KR102077719B1 - 사이토카인(Cytokine) 및 클라우딘(Claudin)을 이용하는 천식 치료제 스크리닝 방법 - Google Patents

사이토카인(Cytokine) 및 클라우딘(Claudin)을 이용하는 천식 치료제 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 천식과 관련된 사이토카인인 종양괴사인자 알파(TNF-α), 인터페론 감마(IFN-γ), 인터류킨-5(IL-5), 인터류킨-13(IL-13), 인터류킨-17(IL-17)과 클라우딘 3(Claudin 3), 클라우딘 4(Claudin 4) 또는 클라우딘 7(Claudin 7)의 단백질 발현 수준을 측정하여 천식 치료제의 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

Description

사이토카인(Cytokine) 및 클라우딘(Claudin)을 이용하는 천식 치료제 스크리닝 방법{Screening Methods for the Therapeutic Candidate in Asthma using Cytokine and Claudins}
본 발명은 천식 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
천식(asthma)은 만성 기도 염증 및 기도과민성을 특징으로 하는 폐질환으로, 대기오염물질, 황사, 알러젠(allergen) 등에 의하여 발생한다. 특히, 천식은 호흡곤란을 야기하는 염증성 호흡기 질환으로 우리나라 인구 중 약 300만명이 천식을 앓고 있다. 천식은 색색거리는 천명, 호흡곤란, 재채기, 심한 경우 산소부족으로 인한 청색증 및 흉통을 나타내는 질환으로 최근 들어 대기오염 및 각종 화학물질에 대한 노출과 식생활의 서구화로 인하여 급격히 증가하고 있으며, 특히 소아에서 발병률이 증가하고 있고 식습관의 변화 및 서구화에 따라 증가하고 있는 추세이다. 그러나 천식 환자들에서는 질병의 원인 및 발병기전이 명확하게 밝혀지지 않은 상태이다. 이러한 발병 기전 중에 Th2(T helper type 2) 타입의 면역반응이 항진되어 이에 따라 인터루킨(interluekin)-4, 5, 13 등의 분비가 증가되게 되며(Liu et al., 2006; Williams et al., 2012), 이러한 반응과 연계하여 호산구를 비롯한 많은 염증세포들이 폐조직 내로 이동 및 침윤하게 된다(Zhou et al., 2011). 또한 염증세포들은 다양한 전염증인자 및 화학주성인자들을 방출하여, 염증반응을 더욱 악화시키며, 기도 내 배상세포의 점액분비를 증가시키고, 기도 과민성을 야기하게 된다(Chibana et al., 2008). 이러한 일련의 반응으로 인하여 천식환자들은 호흡곤란, 청색증 및 흉통 등의 임상증상을 나타내게 된다.
현재, 천식의 치료에 사용되고 있는 약물은 스테로이드제제, 기관지 확장제 및 항염증제가 주로 사용되고 있다. 스테로이드제제와 항염증제의 경우 면역반응 및 염증반응 억제를 통하여 천식치료에 사용되고 있으며, 기관지 확장제의 경우 호흡곤란 등의 임상증상이 발현 시에 이를 상쇄시키고자 사용되고 있다. 현재 가장 광범위하게 사용되고 있는 흡입형 코르티코스테로이드(corticosteroid) 제제는 뛰어난 치료 효과를 나타내지만 장기적으로 사용할 경우 용량과 사용시간에 비례하여 부신 억제, 골밀도 감소, 성장 장애, 눈과 피부의 합병증, 콜라겐의 합성 증가 등을 유발하는 것으로 알려져 있다. 또한, 살메테롤(salmeterol)과 포르메테롤(formeterol)과 같은 지속성 베타-2 길항제(beta-2 agonist)는 천식 발작에 대해 예방 효과를 나타내지만 경우에 따라서는 환자를 사망케 할 수도 있다고 경고된 바 있다. 그리고 장기 사용시 부작용이 발견되어 천식치료제로서 사용이 제한적이다.
현재까지 개발된 천식 치료제는 여러 가지 부작용들을 가지고 있는 바, 부작용이 없는 천식 치료제의 발굴이 시급한 실정이다.
대한민국 공개특허 제 10-2017-0057666 호
본 발명의 목적은, 종양괴사인자 알파(TNF-α), 인터페론 감마(IFN-γ), 인터류킨-5(IL-5), 인터류킨-13(IL-13) 또는 인터류킨-17(IL-17)의 단백질의 발현 수준을 조절하는 천식 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로 “천식치료제를 스크리닝 방법”을 제공한다.
