 2.0 ml microcentrifuge tube, and 0.6 ml of PBS solution (pH 7) containing K2EDTA (2.0 mg / ml blood) was added to prevent clotting of blood. Did. At this time, the dilution factor was 5.
그리고, 희석된 적혈구 용액(CPBS)의 몰 농도는 아래의 식을 사용하여 추정하였다:Then, the molar concentration of the diluted red blood cell solution (C PBS ) was estimated using the following equation:
[계산식 3][Calculation formula 3]
(여기서, Vbl은 혈액의 부피, Vs 는 PBS 용액의 부피, Cbl은 인체의 잔재 당 적혈구의 수(hemocytometer로 얻음) 이며, NA는 아보가드로의 상수이다.)(Here, V bl is the volume of blood, V s is the volume of PBS solution, C bl is the number of red blood cells per remnant of the human body (obtained by hemocytometer), and NA is the constant of Avogadro.)
그리고, 혈액 세포의 세포 성분과 형태를 보존하기 위하여 K2EDTA를 항응고제로 사용하였다.In addition, K2EDTA was used as an anticoagulant to preserve the cell components and morphology of blood cells.
도 3은 K2EDTA가 처리된 적혈구 및 K2EDTA가 처리되지 않은 적혈구의 현미경 사진이다(K2EDTA가 처리된 PBS 용액 내의 적혈구; (A) 0시간, (B) 3시간 후, 미처리된 PBS 용액 내의 적혈구; (C) 0시간, (D) 3시간 후).FIG. 3 is a micrograph of red blood cells treated with K2EDTA and red blood cells not treated with K2EDTA (red blood cells in PBS solution treated with K2EDTA; (A) 0 hours, (B) after 3 hours, red blood cells in untreated PBS solution; ( C) 0 hours, (D) 3 hours later).
K2EDTA로 처리한 혈액 샘플을 25℃에서 3시간동안 보관한 후 적혈구는 안정적이였으며, 응고되지 않았다.After storing the blood sample treated with K2EDTA at 25 ° C for 3 hours, the red blood cells were stable and did not coagulate.
그러나, 처리되지 않은 혈액 샘플은 3시간 이내에 상당히 빨리 응고된 것을 발견하였다. 따라서, K2EDTA가 실시예에서 항응고제로 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.However, it was found that the untreated blood sample solidified fairly quickly within 3 hours. Therefore, it was confirmed that K2EDTA can be used as an anticoagulant in the Examples.
4. 크로노암페로메트리(chronoamperometry, CA) 방법을 이용한 적혈구의 전기화학측정4. Electrochemical measurement of red blood cells using chronoamperometry (CA) method
CA 측정을 수행하기 위하여, 혈장(적혈구 미포함), 3.3fM, 8.3fM, 41fM 및 79fM 적혈구(RBC)를 400mM 페로시안화합물을 함유하는 PBS 용액(pH 7.4)에 첨가하였다.To perform CA measurements, plasma (without red blood cells), 3.3fM, 8.3fM, 41fM and 79fM red blood cells (RBC) were added to PBS solution containing 400mM ferrocyanide (pH 7.4).
한편, 준비된 혈액 샘플에서의 적혈구를 검출하기 위한 크로노암페로메트리(CA)를 측정하기 전에, PBS (pH 7.4)에 용해된 400mM Fe(CN)6 4-에 대하여 순환 전압-전류곡선(cyclic voltammogram)을 기록하였으며, 그 결과(CV)는 정상 상태 전류 범위가 0.4V(vs Ag/AgCl)인 S자형 곡선을 보였다(도 4 참조).On the other hand, before measuring the chronoamperometry (CA) for detecting red blood cells in the prepared blood sample, a cyclic voltage-current curve (cyclic) for 400 mM Fe (CN) 6 4- dissolved in PBS (pH 7.4) voltammogram) was recorded, and the result (CV) showed an S-shaped curve with a steady state current range of 0.4 V (vs Ag / AgCl) (see FIG. 4).
도 4는 50mV/s의 스캔 속도에서 Pt UME (직경 25㎛)를 포함하는 PBS 용액 중의 400mM 페로시안화합물의 순환 전압-전류곡선(cyclic voltammogram)을 나타내는 그래프이다.FIG. 4 is a graph showing a cyclic voltammogram of 400 mM ferrocyanide compound in PBS solution containing Pt UME (25 μm diameter) at a scan speed of 50 mV / s.
이 결과를 바탕으로, CA(chronoamperometry)는 전극 표면에서 Fe(CN)6 4-를 Fe(CN)6 3-로 완전히 산화시키는데 충분한 양의 전위인 0.6V 의 인가 전위에서 수행되었다.Based on these results, CA (chronoamperometry) was performed at an applied potential of 0.6 V, a potential sufficient to completely oxidize Fe (CN) 6 4- to Fe (CN) 6 3- at the electrode surface.
구체적으로, CA 측정은 25㎛ 직경의 Pt UME로 +0.6V(vs Ag/AgCl)의 인가된 전위에서 250초 동안 수행되었다.Specifically, the CA measurement was performed for 250 seconds at an applied potential of + 0.6V (vs Ag / AgCl) with 25 μm diameter Pt UME.
