KR102072958B1 - Fusion nano liposome-nucleic acid for quantitative diagnosis of multi ribonucleic acid marker, method for theoretical stability evaluation thereof, uses thereof and preparation method thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 고리형 말단을 가지는 가지형태의 제1핵산구조체; 및 고리형 말단을 가지는 가지형태의 제2핵산구조체가 접합된 핵산 나노 구조체가 표면에 결합된 실리카 구형체를 리포솜 내부에 포함하는, 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체, 상기 나노융합체의 이론적 안정성 평가 방법, 상기 나노융합체를 질병 진단에 활용하는 이미징 시스템, 및 상기 나노융합체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 리포솜-핵산 나노융합체를 이용하여, 다종의 세포주간 RNA 발현 양상 차이의 정량적 비교 및 단일 세포주내 세포간 차이를 확인할 수 있으며, 이를 통해 실제 임상에서 얻어진 세포내에 발현되고 있는 암특이적 RNA 마커의 다중 실시간 진단이 가능해지고 이를 토대로 하여 진단 및 치료에 필요한 정보를 용이하게 얻을 수 있는 장점을 가진다.The present invention provides a branched first nucleic acid structure having a cyclic terminal; Liposome-nucleic acid nano fusion for quantitative diagnosis of multiple ribonucleic acid markers, wherein the nucleic acid nanostructures having a branched second nucleic acid structure having a cyclic terminal are bonded to the surface thereof in a liposome. The present invention relates to a theoretical stability evaluation method, an imaging system utilizing the nanofusions for disease diagnosis, and a manufacturing method of the nanofusions. Using liposome-nucleic acid nanofusions according to the present invention, quantitative comparison of RNA expression patterns among various cell lines and differences between cells in a single cell line can be confirmed, and thus cancer-specific expression in cells obtained in actual clinical trials. Multiple real-time diagnosis of RNA markers is possible, and based on this, it is possible to easily obtain information necessary for diagnosis and treatment.
Description
본 발명은 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포솜-핵산 나노융합체, 상기 나노융합체 분자동력학적 시뮬레이션 기법을 이용하여 안정성을 확인하고 이를 질병 진단에 활용하는 이미징 시스템, 질병 진단 방법, 및 상기 나노융합체의 제조방법에 관한 것이다.The present invention provides a liposome-nucleic acid nanofusion for quantitative diagnosis of multiple ribonucleic acid markers, an imaging system using the nanofusion molecular dynamics simulation technique to confirm stability and use it for disease diagnosis, a disease diagnosis method, and a method of manufacturing the nanofusion substance. It is about.
현재 대부분의 암 진단은 금속, 고분자 중합체 등 인체에 유해한 물질을 사용하고 정확한 진단을 위해서 적게는 3일, 많게는 한 달 이상이 소요된다. 그리고 대부분의 진단체가 가시광선 파장대의 빛을 발생하지 않기 때문에 암이 상당히 진행되어 종양을 형성하기 전까지는 눈으로만 암을 진단하는 데에 한계가 있다. 또한 같은 이유로 진단이 생체 내에서 실시간으로 진행되는 데에 한계가 발생한다.Currently, most cancer diagnosis uses substances that are harmful to the human body, such as metals and polymers, and it takes as little as 3 days and as many as one month or more for accurate diagnosis. In addition, since most diagnostic subjects do not emit light in the visible wavelength range, there is a limit in diagnosing cancer only by eye until cancer progresses significantly and tumors are formed. Also, for the same reason, there is a limit to the real-time diagnosis in a living body.
이에 따라 최근에는 인체 유해성을 최소화하기 위해 생체 친화적 물질로 진단체를 제작하는 연구가 상당수 진행되고 있다. 핵산은 이들 중 많은 주목을 받고 있는 물질로 나노생명공학기술을 통해 다양한 형태로 제작되고 있다. 이렇게 만들어진 핵산 나노구조체에 형광체를 붙여 암 진단에 사용하는 기술이 크게 이목을 끌고 있다.Accordingly, in recent years, a large number of studies have been conducted to manufacture a diagnostic object using a bio-friendly material in order to minimize harmfulness to the human body. Nucleic acid is a material that is receiving a lot of attention among these, and it is produced in various forms through nano-biotechnology. The technology used to diagnose cancer by attaching a phosphor to the nucleic acid nanostructure thus created is attracting great attention.
그러나 핵산이 생체를 구성하는 물질인 만큼 생체 내에 삽입되었을 시 효소에 의해 부서지게 되어 본래 기능을 상실하게 될 가능성이 매우 높다. 또한 진단체가 암 세포 뿐 아니라 일반 세포에까지 비 특이적으로 결합하는 것을 최소화하기 위해 표적물질과 결합시키는 과정이 요구된다. 하지만 현재까지 상기 요구사항들을 동시에 만족시키는 연구는 아직까지 많이 진행되고 있지 않은 실정이다. 게다가 삼중음성유방암 등과 같이 특이적인 표적체가 발현되지 않는 암세포는 진단에 상당한 어려움을 겪고 있다.However, since nucleic acid is a material constituting a living body, it is highly likely that when inserted into a living body, it is broken by enzymes and loses its original function. In addition, in order to minimize the non-specific binding of the diagnostic object to not only cancer cells but also general cells, a process of binding to a target substance is required. However, until now, research that satisfies the above requirements at the same time has not been conducted much. In addition, cancer cells that do not express a specific target, such as triple negative breast cancer, are experiencing considerable difficulty in diagnosis.
한편, 최근 대상 세포의 RNA의 발현 양상에 따라 암 전주기에 해당하는 진단이 가능한 것으로 밝혀지고 있으며, 그중에서 특정 miRNA의 발현 양상은 초기암에서 빠르게 변화하는 것이 알려져있다. 이로 인해 진단 마커로서 miRNA의 중요성이 나날이 부각되고 있다. 또한 한 부위에서 발생한 암조직 내부에 존재하는 종양 이질성 (Tumor heterogeneity) 으로 인해 정밀한 치료가 어려운 실정으로, 정밀한 환자 맞춤형 치료를 위해서 세포 간 차이를 확인하여 시공적인 (Spatio-temporal) 정보를 얻는 것이 중요하게 여겨지고 있다. On the other hand, it has been recently found that diagnosis corresponding to the entire cancer cycle is possible according to the expression pattern of RNA in the target cell, and among them, it is known that the expression pattern of specific miRNA changes rapidly in early cancer. For this reason, the importance of miRNA as a diagnostic marker is rising day by day. In addition, it is difficult to obtain precise treatment due to the tumor heterogeneity that exists inside the cancer tissue in one area. For precise patient-specific treatment, it is important to check the differences between cells and obtain spatio-temporal information. Is considered to be.
이러한 필요성에 근거하여 단일 세포 실시간 중합효소 연쇄반응 (Single cell real time polymerase chain reaction), 고효율 시퀀싱 (High-throughput sequencing) 등 기술들이 개발되고 있으나, 이 역시 분석에 필요한 시간 및 비용이 크다는 뚜렷한 한계를 가지고 있다. 또한 위의 문제점을 극복하기 위하여 나노기술을 이용한 세포내 실시간 분석을 위해 다양한 진단 시스템들이 보고되고 있으나(국내등록특허 제1464100호), 진단 시스템의 세포내 전달이 세포간 특성으로 크게 좌우되기 때문에 세포 종류에 따른 정량적 비교가 불가능하며, 이로 인해 실질적인 임상 적용에 문제가 있다.Based on this necessity, technologies such as single cell real time polymerase chain reaction and high-throughput sequencing are being developed, but this also has a distinct limitation in that the time and cost required for analysis are large. Have. In addition, in order to overcome the above problems, various diagnostic systems have been reported for real-time intracellular analysis using nanotechnology (Korean Patent No. 1464100). Quantitative comparisons according to types are not possible, and this poses a problem in practical clinical application.
이에, 다종의 세포주 간 RNA 발현 양상 차이를 비교하여, 빠르게 암을 진단할 수 있는 고성능 암 진단체가 요구되고 있는 실정이다.Accordingly, there is a need for a high-performance cancer diagnostic body capable of rapidly diagnosing cancer by comparing differences in RNA expression patterns between various cell lines.
본 발명자들은 종래기술의 문제점을 극복하기 위하여, 고효율, 저비용인 동시에 세포 간의 정량 비교가 가능한 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포솜-핵산 나노융합체를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.In order to overcome the problems of the prior art, the present inventors completed the present invention by developing a liposome-nucleic acid nanofusion body for quantitative diagnosis of multiple ribonucleic acid markers capable of quantitative comparison between cells with high efficiency and low cost.
따라서 본 발명의 목적은 고리형 말단을 가지는 가지형태의 제1핵산구조체; 및 고리형 말단을 가지는 가지형태의 제2핵산구조체가 접합된 핵산 나노 구조체가 표면에 결합된 실리카 구형체를 리포솜 내부에 포함하는, 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체를 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is a branched first nucleic acid structure having a cyclic end; And it is to provide a liposome-nucleic acid nanofusion body for quantitative diagnosis of multiple ribonucleic acid markers, including a silica spherical body in which a nucleic acid nanostructure to which a branched second nucleic acid structure is conjugated with a cyclic end is bonded to the surface of the liposome.
본 발명의 다른 목적은 상기 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체를 포함하는 생체 진단 이미징 시스템을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a biodiagnostic imaging system including a liposome-nucleic acid nanofusion body for quantitative diagnosis of the multiple ribonucleic acid markers.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포솜-핵산 나노융합체의 제조방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for preparing a liposome-nucleic acid nanofusion body for quantitative diagnosis of the multiple ribonucleic acid marker.
