KR102087294B1 - 3차원 장관 오가노이드 및 3차원 신경외배엽 구체를 포함하는 다장기 파킨슨병 모델 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 3차원 장관 오가노이드(3D intestinal organoids) 및 3차원 신경외배엽 구체를 포함하는, 파킨슨병 다장기 모사 모델의 제조방법 및 이의 용도를 제공한다. 상기 파킨슨병 모델의 제조방법은 파킨슨 관련한 기존의 2D 제조방법보다 시간적, 공간적인 면에서 우수하며, 이를 더 정교하게 재현할 수 있는 파킨슨병 특이적인 모델을 제공할 수 있다. 또한, 상기 제조방법으로부터 제조된 모델은 파킨슨병 환자의 장 관련 질환을 동시에 연구할 수 있는 다장기 모델 시스템으로 사용될 수 있다.

Description

3차원 장관 오가노이드 및 3차원 신경외배엽 구체를 포함하는 다장기 파킨슨병 모델 및 이의 용도 {A method for preparing the Parkinson's disease model comprising 3D intestinal organoid and 3D neuro ectodermal sphere, and use thereof}
본 발명은 (a) LRRK2 (leucine-rich repeat kinase 2) 유전자 변이에 의한 파킨슨병 환자 유래의 분리된 성체세포로부터 리프로그래밍된 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell; iPSC)를 3차원 장관 오가노이드 (3D intestinal organid, IO) 및 3차원 신경외배엽 구체 (3D neuro ectodermal sphere, NS)로 분화시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 제조된 3차원 장관 오가노이드 및 3차원 신경외배엽 구체를 LRRK2 변이에 의한 파킨슨병의 다장기 모사 모델로 구축하는 단계; 를 포함하는, LRRK2 변이에 의한 파킨슨병의 생체 외 다장기 (multiple organ) 모사 모델의 제조 방법 및 상기 세포 모델을 파킨슨병 연구에 이용하는 용도에 관한 것이다.
파킨슨병 (Parkinson's disease)은 흑질 치밀부 (substantia nigra pars compacta, SNc)에서 도파민작동성 뉴런의 신경퇴화 및 소실이 일어나는 질환으로, 이는 선조체 (striatum)에서 점차 도파민의 고갈을 일으킨다. 파킨슨병의 특징은 기저핵 순환의 균형을 망가뜨리고 운동뉴런의 제 기능을 못하게 하여, 경직 (rigidity), 진전 (tremor), 운동불능 (akinesia)를 일으킨다. 50대 이상의 인구의 1~5 %가 두 번째로 가장 흔하게 겪는 신경퇴화 질병이다.
LRRK2 (leucine-rich repeat kinase 2) 유전자의 G2019S 변이는 파킨슨병의 가장 흔한 유전적 원인이다. LRRK2 유전자의 변이는 파킨슨병과 관련되어 있으며 (Moehle et al., The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 32, 1602-1611, 2012), LRRK2의 유전적 다양성은 파킨슨병의 증가에 기여할 수 있다고 알려져 있다 (Greggio et al., Journal of neuroinflammation 9, 94, 2012; Simon-Sanchez et al., Nature genetics 41, 1308-1312, 2009).
한편, 파킨슨병은 대표적인 신경퇴행성 질환으로 알려져 있다. 따라서, 기존의 파킨슨병 연구는 주로 동물모델을 이용한, 신경모델에 집중되어 연구되었기 때문에 파킨슨병 환자에서 확인되는 대표적인 비운동증상 (non-motor symptom) 중 하나인 장 관련 질환 (장내 염증반응, 변비, 위염, 크론병 등)에 관해서는 따로 연구할 수 밖에 없는 한계가 있었다. 또한, 기존의 2차원 배양을 통한 세포모델에서는 인체의 장기 및 조직을 구성하는 다양한 세포 종류와 복잡한 구조를 반영할 수 없어, 인체 생리학적인 환경과 기능을 모사하기 어려운 문제점이 있었다. 따라서, 파킨슨병 모델을 개발하는 데에도 한계가 있었다.
상기와 같은 배경하에, 본 발명자들은 파킨슨병 환자로부터 유전적 배경이 동일한 3D 장관모델 및 신경모델을 개발하기 위해, 파킨슨병 환자유래 섬유아세포를 이용하여, 유도만능 줄기세포를 제작하고, 이로부터 동물실험을 대체 할 수 있는 3차원 파킨슨병 모델을 제조함으로써 본 발명을 완성하였다. 특히, 본 발명의 파킨슨병 환자-유래의 3차원 장관 오가노이드 모델은 파킨슨병 장관에서 보이는 증상을 확인하기 위한 최초의 인간 3차원 장관 모델을 제공한다. 또한, 본 발명에서 개발한 파킨슨병 모델은 파킨슨병 환자로부터 유전적 배경이 동일한 3차원 장관모델 및 신경모델을 최초로 동시에 제작하였는바, 다장기 모델 시스템을 활용하는 새로운 파킨슨병 연구 시스템을 제공한다.
본 발명의 하나의 목적은 (a) LRRK2 (leucine-rich repeat kinase 2) 유전자 변이에 의한 파킨슨병 환자 유래의 분리된 성체세포로부터 리프로그래밍된 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell; iPSC)를 3차원 장관 오가노이드 (3D intestinal organid, IO) 및 3차원 신경외배엽 구체 (3D neuro ectodermal sphere, NS)로 분화시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 제조된 3차원 장관 오가노이드 및 3차원 신경외배엽 구체를 LRRK2 변이에 의한 파킨슨병의 다장기 모사 모델로 구축하는 단계; 를 포함하는, LRRK2 변이에 의한 파킨슨병의 생체 외 다장기 (multiple organ) 모사 모델의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) LRRK2 (leucine-rich repeat kinase 2) 유전자 변이에 의한 파킨슨병 환자 유래의 분리된 성체세포로부터 리프로그래밍된 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell; iPSC)를 3차원 장관 오가노이드 (3D intestinal organid, IO) 및 3차원 신경외배엽 구체 (3D neuro ectodermal sphere, NS)로 분화시키는 단계; 및 (b) 상기 분화된 3차원 장관 오가노이드 (3D intestinal organid, IO) 및 3차원 신경외배엽 구체 (3D neuro ectodermal sphere, NS)가 하기 (i) 또는 (ii) 중 어느 하나 이상의 유전적 특징을 갖고 있는지 확인하는 단계를 포함하는, 분화 역가를 판단하는 방법: i) RAB3A (Ras-related protein Rab-3A), SYT1 (Synaptotagmin-1), SYP (Synaptophysin), STX1B (Syntaxin-1B), SYN2 (Synapsin-2) 및 SYN3 (Synapsin-3)로 이루어진 시냅스 소포 수송 (Synaptic vesicle trafficking) 관련 유전자 중 하나 이상의 발현 증가; 및 ii) BMP7 (Bone morphogenetic protein 7), PTCH1 (Protein patched homolog 1), WNT7B (Protein Wnt-7b), GAS1 (Growth arrest-specific protein 1), WNT3 (Proto-oncogene protein Wnt-3), WNT5B (Protein Wnt-5b) 및 WNT7A (Protein Wnt-7a)로 이루어진 헤치호그 신호 전달 (Hedgehog signaling pathway) 관련 유전자로서 중 하나 이상의 발현 증가를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된, LRRK2 변이에 의한 파키슨병의 생체 외 다장기 (multiple organ) 모사 모델에 LRRK2 변이에 의한 파킨슨병의 치료 후보 물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 후보 물질이 처리된 LRRK2 변이에 의한 파킨슨병의 생체 외 다장기 모사 모델의 3차원 장관 오가노이드 및 3차원 신경외배엽 구체의 유전적 변이를, 상기 파킨슨병의 치료 후보 물질이 처리되지 않은 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, LRRK2 변이에 의한 파킨슨병의 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 (a) LRRK2 (leucine-rich repeat kinase 2) 유전자 변이에 의한 파킨슨병 환자 유래의 분리된 성체세포로부터 리프로그래밍된 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell; iPSC)를 3차원 장관 오가노이드 (3D intestinal organid, IO) 및 3차원 신경외배엽 구체 (3D neuro ectodermal sphere, NS)로 분화시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 제조된 3차원 장관 오가노이드 및 3차원 신경외배엽 구체를 LRRK2 변이에 의한 파킨슨병의 다장기 모사 모델로 구축하는 단계; 를 포함하는, LRRK2 변이에 의한 파킨슨병의 생체 외 다장기 (multiple organ) 모사 모델의 제조 방법 을 제공한다.
본 발명자들은 기존 신경 동물 모델을 대체할 수 있는 파킨슨병 환자 유래 섬유아세포로부터, 3차원 장관모델 및 신경모델을 제조하였으며, 이와 같은 3차원 장관 모델이 파킨슨병 환자와 동일/유사한 유전형 및 기능을 갖는 것을 최초로 규명 및 완성하였다. 이와 같은 모델은 3차원 장관 오가노이드 및 3차원 신경외배엽 구체 등의 다양한 장기를 모두 포함하여, 다양한 장기 및 증상을 동시에 확인할 수 있는 모델을 제공한다.
본 발명의 용어, "LRRK2 (leucine-rich repeat kinase 2)"는 류신-풍부한 반복 인산화효소 (leucine-rich repeat kinase)의 패밀리이며 파킨슨병의 유전적 원인으로 알려져 있다. 또한, LRRK2는 PARK8 유전자에 의해 암호화된다.
