KR102070046B1 - Preparation method of nanocomplex comprising near infrared dye-loaded albumin particle and gene delivery vehicle, and method for regulating intracellular gene expression using the same - Google Patents

Preparation method of nanocomplex comprising near infrared dye-loaded albumin particle and gene delivery vehicle, and method for regulating intracellular gene expression using the same Download PDF

Info

Publication number
KR102070046B1
KR102070046B1 KR1020180038865A KR20180038865A KR102070046B1 KR 102070046 B1 KR102070046 B1 KR 102070046B1 KR 1020180038865 A KR1020180038865 A KR 1020180038865A KR 20180038865 A KR20180038865 A KR 20180038865A KR 102070046 B1 KR102070046 B1 KR 102070046B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
dimethyl
cells
spd
indol
nanoassembly
Prior art date
Application number
KR1020180038865A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR20190115769A (en
Inventor
박인규
산토시칼라쉬
Original Assignee
전남대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 전남대학교산학협력단 filed Critical 전남대학교산학협력단
Priority to KR1020180038865A priority Critical patent/KR102070046B1/en
Publication of KR20190115769A publication Critical patent/KR20190115769A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR102070046B1 publication Critical patent/KR102070046B1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/10—Inactivation or decontamination of a medicinal preparation prior to administration to an animal or a person
    • A61K41/17—Inactivation or decontamination of a medicinal preparation prior to administration to an animal or a person by ultraviolet [UV] or infrared [IR] light, X-rays or gamma rays
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 근적외선 염료가 담지된 알부민 입자 및 유전자 전달체를 포함하는 나노복합체 제조방법 및 이를 이용한 세포 내 유전자 발현 조절 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 세포 내로 전달하고자 하는 유전자와 이황화 폴리에틸렌이민과 복합체를 형성하고, 이를 근적외선 염료가 담지된 알부민을 결합하여 나노복합체를 제조한 후, 세포 내로 전달된 나노복합체에 근적외선을 조사하여 유전자 발현을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 BI-SPD 나노 어셈블리는 암세포, 특히 유방암 세포에서 이식 유전자(transgene) 발현이 현저히 향상되었으며, BI 나노 입자를 사용하여, 상기 나노 어셈블리의 세포 내 전달이 향상된 것을 확인하였다. 또한, 광열 효과를 이용하여 세포 내로 엔도솜에서 폴리플렉스를 방출하도록 하고, 글루타치온(GSH)의 작용에 의해 상기 폴리플렉스에서 핵 산화물을 세포질로 방출하는 것을 촉진함으로써 세포 내로 전달하고자 하는 유전자의 발현을 현저히 강화하는 효과를 얻었다. 이로부터, 본 발명에 따른 암세포 특이적인 표적 펩타이드 및 근적외선 염료의 광열 효과를 이용함으로써, 암 유전자 치료에 대해 큰 효과를 얻을 수 있을 것으로 기대된다.The present invention relates to a method for preparing nanocomposites comprising albumin particles and gene carriers carrying a near infrared dye and a method for regulating intracellular gene expression using the same. More specifically, the present invention provides a complex of genes and disulfide polyethyleneimine to be delivered into cells. The present invention relates to a method of increasing gene expression by forming a nanocomposite by forming an albumin carrying a near-infrared dye and then irradiating the near-infrared nanocomposite to cells. The BI-SPD nanoassembly according to the present invention significantly improved transgene expression in cancer cells, particularly breast cancer cells, and confirmed that intracellular delivery of the nanoassembly was improved by using BI nanoparticles. In addition, the photothermal effect is used to release the polyplex from the endosomes into the cell, and by the action of glutathione (GSH) to promote the release of nuclear oxide from the polyplex into the cytoplasm, thereby promoting expression of the gene to be delivered into the cell. A significant strengthening effect was obtained. From this, it is expected that by utilizing the photothermal effects of the cancer cell specific target peptide and the near-infrared dye according to the present invention, a great effect on cancer gene therapy can be obtained.

Description

근적외선 염료가 담지된 알부민 입자 및 유전자 전달체를 포함하는 나노복합체 제조방법 및 이를 이용한 세포 내 유전자 발현 조절 방법{Preparation method of nanocomplex comprising near infrared dye-loaded albumin particle and gene delivery vehicle, and method for regulating intracellular gene expression using the same}Preparation method of nanocomplex comprising near infrared dye-loaded albumin particle and gene delivery vehicle, and method for regulating intracellular gene expression using the same}

본 발명은 근적외선 염료가 담지된 알부민 입자 및 유전자 전달체를 포함하는 나노복합체 제조방법 및 이를 이용한 세포 내 유전자 발현 조절 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 세포 내로 전달하고자 하는 유전자와 이황화 폴리에틸렌이민과 복합체를 형성하고, 이를 근적외선 염료가 담지된 알부민을 결합하여 나노복합체를 제조한 후, 세포 내로 전달된 나노복합체에 근적외선을 조사하여 유전자 발현을 증가시키는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for preparing nanocomposites comprising albumin particles and gene carriers carrying a near infrared dye and a method for regulating intracellular gene expression using the same. More specifically, the present invention provides a complex of genes and disulfide polyethyleneimine to be delivered into cells. The present invention relates to a method of increasing gene expression by forming a nanocomposite by forming an albumin carrying a near-infrared dye and then irradiating the near-infrared nanocomposite to cells.

유전자 요법이란 유전자 및 생물학적 활성 제제를 이용하여 질환을 치료하는 것으로, 암과 같은 여러 유전자가 원인이 되는 장애나 외부에서 유래된 바이러스성 유전자들로부터 생긴 질환도 치료할 수 있는 새로운 개념의 치료법이다. 유전자 요법에는 변이된 유전자를 정상 유전자로 치환하거나, 치료 단백질을 합성하는 새로운 유전자를 도입시키거나, 내부적으로 세포의 유전자 발현을 조절하는 것이 포함된다. 여기에서 필요한 첫 번째 접근이 표적세포로 유전자를 형질주입시키는 것이므로, 치료의 여러 형태에 적합한 형질주입 방법의 개발이 중요하다. 특히, 표적 대상의 종양에 특이적으로 결합할 수 있으면서, 종양 세포 내로 치료를 위한 유전자를 전달하는 효율을 높이는 방법의 개발이 중요한 상황이다.Gene therapy is the treatment of diseases using genes and biologically active agents. It is a new concept of therapy that can treat diseases caused by various genes such as cancer or diseases caused by externally derived viral genes. Gene therapy involves replacing mutated genes with normal genes, introducing new genes that synthesize therapeutic proteins, or internally regulating gene expression in cells. Since the first approach required here is to transfect genes into target cells, it is important to develop a transfection method suitable for various forms of treatment. In particular, the development of a method of increasing the efficiency of delivering genes for treatment into tumor cells while being able to specifically bind to the target target tumor is an important situation.

광화학 내재화(photochemical internalization)는 근적외선(near infrared, NIR)을 흡수하고 열 또는 활성산소종(ROS)을 방출하는 물질을 필요로 하는 치료 유전자의 특정 부위 방출을 달성할 수 있는 방법이다. 광화학 내재화 동안, 엔도사이토졸화된나노 입자(endocytosed nanoparticle)는 근적외선 조사시 세포질로 방출되게 된다. 근적외선을 흡수하는 대부분의 탄소 및 금속 기반의 나노 입자(예를 들어, 탄소 나노 구체, 금 나노 막대, 산화 그래핀, 이황화 몰리브덴 시트 등)는 엔도솜에서 광열적으로 유발된 유전자 방출과 관련이 있으나, 상기 물질은 생체 내부에서 유전적 독성과 염증 반응을 일으키는 문제점이 있다. 따라서 이에 대한 문제를 해결할 수 있는 방법의 개발이 절실한 상황이다.Photochemical internalization is a way to achieve specific site release of therapeutic genes that require materials that absorb near infrared (NIR) and release heat or reactive oxygen species (ROS). During photochemical internalization, endocytosed nanoparticles are released into the cytoplasm upon near-infrared irradiation. Most carbon and metal based nanoparticles that absorb near infrared light (eg, carbon nanospheres, gold nanorods, graphene oxide, molybdenum disulfide sheets, etc.) are associated with photothermally induced gene release in endosome In addition, the substance has a problem of causing genetic toxicity and inflammatory reactions inside the living body. Therefore, the development of a method that can solve the problem is urgently needed.

이에 본 발명자들은 근적외선 염료가 담지된 알부민 입자가 가지는 광열 효과를 이용하여 상기 알부민 입자 및 유전자 전달체를 포함하는 나노복합체를 제조하여 종양 세포에 처리하는 경우, 세포 독성이 나타나지 않을 뿐만 아니라, 종양 세포 내 유전자 전달 및 발현 효율이 현저하게 향상되는 것을 확인하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.Therefore, the present inventors prepared a nanocomposite containing the albumin particles and the gene transferr using the photothermal effects of the albumin particles loaded with the near-infrared dye and treated them to tumor cells, but also showed no cytotoxicity. It was confirmed that the gene transfer and expression efficiency is significantly improved, and came to complete the present invention.

대한민국 공개특허공보 2017-0128916 A (2017.11.24.).Republic of Korea Patent Application Publication No. 2017-0128916 A (Nov. 24, 2017).

Jiang C et al., Acta Biomater 14:61-69 (2014). Jiang C et al., Acta Biomater 14: 61-69 (2014). S. Son et al. Biomaterials 31:6344-6354 (2010). S. Son et al. Biomaterials 31: 6344-6354 (2010). Q. Peng et al. Bioconjug. Chem. 19:499-506 (2008). Q. Peng et al. Bioconjug. Chem. 19: 499-506 (2008).

본 발명에서는 근적외선 염료가 담지된 알부민 입자 및 유전자 전달체를 포함하는 나노복합체 제조방법을 제공하고, 이를 이용한 세포 내 유전자 발현의 조절 방법을 제공하고자 하였다.In the present invention, to provide a method for producing a nanocomposite comprising the albumin particles and gene delivery carriers carrying a near-infrared dye, and to provide a method for controlling gene expression in cells using the same.

본 발명은The present invention

근적외선에 의해 광열 효과를 내는 물질;Materials exerting a photothermal effect by near infrared rays;

상기 근적외선에 의해 광열 효과를 내는 물질에 랩핑(wrapping)된 알부민 층;An albumin layer wrapped on the material exerting a photothermal effect by the near infrared ray;

상기 알부민 층의 표면에 접합되며, 세포 내로 전달하고자 하는 물질을 포함하고, 종양 특이적 세포 침투 단백질과 링커로 연결된 ssPEI (Disulfide-containing Polyethylenimine);A ssPEI (Disulfide-containing Polyethylenimine) conjugated to the surface of the albumin layer and containing a substance to be delivered into a cell, and linked to a tumor specific cell penetrating protein by a linker;

를 포함하는, 근적외선을 이용한 세포 내 물질 전달을 위한 나노 어셈블리에 관한 것이다.It relates to a nano-assembly for intracellular mass transfer using a near-infrared.

본 발명의 다른 양태는Another aspect of the invention

근적외선에 의해 광열 효과를 내는 물질에 알부민 층 (BI)이 랩핑(wrapping)된 나노 입자를 제조하는 단계;Preparing nanoparticles in which an albumin layer (BI) is wrapped in a material that produces a photothermal effect by near infrared rays;

ssPEI (Disulfide-containing Polyethylenimine)와 종양 특이적 세포 침투 단백질의 결합체를 제조하는 단계;preparing a combination of disulfide-containing Polyethylenimine (ssPEI) and tumor specific cell infiltration protein;

상기 결합체에 세포 내로 전달하고자 하는 물질이 결합된 폴리플렉스 (SPD)를 제조하는 단계; 및Preparing a polyplex (SPD) to which the substance to be delivered to the conjugate is bound; And

상기 나노 입자와 상기 폴리플렉스를 혼합하여 나노 어셈블리(nanoassembly) (BI-SPD)를 제조하는 단계;Mixing the nanoparticles with the polyplex to produce a nanoassembly (BI-SPD);

를 포함하는, 근적외선을 이용한 세포 내 물질 전달을 위한 나노 어셈블리의 제조 방법에 관한 것이다.It relates to a method of manufacturing a nano-assembly for intracellular mass transfer using a near-infrared.

본 발명의 또 다른 양태는Another aspect of the invention

세포에 상기 나노 어셈블리를 처리한 후 근적외선을 조사하는 단계를 포함하는, 근적외선을 이용한 세포 내 물질 전달 방법에 관한 것이다.It relates to a method for intracellular mass transfer using near-infrared, comprising the step of irradiating near-infrared after treatment of the nanoassembly to the cell.

본 발명에 따른 BI-SPD 나노 어셈블리는 암세포, 특히 유방암 세포에서 이식 유전자(transgene) 발현이 현저히 향상되었으며, BI 나노 입자를 사용하여, 상기 나노 어셈블리의 세포 내 전달이 향상된 것을 확인하였다. 또한, 광열 효과를 이용하여 세포 내로 엔도솜에서 폴리플렉스를 방출하도록 하고, 글루타치온(GSH)의 작용에 의해 상기 폴리플렉스에서 핵 산화물을 세포질로 방출하는 것을 촉진함으로써 세포 내로 전달하고자 하는 유전자의 발현을 현저히 강화하는 효과를 얻었다. 이로부터, 본 발명에 따른 암세포 특이적인 표적 펩타이드 및 근적외선 염료의 광열 효과를 이용함으로써, 암 유전자 치료에 대해 큰 효과를 얻을 수 있을 것으로 기대된다.The BI-SPD nanoassembly according to the present invention significantly improved transgene expression in cancer cells, particularly breast cancer cells, and confirmed that intracellular delivery of the nanoassembly was improved by using BI nanoparticles. In addition, the photothermal effect is used to release the polyplex from the endosomes into the cell, and by the action of glutathione (GSH) to promote the release of nuclear oxide from the polyplex into the cytoplasm, thereby promoting expression of the gene to be delivered into the cell. A significant strengthening effect was obtained. From this, it is expected that by utilizing the photothermal effects of the cancer cell specific target peptide and the near-infrared dye according to the present invention, a great effect on cancer gene therapy can be obtained.

