KR102074215B1 - Binding sites of β-carotene to NLRP3 PYD domain and screening method for therapeutic agent of gout using same - Google Patents

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Abstract

본 발명은 β-카로틴의 NLRP3 PYD 도메인 결합 사이트 및 이를 이용한 통풍 치료제의 스크리닝 방법에 대한 것으로, NLRP3 인플라마좀(inflammasome) 활성 억제제인 β-카로틴(β-carotene)이 직접 결합하는 NLRP3 PYD 도메인의 특정 사이트를 이용하여, 통풍 치료제 또는 통풍성 염증 질환 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 상기 스크리닝 된 화합물은 통풍 또는 통풍성 염증 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a NLRP3 PYD domain binding site of β-carotene and a method for screening a gout therapeutic agent using the same, wherein the NLRP3 PYD domain to which NLRP3 inflammasome activity inhibitor β-carotene directly binds Specific sites are directed to methods of screening gout agents or gout inflammatory diseases. The screened compounds can be usefully used as a gout or gout inflammatory therapeutic.

Description

β-카로틴의 NLRP3 PYD 도메인 결합 사이트 및 이를 이용한 통풍 치료제의 스크리닝 방법{Binding sites of β-carotene to NLRP3 PYD domain and screening method for therapeutic agent of gout using same}Binding sites of β-carotene to NLRP3 PYD domain and screening method for therapeutic agent of gout using same}

본 발명은 β-카로틴(β-carotene)의 NLRP3 PYD 도메인 결합 사이트 및 이를 이용한 통풍 치료제의 스크리닝 방법에 대한 것으로, NLRP3 인플라마좀(inflammasome) 활성 억제제인 β-카로틴이 직접 결합하는 NLRP3 PYD 도메인의 특정 사이트를 이용하여, 통풍 치료제 또는 통풍성 염증 질환 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a NLRP3 PYD domain binding site of β-carotene and a screening method of a gout therapeutic agent using the same, wherein the NLRP3 PYD domain of β-carotene, an NLRP3 inflammasome activity inhibitor, directly binds to Specific sites are directed to methods of screening gout agents or gout inflammatory diseases.

통풍성 관절염은 관절 및 관절주위의 조직에서 요산 결정의 침착에 의해 야기된다. 이러한 질병 발생은 혈청 요산 수준과 직접 관련되며, 요산의 혈청 수준을 감소시키는 약제는 통풍성 관절염을 갖는 환자를 치료하는 데에 이용된다. 이러한 약제는 크산틴 산화효소 억제제 알로퓨리놀과 같이 요산의 합성을 억제하거나 요산뇨 유인물질과 같이 요산의 배출을 증가시켜 효과를 나타낸다. Gouty arthritis is caused by the deposition of uric acid crystals in the joints and surrounding tissues. This disease occurrence is directly related to serum uric acid levels, and agents that reduce the serum level of uric acid are used to treat patients with gouty arthritis. These agents work by inhibiting the synthesis of uric acid, such as xanthine oxidase inhibitor allopurinol, or by increasing the release of uric acid, such as uric acid urine.

최근, 요산 결정에 반응하여 염증성 신호를 야기하는 수용체로서 NLRP3 [NOD-like receptor family, pyrin domain containing 3]을 확인하였다. NLRP3은 NLR (Nod-like receptor family)의 멤버로서 미생물 침입 및 요산 결정과 같은 내인성 위험 신호를 감지한다. 이러한 신호의 존재 하에서 NLRP3은 어댑터 단백질인 ASC 및 프로-케스페이즈-1과 인플라마좀을 형성한다. 프로-케스페이즈-1은 개열되어 케스페이즈-1으로 분리되어 활성형으로 되며 케스페이즈-1은 프로-IL-1β 전구체를 개열하여 IL-1β를 활성화 시키게 되어 세포외 환경으로 분비한다. Recently, NLRP3 [NOD-like receptor family, pyrin domain containing 3] has been identified as a receptor that causes inflammatory signals in response to uric acid crystals. NLRP3 is a member of the Nod-like receptor family (NLR) and detects endogenous hazard signals such as microbial invasion and uric acid crystals. In the presence of this signal, NLRP3 forms inflammasomes with the adapter proteins ASC and pro-casease-1. Pro-Casephase-1 is cleaved and separated into Kephase-1 to become an active form.Casephase-1 cleaves the pro-IL-1β precursor to activate IL-1β and is secreted into the extracellular environment.

최근의 구조 결정 연구를 통해, NLRP3 활성화와 관련된 잠재적인 기작이 확인되었으며, 이에, NLRP3 인플라마좀의 선택적 소분자 억제제 개발에 있어, NLRP3 PYD가 적절한 분자 표적이 될 수도 있다고 추정되고 있다(도 1A). 다만, 현재까지 NLRP3에 직접 결합하거나, NLRP3 인플라마좀 활성을 특이적으로 조절하는 소분자는 보고된 적이 없다. Recent structural determination studies have identified potential mechanisms associated with NLRP3 activation, suggesting that NLRP3 PYD may be an appropriate molecular target for the development of selective small molecule inhibitors of NLRP3 inflamasomes (FIG. 1A). . However, to date, no small molecules that directly bind to NLRP3 or specifically regulate NLRP3 inflammasome activity have been reported.

비록, NLRP3 인플라마좀의 구성요소(e.g. NLRP3, NEK7, ASC, and caspase-1) 및 관련 신호전달 기작[e.g. 프라이밍(priming), 미토콘드리아 손상, 칼륨이온 방출(potassium efflux) 및 염소이온 방출(chloride efflux)]이 NLRP3 인플라마좀 활성화를 억제하는데 표적이 될 수 있지만, NLRP3의 직접적인 표적화만이 NLRP3 인플라마좀을 선택적으로 억제할 수 있다. sulforaphane, caffeic acid phenetyl ester, β-hydroxybutyrate, CY-09 및 MCC950와 같은 몇몇 NLRP3 인플라마좀 억제제들이 개발되었으나, NLRP3를 직접적이고 특이적으로 표적화하는 화합물은 찾아볼 수 없다. 질병의 예방 또는 치료를 위해, NLRP3가 선택적으로 표적화될 수 있는지는 여전히 불명확하다.Although components of NLRP3 inflamasomes (e.g. NLRP3, NEK7, ASC, and caspase-1) and related signaling mechanisms [e.g. Priming, mitochondrial damage, potassium efflux and chloride efflux] can be targeted to inhibit NLRP3 inflammasome activation, but only direct targeting of NLRP3 can inhibit NLRP3 inflammasomes. Can be selectively suppressed. Several NLRP3 inflammasome inhibitors have been developed, such as sulforaphane, caffeic acid phenetyl ester, β-hydroxybutyrate, CY-09 and MCC950, but no compounds that directly and specifically target NLRP3 have been found. For the prevention or treatment of the disease, it is still unclear whether NLRP3 can be selectively targeted.

한국등록특허 제10-1731303호 (2017.04.24. 등록)Korea Patent Registration No. 10-1731303 (Registered April 24, 2017)

본 발명의 목적은 NLRP3 피린 도메인(PYD)과 후보 화합물을 반응시키는 단계; 및 상기 반응시킨 반응물에서 NLRP3 피린 도메인(PYD)의 Ala-69, Val-72, Trp-73, Tyr-84 및 Glu-91로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상의 잔기와 직접 결합하는 후보 화합물을 선별하는 단계를 포함하는 통풍 치료제 또는 통풍성 염증 질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.It is an object of the present invention to react NLRP3 pyrine domain (PYD) with a candidate compound; And selecting candidate compounds that directly bind to at least one residue selected from the group consisting of Ala-69, Val-72, Trp-73, Tyr-84, and Glu-91 of the NLRP3 pyrine domain (PYD) in the reacted reactant. To provide a method for screening a gout treatment or a gout inflammatory disease comprising the step.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 NLRP3 피린 도메인(PYD)과 후보 화합물을 반응시키는 단계; 및 상기 반응시킨 반응물에서 NLRP3 피린 도메인(PYD)의 Ala-69, Val-72, Trp-73, Tyr-84 및 Glu-91로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상의 잔기와 직접 결합하는 후보 화합물을 선별하는 단계를 포함하는 통풍 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention comprises the steps of reacting the NLRP3 pyrine domain (PYD) and the candidate compound; And selecting candidate compounds that directly bind to at least one residue selected from the group consisting of Ala-69, Val-72, Trp-73, Tyr-84, and Glu-91 of the NLRP3 pyrine domain (PYD) in the reacted reactant. It provides a method for screening a gout treatment comprising the step.

또한, 본 발명은 NLRP3 피린 도메인(PYD)과 후보 화합물을 반응시키는 단계; 및 상기 반응시킨 반응물에서 NLRP3 피린 도메인(PYD)의 Ala-69, Val-72, Trp-73, Tyr-84 및 Glu-91로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상의 잔기와 직접 결합하는 후보 화합물을 선별하는 단계를 포함하는 통풍성 염증 질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of reacting the NLRP3 pyrine domain (PYD) and the candidate compound; And selecting candidate compounds that directly bind to at least one residue selected from the group consisting of Ala-69, Val-72, Trp-73, Tyr-84, and Glu-91 of the NLRP3 pyrine domain (PYD) in the reacted reactant. It provides a method of screening for a gout inflammatory disease treatment comprising the step.

본 발명은 β-카로틴의 NLRP3 PYD 도메인 결합 사이트 및 이를 이용한 통풍 치료제의 스크리닝 방법에 대한 것으로, NLRP3 인플라마좀(inflammasome) 활성 억제제인 β-카로틴(β-carotene)이 직접 결합하는 NLRP3 PYD 도메인의 특정 사이트를 이용하여, 통풍 치료제 또는 통풍성 염증 질환 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 상기 스크리닝 된 화합물은 통풍 또는 통풍성 염증 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a NLRP3 PYD domain binding site of β-carotene and a method for screening a gout therapeutic agent using the same, wherein the NLRP3 PYD domain to which NLRP3 inflammasome activity inhibitor β-carotene directly binds Specific sites are directed to methods of screening gout agents or gout inflammatory diseases. The screened compounds can be usefully used as a gout or gout inflammatory therapeutic.

