KR102083501B1 - 종양 치료를 위한 표적 유전자 판별 방법 - Google Patents

종양 치료를 위한 표적 유전자 판별 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명에 따른 종양 치료를 위한 표적 유전자 판별 방법은, 환자의 종양에서 복수 개의 샘플을 채취하는 단계; 상기 복수 개의 샘플의 유전 변이를 분석하는 단계; 상기 복수 개의 샘플에 대해 약물 스크리닝을 수행하여 상기 각 샘플의 약물 민감도(drug sensitivity)를 측정하는 단계; 상기 유전 변이 분석 결과와 상기 약물 민감도 측정 결과를 이용하여, 상기 종양의 이질성(heterogeneity)을 분석하는 단계; 및 상기 종양의 이질성 분석 결과를 이용하여, 상기 종양의 표적 유전자를 판별하는 단계;를 포함한다.

Description

종양 치료를 위한 표적 유전자 판별 방법{Method of identifying target gene for tumor-therapy}
본 발명은 종양 치료를 위한 표적 유전자를 판별하는 방법, 더욱 상세하게는 복수 개의 종양 샘플을 채취하여 유전자 변이 분석 및 약물 스크리닝을 통해 종양의 조상 변이(ancestral mutation)를 찾아내어 표적 유전자를 판별하는 방법에 관한 것이다.
종양(tumor)은 세포의 유전적 변이에 의해 비정상적으로 자라는 세포 덩어리를 의미한다. 이때 초기의 종양 발생을 일으키는 조상 돌연변이(ancestral genetic alteration)를 시작으로 다양한 곁가지 돌연변이(secondary genetic alteration)가 발생하여, 종양은 세포에 따라 다양한 유전자 변이를 가질 수 있다. 이에 따라, 이러한 종양을 치료하기 위해 어떠한 유전자를 타겟(target)으로 해야 하는지를 결정하기가 어려워진다.
예를 들어 환자에 제1종양, 제2종양이 발생하였을 때, 제1종양을 치료하기 위한 약물이 제1종양에서만 발생한 유전자 변이를 타게팅(targeting)하는 것이라면, 이러한 약물은 제2종양에 효과가 없을 수도 있고, 심지어는 제2종양을 키우게 될 수도 있다. 따라서, 어떠한 유전자 변이가 조상 드라이버(ancestral driver) 변이인지를 알아내는 것이 중요하다.
최근에는 종양 세포의 다양성을 의미하는 종양 내 이질성(intratumor heterogeneity)을 분석하는 방법이 나타나고 있다. 예컨대 Marco Gerlinger. et al.의 선행문헌 2를 참조하면, 종양의 여러 부위에서 세포를 추출한 뒤 유전 정보를 획득하여, 세포마다 공통적으로 가지고 있는(ubiquitous) 돌연변이에서 세포 각각마다 가지고 있는 고유한(private) 돌연변이를 분석하여, 종양의 계통 관계(phylogenetic relationships)를 분석하는 방법이 개시되어 있다.
미국 공개특허 제2015-0227687호에도 비슷하게, 유전 정보를 이용하여 종양 내 이질성을 결정하는 시스템 및 방법이 개시되어 있다.
선행문헌 1: 미국 공개특허 제2015-0227687호 (2015.08.13.)
선행문헌 2: Marco Gerlinger et al., Intratumor Heterogeneity and Branched Evolution Revealed by Multiregion Sequencing, N Engl J Med 366. No. 10 (2012). 선행문헌 3: Verhaak, R. G. et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell 17, 98-110, doi:10.1016/j.ccr.2009.12.020 (2010).
그러나 상기와 같은 방법은, 단순히 종양 내 이질성 또는 종양의 계통 관계를 분석한 것이어서, 실제 최적의 치료 효과를 나타내는 표적 유전자를 발굴하는 방법을 제시하지는 못하고 있다. 또한, 유전자 변이 분석은 어느 정도의 부정확성을 가지고 있어, 항상 완벽하게 종양 내 이질성을 분석할 수 있는 것은 아니다. 즉 기존 방법의 경우 유전자 변이 분석이 맞는지를 검증할 수 있는 다른 방법이 없다는 문제점이 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로써, 유전자 변이 분석과 더불어 약물 스크리닝을 통해 상호 보완적으로 종양 치료를 위한 타겟 유전자를 판별함으로써 최적의 치료 방법을 제시하는 표적 유전자 판별 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나, 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 종양 치료를 위한 표적 유전자 판별 방법은, 환자의 종양에서 복수 개의 샘플을 채취하는 단계; 상기 복수 개의 샘플의 유전 변이를 분석하는 단계; 상기 복수 개의 샘플에 대해 약물 스크리닝을 수행하여 상기 각 샘플의 약물 민감도(drug sensitivity)를 측정하는 단계; 상기 유전 변이 분석 결과와 상기 약물 민감도 측정 결과를 이용하여, 상기 종양의 종양 내 이질성(intratumor heterogeneity)을 분석하는 단계; 및 상기 종양 내 이질성 분석 결과를 이용하여, 상기 종양의 표적 유전자를 판별하는 단계;를 포함한다.
상기 복수 개의 샘플을 채취하는 단계는, 상기 환자의 종양의 각기 다른 부위에서 샘플을 채취하는 단계일 수 있다.
상기 복수 개의 샘플을 채취하는 단계는, 서로 다른 시간에 발생한 상기 환자의 종양에서 각각 샘플을 채취하는 단계일 수 있다.
상기 복수 개의 샘플의 유전 변이를 분석하는 단계는, 대용량 염기서열 분석법(Next-generation sequencing, NGS)을 통해 수행될 수 있다.
상기 약물 민감도를 측정하는 단계에서 사용되는 약물은 항암제(anticancer agent)일 수 있다.
상기 복수 개의 샘플에 대해 약물 스크리닝을 수행하여 상기 각 샘플의 약물 민감도를 측정하는 단계는, 상기 각 약물의 농도에 따른 상기 각 샘플의 세포 생존율 그래프를 얻는 단계; 및 상기 그래프의 아래 면적을 구하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 종양의 표적 유전자를 판별하는 단계는, 상기 각 샘플에 대한 상기 약물 민감도의 분산(variance) 및 평균을 측정하는 단계; 및 상기 분산이 기정된(predetermined) 값보다 작은 약물 중, 상기 약물 민감도의 상기 평균이 가장 높은 약물을 선정하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 종양 내 이질성을 분석하는 단계는, 상기 유전 변이 분석 결과를 통해 상기 종양 내 이질성을 분석하는 단계; 및 상기 약물 민감도 측정 결과를 이용하여 상기 종양 내 이질성 분석 결과를 검증하는 단계;를 포함할 수 있다.
전술한 것 외의 다른 측면, 특징, 이점이 이하의 도면, 특허청구범위 및 발명의 상세한 설명으로부터 명확해질 것이다.
본 발명에 따르면, 복수 개의 샘플을 이용한 종양의 유전 변이 분석 및 약물 스크리닝을 통한 약물 민감도 측정이 서로 상호보완적으로 사용되어, 기존의 방법보다 더욱 높은 정확도로 조상 드라이버 변이(ancestral driver mutation)가 어떤 것인지를 확인할 수 있다. 따라서 더욱 신뢰성 있는 종양 치료를 위한 타겟 유전자 판별 방법을 제공할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명에 따른 종양 치료를 위한 표적 유전자 판별 방법을 개략적으로 나타낸 순서도이다.
도 2는 복수 개의 샘플을 채취하는 여러 가지 방법을 나타낸 그림이다.
도 3은 단일 세포 분석법(single cell anaylsis)에 따라 GBM9 환자의 유전자 변이를 분석한 결과를 나타낸 실험예이고, 도 4는 상기 결과를 바탕으로 GBM9 환자 종양의 종양 내 이질성(intratumor heterogeneity)을 표현한 위상(topological) 그래프이다.
도 5는 군집 세포 분석법(bulk cell analysis)에 따라 GBM9 환자의 유전자 변이를 분석한 결과를 나타낸 실험예이다.
도 6은 GBM9 환자에 대한 3가지의 약물의 농도에 따른 샘플 종양 세포의 생존율을 나타낸 실험그래프이다. 도 7은 GBM9 환자에 대한 40가지의 약물의 농도에 따른 좌, 우측 종양 세포의 약물 민감도를 나타낸 실험그래프이다.
도 8은 GBM9 환자의 종양 내 이질성 분석 결과를 바탕으로 그린 종양의 계통도(phylogeny)이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 설명하고자 한다. 본 발명의 효과 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 다양한 형태로 구현될 수 있다.
용어 '돌연변이' 또는 '변이'는 유전정보가 기록된 DNA가 여러 가지 요인에 의하여 원본과 달라진 상태를 의미하며, 점 돌연변이(point mutation), 삽입(insertion), 결실(deletion) 등 뉴클레오티드 수준에서 일어나는 돌연변이뿐만 아니라 유전자 중복(gene duplication), 유전자 결실(gene deletion), 염색체 역위(chromosomal inversion) 등 유전자 수준에서 일어나는 모든 종류의 돌연변이를 포함할 수 있다.
이하의 실시예에서, 제1, 제2 등의 용어는 한정적인 의미가 아니라 하나의 구성 요소를 다른 구성 요소와 구별하는 목적으로 사용된다.
이하의 실시예에서, 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.
이하의 실시예에서, 포함하다 또는 가지다 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 또는 구성요소가 존재함을 의미하는 것이고, 하나 이상의 다른 특징들 또는 구성요소가 부가될 가능성을 미리 배제하는 것은 아니다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 상세히 설명하기로 하며, 도면을 참조하여 설명할 때 같거나 대응하는 구성 요소는 같은 도면부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다.
도 1은 본 발명에 따른 종양 치료를 위한 표적 유전자 판별 방법을 개략적으로 나타낸 순서도이다.
본 발명에 따른 종양 치료를 위한 표적 유전자 판별 방법은, 환자의 종양에서 복수 개의 샘플을 채취하는 단계(S10); 복수 개의 샘플의 유전 변이를 분석하는 단계(S20); 복수 개의 샘플에 대해 약물 스크리닝을 수행하여 각 샘플의 약물 민감도(drug sensitivity)를 측정하는 단계(S30); 유전 변이 분석 결과와 약물 민감도 측정 결과를 이용하여, 종양 내 이질성(intratumor heterogeneity)을 분석하는 단계(S40); 및 종양 내 이질성 분석 결과를 이용하여, 종양의 표적 유전자를 판별하는 단계(S50);를 포함한다.
도 1을 참조하면, 환자의 종양에서 복수 개의 샘플을 채취하는 단계(S10)가 수행된다. 본 발명에서 종양(tumor)은 세포의 유전적 변이에 의해 비정상적으로 자라는 세포 덩어리를 의미한다.
도 2는 복수 개의 샘플을 채취하는 여러 가지 방법을 나타낸 그림이다.
일 실시예에 따르면, 복수 개의 샘플을 채취하는 단계는, 환자의 종양의 각기 다른 부위에서 샘플을 채취하는 단계일 수 있다.
도 2의 (a)를 참조하면, 예컨대 뇌(B)의 일정 부위에 종양(T)이 발생한 경우, 여러 개의 샘플 채취 점(sample acquisition point, SAP)에서 종양(T)의 샘플을 채취할 수 있다. 도 2의 (a)에서는 예컨대 3개의 샘플 채취 점(SAP1, SAP2, SAP3)으로부터 각각 샘플을 채취한다.
한편, 도 2의 (b)를 참조하면, 뇌에 여러 개의 종양 병변(tumor lesion, TL)이 발생한 경우, 각각의 종양 병변에서 종양의 샘플을 채취할 수 있다. 도 2의 (b)에서는 예컨대 3개의 종양 병변(TL1, TL2, TL3)이 발생하고, 각 병변의 샘플 채취 점(SAP1, SAP2, SAP3)에서 각 샘플을 채취한다.
즉 도 2의 (a) 및 (b)와 같이, 공간적으로 서로 다른 곳에서 여러 개의 샘플을 채취하는 것이 가능하다.
일 실시예에 따르면, 복수 개의 샘플을 채취하는 단계는, 서로 다른 시간에 발생한 환자의 종양에서 각각 샘플을 채취하는 단계일 수 있다. 즉 시간적으로 서로 다른 때에 여러 개의 샘플을 채취하는 것이 가능하다. 예컨대 1차적으로 종양이 발생하여 종양 제거 수술을 제거한 후, 시간이 더 지나 종양이 재발하는 경우가 있을 수 있다. 이때 제1시각(t1)에 발생한 종양 T(t1)과 제2시각(t2)에 발생한 종양 T(t2)는, 도 2의 (c)와 같이 같은 부위에서 발생할 수도 있고 도 2의 (d)와 같이 다른 부위에서 발생할 수도 있다. 어느 경우든, 각 종양 T(t1), T(t2)의 샘플 채취 점(SAP1, SAP2)에서 각각 샘플을 채취할 수 있다.
이러한 도 2의 (a), (b), (c), (d)의 샘플 채취 방식은 복합적으로 이루어질 수도 있다. 예를 들어 도 4를 참조하면, 본 발명의 실험예로 사용된 교모세포종(glioblastoma) 9번째 환자(GBM9)의 종양 MRI 사진이 나타나 있다. 이 환자의 경우 우측 및 좌측 전두엽에 각각 하나의 종양(GBM9-1, GBM9-2)이 발생하였고, 화학 방사선 요법(CCRT) 및 EGFR 표적 치료 이후 좌측 전두엽에 종양이 재발(GBM9-R1, GBM9-R2)하였다. 이때 공간적, 시간적으로 다른 곳에서 발생한 종양(GBM9-1, GBM9-2, GBM9-R1, GBM9-R2)에서 각각 샘플을 채취하여 복수 개의 샘플을 확보하였다.
종양으로부터 복수 개의 샘플을 채취하는 이유는 유전 변이 분석과 약물 민감도 검사 결과를 모두 이용하여 종양 내 이질성(intratumor heterogeneity)을 분석하기 위함인데, 이에 대하여는 후술한다.
다시 도 1을 참조하면, 복수 개의 샘플의 유전 변이를 분석하는 단계(S20)가 수행된다. 유전 변이를 분석하는 단계는, 샘플 세포의 유전자의 염기 서열을 분석하는 단계를 포함한다.
일 실시예에 따르면, 염기 서열 분석은 예컨대 대용량 염기서열 분석법(Next-generation sequencing, NGS)을 통해 수행될 수 있다. 한편, 염기 서열 분석은 엑솜 시퀀싱(Whole exome sequencing, WES)을 통해 수행될 수 있다. 단백질을 코딩하고 있는 부분인 엑솜(Exome)은 전체 인간 유전체의 2% 정도 밖에 되지 않지만, 현재까지 알려진 질병 관련 유전자들의 85% 가량이 엑솜에 위치한다고 알려져 있다 엑솜만을 시퀀싱하기 위해서는 유전체 전체에서 엑솜 부분만을 가려내야 하는데, 엑솜에 해당하는 미끼 프로브(bait probe)를 샘플에 섞어주는 solution-based capture법, 프로브를 칩에 붙여서 추출해내는 array-based capture법, PCR법 다양한 기법이 활용될 수 있다. 이 외에도 DNA, RNA 또는 전사체(transcriptome)의 서열을 분석하는 다양한 기법을 활용하여 종양 샘플 세포의 유전 변이를 분석할 수 있다.
도 3은 단일 세포 분석법(single cell anaylsis)에 따라 GBM9 환자의 유전자 변이를 분석한 결과를 나타낸 실험예이고, 도 4는 상기 결과를 바탕으로 GBM9 환자 종양의 종양 내 이질성(cell heterogeneity)을 표현한 위상(topological) 그래프이다.
세포는 매시간, 매분 분열하기 때문에 같은 종양 세포라도 각기 다른 클론(clone)을 보유할 수 있다. 즉 종양 샘플을 한 명의 환자에서 채취하였더라도, 각 세포마다 다양한 유전자 변이가 발생할 수 있는데, 이를 종양 내 이질성(Intratumor heterogeneity)이라고 한다. 이때 여러 개의 세포의 유전 변이를 분석하기 위해서는, 복수 개의 샘플이 필수적이다.
도 3을 참조하면, GBM9 환자의 오른쪽(Right), 왼쪽(Left), 재발(Recurrence) 종양에서 추출한 세 개의 샘플에서 얻은 각각의 종양 세포의 발현 프로파일(expression profile)이 나타나 있다. 각 세포에 대해, 발현이 최대로 된 아형(subtype)은 점(·)으로 표시되어 있고, EGFR 유전자에서의 변이는 노란색으로 표시되어 있다.
이때 각 세포의 발현 데이터의 유사성을 비교하여, 도 4와 같이 각 종양 세포의 위상 그래프(topological representation)를 그릴 수 있다. 도 4에서, 각각의 노드(node)는 유전자 변이 분석 결과 유사한 변이를 갖는 세포의 클러스터링(clustering)을 나타내며, 각 노드의 크기는 유사 세포의 개수와 비례한다. 하나의 셀은 여러 개의 노드에 나타날 수도 있으며, 각 노드가 공통되는 세포를 가지고 있는 경우 선으로 연결된다.
도 4에서 보듯, GBM9 환자의 각 종양에서 추출한 세포들은 비슷한 위치에 클러스터링되어 있다. 한편, 왼쪽(Left) 종양과 재발(Recurrence) 종양은 서로 겹쳐 있는데, 이를 통해 재발 종양이 GBM9 환자의 왼쪽 종양으로부터 다시 발생하였음을 추측할 수 있다.
도 5는 군집 세포 분석법(bulk cell analysis)에 따라 GBM9 환자의 유전자 변이를 분석한 결과를 나타낸 실험예이다.군집 세포 분석법에서는, 여러 세포 중 일부에서 유전자 변이가 생긴 경우 특정 군집에 변이가 발생한 것으로 나타나게 된다. 도 5의 오른쪽을 참조하면, GBM9 환자의 왼쪽, 오른쪽 종양의 조직 및 각 세포의 유전자 변이 분석 결과가 나타나 있다. 상기 환자의 경우 왼쪽 종양과 오른쪽 종양 모두, PTEN, CDKN2A 유전자에서 각각 결실(deletion)이 일어나고, PIK3CA 유전자 변이가 발생하였다. 한편, NF1 유전자 변이(mutation)는 왼쪽 종양에서만 발생하였고, EGFR 유전자 증폭(amplification), EGFRvIII 유전자 변이, EGFR 유전자 변이, ARID2 유전자 변이는 오른쪽 종양에서만 발생하였다.
위와 같이, 단일 세포 분석법 및/또는 군집 세포 분석법을 이용하여 샘플의 종양의 유전 변이를 분석할 수 있다. 그러나, 상기와 같은 분석법에 의하여 항상 완벽하게 종양 내 이질성을 분석할 수 있는 것은 아니다. 예컨대 다시 도 3을 참조하면, 단일 세포 분석법의 경우 유전자 변이 여부를 알 수 없는 경우가 회색(gray)으로 표시되어 있다. 즉 결손 데이터(missing data)가 많은 상태에서 이를 바탕으로 분석한 도 4의 종양 내 이질성 그래프는 어느 정도 오류가 있게 된다.
마찬가지로 군집 세포 분석법을 이용하여 종양의 유전 변이를 분석할 경우에도 오류가 발생할 수 있다. 예컨대 종양 중 일부 세포의 특정 유전자의 변이 발생 비율이 적은 것으로 데이터가 나왔을 때, 이것이 실제로 변이가 일어난 것인지 측정 기기에서 오류가 발생한 것인지 판단하기 어려운 경우가 있다. 따라서, 실제로 종양에 유전 변이가 발생했는지 여부를 검증하기 위한 또 다른 방법이 필요하다.
본 발명에 따르면, 유전 변이를 분석하는 단계(S20)와는 별도로, 복수 개의 샘플에 대해 약물 스크리닝을 수행하여 각 샘플의 약물 민감도(drug sensitivity)를 측정하는 단계(S30)가 수행된다. 두 단계(S20, S30)는 도 2에서와 같이 서로 동시에 수행될 수도 있으나, 어느 하나의 단계가 다른 단계보다 먼저 수행될 수도 있다.
약물 스크리닝(drug screening)은 약의 후보 물질이 되는 합성 화합물 또는 천연물 등의 약리 활성 또는 독성을 평가하는 과정이다. 본 발명에서, 약물 스크리닝에 사용되는 약물은 항암제일 수 있다. 예컨대 이러한 약물은 종양의 대사를 억제하기 위한 억제제(inhibitor)일 수 있다. 아래의 <표 1>은 이러한 억제제의 종류 및 그 타겟(target)을 나타낸 표이다.
<표 1>
Figure 112017013531599-pat00001
물론, 약물 스크리닝에 사용되는 억제제가 이에 제한되는 것은 아니다.
도 6은 GBM9 환자에 대한 3가지의 약물의 농도에 따른 샘플 종양 세포의 생존율을 나타낸 실험그래프이다.
일 실시예에 따르면, 복수 개의 샘플에 대해 약물 스크리닝을 수행하여 각 샘플의 약물 민감도를 측정하는 단계는, 각 약물의 농도에 따른 각 샘플의 세포 생존율 그래프를 얻는 단계; 및 그래프의 아래 면적을 구하는 단계;를 포함할 수 있다.
GBM9 환자는 뇌 전두엽의 왼쪽과 오른쪽에 각각 종양을 가지고 있었다. 각이때 종양에서 추출한 샘플에, 40가지의 항암제를 투여하여 종양 세포의 생존율을 관찰하였다. (도 7 참조) 이 중 3가지 (BKM120, Selumetinib, Afatinib) 약물의 스크리닝 결과만을 도 6에 도시하였다.
약물의 농도에 대한 종양 세포의 생존율 그래프를 그렸을 때, 그래프의 아래 면적(area under curve, AUC)은 약물 민감도의 지표로 활용된다. AUC 값이 낮다는 것은 약물에 의한 종양 세포의 생존율이 낮다는 것이므로 약물 민감도가 높음을 의미한다.
도 6의 (a)를 참조하면, PIK3CA 돌연변이(mutation)의 PI3K 경로를 억제하는 약물 BKM120에 대한 GBM9 환자의 왼쪽, 오른쪽 종양의 생존율 그래프가 나타나 있다. BKM120의 농도가 높아질수록(x축 방향), 두 종양의 생존율이 모두 낮아지는 것을 확인할 수 있다. 즉, 두 종양 샘플 모두에 대해 그래프의 아래 면적(AUC)이 비교적 작은 값을 가지므로, BKM120의 약물 민감도가 높음을 확인할 수 있고, 따라서 양 종양에 모두 PIK3CA 경로와 연관된 돌연변이가 일어났음을 추측할 수 있다.
도 6의 (b)를 참조하면, NF1 돌연변이(mutation)의 RAS/RAF/MEK/ERK 경로를 억제하는 약물 selumetinib에 대한 GBM9 환자의 왼쪽, 오른쪽 종양의 생존율 그래프가 나타나 있다. 도 6의 (a)와는 달리, selumetinib의 농도가 높아져도 오른쪽 종양의 생존율은 크게 감소하지 않는 반면, 왼쪽 종양의 생존율은 크게 감소한다. 즉 왼쪽 종양의 그래프의 아래 면적(AUC)이 오른쪽의 AUC보다 작으므로, 왼쪽 종양에 대한 selumetinib의 약물 민감도가 높다. 즉 RAS/RAF/MEK/ERK경로와 연관된 NF1 돌연변이는 왼쪽 종양에만 발생하였음을 추측할 수 있다.
도 6의 (c)를 참조하면, EGFR 유전자 돌연변이에 의해 과발현된 EGFR을 억제하는 기능을 가지는 약물 afatinib에 대한 GBM9 환자의 왼쪽, 오른쪽 종양의 생존율 그래프가 나타나 있다. 도 6의 (a) 및 (b)와는 달리, afatinib가 작은 농도를 가지는 경우라도 일정 농도(약 0uM)까지 오른쪽 종양의 생존율은 낮게 유지되는 반면, 왼쪽 종양의 생존율은 높은 상태로 유지된다. 즉 오른쪽 종양의 그래프의 아래 면적(AUC)이 왼쪽의 AUC보다 작으므로, 오른쪽 종양에 대한 afatinib의 약물 민감도가 높다. 즉 EGFR 경로와 연관된 돌연변이는 오른쪽 종양에만 발생하였음을 추측할 수 있다.
도 7은 GBM9 환자에 대한 40가지의 약물의 농도에 따른 좌우측 종양 세포의 약물 민감도를 나타낸 실험그래프이다. 40가지의 약물(항암제)은 표적하는 유전자(또는 억제제)에 따라 8개의 그룹으로 나뉘어 있다. x축에는 왼쪽 종양 샘플 세포의 각 약물에 대한 AUC 값이, y축에는 오른쪽 종양 샘플 세포의 각 약물에 대한 AUC 값이 나타나 있다.
실험 결과, MEK 억제제로 기능하는 약물들의 데이터는 대부분 그래프의 왼쪽 위에 도시되었다. 즉, 오른쪽 종양에 대한 AUC가 높고 왼쪽 종양에 대한 AUC가 낮다. 이는 오른쪽 종양에 대해 약물 민감도가 낮고, 왼쪽 종양에 대해 약물 민감도가 높음을 의미한다. MEK 억제제로 기능하는 약물은 왼쪽 종양에 주로 작용하므로, 왼쪽 종양에는 RAS/RAF/MEK/ERK 경로에 이상을 일으키는 NF1 유전자에 돌연변이가 일어났음을 알 수 있다.
한편, EGFR 억제제로 기능하는 약물들의 데이터는 대부분 그래프의 오른쪽 아래에 도시되었다. 즉, 왼쪽 종양에 대한 AUC가 높고 오른쪽 종양에 대한 AUC가 낮다. 이는 왼쪽 종양에 대해 약물 민감도가 낮고, 오른쪽 종양에 대해 약물 민감도가 높음을 의미한다. 즉 EGFR 억제제로 기능하는 약물은 오른쪽 종양에 주로 작용하므로, 오른쪽 종양에는 EGFR 유전자에 돌연변이가 일어났음을 알 수 있다.
반면 PI3K 경로를 억제하는 약물들의 데이터는 대부분 그래프의 왼쪽 아래 부분에 도시되었다. 즉, 왼쪽 종양과 오른쪽 종양에 대해 모두 비슷한 AUC값을 가진다. 이는 왼쪽 종양과 오른쪽 종양이 비슷한 약물 민감도를 가짐을 의미한다. 즉 왼쪽 종양, 오른쪽 종양 모두 PI3K 경로에 이상을 일으키는 PI3KCA 유전자에 돌연변이가 일어났음을 알 수 있다.
즉 약물 스크리닝에 사용된 약물이 복수 개의 샘플에 모두 민감한 경우, 이 샘플이 채취된 종양 부위에서 모두 이 약물이 타겟팅하는 유전자 변이가 일어났음을 의미한다.
이러한 도 7의 결과는 유전자 변이 분석을 통한 도 5의 결과와 일치한다. 즉 양 방법에서 모두 PIK3CA 변이가 조상 변이(ancestral mutation)에 해당하고, EGFR, MEK는 나중에 일어난 변이임을 알 수 있으므로, 각각의 분석 결과를 검증할 수 있게 된다. 상기와 같은 검증 과정이 없는 경우, 종양 치료를 위한 표적 유전자를 잘못 판별할 가능성이 있다. 이에 대하여는 후술한다.
일 실시예에 따르면, 종양 내 이질성을 분석하는 단계(도 1, S40)는, 유전 변이 분석 결과를 통해 종양 내 이질성을 분석하는 단계 및 약물 민감도 측정 결과를 이용하여 상기 종양 내 이질성 분석 결과를 검증하는 단계를 포함할 수 있다. 즉 단일 세포 분석법, 군집 세포 분석법 등을 통하여 종양의 유전 변이를 분석 결과를 통해 종양 내 이질성을 분석한 뒤, 이 결과를 약물 민감도 측정을 통해 검증할 수 있다.
도 1을 다시 참조하면, 이후, 유전 변이 분석 결과와 약물 민감도 측정 결과를 이용하여 종양의 표적 유전자를 판별하는 단계(S50)가 수행된다. 예컨대 도 5와 도 7의 결과를 바탕으로, GBM9 환자를 치료하기 위해서는 PIK3CA 유전자를 표적으로 삼아야 함을 판단할 수 있다.
도 8은 GBM9 환자의 종양 내 이질성(intratumor heterogeneity) 분석 결과 및 약물 민감도 측정 결과를 바탕으로 그린 종양의 계통수(phylogeny)이다. 예컨대 GBM9 환자의 경우, 처음 발생한 종양에서 먼저 PTEN, CDKN2A 유전자 결실, PIK3CA 변이가 일어난 후, 왼쪽 부위의 종양 세포에서 NF1 유전자 변이가 발생하여 분화하고, 오른쪽 부위의 종양 세포에서 EGFR 유전자 변이 등이 발생하여 분화하였음을 알 수 있다.
이때 GBM9 환자의 경우, 왼쪽과 오른쪽 종양 모두를 치료하기 위해서는, 종양의 근본 원인이 되는 조상 변이(ancestral mutation)에 해당하는 PTEN 유전자 결실, CDKN2A 유전자 결실, 또는 PIK3CA 유전자 변이를 타겟으로 하는 약물, 예컨대 BKM120을 투여하는 것이 바람직하다.
그런데 실제로 약물 민감도 측정을 통해 종양 내 이질성 분석 결과를 검증하기 전에, GBM9 환자는 afatinib을 통해 치료되었다. 치료 1개월 후 오른쪽 종양은 치료되었으나, EGFR 변이가 없는 왼쪽 종양은 EGFR 변이를 타게팅(targeting)하는 afatinib에 효과가 없어 재발하였다.
즉, 유전자 변이 정보 및 약물 민감도 측정 결과를 모두 이용하여 조상 변이(ancestral mutation)가 어떤 것인지를 확인하여야, 이를 바탕으로 종양 치료를 위한 타겟 유전자를 정확하게 판별할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 종양의 표적 유전자를 판별하는 단계는, 각 샘플에 대한 상기 약물 민감도의 분산(variance) 및 평균을 측정하는 단계; 및 분산이 기정된(predetermined) 값보다 작은 약물 중, 약물 민감도의 평균이 가장 높은 약물을 선정하는 단계;를 포함할 수 있다.
도 7을 다시 참조하면, 상기 GBM9 환자의 경우, 점선 근처에 있는 데이터는 약물 민감도 또는 AUC의 분산이 작고, 점선 근처에서 멀어질수록 약물 민감도의 분산이 커지게 된다. 분산이 작다는 것은, 대부분의 샘플에 대하여 약이 고르게 듣는다는 것을 의미한다. 따라서 표적 유전자를 선별하기 위해서는, 약물 민감도의 분산이 작은 것을 선택하여야 한다. 이때 기정된 값은 약물의 종류, 종양의 종류 등에 따라 적절히 선택될 수 있다.
한편, 대부분의 샘플에 대하여 약이 고르게 잘 듣는 약물을 선택하기 위해서는, 약물 민감도의 평균이 높은 것을 선택하여야 한다. 예컨대 이는 도 6의 그래프에서 점선에 가까우면서도 왼쪽 아래에 위치한 약물을 의미한다. 한편, 이러한 약물을 선정하는 과정이 분석 기기에 포함된 컴퓨터의 연산을 통해 수행될 수 있음은 물론이다.
본 발명에 따르면, 복수 개의 샘플을 이용한 종양의 유전 변이 분석 및 약물 스크리닝을 통한 약물 민감도 측정이 서로 상호보완적으로 사용되어, 기존의 방법보다 더욱 높은 정확도로 조상 변이(ancestral mutation)가 어떤 것인지를 확인할 수 있다. 따라서 더욱 신뢰성 있는 종양 치료를 위한 타겟 유전자 판별 방법을 제공할 수 있다.
상기 GBM9 환자에 대한 실험의 결과 및 그래프는 본 발명을 설명하기 위한예시적인 것에 불과하고, 본 발명의 권리범위를 제한하지 않는다.
<실시예>
신경교종( Glioma ) 표본 획득 및 배양
본 연구진은 삼성서울병원(SMC)에서 수술을 받은 신경 교종(glioma) 환자 52명에서 추출한 종양 표본 127개를 대상으로 체세포 변이를 분석하였다. 이때 종양은 샘플을 채취하는 방식에 따라 4가지의 그룹으로 분류되었다 (도 2 참조). 유전자 분석에 사용할 약 5×5×5mm3 크기의 샘플은 액체 질소를 사용하여 급속 동결시킨 후, 효소를 통해 샘플의 일부를 단일 세포로 분리시켰다. N2 및 B27 보충제(supplement, 각 0.5×, Invitrogen), 인간 재조합 염기성 섬유 아세포 성장 인자(bFGF) 및 표피 성장 인자(EGF, 각각 20ng/ml, R&D Systems)를 포함하는 신경 섬유(neurobasal) 배지에서 종양 세포를 배양하였다. 여기에 사용된 환자유래세포(patient-derived cells, PDC)는 미코플라스마(mycoplasma)에 오염되지 않았다.
전체 엑솜 시퀀싱( Whole Exome Sequencing )
원시 데이터( raw data )
엑손 DNA(exonic DNA) 단편을 포획하기 위해 Agilent사의 SureSelect 키트가 수용되었다. Illumina사의 HiSeq2000을 시퀀싱에 사용하여 2 x 101 bp의 페어드 엔드 리드(paired-end reads)를 생성하였다.
체세포 돌연변이( Somatic mutation )
Burrows-Wheeler Aligner ver.0.6.2를 사용하여, FASTQ 파일의 시퀀스된 리드(reads)를 인간 게놈 어셈블리(hg19)에 정렬하였다. 변이 추출(caliing) 전, 초기 정렬 BAM 파일은 정렬, 복제된 리드 제거, 잠재적 작은 인델(indel, insertion&deletion) 주위의 리드의 국소적 재정렬과 같은 사전 처리 과정을 거쳤다. (SAMtools, Picard ver. 1.73 및 GATK (Genome Analysis ToolKit) ver. 2.5.2. 사용)
본 연구진은 MuTect (ver. 1.1.4) 및 Somatic IndelDetector (GATK ver. 2.2)를 사용하여 종양 및 비종양 조직 쌍으로부터의 체세포 돌연변이에 대해 높은 신뢰도로 예측을 할 수 있었다. VEP (Variant Effect Predictor) ver. 73을 사용하여 추출된(called) 체세포 변이에 주석을 달았다. 또한 SAVI (Statistical Variant Identification) 소프트웨어를 실행하여 기존에 추출된 변이와 비교하기 위해 체세포 변이 및 인델(indel)을 추출하였다.
복제 수( Copy number )
ngCGH python 패키지와 Excavator가 비-종양 부분과 비교하여 종양 표본에서 추정된 복제 수 변경을 생성하는데 사용되었다. 각 유전자의 복제 수는 유전자의 모든 엑손 부위를 평균하여 분석하였다. 종양과 정상 종양의 log2 비율이 1보다 클 때 유전자가 '증폭(amplified)'으로 표시되고 -1보다 작으면 '삭제(deleted)'로 표시된다.
암세포 분획 및 클론형 ( Cancer Cell Fractions and Clonality )
본 연구진은 ABSOLUTE에 유전 변이형(genomic variant) 및 복제 수 데이터를 입력하여 샘플 순도 및 암세포 비율(Cancer Cell Fractions, CCF)을 추론하고 순도 20% 미만인 것을 제거하였다.
ABSOLUTE 프로그램을 통해 해당 유전자 변이가 1) "clonal"로 판별 되었고 암세포 비율이 80% 이상 혹은 2) "clonal" 이나 "subclonal" 이라 판별을 못하였지만 암세포 비율이 100% 이면 clonal 이라 정의하였다.
Hypermutated된 GBM18 initial과 TCGA-14-1402 두번째 재발한 샘플의 경우 ABSOLUTE 프로그램에서 대부분의 유전자 변이가 "subclonal"로 판별되었는데, 이러한 이유는 유전자 변이의 수가 너무 많아서 결과에 지장을 주었다고 판독하였다. Hypermutated된 샘플의 경우 mismatch repair 유전자 결함과 치료에 의해 유도되는 유전자 변이가 가장 많게 된다. 따라서 최대 미스매치 리페어 CCF보다 크거나 같은 CCF를 갖는 돌연변이는 이 두 샘플에서 'clonal'로 표시되었다.
Nei 유전적 거리 ( Nei genetic distances )
통계적 비교를 위해, 공간적 또는 시간적인 카테고리의 샘플을 추출하였다. 이후, 각 환자의 샘플에 대해 아래 <수학식 1>과 같이 CCF의 Nei 거리를 계산하였다. 여기서, (X = 샘플 1의 CCF, Y = 샘플 2의 CCF)
<수학식 1>
Figure 112017013531599-pat00002
RNA 시퀀싱
미스매치(mismatch), 인델(indel) 또는 스플라이싱(splicing) 없이, GSNAP (ver. 2012-12-20)을 사용하여 트리밍된 30개의 뉴클레오티드(nt)의 시퀀스 리드를 hg19에 매핑(mapping)하였다. SAMtools는 SAM 파일을 정렬하였고, bedTools (bamToBed, 버전 2.16.2)는 BED 파일로 요약하는 데 사용되었다. RPKM 값은 R package DEGseq를 사용하여 추정되었다. 유전자 융합(gene fusion)을 분석하기 위해, 융합 접합(fusion junction)을 가로지르는 리드가 분리되고, 융합 이벤트가 엑손-스킵 분석과 동일한 기준을 사용하여 추출되었다.
단세포 분리 및 RNA 염기 서열 분석(Isolation of single cells and RNA sequencing)
본 연구진은 단일 세포로부터 cDNA를 생성하기 위해 SMARTer 키트 (Clontech)와 함께 C1TM Single-Cell Auto Prep System(Fluidigm)을 사용하였다. 352R 및 L 세포는 앞서 서술한 바와 같이 현미경 검사에 의해 결정된 C1 chip (17-25 ㎛)에서 포획되었다. 샘플의 RNA는 10ng의 출발 물질을 포함하는 SMARTer 키트를 사용하여 가공하였다. 라이브러리는 Nextera XT DNA Sample Prp Kit(Illumina)를 사용하여 생성되었으며, TruSeq Rapid PECluster 키트와 TruSeq Rapid SBS 키트의 100bp 페어드-엔드 모드를 사용하여 HiSeq 2500에서 시퀀싱되었다. RNA 시퀀싱 리드(RNA sequencing read)를 레퍼런스(reference)에 매핑하기 전에, Trimmomatic-0.30을 사용하여 Q33에서 리드를 필터링했다. TPM 값은 RSEM (ver. 1.2.25)을 사용하여 각 단일 셀에서 계산되었으며 log2 (1 + TPM)로 표시되었다.
유전자 융합( gene fusion ) 검출
유전자 융합의 후보 목록을 생성하기 위해 Chimerascan이 사용되었다. 벌크 시퀀싱의 경우, FGFR3-TACC3, MGMT fusion, EGFR-SEPT14 및 ATRX fusion과 같이 이전에 알려진 프레임 기반 고-발현 융합만이 고려되었다. 단일 세포 융합 분석의 경우, 융합이 고도로 발현되고 다른 세포에서도 독립적으로 검출되면 융합이 보고될 것이다.
발현 기반 아형 결정( Expression based subtypes determination )
유전자 발현을 RSEM으로 측정한 후 log2로 변환하였다. GBM 세포의 발현 기반 아형을 결정하기 위해, 우선 샘플을 통해 유전자 발현 데이터에 대한 z-score를 계산한 다음 정규화된 발현 프로파일에 ssGSEA (ver. gsea2-2.2.1)를 적용하였다. 각 세포에 대해, 발현 값에 기초하여 모든 유전자를 랭크하여 .rnk 파일을 생성한 후 소프트웨어 GseaPreranked에 입력하였다. 이후 Verhaak, R. G. et al. 의 선행문헌 3에서 정의된 4가지 아형 모두에 대해 농축(enrichment) 점수를 계산하였다. 최대 농축 점수를 갖는 아형을 각각의 세포에 대한 대표적인 아형으로 사용하였다.
단일 세포 전사체를 이용한 위상 데이터 분석( Topological data analysis using Single cell transcriptome )
발현 프로파일에 따라 정상 세포를 필터링하였다. 이를 위해 정상적인 희소돌기아교세포(oligodendrocytes), 뉴런(neurons) 및 성상교세포(astrocytes), 소교 세포(microglia), 내피 세포(endothelial cells), T 세포 및 기타 면역 세포의 발현 시그널을 분석하고, 가우스 혼합 모델을 사용하여 발현 프로파일에 따라 개별 세포를 분류하였다. GBM9, GBM10 및 GBM2에 대해 각각 94/133, 82/85 및 90/137 세포가 종양 세포로 분류되었다.
배치 효과(batch effect)로 인한 편향을 제거하기 위해, 각 세포의 총 리드 수를 나누어서 유전자 발현 수준을 정규화 한 후, Ayasdi Inc.가 구현한 Mapper 알고리즘을 사용하여 이러한 단일 세포 데이터의 위상 표현을 만들었다. 이 알고리즘의 오픈-소스는 http://danifold.net/mapper, http://github.com/MLWave/kepler-mapper에서 얻을 수 있다. 알고리즘의 보조 함수로 다차원 스케일링(MDS)의 처음 두 성분을 사용하였다. Mapper의 결과는 데이터의 저-차원 네트워크 표현으로 나타난다. 노드(node)는 유사한 전역(global) 전사 프로필 (각 환자의 가장 높은 분산을 가진 2,000 개의 유전자의 발현 수준의 상관 관계를 통해 측정)을 가진 셀 세트를 나타낸다. 이후, 발현 패턴이 네트워크에서 로컬화(localized)된 개별 유전자를 확인하고, 발현의 수준에서 샘플의 하위 클론 구조를 결정하는 데 이를 사용하였다.
PDC 기반 약물 스크리닝 및 분석(PDC- based chemical screening and analysis)
혈청이 없는 배지에서 성장한 PDC를 384-웰 플레이트(well plate)에 웰 당 500개 세포의 밀도로 두 번 또는 세 번씩 시딩(seeding)하였다. 약물 패널은 발암 신호를 표적으로 하는 40가지의 항암제(Selleckchem)로 구성된다. 플레이팅 2시간 후, PDCs는 Janus Automated Workstation (PerkinElmer, Waltham, MA, USA)을 사용하여 20 μM에서 4.88 nM까지 4배 및 7단계 시리얼 희석하여 약물을 투입하였다. 5 % CO2 가습 배양기에서 37에서 6일간 배양한 후, Firefly luciferase(ATPLite™ 1step, PerkinElmer)을 통한 아데노신삼인산(ATP) 모니터링 시스템을 사용하여 세포 생존력을 분석하였다. 이때 EnVision Multilabel Reader (PerkinElmer)를 사용하여 생존 세포를 추정 하였다. 디메틸설폭사이드(DMSO)도 각 플레이트에 대조군으로 포함시켰다. 대조군은 각 플레이트에 대한 상대적 세포 생존력의 계산 및 플레이트 정규화에 사용되었다. 이후 GraphPad Prism 5 (GraphPad)를 사용하여 DRC 피팅을 수행하고 용량 반응 곡선의 AUC (Area Under Curve)를 측정하였다. 정규화 후 가장 잘 맞는 선(best-fit line)을 결정하고, GraphPad Prism을 사용하여 각 곡선의 AUC 값을 계산하였다. 이때 2개 미만의 피크로 정의된 영역은 무시하였다. 세포 생존력은 비수렴성 피팅(non-convergent fit)을 제외하고 용량-반응 곡선(dose-response curve) (DRC)의 AUC 값을 계산하여 결정하였다.
본 발명은 도면에 도시된 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시 예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

Claims (8)

  1. 환자의 종양에서 복수 개의 샘플을 채취하는 단계;
    상기 복수 개의 샘플 각각에 대하여 유전 변이를 분석하여, 제1 샘플 및 제2 샘플에서 모두 유전 변이가 일어난 제1 유전자와, 상기 제1 샘플에서만 유전 변이가 일어난 제2 유전자와, 상기 제2 샘플에서만 유전 변이가 일어난 제3 유전자를 식별하는 단계;
    상기 복수 개의 샘플 각각에 대해 약물 스크리닝을 수행하여 상기 각 샘플의 약물 민감도(drug sensitivity)를 측정하는 단계;
    상기 약물 민감도 측정을 통해, 약물 민감도가 상기 제1 샘플 및 상기 제2 샘플에 대하여 모두 높은 제1 약물과, 약물 민감도가 상기 제1 샘플에 대하여는 높고 상기 제2 샘플에 대하여는 낮은 제2 약물과, 약물 민감도가 상기 제1 샘플에 대하여는 낮고 상기 제2 샘플에 대하여는 높은 제3 약물을 식별하는 단계;
    상기 유전 변이 분석 결과와 상기 약물 민감도 측정 결과를 이용하여, 상기 제1 약물이 타겟팅하는 유전자가 상기 제1 유전자와 일치함을 확인하고, 상기 제2 약물이 타겟팅하는 유전자가 상기 제2 유전자와 일치함을 확인하고, 상기 제3 약물이 타겟팅하는 유전자가 상기 제3 유전자와 일치함을 확인함으로써 상기 유전 변이 분석 결과를 검증하는 단계를 포함하는, 상기 종양의 종양 내 이질성(intratumor heterogeneity)을 분석하는 단계; 및
    상기 검증에 기초한 상기 종양 내 이질성 분석 결과를 이용하여, 상기 제1 유전자를 상기 종양의 표적 유전자로 판별하는 단계;를 포함하는, 종양 치료를 위한 표적 유전자 판별 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 복수 개의 샘플을 채취하는 단계는,
    상기 환자의 종양의 각기 다른 부위에서 샘플을 채취하는 단계인, 종양 치료를 위한 표적 유전자 판별 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 복수 개의 샘플을 채취하는 단계는,
    서로 다른 시간에 발생한 상기 환자의 종양에서 각각 샘플을 채취하는 단계인, 종양 치료를 위한 표적 유전자 판별 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 복수 개의 샘플의 유전 변이를 분석하는 단계는,
    대용량 염기서열 분석법(Next-generation sequencing, NGS)을 통해 수행되는, 종양 치료를 위한 표적 유전자 판별 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 약물 민감도를 측정하는 단계에서 사용되는 약물은 항암제(anticancer agent)인, 종양 치료를 위한 표적 유전자 판별 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 복수 개의 샘플에 대해 약물 스크리닝을 수행하여 상기 각 샘플의 약물 민감도를 측정하는 단계는,
    상기 각 약물의 농도에 따른 상기 각 샘플의 세포 생존율 그래프를 얻는 단계; 및
    상기 그래프의 아래 면적을 구하는 단계;를 포함하는, 종양 치료를 위한 표적 유전자 판별 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 종양의 표적 유전자를 판별하는 단계는,
    상기 각 샘플에 대한 약물 민감도의 분산(variance) 및 평균을 측정하는 단계; 및
    상기 분산이 기정된(predetermined) 값보다 작은 약물 중, 상기 평균이 가장 높은 약물을 선정하는 단계;를 포함하는, 종양 치료를 위한 표적 유전자 판별 방법.
  8. 삭제
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