도 1은 BI-SPD 나노 어셈블리(nanoassembly)로부터 광열 매개 유전자 방출에 관한 모식도이다. BI-SPD 나노 어셈블리가 세포 내로 진입 후, 808 nm의 레이저를 세포에 조사하였다. 레이저를 조사하는 동안, 엔도솜(endosome)에서 생성된 국부열(local heat)이 불안정해진 BI-SPD 나노 어셈블리를 세포질(cytosol)로 누출되도록 하였다. 이후, 암세포의 풍부한 GSH(glutathione; L-γ-glutamyl-L-cysteinyl-glycine)가 존재하는 세포질 조건에서, 플라스미드는 SPD 폴리플렉스(polyplex)로부터 세포질로 방출되어 이식 유전자(transgene)를 발현하였다.
도 2는 SPD 폴리플렉스의 특성을 조사한 결과이다. a) (i) DS 4-3 펩타이드, (ii) ssPEI 1800 및 (iii) SPD 고분자의 H-NMR 결과, b) 다른 중량비의 플라스미드를 갖는 SPD 폴리플렉스의 아가로스 겔 지연(retardation), c) 크기 및 d) 5:1 (w/w)에서 SPD 폴리플렉스의 제타 전위(zeta potential)를 나타낸 것이다.
도 3은 BI-SPD 나노 어셈블리의 물리 화학적 특성을 나타낸 결과이다. a) i) BI 나노 입자, ii) SPD 폴리플렉스, iii) BI-SPD 나노 어셈블리(고배율)의 TEM 이미지, b) BI-SPD 나노 어셈블리의 평균 수력학(hydrodynamic) 크기, c) 제타 전위, d) BI-SPD 나노 어셈블리의 아가로스 겔 지연(M: 마커, P: 플라스미드만), e) BI-SPD 나노 어셈블리 및 SPD 폴리플렉스를 이용한 형광 퀀칭 분석(fluorescent quenching assays), f) 10% FBS에서 배양된 BI-SPD 나노 어셈블리의 4 시간까지 서로 다른 시점에서 측정된 평균 수력학 직경, 및 g) 1 cm2 당 1 W의 강도로 808 nm 레이저가 조사된 BI-SPD 나노 어셈블리의 열 화상(thermal image)을 나타낸 것이다.
도 4는 유방암 세포에서 엔도/리소좀의 소포(endo/lysosomal vesicle)에 대한 BI-SPD의 세포 내로의 흡수 및 국소화(localization) 결과이다. a) 다른 시간량 동안 배양된 4T1 세포에 의한 BI-SPD 나노 어셈블리 (25:1)의 세포 흡수, b) 1 cm2 당 1 W의 강도로 808 nm 레이저를 5 분간 조사하거나, 조사하지 않은 BI-SPD 나노 어셈블리 (25:1)에서 리소좀 불안정화의 공초점 라이브 셀 이미징(live cell imaging), c) 서로 다른 출력 밀도와 처리 시간으로 808 nm 레이저를 조사하고 BI-SPD 나노 어셈블리 (25:1)를 처리한 4T1 세포에서의 아크리딘 오렌지 엔도솜/리소솜 불안정화 시험을 나타낸 것이다.
도 5는 레이저를 조사하거나 조사하지 않은 4T1 및 4T7 유방암 세포에서, BI-SPD 나노 어셈블리의 세포 생존율 측정 결과이다. a) 서로 다른 농도의 BI-SPD로 처리한 후, 1 cm2 당 1 W의 강도로 808 nm 레이저가 조사된 4T1 및 4T7 세포, 및 b) 다양한 강도(W/cm2)로 조사된 BI-SPD 925:1) 처리된 세포의 MTS 시험 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 808 nm 레이저에 노출된, BI-SPD 처리한 4T1 및 4T7 세포의 유전자 전달의 광열 증대(photothermal augmentation) 측정 결과이다. a) 808 nm 레이저를 1 cm2 당 1 W의 강도로 5분간 조사한, BI-SPD 처리한 4T1 세포에서 외부 레이저 조사 및 레이저 강도에 대한 루시퍼라아제 유전자 발현의 의존성, b) 808 nm 레이저를 1 cm2 당 1 W의 강도로 5분 및 10분간 조사한, BI-SPD (25:1) 처리한 4T1 세포에서 루시퍼라아제 유전자 발현 시험 결과이다. (n = 4, SEM, * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001).
도 7은 808 nm 레이저를 조사한 4T1 유방암 세포에서 양성자 스펀지(proton sponge) 및 산화 환원 억제에 관한 결과이다. a) 바필로마이신(bafilomycin), 및 b) BSO로 처리한 후, 808 nm 레이저를 1 cm2 당 1 W의 강도로 5분간 국부 조사한 4T1 세포에서 BI-SPD 나노 어셈블리 (25:1)의 루시퍼라아제 전달 효과를 나타낸 것이다. (n = 4, SEM, * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01).
도 8은 4T1 종양 회전 타원체 모델(spheroid model)에서 BI_SPD의 종양 침투 및 광열적으로 유발된 유전자 발현 결과이다. a) BI-SPD 나노 어셈블리 (25:1) (BOBO-3 DNA)로 처리한 4T1 회전 타원체의 Z-스택(Z-stack) 공초점 영상, 및 b) 레이저 조사된, BI-SPD 나노 어셈블리 (25:1) 처리된 4T1 회전 타원체의 루시퍼라아제 유전자 발현에 관한 것이다. (n = 4, SEM, *p ≤ 0.05, ***p ≤ 0.001).
도 9는 4T1 종양 마우스 모델에서 BI-SPD의 생체 분포 결과이다. a) 다른 시점에서 (i) BI-SP 및 (ii) BI-SPD 처리된 4T1 종양 마우스의 형광 이미지, b) 종양 영역의 집적 밀도 플롯(integrated density plot), c) 48 시간 후 (i) BI-SP 및 (ii) BI-SPD 처리된 4T1 종양 마우스에서 생체 외 장기 형광 이미징(organ fluorescent imaging), 및 d) 장기의 정규화된 형광 강도 플롯(normalized fluorescent intensity plot)을 나타낸 것이다. (n = 4, SEM, *p ≤0.05, ***p ≤ 0.001)1 is a schematic diagram of light-heat mediated gene release from BI-SPD nanoassemblies. After the BI-SPD nanoassembly entered the cells, 808 nm laser was irradiated to the cells. During the laser irradiation, the local heat generated in the endosome was allowed to leak into the cytosol of the unstable BI-SPD nanoassembly. Subsequently, in cytoplasmic conditions in which abundant GSH (glutathione; L-γ-glutamyl-L-cysteinyl-glycine) of cancer cells is present, the plasmid is released into the cytoplasm from the SPD polyplex to express a transgene.
2 is a result of examining the properties of the SPD polyplex. a) (a) H-NMR results of the DS 4-3 peptide, (ii) ssPEI 1800 and (iii) SPD polymer, b) agarose gel retardation of SPD polyplexes with different weight ratio plasmids, c) Size and d) the zeta potential of the SPD polyplex at 5: 1 (w / w).
3 shows the physicochemical properties of the BI-SPD nanoassembly. a) i) BI nanoparticle, ii) SPD polyplex, iii) TEM image of BI-SPD nanoassembly (high magnification), b) average hydrodynamic size of BI-SPD nanoassembly, c) zeta potential, d A) agarose gel delay of BI-SPD nanoassembly (M: marker, P: plasmid only), e) fluorescent quenching assays using BI-SPD nanoassembly and SPD polyplexes, f) in 10% FBS The average hydrodynamic diameter measured at different time points up to 4 hours of the cultured BI-SPD nanoassembly, and g) thermal imaging of the BI-SPD nanoassembly with 808 nm laser irradiation at an intensity of 1 W per cm 2 . image).
4 shows the results of uptake and localization of BI-SPD into cells for endo / lysosomal vesicles in breast cancer cells. a) cell uptake of BI-SPD nanoassembly (25: 1) by 4T1 cells incubated for different amounts of time, b) BI irradiated for 5 minutes with an 808 nm laser at an intensity of 1 W per cm 2 , or without irradiation Confocal live cell imaging of lysosomal destabilization in -SPD nanoassemblies (25: 1), c) irradiation of 808 nm lasers with different power densities and processing times, and BI-SPD nanoassemblies (25: 1) Acridine orange endosomal / lysosomal destabilization test in 4T1 cells treated with is shown.
Figure 5 shows the results of measuring cell viability of BI-SPD nanoassembly in 4T1 and 4T7 breast cancer cells with or without laser irradiation. a) 4T1 and 4T7 cells irradiated with 808 nm laser at 1 W intensity per cm 2 after treatment with different concentrations of BI-SPD, and b) BI- irradiated at various intensities (W / cm 2 ). SPD 925: 1) MTS test measurement results of the treated cells are shown.
FIG. 6 shows the results of photothermal augmentation of gene transfer of BI-SPD treated 4T1 and 4T7 cells exposed to 808 nm laser. a) dependence of the 808 nm laser to 1 cm 2 1 W strength 5 minutes review, luciferase gene expression to an external laser irradiation, and the laser intensity in 4T1 cells BI-SPD treated with sugar, b) 808 nm laser 1 Luciferase gene expression test results in 4T1 cells treated with BI-SPD (25: 1), irradiated for 5 minutes and 10 minutes at an intensity of 1 W per cm 2 . (n = 4, SEM, * p ≦ 0.05, ** p ≦ 0.01, *** p ≦ 0.001).
FIG. 7 shows the results of proton sponge and redox inhibition in 4T1 breast cancer cells irradiated with 808 nm laser. Lucifer of BI-SPD nanoassembly (25: 1) in 4T1 cells subjected to a) bafilomycin, and b) BSO, and then irradiated with a 808 nm laser for 5 minutes at an intensity of 1 W per cm 2 . Laase delivery effect is shown. (n = 4, SEM, * p ≦ 0.05, ** p ≦ 0.01).
FIG. 8 shows tumor infiltration and photothermally induced gene expression of BI_SPD in a 4T1 tumor spheroid model. a) Z-stack confocal image of 4T1 spheroids treated with BI-SPD nanoassembly (25: 1) (BOBO-3 DNA), and b) laser-irradiated BI-SPD nanoassembly ( 25: 1) Luciferase gene expression of treated 4T1 spheroids. (n = 4, SEM, * p ≦ 0.05, *** p ≦ 0.001).
9 shows the biodistribution results of BI-SPD in the 4T1 tumor mouse model. a) Fluorescent images of (i) BI-SP and (ii) BI-SPD treated 4T1 tumor mice at different time points, b) integrated density plots of tumor areas, c) after 48 hours (i) BI Organ fluorescent imaging in vitro in 4T1 tumor mice treated with -SP and (ii) BI-SPD, and d) normalized fluorescent intensity plot of organs. (n = 4, SEM, * p ≦ 0.05, *** p ≦ 0.001)

이하 첨부한 표 또는 도면들을 참조하여 본 발명에 대해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the accompanying table or drawings.

도면이 기재되어 있을 경우, 이는 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서 본 발명은 제시되는 도면들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있으며, 상기 도면들은 본 발명의 사상을 명확히 하기 위해 과장되어 도시될 수 있다.When the drawings are described, they are provided as examples in order to ensure that features of the present invention to those skilled in the art will fully convey. Accordingly, the present invention is not limited to the drawings presented, but may be embodied in other forms, and the drawings may be exaggerated for clarity.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.At this time, if there is no other definition in the technical terms and scientific terms used, it has the meaning that is commonly understood by those of ordinary skill in the art to which the present invention belongs, the gist of the present invention in the following description and the accompanying drawings Descriptions of well-known functions and configurations that may be unnecessarily blurred are omitted.

이하, 근적외선을 이용한 세포 내 물질 전달을 위한 나노 어셈블리에 대하여 상세히 설명한다.Hereinafter, the nanoassembly for intracellular mass transfer using near infrared rays will be described in detail.

본 발명은The present invention

근적외선에 의해 광열 효과를 내는 물질;Materials exerting a photothermal effect by near infrared rays;

상기 근적외선에 의해 광열 효과를 내는 물질에 랩핑(wrapping)된 알부민 층;An albumin layer wrapped on the material exerting a photothermal effect by the near infrared ray;

상기 알부민 층의 표면에 접합되며, 세포 내로 전달하고자 하는 물질을 포함하고, 종양 특이적 세포 침투 단백질과 링커로 연결된 ssPEI (Disulfide-containing Polyethylenimine);A ssPEI (Disulfide-containing Polyethylenimine) conjugated to the surface of the albumin layer and containing a substance to be delivered into a cell, and linked to a tumor specific cell penetrating protein by a linker;

를 포함하는, 근적외선을 이용한 세포 내 물질 전달을 위한 나노 어셈블리에 관한 것이다.It relates to a nano-assembly for intracellular mass transfer using a near-infrared.

알부민, 그 중에서도 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)은 무기 및 유기 나노 입자를 안정화시키는 데 사용되는 수용성 단백질로, 마약 및 근적외선 염료 등의 소수성 화합물을 수용하고, 양전하를 띤 고분자(polymer)의 정전기 흡수를 선호하는 특징이 있다. 근적외선(near infrared, NIR) 염료가 함유된 소 혈청 알부민 나노 입자는 향상된 투과성 유지(enhanced permeability retention)가 가능하여, 높은 축적(high accumulation)이 가능하여, 본 발명에서와 같이 광열 효과를 이용한 처치에 활용할 수 있다. 또한, 알부민은 폴리에틸렌이민(polyethylenimine, PEI) 폴리플렉스(polyplex)에 우수한 혈청 안정성(serum stability) 및 방오성(antifouling property)을 제공할 수 있어, 종래 기술에서 많이 사용되어 오던 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)의 단점인 친수성 PEG,와 유전자 운반 고분자의 결합이 불량한 고분자-DNA 응축을 야기하는 문제점을 극복할 수 있는 유용한 대안이 될 수 있다.Albumin, especially bovine serum albumin (BSA), is a water-soluble protein used to stabilize inorganic and organic nanoparticles. It contains hydrophobic compounds such as drugs and near-infrared dyes, and is made of a positively charged polymer. There is a feature that favors electrostatic absorption. Bovine serum albumin nanoparticles containing near infrared (NIR) dyes allow for enhanced permeability retention and high accumulation, thus enabling treatment using photothermal effects as in the present invention. It can be utilized. In addition, albumin can provide excellent serum stability and antifouling properties to polyethylenimine (PEI) polyplexes, and thus has been widely used in the prior art. The combination of hydrophilic PEG, a gene-carrying polymer, which is a disadvantage of), can be a useful alternative to overcome the problem of poor polymer-DNA condensation.

본 발명에서, 상기 근적외선에 의해 광열 효과를 내는 물질은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 특별히 제한되지 않으며, 일예로 헤파메틴 시아닌 계열 염료(heptamethine cyanine dyes)일 수 있다. 상기 염료를 사용 시 다양한 종양 모델에서 높은 근적외선 흡광 및 광열 효과를 나타낼 수 있어 바람직하며, 종래의 양이온성 미셀(cationic micelles) 또는 리포좀(liposome) 기반의 나노 입자가 생체 내 순환 시 독성을 나타내거나 누출 현상을 나타내는 문제를 해결할 수 있어 더욱 좋은 대안이 될 수 있다.In the present invention, the material that exerts the photothermal effect by the near infrared ray is not particularly limited as long as the object of the present invention is not impaired. For example, hepamethine cyanine dyes may be used. The use of the dye is preferred because it can exhibit high near-infrared absorption and photothermal effects in various tumor models, and conventional cationic micelles or liposome-based nanoparticles exhibit toxicity or leakage during in vivo circulation. It can be a better alternative because it can solve the problem of the phenomenon.

본 발명에서, 상기 세포 내로 전달하고자 하는 물질은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 특별히 제한되지 않으며, 일예로 핵산, 플라스미드, 유전자 단편, 올리고핵산, 생리활성물질, siRNA, miRNA, 단백질, 리피드, 올리고 펩타이드 및 항체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있으며, 좋게는 핵산, 플라스미드, 유전자 단편, 올리고핵산, 생리활성물질, siRNA, miRNA, 더욱 좋게는 플라스미드일 수 있다.In the present invention, the substance to be delivered into the cell is not particularly limited as long as it does not impair the object of the present invention, for example, nucleic acids, plasmids, gene fragments, oligonucleotides, bioactive substances, siRNA, miRNA, proteins, lipids, It may be any one or two or more selected from the group consisting of oligopeptides and antibodies, preferably may be a nucleic acid, plasmid, gene fragment, oligonucleic acid, bioactive material, siRNA, miRNA, more preferably plasmid.