상기의 천식치료제 스크리닝 방법은 분리된 세포, 분리된 조직 또는 인간을 제외한 동물에 천식 치료제 후보물질을 처리하는 단계; 및 상기 후보물질 처리군에서 종양괴사인자 알파(TNF-α), 인터페론 감마(IFN-γ), 인터류킨-5(IL-5), 인터류킨-13(IL-13), 또는 인터류킨-17(IL-17)의 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명에서 용어, “천식”은 기관, 기관지, 세기관지, 그리고 폐포로 이어지는 기도의 염증반응과 이로 인한 기도조직의 손상 및 변화를 특징으로 하는 여러 가지 질환들을 통칭하는 포괄적인 질환명이다(Wardlaw A 등, Clin Exp Allergy 2005;35:1254-62). 구체적으로, 천식은 폐 속에 있는 기관지가 아주 예민해진 상태로, 때때로 기관지가 좁아져서 숨이 차고 가랑가랑하는 숨소리가 들리면서 기침을 심하게 하는 증상을 나타내는 질환으로, 기관지의 알레르기 염증 반응 때문에 발생하는 알레르기 질환이다. 천식의 대표적인 증상은 호흡곤란, 기침, 천명(쌕쌕거리는 거친 숨소리) 등이며, 좁아진 기관지를 짧은 시간 내에 완화시키는 증상 완화제(기관지 확장제) 또는 기관지의 알레르기 염증을 억제하여 천식발작을 예방하는 질병 조절제(항염증제, 류코트리엔 조절제) 등이 대표적인 치료제로 사용된다. 본 발명에서 상기 천식은 기관지성 천식, 알러지성 천식, 아토피형 천식, 비아토피형 천식, 운동유발 천식, 아스피린 천식, 심인성 천식, 또는 폐포성 천식일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "천식 치료제 후보물질"은 통상적인 선정방식에 따라 천식 치료의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물, 또는 화합물 등이 될 수 있다.
상기 분리된 세포로는 인체에서 분리된 프라이머리(primary) 세포일 수 있으며, 인간 기관지 상피세포주(normal human bronchial epithelial cells, NHBE), 인간 폐 미세혈관내피세포주(Human fetal lung fibroblast cells, MRC-5), 선암 인간 폐포 기저막 상피세포주(adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells, A549), 인간 제대 정맥 내피세포주 (human umbilical vein endothelial cells, EA.hy926), 또는 Ad12-SV40 2B로 형질전환 된 기관지 상피세포(Bronchial Epithelial cells transformed with Ad12-SV40 2B, BEAS-2B) 같은 확립된 세포주를 사용할 수도 있다.
본 발명의 용어 "대조군"이란 천식 치료제 후보물질을 처리하지 않은 분리된 세포, 분리된 조직 또는 인간을 제외한 동물로 상기 후보물질을 처리한 군과 병렬 관계에 속하는 분리된 세포, 분리된 조직 또는 인간을 제외한 동물을 의미한다.
본 발명의 “천식 치료제의 스크리닝 방법”은, 천식에 사이토카인 및 Claudins의 발현이 관련됨을 확인함으로써, 치료제 후보물질을 처리하지 않은 대조군 세포와 비교하는 방식으로 고안되었다.
본 발명에서 상기 사이토카인은 종양괴사인자 알파(TNF-α), 인터페론 감마(IFN-γ), 인터류킨-5(IL-5), 인터류킨-13(IL-13), 또는 인터류킨-17(IL-17)을 포함한다.
본 발명의 일실시예에서, 마우스에 오브알부민(ovalbumin, OVA)를 감작하여 천식 동물 모델을 제조하였으며, 상기 OVA 감작된 마우스는 대조군에 비해 기도과민성(airway hyperresponsiveness, AHR)이 증가되었고, 기관지 폐포세척액(Bronchoalveolar lavage fluid, BALF)에서 총 염증 세포의 수가 증가된 것을 확인하였다.