<실험예><Experimental Example>
실험예 1. 초미세전극 표면에서의 적혈구의 검출Experimental Example 1. Detection of red blood cells on the surface of ultrafine electrodes
적혈구의 충돌을 관찰하기 위하여 산화환원종으로 사용된 페로시안화 칼륨을 초미세전극 표면에서 연속적으로 산화시킨 결과, 계단 전류 반응을 확인하였다(도 5 참조).As a result of continuously oxidizing potassium ferrocyanide used as a redox species on the surface of the ultrafine electrode to observe the collision of red blood cells, a step current response was confirmed (see FIG. 5).
도 5는 초미세전극 표면에서의 산화환원종(페로시안화 이온)의 산화 모식도, 및 적혈구 충돌에 의한 산화환원종의 산화 중단 및 그에 의한 전류의 변화 개요를 나타낸다. 5 shows a schematic diagram of oxidation of a redox species (ferrocyanide ion) on the surface of an ultrafine electrode, and an overview of changes in the current of the redox species due to redox collision and the change in current.
특히, 산화환원종인 페로시안화합물(ferrocyanide, Fe(CN)6 4-)은 전극 표면에서 지속적으로 산화되어 양극의 정상 상태 전류를 생성하고 동시에 양의 전계를 형성하고, 음전하의 적혈구(-15.7mV)는 이동을 통해 UME 표면으로 유인되어 충돌하게 된다.In particular, the redox species of ferrocyanide (ferrocyanide, Fe (CN) 6 4- ) is continuously oxidized on the electrode surface to generate a steady-state current at the anode and at the same time to form a positive electric field, and negatively charged red blood cells (-15.7 mV). ) Is attracted to the UME surface through movement and collides.
단일 적혈구의 충돌한 다음 전극 표면의 흡착 후에는, 페로시안화합물의 산화플럭스가 차단되어 계단 전류가 감소하여 적혈구의 크기와 수에 대한 정량적인 정보를 제공할 수 있는 것으로 판단하였다.After the collision of a single erythrocyte and the adsorption of the electrode surface, it was determined that the oxidizing flux of the ferrocyanide compound was blocked to reduce the step current, thereby providing quantitative information on the size and number of red blood cells.
실험예 2. 실험 결과에 대한 용액 중 불순물의 영향 확인Experimental Example 2. Confirmation of the effect of impurities in the solution on the experimental results
도 6은 초미세전극의 표면에서 적혈구 충돌의 전류-시간 (i-t) 곡선을 나타낸다 ((A) 혈장, (B) 3.3fM 적혈구, (C) 8.3fM 적혈구, (D) 41fM 적혈구 및 (E) 79fM 적혈구).Figure 6 shows the current-time (it) curve of red blood cell collisions on the surface of the ultrafine electrode ((A) plasma, (B) 3.3fM red blood cells, (C) 8.3fM red blood cells, (D) 41fM red blood cells and (E) 79fM red blood cells).
일반적으로, 사람의 혈액은 혈액 세포, 호르몬, 단백질 및 이온을 포함하는 많은 성분을 가지고 있다. 혈액 세포 이외의 구성 요소로부터 발생되는 신호는 적혈구 검출에 오류를 일으킬 수 있다.In general, human blood has many components, including blood cells, hormones, proteins, and ions. Signals from components other than blood cells can cause errors in red blood cell detection.
참고로, 계단 전류 감소는 주로 전극 표면 상에 분석물의 부착으로부터 유래하나, 불순물의 흡착에 의해서도 계단 전류 감소를 야기할 수 있다. 따라서, 혈장만을 포함(적혈구가 없는)하는 용액을 이용하여 대조군 실험을 수행하였다(도 6(a)). For reference, the step current reduction mainly comes from adhesion of an analyte on the electrode surface, but it can also cause step current reduction by adsorption of impurities. Therefore, a control experiment was performed using a solution containing only plasma (without red blood cells) (FIG. 6 (a)).
도 6(a)를 참조하면, 250초가 지나도록 의미 있는 계단 신호를 관찰할 수 없었다. 즉, 인간의 혈액 세포에는 적혈구, 백혈구 및 혈소판을 포함하나, 적혈구의 수는 백혈구나 혈소판의 수 보다 훨씬 많기 때문에, 본 실험예에서 실시한 계단 전류의 감소는 적혈구의 충돌 만에 의한 것이라고 가정하였다.Referring to Figure 6 (a), it was not possible to observe a significant stair signal to pass 250 seconds. That is, human blood cells include red blood cells, white blood cells, and platelets, but since the number of red blood cells is much greater than the number of white blood cells or platelets, it was assumed that the reduction of the step current in this example was due to the collision of red blood cells only.
도 6을 참조하면, 충돌 신호는 적혈구를 포함하는 혈액샘플이 전기 화학 셀에 로드되었을 때 관찰될 수 있었다. 특히, 적혈구의 농도가 3.3fM 에서 79fM 으로 증가함에 따라 계단 전류도 증가하는 것을 관찰할 수 있었으며, 이는 충돌 빈도가 적혈구의 농도에 의존하는 것으로 판단하였다.Referring to FIG. 6, a collision signal could be observed when a blood sample containing red blood cells was loaded into an electrochemical cell. Particularly, as the concentration of red blood cells increased from 3.3 fM to 79 fM, it was observed that the staircase current also increased, and it was judged that the collision frequency was dependent on the concentration of red blood cells.
실험예 3. 충돌빈도에 따른 적혈구 농도 측정Experimental Example 3. Measurement of red blood cell concentration according to collision frequency
도 7의 (a)는 다양한 적혈구 농도에서의 충돌 빈도를 나타낸다.Fig. 7 (a) shows the collision frequency at various red blood cell concentrations.
도 7을 참조하면, 3.3fM, 8.3fM, 41fM 및 79fM의 적혈구 농도에서 각각 0.6(±0.5), 3.3(±1.2), 9.7(±2.9) 및 14.3(±2.5)의 충돌 빈도가 관찰되었다.Referring to FIG. 7, collision frequencies of 0.6 (± 0.5), 3.3 (± 1.2), 9.7 (± 2.9), and 14.3 (± 2.5) were observed at erythrocyte concentrations of 3.3 fM, 8.3 fM, 41 fM, and 79 fM, respectively.
본 실험예에서 측정된 적혈구 검출한계(3.3fM)는 혈액의 한 방울로도 적혈구 수를 측정할 수 있는 매우 적은 양이다.The erythrocyte detection limit (3.3fM) measured in this example is a very small amount that can measure the number of erythrocytes with a single drop of blood.
결론적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 센서(적혈구의 농도 및 크기 분석장치)를 이용함으로써, 적은 양의 혈액으로도 적혈구의 수를 측정할 수 있어, 종래의 정맥 주사를 통한 혈액 샘플링을 피할 수 있는 효과가 있다.In conclusion, by using a sensor (a device for analyzing the concentration and size of red blood cells) according to an embodiment of the present invention, the number of red blood cells can be measured even with a small amount of blood, thereby avoiding blood sampling through conventional intravenous injection. It has the effect.
본 발명의 상술한 초고감도 적혈구 검출은 이동 효과에 기인할 수 있다.The above-described ultra-high sensitivity red blood cell detection of the present invention may be due to the migration effect.
산화 전위를 전극에 가함으로써, 400mM Fe(CN)6 4-의 산화로 인하여 전극 표면 주위에 강력한 양의 전계가 생성되었다. 보다 구체적으로, 적혈구는 음전하를 띄고 있어, 전극 주변의 양의 전기장에 강하게 끌리게 된다. By applying an oxidation potential to the electrode, a strong amount of electric field was created around the electrode surface due to oxidation of 400 mM Fe (CN) 6 4- . More specifically, red blood cells have a negative charge, which is strongly attracted to the positive electric field around the electrode.
상술한 실험예를 바탕으로 회귀 분석을 사용하여 아래와 같은 충돌 횟수를 혈액의 적혈구 수로 환산하는 방정식을 도출하였으며, 그 결과에 따른 회귀 도표를 도 7(b)에 나타내었다:Based on the above-described experimental example, an equation for converting the following collision times to the number of red blood cells in blood was derived using the regression analysis, and the regression chart according to the result is shown in FIG. 7 (b):
[계산식 1][Calculation formula 1]
(여기서, NRBC는 ㎕당 적혈구의 수이고, NC는 충돌 빈도를 나타낸다.)(Here, N RBC is the number of red blood cells per μl, and N C represents the collision frequency.)
계산식 1은 충돌 횟수에서 적혈구 수를 계산하는데 사용할 수 있다.
따라서, 상기 계산식 1을 이용하여 비정상적인 적혈구의 수에 의해서 야기되는 질병 등(빈혈 등)을 진단할 수 있다.Therefore, the disease caused by the abnormal number of red blood cells (anemia, etc.) can be diagnosed using
통상적으로, 적혈구의 수가 정상보다 높으면 진성다혈구증(polycythemia vera), 변형적 혈구 증가증(poikilocytosis) 및 적혈구 증가증(erythrocytosis)과 같은 질병을 나타내며, 적혈구의 수가 정상보다 낮은 경우에는 척수형성이상증(myelodysplasia), 악성 빈혈(pernicious anemia), 골수무형성위기(aplastic crisis) 및 범혈구감소증(pancytopenia) 등과 같은 질병을 나타낸다.Typically, if the number of red blood cells is higher than normal, it indicates diseases such as polycythemia vera, deformed hemocytosis (poikilocytosis), and erythrocytosis. When the number of red blood cells is lower than normal, myelodysplasia , Pernicious anemia, aplastic crisis, and pancytopenia.
그러나, 본 발명의 센서(적혈구의 농도 및 크기 분석장치)를 이용하여 충돌 횟수에 따른 적혈구 수를 계산함으로써, 질병 초기에 일부 유형의 빈혈 또는 적혈구 수에 의해서 야기되는 질병(빈혈)을 신속하고 용이하게 예측할 수 있다.However, by calculating the number of red blood cells according to the number of collisions using the sensor of the present invention (a device for analyzing the concentration and size of red blood cells), the disease caused by some type of anemia or the number of red blood cells (anemia) is quick and easy. Can be predicted.
실험예 4. 충돌빈도에 따른 적혈구 용적 측정Experimental Example 4. Measurement of red blood cell volume according to collision frequency
4-1. 개별 적혈구의 용적을 측정하기 위하여 적혈구가 UME 표면에서 충돌할 때 발생하는 전류 감소의 크기를 분석4-1. To measure the volume of individual red blood cells, analyze the amount of current reduction that occurs when red blood cells collide on the UME surface.
빈혈의 또 다른 중요한 현상은 적혈구의 비정상적인 크기이다.Another important phenomenon of anemia is the abnormal size of red blood cells.
통상적으로 정상적인 적혈구는 직경이 약 7~8㎛이고, 두께가 약 2㎛이다. 그러나, 일부 유형의 빈혈의 경우, 적혈구는 정상보다 높은(10㎛<) 또는 더 낮은(<6㎛) 직경을 보인다.Typically, normal red blood cells have a diameter of about 7 to 8 μm and a thickness of about 2 μm. However, for some types of anemia, red blood cells show higher (10 μm <) or lower (<6 μm) diameter than normal.
이러한 비정상적인 크기의 적혈구는 적혈구로써의 기능을 제대로 하지 못하기 때문에 심각한 건강 문제를 일으킬 수 있다. 이에 따라, 적혈구의 크기를 판별하는 것은 빈혈을 진단하는 데 매우 중요한 요소가 된다.These abnormally sized red blood cells can cause serious health problems because they do not function properly as red blood cells. Accordingly, determining the size of red blood cells is a very important factor in diagnosing anemia.
특히, 적혈구 크기는 적혈구의 평균 체적으로 정의되는 MCV에 반영된다. In particular, red blood cell size is reflected in the MCV, which is defined as the average volume of red blood cells.
실험예에서 개별 적혈구의 용적을 측정하기 위하여 적혈구가 UME 표면에서 충돌할 때 발생하는 전류 감소의 크기를 분석하였다.In the experimental example, in order to measure the volume of individual red blood cells, the magnitude of the current reduction occurring when the red blood cells collide on the UME surface was analyzed.
보다 구체적으로, 동일한 실험 조건으로 시뮬레이션 하고, 서로 다른 적혈구의 착지점에서 UME 표면의 단일 적혈구의 충돌로 인한 전류 감소의 크기를 계산하였다. 그리고, 그 결과를 도 8(b)에 나타내었다.More specifically, it was simulated under the same experimental conditions, and the magnitude of current reduction due to collision of a single red blood cell on the UME surface at different landing points of red blood cells was calculated. And the results are shown in Fig. 8 (b).
도 8(b)는 UME 에서 적혈구의 착지점(landing position)에 따른 전류 감소 정도(6.0㎛(■), 7.5㎛(△), 8.5㎛(▼), 10.0㎛(○) 및 12.0㎛(●))의 직경을 갖는 적혈구가 사용됨)를 나타낸다. 여기서, Δi는 UME 에서 적혈구의 충돌 후 계단 전류 감소의 크기를 나타내며, Δr은 적혈구의 중심과 UME 중심 사이의 거리를 나타낸다.8 (b) shows the degree of current reduction according to the landing position of red blood cells in the UME (6.0㎛ (■), 7.5㎛ (△), 8.5㎛ (▼), 10.0㎛ (○) and 12.0㎛ (●)) ) Is used. Here, Δi represents the magnitude of staircase current reduction after the collision of red blood cells in the UME, and Δr represents the distance between the center of the red blood cells and the center of the UME.
도 8(b)를 참조하면, 전류 감소의 크기는 UME 상에 적혈구의 착지점(landing position) 위치에 따라 결정된 것을 확인할 수 있었다.Referring to FIG. 8 (b), it was confirmed that the magnitude of the current reduction was determined according to the location of the landing position of red blood cells on the UME.
이는 적혈구에 의해 차단된 산화환원종(Fe(CN)6 4-)의 플럭스(flux)가 UME 의 착지점에 따라 달라지기 때문인 것으로 판단된다.This is believed to be because the flux of redox species (Fe (CN) 6 4- ) blocked by red blood cells depends on the landing point of the UME.
다음으로, 시뮬레이션 결과를 바탕으로, 전류 감소의 크기로부터 적혈구의 가장 가능성 있는 직경을 추정하였으며, 그 결과를 도 8(c)에 나타내었다.Next, based on the simulation results, the most probable diameter of red blood cells was estimated from the magnitude of the current reduction, and the results are shown in FIG. 8 (c).
아울러, 도 8(d)는 직경이 증가함에 따른 적혈구의 부피를 나타내는 그래프로, 도 8(d)를 참조하면, 단일 적혈구의 직경도 적혈구의 용적으로 변환될 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. In addition, FIG. 8 (d) is a graph showing the volume of red blood cells as the diameter increases. Referring to FIG. 8 (d), it was confirmed that the diameter of a single red blood cell can be converted into the volume of red blood cells.
도 8(e)는 계단 전류 감소 정도에 기반한 적혈구의 부피를 나타내는 그래프이다. 도 8(e)를 참조하면, 적혈구의 부피는 충돌하는 동안 발생하는 전류 감소를 측정하여 추정할 수 있는 것으로 판단되었다. 참고로, 하기의 회기분석 [계산식 2]을 사용하여 전류 감소 크기와 적혈구 용적에 대한 방정식을 도출하였다:8 (e) is a graph showing the volume of red blood cells based on the level of stair current reduction. Referring to FIG. 8 (e), it was determined that the volume of red blood cells can be estimated by measuring a decrease in current generated during a collision. For reference, the following regression analysis [Calculation 2] was used to derive the equations for the current reduction magnitude and red blood cell volume:
[계산식 2][Calculation formula 2]
VRBC(fL)은 전류 감소로부터 계산된 적혈구의 부피이고, Δi(nA)는 전류 감소의 크기이다. 여기서, 상기 적혈구의 중심이 전극 내부에 얹어졌을 때 얻은 시뮬레이션 데이터만 상기 계산식 2으로 도출하였다. 계산식 2에 나타낸 바와 같이, 가장 관련성 높은 지름과 관련된 가정은 동일한 적혈구로의 착지점에 따라 상이한 전류를 생성할 수 있어 단일 적혈구의 체적에 오차를 유발할 수 있다.V RBC (fL) is the volume of red blood cells calculated from current reduction, and Δi (nA) is the magnitude of current reduction. Here, only the simulation data obtained when the center of the red blood cell is placed on the inside of the electrode was derived by the calculation formula (2). As shown in
그러나, VRBC의 평균값은 여러 데이터 요소의 평균을 포함하기 때문에 오차 발생을 수정할 수 있는 정도이다. 그리고, VRBC의 평균값은 진단을 위해 사용될 것이다.However, since the average value of V RBC includes the average of several data elements, the error occurrence can be corrected. And, the average value of V RBC will be used for diagnosis.
또한, 단일 적혈구를 분석함으로써, 거대한 전류 단계를 생성하는 비정상적으로 큰 적혈구를 스크리닝 할 수 있다. 따라서, 어떠한 큰 신호(>50nA)는 병원에서 완벽한 검사를 권장하는데 충분한 지표가 될 것으로 판단하였다.In addition, by analyzing a single erythrocyte, it is possible to screen abnormally large erythrocytes that produce a huge current phase. Therefore, it was judged that any large signal (> 50 nA) would be sufficient to recommend a complete examination in the hospital.
4-2. 정상 혈액에서의 적혈구의 개별 용적 분석4-2. Individual volume analysis of red blood cells in normal blood
정상혈액에서 충돌에 의한 적혈구의 부피를 분석하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.The volume of red blood cells due to collision in normal blood was analyzed, and the results are shown in FIG. 9.
도 9에서, Δi 는 CA 가 측정한 전류 감소 정도를 나타내며(세번째 열), 하나의 RBC 의 부피는 Δi의 값을 삽입함으로써 얻어진다(네번째 열). 아울러, 네번째열의 빨간색 수직선은 적혈구가 해당 부피를 기준으로 정렬될 때 충돌의 50%를 나타낸다. MCVC는 적혈구의 상위 50% 부피의 평균을 나타낸다(다섯번째 열).In Fig. 9, Δi represents the degree of current reduction measured by CA (third column), and the volume of one RBC is obtained by inserting the value of Δi (fourth column). In addition, the vertical red line in the fourth column represents 50% of the collision when red blood cells are aligned by their volume. MCV C represents the average of the top 50% volume of red blood cells (fifth row).
보다 구체적으로, 분석은 79fM와 41fM 적혈구의 농도로 각각 3개의 혈액 샘플을 사용하였다. 도 9의 세번째 열에 표시된 것처럼 적혈구가 전극에 충돌했을 때 다른 값의 Δi 가 얻어졌다. 상기 Δi의 값은 상술한 계산식 2를 사용하여 단일 적혈구의 부피를 얻은 다음 크기에 따라 분류하였다.More specifically, the analysis used three blood samples with concentrations of 79 fM and 41 fM red blood cells, respectively. Different values of Δi were obtained when the red blood cells hit the electrodes as shown in the third column of FIG. 9. The value of Δi was obtained by calculating the volume of a single red blood
그리고, 샘플에서는 20~130fL 의 적혈구가 검출되었으며, 모든 적혈구의 부피를 더하고, 이를 적혈구의 수(즉, 적혈구의 평균치)로 나눴다.Then, in the sample, 20 to 130 fL of red blood cells were detected, and the volume of all red blood cells was added, and this was divided by the number of red blood cells (ie, the average value of the red blood cells).
그 결과, 정상 크기의 적혈구를 가진 6가지의 실험에서 모든 MCVC 값이 정상범위(80~100fL)로 나타났으며, 이 방법이 적혈구의 MCV를 결정하는데 효과적임을 확인하였다(도 9).As a result, in all 6 experiments with red blood cells of normal size, all MCV C values were shown in the normal range (80-100 fL), and it was confirmed that this method is effective in determining MCV of red blood cells (FIG. 9).
그 결과 값은 병원에서 사용되는 MCV 와 거의 동일하였다.The result was almost the same as the MCV used in hospitals.
이 실험에서 계산된 적혈구의 MCV는 MCVC (단일 적혈구 충돌 실험의 MCV)로 표시되며, 그 값은 도 9의 다섯번째 열에 표시된다. 그 결과, 정상 크기의 적혈구를 가진 6 가지 다른 실험에서, 모든 MCVC 값은 정상 범위에 있었고, 이 방법이 적혈구의 MCV의 측정에 효과적임을 확인하였다. The MCV of the red blood cells calculated in this experiment is expressed as MCV C (MCV of the single red blood cell collision experiment), and the value is displayed in the fifth column of FIG. 9. As a result, in 6 different experiments with red blood cells of normal size, all MCV C values were in the normal range, and it was confirmed that this method is effective for measuring MCV of red blood cells.
참고로, 정확한 데이터 수집을 위해 전극 주변에 떨어지는 적혈구는 무시되었다. 적혈구가 Pt 전극 표면에 부분적으로 접촉하지 않으면, 산화 환원 종의 전극으로의 물질 전달을 방해하여 작은 신호를 줄 수 있다. 따라서 작은 전류 신호는 시뮬레이션과 충돌 영역의 확률적 근사법을 기반으로 제외되었다. (도 9 참조). For reference, red blood cells falling around the electrodes were ignored for accurate data collection. If the red blood cells do not partially contact the surface of the Pt electrode, it may interfere with the mass transfer of the redox species to the electrode and give a small signal. Therefore, the small current signal was excluded based on the simulation and the stochastic approximation of the collision region. (See Figure 9).
한편, 지금까지 POC 빈혈 센서에서 적혈구 수와 MCV 수치를 동시에 계산할 수 있는 방법은 제시되지 않았다.On the other hand, until now, a method for simultaneously calculating the red blood cell count and the MCV value in the POC anemia sensor has not been proposed.
또한 이 방법을 이전에 개발 된 방법 (전기 화학적 Hb 또는 Hct 검출 센서)과 결합하여 모든 중요한 값 (RBC, Hct, MCV, MCH의 수)을 측정하는 POC 빈혈 센서를 개발하는 것이 가능하다. 이러한 POC 빈혈 센서는 빈혈 진행 진단 및 모니터링에 매우 유용할 것으로 판단되었다.It is also possible to develop a POC anemia sensor that measures all important values (number of RBC, Hct, MCV, MCH) by combining this method with a previously developed method (electrochemical Hb or Hct detection sensor). This POC anemia sensor was judged to be very useful for the diagnosis and monitoring of anemia progression.
실험예 5. 충돌영역의 시뮬레이션과 확률적 근사법 Experimental Example 5. Simulation of collision area and stochastic approximation
5-1. UME 에서 적혈구 충돌시 전류 감소를 측정하기 위한 COMSOL 시뮬레이션5-1. COMSOL simulation to measure current reduction in red blood cell collision in UME
화학 반응 엔지니어링 모듈을 갖춘 COMCOL Multiphysics 5.2를 사용하여 적혈구(RBCs)가 UME 에 충돌하는 것을 시뮬레이션 하였다.The use of COMCOL Multiphysics 5.2 with a chemical reaction engineering module was used to simulate red blood cells (RBCs) hitting the UME.
상기 시뮬레이션은 3D 공간에서 Fick's second 법칙을 풀음으로써 수행되었다. UME 반응이 페로시안 화합물의 전자산화를 포함한다고 가정하였다((Fe(CN)6 4- → Fe(CN)6 3- + e). 아울러, 용액 중의 Fe(CN)6 4- 확산은 식 3에 나타내었다:The simulation was performed by solving Fick's second law in 3D space. It was assumed that the UME reaction included the electro-oxidation of the ferrocyanic compound ((Fe (CN) 6 4- → Fe (CN) 6 3- + e). In addition, the diffusion of Fe (CN) 6 4- in the solution was Showed on:
[식 3][Equation 3]
5-2. 충돌영역의 시뮬레이션과 확률적 근사법5-2. Simulation of the collision region and stochastic approximation
도 10은 적혈구(RBC)와 UME 의 충돌의 3D 시뮬레이션 결과를 나타내는 도면이다. 도 10을 참조하면, 전류 감소의 크기(Δi)는 RBC의 착지점(landing position) 위치를 기준으로 추정하였다. 아울러, Δr은 적혈구(RBC)의 중심(직경: 7.5㎛)과 UME 의 중심(반경: 12.5㎛) 사이의 거리를 나타낸다.10 is a view showing a 3D simulation result of the collision of red blood cells (RBC) and UME. Referring to FIG. 10, the magnitude of the current reduction (Δi) was estimated based on the position of the landing position of the RBC. In addition, Δr represents the distance between the center of red blood cells (RBC) (diameter: 7.5 μm) and the center of UME (radius: 12.5 μm).
도 10을 참조하면, 시뮬레이션 결과는 RBC가 전극의 중심에서 가장자리로 이동할 때, Δi는 12.8~36.4nA (RBC가 UME와 충돌할 때, 예상되는 Δi 범위)의 범위를 가진다.Referring to FIG. 10, the simulation results show that when the RBC moves from the center of the electrode to the edge, Δi ranges from 12.8 to 36.4 nA (the expected Δi range when the RBC collides with the UME).
특히, Δr이 14.8㎛보다 클 때, Δi는 연속적으로 감소하고, Δr<14.8㎛ 인 경우 보다 항상 낮았다. 아울러, Δr이 20.8㎛ 보다 크면, Δi는 1nA (실험예에서 얻은 최소 Δi값) 보다 낮았다. 따라서, 유효 충돌 전극 범위(0~14.7㎛)를 초과하는 충돌 신호를 무시하였다.In particular, when Δr was larger than 14.8 µm, Δi was continuously decreased, and was always lower than when Δr <14.8 µm. In addition, when Δr was larger than 20.8 μm, Δi was lower than 1 nA (the minimum Δi value obtained in the experimental example). Therefore, a collision signal exceeding the effective collision electrode range (0 to 14.7 µm) was ignored.
Δi가 검출될 수 있는 총 충돌 전극 면적(>1nA)은 1359㎛2(디스크 전극의 반경은 20.8㎛ 임); MCV 를 계산할 수 있는 유효 충돌 전극 면적은 679㎛2(디스크 전극 반경은 14.7㎛)이었다.The total collision electrode area (> 1 nA) where Δi can be detected is 1359 μm 2 (the radius of the disk electrode is 20.8 μm); The effective collision electrode area from which the MCV can be calculated was 679 µm 2 (the disc electrode radius was 14.7 µm).
이 값(679㎛2)은 총 면적(1359㎛2)의 50%에 해당된다. RBC의 착지점(landing position)의 무작위성을 고려할 때, 충돌 신호의 상반부(50.0%) 만이 전극 상에 생성되고 나머지 신호는 그 주위에 생성된다고 가정할 수 있다.This value (679㎛ 2) is equal to 50% of the total area (1359㎛ 2). Considering the randomness of the landing position of the RBC, it can be assumed that only the upper half (50.0%) of the collision signal is generated on the electrode and the rest of the signal is generated around it.
10: 혈액 분석 장치
100: 반응부
110: 전극부 111: 상대전극
112: 기준전극 113: 작업전극
200: 측정부
210: 농도측정수단 220: 부피측정수단
230: 헤모글로빈 농도측정수단
300: 분석부
310: 비교분석 수단10: blood analysis device
100: reaction unit
110: electrode unit 111: counter electrode
112: reference electrode 113: working electrode
200: measuring unit
210: concentration measurement means 220: volume measurement means
230: hemoglobin concentration measurement means
300: analysis unit
310: comparative analysis means
Claims (12)
반응부 내에 위치하며, 상대전극, 기준전극, 및 작업전극을 포함하는 전극부; 및
시료 내의 적혈구가 작업전극의 표면에 충돌 또는 흡착시 발생하는 전류의 세기 변화를 통하여 적혈구의 농도를 측정하는 농도측정수단, 적혈구의 용적을 측정하는 용적측정 수단 및 적혈구 내의 헤모글로빈의 농도를 측정하는 헤모글로빈 농도 측정 수단을 구비하는 측정부;를 포함하고,
용적측정수단은 적혈구의 전극 표면에 대한 충돌 시뮬레이션을 통하여, 전류 감소 신호 중 적혈구와 전극 표면의 유효 충돌을 나타내는 상위 크기의 전류 감소 신호만을 평균 용적을 산출하는데 이용하는 혈액 분석 장치.
A reaction unit containing a reaction solution and a sample containing redox species;
An electrode unit positioned in the reaction unit and including a counter electrode, a reference electrode, and a working electrode; And
Concentration measuring means for measuring the concentration of red blood cells through changes in the intensity of current generated when red blood cells in the sample collide or adsorb on the surface of the working electrode, volume measurement means for measuring the volume of red blood cells, and hemoglobin for measuring the concentration of hemoglobin in red blood cells It includes; a measuring unit having a concentration measuring means;
The volume measurement means is a blood analysis device used to calculate the average volume of only the current reduction signal having a high magnitude indicating an effective collision between the red blood cells and the electrode surface among the current reduction signals through collision simulation on the electrode surface of the red blood cells.
농도측정수단은 전류 세기 변화량 및 전류 세기 변화 빈도 중 하나 이상을 측정하여 시료 내의 단일세포의 충돌 빈도를 도출하고, 하기 계산식 1을 이용하여 도출된 충돌 빈도로부터 시료 내 단일세포의 농도를 산출하는 혈액 분석 장치:
[계산식 1]
여기서, NRBC는 ㎕당 단일세포의 수이고, NC는 충돌 빈도를 나타낸다.
According to claim 1,
The concentration measurement means derives the collision frequency of a single cell in the sample by measuring at least one of the current intensity change amount and the frequency of the current intensity change, and calculates the concentration of a single cell in the sample from the collision frequency derived using the following equation 1 Analysis device:
[Calculation formula 1]
Here, N RBC is the number of single cells per μl, and N C represents the collision frequency.
용적측정수단은 작업전극의 전류 감소량(Δi)을 측정하고 하기 계산식 2를 이용하여 측정된 전류 감소량으로부터 적혈구의 용적을 산출하는 용적측정수단을 구비하는 혈액 분석 장치:
[계산식 2]
여기서, VRBC는 전류 감소로부터 계산된 적혈구의 부피이며, Δi는 전류 감소의 크기를 나타낸다.
According to claim 1,
The volume measurement means is a blood analysis device having a volume measurement means for measuring the current reduction amount (Δi) of the working electrode and calculating the volume of red blood cells from the current reduction amount measured using the following Equation 2:
[Calculation formula 2]
Here, V RBC is the volume of red blood cells calculated from the current reduction, and Δi represents the magnitude of the current reduction.
측정부는 각각의 농도측정수단 및 용적측정수단에서 측정한 적혈구의 농도 및 용적으로부터 측정 대상 적혈구의 평균 개별 용적을 도출하여, 상기 적혈구의 농도에 따른 개별 용적을 분석하는 비교분석 수단을 포함하는 분석부를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈액 분석 장치.
According to claim 1,
The measurement unit includes an analysis unit including a comparative analysis means for deriving an average individual volume of the target red blood cells from the concentration and volume of the red blood cells measured by the respective concentration measuring means and the volume measuring means, and analyzing the individual volume according to the concentration of the red blood cells. Blood analysis device comprising a.
헤모글로빈 농도 측정 수단은 헤모글로빈의 산화환원에 의해 발생된 전류값을 측정하여 헤모글로빈의 농도를 산출하는 혈액 분석 장치.
According to claim 1,
The hemoglobin concentration measurement means is a blood analysis device that calculates the concentration of hemoglobin by measuring the current value generated by redox oxidation of hemoglobin.
작업전극은 탄소 섬유, 인듐 산화주석, 불소도핑 산화주석, 보론도핑 다이아몬드, 금, 은, 백금, 구리 및 니켈로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 혈액 분석 장치.
According to claim 1,
The working electrode is a blood analysis device, characterized in that any one selected from the group consisting of carbon fiber, indium tin oxide, fluorine-doped tin oxide, boron-doped diamond, gold, silver, platinum, copper and nickel.
반응 용액은 산화환원종으로서 페로시안화(ferrocyanide) 이온, 페리시안화(ferricyanide) 이온, 육아민화 루테늄(Ru) 이온, 하이드로퀴논(hydronquinone), 아스코르브산(ascorbic acid), 도파민(dopamine), 페로센메탄올(ferrocenemethanol), 페로센(ferrocene), 페로센다이메탄올(ferrocenedimethanol), α-메틸페로센메탄올, 페로센카복시산(ferrocene carboxylic acid), 페로센다이카복시산(ferrocene dicarboxylic acid) 및 페로센알데하이드(ferrocene aldehyde)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 혈액 분석 장치.
According to claim 1,
The reaction solution is a redox species, such as ferrocyanide ions, ferricyanide ions, ruthenium hexamide (Ru) ions, hydronquinone, ascorbic acid, dopamine, and ferrocenemethanol ( The group consisting of ferrocenemethanol, ferrocene, ferroenedimethanol, α-methylferrocenemethanol, ferrocene carboxylic acid, ferrocene dicarboxylic acid and ferrocene aldehyde Blood analysis device comprising at least one selected from.
작업전극에서의 시간의 흐름에 따른 전류의 세기 변화를 표시하는 출력부를 더 포함하는 혈액 분석 장치.
According to claim 1,
A blood analysis device further comprising an output unit for displaying a change in current intensity over time at the working electrode.
시료 내의 적혈구가 작업전극의 표면에 충돌 또는 흡착시 발생하는 전류의 세기 변화를 통하여 적혈구의 농도 및 용적을 측정하는 단계; 를 포함하는 혈액 분석 방법.
Injecting a reaction solution and a sample containing a redox species into a reaction unit by using the blood analysis device according to any one of claims 1, 3, 4 and 6 to 10; And
Measuring the concentration and volume of red blood cells through a change in the intensity of current generated when the red blood cells in the sample collide or adsorb on the surface of the working electrode; Blood analysis method comprising a.
측정한 적혈구의 농도 및 용적을 비교하는 단계를 포함하며,
적혈구의 개별 용적을 분석하여 빈혈을 진단하는 것을 특징으로 하는 혈액 분석 방법.The method of claim 11,
Comprising the step of comparing the concentration and volume of the measured red blood cells,
A blood analysis method characterized by diagnosing anemia by analyzing individual volumes of red blood cells.
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