본 발명에서, 상기 헤파메틴 시아닌 계열 염료는 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 특별히 제한되지 않으며, 일예로 IR780(2-[2-[2-Chloro-3-[(1 ,3-dihydro-3,3-dimethyl-1-propyl-2H-indol-2ylidene)ethylidene]-1 -cyclohexen-1-yl]ethenyl]-3,3-dimethyl-1-propylindolium iodide), IR808 (Br 2-[(E)-2-[(3E)-2-chloro-3-{2-[(2E)-3,3-dimethyl-1-pentyl-2,3-dihydro-1H-indol-2-ylidene]ethylidene}cyclohex-1-en-1-yl]ethenyl]-3,3-dimethyl-1-pentyl-3H-indol-1-ium), IR825 (3-(4-carboxybenzyl)-2-((E)-2-((E)-3-((Z)-2-(3-(4-carboxybenzyl)-1,1-dimethyl-1,3-dihydro-2H-benzo[e]indol-2-ylidene)ethylidene)-2-chlorocyclohex-1-en-1-yl)vinyl)-1,1-dimethyl-1H-benzo[e]indol-3-ium bromide), MHI-148 (2-[2-[2-Chloro-3-[2-[1,3-dihydro-3,3-dimethyl-1-(5-carboxypentyl)-2H-indol-2-ylidene]-ethylidene]-1-cyclohexen-1-yl]-ethenyl]-3,3-dimethyl-1-(5-carboxypentyl)-3H-indolium bromide)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상, 바람직하게는 IR780을 사용할 수 있다. 상기 염료를 사용 시 다양한 종양 모델에서 높은 근적외선 흡광 및 광열 효과를 나타낼 수 있으며, 특히 IR780 요오드 염료는 바이오 이미징 및 광열 절제 요법 등에 사용될 수 있어 더욱 바람직하다.In the present invention, the hepamethin cyanine-based dye is not particularly limited as long as it does not impair the object of the present invention, for example, IR780 (2- [2- [2-Chloro-3-[(1,3-dihydro-3) , 3-dimethyl-1-propyl-2H-indol-2ylidene) ethylidene] -1 -cyclohexen-1-yl] ethenyl] -3,3-dimethyl-1-propylindolium iodide), IR808 (Br 2-[(E) -2-[(3E) -2-chloro-3- {2-[(2E) -3,3-dimethyl-1-pentyl-2,3-dihydro-1H-indol-2-ylidene] ethylidene} cyclohex- 1-en-1-yl] ethenyl] -3,3-dimethyl-1-pentyl-3H-indol-1-ium), IR825 (3- (4-carboxybenzyl) -2-((E) -2- ( (E) -3-((Z) -2- (3- (4-carboxybenzyl) -1,1-dimethyl-1,3-dihydro-2H-benzo [e] indol-2-ylidene) ethylidene) -2 -chlorocyclohex-1-en-1-yl) vinyl) -1,1-dimethyl-1H-benzo [e] indol-3-ium bromide), MHI-148 (2- [2- [2-Chloro-3- [2- [1,3-dihydro-3,3-dimethyl-1- (5-carboxypentyl) -2H-indol-2-ylidene] -ethylidene] -1-cyclohexen-1-yl] -ethenyl] -3, 3-dimethyl-1- (5-carboxypentyl) -3H-indolium bromide) any one or two or more selected from the group consisting of, preferably IR780 can do. The use of the dye may exhibit high near-infrared absorption and photothermal effects in various tumor models, and in particular, IR780 iodine dyes may be used for bioimaging and photothermal ablation therapy.

본 발명에서, 상기 종양 특이적 세포 침투 단백질은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 특별히 제한되지 않으며, 일예로 DS 4-3 펩타이드 (CRIMRILRILKLAR-NH2)일 수 있다. DS 4-3 펩타이드는 전위 조절된 칼륨 채널(Kv2.1)의 S5 서브유닛에서 유래된 새로운 세포 침투성 펩타이드로, 암세포에 대한 높은 전달 효능을 가지고 있어 바람직하다.In the present invention, the tumor specific cell penetrating protein is not particularly limited as long as it does not inhibit the object of the present invention, for example, may be a DS 4-3 peptide (CRIMRILRILKLAR-NH2). The DS 4-3 peptide is a novel cell penetrating peptide derived from the S5 subunit of the translocation regulated potassium channel (Kv2.1), which is preferred because it has high delivery efficiency to cancer cells.

본 발명에서, 상기 세포는 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 특별히 제한되지 않으며, 일예로 동물세포 또는 식물세포일 수 있으며, 좋게는 동물세포일 수 있으며, 더욱 좋게는 종양 세포(tumor cell)일 수 있다.In the present invention, the cell is not particularly limited as long as it does not impair the object of the present invention, for example, may be an animal cell or a plant cell, preferably an animal cell, more preferably a tumor cell (tumor cell) Can be.

본 발명에서, 상기 링커는 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 특별히 제한되지 않으며, 일예로 EMCS (N-ε-malemidocaproyl-oxysuccinimide ester)일 수 있다.In the present invention, the linker is not particularly limited as long as it does not impair the object of the present invention, for example, may be N-ε-malemidocaproyl-oxysuccinimide ester (EMCS).

본 발명에서, 상기 동물세포는 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 특별히 제한되지 않으며, 일예로 전이성 유방암 세포(metastatic breast cancer cell)일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따른 결과에 의하면, 전이성 유방암 세포인 4T1과 비전이성 유방암 세포인 4T7에 대하여 본 발명의 BI-SPD 나노 어셈블리 처리 후 레이저를 조사하여 광열 효과를 유도한 결과, 전이성 유방암 세포인 4T1에 대해 현저히 우수한 치료 효과를 나타내어, 전이성 암의 치료용 물질로 활용될 수 있어 바람직하다.In the present invention, the animal cells are not particularly limited so long as they do not impair the object of the present invention, for example, may be metastatic breast cancer cells. According to the results according to an embodiment of the present invention, 4T1, which is a metastatic breast cancer cell and 4T7, which is a non-metastatic breast cancer cell, was irradiated with a laser after the treatment of the BI-SPD nanoassembly of the present invention to induce a photothermal effect. Phosphorus 4T1 exhibits a remarkably excellent therapeutic effect, and can be used as a therapeutic agent for metastatic cancer.

다음으로, 근적외선을 이용한 세포 내 물질 전달을 위한 나노 어셈블리의 제조 방법에 대하여 상세히 설명한다.Next, a method for manufacturing a nanoassembly for intracellular mass transfer using near infrared rays will be described in detail.

본 발명의 다른 양태는Another aspect of the invention

근적외선에 의해 광열 효과를 내는 물질에 알부민 층이 랩핑(wrapping)된 나노 입자를 제조하는 단계;Preparing nanoparticles in which an albumin layer is wrapped in a material exerting a photothermal effect by near infrared rays;

ssPEI (Disulfide-containing Polyethylenimine)와 종양 특이적 세포 침투 단백질의 결합체를 제조하는 단계;preparing a combination of disulfide-containing Polyethylenimine (ssPEI) and tumor specific cell infiltration protein;

상기 결합체에 세포 내로 전달하고자 하는 물질이 결합된 폴리플렉스를 제조하는 단계; 및Preparing a polyplex in which a substance to be delivered into the cell is bound to the conjugate; And

상기 나노 입자와 상기 폴리플렉스를 혼합하여 나노 어셈블리(nanoassembly)를 제조하는 단계;Preparing a nanoassembly by mixing the nanoparticles with the polyplex;

를 포함하는, 근적외선을 이용한 세포 내 물질 전달을 위한 나노 어셈블리의 제조 방법에 관한 것이다.It relates to a method of manufacturing a nano-assembly for intracellular mass transfer using a near-infrared.

알부민, 그 중에서도 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)은 무기 및 유기 나노 입자를 안정화시키는 데 사용되는 수용성 단백질로, 마약 및 근적외선 염료 등의 소수성 화합물을 수용하고, 양전하를 띤 고분자(polymer)의 정전기 흡수를 선호하는 특징이 있다. 근적외선(near infrared, NIR) 염료가 함유된 소 혈청 알부민 나노 입자는 향상된 투과성 유지(enhanced permeability retention)가 가능하여, 높은 축적(high accumulation)이 가능하여, 본 발명에서와 같이 광열 효과를 이용한 처치에 활용할 수 있다. 또한, 알부민은 폴리에틸렌이민(polyethylenimine, PEI) 폴리플렉스(polyplex)에 우수한 혈청 안정성(serum stability) 및 방오성(antifouling property)을 제공할 수 있어, 종래 기술에서 많이 사용되어 오던 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)의 단점인 친수성 PEG,와 유전자 운반 고분자의 결합이 불량한 고분자-DNA 응축을 야기하는 문제점을 극복할 수 있는 유용한 대안이 될 수 있다.Albumin, especially bovine serum albumin (BSA), is a water-soluble protein used to stabilize inorganic and organic nanoparticles. It contains hydrophobic compounds such as drugs and near-infrared dyes, and is made of a positively charged polymer. There is a feature that favors electrostatic absorption. Bovine serum albumin nanoparticles containing near infrared (NIR) dyes allow for enhanced permeability retention and high accumulation, thus enabling treatment using photothermal effects as in the present invention. It can be utilized. In addition, albumin can provide excellent serum stability and antifouling properties to polyethylenimine (PEI) polyplexes, and thus has been widely used in the prior art. The combination of hydrophilic PEG, a gene-carrying polymer, which is a disadvantage of), can be a useful alternative to overcome the problem of poor polymer-DNA condensation.

본 발명에서, 상기 근적외선에 의해 광열 효과를 내는 물질은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 특별히 제한되지 않으며, 일예로 헤파메틴 시아닌 계열 염료(heptamethine cyanine dyes)일 수 있다. 상기 염료를 사용 시 다양한 종양 모델에서 높은 근적외선 흡광 및 광열 효과를 나타낼 수 있어 바람직하며, 종래의 양이온성 미셀(cationic micelles) 또는 리포좀(liposome) 기반의 나노 입자가 생체 내 순환 시 독성을 나타내거나 누출 현상을 나타내는 문제를 해결할 수 있어 더욱 좋은 대안이 될 수 있다.In the present invention, the material that exerts the photothermal effect by the near infrared ray is not particularly limited as long as the object of the present invention is not impaired. For example, hepamethine cyanine dyes may be used. The use of the dye is preferred because it can exhibit high near-infrared absorption and photothermal effects in various tumor models, and conventional cationic micelles or liposome-based nanoparticles exhibit toxicity or leakage during in vivo circulation. It can be a better alternative because it can solve the problem of the phenomenon.

본 발명에서, 상기 세포 내로 전달하고자 하는 물질은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 특별히 제한되지 않으며, 일예로 핵산, 플라스미드, 유전자 단편, 올리고핵산, 생리활성물질, siRNA, miRNA, 단백질, 리피드, 올리고 펩타이드 및 항체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있으며, 좋게는 핵산, 플라스미드, 유전자 단편, 올리고핵산, 생리활성물질, siRNA, miRNA, 더욱 좋게는 플라스미드일 수 있다.In the present invention, the substance to be delivered into the cell is not particularly limited as long as it does not impair the object of the present invention, for example, nucleic acids, plasmids, gene fragments, oligonucleotides, bioactive substances, siRNA, miRNA, proteins, lipids, It may be any one or two or more selected from the group consisting of oligopeptides and antibodies, preferably may be a nucleic acid, plasmid, gene fragment, oligonucleic acid, bioactive material, siRNA, miRNA, more preferably plasmid.

본 발명에서, 상기 헤파메틴 시아닌 계열 염료는 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 특별히 제한되지 않으며, 일예로 IR780(2-[2-[2-Chloro-3-[(1 ,3-dihydro-3,3-dimethyl-1-propyl-2H-indol-2ylidene)ethylidene]-1 -cyclohexen-1-yl]ethenyl]-3,3-dimethyl-1-propylindolium iodide), IR808(Br 2-[(E)-2-[(3E)-2-chloro-3-{2-[(2E)-3,3-dimethyl-1-pentyl-2,3-dihydro-1H-indol-2-ylidene]ethylidene}cyclohex-1-en-1-yl]ethenyl]-3,3-dimethyl-1-pentyl-3H-indol-1-ium), IR825 (3-(4-carboxybenzyl)-2-((E)-2-((E)-3-((Z)-2-(3-(4-carboxybenzyl)-1,1-dimethyl-1,3-dihydro-2H-benzo[e]indol-2-ylidene)ethylidene)-2-chlorocyclohex-1-en-1-yl)vinyl)-1,1-dimethyl-1H-benzo[e]indol-3-ium bromide), MHI-148 (2-[2-[2-Chloro-3-[2-[1,3-dihydro-3,3-dimethyl-1-(5-carboxypentyl)-2H-indol-2-ylidene]-ethylidene]-1-cyclohexen-1-yl]-ethenyl]-3,3-dimethyl-1-(5-carboxypentyl)-3H-indolium bromide)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상, 바람직하게는 IR780을 사용할 수 있다. 상기 염료를 사용 시 다양한 종양 모델에서 높은 근적외선 흡광 및 광열 효과를 나타낼 수 있으며, 특히 IR780 요오드 염료는 바이오 이미징 및 광열 절제 요법 등에 사용될 수 있어 더욱 바람직하다.In the present invention, the hepamethin cyanine-based dye is not particularly limited as long as it does not impair the object of the present invention, for example, IR780 (2- [2- [2-Chloro-3-[(1,3-dihydro-3) , 3-dimethyl-1-propyl-2H-indol-2ylidene) ethylidene] -1 -cyclohexen-1-yl] ethenyl] -3,3-dimethyl-1-propylindolium iodide), IR808 (Br 2-[(E) -2-[(3E) -2-chloro-3- {2-[(2E) -3,3-dimethyl-1-pentyl-2,3-dihydro-1H-indol-2-ylidene] ethylidene} cyclohex- 1-en-1-yl] ethenyl] -3,3-dimethyl-1-pentyl-3H-indol-1-ium), IR825 (3- (4-carboxybenzyl) -2-((E) -2- ( (E) -3-((Z) -2- (3- (4-carboxybenzyl) -1,1-dimethyl-1,3-dihydro-2H-benzo [e] indol-2-ylidene) ethylidene) -2 -chlorocyclohex-1-en-1-yl) vinyl) -1,1-dimethyl-1H-benzo [e] indol-3-ium bromide), MHI-148 (2- [2- [2-Chloro-3- [2- [1,3-dihydro-3,3-dimethyl-1- (5-carboxypentyl) -2H-indol-2-ylidene] -ethylidene] -1-cyclohexen-1-yl] -ethenyl] -3, 3-dimethyl-1- (5-carboxypentyl) -3H-indolium bromide) any one or two or more selected from the group consisting of, preferably IR780 Can. The use of the dye may exhibit high near-infrared absorption and photothermal effects in various tumor models, and in particular, IR780 iodine dyes may be used for bioimaging and photothermal ablation therapy.

본 발명에서, 상기 종양 특이적 세포 침투 단백질은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 특별히 제한되지 않으며, 일예로 DS 4-3 펩타이드 (CRIMRILRILKLAR-NH2)일 수 있다. DS 4-3 펩타이드는 전위 조절된 칼륨 채널(Kv2.1)의 S5 서브유닛에서 유래된 새로운 세포 침투성 펩타이드로, 암세포에 대한 높은 전달 효능을 가지고 있어 바람직하다.In the present invention, the tumor specific cell penetrating protein is not particularly limited as long as it does not inhibit the object of the present invention, for example, may be a DS 4-3 peptide (CRIMRILRILKLAR-NH2). The DS 4-3 peptide is a novel cell penetrating peptide derived from the S5 subunit of the translocation regulated potassium channel (Kv2.1), which is preferred because it has high delivery efficiency to cancer cells.