도 1은 NLRP3의 PYD 도메인에 대한 가상 스크리닝 방법을 나타낸다.
도 2는 1차 대식세포에서 β-카로틴이 NLRP3 인플라마좀의 활성을 억제하지만, AIM2 인플라마좀의 활성을 억제하지 않는다는 결과를 나타낸다. A 및 C-E, 세포 배양 상등액 및 세포 용해물을 pro-caspase-1, caspase-1 (p10), pro-IL-1β 및 IL-1β에 대해 면역블랏한 결과이다. B, 세포 배양 상등액 내 분비된 IL-1β를 ELISA로 분석한 결과이다. 수치는 means ± SEM (n=3)로 나타냈다. #, 대조군 단독에 비해 유의적 차이성을 나타낸다(p <0.05). *, MSU, ATP, 니저리신(nigericin) 및 poly dA:dT 단독에 비해 유의적 차이성을 나타낸다(p <0.05).
도 3은 β-카로틴에 의한 인플라마좀 활성화의 억제가 NLRP3에 의존적이라는 결과를 나타낸다. 수치는 means ± SEM (n=3)로 나타냈다. (A) NLRP3 + ASC + caspase-1, (b) ASC+caspase-1 및 (c) Caspase-1 단독.
도 4는 β-카로틴이 NLRP3 및 ASC의 상호작용을 억제한다는 결과를 나타낸다. (A) LPS-프라이밍된 마우스 1차 대식세포를 β-카로틴으로 1시간 동안 처리한 후, 모노소듐 요산(monosodium uric acid; MSU) 결정(500 μg/ml)으로 6시간 동안 자극하였다. 세포 용해물은 항-NLRP3 항체로 면역침전시켰고 표시한 대로 면역블랏팅을 수행하였다. (B) 293T 세포를 NLRP3 또는 ASC 발현 플라스미드로 형질감염시켰고, 16시간 동안 β-카로틴으로 처리하였다. 세포 용해물은 항-NLRP3 항체로 면역침전시켰고 표시한 대로 면역블랏팅을 수행하였다. (C) 293T 세포를 NLRP3 또는 ASC 발현 플라스미드로 형질감염시켰고, β-카로틴으로 처리하였다. 세포들을 고정하고 침투시켰으며, NLRP3(빨강색), ASC(녹색)에 대해 염색하였다. 핵은 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI; 파란색)로 염색하였다. 적어도 2번 이상 독립적인 실험한 대표 결과를 나타냈다.
도 5는 β-카로틴이 NLRP3의 PYD와 결합한다는 결과를 나타낸다. (A) 계명활성제(0.005% Tween-20) 존재 하에서, NLRP3(PYD) 재조합 단백질과 결합하는 β-카로틴의 센소그램(Sensograms)은 표면 플라즈몬 공명(Surface plasmon resonance; SPR) 분석을 통해 얻었다. 여러 농도의 β-카로틴을 주입 시작 시에 정렬하여 오버레이 플롯으로 나타냈다. (B) 계명활성제(0.005% Tween-20) 존재 하에서, 재조합 ASC 단백질과 결합하는 β-카로틴의 센소그램(Sensograms)은 표면 플라즈몬 공명(Surface plasmon resonance; SPR) 분석을 통해 얻었다. 여러 농도의 β-카로틴을 주입 시작 시에 정렬하여 오버레이 플롯으로 나타냈다. 표는 β-카로틴 및 재조합 단백질 간 결합에 대한 동력학적 파라미터를 나타내는데, 간단한 1:1 상호작용 모델을 사용하여 계산하였다. 최대 예측 결합 수준(maximal expected binding level; Rmax)은 Biocore T200 evaluation software을 통해 계산하였다.
도 6은 β-카로틴이 NLRP3의 피린 도메인(PYD)과 결합한다는 결과를 나타낸다. 계명활성제(0.005% Tween-20) 존재 하에서, (A) 야생형 NLRP3의 PYD, (B) A69K 돌연변이된 NLRP3의 PYD 및 (C) V72K 돌연변이된 NLRP3의 PYD의 재조합 단백질과 결합하는 β-카로틴의 센소그램(Sensograms)은 표면 플라즈몬 공명(Surface plasmon resonance; SPR) 분석을 통해 얻었다. 여러 농도의 β-카로틴을 주입 시작 시에 정렬하여 오버레이 플롯으로 나타냈다. 표는 β-카로틴 및 재조합 단백질 간 결합에 대한 동력학적 파라미터를 나타내는데, 간단한 1:1 상호작용 모델을 사용하여 계산하였다. 최대 예측 결합 수준(maximal expected binding level; Rmax)은 Biocore T200 evaluation software을 통해 계산하였다.
도 7은 β-카로틴과 NLRP3의 PYD의 결합에 있어, Ala 69, Val 72, Trp 73, Tyr 84 및 Glu 91이 필수적이라는 결과를 나타낸다. (A) 세포 용해물의 루시퍼라제 활성을 분석한 결과이다. (B) 세포 배양 상등액 내에 분비된 IL-1β를 ELISA로 측정한 결과이다. 수치는 means ± SEM (n=3)로 나타냈다. (C) 293T 세포를 NLRP3, 돌연변이 NLRP3, ASC 또는 capsase-1 발현 플라스미드로 일시적으로 형질감염시켰다. 8시간 후, 세포들을 β-카로틴(20 μM)으로 16시간 동안 처리하였다. 그 후, 세포 배양 상등액 및 세포 용해물을 pro-caspase-1, caspase-1 (p10), pro-IL-1β 및 IL-1β로 면역블랏하였다.
도 8은 293T 세포에서 β-카로틴이 Ala69, Val72, Trp73, Tyr84 및 Glu91에 의존하여 ASC 입자 형성을 억제한다는 결과를 나타낸다. 세포들을 고정하고 침투시켰으며, NLRP3(빨강색), ASC(녹색)에 대해 염색하였다. 핵은 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI; 파란색)로 염색하였다. 적어도 2번 이상 독립적인 실험한 대표 결과를 나타냈다.
도 9는 마우스 공기 주머니 염증 모델에서, β-카로틴의 경구 투여가 NLRP3 인플라마좀의 요산 결정-유도 활성화를 약화시킨다는 결과를 나타낸다. 공기 주머니 삼출액 유래 상등액을 (A) caspase-1(p10) 및 IL-1β에 대한 면역블랏팅, (B) caspase-1 효소 활성 분석 및 (C 내지 E) IL-1β, IL-18 및 TNF-α에 대한 ELISAs 분석을 수행한 결과이다. (F) 조직학적 시험을 위해 공기 주머니 조직은 고정시켰고, H&E 염색을 사용하였다. 보라색 부분은 침습된 호중구(neutrophils)를 나타낸다. (G) 공기 주머니 삼출액에서 호중구 모집 수준을 반영하는 미엘로퍼록시다제(Myeloperoxidase; MPO) 활성을 측정한 결과이다. 바 그래프 내 수치는 means ± SEM (n=6 마우스)으로 나타냈다. #, 대조군 단독에 비해 유의적 차이성을 나타낸다(p <0.05). *, MSU 단독에 비해 유의적 차이성을 나타낸다(p <0.05). Veh, 대조군(vehicle). β-car, β-카로틴(β-carotene).
도 10은 마우스 발에서, β-카로틴의 경구 투여가 요산 결정-유도 통풍을 완화시킨다는 결과를 나타낸다. (A) 시간 경과에 따른 발 두께를 나타낸다. (B) 뒷 발의 대표적인 사진 및 H&E 염색 결과를 나타낸다. (C) 뒷발 조직에서 침습된 호중구는 H&E 염색에서 보라색 부분으로 나타났다(400X). (D) 발 조직 용해물 유래 상등액을 미엘로퍼록시다제(Myeloperoxidase; MPO) 활성 분석한 결과이다. (E) 발 조직 용해물을 pro-caspase-1, caspase-1(p10), pro-IL-1β 및 IL-1β에 대해 면역블랏팅 분석한 결과이다. (F) Caspase-1 효소 활성 분석 결과이다. (G 내지 I) IL-1β, IL-18, TNF-α에 대한 ELISAs 분석 결과이다. 선 및 바 그래프 내 수치는 means ± SEM (n=6 마우스)으로 나타냈다. #, 대조군 단독에 비해 유의적 차이성을 나타낸다(p <0.05). *, MSU 단독에 비해 유의적 차이성을 나타낸다(p <0.05). Veh, 대조군(vehicle). β-car, β-카로틴(β-carotene).
1 shows a virtual screening method for the PYD domain of NLRP3.
FIG. 2 shows that β-carotene inhibits the activity of NLRP3 inflammasomes in primary macrophages, but does not inhibit the activity of AIM2 inflamasomes. A and CE, cell culture supernatants and cell lysates were immunoblotted against pro-caspase-1, caspase-1 (p10), pro-IL-1β and IL-1β. B, IL-1β secreted in the cell culture supernatant is analyzed by ELISA. The figures are expressed as means ± SEM (n = 3). #, Significant difference compared to control alone (p <0.05). *, MSU, ATP, nigericin and poly dA: dT alone showed significant differences (p <0.05).
3 shows that inhibition of inflammasome activation by β-carotene is dependent on NLRP3. The figures are expressed as means ± SEM (n = 3). (A) NLRP3 + ASC + caspase-1, (b) ASC + caspase-1 and (c) Caspase-1 alone.
4 shows that β-carotene inhibits the interaction of NLRP3 and ASC. (A) LPS-primed mouse primary macrophages were treated with β-carotene for 1 hour and then stimulated with monosodium uric acid (MSU) crystals (500 μg / ml) for 6 hours. Cell lysates were immunoprecipitated with anti-NLRP3 antibody and immunoblotting was performed as indicated. (B) 293T cells were transfected with NLRP3 or ASC expressing plasmids and treated with β-carotene for 16 hours. Cell lysates were immunoprecipitated with anti-NLRP3 antibody and immunoblotting was performed as indicated. (C) 293T cells were transfected with NLRP3 or ASC expressing plasmids and treated with β-carotene. Cells were fixed and infiltrated and stained for NLRP3 (red) and ASC (green). Nuclei were stained with 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; blue). Representative results of at least two independent experiments are shown.
5 shows the results that β-carotene binds to PYD of NLRP3. (A) Sensograms of β-carotene that bind to NLRP3 (PYD) recombinant protein in the presence of the command activator (0.005% Tween-20) were obtained by surface plasmon resonance (SPR) analysis. Different concentrations of β-carotene were aligned at the start of the infusion and represented by overlay plots. (B) Sensograms of β-carotene binding to recombinant ASC protein in the presence of the commander (0.005% Tween-20) were obtained by surface plasmon resonance (SPR) analysis. Different concentrations of β-carotene were aligned at the start of the infusion and represented by overlay plots. The table shows the kinetic parameters for binding between β-carotene and recombinant protein, calculated using a simple 1: 1 interaction model. The maximum expected binding level (Rmax) was calculated using the Biocore T200 evaluation software.
Figure 6 shows the result that β-carotene binds to the pyrine domain (PYD) of NLRP3. Β-carotene senso that binds to the recombinant protein of (A) PYD of wild type NLRP3, (B) PYD of A69K mutated NLRP3 and (C) PYD of V72K mutated NLRP3 in the presence of a commander (0.005% Tween-20) The grams (Sensograms) were obtained by surface plasmon resonance (SPR) analysis. Different concentrations of β-carotene were aligned at the start of the infusion and represented by overlay plots. The table shows the kinetic parameters for binding between β-carotene and recombinant protein, calculated using a simple 1: 1 interaction model. The maximum expected binding level (Rmax) was calculated using the Biocore T200 evaluation software.
7 shows that Ala 69, Val 72, Trp 73, Tyr 84 and Glu 91 are essential for the binding of β-carotene and PYD of NLRP3. (A) Luciferase activity of the cell lysates was analyzed. (B) IL-1β secreted in the cell culture supernatant was measured by ELISA. The figures are expressed as means ± SEM (n = 3). (C) 293T cells were transiently transfected with NLRP3, mutant NLRP3, ASC or capsase-1 expressing plasmids. After 8 hours, cells were treated with β-carotene (20 μM) for 16 hours. Cell culture supernatants and cell lysates were then immunoblotted with pro-caspase-1, caspase-1 (p10), pro-IL-1β and IL-1β.
8 shows that β-carotene inhibits ASC particle formation depending on Ala69, Val72, Trp73, Tyr84 and Glu91 in 293T cells. Cells were fixed and infiltrated and stained for NLRP3 (red) and ASC (green). Nuclei were stained with 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; blue). Representative results of at least two independent experiments are shown.
FIG. 9 shows that in mouse airbag inflammation model, oral administration of β-carotene attenuates uric acid crystal-induced activation of NLRP3 inflammasomes. The supernatant derived from air pocket exudate was subjected to immunoblotting for (A) caspase-1 (p10) and IL-1β, (B) assay for caspase-1 enzyme activity and (C to E) IL-1β, IL-18 and TNF- This is the result of ELISAs analysis for α. (F) Airbag tissue was fixed for histological testing and H & E staining was used. Purple areas indicate invasive neutrophils. (G) Myeloperoxidase (MPO) activity reflecting neutrophil recruitment levels in air bag exudates. Values in the bar graph are represented by means ± SEM (n = 6 mice). #, Significant difference compared to control alone (p <0.05). *, Significant difference compared to MSU alone (p <0.05). Veh, control. β-car, β-carotene.
Figure 10 shows that in mouse paws, oral administration of β-carotene alleviates uric acid crystal-induced gout. (A) Shows foot thickness over time. (B) Representative photographs of hind paws and H & E staining results are shown. (C) Neutrophils invaded in hind paw tissue appeared as purple areas in H & E staining (400X). (D) Myeloperoxidase (MPO) activity of the supernatant derived from the foot tissue lysate was analyzed. (E) Foot tissue lysates were analyzed by immunoblotting of pro-caspase-1, caspase-1 (p10), pro-IL-1β and IL-1β. (F) Caspase-1 enzyme activity analysis result. (G to I) ELISAs analysis results for IL-1β, IL-18, TNF-α. Values in the line and bar graphs are represented by means ± SEM (n = 6 mice). #, Significant difference compared to control alone (p <0.05). *, Significant difference compared to MSU alone (p <0.05). Veh, control. β-car, β-carotene.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명자들은 β-카로틴을 NLRP3 인플라마좀 억제제로서 확인하였다. β-카로틴은 NLRP3 PYD 도메인에 직접 결합하고, NLRP3 인플라마좀 활성화를 억제시켰다. 생체 내에서(in vivo), β-카로틴은 NLRP3를 직접 표적화하여 NLRP3 인플라마좀 활성화를 억제시킨다는 것을 밝혀냈으며, NLRP에 의한 급성 통풍성 관절염 마우스 모델에서 주목할 만한 치료 효과를 확인하고, 본 발명을 완성하였다.We identified β-carotene as an NLRP3 inflammasome inhibitor. β-carotene binds directly to the NLRP3 PYD domain and inhibited NLRP3 inflammasome activation. In vivo, β-carotene has been shown to directly target NLRP3 to inhibit NLRP3 inflammasome activation, confirming the remarkable therapeutic effect in NLRP-induced acute gouty arthritis mouse model, and completing the present invention. It was.

본 발명은 NLRP3 피린 도메인(PYD)과 후보 화합물을 반응시키는 단계; 및 상기 반응시킨 반응물에서 NLRP3 피린 도메인(PYD)의 Ala-69, Val-72, Trp-73, Tyr-84 및 Glu-91로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상의 잔기와 직접 결합하는 후보 화합물을 선별하는 단계를 포함하는 통풍 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.The present invention comprises the steps of reacting the NLRP3 pyrine domain (PYD) and the candidate compound; And selecting candidate compounds that directly bind to at least one residue selected from the group consisting of Ala-69, Val-72, Trp-73, Tyr-84, and Glu-91 of the NLRP3 pyrine domain (PYD) in the reacted reactant. It provides a method for screening a gout treatment comprising the step.

상세하게는, 상기 선별된 후보 화합물은 NLRP3 인플라마좀 활성화를 억제할 수 있으며, 보다 상세하게는, 상기 NLRP3 인플라마좀 활성화 억제는 NLRP3 PYD 및 ASC PYD의 결합을 차단하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.Specifically, the selected candidate compounds may inhibit NLRP3 inflammasome activation, and more specifically, the inhibition of NLRP3 inflammasome activation may be to block binding of NLRP3 PYD and ASC PYD, but is not limited thereto. It doesn't happen.

상세하게는, 상기 선별된 후보 화합물은 β-카로틴(β-carotene)일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.In detail, the selected candidate compound may be β-carotene, but is not limited thereto.

또한, 본 발명은 NLRP3 피린 도메인(PYD)과 후보 화합물을 반응시키는 단계; 및 상기 반응시킨 반응물에서 NLRP3 피린 도메인(PYD)의 Ala-69, Val-72, Trp-73, Tyr-84 및 Glu-91로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상의 잔기와 직접 결합하는 후보 화합물을 선별하는 단계를 포함하는 통풍성 염증 질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다. 바람직하게는 상기 통풍성 염증 질환은 통풍성 관절염일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In addition, the present invention comprises the steps of reacting the NLRP3 pyrine domain (PYD) and the candidate compound; And selecting candidate compounds that directly bind to at least one residue selected from the group consisting of Ala-69, Val-72, Trp-73, Tyr-84, and Glu-91 of the NLRP3 pyrine domain (PYD) in the reacted reactant. It provides a method of screening for a gout inflammatory disease treatment comprising the step. Preferably, the gout inflammatory disease may be gouty arthritis, but is not limited thereto.

상세하게는, 상기 선별된 후보 화합물은 NLRP3 인플라마좀 활성화를 억제할 수 있으며, 보다 상세하게는, 상기 NLRP3 인플라마좀 활성화 억제는 NLRP3 PYD 및 ASC PYD의 결합을 차단하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.Specifically, the selected candidate compounds may inhibit NLRP3 inflammasome activation, and more specifically, the inhibition of NLRP3 inflammasome activation may be to block binding of NLRP3 PYD and ASC PYD, but is not limited thereto. It doesn't happen.

상세하게는, 상기 선별된 후보 화합물은 β-카로틴(β-carotene)일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.In detail, the selected candidate compound may be β-carotene, but is not limited thereto.

본 발명에서 기재한 NLRP3 피린 도메인(PYD)의 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.The amino acid sequence of the NLRP3 pyrine domain (PYD) described in the present invention may be represented by SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.

한편, ASC PYD 도메인은 인플라마좀이 형성될 때 NLRP3의 PYD 도메인과 직접적인 결합을 하는 것으로 알려져 인플라마좀에서의 중요한 역할을 하고 있는데, ASC(apoptosis-associated speck-like protein)는 인플라마좀 어뎁터 단백질로써 N 말단에 PYRIN-PAAD-DAPIN (PYD) 도메인과 C 말단에 caspase-recruitment domain (CARD)으로 구성된 두 개의 단백질 도메인으로 구성되어 있고, 염증성 세포자살 신호전달에 관련되어 있는 것으로 알려져 있다. On the other hand, the ASC PYD domain plays an important role in inflamasomes, which are known to directly bind to the PYD domain of NLRP3 when inflamasomes are formed. ASC (apoptosis-associated speck-like protein) plays an important role in inflamasome adapters. As a protein, it is composed of two protein domains consisting of a PYRIN-PAAD-DAPIN (PYD) domain at the N-terminus and a caspase-recruitment domain (CARD) at the C-terminus.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.Hereinafter, examples will be described in detail to help understand the present invention. However, the following examples are merely to illustrate the content of the present invention is not limited to the scope of the present invention. The embodiments of the present invention are provided to more completely explain the present invention to those skilled in the art.

<< 실험예Experimental Example >>

하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.The following experimental examples are intended to provide experimental examples that are commonly applied to each embodiment according to the present invention.

1. 데이터베이스 선택1. Select Database

본 발명자들은 가상 스크리닝을 위해, 상업적으로 구할 수 있는 ZINC natural compounds database (http://zinc.docking.org/)를 사용하였는데, 여기에는 6백만개 이상의 구매 가능한 화합물을 포함하고 있다. 프로토콜에는 중복 제거, 염 스트리핑(salt stripping), 혼합물 분리(mixture splitting), 기능기 표준화 및 전하 중성화를 포함하고 있다. 그 후, 이온화 가능한 화합물들은 pH 7.4에서 가장 적절한 전하 형태로 전환되었고, 다른 토토머(tautomer)는 Schrodinger 내 LigPrep module을 이용하여 생성하였다. 불명확한 키랄 중심을 갖는 키랄 화합물의 경우, 각 키랄 중심의 키랄성이 조합된 모든 구조는 Schrodinger 내 LigPrep module을 이용하여 생성하였다.We used a commercially available ZINC natural compounds database (http://zinc.docking.org/) for virtual screening, which includes more than 6 million commercially available compounds. Protocols include deduplication, salt stripping, mixture splitting, functional group normalization and charge neutralization. The ionizable compounds were then converted to the most appropriate charge form at pH 7.4, and other tautomers were generated using the LigPrep module in Schrodinger. For chiral compounds with unknown chiral centers, all structures in which the chirality of each chiral center was combined were produced using the LigPrep module in Schrodinger.

2. 표적 제조 및 그리드 생성2. Target Manufacturing and Grid Generation

인간 NLRP3 단백질 피린 도메인(PYD)의 결정 구조는 RCSB PROTEIN DATA BANK (RCSB PDB, http://www.rcsb.org, PDB code: 3QF2)로부터 검색하였다. 단백질 구조는 도킹 계산에 적용되었고, Schrodinger molecular simulation package 내 Glide module로 수행하였다. OPLS force field가 적용된 the Protein Preparation Wizard를 사용하였고, 입체적 충돌을 완화시키기 위한 최소화를 억제하여 구조를 확인하였다. 평균 제곱근 편차(root-mean square deviation; RMSD)이 최고 수치 또는 0.3Å에 도달하면, 최소화를 종결시켰다. 공결정 리간드를 제거하였고, 최종 구조는 본 발명의 수용체 모드로서 사용되었다. 그리드 생성 및 리간드 도킹 과정에서, default Glide settings이 사용되었다. 모든 분자 및 관련 리간드(베타-카로틴)의 도킹 계산은 Glide program을 통해 수행하였다.The crystal structure of the human NLRP3 protein pyrin domain (PYD) was retrieved from RCSB PROTEIN DATA BANK (RCSB PDB, http://www.rcsb.org, PDB code: 3QF2). The protein structure was applied to the docking calculation and performed with the Glide module in the Schrodinger molecular simulation package. The Protein Preparation Wizard using the OPLS force field was used, and the structure was confirmed by suppressing minimization to mitigate steric collisions. Minimization was terminated when the root-mean square deviation (RMSD) reached the highest value or 0.3 dB. The cocrystal ligand was removed and the final structure was used as the receptor mode of the present invention. During grid generation and ligand docking, default Glide settings were used. Docking calculations of all molecules and related ligands (beta-carotene) were performed via the Glide program.

3. 가상 스크리닝 및 육안 조사3. Virtual Screening and Visual Inspection

Glide SP mode를 사용하여, 모든 구조를 도킹시켰고 점수화하였다. 상위-랭크된 분자들 중, 독성이 있거나 과도하게 분해된 분자들과 같이 바람직하지 않은 화합물 그룹 및 하부 구조들은 육안 조사를 통해 걸러냈다.Using Glide SP mode, all structures were docked and scored. Of the top-ranked molecules, undesirable compound groups and substructures, such as toxic or overly degraded molecules, were filtered through visual inspection.

4. 단백질 발현 및 정제4. Protein Expression and Purification

본 발명에서 사용된 발현 및 정제 방법은 이전에 보고된 대로 수행하였다(Bae and Park JBC 2011). 상술하면, 자체 제작된 pOKD 벡터 내의 인간 NLRP3 PYD(amino acid 3 - 110)은 E. coli BL21(DE3)에서 20℃로 밤새도록 유도하여 발현시켰다. 표적 단백질은 니켈 친화 및 크기-배제 크로마토그래피로 정제하였다. pH 5.0에서 20mM Sodium Citrate 및 150mM NaCl 용액으로 전-평형화된 Superdex 200 gel filtration column 10/30 (GE healthcare)이 크기-배제 크로마토그래피에 사용되었다. 약 18 ml 정도 용출된 NLRP3 PYD는 4-5 mg/ml로 농축되었고 결정화에 사용되었다.The expression and purification methods used in the present invention were performed as previously reported (Bae and Park JBC 2011). Specifically, human NLRP3 PYD (amino acid 3-110) in a self-made pOKD vector was expressed by induction at 20 ° C. overnight in E. coli BL21 (DE3). Target proteins were purified by nickel affinity and size-exclusion chromatography. Superdex 200 gel filtration column 10/30 (GE healthcare) pre-equilibrated with 20 mM Sodium Citrate and 150 mM NaCl solution at pH 5.0 was used for size-exclusion chromatography. About 18 ml of eluted NLRP3 PYD was concentrated to 4-5 mg / ml and used for crystallization.

5. 결정화, 화학적 담지 및 데이터 수집5. Crystallization, chemical loading and data collection

이전에 도입된 결정화 조건을 NLRP3 PYD 결정을 얻는데 동일하게 사용하였다. 1 μl 단백질 용액(20 mM sodium citrate, pH 5.0 및 150 mM NaCl 내 4-5mg ml-1 단백질) 및 1 μl 저장용액(저장용액 0.4 ml 당 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium acetate trihydrate pH 4.6, 30 % Polyethylene glycol monomethyl ether 2.000)을 함유하는 혼합물을 평형화시켜, 초기 결정을 플레이트에서 성장시켰다. 최적화 단계 후, 0.24 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium acetate trihydrate pH 4.7, 25 % Polyethylene glycol monomethyl ether 2.000의 조건에서, 가장 좋은 결정을 생성하였다. 결정은 4일 내에 최대 크기 0.1 × 0.1 × 0.5 mm 까지 성장하였다. 액체 질소로 동결시키기 전, 결정은 5 mM β-카로틴-함유 완충액에 24시간 동안 담지하였다. 회절 데이터는 SB-II (5C) beamline at Pohang Accelerator Laboratory (PAL)(대한민국)에서 수집하였다. 데이터 가공 및 스케일링은 HKL2000을 사용하여 수행하였다.Previously introduced crystallization conditions were used equally to obtain NLRP3 PYD crystals. 1 μl protein solution (4-5 mg ml- 1 protein in 20 mM sodium citrate, pH 5.0 and 150 mM NaCl) and 1 μl stock solution (0.2 M ammonium sulfate, 0.4 M stock solution per 0.4 ml stock solution, pH 4.6, 30 The mixture containing% Polyethylene glycol monomethyl ether 2.000) was equilibrated to allow initial crystals to grow on the plate. After the optimization step, the best crystals were produced under the conditions of 0.24 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium acetate trihydrate pH 4.7, 25% polyethylene glycol monomethyl ether 2.000. Crystals grew to a maximum size of 0.1 × 0.1 × 0.5 mm within 4 days. Prior to freezing with liquid nitrogen, the crystals were immersed in 5 mM β-carotene-containing buffer for 24 hours. Diffraction data was collected at the SB-II (5C) beamline at Pohang Accelerator Laboratory (PAL) (South Korea). Data processing and scaling was performed using HKL2000.

6. 구조 결정 및 분석6. Determination and Analysis of Structure

복합체 구조는 Phaser를 사용하여 분자 치환 방법(molecular replacement phasing method)을 통해 결정하였다. 이전에 밝혀진 NLRP3 PYD 구조(PDB code: 3QF2)가 검색 모델로서 사용되었다. Coot 및 PHENIX Refine 내 iterative manual building 및 refinement에 따라 구조가 완성되었다. 상기 모델의 품질은 PROCHECK를 사용하여 확인하였다. 분자 구조 이미지는 PyMOL Molecular Graphics System을 사용하여 생성하였다.The complex structure was determined by molecular replacement phasing method using Phaser. The previously revealed NLRP3 PYD structure (PDB code: 3QF2) was used as the search model. The structure was completed by iterative manual building and refinement in Coot and PHENIX Refine. The quality of the model was confirmed using PROCHECK. Molecular structure images were generated using the PyMOL Molecular Graphics System.

7. 동물 및 세포 배양7. Animal and Cell Culture

마우스(C57BL/6)는 Orient Bio (서울, 대한민국)로부터 구입하였다. 마우스는 온도(23 ± 3℃) 및 상대 습도(40-60%)가 조절되는 방에서 무균 조건하에서 사육하였다. 마우스는 실험 전 최소 일주일 이상 동물 시설에서 순응시켰다. 동물 사육 및 실험 프로토콜은 가톨릭대학교 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee; IACUC)의 가이드라인에 따라 수행하였다(permission #2014-015). 골수 유래 1차 대식세포(Bone marrow-derived primary macrophages; BMDMs)는 C57BL/6로부터 골수를 분리하여 준비하였다. 대식세포 및 293T 세포(인간 배아 신장 세포)는 10% (v/v) 우태아혈청(Invitrogen, Carlsbad, CA), 10,000 units/ml 페니실린 및 10,000 ㎍/ml 스트렙토마이신(Invitrogen)이 포함된 Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)에 배양하였다.Mice (C57BL / 6) were purchased from Orient Bio (Seoul, South Korea). Mice were bred under sterile conditions in a room where temperature (23 ± 3 ° C.) and relative humidity (40-60%) were controlled. Mice were acclimated in animal facilities for at least a week before the experiment. Animal breeding and testing protocols were performed according to the guidelines of the Catholic University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (permission # 2014-015). Bone marrow-derived primary macrophages (BMDMs) were prepared by separating bone marrow from C57BL / 6. Macrophages and 293T cells (human embryonic kidney cells) were Dulbecco's modified with 10% (v / v) fetal bovine serum (Invitrogen, Carlsbad, Calif.), 10,000 units / ml penicillin and 10,000 μg / ml streptomycin (Invitrogen) Incubated in eagle medium (DMEM).

8. 시약8. Reagents

Escherichia coli로부터 분리된 LPS는 List Biological Laboratory Inc. (Campbell, CA)로부터 구입하였고, 엔도톡신-프리 워터에 녹였다. β-카로틴은 Sigma-Aldrich로부터 구입하였고, 스톡 용액은 DMSO로 제조하였다. 마우스 caspase-1 및 ASC에 대한 항체들은 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)로부터 구입하였다. NLRP3에 대한 항체는 Adipogen (San Diego, CA)으로부터 구입하였다. interleukin-1β(IL-1β)에 대한 항체는 R&D Systems (Minneapolis, MN)로부터 구입하였다. 동물 모델에 대한 Caspase-1 활성 키트는 Ab-cam (Cambridge, MA)으로부터 구입하였다. Esherichia LPS isolated from coli was List Biological Laboratory Inc. Purchased from Campbell, CA and dissolved in endotoxin-free water. β-carotene was purchased from Sigma-Aldrich and stock solution was prepared by DMSO. Antibodies against mouse caspase-1 and ASC were purchased from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Calif.). Antibodies against NLRP3 were purchased from Adipogen (San Diego, Calif.). Antibodies against interleukin-1β (IL-1β) were purchased from R & D Systems (Minneapolis, MN). Caspase-1 activity kits for animal models were purchased from Ab-cam (Cambridge, Mass.).

9. 플라스미드9. Plasmid

pcDNA 3.1 nV5-hNLPR3 발현 플라스미드는 You-Me Kim (Pohang University of Science and Technology, Pohang, South Korea)로부터 제공받았다. ASC 및 caspase-1에 대한 발현 플라스미드들은 Giulio Superti-Furga (Austrian Academy of Sciences, Wien, Austria)로부터 제공받았다. iGLuc 플라스미드는 Veit Hornung (University of Bonn, Bonn, Germany)로부터 제공받았다. 일시적인 형질감염 및 루시퍼라제 분석은 이전에 보고된 대로 수행하였다.The pcDNA 3.1 nV5-hNLPR3 expression plasmid was provided by You-Me Kim (Pohang University of Science and Technology, Pohang, South Korea). Expression plasmids for ASC and caspase-1 were provided by Giulio Superti-Furga (Austrian Academy of Sciences, Wien, Austria). iGLuc plasmid was provided by Veit Hornung (University of Bonn, Bonn, Germany). Transient transfection and luciferase assays were performed as previously reported.

10. 족부 통풍 마우스 모델10. Foot Gout Mouse Model

C57BL/6 마우스(7 내지 8 주령)에 β-카로틴 (30 mg/kg) 또는 대조군(0.02% DMSO)이 포함된 0.5 ml 멸균수를 경구 투여하였다. 1시간 후, MSU 결정(2 mg in 0.1 ml 멸균된 엔도톡신-프리 PBS) 또는 PBS를 오른쪽 발의 발바닥 표면에 피하 주사하였다. 시간 경과에 따른 발 두께를 관측하였다. MSU 결정 주사 24시간 후, 발 조직을 RIPA buffer(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1% NP-40, 0.25% sodium deoxycholate, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1 mM PMSF, 1 mM Na3VO4, 10 ㎍/ml aprotinin, and 10 ㎍/ml leupeptin)에 균질화시켰고, MPO 분석, ELISAs 및 immunoblot 분석을 위해 상등액을 수집하였다. 조직학 분석을 위해, 발바닥의 시상 단면을 10% 파라포름알데히드로 고정시켰고, H&E로 염색하였다. C57BL / 6 mice (7-8 weeks old) were orally administered 0.5 ml sterile water with β-carotene (30 mg / kg) or control (0.02% DMSO). After 1 hour, MSU crystals (2 mg in 0.1 ml sterile endotoxin-free PBS) or PBS were injected subcutaneously into the plantar surface of the right foot. Foot thickness was observed over time. Twenty four hours after injection of MSU crystals, the foot tissue was treated with RIPA buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1% NP-40, 0.25% sodium deoxycholate, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1 mM PMSF, 1 mM Na 3 VO). 4 , 10 μg / ml aprotinin, and 10 μg / ml leupeptin), and supernatants were collected for MPO analysis, ELISAs and immunoblot analysis. For histological analysis, the sagittal sections of the plantar were fixed with 10% paraformaldehyde and stained with H & E.

11. 11. 미엘로퍼록시다제Myeloperoxidase (( MyeloperoxidaseMyeloperoxidase ; ; MPOMPO ) 활성 분석 Activity analysis

MPO 활성은 MPO colorimetric activity assay kit (Bio-vision, Milpitas, CA)를 이용하여 공기 주머니(air-pouch) 세척물 및 발바닥 조직 균질물 내 호중구 분리 정도를 정량 측정하여 확인하였다. MPO activity was determined by quantitative determination of neutrophil segregation in air-pouch washes and plantar tissue homogenates using MPO colorimetric activity assay kit (Bio-vision, Milpitas, CA).

12. 12. 인플라마좀Inflamasome 활성화 분석  Activation Analysis

BMDMs을 2x106 세포/ml의 밀도로 6-웰 플레이트 상에 분주하였고, LPS로 4시간 동안 처리하였다. LPS 상의 β-카로틴에 대한 영향을 배제하기 위하여, PBS로 LPS를 세정한 후 β-카로틴을 첨가하였다. 세포를 β-카로틴으로 1시간 동안 처리하였고, 무혈청 배지에 녹인 MSU 결정, ATP 및 니저리신(nigericin)과 같은 NLRP3 인플라마좀 활성화제로 자극시켰다. 상기 세포들은 RIPA 완충액에서 용해시켰고, 면역블롯 분석을 수행하였다. 상등액 내 pro-caspase-1에서 caspase-1(p10)으로의 분해 및 pro-IL-1β에서 IL-1β로의 절단 여부를 인플라마좀 활성화의 지표로서 확인하였고, 면역블랏 분석을 통해 측정하였다. 상기 상등액은 1 부피의 메탄올과 0.25 부피의 클로로포름을 첨가하여 침전시킨 후, 20,000g에서 10분 동안 원심분리하였다. 상층부는 제거하였고, 1 부피의 메탄올을 첨가하였다. 상기 혼합물은 20,000g에서 10분 동안 원심분리하여 단백질 침전물을 얻었고, 상온에서 건조한 후 Laemmli 완충액(0.25 M Tris-HCl, pH 6.8, 0.4% glycerol, 10% SDS, 0.2% 2-mercaptoethanol 및 0.64% bromophenol blue)에 재현탁시켰다. 상기 샘플은 SDS-PAGE에서 분해시켰고, 그 후 폴리비닐리덴 디플루오로라이드 멤브레인에 전기이동시켰다. 상기 멤브레인은 1차 항체 및 관련 HRP-접합 2차 항체로 탐침시켰다. 각 밴드는 ECL 시스템을 이용하여 가시화하였다.BMDMs were dispensed on 6-well plates at a density of 2 × 10 6 cells / ml and treated with LPS for 4 hours. To exclude the effect on β-carotene on LPS, β-carotene was added after washing LPS with PBS. Cells were treated with β-carotene for 1 hour and stimulated with NLRP3 inflammasome activators such as MSU crystals, ATP and nigericin dissolved in serum free medium. The cells were lysed in RIPA buffer and immunoblot analysis was performed. The degradation of pro-caspase-1 to caspase-1 (p10) and cleavage of pro-IL-1β to IL-1β in the supernatant were identified as indices of inflammasome activation and measured by immunoblot analysis. The supernatant was precipitated by addition of 1 volume of methanol and 0.25 volume of chloroform, followed by centrifugation at 20,000 g for 10 minutes. The upper layer was removed and 1 volume of methanol was added. The mixture was centrifuged at 20,000 g for 10 minutes to obtain protein precipitate, dried at room temperature and then Laemmli buffer (0.25 M Tris-HCl, pH 6.8, 0.4% glycerol, 10% SDS, 0.2% 2-mercaptoethanol and 0.64% bromophenol blue). The sample was digested on SDS-PAGE and then electrophoresed to polyvinylidene difluoride membrane. The membrane was probed with the primary antibody and related HRP-conjugated secondary antibody. Each band was visualized using an ECL system.

13. 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA) 13. Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)

IL-1β 및 IL-18 수준은 효소 결합 면역 흡착 분석(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA) 키트(R&D systems, Minneapolis, MN)를 사용하여, 제조사의 지시에 따라 측정하였다. 표준 곡선 농도는 IL-1β에 있어 15.6-1000 pg/ml이었고, IL-18에 있어 25.6-1000 pg/ml이었다. IL-1α, IL-6, KC 및 MCP-1 수준은 MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Kit (Millipore, Billerica, MA)을 사용하여 측정하였다. 형광세기는 MAGPIX® (Luminex Corporation, Austin, TX)로 분석하였다.IL-1β and IL-18 levels were measured using the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (R & D systems, Minneapolis, MN), according to the manufacturer's instructions. Standard curve concentrations were 15.6-1000 pg / ml for IL-1β and 25.6-1000 pg / ml for IL-18. IL-1α, IL-6, KC and MCP-1 levels were measured using the MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine / Chemokine Kit (Millipore, Billerica, Mass.). Fluorescence intensity was analyzed by MAGPIX® (Luminex Corporation, Austin, TX).

14. 14. 공기 주머니(Air pouch)Air pouch 염증 모델 Inflammation model

국소 염증은 공기 주머니 모델을 사용하여 유도하였다. C57BL/6 마우스(7 내지 8주령)의 등 피하에 5 ml 멸균 공기를 주입하여, 공기 주머니를 만들었다. 3일 후, 주머니 내로 5 ml 멸균 공기를 추가적으로 주입하였다. 4일째, 대조군(0.02% DMSO) 또는 β-카로틴(30 mg/kg)이 포함된 0.2 ml 멸균수를 경구 투여하였고, 1시간 후에 MSU 결정(3 mg in 1 ml 멸균된 엔도톡신-프리 PBS)을 주입하였다. MSU 결정 주입 6시간 후, 마우스를 희생시켰고, 공기 주머니 플루이드를 5 mM EDTA가 함유된 2 ml PBS에 수집하였다. 세척액은 1200 rpm에서 2분 동안 원심분리하였고, 상등액은 cytokine ELISAs에 사용하였다. 면역블랏 분석을 위해, 공기 주머니 세척액을 침전시켜 단백질 침전물을 얻었다. 공기 주머니의 조직학적 분석을 위해, 공기 주머니의 시상 단면을 10% 파라포름알데히드로 고정시켰고, 헤마톡실린 및 에오신(hematoxylin and eosin; H&E)으로 염색하였다.Local inflammation was induced using the airbag model. 5 ml sterile air was injected subcutaneously under the back of C57BL / 6 mice (7-8 weeks of age) to create an air bag. After 3 days, 5 ml sterile air was further injected into the bag. On day 4, 0.2 ml sterile water containing control (0.02% DMSO) or β-carotene (30 mg / kg) was orally administered and after 1 hour MSU crystals (3 mg in 1 ml sterile endotoxin-free PBS) Injected. Six hours after MSU crystal injection, mice were sacrificed and air pocket fluids were collected in 2 ml PBS containing 5 mM EDTA. The wash was centrifuged at 1200 rpm for 2 minutes and the supernatant was used for cytokine ELISAs. For immunoblot analysis, air bag washes were precipitated to obtain protein precipitates. For histological analysis of the air sacs, sagittal sections of air sacs were fixed with 10% paraformaldehyde and stained with hematoxylin and eosin (H & E).

15. 시험관 내(in vitro) 15. In vitro caspasecaspase -1 활성 분석-1 activity assay

시험관 내 caspase-1 활성은 fluorometric caspase-1 assay kit with recombinant human caspase-1 (Bio-vision)을 사용하여 제조사의 지시에 따라 측정하였다. 형광도는 505 nm에서 여기 후, 400 nm에서 SpectraMaxM5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 사용하여 기록하였다.In vitro caspase-1 activity was measured according to the manufacturer's instructions using a fluorometric caspase-1 assay kit with recombinant human caspase-1 (Bio-vision). Fluorescence was recorded using SpectraMaxM5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) at 400 nm after excitation at 505 nm.

16. 표면 16. Surface 플라즈몬Plasmon 공명(Surface  Resonance (Surface plasmonplasmon resonance;  resonance; SPRSPR ) 분석) analysis

NLRP3의 재조함 PYD 도메인 단백질은 이전에 보고한 대로 제조하였다(J Biol Chem 286, 39528-39536, 2011). CM5 센서 칩 (cat. # BR-1005-30, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)을 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 및 N-하이드록시숙신이미드로 활성화하여, NLRP3의 PYD 단백질이 공유적으로 고정되는 카르복시메틸화된 덱스트란 매트릭스 표면을 형성시켰다. 친화도 측정을 위해 결합 및 해리 상태를 Biacore T200 (GE Healthcare)로 관찰하였다. β-카로틴은 염기성 러닝 완충액(최종농도 0.05% Tween-20 및 5% DMSO를 함유하는 PBS)에 용해시켰고, 25℃에서 5 ㎕/min의 유속으로 플로우 셀에 다양한 농도로 주입하였다. 센서 칩은 염기성 러닝 완충액으로 씻어냈다. 대조군 실험은 동일 센서 칩에 블랭크 (센서 칩만) 및 활성 (항체만 갖는 센서 칩) 채널로 수행하였다. 얻어진 분석 곡선에 근거하여 완충액의 벌크 효과를 반영한 대조군 신호는 T200 evaluation software ver. 2.0 (GE Healthcare)을 이용하여 제외하였다. 상호 작용의 동력학적 파라미터 및 친화도 상수는 T200 software (ver. 2.0)로 간단한 1:1 상호작용 모델을 이용하여 산출하였다.Reconstitution of NLRP3 The PYD domain protein was prepared as previously reported (J Biol Chem 286, 39528-39536, 2011). CM5 sensor chip (cat. # BR-1005-30, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) was activated with 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide and N-hydroxysuccinimide, The PYD protein of NLRP3 covalently immobilized to form a carboxymethylated dextran matrix surface. Binding and dissociation states were observed with Biacore T200 (GE Healthcare) for affinity measurements. β-carotene was dissolved in basic running buffer (PBS containing a final concentration of 0.05% Tween-20 and 5% DMSO) and injected into the flow cell at various concentrations at a flow rate of 5 μl / min at 25 ° C. The sensor chip was washed with basic running buffer. Control experiments were performed with the blank (sensor chip only) and active (sensor chip with antibody only) channels in the same sensor chip. Based on the analytical curves obtained, the control signals reflecting the bulk effect of the buffers were T200 evaluation software ver. Excluded using 2.0 (GE Healthcare). Kinetic parameters and affinity constants of the interactions were calculated using a simple 1: 1 interaction model with T200 software (ver. 2.0).

17. 동시-면역침전(Co-17. Co-immunoprecipitation (Co- immunoprecipitationsimmunoprecipitations ))

BMDMs 세포 또는 일시적으로 형질감염된 293T cell 용해물에 항-NLRP3 항체를 4℃에서 4시간 동안 처리시킨 후, nProtein A Sepharose-beads (GE healthcare)로 4℃에서 밤새도록 반응시켰다. 샘플은 15,000 g로 5분 동안 원심분리하였고, RIPA 완충액으로 3번 씻어냈다. 비드로 동시-면역침전된 단백질은 면역블랏 분석에 사용하였다.Anti-NLRP3 antibodies were treated with BMDMs cells or transiently transfected 293T cell lysates at 4 ° C. for 4 hours and then reacted overnight at 4 ° C. with nProtein A Sepharose-beads (GE healthcare). Samples were centrifuged at 15,000 g for 5 minutes and washed three times with RIPA buffer. Proteins co-immunoprecipitated with beads were used for immunoblot analysis.

18. 18. 공초점Confocal 현미경 분석 Microscopic analysis

공초점 현미경 분석은 이전에 보고된 대로 수행하였다. 상술하면, 293T cells을 24-웰 디쉬 내 커버슬립 상에 놓았고, 항-ASC 항체(Santa Cruz Biotechnology) 및 항-NLRP3 항체(Adipogen)로 4℃에서 밤새도록 반응시켰다. 그 후, anti-rabbit IgG-FITC, anti-mouse IgG-Alexa 488 antibody (Sigma)로 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 슬라이드는 형광 마운팅 배지(Vector Labs, Burlingame, CA)에서 마운팅시켰다. Zen2010 software (Carl Zeiss)를 사용하여, LSM710 laser scanning confocal microscope (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)로 세포들을 확인하였다.Confocal microscopy analysis was performed as previously reported. Specifically, 293T cells were placed on coverslips in 24-well dishes and reacted overnight at 4 ° C. with anti-ASC antibody (Santa Cruz Biotechnology) and anti-NLRP3 antibody (Adipogen). Thereafter, the mixture was reacted with anti-rabbit IgG-FITC and anti-mouse IgG-Alexa 488 antibody (Sigma) at room temperature for 2 hours. Slides were mounted in fluorescence mounting medium (Vector Labs, Burlingame, Calif.). Cells were identified using an LSM710 laser scanning confocal microscope (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) using Zen2010 software (Carl Zeiss).

19. 통풍성 관절염 마우스 모델19. Gouty Arthritis Mouse Model

무릎 관절 통풍성 관절염 마우스 모델에 대한 실험은 이전에 보고된 대로 수행하였다. C57BL/6 마우스(7 내지 8 주령)에 β-카로틴 (30 mg/kg) 또는 대조군(0.02% DMSO)이 포함된 0.2 ml 멸균수를 경구 투여하였다. 1시간 후, MSU 결정(100 ㎍ in 10 ㎕ 멸균된 엔도톡신-프리 PBS) 또는 PBS 만을 단독으로 마우스의 오른쪽 무릎 관절 내에 주사하였다. 24시간 후, 관절 조직 균질물을 준비하였고, 사이토카인 수준 및 MPO 활성을 측정하였다.Experiments on the knee joint gouty arthritis mouse model were performed as previously reported. C57BL / 6 mice (7-8 weeks old) were orally administered 0.2 ml sterile water containing β-carotene (30 mg / kg) or control (0.02% DMSO). After 1 hour, MSU crystals (100 μg in 10 μl sterile endotoxin-free PBS) or PBS alone were injected into the right knee joint of the mouse alone. After 24 hours, joint tissue homogenates were prepared and cytokine levels and MPO activity were measured.

20. 통계 분석20. Statistical Analysis

데이터는 means ± SEM으로 표시하였다. 그룹 간 데이터 비교는 one-way ANOVA followed by Duncan's multiple range test를 통해 수행하였다. p < 0.05 수치는 유의성이 있다고 판단하였다. 그래프 또는 도면은 적어도 2번 또는 3번 이상의 독립적 실험을 대표하는 것이다.Data is expressed as means ± SEM. Data comparison between groups was performed through one-way ANOVA followed by Duncan's multiple range test. p <0.05 was determined to be significant. The graph or figure represents at least two or three independent experiments.

<< 실시예Example 1> 가상 스크리닝으로 확인된  1> Verified by Virtual Screening NLRP3NLRP3 -결합 분자로서의 β-카로틴Β-carotene as a binding molecule

본 발명자들은 NLRP3 인플라마좀 복합체에 직접 결합하는 소분자를 확인하였다. NLRP3에 직접 결합하는 신규 후보 억제제들을 찾기 위해서, 본 발명자들은 분자 도킹 계산을 사용한 구조-기반 가상 스크리닝을 수행하였다. 본 발명자들은 NLRP3 PYD와 결합하는 분자들을 스크리닝하기 위해 Glide를 사용하였다. 단백질 데이터 은행(protein data bank; PDB)의 NLRP3 PYD 구조는 리간드 없이 결정화되어 있다. 약 62,897개의 천연 화합물을 in silico 상에서 스크리닝하였고, 11개의 상업적으로 구할 수 있는 화합물들을 시험관 내(in vitro) NLRP3 작용-유도 IL-1β 억제 분석으로 시험하였다(도 1B). 본 발명자들은 친화도 및 효율-기반 메트릭스를 통해 결합 에너지(△G) 및 Glide score 점수 분석하였다. 본 발명자들은 최고의 후보로서 β-카로틴을 선택하였다. β-카로틴은 상위 랭크되었는데, 이는 시험관 내(in vitro) 분석에서 결합 포켓 잔기와 최고의 상호작용을 나타냈으며, NLRP3 작용-유도 IL-1β 생산 억제도 매우 높은 것으로 나타났다. 이에 β-카로틴을 하나의 확실한 후보군으로 선택하였다(도 1B).We identified small molecules that bind directly to the NLRP3 inflamasome complex. To find new candidate inhibitors that directly bind to NLRP3, we performed structure-based virtual screening using molecular docking calculations. We used Glide to screen molecules that bind NLRP3 PYD. The NLRP3 PYD structure of the protein data bank (PDB) is crystallized without ligand. About 62,897 natural compounds in silico Were screened in vitro , and eleven commercially available compounds were tested in an in vitro NLRP3 action-induced IL-1β inhibition assay (FIG. 1B). We analyzed binding energy (ΔG) and Glide score scores through affinity and efficiency-based metrics. We chose β-carotene as the best candidate. β-carotene was up-ranked, which showed the best interaction with binding pocket residues in vitro and also showed a very high inhibition of NLRP3 action-induced IL-1β production. Β-carotene was thus selected as one robust candidate group (FIG. 1B).

<< 실시예Example 2> 골수 유래 1차 대식세포에서  2> In primary macrophages derived from bone marrow NLRP3NLRP3 인플라마좀을Inflamasome 차단하는 β-카로틴 Β-carotene blocks

NLRP3 인플라마좀 구성요소가 결핍된 마우스 유래 대식세포는 요산 결정의 자극에 따른 활성 IL-1β를 분비할 수 없다. 이에 본 발명자들은 골수 유래 대식세포(bone marrow-derived macrophages; BMDMs)를 사용하여, β-카로틴이 NLRP3 인플라마좀 활성화를 차단할 수 있는지 확인하였다. 본 발명자들은 BMDMs을 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide; LPS)로 프라이밍시켰다. β-카로틴이 LPS-매개 신호 기작에 영향을 줄 가능성을 배제하기 위해서, 본 발명자들은 LPS 세척 후 β-카로틴을 첨가하였다. 본 발명자들은 β-카로틴으로 1시간 동안 세포를 전처리하였고, 그 후 MSU 결정으로 자극하였다. β-카로틴은 pro-caspase-1 및 pro-IL-1β의 MSU 결정-유도 절단을 억제하였는데, 이는 배양 상등액 내 caspase-1(p10) 및 IL-1β에 대한 면역블랏팅을 통해 나타냈다(도 2A). 또한, β-카로틴은 MSU-유도 IL-1β 분비를 용량-의존적 방식으로 일정하게 억제하였는데, 이는 세포 배양 상등액의 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA)을 통해 측정하였다(도 2B). Mouse-derived macrophages lacking the NLRP3 inflamasome component are unable to secrete active IL-1β upon stimulation of uric acid crystals. The present inventors used bone marrow-derived macrophages (BMDMs) to determine whether β-carotene can block NLRP3 inflammasome activation. We primed BMDMs with lipopolysaccharide (LPS). To rule out the possibility that β-carotene will affect the LPS-mediated signal mechanism, we added β-carotene after LPS washing. We pretreated the cells with β-carotene for 1 hour and then stimulated with MSU crystals. β-carotene inhibited MSU crystal-induced cleavage of pro-caspase-1 and pro-IL-1β, indicated by immunoblotting against caspase-1 (p10) and IL-1β in the culture supernatant (FIG. 2A ). In addition, β-carotene consistently inhibited MSU-induced IL-1β secretion in a dose-dependent manner, which was measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of cell culture supernatants (FIG. 2B).

다음으로, 본 발명자들은 요산과는 다른 기작을 통해 작용하는 ATP 및 니저리신(nigericin)과 같은 다른 활성화제들에 의한 NLRP3 인플라마좀 활성화를 β-카로틴이 억제할 수 있는지 확인하였다. BMDMs에서 β-카로틴은 pro-caspase-1 및 pro-IL-1β에서 caspase-1(p10) 및 IL-1β로의 ATP-유도 절단을 각각 억제시켰다(도 2C). 또한, β-카로틴은 ATP-유도 IL-1β 분비를 억제시켰다(도 2D). 이에 더해, BMDMs에서 β-카로틴은 pro-caspase-1 및 pro-IL-1β의 니저리신(nigericin)-유도 절단을 억제시켰다(도 2E 및도 2F). 상기 결과는 MSU, ATP 및 니저리신(nigericin)을 포함하는 여러 형태의 활성화제들에 의해 유도되는 NLRP3 인플라마좀 활성화를 β-카로틴이 억제시킨다는 것을 보여준다.Next, the inventors confirmed whether β-carotene can inhibit NLRP3 inflamasome activation by other activators such as ATP and nigericin, which act through a mechanism different from uric acid. Β-carotene in BMDMs inhibited ATP-induced cleavage of caspase-1 (p10) and IL-1β in pro-caspase-1 and pro-IL-1β, respectively (FIG. 2C). In addition, β-carotene inhibited ATP-induced IL-1β secretion (FIG. 2D). In addition, β-carotene in BMDMs inhibited nigericin-induced cleavage of pro-caspase-1 and pro-IL-1β (FIG. 2E and FIG. 2F). The results show that β-carotene inhibits NLRP3 inflammasome activation induced by several forms of activators including MSU, ATP and nigericin.

<< 실시예Example 3>  3> NLRP3의NLRP3 PYD와With PYD 직접 결합하는 β-카로틴 Β-carotene that binds directly

본 발명자들은 β-카로틴이 NLRP3 인플라마좀 활성화를 억제하는 기작을 확인하였다. 본 발명자들은 인플라마좀 활성화에 반응하는 iGLuc 루시퍼라제 리포터 유전자와 함께 각 구성요소를 과발현시켜, 293T 세포 내 NLRP3 인플라마좀 복합체를 재구성하였다. 본 발명자들이 caspase-1 또는 ASC 및 caspase-1로 293T 세포를 형질감염시켰을 때, β-카로틴은 iGLuc 루시퍼라제의 발현을 억제하지 않았다(도 3B 및 도 3C). 하지만, 293T 세포를 NLRP3, ASC 및 caspase-1로 형질감염시키면, β-카로틴은 3개의 구성요소에 의해 유도되는 iGLuc 루시퍼라제의 발현을 억제시켰다(도 3A). β-카로틴의 억제 효과는 오직 NLRP3가 존재하는 경우에만 관측되었는데, 상기 결과는 ASC 또는 caspase-1이 아닌 NLRP3 만이 β-카로틴의 표적이라는 것을 뒷받침한다. We have identified a mechanism by which β-carotene inhibits NLRP3 inflammasome activation. We overexpressed each component with the iGLuc luciferase reporter gene in response to inflammasome activation to reconstruct the NLRP3 inflammasome complex in 293T cells. When we transfected 293T cells with caspase-1 or ASC and caspase-1, β-carotene did not inhibit the expression of iGLuc luciferase (FIGS. 3B and 3C). However, when 293T cells were transfected with NLRP3, ASC and caspase-1, β-carotene inhibited the expression of iGLuc luciferase induced by three components (FIG. 3A). The inhibitory effect of β-carotene was observed only in the presence of NLRP3, which supports that NLRP3, but not ASC or caspase-1, is the target of β-carotene.

NLRP3의 PYD가 ASC와의 결합에 참여하므로, 본 발명자들은 β-카로틴이 NLRP3-ASC 결합을 막아내고 NLRP3 PYD에 결합하는지 확인하였다. 항-NLRP3 항체로 동시-면역침전시키고, 항-ASC 항체로 면역블랏팅시킨 결과, BMDMs에서 β-카로틴은 MSU 결정-유도된 NLRP3 및 ASC 결합을 억제하는 것으로 나타났다(도 4A). 또한, 293T 세포에서 NLRP3 및 ASC가 외재적으로 발현시, β-카로틴은 상기 상호작용도 억제시켰다(도 4B). ASC는 NLRP3와 결합하여 소중합체화(oligomerization)를 겪는데, 이에 본 발명자들은 β-카로틴이 ASC 소중합체화(oligomerization)에 영향을 미치는지 확인하였다. 293T 세포에서 NLRP3 및 ASC의 외재성 발현 결과, ASC 소중합체화(oligomerization)가 나타났는데, 이는 입자 형성에 대한 공초점 현미경 분석을 통해 확인하였다. 한편, NLRP3 및 ASC로 형질감염된 293T 세포에서 β-카로틴은 ASC 소중합체화(oligomerization)를 억제시켰다(도 4C). 상기 결과는 β-카로틴이 NLRP3의 PYD와 결합하여, NLRP3 인플라마좀 복합체의 조립을 차단한다는 것을 나타낸다.Since the PYD of NLRP3 participates in binding to ASC, the inventors confirmed that β-carotene blocked NLRP3-ASC binding and binds to NLRP3 PYD. Co-immunoprecipitation with anti-NLRP3 antibody and immunoblotting with anti-ASC antibody showed that β-carotene in BMDMs inhibited MSU crystal-induced NLRP3 and ASC binding (FIG. 4A). In addition, when NLRP3 and ASC were expressed externally in 293T cells, β-carotene also inhibited this interaction (FIG. 4B). ASCs undergo oligomerization in combination with NLRP3, and we have determined that β-carotene affects ASC oligomerization. Exogenous expression of NLRP3 and ASC in 293T cells showed ASC oligomerization, confirmed by confocal microscopic analysis of particle formation. On the other hand, β-carotene inhibited ASC oligomerization in 293T cells transfected with NLRP3 and ASC (FIG. 4C). The results indicate that β-carotene binds to the PYD of NLRP3, blocking the assembly of the NLRP3 inflammasome complex.

다음으로, 본 발명자들은 β-카로틴이 NLRP3에 직접 결합하여, NLRP3 인플라마좀의 활성화를 차단할 수 있는지 확인하였다. NLRP3 인플라마좀 조립은 NLRP3 및 ASC 간의 PYD/PYD 상호작용에 결정적으로 의존한다. 이에 본 발명자들은 재조합 NLRP3 PYD의 표면 플라즈몬 공명(Surface plasmon resonance; SPR)을 분석하여, β-카로틴과 NLRP3의 PYD의 결합을 확인하였다. 본 발명자들은 β-카로틴이 NLRP3의 PYD에 용량 의존적 방식으로 직접 결합한다는 것을 밝혀냈다(도 5A). 상호작용 동력학 및 친화도 상수의 파라미터는 Biacore T200 software를 이용하여 간단한 1:1 상호작용 모델을 기초로 계산되었다(도 5A). 본 발명자들은 β-카로틴이 ASC에는 결합하지 않는다는 것을 밝혀냈다(도 5B). 상기 결과는 β-카로틴의 표적이 ASC가 아니라 NLRP3의 PYD라는 것을 뒷받침한다.Next, the inventors confirmed that β-carotene can directly bind to NLRP3, thereby blocking the activation of NLRP3 inflamasome. NLRP3 inflammasome assembly is critically dependent on the PYD / PYD interaction between NLRP3 and ASC. The present inventors analyzed the surface plasmon resonance (SPR) of recombinant NLRP3 PYD to confirm the binding of β-carotene and NLRP3 PYD. We found that β-carotene binds directly to PYD of NLRP3 in a dose dependent manner (FIG. 5A). The parameters of interaction kinetics and affinity constants were calculated based on a simple 1: 1 interaction model using the Biacore T200 software (FIG. 5A). We found that β-carotene did not bind to ASC (FIG. 5B). The results support that the target of β-carotene is PYD of NLRP3, not ASC.

<< 실시예Example 4>  4> NLRP3의NLRP3 PYD와With PYD β-카로틴의 결합에 필수적인 Ala-69, Val-72, Trp-73, Tyr-84 및 Glu-91  Ala-69, Val-72, Trp-73, Tyr-84 and Glu-91, essential for the binding of β-carotene

β-카로틴과 NLRP3의 PYD의 결합이 Ala 69 및 Val 72 의존적인지 확인하기 위해서, 본 발명자들은 Ala 69 to Lys(A69K) 및 Val 72 to Lys(V72K)과 같은 점 돌연변이를 포함하는 NLRP3에 β-카로틴을 결합시켰다. SPR 분석 결과, β-카로틴은 NLRP3의 A69K- V72K- PYD 변이체에는 거의 결합하지 않았다(도 6B 및 도 6C). 상기 결과와 일관되게, β-카로틴과 NLRP3의 PYD의 결합은 Ala 69 및 Val 72에 의존적이었다(도 6A). 본 발명자들은 pro-caspase-1, ASC 및 돌연변이 NLRP3을 코딩하는 플라스미드로 HEK 293T 세포를 형질감염시켰다. 본 발명자들은 인간 NLRP3 내 β-카로틴 결합 포켓을 형성하는 5개의 아미노산 잔기를 리신(lysines) 또는 아르기닌(arginines)으로 돌연변이시켰고, β-카로틴과 돌연변이 단백질의 결합을 확인하였다(도 7A). 야생형 NLRP3을 발현하는 293T 세포에서, β-카로틴은 인플라마좀 활성화-유도 발광을 억제하였다. A69K, V72K, W73K, Y84R 및 E91R 돌연변이는 β-카로틴-유도 발광 억제에 민감하지 않았다(도 7A). 야생형 및 돌연변이 NLRP3-형질감염 세포 사이의 IL-1β 분비는 유사하였으나, IL-1β가 감소하지는 않았다(도 7B). 또한, 본 발명자들이 293T 세포에서 NLRP3, ASC 및 caspase-1을 외재적으로 발현시켰을 때, β-카로틴은 NLRP3 야생형을 가진 세포에서 caspase-1의 절단을 억제하였으나, NLRP3 돌연변이는 억제하지 않았다(도 7C). 본 발명자들은 야생형 NLRP3 및 ASC로 형질감염된 293T 세포에서 β-카로틴이 ASC 소중합체화(oligomerization)를 억제하지만, 돌연변이 NLRP3 및 ASC로 형질감염된 293T 세포는 그렇지 않다는 것을 밝혀냈다(도 8).In order to determine whether the binding of β-carotene and NLRP3's PYD is Ala 69 and Val 72 dependent, we applied β- Carotene bound. SPR analysis showed little β-carotene bound to the A69K-V72K-PYD variant of NLRP3 (FIGS. 6B and 6C). Consistent with the above results, the binding of β-carotene and PYD of NLRP3 was dependent on Ala 69 and Val 72 (FIG. 6A). We transfected HEK 293T cells with plasmids encoding pro-caspase-1, ASC and mutant NLRP3. We mutated five amino acid residues that form β-carotene binding pockets in human NLRP3 with lysines or arginines and confirmed the binding of β-carotene and mutant proteins (FIG. 7A). In 293T cells expressing wild type NLRP3, β-carotene inhibited inflammasome activation-induced luminescence. A69K, V72K, W73K, Y84R and E91R mutations were not sensitive to β-carotene-induced luminescence inhibition (FIG. 7A). IL-1β secretion between wild-type and mutant NLRP3-transfected cells was similar, but IL-1β was not reduced (FIG. 7B). In addition, when we exogenously expressed NLRP3, ASC and caspase-1 in 293T cells, β-carotene inhibited the cleavage of caspase-1 in cells with NLRP3 wild type, but did not inhibit NLRP3 mutation (FIG. 7C). We found that β-carotene inhibited ASC oligomerization in 293T cells transfected with wild type NLRP3 and ASC, but not 293T cells transfected with mutant NLRP3 and ASC (FIG. 8).

<< 실시예Example 5> 마우스  5> mouse 공기 주머니windbag 염증 모델에서 β-카로틴 경구 투여를 통한 요산-유도 인플라마좀 활성화 억제 Inhibition of Uric Acid-Induced Inflammasome Activation by Oral β-Carotene in Inflammation Model

본 발명자들은 생체 내에서(in vivo) 마우스 공기 주머니 염증 모델을 사용하여, NLRP3 인플라마좀에 대한 β-카로틴 억제 효과를 확인하였다. 본 발명자들은 마우스의 등에 공기 주머니를 형성시킨 후, 마우스에게 30 mg/kg β-카로틴을 경구 투여하였다. 한 시간 후, 본 발명자들은 MSU 결정을 공기 주머니로 주입하여, NLRP3 인플라마좀을 활성화시켰다. MSU 결정 주입으로, 절단된 caspase-1 및 IL-1β가 공기 주머니 삼출액으로 방출되었는데, 이는 MSU 결정에 의한 NLRP3 인플라마좀의 생체 내(in vivo) 활성화를 나타낸다(도 9). β-카로틴의 경구 투여는 공기 주머니 삼출액 내 pro-caspase-1 및 pro-IL-1β의 MSU 결정-유도 절단을 억제하였다(도 9A). 또한, MSU 결정만 주입된 마우스 유래 공기 주머니 삼출액과 비교하면, β-카로틴을 투여한 마우스 유래 삼출액이 더 낮은 caspase-1 활성을 나타냈다(도 9B). 또한, β-카로틴의 경구 투여는 공기 주머니 삼출액 내 IL-1β 및 IL-18의 MSU 결정-유도 방출을 억제하였는데, 이는 ELISA로 측정하였다(도 9C 및 도 9D). 이에 비해, MSU 결정 또는 β-카로틴 모두 공기 주머니 삼출액 내 TNF-α 수준을 변화시키지는 않았는데, 이는 TNF-α가 요산-유도 염증에 결정적이지는 않다는 것을 뒷받침한다(도 9E). 상기 결과는 요산 결정에 의해 유도되는 NLRP3 인플라마좀 에 대한 β-카로틴의 억제 효과를 확인한 것이다. 본 발명자들은 β-카로틴에 의한 MSU 결정 유도 NLRP3 인플라마좀 활성화의 억제가 염증 반응을 약화시키는지 확인하였다. β-카로틴은 공기 주머니 조직 및 삼출액 내 호중구 침습을 감소시켰는데, 이는 조직학적 시험 및 미엘로퍼록시다제(myeloperoxidase) 활성으로 각각 나타냈다(도 9F 및 도 9G). 상기 결과들은 β-카로틴 처리가 NLRP3 인플라마좀 활성화를 억제시킴으로써, 요산에 의해 유도되는 염증 반응을 완화시킨다는 것을 나타낸다.We have used a mouse airbag inflammation model in vivo to identify β-carotene inhibitory effects on NLRP3 inflamasomes. The present inventors formed an air bag on the back of the mouse, and then orally administered 30 mg / kg β-carotene to the mouse. After one hour, we injected MSU crystals into the air sacs to activate the NLRP3 inflammasomes. Injecting MSU crystals, cleaved caspase-1 and IL-1β were released into the air sap exudates, indicating in vivo activation of NLRP3 inflammasomes by MSU crystals (FIG. 9). Oral administration of β-carotene inhibited MSU crystal-induced cleavage of pro-caspase-1 and pro-IL-1β in air bag exudates (FIG. 9A). In addition, compared to mouse-derived air sap effluent injected with only MSU crystals, mouse-derived effusion with β-carotene showed lower caspase-1 activity (FIG. 9B). In addition, oral administration of β-carotene inhibited MSU crystal-induced release of IL-1β and IL-18 in air bag exudates, measured by ELISA (FIGS. 9C and 9D). In comparison, neither MSU crystals nor β-carotene altered TNF-α levels in air bag exudates, which supports that TNF-α is not critical for uric acid-induced inflammation (FIG. 9E). The results confirm the inhibitory effect of β-carotene on NLRP3 inflamasome induced by uric acid crystals. We have identified whether inhibition of MSU crystal induced NLRP3 inflammasome activation by β-carotene attenuates the inflammatory response. β-carotene reduced neutrophil invasion in air pocket tissue and exudate, which was shown by histological testing and myeloperoxidase activity, respectively (FIGS. 9F and 9G). The results indicate that β-carotene treatment inhibits NLRP3 inflammasome activation, thereby alleviating the inflammatory response induced by uric acid.

<< 실시예Example 6> 마우스에서 β-카로틴 경구 투여를 통해  6> Oral administration of β-carotene in mice NLRP3NLRP3 인플라마좀Inflamasome 활성화를 차단시킴으로써 요산-유도 급성 통풍 억제 Inhibition of uric acid-induced acute gout by blocking activation

본 발명자들은 급성 통풍 마우스 모델에서 β-카로틴의 경구 투여가 통풍의 염증 증상을 억제하는지 확인하였다. 본 발명자들은 MSU 결정을 마우스의 뒷발에 주입하였는데, 이는 발 두께 및 발 조직의 호중구 침습을 증가시켰고, 발 조직 균질물 내 사이토카인 수준을 증가시켰다(도 10). β-카로틴의 경구 투여가 발 두께를 정상 수준으로 감소시켰다(도 10A 및 도 10B). β-카로틴은 발 조직으로 호중구의 MSU-유도 모집을 차단시켰는데, 이는 발 조직의 조직학적 시험 및 발 조직 균질물 내 미엘로퍼록시다제(myeloperoxidase) 활성 분석을 통해 나타냈다(도 10C 및 도 10D). 상기 결과는 β-카로틴의 경구 투여가 마우스에서 요산 유도 급성 통풍의 염증 증상을 완화시킨다는 것을 나타냈다.We have determined whether oral administration of β-carotene suppresses the inflammatory symptoms of gout in an acute gout mouse model. We injected MSU crystals into the hind paws of mice, which increased paw thickness and neutrophil invasion of paw tissue and increased cytokine levels in paw tissue homogenate (FIG. 10). Oral administration of β-carotene reduced foot thickness to normal levels (FIGS. 10A and 10B). β-carotene blocked MSU-induced recruitment of neutrophils into paw tissue, which was shown by histological testing of paw tissue and analysis of myeloperoxidase activity in paw tissue homogenate (FIGS. 10C and 10D). . The results indicated that oral administration of β-carotene alleviated the inflammatory symptoms of uric acid induced acute gout in mice.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. Having described the specific part of the present invention in detail, it is apparent to those skilled in the art that such a specific description is merely a preferred embodiment, thereby not limiting the scope of the present invention. something to do. Therefore, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Binding sites of beta-carotene to NLRP3 PYD domain and screening method for therapeutic agent of gout using same <130> ADP-2018-0128 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 112 <212> PRT <213> Human <400> 1 Met Lys Met Ala Ser Thr Arg Cys Lys Leu Ala Arg Tyr Leu Glu Asp 1 5 10 15 Leu Glu Asp Val Asp Leu Lys Lys Phe Lys Met His Leu Glu Asp Tyr 20 25 30 Pro Pro Gln Lys Gly Cys Ile Pro Leu Pro Arg Gly Gln Thr Glu Lys 35 40 45 Ala Asp His Val Asp Leu Ala Thr Leu Met Ile Asp Phe Asn Gly Glu 50 55 60 Glu Lys Ala Trp Ala Met Ala Val Trp Ile Phe Ala Ala Ile Asn Arg 65 70 75 80 Arg Asp Leu Tyr Glu Lys Ala Lys Arg Asp Glu Pro Lys Trp Gly Ser 85 90 95 Asp Asn Ala Arg Val Ser Asn Pro Thr Val Ile Cys Gln Glu Asp Ser 100 105 110 <110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Binding sites of beta-carotene to NLRP3 PYD domain and screening          method for therapeutic agent of gout using same <130> ADP-2018-0128 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 112 <212> PRT <213> Human <400> 1 Met Lys Met Ala Ser Thr Arg Cys Lys Leu Ala Arg Tyr Leu Glu Asp   1 5 10 15 Leu Glu Asp Val Asp Leu Lys Lys Phe Lys Met His Leu Glu Asp Tyr              20 25 30 Pro Pro Gln Lys Gly Cys Ile Pro Leu Pro Arg Gly Gln Thr Glu Lys          35 40 45 Ala Asp His Val Asp Leu Ala Thr Leu Met Ile Asp Phe Asn Gly Glu      50 55 60 Glu Lys Ala Trp Ala Met Ala Val Trp Ile Phe Ala Ala Ile Asn Arg  65 70 75 80 Arg Asp Leu Tyr Glu Lys Ala Lys Arg Asp Glu Pro Lys Trp Gly Ser                  85 90 95 Asp Asn Ala Arg Val Ser Asn Pro Thr Val Ile Cys Gln Glu Asp Ser             100 105 110

Claims (8)

NLRP3 피린 도메인(PYD)과 후보 화합물을 반응시키는 단계; 및 상기 반응시킨 반응물에서 NLRP3 피린 도메인(PYD)의 Ala-69, Val-72, Trp-73, Tyr-84 및 Glu-91 잔기와 직접 결합하는 후보 화합물을 선별하는 단계를 포함하며, 상기 선별된 후보 화합물은 NLRP3 PYD 및 ASC PYD의 결합을 차단하여 NLRP3 인플라마좀 활성화를 억제하는 것을 특징으로 하는 통풍 치료제의 스크리닝 방법.Reacting the NLRP3 pyrine domain (PYD) with the candidate compound; And selecting candidate compounds that directly bind to Ala-69, Val-72, Trp-73, Tyr-84, and Glu-91 residues of the NLRP3 pyrine domain (PYD) in the reacted reactant. The candidate compound blocks the binding of NLRP3 PYD and ASC PYD to inhibit NLRP3 inflammasome activation. 삭제delete 삭제delete 제1항에 있어서, 상기 선별된 후보 화합물은 β-카로틴(β-carotene)인 것을 특징으로 하는 통풍 치료제의 스크리닝 방법.The method of claim 1, wherein the selected candidate compound is β-carotene. NLRP3 피린 도메인(PYD)과 후보 화합물을 반응시키는 단계; 및 상기 반응시킨 반응물에서 NLRP3 피린 도메인(PYD)의 Ala-69, Val-72, Trp-73, Tyr-84 및 Glu-91 잔기와 직접 결합하는 후보 화합물을 선별하는 단계를 포함하며, 상기 선별된 후보 화합물은 NLRP3 PYD 및 ASC PYD의 결합을 차단하여 NLRP3 인플라마좀 활성화를 억제하는 것을 특징으로 하는 통풍성 염증 질환 치료제의 스크리닝 방법.Reacting the NLRP3 pyrine domain (PYD) with the candidate compound; And selecting candidate compounds that directly bind to Ala-69, Val-72, Trp-73, Tyr-84, and Glu-91 residues of the NLRP3 pyrine domain (PYD) in the reacted reactant. The candidate compound blocks the binding of NLRP3 PYD and ASC PYD to inhibit NLRP3 inflammasome activation. 삭제delete 삭제delete 제5항에 있어서, 상기 선별된 후보 화합물은 β-카로틴(β-carotene)인 것을 특징으로 하는 통풍성 염증 질환 치료제의 스크리닝 방법.The method of claim 5, wherein the selected candidate compound is β-carotene.
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Ju Young Bae et al., 'Crystal Structure of NALP3 Protein Pyrin Domain (PYD) and Its Implications in Inflammasome Assembly', THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 2011, Vol. 286, pp 39528-39536. 1부.*

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