본 발명의 또다른 목적은 상기 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포솜-핵산 나노융합체의 안정성을 이론적으로 평가하는 평가방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide an evaluation method for theoretically evaluating the stability of the liposome-nucleic acid nanofusion body for quantitative diagnosis of the multiple ribonucleic acid marker.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the problems mentioned above, and other problems that are not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 고리형 말단을 가지는 가지형태의 제1핵산구조체; 및 고리형 말단을 가지는 가지형태의 제2핵산구조체가 접합된 핵산 나노 구조체가 표면에 결합된 실리카 구형체를 리포솜 내부에 포함하는, 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체를 제공한다.In order to achieve the object of the present invention as described above, the present invention provides a branched first nucleic acid structure having a cyclic end; And it provides a liposome-nucleic acid nanofusion body for quantitative diagnosis of multiple ribonucleic acid markers, including a silica sphere in which a nucleic acid nanostructure to which a branched second nucleic acid structure is conjugated having a cyclic end is bonded to the surface thereof is included in the liposome.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제1핵산구조체는 서열번호 1 내지 3의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 선형핵산들이 Y자 가지형태로 결합한 형태인 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the first nucleic acid structure may be a form in which linear nucleic acids selected from the group consisting of nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3 are combined in a Y-branched form.
본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 제2핵산구조체는 서열번호 4 내지 6의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 선형핵산들이 Y자 가지형태로 결합한 형태인 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the second nucleic acid structure may be a form in which linear nucleic acids selected from the group consisting of nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 4 to 6 are combined in a Y-shaped branch.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 선형핵산은 5' 말단에 형광체를 더 포함하는 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the linear nucleic acid may further include a phosphor at the 5'end.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 제1핵산구조체는 고리형 말단이 표적 RNA와 상보적 서열을 가지는 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the first nucleic acid structure may include a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 whose cyclic end has a sequence complementary to a target RNA.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 제2핵산구조체는 고리형 말단이 표적 RNA와 상보적 서열을 가지는 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.In still another embodiment of the present invention, the second nucleic acid structure may include a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 whose cyclic end has a sequence complementary to the target RNA.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 제1핵산구조체 및 제2핵산구조체는 형광체 및 소광제가 추가로 표지된 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the first and second nucleic acid structures may be labeled with a phosphor and a quencher.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 핵산구조체는 표적 RNA와 상보적서열을 가지는 염기서열의 한 쪽 말단에 소광제가 추가로 표지된 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the nucleic acid structure may be a quencher further labeled at one end of a nucleotide sequence having a complementary sequence to the target RNA.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 실리카 구형체는 50 내지 90 nm인 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the silica sphere may be 50 to 90 nm.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 실리카 구형체는 핵산 나노 구조체가 표면에 결합되기 전에, 아미노프로필 트리메톡시실란(Aminopropyl trimethoxysilane) 및 사이아누릭 클로라이드 (Cyanuric chloride)를 순차적으로 처리하여 표면개질된 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the silica spheres are surface treated by sequentially treating aminopropyl trimethoxysilane and cyanuric chloride before the nucleic acid nanostructure is bonded to the surface. It may be modified.
본 발명의 또다른 실시예에 있어서, 상기 리포솜은 양이온성 지질로 이루어진 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the liposome may be composed of a cationic lipid.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 양이온성 지질은 DOTAP(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane) 및 콜레스테롤을 구성 성분으로 하는 양이온성 지질로 이루어진 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the cationic lipid may be composed of a cationic lipid comprising DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane) and cholesterol as constituent components.
또한, 본 발명은 상기 리포솜-핵산 나노융합체를 포함하는 생체 진단 이미징 시스템을 제공한다.In addition, the present invention provides a biodiagnostic imaging system including the liposome-nucleic acid nanofusion body.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시스템은 세포 내 형광을 측정하는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the system may measure intracellular fluorescence.
또한, 본 발명은 질병의 진단을 필요로 하는 개체에 상기 리포솜-핵산 나노융합체를 투여하고 형광을 측정하는 단계를 포함하는 질병 진단 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for diagnosing a disease comprising administering the liposome-nucleic acid nanofusion to an individual in need of diagnosis and measuring fluorescence.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 질병은 암일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the disease may be cancer.
본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 투여는 경구 투여, 정맥 주사, 복강 주사, 근육 주사, 동맥 주사 또는 피하 주사를 통해 이루어지는 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the administration may be performed through oral administration, intravenous injection, intraperitoneal injection, intramuscular injection, arterial injection, or subcutaneous injection.
이에 더하여, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체의 제조방법을 제공한다:In addition, the present invention provides a method for preparing a liposome-nucleic acid nanofusion body for quantitative diagnosis of multiple ribonucleic acid markers comprising the following steps:
고리형 말단을 가지는 가지형태의 제1핵산구조체, 및 고리형 말단을 가지는 가지형태의 제2핵산구조체를 제조한 후, 리가아제 효소를 이용하여 서로 접합시켜 핵산 나노 구조체를 제조하는 단계(S1);Preparation of a branched first nucleic acid structure having a cyclic end and a branched second nucleic acid structure having a cyclic end, and then conjugating to each other using a ligase enzyme to prepare a nucleic acid nanostructure (S1) ;
용매에 실리케이트 용액을 첨가하여 실리카 나노입자체를 합성하는 단계(S2);Synthesizing silica nanoparticles by adding a silicate solution to a solvent (S2);
상기 S2 단계의 나노입자체에 아미노프로필 트리메톡시실란(Aminopropyl trimethoxysilane) 및 사이아누릭 클로라이드 (Cyanuric chloride)를 순차처리하는 단계(S3);Sequentially treating the nanoparticles of step S2 with aminopropyl trimethoxysilane and cyanuric chloride (S3);
상기 S3 단계의 나노입자체와 S1 단계의 핵산 나노 구조체를 반응시켜 핵산 나노구조체를 제조하는 단계(S4);Preparing a nucleic acid nanostructure by reacting the nanoparticles of step S3 with the nucleic acid nanostructures of step S1 (S4);
상기 S4 단계의 핵산 나노구조체에 양이온성 지질을 첨가한 후 초음파 처리하여 리포좀-핵산 나노융합체를 제조하는 단계(S5).The step of preparing a liposome-nucleic acid nanofusion body by adding a cationic lipid to the nucleic acid nanostructure of step S4 and then ultrasonicating it (S5).
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 S2 단계의 용매는 메탄올, 에탄올, 증류수, 및 암모니아수를 포함하는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the solvent in step S2 may include methanol, ethanol, distilled water, and aqueous ammonia.
본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 메탄올 및 에탄올은 6 : 4 내지 8 : 2의 부피비율로 혼합되는 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the methanol and ethanol may be mixed in a volume ratio of 6:4 to 8:2.
아울러, 본 발명은 상기 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체의 안정성을 이론적으로 평가하는 평가방법으로,In addition, the present invention is an evaluation method for theoretically evaluating the stability of the liposome-nucleic acid nanofusion body for quantitative diagnosis of the multiple ribonucleic acid marker,
상기 방법은 나노융합체 내부에서 발생하는 수소결합 에너지를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 평가방법을 제공한다.The method provides an evaluation method, characterized in that it comprises the step of measuring the hydrogen bond energy generated inside the nanofusion.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 측정은 35 내지 40℃에서 수행되는 것일 수 있다.In an embodiment of the present invention, the measurement may be performed at 35 to 40°C.
본 발명에 따른 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포솜-핵산 나노융합체는 다종의 세포주간 RNA 발현 양상 차이의 정량적 비교 및 단일 세포주내 세포간 차이를 확인할 수 있는 효과를 가진다. 이를 통해 실제 임상에서 얻어진 세포내에 발현되고 있는 암특이적 RNA 마커의 다중 실시간 진단이 가능해지고, 이를 토대로 하여 진단 및 치료에 필요한 정보를 쉽고 빠르게 얻을 수 있는 장점이 있다. The liposome-nucleic acid nanofusion body for quantitative diagnosis of multiple ribonucleic acid markers according to the present invention has an effect of being able to quantitatively compare differences in RNA expression patterns between various cell lines and to identify differences between cells within a single cell line. Through this, it is possible to perform multiple real-time diagnosis of cancer-specific RNA markers expressed in cells obtained in actual clinical practice, and based on this, there is an advantage that information necessary for diagnosis and treatment can be easily and quickly obtained.
특히 세포 내에서 그 농도가 절대적으로 적은 마이크로 리보핵산을 표적으로 하여 고감도 진단이 가능하므로, 상대적으로 표적물질이 많이 발현되지 않는 초기 암의 진단 및 예후를 예측하는 것이 가능하며, 세포막 내외부에 발현되는 다양한 표적물질을 표적화할 수 있기 때문에 삼중음성유방암 등과 같이 진단이 어려운 암종 역시 용이하게 진단이 가능하다.In particular, it is possible to diagnose and predict the prognosis of early cancers in which a relatively large amount of target substances are not expressed by targeting micro-ribonucleic acid whose concentration is absolutely small in cells. Since it can target various target substances, it is also possible to easily diagnose carcinomas that are difficult to diagnose, such as triple negative breast cancer.
이에 더하여, 다양한 형광체를 사용하여 다양한 종류의 miRNA 농도에 따른 다중 비색(Multi-colorimetric) 진단 평가가 가능하고, 단일 세포 내에서 다양한 종류의 miRNA 진단을 통해 세포 간 이종성(Heterogeneity)을 평가할 수 있는 특징이 있으며, 융합체 표면의 리포솜 이중막이 생체 내에서 진단체가 분해되는 것을 늦춰주기 때문에 생체 내 적용이 용이한 장점이 있다.In addition, it is possible to evaluate multi-colorimetric diagnosis according to various types of miRNA concentrations by using various phosphors, and to evaluate heterogeneity between cells through diagnosis of various types of miRNAs within a single cell. In addition, since the liposomal double membrane on the surface of the fusion slows the decomposition of the diagnostic body in vivo, it is easy to apply in vivo.