본 발명에서, 상기 세포는 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 특별히 제한되지 않으며, 일예로 동물세포 또는 식물세포일 수 있으며, 좋게는 동물세포일 수 있으며, 더욱 좋게는 종양 세포(tumor cell)일 수 있다.In the present invention, the cell is not particularly limited as long as it does not impair the object of the present invention, for example, may be an animal cell or a plant cell, preferably an animal cell, more preferably a tumor cell (tumor cell) Can be.

본 발명에서, 상기 링커는 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 특별히 제한되지 않으며, 일예로 EMCS (N-ε-malemidocaproyl-oxysuccinimide ester)일 수 있다.In the present invention, the linker is not particularly limited as long as it does not impair the object of the present invention, for example, may be N-ε-malemidocaproyl-oxysuccinimide ester (EMCS).

본 발명에서, 상기 동물세포는 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 특별히 제한되지 않으며, 일예로 전이성 유방암 세포(metastatic breast cancer cell)일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따른 결과에 의하면, 전이성 유방암 세포인 4T1과 비전이성 유방암 세포인 4T7에 대하여 본 발명의 BI-SPD 나노 어셈블리 처리 후 레이저를 조사하여 광열 효과를 유도한 결과, 전이성 유방암 세포인 4T1에 대해 현저히 우수한 치료 효과를 나타내어, 전이성 암의 치료용 물질로 활용될 수 있어 바람직하다.In the present invention, the animal cells are not particularly limited so long as they do not impair the object of the present invention, for example, may be metastatic breast cancer cells. According to the results according to an embodiment of the present invention, 4T1, which is a metastatic breast cancer cell and 4T7, which is a non-metastatic breast cancer cell, was irradiated with a laser after the treatment of the BI-SPD nanoassembly of the present invention to induce a photothermal effect. Phosphorus 4T1 exhibits a remarkably excellent therapeutic effect, and can be used as a therapeutic agent for metastatic cancer.

다음으로, 근적외선을 이용한 세포 내 물질 전달 방법에 대하여 상세히 설명한다.Next, the intracellular mass transfer method using near infrared rays will be described in detail.

본 발명의 또 다른 양태는Another aspect of the invention

세포에 상기 나노 어셈블리를 처리한 후 근적외선을 조사하는 단계를 포함하는, 근적외선을 이용한 세포 내 물질 전달 방법에 관한 것이다.It relates to a method for intracellular mass transfer using near-infrared, comprising the step of irradiating near-infrared after treatment of the nanoassembly to the cell.

본 발명에서, 상기 근적외선은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 특별히 제한되지 않으며, 일예로 600 내지 1,000 nm, 좋게는 650 내지 900 nm, 더욱 좋게는 700 내지 850 nm의 파장을 가질 수 있다. 상기 범위에서 헤파메틴 시아닌 계열 염료의 근적외선 흡광 및 광열 효과를 나타낼 수 있어 바람직하다.In the present invention, the near-infrared ray is not particularly limited as long as it does not impair the object of the present invention, for example, may have a wavelength of 600 to 1,000 nm, preferably 650 to 900 nm, more preferably 700 to 850 nm. Since the near infrared absorption and the photothermal effect of the hepamethine cyanine series dye can be shown in the said range, it is preferable.

이하, 본 발명의 내용을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the content of the present invention will be described in more detail with reference to Examples. The examples are only for more specifically describing the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereto.

[시약, 재료 및 프로토콜] Reagents, Materials and Protocols

bPEI: Branched Polyethylenimine (Mw=25 KDa) - Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).bPEI: Branched Polyethylenimine (Mw = 25 KDa) -Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

환원 GSH(reduced glutathione), BSA(Bovine Serum Albumin), 부티오닌 술폭시민(buthionine sulfoximine, BSO), 아크리딘 오렌지(acridine orage, AO), 시트라콘산 무수물(citraconic anhydride), IR780 염료 - Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).Reduced glutathione (GSH), Bovine Serum Albumin (BSA), butionine sulfoximine (BSO), acridine orange (AO), citraconic anhydride, IR780 dye-Sigma -Aldrich (St. Louis, MO, USA).

bPEI: Branched Polyethylenimine (Mw=1800 Da) - Polysciences Inc.(Pennsylvania, USA).bPEI: Branched Polyethylenimine (Mw = 1800 Da)-Polysciences Inc. (Pennsylvania, USA).

루시퍼라아제 플라스미드(pLuc), pMAX GFP(green fluorescent protein) - Amaxa LonzaLuciferase plasmid (pLuc), pMAX green fluorescent protein (gmax)-amaxa lonza

100 ug/mL 카나마이신이 포함된 Luria-Bertani 배지 - Biosesang Inc.(Korea).Luria-Bertani medium containing 100 ug / mL kanamycin-Biosesang Inc. (Korea).

프로필렌 설파이드(propylene sulfide) - Tokyo Chemicals Inc.(TCI, Japan).Propylene sulfide-Tokyo Chemicals Inc. (TCI, Japan).

DS 4-3 펩타이드(DS 4-3 peptide; CRIMRILRILKLAR-NH2) - GenicBio(Shanghai, China)에서 합성.DS 4-3 peptide (CRIMRILRILKLAR-NH2)-synthesized in GenicBio (Shanghai, China).

EMCS(N-ε-malemidocaproyl-oxy-succinimide ester) 링커, BOBO3 염료, Lysotracker green, Lysotracker blue, DAPI 염료 - Thermo Fisher Scientific Korea Ltd.(Seoul, South Korea).N-ε-malemidocaproyl-oxy-succinimide ester (EMCS) linker, BOBO3 dye, Lysotracker green, Lysotracker blue, DAPI dye-Thermo Fisher Scientific Korea Ltd. (Seoul, South Korea).

바필로마이신(bafilomycin) - Adipogen Life Sciences(San Diego, USA)Bafilomycin-Adipogen Life Sciences (San Diego, USA)

[실시예] EXAMPLE

ssPEIssPEI (Disulfide- (Disulfide- contatingcontating PolyethyleniminePolyethylenimine )의 합성) Synthesis

티올화된 bPEI (SHbPEI) 및 ssPEI의 제조는 이전에 보고된 방법을 약간 변형하여 수행되었다(S. Son et al. Biomaterials 31:6344-6354 (2010), Q. Peng et al. Bioconjug. Chem. 19:499-506 (2008)). 아래에 변형된 방법을 간략히 기술하였다.The preparation of thiolated bPEI ( SH bPEI) and ssPEI was performed with a slight modification of the previously reported method (S. Son et al. Biomaterials 31: 6344-6354 (2010), Q. Peng et al. Bioconjug. Chem 19: 499-506 (2008). The modified method is briefly described below.

먼저 25 mL 증류수 중의 1.8 kDa bPEI 5 g을 1 N HCl을 첨가하여 pH 6.9로 산성화한 후, 3 일간 동결건조하였다. 고체화된 bPEI 분말을 150 mL 메탄올에 용해하고, 이후 10 분간 질소로 배출(purge)하였다.First 5 g of 1.8 kDa bPEI in 25 mL distilled water were acidified to pH 6.9 by addition of 1 N HCl and then lyophilized for 3 days. The solidified bPEI powder was dissolved in 150 mL methanol and then purged with nitrogen for 10 minutes.

주사기(syringe)를 이용하여, 5배 몰 과량의 프로필렌 황화물(propylene sulfide)을 적가하고, 용액을 60 ℃에서 24 시간 지속적으로 교반하였다. 반응 혼합물을 차가운 디에틸에테르를 이용하여 2 회 침전시킨 후, 5,000 rpm에서 30분간 원심분리하였다. 공기 중에서 건조된 시료는 Ellman 방법을 이용하여 티올 농도를 분석하였다. Using a syringe, a 5-fold molar excess of propylene sulfide was added dropwise and the solution was continuously stirred at 60 ° C. for 24 hours. The reaction mixture was precipitated twice with cold diethyl ether and then centrifuged at 5,000 rpm for 30 minutes. Samples dried in air were analyzed for thiol concentration using the Ellman method.

1 g의 SHbPEI를 100 mL DMSO에 용해한 후, 교반하면서 48 시간 실온에 유지하였다.1 g of SHbPEI was dissolved in 100 mL DMSO and then kept at room temperature for 48 hours with stirring.

최종 생성물은 증류수로 투석하여 정제한 후, 3 일간 동결건조하였다.The final product was purified by dialysis with distilled water and then lyophilized for 3 days.

이후, H-NMR을 이용하여 bPEI의 티올(thiol)의 존재를 확인하였다.Thereafter, the presence of thiol of bPEI was confirmed using H-NMR.

a) SHbPEI, 1H NMR (400 MHz, D2O): δ 3.25-2.45(NCH2CH2N, NCH2CHCH2S), 1.18-1.05(CH3), a) SHbPEI, 1 H NMR (400 MHz, D 2 O): δ 3.25-2.45 (NCH 2 CH 2 N, NCH 2 CHCH 2 S), 1.18-1.05 (CH 3 ),

b) ssPEI, δ 3.14-2.66 (m, NCH2CH2N,NCH2CHCH2S), 1.3-1.15 (m, CH3).b) ssPEI, δ 3.14-2.66 (m, NCH 2 CH 2 N, NCH 2 CHCH 2 S), 1.3-1.15 (m, CH 3 ).

ssPEI 티올 함량의 감소량은 Ellman 방법을 사용하여 결정하였다.The amount of reduction in ssPEI thiol content was determined using the Ellman method.

ssPEIssPEI -- DS의DS 합성 synthesis

DS 4-3 펩타이드를 ssPEI와 결합시키기 전에, 시트라콘산 무수물(citraconic anhydride; CA)을 이용하여 펩타이드의 티아민 말단(theamine terminal)을 캡핑(capping)하였다.Prior to binding the DS 4-3 peptide with ssPEI, citraconic anhydride (CA) was used to cap the amine terminal of the peptide.

DS 4-3 펩타이드와 시트라콘산 무수물을 5 mL PBS(pH 7.4)에서 1:10의 몰 비율로 혼합한 후, 밤새 교반하였다.The DS 4-3 peptide and citraconic anhydride were mixed in 5 mL PBS pH 7.4 at a molar ratio of 1:10 and then stirred overnight.

EMCS 링커를 펩타이드-시트라콘산 무수물 용액에 첨가하고, 0.1 M HCl을 이용하여 pH 6으로 용액의 pH를 감소시켰다.EMCS linker was added to the peptide-citraconic anhydride solution and the pH of the solution was reduced to pH 6 with 0.1 M HCl.

ssPEI-DS의 합성을 위해 10배 몰 과량의 EMCS 링커를 시트라콘산 무수물과 캡핑된 DS 4-3 펩타이드 혼합 용액에 첨가한 후, 4 ℃에서 2 시간 교반하였다.A 10-fold molar excess of EMCS linker was added to the mixed solution of citraconic anhydride and the capped DS 4-3 peptide for the synthesis of ssPEI-DS and then stirred at 4 ° C. for 2 hours.

이후, 50 mg ssPEI를 24 시간 동안 용액에 천천히 첨가하였다.Thereafter, 50 mg ssPEI was slowly added to the solution for 24 hours.

반응 종료 후, 용액을 증류수로 24 시간 투석한 후, 동결건조하였다. 접합(conjugation) 후, 동결건조된 시료를 pH 10의 1 M 히드록실아민-카보네이트 버퍼 용액에 용해시키고, 실온에서 밤새 교반하였다.After completion of the reaction, the solution was dialyzed with distilled water for 24 hours and then lyophilized. After conjugation, the lyophilized sample was dissolved in 1 M hydroxylamine-carbonate buffer solution at pH 10 and stirred overnight at room temperature.

이후 용액은 큰 부피의 증류수로 8 시간 동안 투석하고 다시 동결건조하였다.The solution was then dialyzed with a large volume of distilled water for 8 hours and lyophilized again.

BI 나노입자 (IR780이 BI nanoparticles (IR780 담지된Supported BSA)의 제조 BSA) Preparation

BSA 40 g을 1 mL 증류수에 용해한 후, 25 mM 글루타치온(GSH) 처리하고 37 ℃에서 1 시간 교반하였다.40 g of BSA was dissolved in 1 mL distilled water, and then treated with 25 mM glutathione (GSH) and stirred at 37 ° C for 1 hour.

다음으로, 상이한 농도의 IR780을 함유하는 200 mL DMF를 천천히 수득한 용액에 첨가하였다. 증류수를 전체 용액부피가 5 mL이 되도록 첨가하고, 실온에서 30 분간 방치한 후, 용액을 4 ℃에서 밤새 교반하였다.Next, 200 mL DMF containing different concentrations of IR780 was slowly added to the resulting solution. Distilled water was added so that the total solution volume was 5 mL, left at room temperature for 30 minutes, and then the solution was stirred at 4 ° C. overnight.

GSH 및 결합되지 않은 BSA 제거를 위해, 분자량 컷오프 50 kDa로 3 일간 증류수 투석하였다.For removal of GSH and unbound BSA, distilled water dialysis was performed for 3 days with a molecular weight cutoff of 50 kDa.

마지막으로, BSA-IR780 나노 입자(nanoparticles, NPs)를 동결건조하고, 4 ℃에 보관하였다. BSA-IR780 나노 입자에 담지된 IR780의 양은 BI 입자의 UV-Vis 흡수 스펙트럼과 IR780 표준 곡선을 비교하여 결정하였다.Finally, BSA-IR780 nanoparticles (nanoparticles, NPs) were lyophilized and stored at 4 ° C. The amount of IR780 supported on the BSA-IR780 nanoparticles was determined by comparing the UV-Vis absorption spectrum of the BI particles with the IR780 standard curve.

BI-BI- SPDSPD 나노 어셈블리의 형성 Formation of Nano Assembly

SPD는 실온에서 20 분간 1 ug의 pLuc 플라스미드 DNA(firefly luciferase expression plasmid)와 함께 배양하였다.SPD was incubated with 1 ug of pLuc plasmid DNA (firefly luciferase expression plasmid) for 20 minutes at room temperature.

이후, BI 나노 입자를 상기 제조한 SPD 폴리플렉스에 1:1 (w/w)의 중량비로 첨가하고 실온에서 20 분간 배양하였다.Thereafter, BI nanoparticles were added to the prepared SPD polyplex in a weight ratio of 1: 1 (w / w) and incubated at room temperature for 20 minutes.

나노 어셈블리의 크기와 표면 전하는 Malverin Zetasizer를 이용하여 측정하였고, 1% 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 DNA 복합체화를 확인하였다.The size and surface charge of the nanoassembly were measured using a Malverin Zetasizer, and DNA complexation was confirmed by performing 1% agarose gel electrophoresis.

상기 실시예를 통해 제조한 나노 어셈블리에 대한 특성의 측정 및 본 발명의 목적에 따른 효과를 확인하기 위해 하기 시험예 1 ~ 시험예 12에 따라 수행하였으나 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.In order to measure the properties of the nano-assembly prepared through the above examples and to confirm the effect according to the object of the present invention was performed according to the following Test Example 1 to Test Example 12, but the scope of the present invention is not limited thereto.

[시험예 1] BOBO-3 형광 퀀칭 시험(fluorescent quenching assay)Test Example 1 BOBO-3 Fluorescent Quenching Assay

상기 실시예 4의 플라스미드 DNA와 BOBO-3 염료를 DNA bp: 염료 분자가 5:1의 비율이 되도록 혼합하고 실온에서 30 분간 볼텍싱하였다.The plasmid DNA of Example 4 and the BOBO-3 dye were mixed so that the DNA bp: dye molecule was 5: 1 and vortexed at room temperature for 30 minutes.