LRRK2는 다른 이름으로 다다린 (dardarin)으로 불리워지고 있다. 이의 유전적 정보는 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 미국 국립생물정보센터 (National Center for Biotechnology Information; NCBI)의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 성체세포는 LRRK2 유전자의 G6055A 변이 (서열번호 1) 및 LRRK2 단백질의 G2019S 변이 (서열번호 2) 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 구체적으로 LRRK2의 염기서열 중 6055번의 구아닌 (G)이 아데닌 (A)으로 점 돌연변이가 일어난 경우를 의미하며, 상기 유전자의 변이로 인하여 단백질 상에서는 2019번의 글라이신 (glycine, G)이 세린 (Serine, S)으로 변이가 일어난 것 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 파킨슨병의 생체 외 다장기 모사 모델은 LRRK2 변이에 의한 파킨슨병 환자 모사 모델 일 수 있다. LRRK2 변이에 의한 다장기 모사 모델 내의 유전자 발현 프로파일은 파킨슨병 원인 유전자 네트워크 및 발병 (pathogenesis) 연구에 사용될 수 있다.
본 발명의 용어, "성체세포"는 배아세포와 반대되는 용어로, 태어나서 생존하는 성체로부터 유래한 세포를 지칭한다. 본 발명에서 사용되는 성체세포는 유전적 배경이 동일한 LRRK2 유전자 변이에 의한 파킨슨병 환자 유래일 수 있으며, 구체적으로는 다양한 체세포, 그 예로 인간의 섬유아세포일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기, "섬유아세포"는 섬유성 결합조직의 중요한 성분을 이루는 세포로 특히 본 발명과 관련된 파킨슨병 섬유아세포에 있어서는 신경 또는 장을 구성하는 주요 세포를 의미한다. 본 발명에서 섬유아세포는 인간, 마우스, 랫트 등에서 유래할 수 있으나, 그 유래에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적상 본 발명의 3차원 장관 및 신경외배엽 구체를 제조하는 과정에서 이용하는 섬유아세포는 특히, 인간 유래 표피 섬유아세포일 수 있으며, 구체적으로 인간 유래 섬유아세포는 CRL-2097 세포주이고, LRRK2 G2019S변이 (LRRK2GS)를 가진 파킨슨병 환자의 표피 섬유아세포 ND29492 세포주 일 수 있다. 또한, 본 발명의 섬유아세포는 정상조직 유래 또는 파킨슨병 조직 유래 섬유아세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "리프로그래밍 (reprogramming)"은 분화능이 없는 세포 또는 일정부분 분화능이 있는 세포 등 서로 다른 양태로 존재하는 분화된 세포로부터 최종적으로 새로운 유형의 분화잠재력을 갖는 상태로 복원 또는 전환될 수 있는 프로세스를 의미한다. 또한, 본 발명에서 상기 리프로그래밍은 역분화 (dedifferentiation)와 동일한 의미로 사용될 수 있다. 이러한 세포의 리프로그래밍 기작은 핵 내의 후생유전학 (뉴클레오타이드 서열에서의 변화없이 기능에서의 유전적 변화를 일으키는 것과 관련된 DNA 상태)적 마크가 삭제된 후, 상이한 세트의 후생유전학적 마크를 수립하는 것을 의미하는데, 다세포 생물이 분화 및 성장하는 동안, 상이한 세포 및 조직은 상이한 유전자 발현 프로그램을 획득하게 된다.
상기 리프로그래밍은 파킨슨병 세포로부터 유도만능줄기세포를 만들 수 있는 한 제한이 없으며, 당업계의 공지 방법을 이용할 수 있다.
구체적으로, 본 발명에서 상기 인위적인 리프로그래밍 과정은 비삽입형 바이러스를 이용한 바이러스-매개 또는 비삽입형 비바이러스성 벡터 이용, 단백질 및 세포 추출물 등을 이용하는 비바이러스-매개 리프로그래밍 인자의 도입에 의해 수행되거나, 줄기세포 추출물, 화합물 등에 의한 리프로그래밍 과정을 포함할 수 있다. 유도만능줄기세포는 배아줄기세포와 거의 같은 특성을 가진다. 구체적으로는 동일한 세포 모양을 보여주며, 유전자 및 단백질 발현 패턴이 유사하고, 인 비트로 (in vitro) 및 인 비보 (in vivo)에서 전분화능을 가지며, 테라토마 (teratoma)를 형성한다. 특히, 생쥐의 유도만능줄기세포는 생쥐의 배반포 (blastocyst)에 삽입시켰을 때, 키메라 (chimera) 생쥐를 형성할 수 있으며, 유전자의 생식선 전이 (germline transmission)가 가능하다. 본 발명의 유도만능줄기세포는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐 또는 토끼 등의 모든 유래일 수 있으며, 구체적으로 인간 유래일 수 있다.
본 발명에서 상기, "리프로그래밍 인자"란 최종적으로 분화된 세포가 새로운 유형의 분화되는 잠재력을 갖는 전분화능 줄기세포 (Pluripotent stem cell)로 리프로그래밍 되도록 유도하는 물질이다. 상기 리프로그래밍 인자는 최종적으로 분화된 세포의 리프로그래밍을 유도하는 물질이면 제한 없이 포함할 수 있으며, 분화시키려는 세포의 종류에 따라 선택할 수 있다. 구체적으로, 리프로그래밍 인자는 Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog, Lin-28 및 Rex1로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 핵산분자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell, iPSC)"는 파킨슨병 환자의 성체 세포로부터 인위적인 리프로그래밍 (reprogramming) 과정을 통해 전분화능 (pluripotency)을 가지도록 유도된 세포를 의미한다. 본 발명의 목적상 파킨슨병 세포는 파킨슨병 환자의 질환 조직에서 분리된 성체세포 또는 파킨슨병이 유도된 성체 세포일 수 있으나, 파킨슨병 관련 증상을 가지는 한 제한이 없다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 LRRK2 G2019S 변이를 가진 파킨슨병 환자 특이적 유도만능줄기세포 (iPSCs)를 제조하였다 (실시예 1). 면역염색법, 유동세포계수법, DNA 시퀀싱, STR분석을 통해, LRRK2 G2019S변이를 가진 파킨슨병 섬유아세포의 게놈비삽입형 LRRK2GS-iPSCs로의 성공적인 리프로그래밍이 되었음을 알 수 있었다.
본 발명의 용어, "오가노이드 (organoid)"는 3D 입체구조를 가지는 세포를 의미하며, 동물 등에서 수집, 취득하지 않은 인공적인 배양 과정을 통하여 제조한 신경 및 장과 유사한 모델을 의미한다. 이를 구성하는 세포의 유래는 제한되지 않는다. 상기 오가노이드 (organoid)는 세포의 성장 과정에서 주변 환경과 상호 작용하도록 허용되는 환경을 가질 수 있다. 2D 배양과는 달리, 3D 세포 배양은 체외에서 세포가 모든 방향으로 성장 할 수 있다. 이에 따라 본 발명에서 3D 오가노이드는 실제로 생체내에서 상호 작용을 하고 있는 장기를 거의 완벽히 모사하여, 질병의 치료제 개발 및 등을 관찰할 수 있는 훌륭한 모델이 될 수 있다.
본 발명에서 오가노이드는 (organoid)는 본 발명의 유도만능줄기세포를 배양하여 제조할 수 있다. 구체적으로 파킨슨병 유래의 유도만능 줄기세포로부터 신경외배엽 구체 (neuroectodermal sphere) 형태의 신경외배엽 구체로 분화하거나 파킨슨병 유래의 유도만능 줄기세포로부터 진정 내배엽 (definitive endoderm), 후장 (hindgut)으로의 단계별 분화를 통한 장관 오가노이드로 분화를 유도할 수 있다.
본 발명에서 용어, "분화"는 세포가 분열하여 증식하며 전체 개체가 성장하는 동안에 세포의 구조나 기능이 특수화되는 현상을 의미한다. 즉, 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어지는 역할을 수행하기 위해 적합한 형태 및 기능으로 변하는 과정을 말하며, 예를 들어, 배아줄기세포와 같은 전분화능 줄기세포가 외배엽, 중배엽 및 내배엽 세포로 변하는 과정뿐 아니라 조혈모세포가 적혈구, 백혈구, 혈소판 등으로 변하는 과정, 즉 전구세포가 특정 분화형질을 발현하게 되는 것도 모두 분화에 포함될 수 있다.
본 발명에서 용어 "파킨슨병 (Parkinson's disease)"은 뇌의 흑질 (substantia nigra)에 분포하는 도파민의 신경세포가 점차 소실되어 발생하며 안정떨림, 경직, 운동완만 및 자세 불안정성이 특징적으로 나타나는 신경계의 만성 진행성 퇴행성 질환을 의미한다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 파킨슨병 관련 표현형을 보여주기 위해 LRRK2GS-iPSCs를 신경전구세포 (neural progenitor cells, NPCs)를 포함하는 '신경외배엽 구체' (human neuroectodermal sphere, hNS)로 분화되도록 하였고, LRRK2GS변이가 장내 조직의 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는지 확인하기 위해, 3D hIO (human intestinal organoids) 시스템을 이용하여 hPSC로부터 장 상피세포를 얻었다 (도 3).
qRT-PCR 분석을 통해, hPSC 유래 WT-hNS 및 LRRK2GS-hNS에서 NESTIN 및 PAX6와 같은 신경 줄기/전구체 마커의 높은 발현을 확인하였고, WT-iPSC 및 LRRK2GS-iPSCs에서 장내 전사 인자인 SOX9, KLF5와 장 세포 마커인 VIL (장세포를 위한 Villin 1), MUC2 (배상 세포를 위한 mcin 2), LYZ (파네스 세포를 위한 lysozyme) 및 CHGA (장 내분비 세포를 위한 chromogranin A)의 발현을 확인하였다.
이를 통해, 파킨슨병 섬유아세포로부터 3차원 신경외배엽 구체 및 3차원 장관 오가노이드의 성공적인 분화를 확인할 수 있었다.
본 발명에서 파킨슨병 세포 유래 유도만능 줄기세포를 오가노이드 (organoid)로 배양함으로써 기존의 동물 모델의 한계인 인간의 생리학적 및 진화적 차이를 극복할 수 있고, 2D 세포 배양 시스템을 이용할 경우 발생하는 파킨슨병 관련 인체 신경세포 및 장세포의 형성 과정 및 복잡한 병리학적 과정을 밝히는데 활용될 수 있다. 또한, 신경세포 및 장세포의 형성 등을 유전자 발현, 면역염색 및 형태학적으로 확인하기 쉬우며, 파킨슨병 모델로서 인체내 환경과 유사하고, 정교하게 재현할 수 있는 장점이 있다.
또한, 파킨슨 환자로부터 유전적 배경이 동일한 3차원 장관 오가노이드 및 신경외배엽 구체를 최초로 동시에 제작하였는바, 이들의 비교분석을 통하여 파킨슨 환자의 신경세포와 장관세포에서 보이는 공통점과 차이점을 확인할 수 있는 파킨슨병의 다장기 모델 시스템으로써 활용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 오가노이드 (organoid)는 파킨슨병 모델로서 이용될 수 있다.
본 발명에서, 상기 제조방법은 3차원 장관 오가노이드 및 3차원 신경외배엽 구체는 유전적 배경이 동일한 환자의 성체세포로부터 분화된 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나, 특별히 제한되지 않는다.
상기 "오가노이드" 및 "분화"는 전술한 바와 같다.
본 발명에서 유전적 배경이 동일한 환자의 성체세포란 타고난 유전자 이상이 있는 환자의 성체세포를 의미하며, 구체적으로 LRRK2 유전자 돌연변이로 인하여 파킨슨병을 일으키는 유전적 결함이 있는 파킨슨병 가족력이 있는 환자의 성체세포 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 상기 제조방법은 3차원 장관 오가노이드 및 3차원 신경외배엽 구체는 동일 환자의 성체세포부터 분화되어, 환자 맞춤형 모델인 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나, 특별히 제한되지 않는다.
상기 "오가노이드" 및 "분화"는 전술한 바와 같다.
본 발명에서 동일 환자의 성체세포란 LRRK2 유전자 돌연변이로 인하여 파킨슨병이 유발된 환자의 성체세포로서, 본 발명의 목적상 파킨슨병 조직 유래 성체세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 동일 환자로부터 분리된 성체세포는 이를 분리한 환자에게 다양한 치료제를 투여하여 실험을 수행하기 어려운 경우, 환자 맞춤형 모델로 사용하여 안정적으로 치료제등의 스크리닝 뿐 아니라, 발병원인 연구에 사용될 수 있다.
본 발명에서, 상기 LRRK2 변이에 의한 파킨슨병의 생체 외 다장기 모사 모델은, 파킨슨병의 운동 증상 (motor symptom) 및 비운동 증상 (non-motor symptom)을 동시에 분석할 수 있는 것일 수 있으나, 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "파킨슨병의 운동 증상 (motor symptom)"은 느려짐 (bradykinesia), 떨림 (tremor), 경축 (rigidity), 자세의 불안정 (postural instability), 보행 장애 (gait disturbance)와 같은 증상을 의미하며, "파킨슨병의 비운동 증상 (non-motor symptom)"은 불안, 우울 기분, 환각이나 망상과 같은 정신 증상, 인지 기능의 장애, 수면 장애, 감각 증상, 자율 신경계 증상을 의미한다.
구체적으로 운동증상은 신경외배엽 구체를 통해 분석할 수 있으며, 비운동증상은 장관 오가노이드를 통해 분석할 수 있다. 더욱이 본 발명은 비운동증상 중 하나인 장 관련 질환 (장내 염증반응, 변비, 위염, 크론병 등)을 확인함으로써 파킨슨병 환자의 장 관련 질환까지 이중으로 확인할 수 있는 장점이 있다.
본 발명에 의해 제조된 장관 오가노이드 및 신경외배엽 구체는 하기의 특징을 갖는다:
i) RAB3A (Ras-related protein Rab-3A), SYT1 (Synaptotagmin-1), SYP (Synaptophysin), STX1B (Syntaxin-1B), SYN2 (Synapsin-2) 및 SYN3 (Synapsin-3)로 이루어진 시냅스 소포 수송 (Synaptic vesicle trafficking) 관련 유전자 중 하나 이상의 발현 증가; 및
ii) BMP7 (Bone morphogenetic protein 7), PTCH1 (Protein patched homolog 1), WNT7B (Protein Wnt-7b), GAS1 (Growth arrest-specific protein 1), WNT3 (Proto-oncogene protein Wnt-3), WNT5B (Protein Wnt-5b) 및 WNT7A (Protein Wnt-7a)로 이루어진 헤치호그 신호 전달 (Hedgehog signaling pathway) 관련 유전자로서 중 하나 이상의 발현 증가.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 장관 오가노이드 및 신경외배엽구체에서 파킨슨병과 관련된 경로를 확인한 결과, 시냅스 소포 수송과 관련하여 RAB3A, SYT1, SYP, STX1B, SYN2 또는 SYN3의 발현이 증가되고(도 8A), 헤치호그 신호 전달과 관련하여 BMP7, PTCH1, WNT7B, GAS1, WNT3, WNT5B 또는 WNT7A의 발현이 증가됨을 확인하였다(도 11).
본 발명의 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) LRRK2 (leucine-rich repeat kinase 2) 유전자 변이에 의한 파킨슨병 환자 유래의 분리된 성체세포로부터 리프로그래밍된 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell; iPSC)를 3차원 장관 오가노이드 (3D intestinal organid, IO) 및 3차원 신경외배엽 구체 (3D neuro ectodermal sphere, NS)로 분화시키는 단계; 및 (b) 상기 분화된 3차원 장관 오가노이드 (3D intestinal organid, IO) 및 3차원 신경외배엽 구체 (3D neuro ectodermal sphere, NS)가 하기 (i) 또는 (ii) 중 어느 하나 이상의 유전적 특징을 갖고 있는지 확인하는 단계를 포함하는, 분화 역가를 판단하는 방법을 제공한다:
i) RAB3A (Ras-related protein Rab-3A), SYT1 (Synaptotagmin-1), SYP (Synaptophysin), STX1B (Syntaxin-1B), SYN2 (Synapsin-2) 및 SYN3 (Synapsin-3)로 이루어진 시냅스 소포 수송 (Synaptic vesicle trafficking) 관련 유전자 중 하나 이상의 발현 증가; 및
ii) BMP7 (Bone morphogenetic protein 7), PTCH1 (Protein patched homolog 1), WNT7B (Protein Wnt-7b), GAS1 (Growth arrest-specific protein 1), WNT3 (Proto-oncogene protein Wnt-3), WNT5B (Protein Wnt-5b) 및 WNT7A (Protein Wnt-7a)로 이루어진 헤치호그 신호 전달 (Hedgehog signaling pathway) 관련 유전자로서 중 하나 이상의 발현 증가.
상기 "LRRK2", "파킨슨병", "리프로그래밍", "유도만능줄기세포", "오가노이드" 및 "분화"는 전술한 바와 같다.
본 발명에서 3차원 장관 오가노이드는 장 상피세포 타입을 보여주기 위한 마커 특이적 항체와 함께 장내 전사 인자인 SOX9, KLF5와 장 세포 마커인 VIL (장세포를 위한 Villin 1), MUC2 (배상 세포를 위한 mcin 2), LYZ (파네스 세포를 위한 lysozyme) 및 CHGA (장 내분비 세포를 위한 chromogranin A)의 발현 및 로컬리제이션(localization)을 측정하여 분화역가를 확인할 수 있고, 또한 3차원 신경외배엽 구체는 NPC 마커 PAX6와 신경로젯 마커 ZO-1 및 PLZF로 확인할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 유전자군의 발현이 증가되었으면 원하는 오가노이드 또는 신경외배엽 구체로 분화하였음을 의미한다.
본 발명의 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 상기 방법으로 제조된, LRRK2 변이에 의한 파키슨병의 생체 외 다장기 (multiple organ) 모사 모델에 LRRK2 변이에 의한 파킨슨병의 치료 후보 물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 후보 물질이 처리된 LRRK2 변이에 의한 파킨슨병의 생체 외 다장기 모사 모델의 3차원 장관 오가노이드 및 3차원 신경외배엽 구체의 유전적 변이를, 상기 파킨슨병의 치료 후보 물질이 처리되지 않은 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, LRRK2 변이에 의한 파킨슨병의 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 "LRRK2", "파킨슨병", "리프로그래밍", "유도만능줄기세포", "오가노이드" 및 "분화"는 전술한 바와 같다.
본 발명에서 사용된 용어 "후보 물질(test agent)"은 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함한다. 예를 들어, 이들로 한정되지는 않으나, 단백질, 폴리펩티드, 소 유기분자(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함한다. 또한, 천연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "대조군"은 상기 후보 물질이 처리되지 않은 모사 모델을 의미한다.
본 발명에 따른 파킨슨병 모델은 인간을 포함하는 동물의 파킨슨병과 관련된 생리학적, 분자생물학적, 생화학적 연구의 수행에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 파킨슨병 모델은 인간의 신경 및 장에 가까운 구성을 가지고 있어 전 세계적인 동물실험 대체 모델에 대한 요구에 있어서 파킨슨병 모델에 대안으로 사용될 수 있다.
본 발명의 제조방법에 따른 파킨슨병 모델은 동물실험 대체 실험 분야에서 널리 사용될 수 있다.
도 1은 iPSC와 3D 오가노이드 기술을 이용한 파킨슨병의 LRRK 관련 흐름을 나타내는 도이다.
도 2는 LRRK2 G2019S 변이를 가진 파킨슨병 특이적 iPSC의 구성을 확인한 도이다.
A는 hESC 마커인 OCT4, NANOG, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-3 및 SSEA-4를 위한 LRRK2GS-iPSCs의 대표적 형태 및 면역 염색 도이다; 모든 LRRK2GS-iPSC 군집들은 알칼리 포스파타아제(ALP)를 발현한다. 기준자;100μm.
B는 전능성 표면 마커인 TRA-1-60 및 SSEA3을 위한 LRRK2GS-iPSCs의 유동세포계수법 분석을 나타낸 것이다.
C는 파킨슨병 환자의 섬유아세포와 iPSCs에서 구아닌 (G)에서 아데닌 (A)으로의 변이 (G6055A)가 확인된 LRRK2 유전자의 시퀀싱 결과이다.
D는 LRRK2GS-iPSCs의 시험관 내 분화를 나타내는 도이다; 내배엽 마커 FOXA2 및 SOX17, 중배엽 마커 DESMIN 및 α-평활근 액틴 (α-SMA), 외배엽 마커 TUJ1 및 NESTIN을 위한 LRRK2GS-iPSCs의 면역 염색 도이다. 핵은 DAPI(blue)로 염색되었다. 기준자;100μm.
E는 LRRK2GS-iPSCs 내 에피솜 벡터의 카피수를 나타낸다. 섬유아세포는 양성 대조군으로서 전기천공법 처리 5일 후에 분석되었다.
F는 LRRK2GS-iPSCs의 STR 프로필로서, 회색 부분은 LRRK2GS-iPSCs를 위한 공여자 세포를 나타낸다.
도 3는 LRRK2GS-iPSCs의 신경외배엽 구체 및 장관 오가노이드로의 분화를 확인한 도이다.
A는 신경전구세포 (NPCs)를 포함하고 있는 신경외배엽 구체 (NS)로의 분화 프로토콜을 통해 LRRK2GS-iPSCs 유래 신경외배엽 구체를 확보하였다. NPCs가 hNS형태의 신경외배엽 구체로 제작 및 유지되었고 기계적 절개(dissection)에 의해 계대 배양되었다.
B는 신경 줄기세포 마커(PAX6), 신경 로젯(neural rosette) 연관된 전사 인자(PLZF) 및 단단한 접합 단백질(ZO-1)을 가진 로젯(rosette)의 중앙에 표지한 hNS의 대표적인 형태와 면역염색 도이다. 기준자;100μm.
C는 hNS에서 마커 유전자의 qRT-PCR 분석 결과이다; 다능성 마커인 OCT4는 현저하게 감소하는 반면, 신경 마커인 NESTIN과 PAX6는 매우 풍부해졌다. 발현 수준에서 배율 변화는 미분화된 hESCs와 관련이 있다.
D는 LRRK2GS-iPSCs 유래 인간 장관 오가노이드 (hIOs)를 얻기 위해 사용한 프로토콜의 도이다.
E는 장 전사 인자 (SOX9 및 KLF5), 장세포 마커 (VIL), 배상 세포 (goblet cell) 마커 (MUC2), 파네스 세포 (Paneth cell) 마커 (LYZ) 및 장 내분비세포 마커 (CHGA)를 가진 hIOs의 대표적인 형태 및 면역염색 도이다. 기준자;100μm.
F는 hIOs에서 마커 유전자의 qRT-PCR 분석 결과이다. 장 줄기 세포 마커 (LGR5), 장 표현형 마커 (CDX2) 및 장세포 마커 (VIL 및 ISX)는 매우 풍부함을 확인하였다. 발현 수준의 배율 변화는 미분화된 hESCs와 연관되어 있다.
도 4는 LRRK2GS-iPSC 유래 신경외배엽 구체와 장관 오가노이드 내 LRRK2 변이의 전사체 변화 downstream의 글로벌 분석을 나타내는 결과이다.
A는 hNS와 hIO의 전사체 발현 비율 분포를 나타낸다; 각 전사에 Log2 비율 (LRRK2GS-iPSC-유래/hESC-유래 및 LRRK2GS-iPSC-유래/WT-iPSC-유래에서 각각)이 계산되었다. Log2 비율 (Y축)의 빈도 (X축)는 hNS (왼쪽 막대)와 hIO (오른쪽 막대)를 이용하여 막대그래프로 나타냈다.
B는 LRRK2GS-iPSC, LRRK2GS-hNS 및 LRRK2GS-hIO의 히트맵을 나타낸다. 각 값은 미분화된 PSCs의 값으로 표준화 되었다. 발현에 유의적인 변화 (최소 2배 이상)가 없는 유전자는 제거되었다. hESCs와 WT-iPSC는 모두 대조군으로 사용되었다.
C는 마이크로어레이 데이터에 근거한 LRRK2GS-hNS 및 LRRK2GS-hIO에서 차이나게 발현된 유전자의 주성분 분석 (PCA)을 나타낸다.
도 5는 LRRK2 G2019S 변이를 가진 LRRK2GS-iPSCs 유래 신경외배엽 구체 및 장관 오가노이드 (organoid)의 기능적 주석 클러스터링 분석 결과이다.
클러스터는 색으로 표시된 상자에서 GO 용어와 높은 점수의 대표적인 샘플을 함께 나타낸다. 막대는 GO 용어의 풍부함 (갈색)과 단백질의 총 숫자와 연관되는 포함된 단백질들 (%로 측정, 노란색)을 나타낸다. p값은 가장 오른쪽에 표기하였다.
도 6는 LRRK2 G2019S 변이의 영향을 받아 변화된 유전자의 관련 경로를 나타낸다.
LRRK2GS-iPSCs 유래 신경외배엽 구체 (A) 및 장관 오가노이드 (B)에서 가장 풍부한 경로가 PANTHER 경로 분석으로 확인되었다.
도 7은 LRRK2GS-iPSC 유래 신경외배엽 구체와 장관 오가노이드에서 별도로 발현된 유전자의 GO/경로 용어 강화된 네트워크 (GO/pathway term enrichment network)를 나타낸다.
LRRK2 G2019S 변이를 가진 hNS (A) 및 hIO (B)에서 기능적으로 그룹 지어진 GO/경로 용어의 강화된 네트워크는 ClueGO (kappa score: ≥0.4)에 의해 시각화 되었다 (왼쪽 패널). 기능적으로 그룹화된 GO 용어의 분포는 벤 다이어그램으로 나타내었다 (오른쪽패널). 기능적으로 그룹화된 네트워크 내의 용어는 p값≥0.05에서 차단되었다. GO 용어의 각 그룹은 각 용어의 p값으로 결정된 원의 색과 크기에 의해 구별되었다. 상위 5개 그룹의 GO 용어는 폐쇄된 선으로 표시되었으며 대표적인 용어는 옆쪽에 기재하였다.
도 8은 시냅스 소포 수송 (synaptic vesicle trafficking) 관련 유전자의 발현을 나타낸다.
A는 hNS와 hIO의 시냅스 소포 수송에 관여하는 유전자의 전사체 분석 결과이다.
B는 LRRK2GS-hNS 및 LRRK2GS-hIO에서 RAP3A, SYT1, STX1B, SYN2 및 SYN3를 포함하는 시냅스 소포 수송에 관여하는 조절 장애를 가진 유전자의 qRT-PCR 확인 결과이다. 발현 수준 내의 배율 변화는 각각 hESC 유래 hNS 및 hIO와 연관되어 있음을 나타내는 것이다.
도 9는 LRRK2GS-iPSC 유래 신경외배엽 구체 및 장관 오가노이드 내 전사체의 유전자 온톨로지 (GO) 분석 결과이다.
PANTHER 분류 시스템을 이용하여 G2019S 변이를 가진 hNS (A)와 hIO (B)에서 배율 변화가 두 배 혹은 그 이상인 별도로 발현된 유전자를 분류한 것이다.
도 10은 LRRK2 변이에 의한 시냅스 소포 수송 관련 유전자 발현 분석 결과이다.
A는 인간 전사체 데이터 셋을 이용한 LRRK2 발현 프로필을 나타내는 것이다.
B는 hNS 및 hIOs 내 LRRK2의 qRT-PCR 분석 결과이다.
도 11은 LRRK2 변이에 의한 헤치호그 신호 전달 (Hedgehog signaling pathway) 관련 유전자 발현 분석 결과이다. 헤치호그 신호 전달 중 LRRK2 변이에 의해 hNS 및 hIOs 내 LRRK2의 qRT-PCR 분석 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험예 1. 인간 iPSC 생성 및 배양
인간의 야생형 (WT) 섬유아세포 (CRL-2097)는 ATCC (American Type Culture Collection)에서 구입하였다. 이형접합체 형태의 LRRK2 G2019S변이 (LRRK2GS)를 가진 파킨슨병 섬유아세포 (ND29492)는 Coriell Institute for Medical Research에서 구입하였다. H9 인간 배아줄기세포주 (hESC)는 Madison, WI의 WiCell Research Institute를 통해 얻었다. 섬유아세포 및 hESCs와 iPSCs를 포함하는 인간 만능줄기세포 (hPSCs)의 배양은 공지된 방법 (Chae et al., International journal of cardiology 165, 341-354, 2013; Yoon et al., Molecular carcinogenesis 55, 387-396, 2016)에 따라 수행하였다.
섬유아세포는 공지된 방법 (Ho et al., Mol Brain 8, 54, 2015; Son et al., Experimental & molecular medicine 48, e232, 2016)에 따라 네온 트랜스펙션 시스템 (Neon Transfection System (Cat. No. MPK10096. Invitrogen))을 이용한, OCT4, SOX2, KLF4, L-MYC, LIN28 및 shRNA-p53을 암호화하는 Episomal iPSC 리프로그래밍 백터 (Cat. No. A14703. Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 전기천공법 (electroporation)으로 트랜스팩션시켜서 리프로그래밍 되었다.
트랜스팩션 5일 후 섬유아세포는 마트리겔 (Matrigel)(BD Biosciences, San Diego, CA, USA)-코팅된 6-웰 플레이트에 1×105/웰로 플레이팅 하였다. 세포는 mTeSR1 배지 (Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada) 또는 인간 iPSC 배지로 배양하였다. 3주 뒤, hESC-유사 iPSC 콜로니를 선택하였고, 계대배양 및 추후 특징 설정을 위해 세포수를 증대시켰다. 환자 특이적 인간 iPSC 세포주는 공지된 방법 (Son et al., Stem cells 31, 2374-2387, 2013)에 따라 mTeSR1의 Matrigel에서 배양하였다.
실험예 2. 알칼리성 인산가수분해효소 (ALP)와 면역세포화학
알칼리성 인산가수분해효소 (ALP) 염색을 위해 시트레이트-아세톤-포름알데히드 고정 용액으로 세포를 고정시키고, 그 후에 ALP 염색 키트 (Naphthol/fast red violet, Sigma-Aldrich, St. louis, MO, USA)를 이용하여 염색하였다.
면역세포화학은 공지된 방법에 따라 수행하였다 (Kwak et al., Biochemical and biophysical research communications 457, 554-560, 2015). 구체적으로, 세포를 4% 포름알데히드로 고정시키고, 0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 PBS로 투과시켰다. 3%의 BSA로 블로킹 후 세포를 4℃에서 하룻밤 동안 1차 항체와 반응시켰다. 이후, 상온에서 1시간 동안 2차 항체와 반응시켰다. 사용된 일차 항체는 표 1과 같다. DAPI는 핵을 시각화하기 위해 추가하였다. 슬라이드는 Axiovert 200M 현미경 (Carl Zeiss, Gottingen, Germany) 또는 형광 현미경 (IX51, Olympus, Japan)을 통해 관찰하였다.
항체 Catalog No. 회사 희석
Pluripotency markers
anti-OCT4 sc-9081 Santa Cruz Biotechnology 1:500
anti-NANOG AF1997 R&D 1:40
anti-SSEA-3 MAB4303 Millipore 1:500
anti-SSEA-4 MAB4304 Millipore 1:500
anti-TRA-1-60 MAB4360 Millipore 1:500
anti-TRA-1-81 MAB4381 Millipore 1:500
In vitro differentiation markers
anti-TUJ1 PRB-435P Covance 1:500
anti-NESTIN MAB5326 Millipore 1:100
anti-FOXA2 07-633 Millipore 1:100
anti-SOX17 MAB1924 R&D 1:50
anti-α-SMA A5228 Sigma 1:200
anti-DESMIN AB907 Chemicon 1:50
NPC differentiation markers
anti-PAX6 PRB-278P Covance 1:500
anti-PLZF OP-128 Millipore 1:70
Anti-ZO-1 617300 Invitrogen 1:500
Intestinal organoid differentiation markers
anti-SOX9 sc-20095 Santa Cruz 1:50
anti-KLF5 ab137676 abcam 1:100
anti-Villin sc-7672 Santa Cruz 1:50
anti-Mucin2 sc-7314 Santa Cruz 1:50
anti-Lysozyme ab76784 abcam 1:200
anti-Chromogranin A MA5-14536 Thermo Scientific 1:100
실험예 3. 유세포분석
세포는 Accutase (Millipore, Billerica, MA, USA)를 이용해 분리하였고 FACS 버퍼 50μl (3% FBS in DPBS)에서 1×105의 세포로 현탁시켰다. 세포는 TRA-1-60 (BD Biosciences, Cat. No. 560380) 및 SSEA3 (BD Biosciences, Cat. No. 561564)를 붙인 항체에 의해 4℃에서 1시간 동안 표지하였고, FACS 버퍼로 두 번 씻어냈으며, 이후 제조사의 지침에 따라 BD Accuri™ C6 유세포분석기 (BD Biosciences, Bedford, MA, USA)를 이용해 분석하였다. 데이터는 BD accuri C6 소프트웨어를 이용해 분석하였다.
실험예 4. 돌연변이 확인을 위한 DNA 시퀀싱
제조사의 지침에 따라 DNase Blood & Tissue kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 파킨슨병 섬유아세포와 iPSC로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 5‘-CTT TAA GGG ACA AAG TGA GCA CAG A-3’ (서열번호 3) 및 5‘-CTC ACA AGT GCC AAC AAT ACC TAG A-3’ (서열번호 4) 프라이머는 LRRK2의 게놈 영역을 증폭시키기 위해 쓰였다. PCR은 AccuPower PCR premix (Bioneer Corporation, 대전, 대한민국)를 이용해 수행하였다. DNA 시퀀싱은 GenoTech Corporation (대전, 대한민국)에서 수행하였다.
실험예 5. 에피솜 카피수 검출 (Episomal copy-number detection)
인간 iPSC 펠렛은 1×Taq 버퍼 (Takara, Kyoto, Japan) 및 단백질 가수분해효소 K가 포함된 용해 용액에서 3시간 동안 55℃에서 용해시켰다. 용해물은 공지된 방법에 의해 qRT-PCR 분석에 사용하였다 (Habig et al., Neurogenetics 9, 83-94, 2008). pCXLE-hFbx15-cont2 플라스미드의 정해진 농도를 이용해 표준 커브를 구성하였다. 각 샘플에서 EBNA-1과 FBXO15의 카피수 (copy-number)를 6번 반응에서 얻어진 CT값으로부터 산출하였다.
실험예 6. STR (Short tandem repeat)분석
환자 특이적 iPSC 세포주의 기원을 분석하기 위한 STR 분석은 Humanpass, Inc. (서울, 한국)에 의뢰하여 수행하였다. 데이터는 평균값 ± SD (n=3)로 표시하였다. ***p < 0.001 (Unpaired student's t-test).
실험예 7. 배양체 (EBs) 형성을 통한 In vitro 분화
삼배엽으로의 자연스러운 분화를 위해 인간 iPSCs는 1mg/ml 콜라게나아제 (collagenase) IV 처리에 의해 분리시켰고, 10%의 녹아웃 세럼 대체제, 1%의 비필수 아미노산들, 0.1mM의 β-머캅토에탄올 및 1mM의 L-글루타민이 보충된, 녹아웃 DMEM EB 배지가 있는 페트리접시 위에 플레이팅 하였다. 현탁 배양 5일 후, 배양체(EBs)는 젤라틴으로 코팅된 LabTek 챔버 슬라이드(Nunc International, Naperville, II, USA)로 옮기고, 10일간 추가로 배양시켰다.
실험예 8. 정량적 실시간 RT-PCR(qRT-PCR)
전체 RNA는 RNeasy 키트 (Qiagen)를 이용해 세포로부터 추출하였고 Superscript III cDNA 합성 키트 (Invitrogen)를 이용해 역전사 시켰다. qRT-PCR은 7500 Fast Real-time PCR 시스템 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)에서 공지된 방법으로 수행하였다 (Cho et al., Oncotarget 6, 23837-23844, 2015). 본 발명에 사용된 프라이머는 표 2에 나타내었다. 모든 실험들은 3번 반복했고, 각 타겟 유전자의 CT 값은 제조사가 제공한 소프트웨어를 이용해 계산하였다.
Gene 프라이머 (Forward) 서열번호 프라이머 (Reverse) 서열번호
OCT4 GAGGAGTCCCAGGACATCAA 5 AATAGAACCCCCAGGGTGAG 6
NESTIN CAGGAGAAACAGGGCCTACA 7 TGGGAGCAAAGATCCAAGAC 8
PAX6 gtccatctttgcttgggaaa 9 TAGCCAGGTTGCGAAGAACT 10
LGR5 TGCTCTTCACCAACTGCATC 11 CTCAGGCTCACCAGATCCTC 12
CDX2 CTGGAGCTGGAGAAGGAGTTTC 13 ATTTTAACCTGCCTCTCAGAGAGC 14
VIL AGCCAGATCACTGCTGAGGT 15 TGGACAGGTGTTCCTCCTTC 16
ISX CAGGAAGGAAGGAAGAGCAA 17 TGGGTAGTGGGTAAAGTGGAA 18
LRRK2 GCACAGCTAGGAAGCCTTAAA 19 ATGTCCCAAACGGTCAAGCA 20
SYT1 CGCTACGTACCTACTGCTGG 21 ATGTCTGACCAGTGTCGCAG 22
SYP AGGTCGAGTTCGAGTACCCC 23 TCACATCTGACAGCCCCTTG 24
STX1B CCATGCTCGTAGAGAGCCAG 25 CCGGGCCTTGCTCTGATATT 26
SYN2 AAACTGTGGGTGGACACCTG 27 GGCTGCATTCCTTGGGGTT 28
SYN3 CACAGCAAGGATGGCAGAGA 29 TTCCAGATCTCTGGGGCTGA 30
실험예 9. hPSCs의 신경외배엽 구체로의 분화
신경외배엽 구체는 신경전구세포 (Neural progenitor cells, NPCs)를 포함하는 3차원 신경외배엽 구체 (neuroectodermal sphere, NS)로 분화 유도하였다. 이러한 3차원 신경외배엽 구체는 수정된 공지된 방법을 이용하여 인간 신경외배엽 영역의 형성을 통해 분화시켰다 (Chae et al., Proteomics 9, 1128-1141, 2009; Oh et al., Toxicology and applied pharmacology 299, 8-23, 2016). 구체적으로, EB (embryoid bodies)는 코팅되지 않은 페트리디쉬 위에 feeder-free 배지 mTeSR1에서 hPSCs의 배양으로 발생시켰다. 그 후 결과물인 EB는 DMEM/F12, 1× N2/B27 (Invitrogen), 20 ng/ml bFGF (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), 20 ng/ml EGF (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA) 및 10ng/ml leukemia inhibitory factor (Peprotech)로 구성된 NPC 배지에서 배양시켰다. hNS는 8일마다 McIlwain tissue chopper (Mickle Engineering, Surrey, UK)를 이용해 계대 배양시켰고, 배지는 2일마다 교체시켰다. hNSs는 신경 로젯(neural rosettes)의 파괴없이, 최소 5번은 계대배양 될 수 있다.
실험예 10. hPSCs의 장관 오가노이드로의 분화
인간 장관 오가노이는 수정된 공지된 방법을 이용하여 진정 내배엽(definitive endoderm), 후장 (hindgut)으로의 단계별 분화를 통해 분화시켰다 (Spence JR et al., Nature 2011; 470: 105-9). 구체적으로, hPSCs을 100ng/ml activin A에 3일간 배양하여 진정 내배엽(definitive endoderm)으로 분화시켰으며, 이후, 500 ng/ml FGF4 및 500 ng/ml WNT3A가 첨가된 배지에서 4일간 배양하여 후장 (hindgut)으로 분화하여 후장구 (hindgut spheroid)를 얻었다. 후장구는 matrigel에 embedding하고, 1X B27, 100 ng/ml EGF, 500 ng/ml R-Spondin 1, 100 ng/ml Noggin가 포함된 배지에서 배양하였다. 2주 마다 계대 배양되었고 배지는 2일마다 교체되었다.
실험예 11. 마이크로어레이(Microarray) 분석
마이크로어레이 실험은 제조사의 지침에 따라 Low RNA input linear amplification kit, cRNA cleanup module 및 one-color(Cy3) Whole Human Genome Microarray 4X44K (Agilent Technology, Santa Clara, CA)를 이용해 공지된 방법에 의해 수행하였다 (Son et al., Proteomics 15, 2220-2229, 2015a; Son et al., The Journal of pathology 237, 98-110, 2015b). 유전자 발현 데이터는 GeneSpring 소프트웨어 (Agilent)를 이용하여 처리되었다. 데이터는 전체적인 수준의 표준화과정(global scale normalization)을 통해 표준화 시켰다. 별도로 발현된 유전자는 2 배 이상의 변화에 기초하여 선택하였다. 계층적으로 군집된 히트 맵은 MeV v 4.9.0 소프트웨어를 이용해 만들었다. 유전자의 기능은 GeneCard database를 이용해 주석을 달았다 (http://www.genecards.org). KEGG 분석은 David Bioinformatics Resources를 이용해 진행하였다 (http://david.abcc.ncicrf.gov). 생물학적 과정들과 분자적 기능들은 PANTHER (Protein ANalysis THrough Evolutionary Relationships, http://www.pantherdb.org/)를 이용하여 기재하였다. 기능적으로 그룹지어진 유전자 존재론 (GO)/경로는 Cytoscape 소프트웨어 플랫폼 (version 3.3.0, http://www.cytoscape.org/what_is_cytoscope.html)으로 분석하였다. hNS와 hIO에서 별도로 발현된 유전자 세트는 ReactomeF1 plug-in (Version 5.0.0 beta, http://apps.cytoscape.org/apps/reactomefits)를 이용해 가시화 시켰고, 기능적으로 그룹 지어진 GO/경로 용어 네트워크는 ClueGO (Version 2.2.5, http://apps.cytoscope.org/apps/cluego)에 의해 시각화하였다.
실시예 1. LRRK2 G2019S를 가진 파킨슨병 환자로부터 얻은 게놈 비삽입형 (integration-free) iPSC의 발생
파킨슨병의 LRRK2 변이에 의한 전체적인 흐름도와 방법론을 도 1에 간략히 나타내었다. 구체적으로 본 발명은 하기와 같은 단계들을 포함하고 있다: 1. LRRK2에서 G2019S 변이를 가진 파킨슨병 환자 특이적 iPSCs (LRRK2GS-iPSCs)의 발생; 2. LRRK2GS-iPSCs의 신경전구세포 (NPCs)를 가진 인간 신경외배엽 영역 (hNS)과 인간 장관 오가노이드 (hIO)를 포함하는 3차원 (3D) 질병 관련 세포로의 분화; 3. 게놈의 전사체분석(transcriptomic analysis)을 이용한 LRRK2 변이에 근본적인 분자 네트워크를 확인하기 위한 확인 및 동정.
게놈 비삽입형(non-integrating) oriP/EBNA-1-기반 에피솜(episomal) 벡터를 이용해 LRRK2 G2019S 변이 (LRRK2GS)를 가진 파킨슨병 환자의 표피 섬유아세포로부터 iPSCs을 발생시켰다. LRRK2GS-iPSCs는 핵 대 세포질 비율이 높고 모서리가 뚜렷해서 형태론적으로 미분화된 hESCs와 구분할 수 없고, ALP에 대해 양성 염색시켰다 (도 2A). 전분화능(pluripotency) 마커인 OCT4, NANOG, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-3 및 SSEA-4로 LRRK2GS-iPSCs의 면역염색을 수행하였다 (도 2A). 유세포분석기로 LRRK2GS-iPSCs에서 발현된 TRA-1-60 및 SSEA3을 포함하는 전분화능 표면 마커를 확인했다 (도 2B). DNA 시퀀싱을 통해 ND29492 파킨슨병 섬유아세포가 LRRK2 유전자에 G2019S 변이를 가지고 있음을 확인하였다 (도 2C). 결과물인 iPSCs에서 같은 변이 (LRRK2GS-iPSCs)가 확인되었다. LRRK2GS-iPSCs의 삼배엽의 다양한 세포 타입으로의 분화 가능성이 in vitro EB 형성에서 확인되었다. LRRK2GS-iPSCs은 내배엽 (FOXA2, SOX17), 중배엽 (DESMIN, α-평활근 액틴 (α-SMA)) 및 외배엽의 대표적 파생물로 분화되었다 (도 2D). 이 후, LRRK2GS-iPSCs에 있는 에피솜 벡터의 카피수를 확인하였다. EBNA-1 서열 및 내생적 FBXO12의 위치(endogenous FBXO15 locus)의 특이적인 프라이머를 사용하여 qRT-PCR에 의해 측정된 바와 같이, LRRK2GS-iPSCs는 15번의 계대 후에 전이유전자의 게놈 삽입이 없음을 확인하였다 (도 2E).
이 결과, LRRK2GS-iPSCs는 에피솜 벡터가 완전히 없다는 것과 에피솜 벡터-매개된 리프로그래밍은 게놈이 어떠한 탐지 가능한 변화로 이어지지 않는다는 것을 나타낸다. 또한, STR 분석은 LRRK2GS-iPSCs가 파킨슨병 섬유아세포로부터 유래되었다는 것을 보여주며 리프로그래밍이나 iPSC를 유지하는 동안에 오염이 일어나지 않았다는 것을 나타낸다 (도 2F).
이를 통해, LRRK2 G2019S변이를 가진 파킨슨병 섬유아세포의 게놈비삽입형 LRRK2GS-iPSCs로의 성공적인 리프로그래밍이 되었음을 알 수 있었다.
실시예 2. LRRK2 GS - iPSCs의 hNS와 hIO로의 분화
파킨슨병 관련 표현형을 보여주기 위해 LRRK2GS-iPSCs가 hNS를 포함하는 신경전구세포(neural progenitor cells, NPCs)로 분화되도록 하였다. 신경전구세포 (NPCs)는 뉴런, 희소돌기신경교세포 및 성상교세포를 포함하는 신경세포의 주류로 발생할 수 있는 가능성을 가지고 있다 (Wilson et al., Stem Cell Rev 2, 67-77, 2006). LRRK2 변이를 가지지 않은 NPCs는 대조군 hESCs와 WT-iPSC 모두에서 얻을 수 있고 LRRK2GS-iPSCs는 일반적인 분화조건의 현탁 배양에서 hNS의 형성에 의해 얻을 수 있다 (Reubinoff et al., Nature biotechnology 19, 1134-1140, 2001) (도 3A 및 도 3B). hNSs는 부착되고 신경의 튜브형태 구조를 가진 신경로젯 (neural rosettes) 을 형성한 뒤, NPC 마커 PAX6와 신경로젯 마커 ZO-1 및 PLZF를 위해 면역염색 되었다 (도 3B). qRT-PCR 분석을 통해 hPSC 유래 WT-hNS 및 LRRK2GS-hNS 에서 NESTIN 및 PAX6와 같은 신경 줄기/전구체 마커의 높은 발현을 확인하였다 (도 3C).
LRRK2GS변이가 장내 조직의 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는지 확인하기 위해, 공지된 방법(Spence et al., Nature 470, 105-109, 2011)인 3D hIO(human intestinal organoids) 시스템을 이용하여 hPSC로부터 장 상피세포를 얻었다 (도 3D). 또한, hIOs는 대조군 hESCs와 WT-iPSC 및 LRRK2GS-iPSCs로부터 발생된다. Matrigel에서의 배양 4주 후 (계대 2), hIOs는 중앙의 빈 내강과 지하실 같은 구조로 이루어진 스페로이드 구조를 형성하였다 (도 3E). hIOs에서 hIO를 구성하는 모든 장 상피세포 타입을 보여주기 위한 마커 특이적 항체와 함께 장내 전사 인자인 SOX9, KLF5와 장 세포 마커인 VIL (장세포를 위한 Villin 1), MUC2 (배상 세포를 위한 mcin 2), LYZ (파네스 세포를 위한 lysozyme) 및 CHGA (장 내분비 세포를 위한 chromogranin A)의 발현 및 로컬리제이션(localization)을 측정하였다 (도 3E).
qRT-PCR 분석을 통해 모든 hIOs에서 LGR5 (장 줄기세포 마커), CDX2 (장의 표현형 마커), VIL 및 ISX (장세포 마커)와 같은 몇몇의 mRNA가 유의적이고 높은 수준으로 포함되어 있다는 것을 확인하였다 (도 3F).
이 시스템에서 LRRK2의 발현을 확인하기 위해, hNS를 함유하는 NPC와 hIO를 함유하는 hPSCs로부터 얻은 다양한 장 상피세포를 이용하여 qRT-PCR 분석을 수행하였다. 미분화된 hPSCs에서 LRRK2의 기본 발현은 낮았지만 hNS와 hIO로의 분화 유도 후 LRRK2의 발현은 증가함을 확인하였다 (도 9). 또한, LRRK2의 발현은 LRRK2GS-hIO가 WT-hIO보다 높았으나 WT-hNS와 LRRK2GS-hNS의 발현 수준은 모두 비슷함을 확인하였다(p<0.05).
이를 통해, LRRK2GS-iPSCs가 LRRK2GS-hNS 및 LRRK2GS-hIO로 성공적으로 분화 되었음을 알 수 있었다.
실시예 3. WT와 LRRK2 GS - iPSCs로부터 얻은 hNS와 hIO의 비교를 통한 유전자 발현 프로파일링
LRRK2GS변이에 의해 발현이 영향을 받는 유전자를 확인하기 위해, WT와 LRRK2GS-iPSCs로부터 얻은 hNS 및 hIO를 이용하여 마이크로어레이 분석을 수행하였다. 차별적으로 발현된 유전자 (DEGs)를 선택하기 위해 대조군 (hESC- 와 WT-iPSC 유래 세포)과 LRRK2GS-iPSC 유래 세포 사이에 2.0의 폴드-체인지 역치값을 적용했다. 그에 따라 LRRK2변이를 가진 hNS에서 10,920개의 유전자들이 상향조절 되었고 8,376개의 유전자들이 하향조절 되었다 (도 4A, 왼쪽 패널). 더욱이, hNS보다 더 많은 상향조절 (13,353개 유전자) 및 하향조절 (16,181개 유전자)된 유전자들이 LRRK2 변이를 가진 hIO에서 발견되었다 (도 4A, 오른쪽 패널).
히트맵 분석(Heatmap analysis)은 미분화된 hPSC와 분화된 hNS 또는 hIO에서 DEGs와 같이 수행되었고, 이는 대조군과 LRRK2GS사이의 달라진 발현 패턴의 부분적 분리를 나타내었다 (도 4B). 신경 및 장 세포는 파킨슨병 환자에서 영향을 많이 받기 때문에, 분화된 hNS 및 hIO에서 예측되었던 미분화된 hPSCs보다 대조군 세포들과 동등하게 비교했을 때 더욱 유의적인 유전자 발현 차이가 나타남을 확인하였다 (도 4B). 더욱이 유전자 발현 차이는 hIO가 hNS보다 더 높았다. 또한, 주요성분분석 (PCA)에서도 대조군에서 높은 동질성을 가진 각 PSC로부터 유래된 hNS 및 hIO 모두에서 대조군과 LRRK2GS는 뚜렷하게 분리되었다는 것이 확인되었다 (도 4C).
이를 통해, 변화된 유전자의 발현 프로필은 신경 및 장 세포에 있는 LRRK2GS변이에 의해 나타난다는 것을 시사한다.
실시예 4. 유전자 온톨로지 (GO)와 LRRK2 GS - iPSC 유래 hNS 및 hIO에서의 경로강화분석
LRRK2GS변이와 연관된 분자 메카니즘과 신호전달 네트워크를 분석하기 위해, hNS 및 hIO에서 LRRK2GS변이에 의해 유도된 세포 타입 특이적 전사체 변화를 분석했다. 마이크로어레이에 의해 확인된 DEGs를 분류하기 위해 상향 또는 하향 조절된 유전자들은 온톨로지(ontology) 분석 및 PANTHER 분류 시스템을 이용해 그들의 생물학적 과정, 분자적 기능, 단백질 종류에 따라 분류되었다(도 10).
이 결과, hNS 및 hIO에서 50% 이상의 DEGs가 물질대사 과정, 세포과정, 생물학적 조절에 연관되어 있음을 알 수 있었다.
LRRK2GS변이에 의한 DEGs의 기능들의 더욱 종합적인 이해를 얻기 위해, 주석의 불필요한 중복을 줄여 기능적으로 연결된 그룹들을 보여주는 DAVID 기능적 주석 클러스터링을 이용하여 GO 용어 강화 분석을 진행하였다 (Huang da et al., Nature protocols 4, 44-57, 2009; Son et al., Proteomics 15, 2220-2229, 2015a). 통계적 기준에 기초하여 볼때, 전사의 조절, 금속 결합, 스페락트/스캐빈저 수용체(speract/scavenger receptor), 칼모둘린 결합(calmodulin binding), 아릴설파타제 활성(arylsulfatase activity), 세포사멸에 대한 조절, 신경발생의 음성조절과 관련이 있는 7개의 유의적인 주석 집단이 hNS에서 확인되었다 (p<0.05, 최소 1.2의 강화점수) (도 5A). PANTHER를 이용한 경로 분석은 전사 조절, 생물학적 시계 시스템(circadian clock system), 세포 주기, 시냅스 소포(synaptic vesicle (SV)) 수송, Toll 수용체 신호전달체계 TGF-베타 신호전달체계, 축색 유도와 같은 여러 경로와 LRRK2 변이가 유의적으로 연관되어있다는 것을 보여주었다 (p<0.1) (도 6A). Cytoscape의 플러그인인 ClueGO를 이용한 생물학적 과정 분류 속의 GO 용어에 해당하는 네트워크 기반 분석은 시냅스 전달의 조절 (31%), Toll 유사 수용체의 신호전달체계 (16%), 신경전달물질 수준의 조절 (10%), 혈액순환의 조절 (9%), 시토카인의 분비 (8%), Wnt 신호전달체계 (8%)를 보여주었다.
또한, hIO에서 세포 접합, 뉴런 분화, EGF, 세포 연결 (시냅스), 분비, 신경 자극의 전송 (시냅스 전송), 및 세포이동을 포함하는 유전적으로 유의적인 주석 집단을 엄격한 통계적 표준에 근거하여 확인하였다 (p<0.02, 최소 2 이상의 강화점수) (도 5B). 경로분석을 통해 LRRK2GS변이가 hIO의 축색 유도, G-protein 신호전달체계, 카데린 신호전달체계, B-cell 활성화, SV 수송, 이온성 글루탐산 수용체 경로에 기여하는 많은 신호전달체계에 영향을 주는 것을 알 수 있었다 (p<0.05) (도 6B). 가장 기능적인 주석 집단의 DEG 중에, Clue GO를 이용한 네트워크기반 분석에 의해 확인된 유전자는 소포매개성 운반의 조절 (20%), 시냅스 전송 (15%), 개발과정의 양성조절 (13%), 시냅스 신호전달 (11%)과 연관이 있었다 (도 7B).
실시예 5. LRRK2 GS -hNS 및 LRRK2 GS - hIO에서 파킨슨병 연관 경로를 위한 DEGs의 동정
경로 및 생물학적 과정 강화 분석에서 LRRK2GS변이에 의해 가장 흔하게 영향받는 경로는 시냅스 수송, 특히 시냅스 소포 수송이라는 것을 확인하였다 (도 6 및 도 7). 또한, 마이크로어레이 데이터에서 조절장애를 가장 많이 가진 유전자들의 발현은 LRRK2GS-hNS 및 LRRK2GS-hIO에서 상향조절된 RAB3A (Ras-related protein Rab-3A), SYT1 (Synaptotagmin-1), SYP (Synaptophysin), STX1B (Syntaxin-1B), SYN2 (Synapsin-2) 및 SYN3 (Synapsin-3) 유전자가 시냅스 소포 수송에 참여한다는 것을 확인하였다 (도 8A). 따라서, 상기 6개의 DEGs는 마이크로어레이를 통한 발현변화를 확인하기 위해 선택되었다. 또한, LRRK2GS-hNS 및 LRRK2GS-hIO에서 상향조절된 BMP7 (Bone morphogenetic protein 7, PTCH1 (Protein patched homolog 1), WNT7B (Protein Wnt-7b), GAS1 (Growth arrest-specific protein 1), WNT3 (Proto-oncogene protein Wnt-3), WNT5B (Protein Wnt-5b) 및 WNT7A (Protein Wnt-7a) 유전자가 헤치호그 신호 전달 (Hedgehog signaling pathway)에 참여한다는 것을 확인하였다 (도 11).
이 결과, qRT-PCR분석을 통해 시냅스 소포 수송 및 헤치호그 신호 전달의 선택된 요소의 발현수준은 LRRK2GS-hNS 및 LRRK2GS-hIO 모두에서 마이크로어레이를 통해 관찰된 것처럼 비슷한 정도로 변화되었다는 것을 알 수 있었다(도 8B, 도 11).
이와 같은 결과들은 본 발명의 3차원 장관 오가노이드 및 3차원 신경외배엽 구체를 포함하는 유사 모델이 완벽히 LRRK2 변이에 의한 파킨슨병 환자의 유전적 환경 및 생리형태학적 환경을 모사하는 것을 시사하는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> A method for preparing the Parkinson's disease model comprising 3D intestinal organoid and 3D neuro ectodermal sphere, and use thereof <130> KPA161248-KR <160> 30 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 7584 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggctagtg gcagctgtca ggggtgcgaa gaggacgagg aaactctgaa gaagttgata 60 gtcaggctga acaatgtcca ggaaggaaaa cagatagaaa cgctggtcca aatcctggag 120 gatctgctgg tgttcacgta ctccgagcac gcctccaagt tatttcaagg caaaaatatc 180 catgtgcctc tgttgatcgt cttggactcc tatatgagag tcgcgagtgt gcagcaggtg 240 ggttggtcac ttctgtgcaa attaatagaa gtctgtccag gtacaatgca aagcttaatg 300 ggaccccagg atgttggaaa tgattgggaa gtccttggtg ttcaccaatt gattcttaaa 360 atgctaacag ttcataatgc cagtgtaaac ttgtcagtga ttggactgaa gaccttagat 420 ctcctcctaa cttcaggtaa aatcaccttg ctgatattgg atgaagaaag tgatattttc 480 atgttaattt ttgatgccat gcactcattt ccagccaatg atgaagtcca gaaacttgga 540 tgcaaagctt tacatgtgct gtttgagaga gtctcagagg agcaactgac 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Ser Pro Val Val Glu Val Trp Asp Lys Lys Thr Glu Lys Leu Cys 2370 2375 2380 Gly Leu Ile Asp Cys Val His Phe Leu Arg Glu Val Met Val Lys Glu 2385 2390 2395 2400 Asn Lys Glu Ser Lys His Lys Met Ser Tyr Ser Gly Arg Val Lys Thr 2405 2410 2415 Leu Cys Leu Gln Lys Asn Thr Ala Leu Trp Ile Gly Thr Gly Gly Gly 2420 2425 2430 His Ile Leu Leu Leu Asp Leu Ser Thr Arg Arg Leu Ile Arg Val Ile 2435 2440 2445 Tyr Asn Phe Cys Asn Ser Val Arg Val Met Met Thr Ala Gln Leu Gly 2450 2455 2460 Ser Leu Lys Asn Val Met Leu Val Leu Gly Tyr Asn Arg Lys Asn Thr 2465 2470 2475 2480 Glu Gly Thr Gln Lys Gln Lys Glu Ile Gln Ser Cys Leu Thr Val Trp 2485 2490 2495 Asp Ile Asn Leu Pro His Glu Val Gln Asn Leu Glu Lys His Ile Glu 2500 2505 2510 Val Arg Lys Glu Leu Ala Glu Lys Met Arg Arg Thr Ser Val Glu 2515 2520 2525 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for LRRK2 <400> 3 ctttaaggga caaagtgagc acaga 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for LRRK2 <400> 4 ctcacaagtg ccaacaatac ctaga 25 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for OCT4 <400> 5 gaggagtccc aggacatcaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for OCT4 <400> 6 aatagaaccc ccagggtgag 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for NESTIN <400> 7 caggagaaac agggcctaca 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for NESTIN <400> 8 tgggagcaaa gatccaagac 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for PAX6 <400> 9 gtccatcttt gcttgggaaa 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for PAX6 <400> 10 tagccaggtt gcgaagaact 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for LGR5 <400> 11 tgctcttcac caactgcatc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for LGR5 <400> 12 ctcaggctca ccagatcctc 20 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CDX2 <400> 13 ctggagctgg agaaggagtt tc 22 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CDX2 <400> 14 attttaacct gcctctcaga gagc 24 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for VIL <400> 15 agccagatca ctgctgaggt 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for VIL <400> 16 tggacaggtg ttcctccttc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for ISX <400> 17 caggaaggaa ggaagagcaa 20 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for ISX <400> 18 tgggtagtgg gtaaagtgga a 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for LRRK2 <400> 19 gcacagctag gaagccttaa a 21 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for 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<400> 28 ggctgcattc cttggggtt 19 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SYN3 <400> 29 cacagcaagg atggcagaga 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for SYN3 <400> 30 ttccagatct ctggggctga 20

Claims (9)

  1. (a) LRRK2 (leucine-rich repeat kinase 2) 유전자 변이에 의한 파킨슨병 환자 유래의 분리된 섬유아세포로부터 리프로그래밍된 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell; iPSC)를 3차원 장관 오가노이드 (3D intestinal organid, IO) 및 3차원 신경외배엽 구체 (3D neuro ectodermal sphere, NS)로 분화시키는 단계로서,
    activin A, FGF4 (fibroblast growth factor 4) 또는 WNT3A를 포함하는 배지에서 배양하여 장관 오가노이드로 분화시키고,
    N2, B27, bFGF (basic fibroblast growth factor), EGF (epidermal growth factor) 또는 LIF (leukemia inhibitory factor)를 포함하는 배지에서 배양하여 신경외배엽 구체로 분화시키는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계에서 제조된 3차원 장관 오가노이드 및 3차원 신경외배엽 구체를 LRRK2 변이에 의한 파킨슨병의 다장기 모사 모델로 구축하는 단계; 를 포함하는, LRRK2 변이에 의한 파킨슨병의 생체 외 다장기 (multiple organ) 모사 모델의 제조 방법으로서,
    상기 장관 오가노이드가 하기 (i) 또는 (ii) 중 어느 하나 이상을 특징으로 하고,
    i) RAB3A (Ras-related protein Rab-3A), SYT1 (Synaptotagmin-1), STX1B (Syntaxin-1B), SYN2 (Synapsin-2) 및 SYN3 (Synapsin-3)로 이루어진 시냅스 소포 수송 (Synaptic vesicle trafficking) 관련 유전자 중 하나 이상의 발현 증가; 및
    ii) BMP7 (Bone morphogenetic protein 7), PTCH1 (Protein patched homolog 1), WNT7B (Protein Wnt-7b), WNT3 (Proto-oncogene protein Wnt-3) 및 WNT7A (Protein Wnt-7a)로 이루어진 헤치호그 신호 전달 (Hedgehog signaling pathway) 관련 유전자 중 하나 이상의 발현 증가;
    상기 신경외배엽 구체가 하기 (iii) 또는 (iv) 중 어느 하나 이상을 특징으로 하는 방법:
    iii) RAB3A (Ras-related protein Rab-3A), SYT1 (Synaptotagmin-1), STX1B (Syntaxin-1B), SYN2 (Synapsin-2) 및 SYN3 (Synapsin-3)로 이루어진 시냅스 소포 수송 (Synaptic vesicle trafficking) 관련 유전자 중 하나 이상의 발현 증가; 및
    iv) PTCH1 (Protein patched homolog 1), WNT7B (Protein Wnt-7b) 및 WNT7A (Protein Wnt-7a)로 이루어진 헤치호그 신호 전달 (Hedgehog signaling pathway) 관련 유전자 중 하나 이상의 발현 증가.
  2. 제1항에 있어서, 상기 분리된 섬유아세포는 하기 특징 중 어느 하나를 포함하는 방법:
    i) LRRK2 유전자의 G6055A 변이; 및
    ii) LRRK2 단백질의 G2019S 변이.
  3. 제1항에 있어서, 상기 3차원 장관 오가노이드 및 3차원 신경외배엽 구체는 유전적 배경이 동일한 환자의 섬유아세포로부터 분화된 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 3차원 장관 오가노이드 및 3차원 신경외배엽 구체는 동일 환자의 섬유아세포로부터 분화되어, 환자 맞춤형 모델인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 LRRK2 변이에 의한 파킨슨병의 생체 외 다장기 모사 모델은, 파킨슨병의 운동 증상 (motor symptom) 및 비운동 증상 (non-motor symptom)을 동시에 분석할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 삭제
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된, LRRK2 변이에 의한 파킨슨병의 생체 외 다장기 (multiple organ) 모사 모델.
  8. (a) LRRK2 (leucine-rich repeat kinase 2) 유전자 변이에 의한 파킨슨병 환자 유래의 분리된 섬유아세포로부터 리프로그래밍된 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell; iPSC)를 3차원 장관 오가노이드 (3D intestinal organid, IO) 및 3차원 신경외배엽 구체 (3D neuro ectodermal sphere, NS)로 분화시키는 단계로서,
    activin A, FGF4 (fibroblast growth factor 4) 또는 WNT3A를 포함하는 배지에서 배양하여 장관 오가노이드로 분화시키고,
    N2, B27, bFGF (basic fibroblast growth factor), EGF (epidermal growth factor) 또는 LIF (leukemia inhibitory factor)를 포함하는 배지에서 배양하여 신경외배엽 구체로 분화시키는 단계; 및
    (b) 상기 분화된 3차원 장관 오가노이드 (3D intestinal organid, IO)가 하기 (i) 또는 (ii) 중 어느 하나 이상의 유전적 특징을 갖고 있는지 및 상기 분화된 3차원 신경외배엽 구체 (3D neuro ectodermal sphere, NS)가 하기 (iii) 또는 (iv) 중 어느 하나 이상의 유전적 특징을 갖고 있는지 확인하는 단계를 포함하는, 분화 역가를 판단하는 방법:
    i) RAB3A (Ras-related protein Rab-3A), SYT1 (Synaptotagmin-1), STX1B (Syntaxin-1B), SYN2 (Synapsin-2) 및 SYN3 (Synapsin-3)로 이루어진 시냅스 소포 수송 (Synaptic vesicle trafficking) 관련 유전자 중 하나 이상의 발현 증가; 및
    ii) BMP7 (Bone morphogenetic protein 7), PTCH1 (Protein patched homolog 1), WNT7B (Protein Wnt-7b), WNT3 (Proto-oncogene protein Wnt-3) 및 WNT7A (Protein Wnt-7a)로 이루어진 헤치호그 신호 전달 (Hedgehog signaling pathway) 관련 유전자 중 하나 이상의 발현 증가;
    iii) RAB3A (Ras-related protein Rab-3A), SYT1 (Synaptotagmin-1), STX1B (Syntaxin-1B), SYN2 (Synapsin-2) 및 SYN3 (Synapsin-3)로 이루어진 시냅스 소포 수송 (Synaptic vesicle trafficking) 관련 유전자 중 하나 이상의 발현 증가; 및
    iv) PTCH1 (Protein patched homolog 1), WNT7B (Protein Wnt-7b) 및 WNT7A (Protein Wnt-7a)로 이루어진 헤치호그 신호 전달 (Hedgehog signaling pathway) 관련 유전자 중 하나 이상의 발현 증가.
  9. (a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된, LRRK2 변이에 의한파키슨병의 생체 외 다장기 (multiple organ) 모사 모델에 LRRK2 변이에 의한 파킨슨병의 치료 후보 물질을 처리하는 단계; 및
    (b) 상기 후보 물질이 처리된 LRRK2 변이에 의한 파킨슨병의 생체 외 다장기 모사 모델의 3차원 장관 오가노이드 및 3차원 신경외배엽 구체의 유전적 변이를, 상기 파킨슨병의 치료 후보 물질이 처리되지 않은 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, LRRK2 변이에 의한 파킨슨병의 치료제 스크리닝 방법.
KR1020160152257A 2016-11-15 2016-11-15 3차원 장관 오가노이드 및 3차원 신경외배엽 구체를 포함하는 다장기 파킨슨병 모델 및 이의 용도 KR102087294B1 (ko)

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