도 1은 본 발명의 세포내 실시간 다중 RNA 마커 진단을 위한 리포좀-핵산 나노융합체의 제조방법 및 진단 방법을 도시적으로 나타낸 도면이다.
도 2의 위쪽은 핵산 나노 구조체(afc-DNA)의 제조방법을 나타낸 것이고, 아래쪽은 핵산 나노 구조체의 합성을 전기영동기법을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 핵산 나노구조체의 삼차원적 구조를 확인하기 위한 시뮬레이션 조건을 나타낸 도면이다.
도 4는 핵산 나노구조체의 삼차원적 구조를 도 3의 조건에 따라 oxDNA 프로그램을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 실리카 나노입자체의 표면에 핵산 나노구조체를 접합하는 과정과 결과를 나타낸 도면으로, 5a는 접합 과정의 모식도를 나타낸 것이고, 5b는 온도에 따른 결합 안정성(37도)을 확인한 결과이며, 5c는 표면 처리 단계별 입자체 크기 변화를 나타낸 것이고, 5d는 실리카 표면에 붙은 핵산 나노구조체를 형광현미경을 통해 시각화한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 리포좀-핵산 나노융합체의 제조 단계에 따른 크기와, 크기에 따른 형광 시그널 증폭 및 표면 전하 변화를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명에서 제조된 리포좀-핵산 나노융합체를 두가지 종류(MCF-7 및 SK-BR-3)의 유방암 세포주에 처리하여, 세포 내 전달이 잘 이루어지는지를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 나노융합체가 다중 진단능을 가지는지 확인한 결과로, 5종의 유방암 세포주(HCC-1937, MCF-7, MDA-MB-453, MDA-MB-231 및 SK-BR-3)를 대상으로 본 발명의 리포좀-핵산 나노융합체를 처리한 후, 유세포 분석을 통해 얻어지는 결과를 현재 표준적으로 사용되고 있는 RT-PCR의 결과와 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9a는 대상 miRNA를 핵산 나노구조체에 처리하고, 그로 인해 발생하는 형광시그널의 증대를 측정한 결과를 나타낸 것이고, 도 9b는 대상 miRNA를 다양한 농도로 혼합하고, 상기 혼합액에의 농도에 따른 형광시그널의 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이며, 도 9c는 상기 형광시그널의 변화를 색깔로 변환한 결과를 나타낸 도면이다.1 is a diagram schematically showing a method for preparing a liposome-nucleic acid nanofusion body and a diagnostic method for diagnosing an intracellular multi-RNA marker in real time according to the present invention.
The upper part of FIG. 2 shows a method of manufacturing a nucleic acid nanostructure (afc-DNA), and the lower part is a view showing the result of confirming the synthesis of the nucleic acid nanostructure through an electrophoresis technique.
3 is a diagram showing simulation conditions for confirming the three-dimensional structure of a nucleic acid nanostructure.
FIG. 4 is a diagram showing a result of confirming the three-dimensional structure of a nucleic acid nanostructure through an oxDNA program according to the conditions of FIG. 3.
5 is a diagram showing a process and result of bonding a nucleic acid nanostructure to the surface of a silica nanoparticle, 5a shows a schematic diagram of the bonding process, 5b is a result of confirming the binding stability according to temperature (37 degrees), 5c is a view showing the particle size change in each step of surface treatment, and 5d is a view showing the result of visualizing the nucleic acid nanostructure attached to the silica surface through a fluorescence microscope.
Figure 6 is a view showing the size according to the manufacturing step of the liposome-nucleic acid nanofusion body of the present invention, the result of confirming the fluorescence signal amplification and surface charge change according to the size.
7 is a diagram showing the results of confirming whether intracellular delivery is performed well by treating the liposome-nucleic acid nanofusion body prepared in the present invention on two types of breast cancer cell lines (MCF-7 and SK-BR-3).
Figure 8 is a result of confirming whether the nanofusion body of the present invention has multiple diagnostic capabilities, 5 kinds of breast cancer cell lines (HCC-1937, MCF-7, MDA-MB-453, MDA-MB-231 and SK-BR-3 ), the liposome-nucleic acid nanofusion body of the present invention is treated, and the result obtained through flow cytometry is compared with the result of RT-PCR, which is currently used as a standard.
9A shows the result of measuring the increase of the fluorescent signal generated by processing the target miRNA on the nucleic acid nanostructure, and FIG. 9B is a fluorescent signal according to the concentration in the mixed solution after mixing the target miRNA at various concentrations. It shows the result of confirming the change of, and FIG. 9C is a view showing the result of converting the change of the fluorescent signal into color.
본 발명자들은 실시간 세포내 다중 RNA 마커 진단이 가능한 암세포 진단체를 개발하기 위해 연구한 결과 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors have completed the present invention as a result of researching to develop a cancer cell diagnostic body capable of real-time intracellular multi-RNA marker diagnosis.
따라서 본 발명은 고리형 말단을 가지는 가지형태의 제1핵산구조체; 및 고리형 말단을 가지는 가지형태의 제2핵산구조체가 접합된 핵산 나노 구조체가 표면에 결합된 실리카 구형체를 리포솜 내부에 포함하는, 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체 및 이를 포함하는 생체 진단 이미징 시스템을 제공하는 것을 그 특징으로 한다.Accordingly, the present invention provides a branched first nucleic acid structure having a cyclic end; And a liposome-nucleic acid nanofusion body for quantitative diagnosis of multiple ribonucleic acid markers, including a silica sphere in which a nucleic acid nanostructure to which a branched second nucleic acid structure is conjugated with a cyclic end is conjugated to the surface thereof is contained inside the liposome. It is characterized by providing a diagnostic imaging system.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체의 제조방법을 제공한다:In addition, the present invention provides a method for preparing a liposome-nucleic acid nanofusion body for quantitative diagnosis of multiple ribonucleic acid markers comprising the following steps:
고리형 말단을 가지는 가지형태의 제1핵산구조체, 및 고리형 말단을 가지는 가지형태의 제2핵산구조체를 제조한 후, 리가아제 효소를 이용하여 서로 접합시켜 핵산 나노 구조체를 제조하는 단계(S1);Preparation of a branched first nucleic acid structure having a cyclic end and a branched second nucleic acid structure having a cyclic end, and then conjugating to each other using a ligase enzyme to prepare a nucleic acid nanostructure (S1) ;
용매에 실리케이트 용액을 첨가하여 실리카 나노입자체를 합성하는 단계(S2);Synthesizing silica nanoparticles by adding a silicate solution to a solvent (S2);
상기 S2 단계의 나노입자체에 아미노프로필 트리메톡시실란(Aminopropyl trimethoxysilane) 및 사이아누릭 클로라이드 (Cyanuric chloride)를 순차처리하는 단계(S3);Sequentially treating the nanoparticles of step S2 with aminopropyl trimethoxysilane and cyanuric chloride (S3);
상기 S3 단계의 나노입자체와 S1 단계의 핵산 나노 구조체를 반응시켜 핵산 나노구조체를 제조하는 단계(S4);Preparing a nucleic acid nanostructure by reacting the nanoparticles of step S3 with the nucleic acid nanostructures of step S1 (S4);
상기 S4 단계의 핵산 나노구조체에 양이온성 지질을 첨가한 후 초음파 처리하여 리포좀-핵산 나노융합체를 제조하는 단계(S5).The step of preparing a liposome-nucleic acid nanofusion body by adding a cationic lipid to the nucleic acid nanostructure of step S4 and then ultrasonicating it (S5).
이때, 상기 제조방법은 본 발명에 따른 리포솜-핵산 나노융합체를 제조할 수 있다면, 적절하게 단계의 순서 및/또는 구성을 변경할 수 있으며 상기 단계에 제한되는 것은 아니다.At this time, the manufacturing method is not limited to the above steps, as long as the liposome-nucleic acid nanofusion body according to the present invention can be prepared, the sequence and/or configuration of the steps may be appropriately changed.
본 발명에 따른 리포솜-핵산 나노융합체는 질병의 진단을 위해 사용될 수 있으며, 이를 위해 본 발명의 일실시예에서는 세포 내에서 구현 가능하도록 형광체를 표지한 핵산구조체 2종을 실리카 구형체에 부착한 다음 리포좀으로 상기 구형체 표면을 코팅하였다(도 1 참조). 이때, 본 발명의 일실시예에서는 지지를 위한 구형체로 실리카를 이용하였으나, 생체 내 사용가능한 나노사이즈의 구형체라면 이에 제한되지 않고 사용할 수 있으며, 제조된 나노융합체의 크기는 체내에 주입할 수 있는 크기 및 모양이라면 적절하게 조절 가능 하지만, 바람직하게는 직경이 50 nm 내지 90 nm인 구형으로 제조할 수 있다.The liposome-nucleic acid nanofusion body according to the present invention can be used for diagnosis of a disease. For this purpose, in an embodiment of the present invention, two kinds of fluorescently labeled nucleic acid structures are attached to a silica sphere so that it can be implemented in a cell. The surface of the spherical body was coated with liposomes (see FIG. 1). At this time, in one embodiment of the present invention, silica is used as a spherical body for support, but any nano-sized spherical body that can be used in vivo is not limited thereto, and the size of the prepared nanofusion body can be injected into the body. The size and shape can be appropriately adjusted, but preferably, it can be made into a sphere having a diameter of 50 nm to 90 nm.
본 발명에서 제1핵산구조체 및 제2핵산구조체는 점착성 말단을 가지는 선형핵산이 Y자 가지형태로 결합하거나 상기 Y자 가지형태로 반복 결합하게 함으로써 나뭇가지 형태로 제조할 수 있으며, 상기 점착성 말단이 가지는 최소 3개의 5' 말단에 형광체를 표지하는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the first nucleic acid structure and the second nucleic acid structure can be prepared in the form of a tree branch by allowing a linear nucleic acid having an adhesive end to be bonded in a Y-branched form or repeatedly bonded in the Y-branched form, and the sticky end is The branch may be to label a phosphor at at least three 5'ends, but is not limited thereto.