서로 다른 양의 SPD를 상기 염료가 라벨링된 플라스미드 DNA 1 ug에 첨가하고, 30분간 배양하였다. 이후, BSA/IR780 나노 입자를 1:1의 중량비로 SPD 폴리플렉스에 30 분간 혼합하였다.Different amounts of SPD were added to 1 ug of the dye-labeled plasmid DNA and incubated for 30 minutes. Thereafter, the BSA / IR780 nanoparticles were mixed for 30 minutes in the SPD polyplex at a weight ratio of 1: 1.

BOBO-3 용액 및 고분자가 포함되지 않은 DNA/BOBO-3 용액을 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용하였다. The BOBO-3 solution and the DNA / BOBO-3 solution without polymer were used as positive and negative controls, respectively.

602 nm에서의 형광을 Tecan multiplate reader를 사용하여 측정한 후, 형광 퀀칭 비율을 하기 수학식 1을 이용하여 계산하였다.Fluorescence at 602 nm was measured using a Tecan multiplate reader, and the fluorescence quenching ratio was calculated using Equation 1 below.

[수학식 1][Equation 1]

형광 퀀칭(%) = 1-[F-FBOBO-3]/(F0-FBOBO-3)] x 100Fluorescence quenching (%) = 1- [F-FBOBO-3] / (F0-FBOBO-3)] x 100

여기서, FBOBO-3은 순수한 BOBO-3 용액의 형광 강도이고, F는 고분자가 포함된 DNA-BOBO-3의 형광 강도이며, F0은 고분자가 포함되지 않은 DNA-BOBO-3의 형광 강도를 나타낸다.Here, FBOBO-3 is the fluorescence intensity of pure BOBO-3 solution, F is the fluorescence intensity of DNA-BOBO-3 containing polymer, and F0 is the fluorescence intensity of DNA-BOBO-3 not containing polymer.

[시험예 2] BI 나노 입자 및 BI-SPD 나노 어셈블리의 TEM 특성Test Example 2 TEM Characteristics of BI Nanoparticles and BI-SPD Nano Assemblies

BSA-IR780 나노 입자의 입자 크기 및 형태학적 구조는 FE-TEM(field emission TEM; Jeol JEM-2100F)를 이용하여 측정하였다.Particle size and morphological structure of the BSA-IR780 nanoparticles were measured using a field emission TEM (Jeol JEM-2100F).

나노 어셈블리는 무정형 탄소 코팅 구리 격자(amorphous carbon-coated copper grid)에서 밤새 건조한 후, 200 kV에서 관찰하였다. 상기 격자는 0.05% (w/v)의 포스포텅스텐산 방울로 매질 염색(negative-stained)되었다. 이 단계는 BI 나노 입자를 제외한 모든 시료에 대해 수행되었다.Nano assemblies were observed at 200 kV after overnight drying on an amorphous carbon-coated copper grid. The lattice was negative-stained with 0.05% (w / v) phosphotungstic acid drops. This step was performed for all samples except BI nanoparticles.

[시험예 3] BI-SPD 나노 어셈블리의 광열 효과 측정Test Example 3 Measurement of Photothermal Effect of BI-SPD Nano Assembly

BSA-IR780 나노 입자를 증류수에 용해하여 1 mg/mL의 농도로 제조한 다음, 1 mg/mL에서 62.5 ug/mL까지 연속 희석하였다. BSA-IR780 nanoparticles were dissolved in distilled water to prepare a concentration of 1 mg / mL, and then serially diluted from 1 mg / mL to 62.5 ug / mL.

808 nm 레이저를 1 cm2 당 1 W의 강도로 0.5 cm 직경의 스팟(spot)에 조사하였다. NIR을 조사하는 동안, 용액의 농도를 매 3초마다 15 분간 디지털 열 카메라(digital thermal camera; Avio IR camera/thermometer, Shinagawa-ku, Tokyo, Japan)로 측정하였다. 모든 시험관 세포 연구에서, 유방암 세포는 나노 어셈블리로 2 시간동안 처리한 다음, 배지를 완전 배지(complete medium)로 교체하였다.A 808 nm laser was irradiated to spots of 0.5 cm diameter at an intensity of 1 W per cm 2 . During the NIR irradiation, the concentration of the solution was measured every 15 seconds with a digital thermal camera (Avio IR camera / thermometer, Shinagawa-ku, Tokyo, Japan). In all in vitro cell studies, breast cancer cells were treated with nanoassembly for 2 hours and then the medium was replaced with complete medium.

이후, 808 nm 레이저를 5 분간 조사하고, 세포를 추가로 24 시간 더 배양하였다.Thereafter, the 808 nm laser was irradiated for 5 minutes, and the cells were further incubated for 24 hours.

[시험예 4] BI-SPD 나노 어셈블리에 의해 매개된 이식 유전자 발현(transgene expression)Test Example 4 Transgene Expression Mediated by BI-SPD Nanoassembly

4T1 및 4T7 유방암 세포를 24-웰 플레이트에 5 x 104 cells/웰의 밀도로 접종하고, 37 ℃, 5% CO2인 완전 배지 1 mL에서 밤새 배양하였다. 세포를 무혈청 배지에서 4 시간, 이후 추가로 24 시간 동안 완전 배지에서 나노 어셈블리 처리하였다. 세포를 1 mL의 DPBS로 2회 세척하고, 100 uL/웰의 용해 완충액을 첨가하였다. 기질로 루시페린(luciferin)을 첨가한 후, 마이크로플레이트 분광형광 측정기(microplate spectrofluorometric reader; Tecan Spark®)를 사용하여 발광을 측정하였다.4T1 and 4T7 breast cancer cells were seeded in 24-well plates at a density of 5 × 10 4 cells / well and incubated overnight in 1 mL of complete medium at 37 ° C., 5% CO 2 . Cells were nanoassembled in complete medium for 4 hours in serum-free medium followed by an additional 24 hours. The cells were washed twice with 1 mL of DPBS and 100 uL / well of lysis buffer was added. After adding luciferin as a substrate, luminescence was measured using a microplate spectrofluorometric reader (Tecan Spark®).

[시험예 5] GFP의 정량적, 정성적 발현 분석Test Example 5 Quantitative and Qualitative Expression Analysis of GFP

96-웰 플레이트에 5 x 104 cells/웰의 밀도로 파종된 4T1 세포는 2 시간 동안 pMAX GFP 나노 어셈블리 시료와 함께 배양한 후, 레이저를 조사하였다. 24 시간 동안 배양한 후, 세포는 DPBS로 2회 세척하고, 형광 이미징 시스템(ZOE™ fluorescent cell imager)으로 영상화하였다. 형광 분석을 위해 상기 시료로부터 제조된 세포 용해물을 마이크로플레이트 분광형광 측정기(microplate spectrofluorometric reader; Tecan Spark®)를 사용하여 GFP 형광을 평가하였다. 그 결과는 mg 당 단백질의 GFP 형광 강도로 표시하였다.4T1 cells seeded at a density of 5 × 10 4 cells / well in 96-well plates were incubated with the pMAX GFP nanoassembly sample for 2 hours and then irradiated with a laser. After incubation for 24 hours, cells were washed twice with DPBS and imaged with a fluorescence imaging system (ZOE ™ fluorescent cell imager). Cell lysates prepared from the samples for fluorescence analysis were evaluated for GFP fluorescence using a microplate spectrofluorometric reader (Tecan Spark®). The results are expressed in GFP fluorescence intensity of protein per mg.

[시험예 6] 세포독성 측정Test Example 6 Cytotoxicity Measurement

나노 어셈블리 처리된 유방암 세포의 생존력을 MTS 세포 증식 분석 키트(Promega, USA)를 사용하여 조사하였다. 96-웰 플레이트에서 1 x 104 cells/웰의 밀도로 파종한 후 밤새 배양하였다.The viability of nanoassembly treated breast cancer cells was examined using the MTS Cell Proliferation Assay Kit (Promega, USA). The cells were seeded at a density of 1 × 10 4 cells / well in a 96-well plate and incubated overnight.

레이저 조사 없는 처리를 위해, 나노 어셈블리는 400 uL 무혈청 배지에서 4 시간 동안 세포와 함께 배양한 후, 100 uL의 완전 배지에서 24 시간 배양하였다. 그런 다음, 20 uL의 MTS 용액을 각 웰에 첨가하고, 4 시간 동안 더 배양하였다.For the treatment without laser irradiation, the nanoassembly was incubated with the cells for 4 hours in 400 uL serum free medium and then incubated for 24 hours in 100 uL complete medium. Then, 20 uL of MTS solution was added to each well and incubated further for 4 hours.

490 nm에서의 포르마잔(formazan) 흡광도를 마이크로플레이트 분광형광 측정기(microplate spectrofluorometric reader; Tecan Spark®)를 사용하여 측정하였다.Formazan absorbance at 490 nm was measured using a microplate spectrofluorometric reader (Tecan Spark®).

[시험예 7] 라이브셀 공초점 이미징(live cell confocal imaging)Test Example 7 Live Cell Confocal Imaging

5 x 104 cells/웰을 8-웰 챔버 슬라이드(Nunc® Lab-Tex® II)에 로딩하여 밤새 배양하였다. 그런 다음, 세포를 37 ℃에서 정해진 시간 동안 BI-SPD 나노 어셈블리를 일정량 첨가한 후 배양하였다. 5 x 10 4 cells / well were loaded onto 8-well chamber slides (Nunc® Lab-Tex® II) and incubated overnight. Then, the cells were cultured after adding a certain amount of BI-SPD nanoassembly at 37 ℃ for a predetermined time.

DPBS로 세포를 간단히 세척한 후, 실온에서 15 분 동안 배양하였다. 마지막으로, 세포는 anti-fade 시약을 포함하는 DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole; Thermo Fisher Scientific)로 카운터페이드(counterfade)한 후, 커버 슬립을 덮었다.The cells were briefly washed with DPBS and then incubated for 15 minutes at room temperature. Finally, the cells were counterfade with DAPI (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole; Thermo Fisher Scientific) containing an anti-fade reagent, followed by a cover slip.

라이소트래커(lysotracker) 및 아크리딘 오렌지 분석을 통한 라이브셀 이미징을 위해, 5 x 105 개의 세포를 유리-바닥 접시에 파종 한 후, 밤새 배양하였다. BI-SPD를 처리하고 레이저를 조사한 후, 배지를 제거하였다. 이후 세포는 DPBS로 2회 세척하였다.For live cell imaging via lysotracker and acridine orange analysis, 5 x 10 5 cells were seeded in glass-bottomed dishes and then cultured overnight. After the BI-SPD was treated and laser irradiated, the medium was removed. The cells were then washed twice with DPBS.

그런 다음, 200 uL 라이브셀 이미징 용액에서 15 분간 75 nM의 라이소트래커 DND-26 그린 또는 라이소트래커 DND-22 블루와 함께 배양하였다. 라이소트래커 염색 후, 세포를 DPBS로 2회 세척하고, 1 ug/mL 농도의 Hoechst 33,342로 15 분간 핵산-역염색(nucleic acid counter-staining)하였다. 다시 세포를 DPBS로 세척한 후, 세포를 라이브셀 이미징 용액에서 배양하였다. 유사한 방법으로, 세포를 37 ℃, 5% CO2 환경에서 1 ug/mL 아크리딘 오렌지를 30 분간 처리하였다. 세포를 레이저 스캐닝 공초점 현미경(laser scanning confocal microscope, LSCM)으로 관찰하고, Zeiss LSM Image Browser 소프트웨어로 분석하였다.It was then incubated with 75 nM of Lysotracker DND-26 Green or Lysotracker DND-22 Blue for 15 min in 200 uL livecell imaging solution. After lysotracker staining, cells were washed twice with DPBS and nucleic acid counter-stained for 15 minutes with Hoechst 33,342 at a concentration of 1 ug / mL. After washing the cells again with DPBS, the cells were incubated in live cell imaging solution. In a similar manner, cells were treated with 1 ug / mL acridine orange for 30 minutes at 37 ° C., 5% CO 2 environment. Cells were observed with a laser scanning confocal microscope (LSCM) and analyzed with Zeiss LSM Image Browser software.

[시험예 8] BI-SPD 나노 어셈블리를 이용한 양성자 스펀지 효과(proton sponge effect) 및 글루타치온(GSH) 저해 분석[Test Example 8] Analysis of proton sponge effect and glutathione (GSH) inhibition using BI-SPD nanoassembly

5 x 104 cells/웰의 4T1 세포를 24-웰 배양 플레이트에서 배양한 후, 밤새 배양하였다. 나노 어셈블리 처리 전에 200 nM 바필로마이신(bafilomycin) A1 또는 200 uM L-부티오닌-술폭시민(L-buthionine-sulfoximine)을 30 분간 전처리하였다. DPBS로 간단히 세척한 후, 세포를 1 mL의 무혈청 배지에서 BI-SPD 나노 어셈블리와 함께 2 시간 배양하였다.5 x 10 4 cells / well of 4T1 cells were incubated in 24-well culture plates and then overnight. 200 nM bafilomycin A1 or 200 uM L-buthionine-sulfoximine were pretreated for 30 minutes prior to nanoassembly treatment. After brief washing with DPBS, cells were incubated for 2 hours with BI-SPD nanoassembly in 1 mL serum-free medium.

그런 다음, 배지를 1 mL의 완전 배지로 대체하고, 세포에 1 cm2 당 1 W의 강도로 808 nm 레이저를 바로 조사하였다. 루시퍼라아제 리포터 유전자 발현 실험은 상기 기술한 것처럼 24 시간 배양 후에 수행하였다.The medium was then replaced with 1 mL of complete medium and the cells were directly irradiated with a 808 nm laser at an intensity of 1 W per 1 cm 2 . Luciferase reporter gene expression experiments were performed after 24 hours of incubation as described above.

[시험예 9] 종양 회전 타원체 모델 형성(tumor spheroid formation)Test Example 9 Tumor spheroid formation

회전 타원체 모델 형성은 이전에 보고된 방법을 약간 변형하여 수행되었다(K. M. Charoen et al. Biomaterials 35:2264-2271 (2014)). 아래에 변형된 방법을 간략히 기술하였다.Spheroid model formation was performed by slightly modifying the previously reported method (K. M. Charoen et al. Biomaterials 35: 2264-2271 (2014)). The modified method is briefly described below.

먼저, 1.5% (w/v) 아가로스 용액 70 uL을 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고 20 분간 냉각하였다. 그런 다음, 각각의 아가로스가 코팅된 웰에 5 x 104 개의 세포를 함유하는 트립신 처리된 세포 현탁액 100 uL을 각각 첨가하였다.First, 70 uL of a 1.5% (w / v) agarose solution was added to each well of a 96-well plate and cooled for 20 minutes. Then 100 uL of trypsin treated cell suspension containing 5 × 10 4 cells was added to each agarose coated well, respectively.

플레이트를 37 ℃, 5% CO2에서 8 일간 배양하면서, 3 일 간격으로 배지를 교체하였다.The plates were incubated for 8 days at 37 ° C., 5% CO 2 , and the medium was changed every 3 days.

BOBO-3 표지된 플라스미드 DNA를 함유하는 BI-SPD 나노 어셈블리를 회전 타원체와 4 시간 배양하였다. 3차원 회전 타원체 이미징을 위해, 각각의 회전 타원체는 DPBS로 철저히 세척한 후, 4% PFA를 실온에서 15 분간 처리하여 고정시켰다.BI-SPD nanoassemblies containing BOBO-3 labeled plasmid DNA were incubated with spheroids for 4 hours. For three-dimensional spheroid imaging, each spheroid was washed thoroughly with DPBS and then fixed by treatment with 4% PFA for 15 minutes at room temperature.