또한, OVA로 감작된 천식 모델 마우스의 폐 조직에서 종양괴사인자 알파(TNF-α), 인터페론 감마(IFN-γ), 인터류킨-5(IL-5), 인터류킨-13(IL-13), 인터류킨-17(IL-17)의 발현이 증가되는 것을 웨스턴 블럿과 면역조직화학 염색으로 확인하였다. 또한 상기 마우스에 후보물질 헤데라코사이드 C(Hederacoside C)를 처리했을 때 종양괴사인자 알파(TNF-α), 인터페론 감마(IFN-γ), 인터류킨-5(IL-5), 인터류킨-13(IL-13), 인터류킨-17(IL-17)의 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 따라서 상기 종양괴사인자 알파(TNF-α), 인터페론 감마(IFN-γ), 인터류킨-5(IL-5), 인터류킨-13(IL-13), 인터류킨-17(IL-17)의 단백질의 발현을 감소시키는 물질을 천식 치료제로 예측할 수 있음을 확인하였다.
천식을 예방 또는 치료할 수 있는 후보물질의 부재 하에 분리된 세포, 분리된 조직 또는 인간을 제외한 동물에서의 종양괴사인자 알파(TNF-α), 인터페론 감마(IFN-γ), 인터류킨-5(IL-5), 인터류킨-13(IL-13), 또는 인터류킨-17(IL-17)의 단백질의 수준을 측정하고, 또한, 상기 후보물질의 존재 하에서 종양괴사인자 알파(TNF-α), 인터페론 감마(IFN-γ), 인터류킨-5(IL-5), 인터류킨-13(IL-13), 또는 인터류킨-17(IL-17) 단백질의 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 상기 후보물질이 존재할 때의 종양괴사인자 알파(TNF-α), 인터페론 감마(IFN-γ), 인터류킨-5(IL-5), 인터류킨-13(IL-13), 또는 인터류킨-17(IL-17) 단백질의 수준이 상기 후보물질의 부존재 하에서의 수준보다 감소시키는 물질을 천식 예방 또는 치료용 제제로 예측할 수 있다.
이에 따라, 본 발명은 상기 측정된 종양괴사인자 알파(TNF-α), 인터페론 감마(IFN-γ), 인터류킨-5(IL-5), 인터류킨-13(IL-13) 또는 인터류킨-17(IL-17)의 단백질의 발현 수준이 후보물질을 처리하지 않은 대조군보다 감소하면 상기 후보물질을 천식 치료제로 선택하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일실시예에서 천식 모델 마우스에 OVA 감작한 경우 클라우딘 3(Claudin 3)의 발현은 감소하고 클라우딘 4(Claudin 4), 클라우딘 7(Claudin 7)의 발현은 증가함을 확인하였다. 반면 후보물질인 페오니플로린(Paeoniflorin) 또는 헤데라코사이드 C(Hederacoside C)을 처리한 경우 Claudin 3의 발현은 증가하고, Claudin 4, Claudin 7의 발현은 감소함을 확인하였다.
따라서 Claudin 3의 발현을 증가시키거나 Claudin 4 또는 Claudin 7의 발현을 감소시키는 물질을 천식 치료제로 개발에 활용할 수 있음을 알 수 있었다.
이에 따라, 천식을 예방 또는 치료할 수 있는 후보물질의 부재 하에 분리된 세포, 분리된 조직 또는 인간을 제외한 동물에서의 Claudin 3의 단백질의 수준을 측정하고, 또한, 상기 후보물질의 존재 하에서 Claudin 3의 단백질의 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 상기 후보물질이 존재할 때의 Claudin 3의 단백질의 수준이 상기 후보물질의 부존재 하에서의 수준보다 증가시키는 물질을 천식의 예방 또는 치료용 제제로 예측할 수 있다.
또한, 천식을 예방 또는 치료할 수 있는 후보물질의 부재 하에 분리된 세포, 분리된 조직 또는 인간을 제외한 동물에서의 Claudin 4 또는 7의 단백질의 수준을 측정하고, 또한, 상기 후보물질의 존재 하에서 Claudin 4 또는 7의 단백질의 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 상기 후보물질이 존재할 때의 Claudin 4 또는 7의 단백질의 수준이 상기 후보물질의 부존재 하에서의 수준보다 감소시키는 물질을 천식의 예방 또는 치료용 제제로 예측할 수 있다.
이에 따라, 본 발명의 상기 스크리닝 방법은 후보물질 처리군에서 추가적으로 Claudin 3의 단백질의 발현수준을 측정하는 단계 및 상기 측정된 Claudin 3의 단백질의 발현수준이 후보물질을 처리하지 않은 대조군보다 증가하면 상기 후보물질을 천식 치료제로 선택하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 스크리닝 방법은 후보물질 처리군에서 추가적으로 Claudin 4 또는 7의 단백질의 발현수준을 측정하는 단계 및 상기 측정된 Claudin 4 또는 7의 단백질의 발현수준이 후보물질을 처리하지 않은 대조군보다 감소하면 상기 후보물질을 천식 치료제로 선택하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "Claudin 3"은 CLDN3으로도 알려져 있으며, 상기 Claudin 3를 코딩하는 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(Genebank: NM_009902.4 또는 NM_001306.3).
본 발명의 용어 "Claudin 4"은 CLDN4으로도 알려져 있으며, 상기 Claudin 4를 코딩하는 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(Genebank: NM_001305.4 또는 NM_009903.2).
본 발명의 용어 "Claudin 7"은 CLDN7으로도 알려져 있으며 상기 Claudin 7를 코딩하는 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(Genebank: NM_001193619.1. 또는 NM_016887.6.).
본 발명에 사용된 용어 "단백질 발현 수준 측정"이란 후보물질 부재 그리고 존재 하에 분리된 세포, 분리된 조직 또는 인간을 제외한 동물에서 상기 종양괴사인자 알파(TNF-α), 인터페론 감마(IFN-γ), 인터류킨-5(IL-5), 인터류킨-13(IL-13), 인터류킨-17(IL-17), Claudin 3, Claudin 4 또는 Claudin 7에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 발현 정도를 확인하는 과정이다.
구체적으로, 본 발명의 상기 단백질 발현 수준은 해당 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 측정 및 비교할 수 있다. 상기 항체와 생물학적 시료 내의 해당 단백질이 항원-항체 복합체를 형성하도록 하고, 이를 검출하는 방법을 이용한다.
본 발명에 사용된 용어 "항체"는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 상기 종양괴사인자 알파(TNF-α), 인터페론 감마(IFN-γ), 인터류킨-5(IL-5), 인터류킨-13(IL-13), 인터류킨-17(IL-17), Claudin 3, Claudin 4 또는 Claudin 7의 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.
또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "항원-항체 복합체"는 생물학적 시료 중의 해당 단백질 항원과 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다. 상기 항원-항체 복합체의 검출은 당업계에 공지된 바와 같은 방법, 예를 들어 분광학적, 광화학적, 생물화학적, 면역화학적, 전기적, 흡광적, 화학적 및 기타 방법을 이용하여 검출할 수 있다.
상기 단백질의 정보가 Genebank 등에 알려져 있으므로 당업자가 상기 서열을 바탕으로 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 디자인할 수 있다.
상기 단백질 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학(immunohistochemistry) 분석, 면역세포화학(immunocytochemistry) 분석, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일실시예에서는, 상기 종양괴사인자 알파(TNF-α), 인터페론 감마(IFN-γ), 인터류킨-5(IL-5), 인터류킨-13(IL-13), 인터류킨-17(IL-17), Claudin 3, Claudin 4 또는 Claudin 7의 단백질의 발현 수준 자체를 측정 및 비교하기 위해서, 면역조직화학(immunohistochemistry)과 웨스턴 블랏을 사용하였다.
상기에서 기술한 바와 같이, 본 발명은, 천식 치료제 후보물질을 처리하여 후보물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 변화하는 단백질 발현 수준을 측정 및 비교함으로써, 천식 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
도 1은 마우스에 오브알부민(ovalbumin, OVA)으로 감작 유발하여 기도과민성을 유발한 마우스에 치료제 후보물질을 처리하는 실험디자인을 나타낸다.
도 2A는 마우스에 OVA으로 감작 유발하여 기도과민성을 유발한 마우스와 천식 치료제 후보물질을 처리한 마우스의 기도과민성(airway hyperresponsiveness, AHR)을 나타낸다.
도 2B는 OVA으로 감작된 마우스와 천식 치료제 후보물질을 처리한 마우스의 기관지 폐포세척액(Bronchoalveolar lavage fluid, BALF)에서 증가된 염증 세포의 수를 나타낸다.
도 3은 OVA로 자극한 천식 마우스와 추가로 천식 치료제 후보물질인 페오니플로린(Paeoniflorin)과 헤데라코사이드 C(Hederacoside C)를 처리한 마우스의 폐 조직을 이용하여 웨스턴 블럿으로 천식에 관여하는 것으로 알려진 종양괴사인자 알파(TNF-α), 인터페론 감마(IFN_γ), 인터류킨-5(IL-5), 인터류킨-13(IL-13), 그리고 인터류킨-17(IL-17)의 단백질 발현 수준을 확인하고, 베타-액틴으로 표준화 한 것이다. 대조군과 비해 *P<0.05, OVA로 자극된 군과 비해 #P<0.05.
도 4A는 OVA로 자극한 천식 마우스와 추가로 천식치료제 후보물질인 Paeoniflorin과 Hederacoside C를 처리한 마우스의 폐 조직을 이용하여 웨스턴 블럿으로 클라우딘 3(Claudin 3), 클라우딘 4(Claudin 4) 그리고 클라우딘 7(Claudin 7)의 단백질 발현 수준을 확인하고, 베타-액틴으로 표준화한 것이다.
도 4B는 OVA로 자극한 천식 마우스와 추가로 천식치료제 후보물질인 Paeoniflorin과 Hederacoside C를 처리한 마우스의 폐 조직을 이용하여 면역조직화학 염색법으로 Claudin 3, Claudin 4 그리고 Claudin 7의 발현을 분석한 것이다. 대조군과 비해 *P<0.05, OVA로 자극된 군과 비해 #P<0.05
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
A. 실험방법
<실시예 1> 천식 동물모델 준비
암컷 생후 6주된 BALB/c 마우스에 1일과 14일에 오브알부민(ovalbumin, OVA)을 복강내 주사하였으며, 21일 내지 23일에, 마우스에 OVA를 비강내(intranasal) 흡입(aerosol)하여 천식 동물 모델을 제조하였다(OVA그룹).
또한, 상기 OVA 그룹 마우스에 추가로 21일부터 6일간 연속으로 DPBS로 용해한 50mg/kg 페오니플로린(Paeoniflorin)을 경구로 투여하여 동물 모델을 제조하였다(OVA + Paeoniflorin 그룹). 또한, 상기 OVA 그룹 마우스에 추가로 21일부터 6일간 연속으로 DPBS로 용해한 50mg/kg 헤데라코사이드 C(Hederacoside C)를 경구로 투여하여 동물 모델을 제조하였다(OVA + Hederacoside C 그룹). 대조군 마우스에는 식염수를 투여하였다(sham 그룹).
상기 제조된 동물모델에 27일에 0, 5, 20, 또는 100 mg/ml의 메타콜린 (Sigma-Aldrich)을 투여한 후, 기도과민증(AHR)을 평가하였다. 다음 날에, 2.5 mg/kg 틸레타민(tiletamine)과 자일라진(xylazine) (Zoletil and lumpum; Bayer Korea Co., Seoul, Korea)으로 마취하고, 기관지폐포 세척액(BALF)을 수거하여 염증세포의 수를 평가하였다.
<실시예 2> 폐 조직 평가
마우스 폐 절편의 파라핀을 제거하고, 에탄올 시리즈(ethanol series)로 재수화(rehydrated)하였다. 절편을 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin) 용액으로 염색하였다.
<실시예 3> 웨스턴 블럿
마우스 폐 조직을 증류수에 50 mM Tris-HCL(pH 7.4), 50 mM NaCl, 0.1% 도데실 황산 나트륨(SDS), 1% Triton X-100, 0.5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) 및 100 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드 (PMSF)를 포함하는 단백질 용해 용액에서 균질화하고, 20,000g로 30분간 4℃에서 원심 분리한 후, 수용성 물질(soluble material)을 수거하였다. 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리하여 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막으로 옮겼다. 5% 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)을 포함하는 0.1% Tween-20을 함유하는 트리스 완충 식염수(TBS)로 막을 21℃에서 2시간 블로킹하였고, 항-종양괴사인자-알파(anti-TNF-α), 항-인터페론-감마(anti-IFN-γ), 항-인터류킨-5(anti-IL-5), 항-인터류킨-13(anti-IL-13), 항-인터류킨-17(anti-IL-17), 항-Claudin 3, 항-Claudin 4 또는 항-claudin 7 항체로 배양(4℃, 밤새)한 후에, HRP(horseradish peroxidase)-접합 이차 항체를 사용하여 배양하였다. WEST-ZOL과 웨스턴 블럿 검출 시스템(iNtRon, SungNam, Korea)을 사용하여 검출하였다. 정량적 농도법으로 상대적인 단백질 수준을 판단하였고 데이터는, 베타-액틴(Sigma-Aldrich)으로 표준화하였다.
<실시예 4> 통계 분석
데이터는 평균 ± 표준 오차(SEM)로 나타내고, Mann-Whitney U 테스트는 두 그룹 사이의 유의한 차이를 판단하는데 사용되었다. p<0.05는 통계적 유의성을 의미하는 것으로 간주되었다.
B. 실험결과
<실험예 1> 후보물질 처리 후 천식 동물 모델에서 기도과민성 증가 및 염증 세포 증가
도 1은 마우스에 OVA으로 감작 유발하여 기도과민성을 유발한 마우스에 치료제 후보물질을 처리하는 실험디자인을 나타낸다.
도 2A는 마우스에 OVA으로 감작 유발하여 기도과민성을 유발한 마우스와 천식 치료제 후보물질 처리 마우스의 기도과민성(airway hyperresponsiveness, AHR)을 나타낸다. 도 2B는 OVA으로 감작된 마우스와 천식 치료제 후보물질 처리 마우스의 기관지 폐포세척액(Bronchoalveolar lavage fluid, BALF)에서 증가된 염증 세포의 수를 나타낸다.
도 2A에 나타난 바와 같이 OVA으로 감작 유발된 마우스는 식염수를 처리한 sham 마우스보다 기도과민성이 증가하였다. 반면 OVA로 감작 유발된 마우스에 천식 치료제 후보물질로 Hederacoside C와 Paeoniflorin을 처리한 마우스의 경우, OVA으로 감작 유발된 마우스에 비해 현저하게 기도과민성이 감소하였다
도 2B에 나타난 바와 같이 OVA으로 감작된 마우스는 sham 마우스와 비교하여 기관지 폐포세척액의 총염증 세포도 증가하였으며, 대식 세포, 호산구, 호중구의 수도 모두 현저하게 증가하였다.
반면, Hederacoside C 또는 Paeoniflorin을 처리한 마우스의 경우 OVA으로 감작 유발된 마우스에 비해 폐포세척액의 총염증 세포도 감소하였으며, 대식 세포, 호산구, 호중구의 수도 모두 현저하게 감소하였다.
<실험예 2> 천식 치료제 후보물질을 처리한 천식 모델에서 사이토카인의 발현 양상
다음으로, 웨스턴 블럿을 이용하여 천식에 관여하는 것으로 알려진 사이토카인의 발현을 분석하였다. 도 3은 OVA로 자극한 천식 마우스와 추가로 천식치료제 후보물질인 Paeoniflorin과 Hederacoside C를 처리한 마우스의 폐 단백질을 이용하여 웨스턴 블럿으로 천식에 관여하는 것으로 알려진 종양괴사인자 알파(TNF-α), 인터페론 감마(IFN-γ), 인터류킨-5(IL-5), 인터류킨-13(IL-13), 그리고 인터류킨-17(IL-17)의 단백질 수준을 확인하고, 베타-액틴으로 표준화 한 것이다.
도 3에 나타난 바와 같이, OVA으로 유발된 천식 마우스에서 종양괴사인자 알파(TNF-α), 인터페론 감마(IFN-γ), 인터류킨-5(IL-5), 인터류킨-13(IL-13), 그리고 인터류킨-17(IL-17)의 발현이 증가하였다. OVA로 천식 유발된 마우스에 천식 치료제 후보물질로 Paeoniflorin을 처리한 경우는 이들 사이토카인의 발현은 감소하지 않았다. 반면 천식 치료제 후보물질 Hederacoside C를 처리한 그룹은 이들 사이토카인의 발현이 모두 감소되는 것을 확인하였다.
이와 같이 Hederacoside C 처리에 의해 OVA로 자극한 마우스에서 기도과민성과 염증세포의 수가 감소하였으며, 종양괴사인자 알파(TNF-α), 인터페론 감마(IFN-γ), 인터류킨-5(IL-5), 인터류킨-13(IL-13), 또는 인터류킨-17(IL-17)의 발현이 현저히 감소하는 것을 확인하였는 바, 종양괴사인자 알파(TNF-α), 인터페론 감마(IFN-γ), 인터류킨-5(IL-5), 인터류킨-13(IL-13), 또는 인터류킨-17(IL-17)의 발현이 감소하는 물질을 천식 치료제 개발할 수 있음을 알 수 있었다.
<실험예 3> 천식 치료제 후보물질을 처리한 천식 모델에서 Claudins의 발현 양상
OVA으로 감작한 마우스와 추가로 천식치료제 후보 물질을 처리하여 마우스 그리고 sham 마우스의 Claudins 단백질의 발현을 확인하였다. OVA와 Paeoniflorin 처리군, OVA와 Hederacoside 처리군, OVA 처리군, 식염수 대조군 폐 조직에서 Claudin 3, Claudin 4, 그리고 Claudin 7의 발현 정도를 분석하였다.
도 3는 웨스턴 블럿으로 OVA와 Paeoniflorin 처리군, OVA와 Hederacoside 처리군, OVA 처리군, 식염수 대조군 폐 조직에서 Claudin 3, Claudin 4, 그리고 Claudin 7의 단백질 수준을 확인하고 베타-액틴으로 표준화 한 것이다
도 4는 웨스턴 블럿과 면역조직화학 염색법에 의해 OVA와 Paeoniflorin 처리군, OVA와 Hederacoside 처리군, OVA 처리군, 식염수 대조군 폐 조직에서 Claudin 3, Claudin 4, 그리고 Claudin 7의 발현을 분석한 것이다.
도 3과 4에 나타난 바와 같이, OAV만 처리한 군의 폐 조직에서는 Claudin 3의 발현이 감소하고, Claudin 4, Claudin 7의 발현이 증가하였다. 반면, 천식 치료제 후보물질인 Paeoniflorin 또는 Hederacoside C를 OAV와 함께 처리한 군의 폐 조직에서 Claudin 3의 발현이 증가하고 Claudin 4, Claudin 7의 발현이 감소하였다.
이와 같이 Paeoniflorin 또는 Hederacoside C와 처리에 의해 OAV로 자극한 마우스에서 기도과민성과 염증세포의 수가 감소하였으며, Claudin 3의 발현이 증가하고 Claudin 4, Claudin 7의 발현이 감소하는 것을 확인하였는바, 폐 조직의 Claudin 3 발현을 증가시키거나 또는 Claudin 4 또는 Claudin 7의 발현을 감소시키는 물질을 천식 치료제로 개발할 수 있음을 알 수 있었다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims (6)

  1. 분리된 세포, 분리된 조직 또는 인간을 제외한 동물에 천식 치료제 후보물질을 처리하는 단계;
    상기 후보물질 처리군에서 클라우딘 3(Claudin 3)의 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 클라우딘 3(Claudin 3)의 단백질의 발현수준이 후보물질을 처리하지 않은 대조군 보다 증가하면 상기 후보물질을 천식 치료제로 선택하는 단계를 포함하는,
    천식 치료제의 스크리닝 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 후보물질 처리군에서 추가적으로 종양괴사인자 알파(TNF-α), 인터페론 감마(IFN-γ), 인터류킨-5(IL-5), 인터류킨-13(IL-13), 또는 인터류킨-17(IL-17)의 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 종양괴사인자 알파(TNF-α), 인터페론 감마(IFN-γ), 인터류킨-5(IL-5), 인터류킨-13(IL-13), 또는 인터류킨-17(IL-17)의 단백질의 발현수준이 후보물질을 처리하지 않은 대조군보다 감소하면 상기 후보물질을 천식 치료제로 선택하는 단계를 더 포함하는, 천식 치료제의 스크리닝 방법.
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 후보물질 처리군에서 추가적으로 클라우딘 4(Claudin 4) 또는 클라우딘 7(Claudin 7)의 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 클라우딘 4(Claudin 4) 또는 클라우딘 7(Claudin 7)의 단백질의 발현수준이 후보물질을 처리하지 않은 대조군보다 감소하면 상기 후보물질을 천식 치료제로 선택하는 단계를 더 포함하는, 천식 치료제의 스크리닝 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 세포는 인간 기관지 상피세포주(normal human bronchial epithelial cells, NHBE), 인간 폐 미세혈관내피세포주(Human fetal lung fibroblast cells, MRC-5), 선암 인간 폐포 기저막 상피세포주(adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells, A549), 인간 제대 정맥 내피세포주(human endothelial cell line, EA.hy926), 또는 형질전환된 기관지 상피세포주(Bronchial Epithelial cells transformed, BEAS-2B)인 것을 특징으로 하는 천식 치료제의 스크리닝 방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 단백질 발현 수준 측정은 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학(immunohistochemistry) 분석, 면역세포화학(immunocytochemistry) 분석, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는, 천식 치료제의 스크리닝 방법.
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