상기 핵산구조체는 고리형 말단을 가지는 것으로, 세포 내부 신호를 검출하기 위하여, 세포 내 표적 메신저 리보핵산(mRNA) 또는 표적 마이크로 리보핵산(miRNA)과 상보적으로 결합할 수 있도록 상기 표적 리보핵산과 상보적인 서열 및 고리형 핵산구조체로 묶이게 하는 짧은 서열을 포함하는 핵산을 Y자 가지의 어느 한 쪽 이상의 말단에 부착한 것일 수 있다. 이때, 상기 표적 리보핵산과 상보적인 서열의 한 쪽 말단에 소광제를 추가로 표지함으로써, 상기 표적 리보핵산과 결합하는 고리형 핵산구조체가 형광체와 소광제 사이의 포스터 공명에너지전달현상(Forster Resonance Energy Transfer, FRET)을 토대로 작동될 수 있도록 하였다. 즉, 상기 고리형 핵산구조체가 표적 리보핵산과 결합하지 않으면, 포스터공명에너지전달효과로 인해 빛이 발생하지 않고, 결합하면 형광체에서 빛이 발생할 수 있도록 하였다.The nucleic acid structure has a cyclic end, and is complementary to the target ribonucleic acid so that it can complementarily bind to a target messenger ribonucleic acid (mRNA) or a target micro ribonucleic acid (miRNA) in a cell in order to detect an intracellular signal. Nucleic acid including a short sequence that binds to a typical sequence and a cyclic nucleic acid structure may be attached to one or more ends of the Y-branched branch. At this time, by additionally labeling a quencher at one end of the sequence complementary to the target ribonucleic acid, the cyclic nucleic acid structure binding to the target ribonucleic acid is Foster Resonance Energy transfer between the phosphor and the quencher. Transfer, FRET). That is, when the cyclic nucleic acid structure does not bind to the target ribonucleic acid, light is not generated due to the Foster resonance energy transfer effect, and when the cyclic nucleic acid structure is combined, light can be generated from the phosphor.
바람직하게 상기 형광체는 플루오레신(fluorescein), 텍사스레드(TexasRed), 로다민(rhodamine), 알렉사(alexa), 시아닌(cyanine), 보디피(BODIPY) 또는 쿠마린(coumarin)일 수 있고, 더욱 바람직하게는 6-FAM, Texas 615, Alexa Fluor 488, Cy5, 또는 Cy3일 수 있으며, 바람직하게 상기 소광제는 탐라(TAMRA), 비에이치큐(BHQ), 아이오와블랙 알큐(Iowa Black RQ) 또는 엠지비엔에프큐(MGBNFQ, molecular grove binding non-fluorescence quencher)일 수 있고, 더욱 바람직하게는 Iowa Black RQ 일 수 있으나, 생체 내 사용 가능한 형광체 또는 소광제라면 이에 한정되지 않고 당업자가 적절하게 변경하여 사용할 수 있다.Preferably, the phosphor may be fluorescein, Texas Red, rhodamine, alexa, cyanine, BODIPY, or coumarin, more preferably 6-FAM, Texas 615, Alexa Fluor 488, Cy5, or Cy3 may be, preferably, the quencher is Tamra (TAMRA), BHQ (BHQ), Iowa Black RQ (Iowa Black RQ) or MGBNFC It may be (MGBNFQ, molecular grove binding non-fluorescence quencher), more preferably Iowa Black RQ, but if it is a phosphor or quencher that can be used in vivo, it is not limited thereto, and a person skilled in the art may appropriately change and use it.
본 발명의 리포솜은 사용 목적에 따라 세포와의 상호작용을 조절할 수 있도록 지질조성을 달리할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 표적 세포에 비특이적으로 세포막과 융합하여 본 발명에 따른 리포솜-핵산 나노융합체가 세포질 내로 유입될 수 있도록 양전하를 띄는 지질로 리포솜을 제조하였으며, 바람직하게 상기 양전하를 띄는 지질은 DOTAP(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane)를 이용하여 제조할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. The liposome of the present invention may have a different lipid composition according to the purpose of use so as to control the interaction with cells. In one embodiment of the present invention, a liposome was prepared with a positively charged lipid so that the liposome-nucleic acid nanofusion body according to the present invention could be introduced into the cytoplasm by nonspecific fusion with the cell membrane to the target cell, preferably the positively charged lipid May be prepared using DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane), but is not limited thereto.
또한, 본 발명의 리포솜-핵산형광 융합체는 동일한 용액(용매)에 각각 첨가한 핵산나노융합체(제1핵산구조체 및 제2핵산구조체가 접합된 핵산 나노구조체가 표면에 결합된 실리카 구형체) 및 리포솜을 혼합함으로써 제조될 수 있으며, 바람직하게는 핵산 나노융합체가 표면 처리된 실리카 나노입자체 및 리포솜의 혼합 중량비는 제한이 없으며, 본 발명의 일실시예에서와 같이 핵산 나노융합체가 포함된 용액 및 리포솜이 포함된 용액을 8:7의 무게비로 혼합할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 이때, 동일한 용액(용매)를 사용해야 삼투압에 의한 리포솜의 파열을 방지할 수 있으며, 바람직하게 상기 용액은 증류수 또는 PBS(Phosphate buffer saline)와 같은 인산염 용액을 포함하는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.In addition, the liposome-nucleic acid fluorescent fusion body of the present invention is a nucleic acid nanofusion body (a silica sphere in which a nucleic acid nanostructure to which the first and second nucleic acid structures are conjugated) and liposomes added to the same solution (solvent) respectively. It can be prepared by mixing, and preferably, the mixing weight ratio of the silica nanoparticles and liposomes surface-treated with the nucleic acid nanofusion is not limited, and as in an embodiment of the present invention, a solution and liposome containing a nucleic acid nanofusion body The included solution may be mixed in a weight ratio of 8:7, but is not limited thereto. At this time, the same solution (solvent) may be used to prevent the liposome from rupturing due to osmotic pressure, and preferably, the solution may include distilled water or a phosphate solution such as PBS (Phosphate buffer saline), but is not limited thereto.
또한, 본 발명의 S2 단계의 용매는 메탄올, 에탄올, 증류수, 및 암모니아수를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 메탄올 및 에탄올은 6 : 4 내지 8 : 2의 부피비율로 혼합되는 것일 수 있다.In addition, the solvent of step S2 of the present invention may include methanol, ethanol, distilled water, and aqueous ammonia, and the methanol and ethanol may be mixed in a volume ratio of 6:4 to 8:2.
본 발명에 따른 리포솜-핵산 나노융합체는 제1핵산구조체와 제2핵산구조체의 말단에 상이한 색조의 형광체를 표지함으로써, 상기 색조의 발현에 따라 정량적 진단이 가능하도록 한 특징이 있다.The liposome-nucleic acid nanofusion body according to the present invention is characterized by labeling phosphors of different shades at the ends of the first and second nucleic acid structures, thereby enabling quantitative diagnosis according to the expression of the color tone.
따라서 본 발명의 리포솜-핵산 나노융합체는 생체 진단 이미징 시스템으로 활용될 수 있으며, 상기 시스템은 다중 RNA 마커를 포획하여 특이적인 형광물질의 활성화시킴으로써, miRNA 농도에 따른 형광 시그널 변화 및 색상 환산에 따라, 세포간 정량 비교가 가능한 특징을 가지는 것이다.Therefore, the liposome-nucleic acid nanofusion body of the present invention can be used as a biodiagnostic imaging system, and the system captures multiple RNA markers and activates a specific fluorescent substance, according to changes in fluorescence signal and color conversion according to miRNA concentration, It has a feature that allows quantitative comparison between cells.
이에 더하여, 본 발명은 질병의 진단을 필요로 하는 개체에 상기 리포솜-핵산 나노융합체를 투여하고 세포 내 형광을 측정하는 단계를 포함하는 질병 진단 방법을 제공할 수 있다. 상기 투여는 경구 투여, 정맥 주사, 복강 주사, 근육 주사, 동맥 주사 또는 피하 주사 방법을 통해 이루어질 수 있으며, 상기 개체란 질병의 진단을 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간, 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 또는 소 등의 포유류를 의미한다. 또한, 상기 진단 방법은 진단을 필요로 하는 질병의 종류에 따라 핵산 서열을 변경하고 리포솜-핵산 형광 나노융합체를 제조할 수 있기 때문에 어느 하나의 질병에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 암 진단을 목적으로 하는 것일 수 있고, 가장 바람직하게는 본 발명의 일실시예에 따라 유방암 진단을 목적으로 하는 것일 수 있다.In addition, the present invention can provide a method for diagnosing a disease comprising administering the liposome-nucleic acid nanofusion to an individual in need of diagnosis and measuring intracellular fluorescence. The administration may be performed by oral administration, intravenous injection, intraperitoneal injection, intramuscular injection, arterial injection or subcutaneous injection method, and the subject means a subject in need of diagnosis of a disease, and more specifically, human or non- -Means mammals such as human primates, mice, rats, dogs, cats, horses, or cows. In addition, the diagnostic method is not limited to any one disease, but is not limited to any one disease, since it is possible to change the nucleic acid sequence according to the type of disease to be diagnosed and prepare a liposome-nucleic acid fluorescent nanofusion body, but is preferably for the purpose of cancer diagnosis. It may be, and most preferably may be for the purpose of breast cancer diagnosis according to an embodiment of the present invention.
나아가 본 발명의 리포솜-핵산 형광 나노융합체는 내부가 비어 있어, 다양한 물질을 포함하도록 제조할 수 있다. 내부에 포함할 수 있는 물질에는 제한이 없으나, 바람직하게는 치료제를 포함하도록 함으로써 생체 진단 이미징과 동시에 치료용 시스템으로 활용할 수 있다.Furthermore, the liposome-nucleic acid fluorescent nanofusion body of the present invention has an empty interior, so that it can be prepared to contain various materials. There is no limitation on the material that can be included in the interior, but preferably, by including a therapeutic agent, it can be utilized as a system for treatment at the same time as biodiagnostic imaging.
아울러, 본 발명은 상기 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체의 안정성을 이론적으로 평가하는 평가방법으로, 상기 방법은 나노융합체 내부에서 발생하는 수소결합 에너지를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 평가방법을 제공할 수 있다.In addition, the present invention is an evaluation method for theoretically evaluating the stability of the liposome-nucleic acid nanofusion body for quantitative diagnosis of the multiple ribonucleic acid marker, the method comprising the step of measuring the hydrogen bonding energy generated inside the nanofusion body It is possible to provide an evaluation method.
상기 평가방법은 oxDNA 시뮬레이션에 의해서 수행되는 것으로, 상기 oxDNA는 대단위-입자 DNA 모델을 구현하기 위해 개발된 시뮬레이션 코드로서, 분자동력학을 통해서 핵산 나노융합체의 물리적 안정성을 이론적으로 평가하는 것이 가능하게 한다.The evaluation method is performed by oxDNA simulation, and the oxDNA is a simulation code developed to implement a large-scale-particle DNA model, which makes it possible to theoretically evaluate the physical stability of the nucleic acid nanofusion through molecular dynamics.
본 발명에서 상기 수소결합 에너지의 측정은 35 내지 40℃에서 수행되는 것을 특징으로 하며, 상기 평가방법은 나노융합체 또는 핵산 나노구조체의 내부에서 발생하는 수소결합 에너지를 일정시간(x105) 동안 측정하여, 상기 수소결합 에너지가 일정하게 유지되는 것이 확인될 때, 제조된 나노융합체 또는 핵산 나노구조체에 구조적 안정성이 있는 것으로 판단한다.In the present invention, the measurement of the hydrogen bonding energy is characterized in that it is carried out at 35 to 40 °C, and the evaluation method is by measuring the hydrogen bonding energy generated inside the nanofusion or nucleic acid nanostructure for a certain period of time (x10 5 ). , When it is confirmed that the hydrogen bonding energy is kept constant, it is determined that the prepared nanofusion or nucleic acid nanostructure has structural stability.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, a preferred embodiment is presented to aid the understanding of the present invention. However, the following examples are provided for easier understanding of the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following examples.
[실시예][Example]
본 실시예에서는 효과적인 암진단 및 임상 적용을 위해, 대상 miRNA는 기존 연구에서 암과의 연관성이 깊은 것으로 알려진 miRNA들인 miR-21 및 miR-22로 선택하여 사용하였다. 진단 프로브의 단순 세포내 전달은 세포 특이적인 세포내 이입률로 인해 정량 분석이 어려운 한계가 있는 것으로, 예를 들면 진단 프로브가 세포 특성으로 인해 단순히 세포내로 다량 전달된 경우, 진단 프로브 자체의 Background noise로 인해 실제 대상 miRNA가 없을 경우에도 positive false를 야기할 가능성이 있으며, 대상 miRNA가 있을 경우에도 negative false를 야기하기도 한다. 이에 현재까지 개발된 나노기술 기반의 진단 프로브는 대부분 상대적 정량만이 가능한 특성을 가지고 있는 바, 본 발명자들은 상기 한계를 극복하고자, 세포내 효율적인 miRNA의 진단을 위해, 도 1에 도시된 방법과 같이 특이적인 리포좀-핵산 나노융합체를 개발하였다.In this example, for effective cancer diagnosis and clinical application, the target miRNA was selected from miR-21 and miR-22, miRNAs known to have a deep relationship with cancer in previous studies. The simple intracellular delivery of a diagnostic probe has a limitation in that it is difficult to perform quantitative analysis due to the cell-specific intracellular penetration rate.For example, when a large amount of the diagnostic probe is simply delivered intracellularly due to cell characteristics, the background noise of the diagnostic probe itself Because of this, even if there is no actual target miRNA, it is possible to cause a positive false, and even if the target miRNA is present, it may cause a negative false. Accordingly, most of the nanotechnology-based diagnostic probes developed so far have characteristics that can only be quantified relative to each other.In order to overcome the above limitations, the present inventors have used the method shown in FIG. 1 for efficient intracellular diagnosis of miRNA. A specific liposome-nucleic acid nanofusion was developed.
실시예 1. 리포좀-핵산 나노융합체의 제조Example 1. Preparation of liposome-nucleic acid nanofusion body
1-1. 핵산 나노구조체 합성 및 분자동력학 시뮬레이션1-1. Nucleic acid nanostructure synthesis and molecular dynamics simulation
제1핵산구조체(fc1-DNA) 및 제2핵산구조체(fc2-DNA)를 이루는 핵산 올리고머의 염기서열과 표적 RNA와 상보적 서열을 가지는 서열은 표 1에 나타내었다. TE buffer(10 mM Tris, pH 8.0, 0.1 mM EDTA)에 녹인 후, 각 핵산 올리고머를 동일한 몰수비(0.1 mM)로 혼합하였다. 이후 용액의 온도를 60℃에서 20℃까지 분당 1℃씩 서서히 낮추는 과정을 통해 제1핵산 구조체 및 제2핵산구조체를 합성하였다. Table 1 shows the nucleotide sequence of the nucleic acid oligomer constituting the first nucleic acid structure (fc1-DNA) and the second nucleic acid structure (fc2-DNA) and a sequence complementary to the target RNA. After dissolving in TE buffer (10 mM Tris, pH 8.0, 0.1 mM EDTA), each nucleic acid oligomer was mixed at the same molar ratio (0.1 mM). Thereafter, the first and second nucleic acid structures were synthesized by gradually lowering the temperature of the solution from 60° C. to 20° C. by 1° C. per minute.
핵산 나노 구조체(afc-DNA)의 합성은 도 2의 위쪽에 나타낸 것과 같이 제1핵산구조체 및 제2핵산구조체 사이의 리가아제 효소를 통한 접합으로 수행되었다. 동일 몰수의 단위 핵산 나노구조체 혼합액 (0.1 mM)을 3 Weiss unit의 T4 리가아제 효소 및 버퍼에 하였다(4℃, 16시간). 도 2 아래에 나타낸 것과 같이, 핵산 나노구조체 합성은 전기영동기법을 통해 확인되었다. The synthesis of the nucleic acid nanostructure (afc-DNA) was performed by conjugation between the first nucleic acid structure and the second nucleic acid structure through a ligase enzyme, as shown in the upper part of FIG. 2. A mixture of unit nucleic acid nanostructures (0.1 mM) of the same number of moles was added to 3 Weiss units of T4 ligase enzyme and buffer (4° C., 16 hours). As shown below in Figure 2, the synthesis of the nucleic acid nanostructure was confirmed through the electrophoresis technique.
합성된 핵산 나노구조체의 삼차원적 구조를 확인하기 위해 oxDNA 프로그램을 사용하였으며, 구체적인 시뮬레이션 조건은 도 3에 나타내었으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 확인할 수 있는 것과 같이, 본 발명에서 합성된 핵산구조체와 핵산 나노구조체는 내부에서 발생하는 수소결합 에너지가 일정하게 유지되어, 안정성을 가진다는 것을 확인하였다.To confirm the three-dimensional structure of the synthesized nucleic acid nanostructure, the oxDNA program was used, and specific simulation conditions are shown in Fig. 3, and the results are shown in Fig. 4. As can be seen in FIG. 4, it was confirmed that the nucleic acid structure and the nucleic acid nanostructure synthesized in the present invention maintain constant hydrogen bonding energy generated inside and have stability.
(miR-22)Target
(miR-22)
(miR-21)Target
(miR-21)
1-2. 다양한 크기의 실리카 나노입자체 합성 및 핵산 나노입자체 부착1-2. Synthesis of silica nanoparticles of various sizes and attachment of nucleic acid nanoparticles
입자체 합성을 위해서, 최종 부피가 46mL가 되도록 메탄올과 에탄올을 다양한 부피 비율로 혼합한 후, 1 mL의 증류수와 3 mL의 암모니아수(28~30 w/w%)를 첨가해주었고, 10분간 교반한 뒤 Tetraethyl orthosilicate (TEOS) 용액 0.6 ml을 서서히 처리하여 실리카 나노입자체를 제조하였다. 제조된 실리카 나노입자체는 원심분리를 통해(15,000 G, 30분) 3회 이상 에탄올로 씻어내었다. For the synthesis of particles, methanol and ethanol were mixed in various volume ratios so that the final volume became 46 mL, and then 1 mL of distilled water and 3 mL of ammonia water (28~30 w/w%) were added, followed by stirring for 10 minutes. Then, 0.6 ml of a Tetraethyl orthosilicate (TEOS) solution was slowly treated to prepare silica nanoparticles. The prepared silica nanoparticles were washed with ethanol at least three times through centrifugation (15,000 G, 30 minutes).
에탄올로 씻어낸 후, 200 mg의 실리카 나노입자체에 0.8 mL의 APTMS(아미노프로필트리메톡시실란, (3-Aminopropyl)trimethoxysilane), 38 ml의 에탄올, 2 ml의 증류수, 및 0.25 ml의 아세트산을 첨가하였다. 이후 3회 이상의 원심분리를 통해 에탄올, 아세토니트릴 (Acetonitrile)로 씻어내고, 115.2 mg의 염화시아누르(cyanuric chloride)를 처리한 후 2시간 동안 교반해주었다. 3회 이상 아세토니트릴, 에탄올, 증류수, 붕산염 버퍼용액 (Borate buffer, pH 8.5)로 씻어내었다.After washing with ethanol, 0.8 mL of APTMS (aminopropyltrimethoxysilane, (3-Aminopropyl)trimethoxysilane), 38 mL of ethanol, 2 mL of distilled water, and 0.25 mL of acetic acid were added to 200 mg of silica nanoparticles. Added. Thereafter, it was washed with ethanol and acetonitrile through three or more centrifugal separations, treated with 115.2 mg of cyanuric chloride, and stirred for 2 hours. At least three times, it was washed with acetonitrile, ethanol, distilled water, and borate buffer (pH 8.5).
마지막으로 4 mg의 실리카 나노입자체 당 25 pmole의 아민기가 말단에 치환된 핵산 나노 구조체를 처리한 후 16시간 이상 반응시켜 핵산 나노융합체를 제조하였다. 미반응된 핵산 나노 구조체는 원심분리를 통해 증류수로 씻어내 제거하였다.Finally, a nucleic acid nanostructure in which 25 pmoles of an amine group per 4 mg of silica nanoparticles was substituted at the terminal was treated and reacted for 16 hours or more to prepare a nucleic acid nanofusion body. The unreacted nucleic acid nanostructure was removed by washing with distilled water through centrifugation.
1-3. 양이온성 인지질막 처리1-3. Cationic phospholipid membrane treatment
핵산 나노입자체가 결합된 실리카 나노입자체에 양이온성 지질인 DOTAP(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane)을 처리하였다. 반응에 앞서 3.5 mg의 DOTAP 인지질은 1.4 ml의 증류수에 10 % 진폭 (amplitude, Qsonica Q500)로 초음파 처리하여 분산시켰다(4℃에서 분산되어 반응 전까지 저온 보관됨). DOTAP 용액과 나노융합체 용액을 혼합하고, 1시간 동안 교반하며 반응시킨 뒤, 원심분리를 통해 증류수, 생리식염수로 씻어주었다.A cationic lipid, DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane), was treated on the silica nanoparticles to which the nucleic acid nanoparticles were bound. Prior to the reaction, 3.5 mg of DOTAP phospholipid was dispersed in 1.4 ml of distilled water by sonicating at 10% amplitude (Qsonica Q500) (dispersed at 4°C and stored at a low temperature until the reaction). The DOTAP solution and the nanofusion solution were mixed, reacted with stirring for 1 hour, and then washed with distilled water and physiological saline through centrifugation.
실시예 2. 실리카 나노입자체 합성 및 핵산 나노구조체 접합Example 2. Synthesis of silica nanoparticles and conjugation of nucleic acid nanostructures
본 실시예 2에서 핵산 나노구조체의 시그널 증폭과 효율적인 세포내 전달을 위해 다양한 크기의 실리카 나노입자체를 제조하여, 최적의 실리카 나노입자체 크기를 도출하고자하였다. 메탄올과 에탄올 혼합액을 사용한 합성법을 기반으로 하여, 20~270 nm의 크기를 갖는 실리카 나노입자체를 합성하였다. In Example 2, silica nanoparticles of various sizes were prepared for signal amplification and efficient intracellular delivery of nucleic acid nanostructures, and an optimal silica nanoparticle size was to be derived. Based on the synthesis method using a mixture of methanol and ethanol, silica nanoparticles having a size of 20 to 270 nm were synthesized.
이후 도 5a에 나타낸 것과 같이 핵산 나노구조체를 표면에 접합하기 위해 실리카 나노입자체에 아미노프로필 트리메톡시실란(Aminopropyl trimethoxysilane) 및 사이아누릭 클로라이드 (Cyanuric chloride)를 순차적으로 처리하여 핵산 나노 구조체의 아민기 (Amine group)과 반응할 수 있도록 하였다. Thereafter, as shown in FIG. 5A, aminopropyl trimethoxysilane and cyanuric chloride were sequentially treated on silica nanoparticles to bond the nucleic acid nanostructure to the surface, thereby amine of the nucleic acid nanostructure. It was made to react with the group (Amine group).
또한 도 5b에서는 실리카 표면에 부착된 형광인자가 37℃에서 시간이 지남에 따라 어느 정도 떨어지는지 확인한 결과를 나타낸 것으로, 실리카 나노입자체의 크기에 따라 핵산 나노구조체에서 발생하는 형광 시그널의 강도가 달라지고, 최적점이 있는 것을 확인하였다.In addition, Figure 5b shows the result of confirming how much the fluorescence factor attached to the silica surface falls over time at 37°C. The intensity of the fluorescence signal generated from the nucleic acid nanostructure varies according to the size of the silica nanoparticle. It was confirmed that there was an optimal point.
실시예 3. 양이온성 인지질막 처리 및 세포 내 miRNA 검출능 확인Example 3. Cationic Phospholipid Membrane Treatment and Confirmation of MiRNA Detection Ability in Cells
본 발명에서는, 효율적인 세포내 전달 및 엔도조말 탈출 (Endosomal escape)을 위해서, 핵산 나노 구조체가 코팅된 실리카 나노입자체(즉, 핵산 나노융합체)를 양이온성 인지질인 DOTAP (Dioleoyl-trimethylammonium-propane) 처리하여 리포좀-핵산 나노융합체로 제조하여 진단에 사용한다. 본 실시예에서는 DOTAP 처리에 따른 입자체의 크기 및 표면 전하 변화를 확인하였다. In the present invention, for efficient intracellular delivery and endosomal escape, a silica nanoparticle coated with a nucleic acid nanostructure (ie, a nucleic acid nanofusion) is treated with a cationic phospholipid DOTAP (Dioleoyl-trimethylammonium-propane). Then, it is prepared as a liposome-nucleic acid nanofusion body and used for diagnosis. In this example, changes in the size and surface charge of the particle body according to the DOTAP treatment were confirmed.
그 결과, 도 5c에 나타낸 것과 같이, 다양한 크기의 실리카 나노입자체 표면에 핵산 나노구조체를 부착하고 이후 DOTAP를 처리하여 다양한 크기의 나노융합체를 제작하는 것이 가능하다는 것을 확인할 수 있으며, 메탄올 및 에탄올의 혼합 부피 비율이 8:2일 때 제작된 실리카 나노입자체를 사용하여 최종 나노융합체를 제작한 경우는 51.38 nm의 크기를, 6:4일 때는 80.56 nm의 크기를, 4:6일 때는 134.21 nm의 크기를, 2:8일 때는 225.70 nm의 크기를, 0:10일 때는 264.40 nm의 크기를 가진다는 것을 알 수 있다. 또한 도 5d에서 확인할 수 있는 것과 같이, 마이크로 크기의 실리카 비드의 표면에 동일한 아미노프로필 트리메톡시실란과 사이아누릭 클로라이드 화학반응을 통해 부착된 핵산 나노구조체를 형광현미경(Zeiss Axiovert 200M, Carl Zeiss)을 통해 확인하여 본 발명에서 실리카 나노입자체 표면의 핵산 나노융합체 부착을 검증하였다.As a result, as shown in Fig. 5c, it can be seen that it is possible to manufacture nanofusions of various sizes by attaching nucleic acid nanostructures to the surface of silica nanoparticles of various sizes and then treating DOTAP. When the mixing volume ratio is 8:2, the final nanofusion is 51.38 nm when the final nanofusion is manufactured using the prepared silica nanoparticles, the size of 80.56 nm when the ratio is 6:4, and the size of 134.21 nm when the 4:6 is It can be seen that the size of is 225.70 nm when it is 2:8, and 264.40 nm when it is 0:10. In addition, as can be seen in Figure 5d, the nucleic acid nanostructure attached to the surface of the micro-sized silica beads through the same aminopropyl trimethoxysilane and cyanuric chloride chemical reaction with a fluorescence microscope (Zeiss Axiovert 200M, Carl Zeiss) The adhesion of the nucleic acid nanofusion body on the surface of the silica nanoparticles in the present invention was verified by checking through.
도 6에서 본 발명의 리포좀-핵산 나노융합체의 제조 단계에 따른 크기와, 크기에 따른 형광 시그널 증폭 및 표면 전하 변화를 확인한 결과를 나타내었다. 형광세기는 형광광도계 (SpectraMax M5, Molecular Devices)를 이용하여 측정하였고, 표면 전하의 변화는 동적빛산란 기법으로 측정하였다 (Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments). 도 6a는 본 발명의 제조단계를 모식적으로 나타낸 것이며, 다양한 분율의 메탄올/에탄올 혼합액을 사용하게 제작된 실리카 나노입자체의 표면에 핵산 나노구조체를 부착하고, 최종적으로 DOTAP을 처리하여 표면을 코팅하였다. 도 6b 및 6c는 는 메탄올 및 에탄올의 혼합 부피 비율에 따른 실리카 구형체의 크기와 주사전자현미경 (JEM-3010, JEOL)을 이용하여 촬영된 이미지를 나타낸 것이고, 도 6d는 구형체 크기에 따라 결합되는 핵산 나노구조체의 양과 형광 시그널을 나타낸 것이다. 해당 결과에서 구형체의 크기에 따라 핵산 나노구조체의 표면에 응집되는 양이 달라지고 그로인해 형광시그널의 크기가 변화한다는 것을 알 수 있다. 도 6e는 DOTAP 처리 전/후의 표면 전하 변화를 나타낸 것으로, DOTAP를 처리할 때 표면 전하가 음전하에서 양전하로 바뀌는 결과를 통해 DOTAP (양전하)으로 표면이 코팅되는 것을 확인할 수 있다.In Figure 6, the size according to the manufacturing step of the liposome-nucleic acid nanofusion body of the present invention, fluorescence signal amplification and surface charge change according to the size are shown. Fluorescence intensity was measured using a fluorescence photometer (SpectraMax M5, Molecular Devices), and the change in surface charge was measured by a dynamic light scattering technique (Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments). Figure 6a schematically shows the manufacturing step of the present invention, attaching the nucleic acid nanostructure to the surface of the silica nanoparticles prepared to use a mixture of methanol / ethanol of various fractions, and finally DOTAP treatment to coat the surface I did. 6b and 6c show the size of a silica sphere according to the mixing volume ratio of methanol and ethanol and an image taken using a scanning electron microscope (JEM-3010, JEOL), and FIG. 6d is a combination according to the size of the sphere. It shows the amount of nucleic acid nanostructure and the fluorescence signal. From the results, it can be seen that the amount of aggregated on the surface of the nucleic acid nanostructure varies depending on the size of the spherical body, and thus the size of the fluorescent signal changes. Figure 6e shows the change of the surface charge before / after the DOTAP treatment, it can be confirmed that the surface is coated with DOTAP (positive charge) through the result of the change of the surface charge from the negative charge to the positive charge when the DOTAP treatment.
제조된 리포좀-핵산 나노융합체를 두가지 종류(MCF-7 및 SK-BR-3)의 유방암 세포주에 처리하여, 세포 내 전달이 잘 이루어지는지를 확인하였다. 도 7a에 나타낸 것과 같이, DOTAP가 존재할 때 보다 세포 내로 잘 전달된다는 것을 확인하였고, 최종 크기 70 nm 가량의 리포좀-핵산 나노융합체가 세포내로 가장 잘 전달되는 것으로 확인하였다.The prepared liposome-nucleic acid nanofusion body was treated with two types of breast cancer cell lines (MCF-7 and SK-BR-3) to confirm whether intracellular delivery was well performed. As shown in Fig. 7a, it was confirmed that DOTAP was better delivered into the cell than when it was present, and it was confirmed that the liposome-nucleic acid nanofusion body having a final size of about 70 nm was best delivered into the cell.
도 7b에서 확인할 수 있는 것과 같이, 유세포 분석 (MacsQuant VYB, Miltenyi Biotec)을 통해 확인한 결과 본 발명의 핵산 나노 구조체가 세포내로 전달될 때, 형광체가 동일한 비율로 나타나 세포 내로 핵산구조체가 동일한 비율로 전달될 수 있다는 것을 확인하였다.As can be seen in Figure 7b, as a result of confirming through flow cytometry (MacsQuant VYB, Miltenyi Biotec), when the nucleic acid nanostructure of the present invention is delivered into a cell, the phosphor appears in the same ratio, and the nucleic acid structure is delivered into the cell at the same ratio. Confirmed that it can be done.
실시간 세포내 다중 진단능을 확인하기 위해, 5종의 유방암 세포주(HCC-1937, MCF-7, MDA-MB-453, MDA-MB-231 및 SK-BR-3)를 대상으로 본 발명의 리포좀-핵산 나노융합체를 처리한 후, 유세포 분석을 통해 얻어지는 결과를 현재 표준적으로 사용되고 있는 RT-PCR의 결과와 비교하였다. 모든 암세포는 24-well plate에서 배양되었으며, 1 x 105 개의 세포를 대상으로 0.5 mg의 리포좀-핵산 나노융합체가 처리되었다. 처리 후 37℃, 5% CO2 농도에서 2시간 동안 배양 후 세포를 추출하여 유세포 분석 측정하였다. RT-PCR의 경우, TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems)를 사용하여 측정되었으며, 동 업체에서 제공하는 miRNA 특이적 프라이머 키트를 구매하여 사용하였다(miR-21: Hs04231424_s1, miR-22: Hs00993773_g1). 대상 miRNA의 발현 정도를 본 발명에서 제시한 방식으로 얻어진 결과와 RT-PCR을 이용하여 확인한 결과를 도 8a에서 비교하였다. 사용된 프라이머 서열은 하기 표 2에 나타내었다. 그 결과 사용된 다섯가지 종류의 암세포종 모두에서 RT-PCR에서 얻어진 결과와 본 발명에서 제시된 방식으로 얻어진 결과의 상대적 비율이 일치하는 것을 확인하였다.In order to confirm the real-time intracellular multiple diagnostic ability, the liposome of the
결과적으로 세포간 miR-21과 miR-22의 발현 양상 차이를 정량적으로 비교하는 것이 가능함을 확인하였고, 동일 세포주 내 세포간 차이에 관한 데이터를 얻는 것이 가능함을 확인하였다.As a result, it was confirmed that it was possible to quantitatively compare the difference in the expression patterns of miR-21 and miR-22 between cells, and it was confirmed that it was possible to obtain data on the difference between cells within the same cell line.
실시예 4. 핵산 나노구조체 개발 및 대상 miRNA 검출능 확인Example 4. Development of nucleic acid nanostructure and confirmation of target miRNA detection ability
본 발명의 리포좀-핵산 나노융합체는 대상 miRNA와 특이적인 결합을 할 수 있는 Molecular beacon 구조와 나노구조체가 세포내로 전달되었을 때, 나노구조체 자체적인 정량화가 가능한 표지 형광인자로 구성된다는 것을 앞선 실시예를 통해서 확인하였다. 또한 합성된 리포좀-핵산 나노융합체의 구조적 안정성은 전기영동 기법과 분자동력학적 시뮬레이션을 통해 검증되었고, 대상 miRNA에 대한 특이적 검출능의 경우, 다양한 농도의 대상 miRNA의 혼합액과 다른 종류의 miRNA와의 비교 실험을 통해 miRNA 특이성 및 검출능이 유효한 것을 확인하였다. 구조적 안정성을 확인하기 위해 사용된 분자동력학적 시뮬레이션 프로그램은 프리웨어인 oxDNA를 사용하였다. oxDNA 시뮬레이션 상에서 본 발명에 사용된 동일한 염기서열을 갖는 핵산 가닥을 입력하고, 시간이 지남에 따라 내부 에너지가 안정적으로 유지되는 것을 도 4에서 확인하였다. 또한 검출능을 확인하기 위해 다양한 농도의 대상 miRNA를 핵산 나노구조체에 처리하고, 그로 인해 발생하는 형광시그널의 증대를 형광광도계 (SpectraMax M5, Molecular Devices)를 사용하여 측정하여 도 9a에 나타내었다. 핵산 나노구조체간 조립 과정 이후에도 대상 miRNA의 검출능에 변화가 없음을 확인하였고, 대상으로하는 miR-21과 miR-22를 다양한 농도로 혼합하고, 혼합액에서 대상으로하는 miRNA의 농도에만 의존적으로 형광시그널이 증가하는 것을 도 9b에서 확인하였다. 이와 같이 얻어진 형광시그널을 색깔로 변환하여 나타낸 결과는 도 9c와 같다.According to the previous example, the liposome-nucleic acid nanofusion body of the present invention is composed of a molecular beacon structure capable of specific binding to a target miRNA and a labeled fluorescent factor capable of quantifying the nanostructure itself when the nanostructure is delivered into the cell. It was confirmed through. In addition, the structural stability of the synthesized liposome-nucleic acid nanofusion was verified through electrophoresis techniques and molecular dynamics simulations, and in the case of specific detection ability for the target miRNA, the mixture of target miRNAs of various concentrations and comparison with other types of miRNAs. Through the experiment, it was confirmed that miRNA specificity and detection ability were effective. The molecular dynamics simulation program used to confirm the structural stability used oxDNA, a freeware. In the oxDNA simulation, a nucleic acid strand having the same nucleotide sequence used in the present invention was input, and it was confirmed in FIG. 4 that internal energy is stably maintained over time. In addition, in order to confirm the detection ability, the target miRNA of various concentrations was treated on the nucleic acid nanostructure, and the increase of the fluorescent signal generated therefrom was measured using a fluorescence photometer (SpectraMax M5, Molecular Devices), and is shown in FIG. 9A. It was confirmed that there was no change in the detection ability of the target miRNA even after the assembly process between the nucleic acid nanostructures, and the target miR-21 and miR-22 were mixed at various concentrations, and the fluorescent signal was only dependent on the target miRNA concentration in the mixture. It was confirmed in Figure 9b that the increase. The result of converting the obtained fluorescent signal into color is shown in FIG. 9C.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.The above description of the present invention is for illustrative purposes only, and those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains will be able to understand that other specific forms can be easily modified without changing the technical spirit or essential features of the present invention. will be. Therefore, it is to be understood that the embodiments described above are illustrative and non-limiting in all respects.
<110> Research & Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> FUSION NANO LIPOSOME-NUCLEIC ACID FOR QUANTITATIVE DIAGNOSIS OF MULTI RIBONUCLEIC ACID MARKER, METHOD FOR THEORETICAL STABILITY EVALUATION THEREOF, USES THEREOF AND PREPARATION METHOD THEREOF <130> PN1901-037 <150> KR 10-2017-0022884 <151> 2017-02-21 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fc1-a <400> 1 gcgagacagt tcttcaactg gcagcttctc gcaggctgat tcggttcatg cggatcca 58 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fc1-b <400> 2 cttacggcga atgaccgaat cagcct 26 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fc1-c <400> 3 agtctggatc cgcatgacat tcgccgtaag 30 <210> 4 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fc2-a <400> 4 gcgagtcaac atcagtctga taagctactc gcaggctgat tcggttcatg cggatcca 58 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fc2-b <400> 5 cttacggcga atgaccgaat cagcct 26 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fc2-c <400> 6 gacttggatc cgcatgacat tcgccgtaag 30 <210> 7 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-22 target RNA <400> 7 aagcugccag uugaagaacu gu 22 <210> 8 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-21 target RNA <400> 8 uagcuuauca gacugauguu ga 22 <110> Research & Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> FUSION NANO LIPOSOME-NUCLEIC ACID FOR QUANTITATIVE DIAGNOSIS OF MULTI RIBONUCLEIC ACID MARKER, METHOD FOR THEORETICAL STABILITY EVALUATION THEREOF, USES THEREOF AND PREPARATION METHOD THEREOF <130> PN1901-037 <150> KR 10-2017-0022884 <151> 2017-02-21 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fc1-a <400> 1 gcgagacagt tcttcaactg gcagcttctc gcaggctgat tcggttcatg cggatcca 58 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fc1-b <400> 2 cttacggcga atgaccgaat cagcct 26 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fc1-c <400> 3 agtctggatc cgcatgacat tcgccgtaag 30 <210> 4 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fc2-a <400> 4 gcgagtcaac atcagtctga taagctactc gcaggctgat tcggttcatg cggatcca 58 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fc2-b <400> 5 cttacggcga atgaccgaat cagcct 26 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fc2-c <400> 6 gacttggatc cgcatgacat tcgccgtaag 30 <210> 7 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-22 target RNA <400> 7 aagcugccag uugaagaacu gu 22 <210> 8 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-21 target RNA <400> 8 uagcuuauca gacugauguu ga 22
Claims (16)
메탄올 및 에탄올 합성법으로 합성된 실리카 나노 입자체 표면에 상기 핵산 나노 구조체를 합성한 핵산 나노 융합체;
상기 합성된 핵산 나노 융합체를 포함하는 리포솜;을 포함하는, 기저형 (basal type), 기저-유사형(basal-like type), 루미널 A형 (luminal A type) 및 HER2(human epidermal growth factor receptor type 2)형을 포함하는 유방암 분자아형 진단용 리포좀-핵산 나노융합체로서,
상기 제1핵산구조체는 서열번호 1 내지 3의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 선형핵산들이 Y자 가지형태로 결합한 형태이고,
상기 제2핵산구조체는 서열번호 4 내지 6의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 선형핵산들이 Y자 가지형태로 결합한 형태이고,
상기 제1핵산구조체는 고리형 말단이 표적 RNA와 상보적 서열을 가지는 서열번호 7의 염기서열을 포함하고,
상기 제2핵산구조체는 고리형 말단이 표적 RNA와 상보적 서열을 가지는 서열번호 8의 염기서열을 포함하고,
상기 메탄올 및 에탄올은 8:2 내지 2:8의 부피비로 합성되는 것인, 기저형 (basal type), 기저-유사형(basal-like type), 루미널 A형 (luminal A type) 및 HER2형을 포함하는 유방암 분자아형 진단용 리포좀-핵산 나노융합체.Branched first nucleic acid structure having a cyclic terminal; And a nucleic acid nanostructure conjugated to a branched second nucleic acid structure having a cyclic terminal.
Nucleic acid nano fusions that synthesize the nucleic acid nanostructures on the surface of silica nanoparticles synthesized by methanol and ethanol synthesis;
Liposomes comprising the synthesized nucleic acid nano fusions; including, basal type, basal-like type, luminal A type, and human epidermal growth factor receptor type A liposome-nucleic acid nanofusion for diagnosing a breast cancer molecular subtype comprising a type 2),
The first nucleic acid structure is a form in which linear nucleic acids selected from the group consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3 are combined in a Y-shaped branch form,
The second nucleic acid structure is a form in which linear nucleic acids selected from the group consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 4 to 6 are combined in a Y-shaped branch form,
The first nucleic acid structure comprises a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 having a cyclic terminal complementary to the target RNA,
The second nucleic acid structure comprises a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 having a cyclic terminal complementary to the target RNA,
The methanol and ethanol are synthesized in a volume ratio of 8: 2 to 2: 8, basal type (basal type), basal-like type (luminal A type) and HER2 type Liposome-nucleic acid nanofusion for diagnosing breast cancer molecular subtype.
상기 선형핵산은 5' 말단에 형광체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 리포좀-핵산 나노융합체.The method of claim 1,
The linear nucleic acid is a liposome-nucleic acid nano fusion, characterized in that it further comprises a phosphor at the 5 'end.
상기 제1핵산구조체 및 제2핵산구조체는 형광체 및 소광제가 추가로 표지된 것을 특징으로 하는, 리포좀-핵산 나노융합체.The method of claim 1,
The first nucleic acid structure and the second nucleic acid structure is characterized in that the phosphor and quencher further labeled, liposome-nucleic acid nano fusion.
상기 리포좀-핵산 나노융합체는 50 nm 내지 80 nm인 것을 특징으로 하는, 리포좀-핵산 나노융합체.The method of claim 1,
The liposome-nucleic acid nanofusion is characterized in that 50 nm to 80 nm, liposome-nucleic acid nanofusion.
상기 리포솜은 양이온성 지질로 이루어진 것을 특징으로 하는, 리포좀-핵산 나노융합체.The method of claim 1,
The liposome is characterized in that consisting of cationic lipids, liposome-nucleic acid nano fusion.
상기 양이온성 지질은 DOTAP(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane) 및 콜레스테롤을 구성 성분으로 하는 양이온성 지질로 이루어진 것을 특징으로 하는, 리포좀-핵산 나노융합체.The method of claim 5, wherein
The cationic lipid is DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane) and a cationic lipid comprising cholesterol as a component, liposome-nucleic acid nano fusion.
상기 시스템은 세포 내 형광을 측정하는 것을 특징으로 하는, 생체 진단 이미징 시스템.The method of claim 8,
And the system measures intracellular fluorescence.
(1) 고리형 말단을 가지는 가지형태의 제1핵산구조체, 및 고리형 말단을 가지는 가지형태의 제2핵산구조체를 접합하여 핵산 나노 구조체를 제조하는 단계로서,
상기 제1핵산구조체는 서열번호 1 내지 3의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 선형핵산들이 Y자 가지형태로 결합한 형태이고, 상기 제2핵산구조체는 서열번호 4 내지 6의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 선형핵산들이 Y자 가지형태로 결합한 형태이고, 상기 제1핵산구조체는 고리형 말단이 표적 RNA와 상보적 서열을 가지는 서열번호 7의 염기서열을 포함하고, 상기 제2핵산구조체는 고리형 말단이 표적 RNA와 상보적 서열을 가지는 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단계;
(2) 메탄올 및 에탄올 합성법으로 합성된 실리카 나노 입자체의 표면에 상기 핵산 나노 구조체를 합성하여 핵산 나노 융합체를 제조하는 단계로서,
상기 메탄올 및 에탄올은 8:2 내지 2:8의 부피비로 합성하는 것을 특징으로 하는 단계; 및
(3) 상기 핵산 나노 융합체에 양이온성 지질을 처리하여 리포좀-핵산 나노 융합체를 제조하는 단계. Preparation of liposome-nucleic acid nanofusions for the diagnosis of breast cancer molecular subtypes, including basal type, basal-like type, luminal A type and HER2 type comprising the following steps Way:
(1) conjugating a branched first nucleic acid structure having a cyclic terminal and a branched second nucleic acid structure having a cyclic terminal to prepare a nucleic acid nanostructure;
The first nucleic acid structure is a linear nucleic acid selected from the group consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 to 3 is a form in which Y-branched form, the second nucleic acid structure from the group consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 4 to 6 The selected linear nucleic acids are in the form of Y-branched form, the first nucleic acid structure comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 having a cyclic terminal complementary to the target RNA, the second nucleic acid structure is cyclic A terminal comprising a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 having a sequence complementary to a target RNA;
(2) synthesizing the nucleic acid nanostructure on the surface of the silica nanoparticles synthesized by methanol and ethanol synthesis method to produce a nucleic acid nano fusion,
Methanol and ethanol are synthesized in a volume ratio of 8: 2 to 2: 8; And
(3) treating the nucleic acid nano fusion with a cationic lipid to prepare a liposome-nucleic acid nano fusion.
상기 선형핵산은 5' 말단에 형광체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 리포좀-핵산 나노융합체의 제조방법.The method of claim 10,
Wherein the linear nucleic acid is characterized in that it further comprises a phosphor at the 5 'end, a liposome-nucleic acid nano fusion method of manufacturing.
상기 제1핵산구조체 및 제2핵산구조체는 형광체 및 소광제가 추가로 표지된 것을 특징으로 하는, 리포좀-핵산 나노융합체의 제조방법.The method of claim 10,
The first nucleic acid structure and the second nucleic acid structure is characterized in that the phosphor and quencher further labeled, liposome-nucleic acid nano fusion method.
상기 리포좀-핵산 나노융합체는 50 nm 내지 80 nm인 것을 특징으로 하는, 리포좀-핵산 나노융합체의 제조방법.The method of claim 10,
The liposome-nucleic acid nano fusion is characterized in that 50 nm to 80 nm, method for producing a liposome-nucleic acid nano fusion.
상기 양이온성 지질은 DOTAP(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane) 및 콜레스테롤을 구성 성분으로 하는 양이온성 지질로 이루어진 것을 특징으로 하는, 리포좀-핵산 나노융합체의 제조방법.The method of claim 10,
The cationic lipid is DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane) and a cationic lipid comprising a cholesterol as a component, characterized in that the liposome-nucleic acid nano fusion method.
상기 방법은 나노 융합체 내부에서 발생하는 수소결합 에너지를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 평가방법.An evaluation method of theoretically evaluating the stability of the liposome-nucleic acid nano fusion for diagnosing breast cancer molecular subtype of claim 1,
The method comprises the step of measuring the hydrogen bond energy generated inside the nano fusion, evaluation method.
상기 측정은 35 내지 40℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 평가방법.The method of claim 15,
The measurement method, characterized in that carried out at 35 to 40 ℃.
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