이어서, 간단히 세척한 후, 회전 타원체를 유리 바닥 페트리 디쉬 상에 놓고 1% 아가로스 겔을 덮었다. 회전 타원체는 즉시 LSCM을 이용하여 Zstack 이미지를 얻고, Zeiss LSM Image eBrowser 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.Then, after a brief wash, the spheroids were placed on a glass bottom petri dish and covered with 1% agarose gel. The spheroids were immediately obtained Zstack images using LSCM and analyzed using Zeiss LSM Image eBrowser software.

[시험예 10] 4T1 종양 모델에서 BI-SPD 나노 어셈블리의 생체 내 생체 분포와 종양 타켓팅 특성Test Example 10 In Vivo Biodistribution and Tumor Targeting Characteristics of BI-SPD Nanoassembly in a 4T1 Tumor Model

생체 분포 실험은 전남대학교 의과대학 및 전남대학교 병원(CNU IACUC-H-2015-47)의 제도적 지침에 따라 살아 있는 동물에서 수행되었다.Biodistribution experiments were performed in living animals according to the institutional guidelines of Chonnam National University Medical School and Chonnam National University Hospital (CNU IACUC-H-2015-47).

4T1 이종 이식(xenocraft) 종양 모델은 6-8 주령의 BALB/c 마우스(Orient Bio Inc., 성남, 대한민국)를 대상으로, 200 uL PBS에 1 x 106 개의 4T1 세포를 피하 주사하여 제작하였다. 종양이 약 100 mm3으로 발달한 후, 200 uL PBS에 BI-SPD 또는 BI-SP 나노 어셈블리가 포함된 pLUC 플라스미드 20 ug을 정맥 주사한 다음, 근적외선 형광(near infrared fluorescence, NIRF)을 FOBI(Neo Science, 경기, 대한민국)에서 서로 다른 시간대에 48 시간까지 관찰하였다.A 4T1 xenocraft tumor model was constructed by subcutaneous injection of 1 × 10 6 4T1 cells in 200 uL PBS of 6-8 week old BALB / c mice (Orient Bio Inc., Seongnam, South Korea). After the tumor developed to about 100 mm 3 , 200 uL PBS was intravenously injected with 20 ug of pLUC plasmid containing the BI-SPD or BI-SP nanoassembly, followed by near-infrared fluorescence (NIRF) to FOBI (Neo). Science, Gyeonggi, Korea) up to 48 hours at different time zones.

48 시간 후, 종양과 함께 마우스 기관(장기)을 절제하고, FOBI에서 형광 신호 강도를 분석하였다. 모든 시료는 4 번씩 검사하였고, 시료 축적은 다양한 장기의 근적외선 형광 강도를 정량화하여 확인하였다.After 48 hours, mouse organs (organs) were excised with tumors and fluorescence signal intensity was analyzed in FOBI. All samples were examined four times, and sample accumulation was confirmed by quantifying the near-infrared fluorescence intensity of various organs.

[시험예 11] 통계 분석[Test Example 11] Statistical Analysis

통계 분석은 GraphPad Prism 5를 이용하여 수행되었다. 그래픽 데이터는 평균±SEM(평균의 표준 오차)의 평균으로 표현되었다. Statistical analysis was performed using GraphPad Prism 5. Graphic data is expressed as the mean of the mean ± SEM (standard error of the mean).

또한, t-테스트를 통해 레이저 조사 그룹과 비조사 그룹을 비교하였다.The t-test also compared the laser irradiation group with the non-irradiation group.

차이는 *p≤0.05, **p≤0.01, and ***p≤0.001에서 유의한 것으로 간주하였다.Differences were considered significant at * p ≦ 0.05, ** p ≦ 0.01, and *** p ≦ 0.001.

상기 실시예를 통해 제조한 SPD 폴리플렉스의 특성을 조사한 결과를 도 2, 3에 도시하였다. 이를 통해 DS 4-3 펩타이드가 ssPEI에 성공적으로 접합된 것을 H-NMR을 통해 확인하였으며(도 2a), 펩타이드 결합의 백분율은 45.25 몰%의 ssPEI 1차 아민 그룹(primary amine group)이 DS 4-3 펩타이드의 티올 그룹(thiol group)에 접합된 것을 확인하였다. 또한 5:1 (w/w)의 비율로 플라스미드 형성된 SPD 폴리플렉스는 표면 전하 20 ± 5 mV를 갖으며, 평균 수력학 크기(average hydrodynamic size)는 154 ± 10 nm로 측정되었다(도 2c, 2d).The results of investigating the properties of the SPD polyplex prepared through the above examples are shown in FIGS. 2 and 3. H-NMR confirmed the successful conjugation of the DS 4-3 peptide to ssPEI (FIG. 2a), and the percentage of peptide bond was 45.25 mol% of the ssPEI primary amine group (DS 4-). It was confirmed that it was conjugated to a thiol group of three peptides. In addition, the plasmid-formed SPD polyplexes at a ratio of 5: 1 (w / w) had a surface charge of 20 ± 5 mV, and the average hydrodynamic size was measured at 154 ± 10 nm (FIGS. 2C, 2D). ).

상기 결과로부터 양이온성 고분자(polymer)는 음이온성 또는 중성의 구조물(construct)에 비해 플라스미드 DNA를 더 효율적으로 응축시키는 특성이 있음을 알 수 있으며, 겔 지연 분석(gel retardation assay)에 의하면 SPD와 플라스미드 DNA의 완전한 응축이 1:1의 낮은 중량비에서 발생한다는 것을 확인하였다(도 2b).These results indicate that cationic polymers have more efficient condensation of plasmid DNA than anionic or neutral constructs. According to gel retardation assay, SPD and plasmid It was confirmed that complete condensation of DNA occurred at a low weight ratio of 1: 1 (FIG. 2B).

또한, 도 3a (ii)에서 확인할 수 있는 바와 같이 상기 SPD 폴리플렉스의 TEM 이미지는 약 120 nm 의 평균 입자 크기를 나타내는 것을 확인하였다.In addition, as can be seen in Figure 3a (ii) it was confirmed that the TEM image of the SPD polyplex shows an average particle size of about 120 nm.

상기 실시예를 통해 형성된 BI-SPD 나노 어셈블리는 음전하를 띠는 BI 나노 입자 농도와 양전하를 띠는 SPD 폴리플렉스의 비율을 조절하여 수득하였다.The BI-SPD nanoassembly formed through the above example was obtained by adjusting the ratio of the negatively charged BI nanoparticle concentration and the positively charged SPD polyplex.

SPD 폴리플렉스의 농도가 증가하면, BI-SPD 나노 어셈블리의 크기가 감소하는 반면, 제타 전위는 증가하는 것을 확인하였다(도 3b). 이 경우, 여분의 SPD 폴리플렉스는 BI-SPD 나노 어셈블리를 추가로 응축시키고, 수력학 크기를 감소시키는 것에 의한 것으로 판단된다. BI-SPD 나노 어셈블리의 크기는 TEM 분석을 통해 약 420 nm 인 것을 확인하였으며, DLS 분석을 통한 표면 전하는 +15 ± 5 mV로 측정되었다(도 3a (iii)). As the concentration of the SPD polyplexes increased, the size of the BI-SPD nanoassembly decreased while the zeta potential increased (FIG. 3B). In this case, the extra SPD polyplexes are believed to be due to the further condensation of the BI-SPD nanoassembly and the reduction in hydraulic size. The size of the BI-SPD nanoassembly was confirmed to be about 420 nm by TEM analysis, and the surface charge through DLS analysis was measured to be +15 ± 5 mV (FIG. 3A (iii)).

또한, 겔 지연 분석 및 제타 전위 결과로부터 양전하를 나타내는 BI-SPD 나노 어셈블리가 플라스미드와 SPD 고분자(polymer) 사이의 해리 징후가 없는 완전히 안정한 복합체를 형성하는 것을 확인할 수 있었다(도 3c, 3d).In addition, it was confirmed from the gel delay analysis and the zeta potential result that the positively charged BI-SPD nanoassembly forms a completely stable complex with no signs of dissociation between the plasmid and the SPD polymer (FIGS. 3C and 3D).

BOBO-3 형광 퀀칭 시험을 통해 3차원 BI-SPD의 나노 어셈블리 형성을 평가한 결과, SPD와 DNA 사이에 형성된 폴리플렉스는 거의 60%에 가까운 소멸을 나타낸 반면, BI-SPD 나노 어셈블리의 경우, 80%의 소멸을 나타내는 것을 확인하였다(도 3e). BOBO-3 형광의 감소는 BI 나노 입자에 의해 SPD 폴리플렉스의 응축이 강화되었기 때문인 것으로 생각할 수 있으며, 이를 통해 BI-SPD 나노 어셈블리의 크기가 감소하고, 표면에 양전하를 띠는 것을 설명할 수 있다.The BOBO-3 fluorescence quenching test evaluated the nanoassembly formation of the three-dimensional BI-SPD. The polyplexes formed between the SPD and the DNA showed nearly 60% disappearance, whereas for the BI-SPD nanoassembly, 80 It was confirmed that the disappearance of% (Fig. 3e). The reduction in BOBO-3 fluorescence can be thought to be due to the enhanced condensation of the SPD polyplex by the BI nanoparticles, which may explain the decrease in the size of the BI-SPD nanoassembly and the positive charge on the surface. .

혈장의 안정성은 생체 내 생체 분포 및 유전자 형질 전환에 있어 중요하게 작용하는데, 기존에는 폴리에틸렌글리콜화(PEGylation)가 혈청 조건 하에서 폴리플렉스의 응집을 방지하기 위해 일반적으로 사용되어 왔다. 그러나, 친수성을 나타내는 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol, PEG)과 유전자를 운반하는 고분자의 결합은 고분자-DNA의 응축이 좋지 않고, 유전자 전달 효율을 저해하는 문제로 인해 부정적인 결과를 초래하였다.The stability of plasma plays an important role in biodistribution and gene transformation in vivo, and polyethylene glycolation (PEGylation) has been commonly used to prevent aggregation of polyplexes under serum conditions. However, the combination of hydrophilic polyethyleneglycol (PEG) and the polymer-carrying polymer has a negative result due to the poor condensation of the polymer-DNA and the problem of inhibiting gene transfer efficiency.

따라서, 고분자의 PEG화에 대한 대안으로, 본 발명에서 새롭게 제안한 BSA 나노 입자와 DNA의 복합체는 유전자 전달 효율을 향상시키며, 동시에 혈청의 안정성 또한 증가시키는 효과를 나타내는 결과를 얻었다. SPD 폴리플렉스는 혈청 조건에서 더욱 응집되기 쉽기 때문에, 10% FBS에서 배양한 후에 SPD 폴리플렉스의 수력학적 크기는 더 증가하는 결과를 얻었다. 반면, BI-SPD 나노 어셈블리는 상기와 같은 응집의 징후를 전혀 나타내지 않았고, 4 시간 동안 안정된 크기를 유지하였다. 이는 BI-SPD 나노 어셈블리의 알부민 나노 입자가 혈청 단백질의 폴리플렉스 결합을 방해하기 때문인 것으로 생각할 수 있다.Therefore, as an alternative to the PEGylation of the polymer, the BSA nanoparticles and DNA complexes newly proposed in the present invention have been shown to improve the gene transfer efficiency and at the same time increase the stability of the serum. Since SPD polyplexes are more likely to aggregate in serum conditions, the hydrodynamic size of SPD polyplexes is increased further after incubation in 10% FBS. On the other hand, the BI-SPD nanoassembly showed no signs of such aggregation and maintained a stable size for 4 hours. This may be because albumin nanoparticles of the BI-SPD nanoassembly interfere with the polyplex binding of serum proteins.

1 W/cm2의 출력 밀도로 808 nm 레이저를 조사할 때 BI:SPD:DNA=25:25:1인 BI-SPD 나노 어셈블리의 열 방출을 조사하는 동안, BI-SPD 나노 어셈블리의 IR780을 증가시키면, 농도-의존적으로 광열 온도가 크게 상승하는 것을 확인하였다(도 2g). 특히, 레이저 조사 전에, BI 나노 입자에 IR780을 5.625 ug/mL의 농도로 담지하면, 열 충격을 통해 엔도솜 파괴(endosomal breakage)를 유도하기에 충분한 것을 확인하였다.When irradiating a 808 nm laser at an output density of 1 W / cm 2 , the IR780 of the BI-SPD nanoassembly is increased while investigating the heat emission of the BI-SPD nanoassembly with BI: SPD: DNA = 25: 25: 1 As a result, it was confirmed that the photothermal temperature increased significantly in a concentration-dependent manner (FIG. 2G). In particular, before the laser irradiation, it was confirmed that the IR nanoparticles were loaded on the BI nanoparticles at a concentration of 5.625 ug / mL, which was sufficient to induce endosomal breakage through thermal shock.

유방암 세포인 4T1 및 4T7에서 엔도/리소좀의 소포(endo/lysosomal vesicle)에 대한 BI-SPD의 세포 내로의 흡수 및 국소화(localization) 결과를 살펴보면, 모두 배양 2 시간 후에 증가하는 것을 확인하였다(도 4a). 이는 본 발명의 BI-SPD 나노 어셈블리가 광열 기반의 유전자 전달을 효율적으로 수행하기 위한 요소인 세포 내 흡수 및 국소 열 유발을 통한 엔도솜 탈출에 있어 효과적임을 뜻하는 것이다.Examining the results of the uptake and localization of BI-SPD into the cells of endo / lysosomal vesicles of endo / lysosomal vesicles in breast cancer cells 4T1 and 4T7, both increased after 2 hours of culture (FIG. 4A). ). This means that the BI-SPD nanoassembly of the present invention is effective in endosome escape through intracellular uptake and local heat induction, which are factors for efficiently performing light-heat-based gene delivery.

세포를 BI-SPD 나노 어셈블리와 함께 2 시간 배양한 후, 5 분 동안 808 nm 레이저에 노출시킨 결과, BI-SPD 나노 어셈블리 처리 후 조사한 4T1 세포에서 라이소트래커(lysotracker)의 강도(intensity)가 크게 감소하는 것을 확인하였다(도 3b). 라이소트래커 그린 DND26은 살아 있는 세포(live cell)에서 산성인 구역을 염색하기 때문에, 레이저가 조사된 세포에서 염색된 곳이 나타나지 않는 것은 엔도/리소좀이 열 충격에 의해 불안정화된다는 것을 새롭게 확인하였다.Cells were incubated with BI-SPD nanoassembly for 2 hours, and then exposed to 808 nm laser for 5 minutes, resulting in large intensity of lysotracker in 4T1 cells irradiated after BI-SPD nanoassembly treatment. It was confirmed to decrease (FIG. 3B). Since lysotracker green DND26 stains acidic zones in live cells, the absence of stained spots in the cells irradiated with the laser has newly confirmed that the endo / lysosomes are destabilized by thermal shock.

상기 결과의 검증을 수행한 결과, 레이저가 조사되지 않은 세포에서 나타난 적색 반점은, 레이저가 조사된 세포에서는 완전히 소멸됨으로써, 근적외선 레이저 조사를 통해 세포 내 파괴가 발생하는 것을 확인하였으며, BI-SPD에 의한 엔도솜의 탈출은 유방암 세포에서 광열 효과에 의해 초래되는 것을 확인하였다(도 4c).As a result of verifying the results, it was confirmed that the red spots appeared in the cells not irradiated with laser are completely extinguished in the cells irradiated with laser, so that intracellular destruction occurs through near-infrared laser irradiation. Escape of the endosome by the result was confirmed to be caused by the photothermal effect in breast cancer cells (Fig. 4c).

