KR102099194B1 - Analytical Method for Thyroid Hormones in Zebrafish - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 제브라피쉬 내 갑상선 호르몬 분석 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인체 및 환경 독성을 모니터링 하기 위하여 제브라피쉬 내 갑상선 호르몬 분석을 위한 시료 전처리 방법 및 LC-MS/MS를 이용한 정성 및 정량분석 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for analyzing thyroid hormone in zebrafish, and more specifically, a sample preparation method for thyroid hormone analysis in zebrafish and a qualitative and quantitative analysis method using LC-MS / MS to monitor human and environmental toxicity. It is about.
제브라피쉬는 척추동물의 발생 및 유전자 기능연구, 인체의 독성 및 다양한 질병 메커니즘 연구를 위한 모델로서 세계적으로 활발하게 활용되고 있는 동물모델이다. 제브라피쉬는 인간과 마우스와 같은 척추동물로서 인간의 유전자와 크기와 수가 비슷하고 단백질 및 유전자간의 상동성이 매우 높으며, 신경계 및 각종 기관 형성 과정이 인간과 매우 유사하기 때문에 인체의 각종 질병연구를 위한 동물모델로서 활용되고 있다. 이와 함께 제브라피쉬는 선충이나 초파리에서나 가능한 생체 내 세포생물학적인 실험이나 대규모 연구가 가능하다는 장점이 있다. 하지만 제브라피쉬의 실험에서 취할 수 있는 시료 양이 작아 단백질, 유전자 연구에서는 많이 활용되고 있지만 저분자 대사체(호르몬) 연구에 있어서는 제브라피쉬의 활용에 어려움이 있다.The zebrafish is an animal model that is actively being used worldwide as a model for research on the development and gene function of vertebrate animals, the toxicity of the human body, and various disease mechanisms. Zebrafish are vertebrates such as humans and mice, which are similar in size and number to human genes, have very high homology between proteins and genes, and are very similar to humans in the process of forming the nervous system and various organs. It is being used as an animal model. Along with this, zebrafish has the advantage of being able to perform large-scale studies or cell-biological experiments in vivo that are possible in nematodes or fruit flies. However, although the amount of sample that can be taken in the experiment of zebrafish is small, it is widely used in protein and gene research, but it is difficult to use zebrafish in the study of low molecular metabolites (hormones).
요오드를 원료로 하여 갑상선에서 생성되는 갑상선 호르몬(thyroid hormones)은 티록신(thyroxine, T4), 삼요오드티로닌(triiodothyronine, T3), 역삼요오드티로닌(reverse-triiodothyronine, rT3)을 주로 말한다. 이중 T4와 T3는 특히 생체 내 활성을 띈다. 이러한 갑상선 호르몬은 체내의 특정부위에서만 작용이 일어나는 다른 호르몬들과는 달리, 신체 내의 거의 모든 조직에서 작용하며, 생체 내 다양한 대사에 관여한다. 따라서 생체 내 다양한 대사 이상 및 이와 관련된 질병을 모니터링 하기 위한 표지자로서 갑상선 호르몬은 사용되고 있다.Thyroid hormones produced by the thyroid using iodine as a raw material mainly refer to thyroxine (T4), triiodothyronine (T3), and reverse-triiodothyronine (rT3). Among them, T4 and T3 are particularly active in vivo. Unlike other hormones that act only on specific parts of the body, these thyroid hormones act on almost all tissues in the body and are involved in various metabolism in vivo. Therefore, thyroid hormone has been used as a marker for monitoring various metabolic abnormalities and related diseases in vivo.
제브라피쉬 내 갑상선 호르몬의 분석 및 모니터링은 대사 관련 다양한 질병 연구 및 독성물질에 의한 대사변화를 연구하기 위하여 매우 중요하지만, 앞서 언급한대로 제브라피쉬의 실험에서 취할 수 있는 시료 양이 작아 효소결합면역측정법(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA)이 거의 유일하게 사용되고 있는 실정이다. 하지만 상기의 방법은 생체 내 활성이 적은 rT3와 실제 대사변화 연구에 중요한 T3를 구분하지 못한다는 단점이 있다. 따라서 제브라피쉬 내 갑상선 호르몬들의 정확한 정량을 위해서는 각각의 갑상선 호르몬들을(rT3, T3, T4) 분리 분석할 수 있는 분석방법이 요구되는 실정이다. The analysis and monitoring of thyroid hormones in zebrafish is very important for studying various diseases related to metabolism and metabolic changes caused by toxic substances, but as mentioned above, the amount of sample that can be taken in the experiment of zebrafish is small, so that enzyme binding immunoassay ( Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is almost exclusively used. However, the above method has a disadvantage in that it cannot distinguish between rT3, which has low activity in vivo, and T3, which is important for the study of actual metabolic changes. Therefore, in order to accurately quantify thyroid hormones in zebrafish, an analysis method capable of separating and analyzing each thyroid hormone (rT3, T3, T4) is required.
본 발명의 목적은 인간과 가장 유사한 유전자를 보유한 어류 제브라피쉬를 활용하여 인체 및 환경 독성을 모니터링하기 위하여 제브라피쉬 내 갑상선 호르몬들을 분석하기 위한 것으로서, 매우 작은 크기의 제브라피쉬 내 갑상선 호르몬을 용이하게 추출 및 농축하기 위한 제브라피쉬의 전처리 방법을 제공하는데 있다.The object of the present invention is to analyze thyroid hormones in zebrafish to monitor human and environmental toxicity by utilizing the fish zebrafish that has the most similar gene to humans, and easily extract thyroid hormones in very small size zebrafish And to provide a method for pre-treatment of zebrafish for concentration.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 전처리 방법을 통해 추출된 제브라피쉬 내 갑상선 호르몬인 rT3, T3, T4을 각각 분리하여 정확한 정성 및 정량 방법을 제공하는 데 있다.In addition, another object of the present invention to provide an accurate qualitative and quantitative method by separating each of the thyroid hormones rT3, T3, T4 in the zebrafish extracted through the pre-treatment method.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제(들)로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제(들)는 이하의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.The problem to be solved by the present invention is not limited to the problem (s) mentioned above, and another problem (s) not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 제브라피쉬 시료를 아세트산 완충용액과 함께 균질화하는 단계; 상기 균질화된 혼합용액을 초음파 처리하는 단계; 및 상기 초음파 처리된 혼합용액을 고체상으로 추출하는 고체상 추출단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 제브라피쉬의 전처리 방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention comprises the steps of homogenizing the zebrafish sample with acetic acid buffer solution; Ultrasonicating the homogenized mixed solution; And a solid phase extraction step of extracting the sonicated mixed solution into a solid phase.
본 발명은 또한, 전처리된 제브라피쉬 시료 내 주요한 갑상선 호르몬인 rT3, T3, T4을 액체 크로마토그래피를 이용하여 분리시키는 분리단계; 상기 액체 크로마토그래피를 통과한 분석물질을 질량분석기를 이용하여 분석하는 분석단계; 및 제브라피쉬 내 갑상선 호르몬의 변화를 모니터링하고 확인하는 것을 특징으로 하는 제브라피쉬 내 갑상선 호르몬 분석 방법을 제공한다.The present invention also provides a separation step of separating the major thyroid hormones rT3, T3, T4 in the pre-treated zebrafish sample using liquid chromatography; An analysis step of analyzing the analyte that has passed through the liquid chromatography using a mass spectrometer; And monitoring and confirming changes in thyroid hormones in zebrafish.
본 발명에 따르면, 효율적인 분석단계를 거치는 새로운 분석방법을 통해 제브라피쉬를 전처리하는 경우, 매우 적은 양(4~6개월 성체 제브라피쉬의 경우 몸무게가 0.3 g 내외임)의 제브라피쉬 시료로부터 갑상선 호르몬을 효과적으로 추출 및 농축할 수 있으며, 그동안 효소결합면역측정법에서 정확히 분석 할 수 없었던 생체 내 활성이 적은 rT3와 실제 대사변화 연구에 중요한 T3를 액체크로마토그래피-질량분석기를 통해 효과적으로 분리하여 정성 및 정량 분석함으로서 인체 및 환경 독성에 의한 갑상선 호르몬 변화를 모니터링 하기 위한 연구에 바람직하게 이용될 수 있는 효과가 있다.According to the present invention, when pre-treating zebrafish through a new analytical method that undergoes an efficient analysis step, thyroid hormone is obtained from a zebrafish sample in a very small amount (in the case of an adult zebrafish of 4 to 6 months, the body weight is around 0.3 g). By efficiently separating and concentrating rT3, which is not able to be accurately analyzed by enzyme-linked immunoassay, and T3, which is important for the study of actual metabolic changes, through liquid chromatography-mass spectrometry, qualitative and quantitative analysis There is an effect that can be preferably used in studies for monitoring thyroid hormone changes due to human and environmental toxicity.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.It should be understood that the effects of the present invention are not limited to the above-described effects, and include all effects that can be deduced from the configuration of the invention described in the detailed description or claims of the present invention.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 제브라피쉬 내 갑상선 호르몬 분석을 위한 공정 순서도이다.
도 2은 본 발명의 LC-MS/MS를 사용하여 분리 분석한 갑상선 호르몬의 MRM 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 3은 균질화된 시료의 초음파처리 시간의 변화에 따른 분석물질의 상대적 추출 효율이다.
도 4는 모노-에틸헥실프탈레이트를 0, 2, 10, 50 ㎍/mL 농도로 21일 동안 노출한 후 본 발명에 따라 측정된 갑상선 호르몬의 변화를 도식화 한 것이다.1 is a process flow diagram for thyroid hormone analysis in zebrafish according to an embodiment of the present invention.
Figure 2 shows the MRM chromatogram of the thyroid hormone analyzed separately using the LC-MS / MS of the present invention.
3 is a relative extraction efficiency of the analyte according to the change in the sonication time of the homogenized sample.
4 is a diagram illustrating the change in thyroid hormone measured according to the present invention after exposure of mono-ethylhexyl phthalate at a concentration of 0, 2, 10, 50 μg / mL for 21 days.
하기의 설명에서는 본 발명의 실시예를 이해하는데 필요한 부분만이 설명되며, 그 이외 부분의 설명은 본 발명의 요지를 흐리지 않는 범위에서 생략될 수 있다는 점에 유의하여야 한다.It should be noted that in the following description, only parts necessary for understanding the embodiments of the present invention are described, and descriptions of other parts may be omitted without departing from the scope of the invention.
이하에서 설명되는 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념으로 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 바람직한 실시예에 불과할 뿐이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.The terms or words used in the present specification and claims described below should not be construed as being limited to ordinary or dictionary meanings, and the inventor is appropriate as a concept of terms to describe his or her invention in the best way. It should be interpreted as a meaning and a concept consistent with the technical idea of the present invention based on the principle that it can be defined as such. Therefore, the configuration shown in the embodiments and drawings described in this specification is only a preferred embodiment of the present invention, and does not represent all of the technical spirit of the present invention, and various equivalents that can replace them at the time of this application It should be understood that there may be and variations.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 인간과 가장 유사한 유전자를 보유한 어류 제브라피쉬를 활용하여 인체 및 환경 독성을 모니터링하기 위하여 제브라피쉬 내 갑상선 호르몬들을 분석하기 위한 것으로서, 매우 작은 크기의 제브라피쉬 내 갑상선 호르몬을 효과적으로 추출 및 농축하기 위한 제브라피쉬의 전처리 방법 및 액체크로마토그래피-질량분석기를 이용한 정성 및 정량 분석방법에 관한 것이다. 도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 제브라피쉬 내 갑상선 호르몬 분석을 위한 공정 순서도이다.The present invention is to analyze thyroid hormones in zebrafish to monitor human and environmental toxicity by using the fish zebrafish with the most similar gene to humans, and effectively extract and concentrate thyroid hormones in very small size zebrafish It relates to a pre-treatment method for zebrafish and a qualitative and quantitative analysis method using a liquid chromatography-mass spectrometer. 1 is a process flow diagram for thyroid hormone analysis in zebrafish according to an embodiment of the present invention.
본 발명의 일 측면에 따른 제브라피쉬의 전처리 방법은,The pre-treatment method of zebrafish according to an aspect of the present invention,
제브라피쉬 시료를 아세트산 완충용액과 함께 균질화하는 단계; 상기 균질화된 혼합용액을 초음파 처리하는 단계; 및 상기 초음파 처리된 혼합용액을 고체상으로 추출하는 고체상 추출단계;를 포함한다.Homogenizing the zebrafish sample with acetic acid buffer solution; Ultrasonicating the homogenized mixed solution; And a solid phase extraction step of extracting the sonicated mixed solution into a solid phase.
도 1을 참조하면, 우선 제브라피쉬 및 버퍼용액을 혼합하여 혼합용액을 제조한다(S10).Referring to FIG. 1, first, a zebrafish and buffer solution are mixed to prepare a mixed solution (S10).
상기 S10은 제브라피쉬를 용이하게 균질화시키기 위해 제브라피쉬 및 버퍼용액을 혼합하는 단계일 수 있다.The S10 may be a step of mixing the zebrafish and the buffer solution to easily homogenize the zebrafish.
상기 제브라피쉬는 소형 열대 담수어로서, 3 cm 정도의 크기의 형광색을 나타내며, 수명은 2년 정도이고 생후 3개월이면 번식이 가능하다. 암컷은 일주일 간격으로 100 ~ 500개의 알을 낳을 수 있고, 체외수정을 하며, 발생 중의 배아가 투명하기 때문에 일반 해부현미경 하에서 쉽게 발생의 모든 과정을 관찰할 수 있어 이미지 연구에 있어서 매우 큰 장점을 가지고 있다.The zebrafish is a small tropical freshwater fish, exhibits a fluorescence color of about 3 cm, and has a lifespan of about 2 years and can reproduce in 3 months after birth. Females can lay 100 to 500 eggs at weekly intervals, fertilize in vitro, and the embryos during development are transparent, so it is easy to observe all processes of development under a general anatomical microscope, which has a great advantage in image research. have.
또한 상기 제브라피쉬는 유전자 구성면에서 인간과 매우 유사하며 인간이 가지고 있는 대부분의 유전자를 가지고 있다. 유전자 및 단백질, 신경계, 각종 기관형성이 사람과 매우 유사하기 때문에 인체의 각종 질병 예방을 위한 질환 모델로서 용이할 수 있다.In addition, the zebrafish is very similar to humans in terms of gene composition and has most of the genes possessed by humans. Genes and proteins, nervous system, and various organ formations are very similar to humans, so it can be easily used as a disease model for preventing various diseases in the human body.
상기 버퍼용액은 아세테이트 버퍼용액을 사용하는 것이 바람직한데, 일반적으로 조직이나 세포 균질화에 사용되는 다른 버퍼인 트리스(히드록시메틸)아미노메테인 (Tris) 버퍼용액 혹은 포스페이트 버퍼용액을 사용할 경우 시료가 뭉쳐 균일하게 균질화시키는데 어려움이 있다.As the buffer solution, it is preferable to use an acetate buffer solution. In general, when a tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) buffer solution or a phosphate buffer solution, which is another buffer used for tissue or cell homogenization, is used, the samples are agglomerated. It is difficult to homogenize uniformly.
상기 버퍼용액의 pH는 5 내지 6이 바람직하며, 구체적으로 pH 5.2 일 경우 가장 바람직하다. 이는 이러한 pH 조건에서 제브라피쉬 시료가 가장 균일하게 균질화될 수 있다.The pH of the buffer solution is preferably 5 to 6, and most preferably, pH 5.2. This allows the zebrafish sample to be most homogenized at these pH conditions.
상기 버퍼용액의 몰농도는 0.1 내지 0.3 M, 구체적으로 0.2 M일 수 있다. 상기 버퍼용액의 몰농도가 0.1M 미만이면 제브라피쉬 시료의 균질화를 위한 버퍼용액의 역할을 충분히 할 수 없으며, 0.3 M이 초과되면 염의 농도가 높아 실험에 방해가 될 수 있다.The molar concentration of the buffer solution may be 0.1 to 0.3 M, specifically 0.2 M. If the molar concentration of the buffer solution is less than 0.1M, it cannot sufficiently serve as a buffer solution for homogenization of the zebrafish sample, and if it exceeds 0.3 M, the salt concentration may be high, which may interfere with the experiment.
상기 버퍼용액은, 상기 제브라피쉬 0.3 g 당 1 mL로 혼합할 수 있다. The buffer solution can be mixed in 1 mL per 0.3 g of zebrafish.
다음, 상기 혼합용액을 균질화한다(S20).Next, the mixed solution is homogenized (S20).
상기 S20은 상기 S10에서 제조된 혼합용액에 포함되는 제브라피쉬 내 갑상선 호르몬이 용이하게 추출될 수 있도록 제브라피쉬를 분쇄하는 단계일 수 있다.The S20 may be a step of crushing the zebrafish so that the thyroid hormone in the zebrafish contained in the mixed solution prepared in S10 can be easily extracted.
상기 혼합용액의 균질화는 균질화 동안 제브라피쉬 시료의 변성을 막기 위하여 ice-bath 에서 5분 내지 10분 동안 수행될 수 있다.Homogenization of the mixed solution can be performed for 5 to 10 minutes in an ice-bath to prevent denaturation of the zebrafish sample during homogenization.
다음, 상기 균질화된 혼합용액을 초음파 처리한다(S30).Next, the homogenized mixed solution is ultrasonicated (S30).
상기 S30은 상기 S20에서 균질화된 혼합용액에 포함된 제브라피쉬 내 갑상선 호르몬의 추출 효율을 향상시키기 위해서 초음파 처리하는 단계일 수 있다.The S30 may be a sonication step to improve the extraction efficiency of thyroid hormone in zebrafish contained in the mixed solution homogenized in S20.
상기 균질화된 혼합용액의 초음파 처리는 30분 내지 2 시간, 구체적으로 1 시간 동안 수행될 수 있다. 상기 초음파 처리가 30분 내지 2 시간, 구체적으로 1 시간 동안 수행되는 경우에 제브라피쉬 내 갑상선 호르몬의 추출 효율이 향상될 수 있다.Ultrasonic treatment of the homogenized mixed solution may be performed for 30 minutes to 2 hours, specifically 1 hour. When the ultrasonic treatment is performed for 30 minutes to 2 hours, specifically 1 hour, the extraction efficiency of thyroid hormone in zebrafish can be improved.
다음, 상기 초음파 처리된 혼합용액을 고체상 추출 (Oasis PRiME HLB cartridge, 3 mL, 60 mg) 방법을 통해 시료 내 갑상선호르몬을 추출한다(S40).Next, the thyroid hormone in the sample is extracted through a method of solid-phase extraction (Oasis PRiME HLB cartridge, 3 mL, 60 mg) of the sonicated mixed solution (S40).
상기 S40은 추출 용매로서 메탄올을 사용하여 제브라피쉬 내 많은 양을 차지하는 지질 성분 및 친수성인 amino acids와 단백질 등을 제거 할 수 있다.The S40 can remove lipid components and hydrophilic amino acids and proteins, which occupy a large amount in zebrafish, using methanol as an extraction solvent.
다음, 고체상 추출방법을 통해 전처리 된 시료는 액체 크로마토그래피-질량분석기를 통해 주요한 갑상선 호르몬인 rT3, T3, T4를 분리하여 분석한다.Next, the sample pre-treated through the solid phase extraction method is analyzed by separating the major thyroid hormones rT3, T3, and T4 through a liquid chromatography-mass spectrometer.
상기 S50은 상기 S40 고체상 추출을 통해 용출된 용액을 증발건조기를 이용하여 건조시킨 후, 이동상 용액에 녹인 용액을 액체크로마토그래피에 주입하게 된다.In the S50, the solution eluted through the S40 solid phase extraction is dried using an evaporation dryer, and then the solution dissolved in the mobile phase solution is injected into the liquid chromatography.
상기 분석단계에서 사용되는 이동상은 아세트산암모늄 완충용액과 아세토니트릴을 사용하며, 아세토니트릴 용액의 양은 처음에는 적은 양으로 시작하여 시간이 경과함에 따라 그 양을 점차 늘려가다가 다시 줄이는 방식으로 공급하는 것이 바람직하다. 예컨대 초기에는 아세트산암모늄 완충용액과 아세토니트릴의 혼합비를 70 : 30의 중량비로 혼합하여 초기 전개용액(아세토니트릴 30중량% 함유)으로 사용하고 아세토니트릴의 혼합비율을 늘려가다가 아세토니트릴이 100 %인 상태로 진행하다 다시 그 함량을 초기와 같이 30 %로 줄여 초기상태로 적용할 수 있다. 아세트산암모늄 완충용액과 아세토니트릴의 혼합비의 조절을 통해 이성질체 구조의 T3와 rT3를 효과적으로 분리 분석 할 수 있다.The mobile phase used in the analysis step uses an ammonium acetate buffer solution and acetonitrile, and the amount of the acetonitrile solution starts at a small amount at first and gradually increases over time and then is supplied in a manner that reduces again. Do. For example, initially, the mixture ratio of ammonium acetate buffer solution and acetonitrile is mixed in a weight ratio of 70:30 to be used as an initial developing solution (containing 30% by weight of acetonitrile), increasing the mixing ratio of acetonitrile, and then acetonitrile is 100% Proceed to and again, the content can be reduced to 30% as in the initial stage and applied to the initial stage. By adjusting the mixing ratio of ammonium acetate buffer solution and acetonitrile, T3 and rT3 of the isomer structure can be effectively separated and analyzed.
상기 이동상은 0.3 내지 0.5 mL/min, 구체적으로 0.4 mL/min의 유속으로 흘려주는 것이 장비의 안정된 압력 및 분리능 측면에서 바람직할 수 있다.It may be desirable in terms of stable pressure and resolution of the equipment to flow the mobile phase at a flow rate of 0.3 to 0.5 mL / min, specifically 0.4 mL / min.
다음, 상기 액체 크로마토그래피를 통과한 분석물질을 질량분석기를 이용하여 분석한다. 하나의 바람직한 예에서, 상기 질량분석기는 이중질량분석기(Tandom Mass Spectrometry)인 것이 바람직하다. 기존의 질량분석기는 1 차 이온화를 통해서 생성된 이온을 전하대 질량비로 검출하는 데 반하여, 이중질량분석기는 1 차 이온화로 생성된 이온을 CID(collision cell)에서 또 다시 이온화한다는 차이가 있다. 하나의 예에서, 상기 분리단계를 거쳐 분리된 분석물질은 Waters® Xevo TQ-S micro tandem mass spectrometer를 사용하여 전기분무-이중질량분석기(electrospray-tandem mass spectrometry)를 통해 분석할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 분석단계에서, 검출된 분석물질의 정량은 질량분석기의 MRM(Multiple Reaction Monitoring) 모드를 사용하여 수행될 수 있다. 분석된 갑상선 호르몬들의 선구이온은 [M+H]+ 값을 선구이온으로 가지며, 각각 최적의 충돌 에너지에서 생성이온을 형성하게 된다.Next, the analyte that has passed through the liquid chromatography is analyzed using a mass spectrometer. In one preferred example, the mass spectrometer is preferably a dual mass spectrometer. The existing mass spectrometer detects ions generated through primary ionization by a charge-to-mass ratio, whereas a dual mass spectrometer has a difference that ion generated by primary ionization is ionized again in a collision cell (CID). In one example, the analyte separated through the separation step can be analyzed through an electrospray-tandem mass spectrometry using a Waters® Xevo TQ-S micro tandem mass spectrometer. In addition, the present invention, in the analysis step, the quantification of the analyte detected can be performed using the MRM (Multiple Reaction Monitoring) mode of the mass spectrometer. The progenitor ions of the analyzed thyroid hormones have a [M + H] + value as a progenitor ion, and each of them forms a product ion at an optimal collision energy.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.Hereinafter, examples will be described in detail to specifically describe the present invention. However, the embodiments according to the present invention may be modified in various other forms, and the scope of the present invention should not be construed as being limited to the embodiments described below. The embodiments of the present invention are provided to more fully describe the present invention to those skilled in the art.
실시예Example
<실시예 1> <Example 1>
1-1. 제브라피쉬 시료의 전처리 단계1-1. Pre-treatment step of zebrafish sample
2 mL 용량의 마이크로원심분리기용 튜브에 제브라피쉬(the wild-type zebrafish adults, AB strain, 4-6 개월의 몸무게 300 mg 내외의 제브라피쉬) 시료와 아세테이트 버퍼용액(0.2 M, pH 5.2) 1 mL 및 내부표준물질(T3-13C6)을 혼합하여 혼합용액을 제조하였다. 상기 혼합용액을 균질기(PRO200 Bio-Gen Series Homogenizer)를 이용하여 16,000 rpm으로 5-10분 동안 ice-bath에서 균질화 시켰다. 균질화된 혼합용액은 1 시간 동안 초음파 처리(ultrasonication)하였다. 초음파 처리 된 시료는 고체상 추출 (Oasis PRiME HLB cartridge, 3 mL, 60 mg) 방법을 통해 시료 내의 분석방해물질을 제거하고 분석물질인 갑상선 호르몬이 고체상으로 추출되도록 유도하였다. 이후, 카트리지에 고정된 분석물질인 갑상선 호르몬을 2 mL 의 메탄올을 이용하여 용출하였다.1 mL sample of zebrafish (the wild-type zebrafish adults, AB strain, zebrafish with a body weight of about 300 mg for 4-6 months) and acetate buffer solution (0.2 M, pH 5.2) in a 2 mL microcentrifuge tube And an internal standard material (T3- 13 C 6 ) to prepare a mixed solution. The mixed solution was homogenized in an ice-bath for 5-10 minutes at 16,000 rpm using a homogenizer (PRO200 Bio-Gen Series Homogenizer). The homogenized mixed solution was subjected to ultrasonic treatment for 1 hour. The sonicated sample was analyzed by removing the analyte in the sample through the method of solid phase extraction (Oasis PRiME HLB cartridge, 3 mL, 60 mg) and inducing that the analyte thyroid hormone was extracted into the solid phase. Thereafter, thyroid hormone, an analyte fixed to the cartridge, was eluted using 2 mL of methanol.
1-2. 분리단계1-2. Separation step
상기 1-1의 단계를 통해 용출된 시료를 증발건조기를 이용하여 건조하였다. 건조된 갑상선 호르몬을 포함한 시료는 50 μL 이동상을 사용하여 녹인 후, 5 μL를 액체 크로마토그래피에 주입하였다.The sample eluted through the step 1-1 was dried using an evaporative dryer. After the sample containing the dried thyroid hormone was dissolved using a 50 μL mobile phase, 5 μL was injected into liquid chromatography.
상기 액체 크로마토그래피는 워터스 코퍼레이션(Waters®)의 Acquity UPLC I-Class system를 사용하였다. 사용된 분석컬럼은, 워터스 코퍼레이션의 Acquity UPLC BEH C18 octadecylsilane column(2.1 ⅹ 100 mm, 1.7 μm)를 사용하였다.For the liquid chromatography, an Acquity UPLC I-Class system of Waters Corporation was used. As an analysis column used, Acquity UPLC BEH C18 octadecylsilane column (2.1 ⅹ 100 mm, 1.7 μm) of Waters Corporation was used.
분리를 위해 10 mM 농도의 암모늄아세테이트 버퍼와 아세토니트릴을 기울기 용리 방법으로 사용하였다. 아세토니트릴 용액을 전체 전개용매 중 30%(v/v)로부터 시작하여 3분에 50%, 6분에 100%로 증가시켜 3분간 유지한 후 9분에 다시 30%로 감소시키고 300 ml/분의 유속으로 흘려주며 분석물질을 용출시켰다.For separation, 10 mM ammonium acetate buffer and acetonitrile were used as a gradient elution method. The acetonitrile solution was increased from 30% (v / v) in the total development solvent to 50% in 3 minutes and 100% in 6 minutes, held for 3 minutes, then reduced to 30% again in 9 minutes and 300 ml / min. The analyte was eluted at a flow rate of.
1-3. 분석단계1-3. Analysis phase
상기 1-2의 분리단계를 통해 분리된 분석물질은 워터스 코퍼레이션(Waters®)의 Xevo TQ-S micro 이중질량분석기(Tandem Mass Spectrometry)를 사용하여 분석하였다.The analytes separated through the separation steps of 1-2 were analyzed using a Xevo TQ-S micro dual mass spectrometry (Waters®).
상기 이중질량분석기를 전기분무-이중질량분석기(electrospray-tandem mass spectrometry)를 통해 분석을 실시하였다. 상기 질량분석기의 전기분무 이온화기의 조건은, 보조(질소) 가스의 속도는 800L/hr, 이온스프레이 전압은 3 kV, 모세관 전압은 1 kV, 콘 가스 속도(cone gas flow)은 30 L/hr, 및 모세관 온도는 450℃로 설정하였다.The dual mass spectrometer was analyzed by electrospray-tandem mass spectrometry. The conditions of the electrospray ionizer of the mass spectrometer are: the speed of the auxiliary (nitrogen) gas is 800 L / hr, the ion spray voltage is 3 kV, the capillary voltage is 1 kV, and the cone gas flow is 30 L / hr. , And the capillary temperature was set to 450 ° C.
1-4. 정량 분석 단계1-4. Quantitative analysis steps
분석된 시료의 정량은 질량분석기의 MRM(Multiple Reaction Monitoring) 모드를 사용하여 분석하였다. 분석된 3종의 갑상선 호르몬의 선구이온은 [M+H]+ 값을 선구이온으로 가지며, 각각 최적의 충돌 에너지에서 생성이온을 형성한다. 상기와 같이 얻어진 갑상선 호르몬의 MRM 크로마토그램을 도 2에 나타내었다. Quantification of the analyzed sample was analyzed using MRM (Multiple Reaction Monitoring) mode of the mass spectrometer. The analyzed progenitor ions of the three thyroid hormones have a [M + H] + value as a progenitor ion, and each of them forms a product ion at optimal collision energy. The MRM chromatogram of the thyroid hormone obtained as above is shown in FIG. 2.
또한, 제브라피쉬 시료에서 갑상선 호르몬들의 농도를 정량하기 위하여 내부표준법을 사용하여 도출한 검량곡선을 이용하였고 이에 대한 정보는 각각 다음의 표 1에 나타내었다. 이 검량곡선은 R2=0.997 이상의 좋은 선형성을 보였고, 변동계수(Cofficient Variation)값도 10 % 이내로 나타내어 좋은 반복성을 보였다.In addition, a calibration curve derived using an internal standard method was used to quantify the concentrations of thyroid hormones in the zebrafish sample, and the information on this is shown in Table 1 below. This calibration curve showed good linearity of R 2 = 0.997 or more, and the coefficient of variation (Cofficient Variation) was within 10%, showing good repeatability.
비교예Comparative example
<비교예 1> 균질화 시료의 초음파처리 시간에 따른 회수율 비교<Comparative Example 1> Comparison of the recovery rate according to the sonication time of the homogenized sample
상기 실시예 1-1과 비교하여, 균질화된 시료의 초음파처리 시간을 달리하였다는 점을 제외하고는, 동일한 방법으로 실험을 실시하였다. 균질화된 시료의 초음파처리 시간의 변화에 따른 분석물질의 상대적 추출 효율을 도 3에 나타내었다.Compared to Example 1-1, the experiment was conducted in the same manner, except that the sonication time of the homogenized sample was different. The relative extraction efficiency of the analyte according to the change in the sonication time of the homogenized sample is shown in FIG. 3.
도 3을 참조하면, 균질화된 시료를 1시간 초음파 처리 하였을 때 상대적 추출 효율리 가장 우수함을 확인 할 수 있다.Referring to FIG. 3, when the homogenized sample is subjected to ultrasonic treatment for 1 hour, it can be confirmed that the relative extraction efficiency is the best.
실험예Experimental example
상기 실시예의 검출방법을 통하여 4~6개월의 성체 제브라피쉬에 환경호르몬의 일종인 모노-에틸헥실프탈레이트; Mono-(2-ethylhexyl) phthalate (MEHP)를 0, 2, 10, 50 ㎍/mL 농도로 21일 동안 노출한 후 노출된 제브라피쉬 시료 내의 갑상선 호르몬의 변화를 측정하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 10 ㎍/mL 이상의 MEHP에 노출되었을 경우 제브라피쉬 내 T3 농도가 유의성 있게 (T-test, 10 ㎍/mL MEHP; P < 0.05, 10 ㎍/mL MEHP; P < 0.03) 증가 되었다.Through the detection method of the above embodiment, mono-ethylhexyl phthalate which is a kind of environmental hormone in adult zebrafish of 4-6 months; Mono- (2-ethylhexyl) phthalate (MEHP) was exposed to concentrations of 0, 2, 10, and 50 μg / mL for 21 days, and changes in thyroid hormone in the exposed zebrafish samples were measured, and the results are shown in FIG. 4. Shown. When exposed to MEHP above 10 μg / mL, the concentration of T3 in zebrafish was significantly increased (T-test, 10 μg / mL MEHP; P <0.05, 10 μg / mL MEHP; P <0.03).
지금까지 본 발명에 따른 제브라피쉬의 전처리 방법 및 제브라피쉬 내 갑상선 호르몬 분석 방법에 관한 구체적인 실시예에 관하여 설명하였으나, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한도 내에서는 여러 가지 실시 변형이 가능함은 자명하다.So far, specific examples of the pretreatment method of zebrafish according to the present invention and a method of analyzing thyroid hormone in zebrafish have been described, but it is apparent that various implementation modifications are possible without departing from the scope of the present invention.
그러므로 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 안 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.Therefore, the scope of the present invention should not be limited to the described embodiments, but should be determined not only by the following claims, but also by the claims and equivalents.
즉, 전술된 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술될 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 그 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.That is, the above-described embodiment is illustrative in all respects, and should be understood as not limiting, and the scope of the present invention is indicated by the claims to be described later rather than the detailed description, and the meaning and scope of the claims and It should be construed that any altered or modified form derived from the equivalent concept is included in the scope of the present invention.
Claims (12)
상기 균질화된 혼합용액을 초음파 처리하는 단계; 및
상기 초음파 처리된 혼합용액을 고체상으로 추출하는 고체상 추출단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 제브라피쉬의 전처리 방법에 있어서,
상기 버퍼용액은 0.1 내지 0.3 M 아세테이트 버퍼용액을 사용하며 pH 5 내지 6 이고,
상기 초음파 처리는 30분 내지 1 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는
제브라피쉬의 전처리 방법.
Homogenizing the zebrafish sample with an acetic acid buffer solution;
Ultrasonicating the homogenized mixed solution; And
In the pre-treatment method of the zebrafish, characterized in that it comprises; a solid phase extraction step of extracting the sonicated mixed solution to a solid phase,
The buffer solution uses a 0.1 to 0.3 M acetate buffer solution and has a pH of 5 to 6,
The ultrasonic treatment is characterized in that it is performed for 30 minutes to 1 hour
Method of pre-treatment of zebrafish.
상기 버퍼용액은, 상기 제브라피쉬 0.3g 당 0.8 내지 1.2 mL로 혼합하는 것을 특징으로 하는 제브라피쉬의 전처리 방법.
According to claim 1,
The buffer solution, a zebrafish pre-treatment method, characterized in that mixing with 0.8 to 1.2 mL per 0.3 g of the zebrafish.
상기 균질화는 ice-bath에서 5분 내지 10분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 제브라피쉬의 전처리 방법.
According to claim 1,
The homogenization is a pre-treatment method of zebrafish, characterized in that is performed for 5 to 10 minutes in an ice-bath.
상기 추출단계는,
초음파 처리된 혼합용액을 고체상 추출 (Oasis PRiME HLB cartridge, 3 mL, 60 mg) 방법을 통해 1.5 내지 3 mL 메탄올로 추출하는 것을 특징으로 하는 제브라피쉬의 전처리 방법.
According to claim 1,
The extraction step,
Pre-treatment method of zebrafish, characterized in that the sonicated mixed solution is extracted with 1.5 to 3 mL methanol through a solid phase extraction (Oasis PRiME HLB cartridge, 3 mL, 60 mg) method.
상기 액체 크로마토그래피를 통과한 분석물질을 질량분석기를 이용하여 분석하는 분석단계; 및
상기 제브라피쉬 내 갑상선 호르몬의 변화를 모니터링하고 확인하는 것을 특징으로 하는 제브라피쉬 내 갑상선 호르몬 분석 방법에 있어서,
상기 분리단계는,
아세트산암모늄 완충용액과 아세토니트릴을 사용하며,
아세토니트릴을 30 중량%로 시작하여 시간이 경과함에 따라
아세토니트릴의 혼합비율을 늘려가다가 아세토니트릴이 100%인 상태로
진행한 후 다시 그 함량을 30%로 줄이는 방식으로 공급하고,
이동상을 0.3 내지 0.5 mL/min의 유속으로 흘려주는 것을 특징으로 하는
제브라피쉬 내 갑상선 호르몬 분석 방법.
A separation step of separating the major thyroid hormones rT3, T3 and T4 in the pre-treated zebrafish sample using liquid chromatography;
An analysis step of analyzing the analyte that has passed through the liquid chromatography using a mass spectrometer; And
In the method of analyzing the thyroid hormone in the zebrafish, characterized in that for monitoring and confirming the change in the thyroid hormone in the zebrafish,
The separation step,
Ammonium acetate buffer solution and acetonitrile are used,
Acetonitrile starts at 30% by weight and over time
Increasing the mixing ratio of acetonitrile and then increasing the acetonitrile to 100%
After proceeding, the content is reduced to 30% and supplied again.
Characterized by flowing a mobile phase at a flow rate of 0.3 to 0.5 mL / min.
How to analyze thyroid hormones in zebrafish.
상기 분석단계에서,
상기 질량분석기는 이중질량분석기인 것을 특징으로 하는 제브라피쉬 내 갑상선 호르몬 분석 방법.
The method of claim 7,
In the analysis step,
The mass spectrometer is a thyroid hormone analysis method in zebrafish, characterized in that the dual mass spectrometer.
상기 분석물질은 thyroxine(T4), reverse- triiodothyronine(rT3) 및 triiodothyronine(T3)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 제브라피쉬 내 갑상선 호르몬 분석 방법.
The method of claim 7,
The analyte is thyroxine (T 4 ), reverse- triiodothyronine (rT 3 ) and triiodothyronine (T 3 ) selected from the group consisting of one or more thyroid hormone analysis method in zebrafish.
A method of analyzing thyroid hormones in zebrafish, characterized by monitoring changes in the endocrine system caused by environmental toxic substances using the pretreatment method of claim 1 and the method of analyzing thyroid hormones of claim 7.
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| CN114002345A (en) * | 2021-10-12 | 2022-02-01 | 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 | Fish gill metabonomics sample pretreatment optimization method |
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