4T1 및 4T7 유방암 세포에 대하여 본 발명의 BI-SPD 나노 어셈블리를 처리한 경우에 대한 세포 생존율을 측정하여, 세포 독성의 유무를 판단하였다.Cell viability of 4T1 and 4T7 breast cancer cells treated with the BI-SPD nanoassembly of the present invention was measured to determine the presence or absence of cytotoxicity.

SPD:DNA가 10:1, 20:1 및 30:1의 서로 다른 농도로 BI-SPD를 처리한 결과, 레이저 조사 여부에 관계없이 4T1 및 4T7 세포에서 30:1의 비율까지 유의한 독성을 나타내지 않음을 확인하였다(도 5a).Treatment with BI-SPD at different concentrations of 10: 1, 20: 1, and 30: 1 SPD: DNA showed significant toxicity up to a 30: 1 ratio in 4T1 and 4T7 cells, with or without laser irradiation. Was confirmed (FIG. 5A).

반면, 대조 실험군으로 상기 세포들에 대해 bPEI 및 SPD를 각각 처리한 경우에는 SPD를 처리한 경우가 bPEI 만을 처리한 경우에 비해 낮은 세포 독성을 나타내었으며, bPEI의 경우 낮은 분자량인 1,800 Da을 이용하여 제조한 경우가 높은 25,000 Da을 이용하여 제조한 경우에 비해 낮은 세포 독성을 나타내는 것을 알 수 있었다.On the other hand, in the control group treated with bPEI and SPD, respectively, the cells treated with SPD showed lower cytotoxicity than those treated with bPEI alone, and the low molecular weight of bPEI using 1,800 Da It was found that the case of preparation showed a lower cytotoxicity compared to the case of using the high 25,000 Da.

또한, BI-SPD (25:1)로 처리한 후, 808 nm 레이저를 5 분 동안 다른 출력 밀도(power densities)로 조사한 유방암 세포에서는 세포 독성의 눈에 띠는 징후가 나타나지 않았다(도 5b). 이러한 결과는 BI-SPD 나노 어셈블리 처리된 세포의 생존력은 농도에 의존적임에도 불구하고, 출력 밀도가 세포 생존 능력에 중요한 영향을 미치지 못하는 것을 뜻한다.In addition, no visible signs of cytotoxicity were seen in breast cancer cells treated with BI-SPD (25: 1) at different power densities with 808 nm lasers for 5 minutes (FIG. 5B). These results indicate that although the viability of BI-SPD nanoassembly treated cells is concentration dependent, power density does not have a significant effect on cell viability.

레이저 조사 중에 BI-SPD 나노 어셈블리는 엔도솜 소포(endosome vesicle) 내부에서 열을 발생시키고, 엔도솜 탈출을 위한 엔도솜 막의 파괴를 유도한다. 광열로 조절된 유전자 운반체로서, BI-SPD의 잠재적 용도 확인을 위해, 광열로 유도된 루시퍼라아제 유전자의 발현 분석을 수행하였다. 이식 유전자 발현(transgene expression) 결과는 레이저 조사의 유무에 따른 bPEI 25,000 (25k) Da, BI-SPD 또는 SPD 처리된 세포에 대하여 정량화하였다. 그 결과, BI-SPD 나노 어셈블리는 4T1 세포에서 SPD 폴리플렉스 단독 처리한 경우에 비해 2 배 더 높은 형질전환 효율을 나타내었다(도 6a). 이는 BI 나노 입자가 BI-SPD 나노 어셈블리에서 세포 흡수 및 형질 전환 효율을 향상시키는 데 특정한 역할을 수행하기 때문인 것으로 유추할 수 있다. BI-SPD 처리된 4T1 및 4T7 세포에 808 nm 레이저를 5 분간 조사한 후 광열 효과가 증진된 이식 유전자 발현이 관찰되었으며, 두 세포주 모두 근적외선 레이저가 조사된 세포에서 비조사된 경우에 대비하여 루시퍼라아제 유전자 발현이 증가되었다.During laser irradiation, the BI-SPD nanoassembly generates heat inside the endosome vesicles and induces disruption of the endosome membrane for endosomal escape. As a photothermally regulated gene carrier, expression analysis of the photothermally induced luciferase gene was performed to identify potential use of BI-SPD. Transgene expression results were quantified for bPEI 25,000 (25k) Da, BI-SPD or SPD treated cells with and without laser irradiation. As a result, BI-SPD nanoassembly showed 2 times higher transformation efficiency than 4D1 cells treated with SPD polyplex alone (FIG. 6A). This may be inferred because BI nanoparticles play a specific role in enhancing cell uptake and transformation efficiency in BI-SPD nanoassemblies. After 5 minutes of 808 nm laser irradiation on BI-SPD-treated 4T1 and 4T7 cells, the expression of transplanted genes with enhanced photothermal effects was observed, and luciferase in both cell lines was not irradiated in the cells irradiated with near infrared laser. Gene expression was increased.

특히, 4T7 세포주와 비교하여, 30:1의 SPD:DNA 비율로 형질전환된 4T1 세포에서 8배 더 많은 이식 유전자 발현이 측정되었다(도 6a). 이는 DS 4-3 펩타이드가 전이성 4T1 세포에서 BI-SPD 나노 어셈블리의 세포 흡수를 비전이성인 4T7 세포에서에 비해 증가시켰기 때문이라고 유추할 수 있다.In particular, 8-fold more transplant gene expression was measured in 4T1 cells transformed at a SPD: DNA ratio of 30: 1 compared to 4T7 cell line (FIG. 6A). This may be inferred because the DS 4-3 peptide increased cell uptake of the BI-SPD nanoassembly in metastatic 4T1 cells compared to non-metastatic 4T7 cells.

BI-SPD 처리된 4T1 세포는 5 분 또는 10 분 동안 방사선 조사를 받은 세포 간에 유전자 발현의 유의한 차이가 발생하지 않았으나, 조사 강도가 증가함에 따라, 루시퍼라아제 이식 유전자 발현이 증가함을 확인하였다(도 6b). 이는 5 분 경과 전에 IR780 염료의 분해가 발생하기 때문에, 증가된 조사 시간에 따라 형질전환 효율이 향상되지 않는 것을 뜻한다.4T1 cells treated with BI-SPD did not show significant differences in gene expression between the irradiated cells for 5 or 10 minutes. However, as the intensity of irradiation increased, luciferase transplanted gene expression increased. (FIG. 6B). This means that the degradation of IR780 dye occurs 5 minutes before the transformation efficiency does not improve with increased irradiation time.

엔도솜 파괴(endosomal breakage)는 레이저 조사 후, BI-SPD에 의해 생성된 열 또는 BI-SPD 나노 어셈블리에서 SPD 폴리플렉스에 의해 생성된 양성자 스펀지 효과(proton sponge effect)에 의한 것이다. 도 7a에서 확인할 수 있는 바와 같이, 대조군인 폴리플렉스 나노 입자 ssPEI, bPEI 및 SPD에 바필로마이신(bafilomycin)을 처리한 경우 형질전환 효율이 비처리 세포와 비교하여 현저하게 감소되었다.Endosomal breakage is due to heat generated by BI-SPD or proton sponge effect generated by SPD polyplexes in BI-SPD nanoassemblies after laser irradiation. As can be seen in Figure 7a, when the control of the polyflex nanoparticles ssPEI, bPEI and SPD was treated with bafilomycin (bafilomycin) significantly reduced transformation efficiency compared to untreated cells.

반면, BI-SPD 나노 어셈블리 처리된 4T1 세포에 808 nm 레이저 조사 후, 바필로마이신 처리를 수행한 경우, 형질전환 효율은 레이저가 조사되지 않은 세포에 비해 100 배 향상되어, 현저한 상승 효과를 나타냄을 확인하였다.On the other hand, in the case of performing the bacillomycin treatment after 808 nm laser irradiation of 4T1 cells treated with BI-SPD nanoassembly, the transformation efficiency is 100 times higher than that of the non-irradiated cells, indicating a significant synergistic effect. Confirmed.

이는 레이저 조사에 의해 생성된 국부적인 열이 양성자 스펀지 효과를 통해 엔도솜 탈출(endosome escape)을 촉발하며, 염화물 이온이 나노-운반체(nano-carrier)가 많은 소포에 축적된다. 이어서 엔도/리소좀이 팽창하여 핵 산화물이 세포질로 부분적으로 방출되는 기전에 의한 것으로 추정된다. 그러나, 국부적 열 발생을 통해 엔도솜이 완전히 파괴되는 경우 핵 산화물의 방출이 촉진되어 이식 유전자(transgene)의 발현을 증가시키기 때문인 것으로 생각할 수 있다.This results in localized heat generated by laser irradiation triggering endosome escape through the proton sponge effect, and chloride ions accumulate in vesicles with many nano-carriers. It is presumed that this is due to the mechanism by which the endo / lysosomes swell and then partially release the nuclear oxide into the cytoplasm. However, it can be considered that if the endosomes are completely destroyed through local heat generation, the release of nuclear oxide is promoted to increase the expression of the transgene.

마찬가지로, 도 7b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 대조군인 폴리플렉스 나노 입자 ssPEI, bPEI 및 SPD에 GSH 억제제인 부티오닌 술폭시민(BSO)을 처리한 경우 형질전환 효율이 비처리 세포와 비교하여 현저하게 감소되었다. 이는 플라스미드 DNA가 GSH에 의해 ssPEI에서 이황화 결합이 전달되어 폴리플렉스로부터 분리되었음을 나타내는 것이다.Similarly, as can be seen in Figure 7b, when the control group of polyplex nanoparticles ssPEI, bPEI and SPD treated with GSH inhibitor butionine sulfoximine (BSO), the transformation efficiency was significantly higher than that of untreated cells. Reduced. This indicates that the plasmid DNA has been separated from the polyplex by transfer of disulfide bonds in ssPEI by GSH.

본 발명에서, BI-SPD 나노 어셈블리의 종양 침투 및 광열 효과에 따른 유전자 형질전환 효율을 4T1 회전 타원체 모델에서 측정한 결과를 도 8에 도시하였다. BI-SPD 나노 어셈블리 (25:1) (BOBO-3 DNA)는 4T1 회전 타원체로 침투하며, 최대 37.03 um 의 조직 깊이까지 균일하게 퍼진 것을 확인하였다. 대조군으로 사용된 SPD에서 보다 높은 세포 섭취(cellular uptake)를 나타냈지만, 나노 입자의 양전하 표면은 회전 타원체의 표면 상에 단단한 코팅을 유발하였으며, BI-SP의 경우, 나노 어셈블리 적용 시 37.03 um 까지 침투하지만, 고르지 않으며 균일하지 않은 분포를 나타내는 것을 확인하였다. 이러한 불균일성은 BI-SP 나노 어셈블리의 경우, 세포 특이적 흡수를 위한 DS 4-3 펩타이드 등을 보유하고 있지 않기 때문인 것으로 생각할 수 있다.In the present invention, gene transformation efficiency according to tumor infiltration and photothermal effects of the BI-SPD nanoassembly is measured in the 4T1 spheroid model shown in Figure 8. BI-SPD nanoassembly (25: 1) (BOBO-3 DNA) was found to infiltrate 4T1 spheroids and spread evenly to tissue depths up to 37.03 um. The SPD used as a control showed higher cellular uptake, but the positively charged surface of the nanoparticles resulted in a rigid coating on the surface of the spheroid, and in the case of BI-SP, penetration of up to 37.03 um when the nanoassembly was applied However, it was confirmed that it is uneven and shows a non-uniform distribution. This heterogeneity may be considered to be because the BI-SP nanoassembly does not possess a DS 4-3 peptide or the like for cell specific uptake.

또한, BI-SPD 나노 어셈블리 (25:1) 처리된 4T1 회전 타원체에 레이저 조사를 통해 루시퍼라아제 이식 유전자 발현을 놀랍게 증가시키는 것을 발견하였다(도 8b). 상기의 경우와 유사하게 BI-SP 나노 어셈블리의 경우에도 도입 유전자 발현은 증가하였으나, 종양 분포가 낮기 때문에 BI-SPD 처리된 4T1 스페로이드에 비해 유전자 발현의 향상이 미미한 정도에 불과한 것을 알 수 있다.In addition, 4T1 spheroids treated with BI-SPD nanoassembly (25: 1) were found to dramatically increase luciferase transplant gene expression through laser irradiation (FIG. 8B). Similarly to the above case, the transgene expression was increased in the case of the BI-SP nanoassembly, but since the tumor distribution was low, the improvement in gene expression was only minimal compared to the BI-SPD-treated 4T1 spheroid.

4T1 종양 마우스 모델에서 BI-SPD의 생체 분포 결과를 도 9a 및 도 9b에 도시하였다. BI-SPD 나노 어셈블리 처리한 4T1 마우스는 비표적화된 BI-SP 나노 어셈블리와 비교하여, 종양에서 시간 의존적인 방식으로 높은 근적외선 형광(NIRF) 강도를 나타내었다.Biodistribution results of BI-SPD in the 4T1 tumor mouse model are shown in FIGS. 9A and 9B. 4T1 mice treated with BI-SPD nanoassembly exhibited high near infrared fluorescence (NIRF) intensity in a time-dependent manner in tumors as compared to non-targeted BI-SP nanoassembly.

또한, BI-SPD 나노 어셈블리 처리한 4T1 종양 마우스의 생체 내 기관(장기)에 대한 NIRF 분석 결과, 대조군인 BI-SP 나노 어셈블리에 비하여 종양의 형광 강도가 유의하게 증가한 것을 확인하였다(도 9c, 9d). 이는 BI-SPD 처리한 4T1 종양 마우스의 형광 강도가 증가하는 경우, BI-SP 대비 나노 어셈블리의 축적이 현저히 높다는 것을 의미한다. 이는 DS 4-3 펩타이드의 작용에 따른 것으로 예상할 수 있으며, BI-SPD 나노 어셈블리가 4T1 유방암 종양에 플라스미드 DNA를 보다 효율적이고, 종양-특이적으로 전달할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.In addition, NIRF analysis of organs (organs) of 4T1 tumor mice treated with BI-SPD nanoassembly showed that the tumor fluorescence intensity was significantly increased as compared to the control group BI-SP nanoassembly (FIGS. 9C and 9D). ). This means that when the fluorescence intensity of 4T1 tumor mice treated with BI-SPD is increased, the accumulation of nanoassembly is significantly higher than that of BI-SP. This can be expected due to the action of the DS 4-3 peptide, and the present invention was completed by discovering that the BI-SPD nanoassembly can deliver plasmid DNA more efficiently and tumor-specifically to 4T1 breast cancer tumors.

Claims (17)

헤파메틴 시아닌 계열 염료(heptamethine cyanine dyes);
상기 헤파메틴 시아닌 계열 염료(heptamethine cyanine dyes) 바깥에 랩핑(wrapping)된 알부민 층;
상기 알부민 층의 표면에 접합되며, 핵산, 유전자 단편 및 올리고핵산로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상을 포함하고, DS 4-3 펩타이드 (CRIMRILRILKLAR-NH2)와 링커로 연결된 ssPEI (Disulfide-containing Polyethylenimine);
를 포함하는, 근적외선을 이용한 세포 내 물질 전달을 위한 나노 어셈블리.Hepamethine cyanine dyes;
An albumin layer wrapped outside the hepamethine cyanine dyes;
SsPEI (Disulfide-containing) conjugated to the surface of the albumin layer, comprising any one or two or more selected from the group consisting of nucleic acids, gene fragments and oligonucleotides, and linked with a linker with a DS 4-3 peptide (CRIMRILRILKLAR-NH2) Polyethylenimine);
Including, nano assembly for intracellular mass transfer using near infrared. 삭제delete 삭제delete 제 1항에 있어서,
상기 헤파메틴 시아닌 계열 염료는 IR780(2-[2-[2-Chloro-3-[(1 ,3-dihydro-3,3-dimethyl-1-propyl-2H-indol-2ylidene)ethylidene]-1 -cyclohexen-1-yl]ethenyl]-3,3-dimethyl-1-propylindolium iodide), IR808(Br 2-[(E)-2-[(3E)-2-chloro-3-{2-[(2E)-3,3-dimethyl-1-pentyl-2,3-dihydro-1H-indol-2-ylidene]ethylidene}cyclohex-1-en-1-yl]ethenyl]-3,3-dimethyl-1-pentyl-3H-indol-1-ium), IR825 (3-(4-carboxybenzyl)-2-((E)-2-((E)-3-((Z)-2-(3-(4-carboxybenzyl)-1,1-dimethyl-1,3-dihydro-2H-benzo[e]indol-2-ylidene)ethylidene)-2-chlorocyclohex-1-en-1-yl)vinyl)-1,1-dimethyl-1H-benzo[e]indol-3-ium bromide), MHI-148 (2-[2-[2-Chloro-3-[2-[1,3-dihydro-3,3-dimethyl-1-(5-carboxypentyl)-2H-indol-2-ylidene]-ethylidene]-1-cyclohexen-1-yl]-ethenyl]-3,3-dimethyl-1-(5-carboxypentyl)-3H-indolium bromide)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상인 것을 특징으로 하는, 근적외선을 이용한 세포 내 물질 전달을 위한 나노 어셈블리.The method of claim 1,
The hepamethin cyanine-based dye is IR780 (2- [2- [2-Chloro-3-[(1,3-dihydro-3,3-dimethyl-1-propyl-2H-indol-2ylidene) ethylidene] -1- cyclohexen-1-yl] ethenyl] -3,3-dimethyl-1-propylindolium iodide), IR808 (Br 2-[(E) -2-[(3E) -2-chloro-3- {2-[(2E ) -3,3-dimethyl-1-pentyl-2,3-dihydro-1H-indol-2-ylidene] ethylidene} cyclohex-1-en-1-yl] ethenyl] -3,3-dimethyl-1-pentyl -3H-indol-1-ium), IR825 (3- (4-carboxybenzyl) -2-((E) -2-((E) -3-((Z) -2- (3- (4-carboxybenzyl) ) -1,1-dimethyl-1,3-dihydro-2H-benzo [e] indol-2-ylidene) ethylidene) -2-chlorocyclohex-1-en-1-yl) vinyl) -1,1-dimethyl- 1H-benzo [e] indol-3-ium bromide), MHI-148 (2- [2- [2-Chloro-3- [2- [1,3-dihydro-3,3-dimethyl-1- (5) -carboxypentyl) -2H-indol-2-ylidene] -ethylidene] -1-cyclohexen-1-yl] -ethenyl] -3,3-dimethyl-1- (5-carboxypentyl) -3H-indolium bromide) Nano assembly for intracellular mass transfer using near infrared light, characterized in that any one or two or more selected from. 삭제delete 제 1항에 있어서,
상기 세포는 동물세포 또는 식물세포인 것을 특징으로 하는, 근적외선을 이용한 세포 내 물질 전달을 위한 나노 어셈블리.The method of claim 1,
The cell is characterized in that the animal cells or plant cells, nano assembly for intracellular mass transfer using near infrared. 제 1항에 있어서,
상기 링커는 EMCS (N-ε-malemidocaproyl-oxysuccinimide ester)인 것을 특징으로 하는, 근적외선을 이용한 세포 내 물질 전달을 위한 나노 어셈블리.The method of claim 1,
The linker is N-ε-malemidocaproyl-oxysuccinimide ester (EMCS), characterized in that the nano-assembly for intracellular mass transfer using infrared. 제 6항에 있어서,
상기 동물세포는 전이성 유방암 세포(metastatic breast cancer cell)인 것을 특징으로 하는, 근적외선을 이용한 세포 내 물질 전달을 위한 나노 어셈블리.The method of claim 6,
The animal cell is characterized in that the metastatic breast cancer cells (metastatic breast cancer cells), nano-assembly for intracellular mass transfer using near infrared. 헤파메틴 시아닌 계열 염료(heptamethine cyanine dyes)에 알부민 층이 랩핑(wrapping)된 나노 입자를 제조하는 단계;
ssPEI (Disulfide-containing Polyethylenimine)와 DS 4-3 펩타이드 (CRIMRILRILKLAR-NH2)의 결합체를 제조하는 단계;
상기 결합체에 핵산, 유전자 단편 및 올리고핵산로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상이 결합된 폴리플렉스를 제조하는 단계; 및
상기 나노 입자와 상기 폴리플렉스를 혼합하여 나노 어셈블리(nanoassembly)를 제조하는 단계;
를 포함하는, 근적외선을 이용한 세포 내 물질 전달을 위한 나노 어셈블리의 제조 방법.Preparing nanoparticles having an albumin layer wrapped in hepamethine cyanine dyes;
preparing a conjugate of ssPEI (Disulfide-containing Polyethylenimine) and DS 4-3 peptide (CRIMRILRILKLAR-NH 2);
Preparing a polyplex in which any one or two or more selected from the group consisting of nucleic acids, gene fragments and oligonucleic acids are bound to the conjugate; And
Preparing a nanoassembly by mixing the nanoparticles with the polyplex;
Including, the method of manufacturing a nano-assembly for intracellular mass transfer using near infrared. 삭제delete 삭제delete 제 9항에 있어서,
상기 헤파메틴 시아닌 계열 염료는 IR780(2-[2-[2-Chloro-3-[(1 ,3-dihydro-3,3-dimethyl-1-propyl-2H-indol-2ylidene)ethylidene]-1 -cyclohexen-1-yl]ethenyl]-3,3-dimethyl-1-propylindolium iodide), IR808(Br 2-[(E)-2-[(3E)-2-chloro-3-{2-[(2E)-3,3-dimethyl-1-pentyl-2,3-dihydro-1H-indol-2-ylidene]ethylidene}cyclohex-1-en-1-yl]ethenyl]-3,3-dimethyl-1-pentyl-3H-indol-1-ium), IR825 (3-(4-carboxybenzyl)-2-((E)-2-((E)-3-((Z)-2-(3-(4-carboxybenzyl)-1,1-dimethyl-1,3-dihydro-2H-benzo[e]indol-2-ylidene)ethylidene)-2-chlorocyclohex-1-en-1-yl)vinyl)-1,1-dimethyl-1H-benzo[e]indol-3-ium bromide), MHI-148 (2-[2-[2-Chloro-3-[2-[1,3-dihydro-3,3-dimethyl-1-(5-carboxypentyl)-2H-indol-2-ylidene]-ethylidene]-1-cyclohexen-1-yl]-ethenyl]-3,3-dimethyl-1-(5-carboxypentyl)-3H-indolium bromide)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상인 것을 특징으로 하는, 근적외선을 이용한 세포 내 물질 전달을 위한 나노 어셈블리의 제조 방법.The method of claim 9,
The hepamethin cyanine-based dye is IR780 (2- [2- [2-Chloro-3-[(1,3-dihydro-3,3-dimethyl-1-propyl-2H-indol-2ylidene) ethylidene] -1- cyclohexen-1-yl] ethenyl] -3,3-dimethyl-1-propylindolium iodide), IR808 (Br 2-[(E) -2-[(3E) -2-chloro-3- {2-[(2E ) -3,3-dimethyl-1-pentyl-2,3-dihydro-1H-indol-2-ylidene] ethylidene} cyclohex-1-en-1-yl] ethenyl] -3,3-dimethyl-1-pentyl -3H-indol-1-ium), IR825 (3- (4-carboxybenzyl) -2-((E) -2-((E) -3-((Z) -2- (3- (4-carboxybenzyl) ) -1,1-dimethyl-1,3-dihydro-2H-benzo [e] indol-2-ylidene) ethylidene) -2-chlorocyclohex-1-en-1-yl) vinyl) -1,1-dimethyl- 1H-benzo [e] indol-3-ium bromide), MHI-148 (2- [2- [2-Chloro-3- [2- [1,3-dihydro-3,3-dimethyl-1- (5) -carboxypentyl) -2H-indol-2-ylidene] -ethylidene] -1-cyclohexen-1-yl] -ethenyl] -3,3-dimethyl-1- (5-carboxypentyl) -3H-indolium bromide) A method for producing a nano-assembly for intracellular mass transfer using near infrared light, characterized in that any one or two or more selected from. 삭제delete 제 9항에 있어서,
상기 세포는 동물세포 또는 식물세포인 것을 특징으로 하는, 근적외선을 이용한 세포 내 물질 전달을 위한 나노 어셈블리의 제조 방법.The method of claim 9,
The cell is characterized in that the animal cells or plant cells, a method for producing a nano-assembly for intracellular mass transfer using near infrared rays. 제 14항에 있어서,
상기 동물세포는 전이성 유방암 세포(metastatic breast cancer cell)인 것을 특징으로 하는, 근적외선을 이용한 세포 내 물질 전달을 위한 나노 어셈블리의 제조 방법.The method of claim 14,
The animal cell is characterized in that the metastatic breast cancer cells (metastatic breast cancer cells), a method of manufacturing a nano-assembly for intracellular mass transfer using near infrared rays. 시험관 내(in vitro) 세포에 제 1항, 제 4항 및 제 6항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 나노 어셈블리를 처리한 후 근적외선을 조사하는 단계를 포함하는, 근적외선을 이용한 세포 내 물질 전달 방법.A method of intracellular mass transfer using near-infrared radiation comprising irradiating near-infrared rays after treatment of in vitro cells with the nanoassembly of any one of claims 1, 4 and 6-8. . 제 16항에 있어서,
상기 근적외선은 600 내지 1,000 nm의 파장을 갖는 것을 특징으로 하는, 근적외선을 이용한 세포 내 물질 전달 방법.The method of claim 16,
The near-infrared ray is characterized in that having a wavelength of 600 to 1,000 nm, intracellular mass transfer method using near-infrared.
KR1020180038865A 2018-04-03 2018-04-03 Preparation method of nanocomplex comprising near infrared dye-loaded albumin particle and gene delivery vehicle, and method for regulating intracellular gene expression using the same KR102070046B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180038865A KR102070046B1 (en) 2018-04-03 2018-04-03 Preparation method of nanocomplex comprising near infrared dye-loaded albumin particle and gene delivery vehicle, and method for regulating intracellular gene expression using the same

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180038865A KR102070046B1 (en) 2018-04-03 2018-04-03 Preparation method of nanocomplex comprising near infrared dye-loaded albumin particle and gene delivery vehicle, and method for regulating intracellular gene expression using the same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190115769A KR20190115769A (en) 2019-10-14
KR102070046B1 true KR102070046B1 (en) 2020-01-29

Family

ID=68171318

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180038865A KR102070046B1 (en) 2018-04-03 2018-04-03 Preparation method of nanocomplex comprising near infrared dye-loaded albumin particle and gene delivery vehicle, and method for regulating intracellular gene expression using the same

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102070046B1 (en)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114540228B (en) * 2022-02-21 2024-01-23 上海交通大学医学院附属仁济医院 Bacterium modified by photo-thermal agent, preparation method and application thereof

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101914827B1 (en) 2016-05-16 2018-11-02 성균관대학교산학협력단 Self-assembly nanoparticles base on a supramolecular interaction, manufacturing thereof and use thereof

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Acta Biomaterialia (2015) 14:61-69
Journal of Drug Delivery (2012) Article ID 686108
Macromolecular Research (2013) 21(11):1201-1209

Also Published As

Publication number Publication date
KR20190115769A (en) 2019-10-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Nomoto et al. Three-layered polyplex micelle as a multifunctional nanocarrier platform for light-induced systemic gene transfer
Fortuni et al. Polymeric engineering of nanoparticles for highly efficient multifunctional drug delivery systems
Qian et al. AIE luminogens for bioimaging and theranostics: from organelles to animals
Chen et al. Tumor-targeted pH/redox dual-sensitive unimolecular nanoparticles for efficient siRNA delivery
Schwartz et al. Synthetic DNA-compacting peptides derived from human sequence enhance cationic lipid-mediated gene transfer in vitro and in vivo
Park et al. Quantum dots in an amphiphilic polyethyleneimine derivative platform for cellular labeling, targeting, gene delivery, and ratiometric oxygen sensing
Dirisala et al. Optimized rod length of polyplex micelles for maximizing transfection efficiency and their performance in systemic gene therapy against stroma-rich pancreatic tumors
Zou et al. Systemic linear polyethylenimine (L‐PEI)‐mediated gene delivery in the mouse
CN102414116B (en) A supramolecular approach for preparation of size controllable nanoparticles
Guo et al. Ternary complexes of amphiphilic polycaprolactone-graft-poly (N, N-dimethylaminoethyl methacrylate), DNA and polyglutamic acid-graft-poly (ethylene glycol) for gene delivery
Mironova et al. Ultraviolet phototoxicity of upconversion nanoparticles illuminated with near-infrared light
Rajendrakumar et al. Dual-stimuli-responsive albumin-polyplex nanoassembly for spatially controlled gene release in metastatic breast cancer
Tambe et al. Triptorelin tethered multifunctional PAMAM-histidine-PEG nanoconstructs enable specific targeting and efficient gene silencing in LHRH overexpressing cancer cells
Yang et al. The effect of quantum dot size and poly (ethylenimine) coating on the efficiency of gene delivery into human mesenchymal stem cells
Park et al. Sunflower-type nanogels carrying a quantum dot nanoprobe for both superior gene delivery efficacy and tracing of human mesenchymal stem cells
Hu et al. Doxorubicin‐Loaded Physalis Mottle Virus Particles Function as a pH‐Responsive Prodrug Enabling Cancer Therapy
Zhang et al. Gold nanorods with silica shell and PAMAM dendrimers for efficient photothermal therapy and low toxic codelivery of anticancer drug and siRNA
Cao et al. Dual‐targeting peptides RGD10‐NGR9‐conjugated lanthanide nanoparticle@ polydopamine as upconversion nanoprobes for in vivo imaging of lung cancer
Taschauer et al. Peptide-targeted polyplexes for aerosol-mediated gene delivery to CD49f-overexpressing tumor lesions in lung
Zou et al. Self‐Assembling Proteins for Design of Anticancer Nanodrugs
Yang et al. GSH/pH Dual Activatable Cross‐linked and Fluorinated PEI for Cancer Gene Therapy Through Endogenous Iron De‐Hijacking and in Situ ROS Amplification
Zhang et al. Ultrasound-enhanced reactive oxygen species responsive charge-reversal polymeric nanocarriers for efficient Pancreatic Cancer gene delivery
Ji et al. Light-controlled in vitro gene delivery using polymer-tethered spiropyran as a photoswitchable photosensitizer
KR102070046B1 (en) Preparation method of nanocomplex comprising near infrared dye-loaded albumin particle and gene delivery vehicle, and method for regulating intracellular gene expression using the same
Del Valle et al. NIR-cleavable drug adducts of gold nanostars for overcoming multidrug-resistant tumors

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant