KR102064961B1 - Magnetic nanoparticles and method for amplification of signal in lateral flow assay by using the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 자성 나노입자 및 이를 이용한 측방유동 분석에서의 신호 증폭 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 자성 나노입자를 포함하는 코어(core) 및 상기 코어의 표면에 위치하고, 백금(Pt) 나노입자를 포함하는 쉘(shell)로 이루어지며, 백금이 7 중량% 내지 30 중량%의 양으로 포함된, 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체; 이의 제조 방법; 및 이를 이용한 측방유동 (Lateral flow) 분석에서의 신호 증폭 방법에 관한 것이다. The present invention relates to magnetic nanoparticles and a signal amplification method in lateral flow analysis using the same, and more particularly, a core comprising magnetic nanoparticles and a surface of the core, the platinum (Pt) nanoparticles Magnetic nanoparticle-platinum coreshell composite, consisting of a shell (shell) comprising, platinum contained in an amount of 7% to 30% by weight; Its preparation method; And it relates to a signal amplification method in the lateral flow (Lateral flow) analysis using the same.
Description
본 발명은 분석물을 고감도로 검출하기 위한 자성 나노입자 및 이를 이용한 측방유동(Lateral flow) 방식의 분석에서의 신호 증폭 방법에 관한 것이다. 보다 자세하게, 촉매 활성이 우수한 자성 나노입자 및 자성을 이용한 항원 증폭 공정에 의해 샌드위치(sandwich) 분석법에 있어서 신호를 효과적으로 증폭시키는 기술에 관한 것이다.The present invention relates to magnetic nanoparticles for detecting analytes with high sensitivity and a signal amplification method in a lateral flow analysis using the same. More specifically, the present invention relates to a technique for effectively amplifying a signal in a sandwich assay by magnetic nanoparticles having excellent catalytic activity and an antigen amplification process using magnetic.
면역크로마토그래피 분석법은 생물학적 물질 또는 화학적 물질이 서로 특이적으로 부착하는 성질을 이용하여 분석 물질을 단시간에 정성 및 정량적으로 검사할 수 있는 방법으로, 특히 샌드위치형 면역분석법은 존재 여부 및 농도 조사의 대상이 되는 분석물의 제 1 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항체가 고체 지지체에 고정화 되고, 분석물의 제 2 에피토프에 특이적인 제 2 항체를 이용하는 것으로서 잘 알려져 있다. Immunochromatography is a method that allows qualitative and quantitative testing of analytes in a short time by utilizing the properties of biological or chemical substances specifically attaching to each other. It is well known that a first antibody capable of specifically binding to a first epitope of the analyte to be immobilized on a solid support and using a second antibody specific for the second epitope of the analyte.
이러한 분석을 위한 장치로는 분석 스트립 또는 상기 분석 스트립을 하우징 내부에 장착해 조립한 형태의 분석 장치가 일반적으로 사용된다. 이때 분석물을 포함하는 유체를 다공성 스트립 한편에 적용하면 모세관 현상에 의해 유체가 흘러가면서 분석 대상물이 표지체를 포함하는 항체 및 고정화 항체에 결합하여 분석법을 완성한다. As the device for such an analysis, an analysis strip or an analysis device in which the assay strip is mounted and assembled inside a housing is generally used. In this case, when the fluid containing the analyte is applied to one of the porous strips, the fluid flows due to capillary action, and the analyte binds to the antibody including the label and the immobilized antibody to complete the assay.
보다 상세하게 측방유동(Lateral flow) 장치는 일반적으로 액체 시료가 모세관 현상으로 흐를 수 있는 다공성 막인 멤브레인에 항체가 고정되어 있고, 멤브레인의 상류 측에는 샘플 패드와 접합 패드가 구비되어 있으며, 하류 측에 흡수 패드가 연결되어 있다. 상기 샘플패드는 분석물을 포함하는 액체 시료를 흡수하고 균일한 유동을 보장하며, 접합 패드에는 분석물과 선택적으로 결합할 수 있는 항체가 부착된 표지체가 건조되어 있다. 상기 멤브레인에는 분석물에 선택적으로 결합하는 고정화된 항체 및 표지체에 고정화된 항체와 결합할 수 있는 물질이 각각 다른 위치에 고정화되어 각각 탐지 부 및 컨트롤 부를 형성한다. 상기 분석물과 선택적으로 결합할 수 있는 멤브레인에 고정화된 항체와 표지체에 고정화된 항체는 분석물에 대해 샌드위치 형태로 결합될 수 있도록 구성된다. 상기 흡수패드는 액체시료를 흡수할 수 있는 물질로 구성된다. 이와 같은 면역 크로마토그래피 분석 장치에 있어서 분석물을 포함하는 액체 시료를 샘플패드에 떨어뜨리면, 분석물에 선택성을 가지는 항체-표지체와 멤브레인에 고정화된 항체가 샌드위치 형태로 결합되어 상기 항체가 고정화된 멤브레인 위치에 육안으로 확인할 수 있는 밴드를 형성하게 된다.More specifically, the Lateral flow device generally has an antibody fixed to a membrane, a porous membrane through which a liquid sample can flow through a capillary phenomenon, and an upstream side of the membrane includes a sample pad and a bonding pad, and is absorbed downstream. The pads are connected. The sample pad absorbs the liquid sample containing the analyte and ensures uniform flow, and the conjugate pad is dried with a label having an antibody attached thereon to selectively bind the analyte. In the membrane, immobilized antibodies selectively binding to analytes and substances capable of binding to antibodies immobilized on a label are immobilized at different positions, respectively, to form a detection unit and a control unit, respectively. Antibodies immobilized on a membrane capable of selectively binding to the analyte and antibodies immobilized on a label are configured to bind in the form of a sandwich to the analyte. The absorption pad is made of a material capable of absorbing a liquid sample. In such an immunochromatographic assay apparatus, when a liquid sample containing an analyte is dropped on a sample pad, an antibody-label having selective selectivity to the analyte and an antibody immobilized on a membrane are bound in a sandwich form, thereby immobilizing the antibody. A visually visible band is formed at the membrane location.
도 1은 종래 면역검출법(Lateral flow immunoassay, LFIA) 칩의 구조를 도식적으로 나타낸 것이다. 면역검출법 은 진단 방법의 간편성과 검출 물질의 다양성, 경제적 측면의 장점으로 인해 현장진단 (Point-of-Care) 시장에서 가장 널리 사용되고 있는 바이오 진단 시스템으로, 주로 면역검출법을 기반으로 분석물을 검출하고 짧은 시간 내에 즉각적인 항원 존재 유무를 알 수 있기 때문에 병원이나 기관뿐만 아니라 가정용 의료진단 키트로도 개발되어 사용되고 있다.Figure 1 schematically shows the structure of a conventional flow detection (Lateral flow immunoassay, LFIA) chip. Immunodetection is the most widely used bio-diagnosis system in the point-of-care market due to the simplicity of diagnostic methods, the diversity of detection materials, and the economics. Since it is possible to know the presence of an immediate antigen in a short time, it has been developed and used as a home medical diagnosis kit as well as a hospital or institution.
종래 기술로서 1차 접합체와 항원이 결합된 후 2차 접합체가 추가로 결합하고 이들이 최종적으로 멤브레인에 고정화된 항체에 결합하는 면역크로마토그래피의 신호증폭 방법이 개시되어 있으나, 종래의 면역 크로마토그래피 방법으로 측정할 수 있는 감도가 낮아 더 높은 감도를 요구하는 시료의 경우 측정하기 어려운 문제가 있다. 나아가, 한국특허출원 제2009-0047004호에서는 접합 패드 및 상기 멤브레인 중 어느 것에도 접촉되지 않도록 구성된 신호 증폭 패드를 추가로 형성하여 이용하여 감도를 향상시키는 방법을 제공하고 있으나, 이 경우 신호 증폭 패드가 추가적으로 구비되어야 하며, 사용자가 신호 증폭 패드를 멤브레인에 접촉시키기 위한 공정이 추가적으로 필요한 문제가 있다. As a conventional technique, an immunochromatography signal amplification method is disclosed in which a secondary conjugate further binds after binding of a primary conjugate to an antigen and finally binds to an antibody immobilized on a membrane. In the case of a sample requiring a higher sensitivity due to the low sensitivity that can be measured, there is a problem that is difficult to measure. Furthermore, Korean Patent Application No. 2009-0047004 provides a method of improving sensitivity by further forming and using a signal amplification pad configured to not be in contact with any of the bonding pad and the membrane. It must be additionally provided, and there is a problem that a user additionally needs a process for contacting the signal amplification pad with the membrane.
이에, 촉매 활성이 우수한 자성 나노입자 및 자성을 이용한 항원 증폭 공정에 의해 샌드위치(sandwich) 분석법에 있어서 신호를 효과적으로 증폭시키는 기술이 개발되는 경우에는 관련 분야에서 널리 적용될 수 있을 것으로 기대된다. Accordingly, when a technique for effectively amplifying a signal in a sandwich assay method is developed by magnetic nanoparticles having excellent catalytic activity and an antigen amplification process using magnetic, it can be widely applied in related fields.
이에 본 발명의 한 측면은 촉매 활성이 우수한 자성 나노입자를 제공하는 것이다. Accordingly, one aspect of the present invention is to provide magnetic nanoparticles having excellent catalytic activity.
이에 본 발명의 또 다른 측면은 상기 자성 나노입자 및 자성을 이용한 항원 증폭 공정에 의해 샌드위치(sandwich) 분석법에 있어서 신호를 효과적으로 증폭시키는 방법을 제공하는 것이다.Accordingly, another aspect of the present invention is to provide a method for effectively amplifying a signal in a sandwich assay by the magnetic amplification process using the magnetic nanoparticles and magnetic.
본 발명의 일 견지에 의하면, 자성 나노입자를 포함하는 코어(core); 및 상기 코어의 표면에 위치하고, 백금(Pt) 나노입자를 포함하는 쉘(shell)로 이루어지며, 백금이 7 중량% 내지 30 중량%의 양으로 포함된, 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체가 제공된다.According to one aspect of the invention, the core containing a magnetic nanoparticles (core); And a shell comprising platinum (Pt) nanoparticles located on the surface of the core and comprising platinum in an amount of 7% to 30% by weight. do.
본 발명의 다른 견지에 의하면, (a) 자성 나노입자를 제조하는 단계; (b) 상기 자성 나노입자를 분산 용매에 분산시켜 자성 나노입자가 분산된 용액을 제조하는 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 제조된 용액에 백금(Pt)염과, 안정제의 기능을 동시에 수행하는 환원제를 Pt와 자성 나노입자의 몰비가 Pt 1몰 기준으로 자성 나노입자 1몰 초과 내지 10몰 미만이 되도록 첨가하여 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체를 제조하는 단계를 포함하는, 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체의 제조방법이 제공된다. According to another aspect of the invention, (a) preparing the magnetic nanoparticles; (b) dispersing the magnetic nanoparticles in a dispersion solvent to prepare a solution in which the magnetic nanoparticles are dispersed; And (c) a reducing agent that simultaneously performs the function of the platinum (Pt) salt and the stabilizer in the solution prepared in step (b), wherein the molar ratio of Pt and magnetic nanoparticles is greater than 1 mole of magnetic nanoparticles based on 1 mole of Pt. To be less than a mole Provided is a method of making a magnetic nanoparticle-platinum coreshell composite, comprising the step of adding a magnetic nanoparticle-platinum coreshell composite.
본 발명의 또 다른 견지에 의하면, 상기 본 발명의 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체에, 분석물(analyte)의 제 1 에피토프 또는 제 1 결합부위에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항체 또는 제 1 특이적 결합물질을 고정하는 단계; 제 1 항체 또는 제 1 특이적 결합물질이 고정된 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체와 분석물을 결합하는 단계; 분석물이 결합된 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체를 자성분리하여 농축하는 단계; 및 농축된 분석물이 결합된 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체를 측방유동 (Lateral flow) 면역 크로마토그래피에 적용하는 단계를 포함하는, 측방유동 (Lateral flow) 분석에서의 신호 증폭 방법이 제공된다. According to another aspect of the invention, the first antibody or agent that can specifically bind to the first epitope or the first binding site of the analyte (analyte) to the magnetic nanoparticle-platinum coreshell complex of the present invention Fixing one specific binding agent; Binding the analyte with the magnetic nanoparticle-platinum coreshell complex immobilized with the first antibody or first specific binding material; Magnetically separating and concentrating the magnetic nanoparticle-platinum coreshell complex to which the analyte is bound; And applying the magnetic nanoparticle-platinum coreshell complexes to which the concentrated analyte is bound to lateral flow immunochromatography, provides a signal amplification method in lateral flow analysis.
본 발명에 의하면 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체에 항체를 고정하고, 나노입자의 자성을 이용해 항원을 농축한 후 효소 모방 활성을 갖는 백금으로 신호 증폭시켜 기존 금 나노 입자 기반의 면역진단법(LFIA, lateral flow immunoassay) 법에 비해 고 민감도를 갖는 면역진단 시스템을 획득할 수 있다. 한편, 코어-쉘 구조의 나노입자 기반 면역진단법은 일반 가정에서도 사용할 수 있을 만큼 간단하며, 신속하고 높은 민감도를 갖는 현장진단 바이오센서로서, 그 응용분야가 심장질환진단, 호르몬 검사, 조기 암진단 및 여러 감염병 등 매우 다양하므로, 진단기기 전문 기업에 기술 이전을 통하여 실용화 가능할 것으로 기대된다.According to the present invention, the antibody is immobilized on a magnetic nanoparticle-platinum core shell complex, the antigen is concentrated using the magnetism of the nanoparticle, and the signal is amplified by platinum having an enzyme mimic activity. Compared to the lateral flow immunoassay method, an immunodiagnostic system with higher sensitivity can be obtained. On the other hand, core-shell nanoparticle-based immunodiagnosis is a simple, fast and highly sensitive on-site diagnostic biosensor that can be used in the home, and its applications include cardiac disease diagnosis, hormonal testing, early cancer diagnosis and As it is very diverse such as various infectious diseases, it is expected that it can be put to practical use by transferring technology to specialized diagnostic device companies.
도 1은 종래 면역검출법(Lateral flow immunoassay, LFIA) 면역 크로마토그래피 장치의 구조를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 면역검출법(Lateral flow immunoassay, LFIA)이 적용되는 면역 크로마토그래피 장치의 구조를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 의한 효소 모방 자성나노입자 기반 LFIA 방법을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 4는 (a) Fe3O4 NPs, (b) MPt/CS-7 NPs, (c) MPt/CS-15 NPs, (d) MPt/CS-30 NPs 의 TEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 5는 (a) Fe3O4 NPs, (b) MPt/CS-7 NPs, (c) MPt/CS-15 NPs, (d) MPt/CS-30 NPs 의 XRD 패턴(pattern)을 나타낸 것이.
도 6은 Fe3O4 NPs, MPt/CS-7 NPs, MPt/CS-15 NPs, MPt/CS-30 NPs의 hCG 항체 고정량을 나타난 것이다.
도 7은 MPt/CS-7 NPs의 시간에 따른 자성 분리(magnetic separation optical) 광학 이미지를 나타낸 것이다.
도 8은 자성 분리(magnetic separation) 된 Fe3O4 NPs, MPt/CS-7 NPs, MPt/CS-15 NPs, MPt/CS-30 NPs의 시간에 따른 상층액(supernatant)에서의 상대적인 흡광도(absorbance) 변화를 나타낸 것이다.
도 9는 MPt/CS-7 NPs 의 hCG 농도에 따른 (a) 디지털 이미지 및 (b) 그레이 스케일(gray scale) 이미지를 나타낸 것이다.
도 10은 이미징 프로그램 분석에 의한 검출 한계 테스트 결과를 그래프로 나타낸 것이다.Figure 1 schematically shows the structure of a conventional immunoassay (Lateral flow immunoassay, LFIA) immunochromatography device.
Figure 2 schematically shows the structure of an immunochromatography apparatus to which an immunodetection method (Lateral flow immunoassay, LFIA) of the present invention is applied.
Figure 3 schematically shows an enzyme-mimicking magnetic nanoparticle-based LFIA method according to the present invention.
4 shows TEM images of (a) Fe 3 O 4 NPs, (b) MPt / CS-7 NPs, (c) MPt / CS-15 NPs, and (d) MPt / CS-30 NPs.
5 shows XRD patterns of (a) Fe 3 O 4 NPs, (b) MPt / CS-7 NPs, (c) MPt / CS-15 NPs, and (d) MPt / CS-30 NPs.
Figure 6 shows the fixed amount of hCG antibody of Fe 3 O 4 NPs, MPt / CS-7 NPs, MPt / CS-15 NPs, MPt / CS-30 NPs.
7 shows magnetic separation optical optical images over time of MPt / CS-7 NPs.
FIG. 8 shows the relative absorbance of supernatant with time of Fe 3 O 4 NPs, MPt / CS-7 NPs, MPt / CS-15 NPs, MPt / CS-30 NPs with magnetic separation ( absorbance).
FIG. 9 shows (a) digital images and (b) gray scale images according to the hCG concentration of MPt / CS-7 NPs.
10 graphically illustrates detection limit test results by imaging program analysis.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 형태를 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, with reference to the accompanying drawings will be described a preferred embodiment of the present invention. However, embodiments of the present invention may be modified in various other forms, and the scope of the present invention is not limited to the embodiments described below.
본 발명의 신호증폭 방법은 측방유동(Lateral flow)에서 촉매 활성이 우수한 자성 나노입자 및 자성을 이용한 항원 증폭 공정에 의해 신호를 효과적으로 증폭시키는 기술에 관한 것이다.The signal amplification method of the present invention relates to a technique for effectively amplifying a signal by an antigen amplification process using magnetic nanoparticles and magnetic having excellent catalytic activity in lateral flow.
본 발명의 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체는 자성 나노입자를 포함하는 코어(core); 및 상기 코어의 표면에 위치하고, 백금(Pt) 나노입자를 포함하는 쉘(shell)로 이루어지며, 백금이 7 중량% 내지 30 중량%의 양으로 포함된 것이다.Magnetic nanoparticle-platinum coreshell composite of the present invention includes a core (core) comprising magnetic nanoparticles; And it is located on the surface of the core, consisting of a shell (shell) containing platinum (Pt) nanoparticles, the platinum is contained in an amount of 7% to 30% by weight.
보다 상세하게, 본 발명의 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체는 자성 나노입자를 포함하는 코어(core) 및 상기 코어의 표면에 위치하고, 백금(Pt) 나노입자를 포함하는 쉘(shell) 을 포함한다. More specifically, the magnetic nanoparticle-platinum coreshell composite of the present invention includes a core including magnetic nanoparticles and a shell positioned on the surface of the core and including a platinum (Pt) nanoparticle. .
상기 자성 나노입자는 Fe2O3 및 Fe3O4 중에서 선택된 산화철; 및 CoFe2O4, 및 MnFe2O4 중에서 선택된 페라이트(ferrite)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다. The magnetic nanoparticles are iron oxide selected from Fe 2 O 3 and Fe 3 O 4 ; And CoFe 2 O 4 , and MnFe 2 O 4 It may be at least one selected from the group consisting of ferrite selected from among.
즉, 상기 자성 나노입자는 산화철 및 페라이트(ferrite) 중 어느 하나일 수 있으며, 이때 상기 페라이트는 산화철에서 Fe 하나가 다른 금속원소로 치환된 형태이다. 상기 페라이트는 CoFe2O4, MnFe2O4, 등이 가능할 수 있다. 상기 산화철은 Fe2O3, Fe3O4, 등이 가능할 수 있다.That is, the magnetic nanoparticles may be any one of iron oxide and ferrite, wherein the ferrite is a form in which one Fe is substituted with another metal element in iron oxide. The ferrite may be CoFe 2 O 4 , MnFe 2 O 4 , and the like. The iron oxide may be Fe 2 O 3 , Fe 3 O 4 , and the like.
본 발명의 상기 자성 나노입자는 평균 직경이 0.1 내지 5nm일 수 있고, 바람직하게는 0.5 내지 4nm, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 3nm일 수 있다. 한편, 상기 코어의 직경은 8 내지 12nm일 수 있고, 바람직하게는 9 내지 11nm, 더욱 바람직하게는 9.5 내지 10.5nm일 수 있다. The magnetic nanoparticles of the present invention may have an average diameter of 0.1 to 5nm, preferably 0.5 to 4nm, more preferably 0.5 to 3nm. On the other hand, the diameter of the core may be 8 to 12nm, preferably 9 to 11nm, more preferably 9.5 to 10.5nm.
나아가, 상기 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체는 표면에 기능기를 추가로 포함 할 수 있으며, 기능기는 표면안정제인 시트르산나트륨의 카르복실산에서 기인할 수 있다. 상기 기능기는 검출 항체의 고정 수단으로써 공유결합 또는 이온성의 전기적 인력을 제공할 수 있다. 예를 들어 상기 기능기는 카르복실기일 수 있다. Furthermore, the magnetic nanoparticle-platinum core shell composite may further include a functional group on the surface, and the functional group may be derived from a carboxylic acid of sodium citrate, which is a surface stabilizer. The functional group can provide covalent or ionic electrical attraction as a means of immobilizing the detection antibody. For example, the functional group may be a carboxyl group.
이하, 본 발명의 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체의 제조방법에 대해 설명하도록 한다. Hereinafter, a method of manufacturing the magnetic nanoparticle-platinum coreshell composite of the present invention will be described.
본 발명의 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체의 제조방법은 (a) 자성 나노입자를 제조하는 단계; (b) 상기 자성 나노입자를 분산 용매에 분산시켜 자성 나노입자가 분산된 용액을 제조하는 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 제조된 용액에 백금(Pt)염과, 안정제의 기능을 동시에 수행하는 환원제를 Pt와 자성 나노입자의 몰비가 Pt 1몰 기준으로 자성 나노입자 1몰 초과 내지 10몰 미만이 되도록 첨가하여 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체를 제조하는 단계를 포함하는 것이다. Method for producing a magnetic nanoparticle-platinum core shell composite of the present invention comprises the steps of (a) preparing a magnetic nanoparticle; (b) dispersing the magnetic nanoparticles in a dispersion solvent to prepare a solution in which the magnetic nanoparticles are dispersed; And (c) a reducing agent that simultaneously performs the function of the platinum (Pt) salt and the stabilizer in the solution prepared in step (b), wherein the molar ratio of Pt and magnetic nanoparticles is greater than 1 mole of magnetic nanoparticles based on 1 mole of Pt. Adding less than molar to prepare the magnetic nanoparticle-platinum coreshell composite.
즉, 본 발명의 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체는 먼저 자성 나노입자를 포함하는 코어(core)를 제조하고, 상기 코어의 표면에 백금(Pt) 나노입자를 코팅하여 백금 쉘(shell)을 형성함으로써 제조할 수 있다. That is, the magnetic nanoparticle-platinum coreshell composite of the present invention first prepares a core including magnetic nanoparticles, and forms platinum shell by coating platinum (Pt) nanoparticles on the surface of the core. It can manufacture by doing.
좀 더 상세하게 설명하면, 먼저, 자성 나노입자를 제조한다(단계 a). In more detail, first, magnetic nanoparticles are prepared (step a).
상기 자성 나노입자의 제조 단계를 좀 더 상세하게 설명하면, 자성을 갖는 금속의 염을 포함하는 용액을 준비한다(단계 a-1). 다음으로, 상기 용액에 염기성 용액을 첨가하여 염기성 조건 하에서 자성 나노입자를 침전시켜 자성 나노입자를 제조한다(단계 a-2).Referring to the manufacturing step of the magnetic nanoparticles in more detail, to prepare a solution containing a salt of a metal having a magnetic (step a-1). Next, by adding a basic solution to the solution to precipitate the magnetic nanoparticles under basic conditions to prepare a magnetic nanoparticles (step a-2).
상기 자성을 갖는 금속의 염은 FeCl3, 또는/및 FeCl2 등이 가능할 수 있으며, 바람직하게는 FeCl3 및 FeCl2를 적절한 비율로 혼합하여 사용할 수 있다. The salt of the magnetic metal may be FeCl 3 , or / and FeCl 2 and the like, preferably FeCl 3 and FeCl 2 may be used in an appropriate ratio.
상기 침전은 50 내지 100℃에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 60 내지 95℃, 더욱 바람직하게는 70 내지 90℃에서 수행될 수 있다. 상기 침전은 2 내지 6시간 동안 수행될 수 있고, 바람직하게는 3 내지 5시간, 더욱 바람직하게는 3시간 30분 내지 4시간 30분 동안 수행될 수 있다. 그러나, 상기 침전의 수행 시간이 반드시 이에 한정되는 것은 아니며 상기 침전의 수행 온도에 따라 달라질 수 있다. The precipitation may be carried out at 50 to 100 ° C, preferably at 60 to 95 ° C, more preferably at 70 to 90 ° C. The precipitation may be carried out for 2 to 6 hours, preferably 3 to 5 hours, more preferably 3
상기 염기성 용액은 암모니아, 탄산나트륨, 탄산칼륨, 수산화나트륨, 또는 수산화칼륨 등의 수용액일 수 있으며, 바람직하게는 암모니아 수용액일 수 있다. 상기 염기성 조건은 pH가 8 내지 12일 수 있으며, 바람직하게는 9 내지 11, 더욱 바람직하게는 9.5 내지 10.5일 수 있다.The basic solution may be an aqueous solution of ammonia, sodium carbonate, potassium carbonate, sodium hydroxide, potassium hydroxide, or the like, and preferably, an aqueous ammonia solution. The basic conditions may have a pH of 8 to 12, preferably 9 to 11, more preferably 9.5 to 10.5.
다음으로, 상기 자성 나노입자를 분산 용매에 분산시켜 자성 나노입자가 분산된 용액을 제조한다(단계 b).Next, the magnetic nanoparticles are dispersed in a dispersion solvent to prepare a solution in which the magnetic nanoparticles are dispersed (step b).
상기 분산 용매는 히드록실아민 히드로클로라이드(NH2OH·HCl), 테트라메틸 암모늄 히드록사이드(TMAOH) 등이 가능할 수 있고, 바람직하게는 히드록실아민 히드로클로라이드 및 테트라메틸 암모늄 히드록사이드를 혼합하여 사용할 수 있다. The dispersion solvent may be hydroxylamine hydrochloride (NH 2 OH.HCl), tetramethyl ammonium hydroxide (TMAOH), and the like, preferably, by mixing hydroxylamine hydrochloride and tetramethyl ammonium hydroxide Can be used.
후속적으로, 상기 자성 나노입자가 분산된 용액에 백금(Pt)염과 환원제를 첨가하여 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체를 제조한다(단계 c).Subsequently, platinum (Pt) salt and a reducing agent are added to the solution in which the magnetic nanoparticles are dispersed to prepare a magnetic nanoparticle-platinum core shell composite (step c).
상기 백금염은 H2PtCl6·6H2O, 또는 K2PtCl4 등이 가능할 수 있고, 바람직하게는 H2PtCl6·6H2O일 수 있다. The platinum salt is H 2 PtCl 6 .6H 2 O, or K 2 PtCl 4 And the like, and preferably H 2 PtCl 6 .6H 2 O.
상기 환원제는 안정제의 기능을 동시에 수행할 수 있는 것이며, 시트르산나트륨, 아스코르브산, 등이 가능할 수 있다. 상기 환원제는 바람직하게는 시트르산나트륨과 아스코르브산을 동시에 사용할 수 있다.The reducing agent may perform the function of the stabilizer at the same time, sodium citrate, ascorbic acid, and the like may be possible. The reducing agent may preferably use sodium citrate and ascorbic acid simultaneously.
상기 첨가는 1 내지 3시간 동안 천천히 수행될 수 있으며, 바람직하게는 1시간 30분 내지 2시간 30분, 더욱 바람직하게는 1시간 45분 내지 2시간 15분 동안 수행될 수 있다. The addition may be carried out slowly for 1 to 3 hours, preferably 1
상기 첨가 이후에 상기 자성 나노입자의 표면에 백금 나노입자가 코팅될 수 있도록 반응 시간이 필요할 수 있으며, 상기 반응 시간은 2시간 내지 6시간, 바람직하게는 3시간 내지 5시간, 더욱 바람직하게는 3시간 30분 내지 4시간 30분일 수 있다.After the addition, a reaction time may be required so that the platinum nanoparticles may be coated on the surface of the magnetic nanoparticles, and the reaction time may be 2 to 6 hours, preferably 3 to 5 hours, more preferably 3
특히, 본 발명에 있어서 상기 (b)에서 제조된 용액에 백금(Pt)염과, 안정제의 기능을 동시에 수행하는 환원제는 Pt와 자성 나노입자의 몰비가 Pt 1몰 기준으로 자성 나노입자 1몰 초과 내지 10몰 미만이 되도록 첨가하여 백금(Pt) 나노입자를 포함하는 쉘(shell)에 있어서, 백금이 7 중량% 내지 30 중량%의 양으로 포함될 수 있도록 한다. In particular, in the present invention, the reducing agent which simultaneously performs the function of the platinum (Pt) salt and the stabilizer in the solution prepared in the above (b) has a molar ratio of Pt and magnetic nanoparticles greater than 1 mol of magnetic nanoparticles based on 1 mol of Pt. It is added to less than 10 moles so that in a shell containing platinum (Pt) nanoparticles, platinum may be included in an amount of 7% to 30% by weight.
본 발명의 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체에 있어서, 백금이 7 중량% 미만인 경우에는 자성나노입자-백금 코어쉘 복합체의 촉매활성이 낮아 문제가 있으며, 30 중량% 초과인 경우 백금입자가 따로 형성된다는 문제가 있다.In the magnetic nanoparticle-platinum core shell composite of the present invention, when the platinum is less than 7% by weight, there is a problem that the catalytic activity of the magnetic nanoparticle-platinum coreshell composite is low, and in the case of more than 30% by weight, the platinum particles are separately formed. There is a problem.
본 발명의 다른 견지에 의하면 촉매 활성이 우수한 자성 나노입자 및 자성을 이용한 항원 증폭 공정에 의해 샌드위치(sandwich) 분석법에 있어서 신호를 효과적으로 증폭시킬 수 있는 방법이 제공된다. According to another aspect of the present invention, there is provided a method capable of effectively amplifying a signal in a sandwich assay by magnetic nanoparticles having excellent catalytic activity and an antigen amplification process using magnetic.
본 발명의 측방유동 (Lateral flow) 분석에서의 신호 증폭 방법은 상기 본 발명의 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체에, 분석물(analyte)의 제 1 에피토프 또는 제 1 결합부위에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항체 또는 제 1 특이적 결합물질을 고정하는 단계; 제 1 항체 또는 제 1 특이적 결합물질이 고정된 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체와 분석물을 결합하는 단계; 분석물이 결합된 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체를 자성분리하여 농축하는 단계; 및 농축된 분석물이 결합된 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체를, 분석물의 제 2 에피토프 또는 제 2 결합부위에 특이적으로 결합하는 제 2 항체 또는 제 2 특이적 결합물질이 고정화 된 탐지부(detection site)를 구비하는 측방유동 (Lateral flow) 면역 크로마토그래피에 적용하는 단계; 농축된 분석물이 결합된 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체가 탐지부(detection site)에 결합된 후 발색 기질을 탐지부에 가하는 단계를 포함하는 것이다.The signal amplification method in the lateral flow analysis of the present invention specifically binds the magnetic nanoparticle-platinum coreshell complex of the present invention to the first epitope or the first binding site of the analyte. Immobilizing the first antibody or the first specific binding agent which may be present; Binding the analyte with the magnetic nanoparticle-platinum coreshell complex immobilized with the first antibody or first specific binding material; Magnetically separating and concentrating the magnetic nanoparticle-platinum coreshell complex to which the analyte is bound; And a detection part in which the magnetic nanoparticle-platinum coreshell complex to which the concentrated analyte is bound is immobilized with a second antibody or second specific binding agent that specifically binds to the second epitope or the second binding site of the analyte. applying to Lateral flow immunochromatography having a detection site; After the magnetic nanoparticle-platinum core-shell complex with the concentrated analyte is bound to a detection site, the method further comprises adding a chromogenic substrate to the detection site.
본 발명에 따른 측방유동 크로마토그래피는 제 1 항체 또는 제 1 특이적 결합물질이 고정된 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체를 이용하며, 이때 상기 표지된 상기 복합체는 효소 모방 무기 나노입자를 포함하는 것으로, 상기 단백질 효소 무기 나노입자는 표적물질과 결합하여 반응부에서 고정된 후, 발색기질과 반응하여 산화반응을 촉매함으로써 검출 신호를 증폭시킬 수 있는 것이다. Lateral flow chromatography according to the present invention uses a magnetic nanoparticle-platinum coreshell complex to which a first antibody or a first specific binding substance is immobilized, wherein the labeled complex comprises enzyme-mimicking inorganic nanoparticles. In addition, the protein enzyme inorganic nanoparticles may be amplified in the detection unit by binding to a target material and immobilized in a reaction unit, and then reacting with a color substrate to catalyze an oxidation reaction.
이론적으로 한정된 것은 아니지만, 상기 효소 모방 무기 나노입자들은 표지된 검출항체가 액상 시료에 포함된 표적 물질과 결합하고, 액상시료와 함께 반응부로 이동하여, 분석물의 제 2 에피토프 또는 제 2 결합부위에 특이적으로 결합하는 제 2 항체 또는 제 2 특이적 결합물질이 고정화 된 탐지부(detection site)에 분석물과 결합함으로서 탐지부에 고정되어 검출 신호를 나타내게 되며, 이와 같이 탐지부에 고정된 효소 모방 무기나노입자들이 발색기질을 산화시켜 검출 신호를 증폭시키게 된다. Although not theoretically limited, the enzyme-mimicking inorganic nanoparticles bind a labeled detection antibody to a target substance contained in a liquid sample, and move to a reaction portion together with the liquid sample, so as to be specific for the second epitope or the second binding site of the analyte. The second antibody or second specific binding agent that binds to the analyte is bound to the detection site to display a detection signal by binding to the analyte to the immobilized detection site, thereby immobilizing the enzyme immobilized on the detection device. Nanoparticles amplify the detection signal by oxidizing the color substrate.
효소 모방 무기 나노입자들은 기존의 면역분석에서 시그널 증폭법으로 사용되는 효소-기질 반응에서, 기질과 반응할 수 있는 장소가 대부분 가려져 있는 단백질 효소와는 달리 반응 표면이 전체적으로 노출되어 있기 때문에 반응 효율을 훨씬 높아 발색 특성이 현저하게 향상된다. 또한 단백질 효소는 단백질 특성에 의해 주변 환경 (온도, pH 등)에 영향을 많이 받지만 무기 나노입자는 상대적으로 매우 안정적으로 활성을 유지하고 오랜 기간 보존될 수 있다. Enzyme-mimicking inorganic nanoparticles, in the enzyme-substrate reactions that are used as signal amplification methods in conventional immunoassays, unlike protein enzymes, in which most of the sites can react with substrates, the reaction surface is exposed to the entire reaction surface. It is much higher and the color development is remarkably improved. In addition, protein enzymes are greatly affected by the environment (temperature, pH, etc.) by protein properties, but inorganic nanoparticles can be relatively stable and active for a long time.
특히, 분석물이 결합된 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체를 자성분리하여 농축한 후 농축된 분석물이 결합된 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체를 탐지부(detection site)를 구비하는 측방유동 (Lateral flow) 면역 크로마토그래피에 적용하는 것이다. In particular, the magnetic nanoparticle-platinum coreshell complex with the analyte bound therein is concentrated by magnetic separation, and the magnetic nanoparticle-platinum coreshell complex with the concentrated analyte bound is provided with a lateral flow having a detection site (detection site) ( Lateral flow).
이와 같은 방법에 의해 본 발명의 측방유동 (Lateral flow) 분석에서의 신호 증폭 방법은 분석물이 결합된 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체를 자성분리하여 농축하는 단계를 포함하여, 발색을 현저하게 향상시킬 수 있다.The signal amplification method in the lateral flow analysis of the present invention by such a method includes a step of magnetically separating and concentrating the magnetic nanoparticle-platinum coreshell complex to which the analyte is bound, thereby significantly improving color development. You can.
상기 측방유동 면역 크로마토그래피에 적용하는 단계는 농축된 분석물이 결합된 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체를 액체 시료와 함께 적용하여 수행될 수 있으며, 이때 사용될 수 있는 액체 시료는 특히 제한되는 것은 아니며, 예를 들어, 소듐아세테이트 버퍼(sodium acetate buffer), 포스페이트 버퍼(phosphate buffer) 등을 사용할 수 있으나, 분석물, 발색 반응 및 전체적인 면역분석의 결과에 영향을 주지 않는 어떠한 성분을 사용할 수 있다.The step of applying the lateral flow immunochromatography may be performed by applying the magnetic nanoparticle-platinum coreshell complex with the concentrated analyte bound together with the liquid sample, and the liquid sample which may be used is not particularly limited. For example, sodium acetate buffer, phosphate buffer, and the like may be used, but any component that does not affect the results of the analyte, color reaction, and overall immunoassay may be used.
상기 '효소 모방 무기 나노입자'는 단백질효소와 유사하게 다양한 기질의 화학반응을 촉매하는 물질을 의미한다. 상기 용어'발색 기질'은 상기 효소 모방 나노입자의 촉매 작용에 의해 반응 전 물질과 반응 후 물질의 발색 변화가 일어나는 물질을 의미한다. The 'enzyme-mimicking inorganic nanoparticle' refers to a substance that catalyzes chemical reactions of various substrates similar to proteinases. The term 'chromatic substrate' refers to a substance in which the color change of the material before and after the reaction occurs by the catalytic action of the enzyme-mimicking nanoparticles.
상기 용어'발색 변화' 또는 '증폭'은 색의 발현, 발색 파장 변화, 및 발색 강도 변화 중 하나 이상을 의미하는 것으로 이해된다.The term 'color change' or 'amplification' is understood to mean one or more of the manifestation of color, the change in color wavelength, and the change in color intensity.
용어 '분석물(표적물질)'은 항원 단백질, 리간드, DNA, 환경 호르몬, 환경 오염 물질, 및 바이러스 등으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 일 수 있으나, 검출항체와 결합할 수 있는 물질이라면 그 종류는 제한되지 않으며, 바람직하게 상기 분석물은 DNA, 환경호르몬, 항원 단백질로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.The term 'analyte (target material)' may be any one selected from the group consisting of antigenic protein, ligand, DNA, environmental hormone, environmental pollutant, virus, etc., but if the substance that can bind to the detection antibody Is not limited, preferably the analyte is selected from the group consisting of DNA, environmental hormones, antigenic proteins.
한편, 상기 결합부위는 단백질 리간드(Ligand), DNA 서열 및 RNA 서열로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 1 이상이며, 상기 특이적 결합물질은 상기 결합부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질, 바이러스 파아지, 핵산분자 앱타머(Aptamer) 및 합텐(hapten;DNP)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 1 이상일 수 있다. On the other hand, the binding site is at least one selected from the group consisting of a protein ligand (Ligand), DNA sequence and RNA sequence, the specific binding material is a protein, viral phage, which can specifically bind to the binding site, It may be at least one selected from the group consisting of nucleic acid molecule aptamer and hapten (DNP).
본 발명에 있어서 상기 용어 "제1 항체 또는 제 1 특이적 결합물질"이란 표적물질과 결합할 수 있는 항체, 항체의 단편인 Fab 또는 항체의 재조합 물질을 의미한다. 결합은 화학적 결합 및 물리적 결합 모두 가능하다. In the present invention, the term "first antibody or first specific binding substance" means an antibody capable of binding to a target substance, a Fab or a recombinant substance of the antibody. The bond can be both chemical bond and physical bond.
용어 "제 2 항체 또는 제 2 특이적 결합물질"은 표적물질, 또는 표적물질과 결합된 반응물질과 결합할 수 있는 물질을 의미한다. 결합은 화학적 결합 및 물리적 결합 모두 가능하나, 특별한 화학 반응 없이 결합이 이루어질 수 있는 물리적 결합이 바람직하다. 상기 반응물질의 예로는 항체, 항체의 단편인 Fab나 재조합 scFv 등 일 수 있으며, 리셉터 또는 리셉터의 단편일 수 있다.The term "second antibody or second specific binding agent" means a target substance or a substance capable of binding to a reactant bound to the target substance. The bond can be both chemical and physical bonds, but a physical bond is preferred in which the bond can be made without a special chemical reaction. Examples of the reactant may be an antibody, a Fab or a recombinant scFv, which is a fragment of the antibody, or a receptor or a fragment of the receptor.
용어'효소-기질 반응'이란 효소에 의해서 촉매 작용이 이루어지는 기질의 반응 뿐만아니라, 효소 모방 나노입자에 의해서 촉매 작용이 이루어지는 발색 기질의 반응을 포함하는 것으로 이해된다. The term 'enzyme-substrate reaction' is understood to encompass not only the reaction of the substrate catalyzed by the enzyme, but also the reaction of the chromogenic substrate catalyzed by the enzyme-mimicking nanoparticles.
본 발명에 있어서, 발색기질은 효소 모방 무기 나노입자가 산화촉매로 작용하여 산화 후 무기 나노입자가 존재하는 위치에서 침전 및 불용화되면서 발색하여, 검출신호를 육안으로 인식할 수 있을 정도로 증폭시키게 된다. In the present invention, the chromophore substrate is the color of the enzyme mimic inorganic nanoparticles act as an oxidation catalyst to precipitate and insoluble at the position where the inorganic nanoparticles are present after oxidation, thereby amplifying the detection signal to the naked eye. .
본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 발색기질은 상기 발색 기질은 AEC(3-amino-9-ethylcarbazole), DAB(3,3'-Diaminobenzidine) 및 TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있으며, 예를 들어 과산화 효소 모방 무기 나노입자일 경우, 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC)일 수 있다. In a preferred embodiment of the present invention, the chromogenic substrate is the chromogenic substrate AEC (3-amino-9-ethylcarbazole), DAB (3,3'-Diaminobenzidine) and TMB (3,3 ', 5,5'- Tetramethylbenzidine) may be at least one selected from the group consisting of, for example, peroxidase-mimicking inorganic nanoparticles, it may be 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC).
본 발명에 있어서, 상기 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체의 표면에는 검출 항체를 고정시킬 수 있는 기능기들이 존재할 수 있다. 상기 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체의 표면에 존재하는 기능기는 검출 항체의 고정 수단으로써 공유결합 또는 이온성의 전기적 인력을 제공할 수 있는 카르복실산기 (Carboxylic acid group)인 것이 바람직하다. 이 경우 IgG 항체에 풍부하게 존재하는 아민기 (-NH2, amine group)를 사용할 수 있다. In the present invention, functional groups capable of immobilizing the detection antibody may be present on the surface of the magnetic nanoparticle-platinum coreshell complex. The functional group present on the surface of the magnetic nanoparticle-platinum core shell complex is preferably a carboxylic acid group (Carboxylic acid group) capable of providing covalent or ionic electrical attraction as a means of fixing the detection antibody. In this case, an amine group (-NH 2 , amine group) which is present in abundance in an IgG antibody can be used.
본 발명에 따른 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체는 액상에 포함되어 수 마이크로미터 직경의 모세관로를 통해서 측방유동 크로마토그래피의 접합부로 이동할 수 있도록 단분산된 나노입자인 것이 바람직하다. 상기 단분산성이라 함은 나노입자의 크기와 구조가 균일한 정도를 나타내는 척도로서, 실질적으로 균일한 것을 의미한다. The magnetic nanoparticle-platinum coreshell composite according to the present invention is preferably monodisperse nanoparticles contained in the liquid phase so as to move to the junction of lateral flow chromatography through a capillary tube having a diameter of several micrometers. The monodispersity is a measure of uniformity in size and structure of the nanoparticles, and means substantially uniformity.
상기 단분산성 무기 나노입자의 제조 방법은 본 발명에서 전체로 참고문헌으로 도입된 문헌[(J. Am. Chem. Soc., Shouheng Sun 외, 단분산성의 MFe2O4 (M = Fe, Co, Mn) 나노입자 : 2004, Vol.126, 273-279 쪽]을 이용해서 제조할 수 있다. The method for producing the monodisperse inorganic nanoparticles is described in detail in the present invention (J. Am. Chem. Soc., Shouheng Sun et al., Monodisperse MFe 2 O 4 (M = Fe, Co, Mn) nanoparticles: 2004, Vol. 126, pp. 273-279].
본 발명의 실시에 있어서, 상기 단분산성 무기 나노입자의 합성은 유기용매 내에서 계면활성제를 이용하여 단분산성을 향상시킨 합성법을 이용하여 제조될 수 있다. In the practice of the present invention, the synthesis of the monodisperse inorganic nanoparticles can be prepared using a synthetic method to improve the monodispersity using a surfactant in an organic solvent.
검출 항체를 무기 나노입자 표면에 고정시킨 후 수크로오즈와 소혈청알부민이 포함된 생리식염수에 분산시켜 유리 섬유로 이루어진 접합부에 고르게 흡수시켜 건조시켰다. 유리섬유는 단백질에 대해서 친화능력이 낮기 때문에 건조된 상태의 항체-무기 나노입자는 유리섬유 속에서 분석물의 유체를 만났을 때 수화된 후 쉽게 테스트 패드로 빠져나갈 수 있다. The detection antibody was immobilized on the surface of the inorganic nanoparticles, dispersed in physiological saline containing sucrose and bovine serum albumin, and evenly absorbed and dried at the junction made of glass fibers. Because glass fibers have low affinity for proteins, the dried antibody-inorganic nanoparticles can easily hydrate when they meet the analyte's fluid in the glass fibers and then exit into the test pad.
분석물의 검출을 위하여 분석물이 함유된 체액을 측면유동 면역발색칩에 흘려주고 침전성의 불용 기질을 사용하여 효소-기질 반응을 보내주면 발색 시그널이 증폭되면서 성공적으로 검출 감도를 향상시킬 수 있다.For detection of the analyte, the fluid containing the analyte is flowed into the lateral flow immunochromic chip and an enzyme-substrate reaction using a precipitated insoluble substrate is used to amplify the color signal and successfully increase the detection sensitivity.
본 발명에 사용될 수 있는 상기 측방유동 면역 크로마토그래피는, 도2에 나타낸 바와 같이, 분석물을 포함하는 액체 시료가 가해지는 샘플 패드; 상기 샘플 패드에 접촉하며, 상기 분석물의 제 2 에피토프 또는 제 2 결합부위에 특이적으로 결합하는 제 2 항체 또는 제 2 특이적 결합물질이 고정화 된 탐지부(detection site) 및 컨트롤부를 포함하는 멤브레인; 및 상기 멤브레인의 하류에 설치되어 액체 시료를 모세관 현상에 의해 흡수할 수 있는 흡수 패드를 포함하는 것일 수 있다. Said lateral flow immunochromatography that can be used in the present invention, as shown in Figure 2, a sample pad to which a liquid sample containing an analyte is applied; A membrane in contact with the sample pad and including a detection site and a control unit to which a second antibody or second specific binding agent that specifically binds to a second epitope or a second binding site of the analyte is immobilized; And an absorbent pad installed downstream of the membrane to absorb a liquid sample by capillary action.
상기 측방유동 크로마토그래피는 표적 물질을 포함하는 액상 시료가 다공성 매질을 통해 이동하면서 고정된 검출물질과 반응하여 육안으로 식별할 수 있도록 검출시 발색 신호를 나타내는 키트를 의미한다. The lateral flow chromatography refers to a kit that displays a color signal upon detection so that a liquid sample including a target material may be visually identified by reacting with a fixed detection material while moving through a porous medium.
본 발명의 실시에 있어서, 상기 측면 유동 면역 발색 칩은 표적물질을 포함하는 시료가 투입되는 샘플부를 포함하는 시료 패드, 무기 나노입자가 결합된 표적물질과 결합할 수 있는 검출물질이 고정된 탐지부 및 오류 확인을 위한 컨트롤부를 포함하는 멤브레인(실험 패드) 및 액체 시료를 모세관 현상에 의해 흡수할 수 있는 흡수부를 포함하는 흡수 패드를 포함하여 이루어질 수 있다. In the practice of the present invention, the side flow immunochromic chip is a sample pad including a sample portion into which the sample containing the target material, a detection unit fixed to the detection material capable of binding to the target material to which inorganic nanoparticles are bound And an absorbent pad including a membrane (experimental pad) including a control unit for error checking and an absorbing unit capable of absorbing a liquid sample by capillary action.
상기 측방유동 크로마토그래피의 분석 키트의 각각 샘플부, 탐지부, 컨트롤부 및 흡수부는 미세관을 통하여 서로 연결되거나, 또는 멤브레인로 서로 연결되며, 상기 멤브레인은 천연 또는 합성 재료의 다공질 재료일 수 있으며, 니트로셀룰로오스 일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.Each of the sample part, the detector part, the control part and the absorber part of the analysis kit of the lateral flow chromatography is connected to each other through a microtubule or to each other by a membrane, and the membrane may be a porous material of natural or synthetic material, It may be nitrocellulose, but is not limited thereto.
본 발명의 신호증폭 방법은 측방유동(Lateral flow) 방식의 분석법에 적용될 수 있는 것으로, 상기 측방유동(Lateral flow) 방식은 수직유동(vertical flow)이나 통과유동(flow though) 방식을 포함한다. 상기 수직유동 방식의 경우, 시료는 병렬로 배치된 다공성 막 등에 수직으로 쌓인다. The signal amplification method of the present invention can be applied to an analysis method of a lateral flow method, and the lateral flow method includes a vertical flow or a flow though method. In the case of the vertical flow method, the sample is piled vertically on the porous membrane and the like arranged in parallel.
한편, 상기 측방유동방식은 항체-항원 반응에 국한되지 않는 것으로, 본 명세서에서 언급되는 '결합부위(리간드)'는 다양한 분석물에 있어서 단백질 리간드 (Ligand), 핵산(DNA 또는 RNA) 분자 서열의 결합부위 등을 포함하고, '특이적 결합물질'은 상기 결합부위에 선택적, 특이적으로 결합할 수 있는 단백질, 바이러스 파아지, 핵산분자 앱타머(Aptamer), 합텐(hapten;DNP) 등을 포함하는 생체분자를 모두 포함하는 것으로, 나아가 상기 기재 사항에 특히 제한되는 것은 아니다. On the other hand, the lateral flow method is not limited to the antibody-antigen reaction, the 'binding site (ligand) referred to herein is the protein ligand (Ligand), nucleic acid (DNA or RNA) molecular sequence of the various analytes Binding sites, and the like, and 'specific binding materials' include proteins, viral phages, nucleic acid molecule aptamers, hapten (DNP), and the like that can selectively and specifically bind to the binding sites. It includes all biomolecules, and is not particularly limited to the above description.
본 발명의 방법에 의해 검출될 수 있는 분석물은 면역학적 반응, 즉 항원항체 반응에 의해 제 1항체 및 제 2항체와 결합하고 샌드위치형 면역 복합체를 형성할 수 있는 것이면 특히 제한되지 아니하며, 예를 들어 단백질 또는 DNA, 환경호르몬 등을 포함하는 환경오염 물질, 바이러스 등에 대해 적용할 수 있다. The analyte that can be detected by the method of the present invention is not particularly limited as long as it can bind to the first and second antibodies and form a sandwich immune complex by an immunological response, ie, an antigen antibody response. For example, it can be applied to environmental pollutants, viruses, and the like, including proteins or DNA, environmental hormones.
본 발명에 있어서 항원 및 항체는 항원-항체 반응에 의해 분석물과 특이적으로 결합할 수 있는 물질이라면 특별히 제한되지 아니하며, 분석물이 항체인 경우에는 이와 특이적으로 결합하는 물질을 항원으로 할 수 있다. 상기 항원 및 항체는 분석물에 따라 공지의 항원 및 항체를 채용할 수 있다. 나아가, 분석물을 '결합부위(리간드)'로 인식하여 선택적으로 결합하는 '특이적 결합물질'의 반응도 넓은 의미에서 항원-항체 반응에 포함되는 것으로 본다. In the present invention, the antigen and the antibody are not particularly limited as long as it is a substance capable of specifically binding to the analyte by an antigen-antibody reaction. When the analyte is an antibody, a substance that specifically binds to the analyte may be an antigen. have. The antigen and antibody may employ a known antigen and antibody depending on the analyte. Furthermore, the reaction of the 'specific binding agent' which selectively recognizes the analyte as a binding site (ligand) and selectively binds the antigen-antibody reaction.
도 2는 본 발명의 측방유동(Lateral flow) 분석 장치 내 각각의 구성의 예시적인 구조를 개략적으로 나타낸 모식도이며, (10)은 샘플 패드, (12)은 멤브레인, (13)는 탐지부, (14)는 컨트롤부, (15)은 흡수 패드를 나타내며, 도 1의 종래 측방유동(Lateral flow) 분석 장치에 비하여 접합 패드(11)가 생략될 수 있다. FIG. 2 is a schematic diagram schematically showing an exemplary structure of each configuration in the Lateral flow analysis device of the present invention, (10) a sample pad, (12) a membrane, (13) a detector, ( 14 denotes a control unit, and 15 denotes an absorption pad, and the
상기 샘플 패드(sample pad)는 분석물을 포함하는 액체 시료가 처음 흡수되는 부분으로, 멤브레인의 한쪽 끝단을 그대로 사용하거나 별도의 부재로 구성될 수 있고 분석물을 포함하는 시료를 흡수하여 모세관 현상에 의해 분석물을 접합패드로 이동시킨다. The sample pad is a portion in which a liquid sample including an analyte is first absorbed. The sample pad may be used as it is, or may be configured as a separate member, and absorbs the sample containing the analyte to prevent capillary phenomenon. The analyte is then moved to the junction pad.
상기 멤브레인(membrane)은 액체 시료의 유동성을 확보할 수 있는 재질이라면 특히 제한되지 아니하며, 다공성 막으로 이루어지는 것이 바람직하다. 보다 상세하게, 항체 또는 특이적 결합물질, 및 효소 단백질을 고정화하고 비특이적 반응을 최소화하는 니트로셀룰로스, 셀룰로스, PVDF(Poly-vinylidene fluoride), PET(poly(ethylene terephthalate)), PES(polyethersulfone), 유리섬유, 나일론 등과 같이 일정한 미세 구멍(Micropore) 크기의 조절이 가능한 소수성 다공성 막을 사용할 수 있다. The membrane is not particularly limited as long as it is a material capable of securing fluidity of the liquid sample, and it is preferable that the membrane is made of a porous membrane. More specifically, nitrocellulose, cellulose, poly-vinylidene fluoride (PVDF), polyethylene terephthalate (PET), polyethersulfone (PES), free of immobilized antibodies or specific binding agents, and enzyme proteins and minimize nonspecific reactions Hydrophobic porous membranes capable of controlling a constant micropore size, such as fibers and nylon, can be used.
상기 멤브레인은 접합체가 결합된 분석물의 제 2 부위에 특이적으로 결합하는 제 2 항체 또는 제 2 특이적 결합물질이 고정화 되어 있는 탐지부(detection site) 및 이에 대한 대조군으로서 오류로 인한 반응 유무를 파악하기 위한 컨트롤부(control site)를 포함한다. 탐지부는 테스트 결과의 판독을 위해 결과를 보여주는 부분이다. 컨트롤부는 금나노입자 접합체와 포획항체 또는 고정된 제 2 특이적 결합물질의 오류를 확인하기 위해 구성되며 이동성을 가진 물질들이 탐지부/컨트롤부까지 오류 없이 반응이 제대로 진행되었는지 여부를 확인하기 위한 것이다. The membrane is a detection site for fixing a second antibody or a second specific binding material that specifically binds to a second site of an analyte to which a conjugate is bound, and as a control thereof, detects whether a reaction occurs due to an error. It includes a control site for controlling. The detection part shows the result for reading the test result. The control unit is configured to check the error of the gold nanoparticle conjugate and the capture antibody or the fixed second specific binding agent, and checks whether or not the mobile materials react properly without any error to the detection / control unit. .
흡수 패드(absorbing pad)는 모세관 현상에 의해 반응 후 남은 잔여물을 충분히 흡수할 수 있는 것이면 특히 제한되지 않으며, 예를 들어 셀룰로오스, 무명. 친수다공성 폴리머 등을 사용할 수 있다.Absorbing pad is not particularly limited as long as it can sufficiently absorb the residue remaining after the reaction by capillary action, for example, cellulose, cotton. Hydrophilic porous polymer etc. can be used.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to specific examples. The following examples are merely examples to help understanding of the present invention, but the scope of the present invention is not limited thereto.
실시예Example
1. 자성 나노입자-백금 코어-쉘 복합체 제조1. Preparation of magnetic nanoparticle-platinum core-shell composite
(1) Fe3O4 나노입자(NPs) 합성(1) Synthesis of Fe 3 O 4 Nanoparticles (NPs)
FeCl3 및 FeCl2 를 FeCl3:FeCl2=2:1의 몰비로 포함하는 30% 암모니아수를 이용한 pH 10 조건의 수용액에서, 90℃ 온도 하에서 4시간 반응 후 균일하게 침전시킴으로써 Fe3O4 NPs를 합성할 수 있었다. TEM(JEOL EM-2010 microscope) 이미지를 통하여 무기 Fe3O4 NPs의 존재를 도 4와 같이 확인하였고, 도 5의 XRD (Rigaku D/Max 2500) 데이터를 통해 Fe3O4와 Pt의 존재를 확인하였다. FeCl 3 And FeCl 2 To Fe 3 O 4 NPs could be synthesized by uniform precipitation after 4 hours of reaction at 90 ° C. in an aqueous solution of
(2) 자성 나노입자-백금 코어-쉘(MPt/CS NPs)의 합성(2) Synthesis of Magnetic Nanoparticle-Platinum Core-Shells (MPt / CS NPs)
상기 (1)에서 합성된 Fe3O4 NPs 50 mg에, 하이드록실 아민 하이드로클로라이드(NH2OH·HCl) 50 mg과 테트라메틸 암모늄하이드록사이드(TMAOH) 136 mg이 녹아있는 수용액 75 mL를 넣어 분산시킨 후에, 아르곤 기체 조건 하의 80 ℃에서 H2PtCl6·6H2O와 환원제이자 표면 안정제인 구연산나트륨(sodium citrate) 15 mM의 수용액 100 mL를 2시간 동안 천천히 넣어준 후 3시간 반응을 진행시킴으로써 MPt/CS NPs를 제조할 수 있다. In 50 mg of Fe 3 O 4 NPs synthesized in (1), 50 mL of hydroxyl amine hydrochloride (NH 2 OH HCl) and 136 mg of tetramethyl ammonium hydroxide (TMAOH) were dissolved and dispersed in 75 mL. Thereafter, 100 ml of H 2 PtCl 6 .6H 2 O and a 15 mM aqueous solution of sodium citrate, a reducing agent and a surface stabilizer, were slowly added at 80 ° C. under argon gas for 2 hours, followed by a reaction for 3 hours. / CS NPs can be prepared.
이 때, H2PtCl6 ·6H2O를 넣어주는 양을 Pt : Fe3O4 NPs = 1:10, 1:3, 1:1 몰비로 맞춰줘 각각 7wt%, 15wt%, 30wt%의 백금이 코팅된 MPt/CS NPs (MPt/CS-7 NPs, MPt/CS-15 NPs, MPt/CS-30 NPs)를 합성하였다.At this time, adjust the amount of H 2 PtCl 6 · 6H 2 O to Pt: Fe 3 O 4 NPs = 1:10, 1: 3, 1: 1 molar ratio of 7wt%, 15wt%, 30wt% platinum The coated MPt / CS NPs (MPt / CS-7 NPs, MPt / CS-15 NPs, MPt / CS-30 NPs) were synthesized.
(3) MPt/CS의 촉매 상수 분석(3) Catalytic Constant Analysis of MPt / CS
MPt/CS의 과산화효소 모방 활성은 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB)를 이용하여, 적외선 분광분석(UV-Visible) 측정기를 통해 측정하였다. The peroxidase mimic activity of MPt / CS was measured by infrared spectroscopy (UV-Visible) using 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB).
TMB에 대한 활성은 100 μL의 H2O2 (1M), 100 uL의 TMB (31.25 μM ~1200 μM), 30 uL를 770 μL의 소듐 아세테이트 버퍼를 큐벳에 넣고, 1분간 652 nm 에서의 흡광도(absorbance) 차이를 측정하였다. Activity against TMB was determined by placing 100 μL of H2O2 (1M), 100 uL of TMB (31.25 μM to 1200 μM), 30 uL of 770 μL of sodium acetate buffer into the cuvette, and absorbance at 652 nm for 1 minute. Was measured.
이때 측정된 초기 동역학적 반응속도 데이터를 이용해, 다음의 미카엘리스-멘텐 식을 통해 각각의 상수를 측정할 수 있다.Using the measured initial kinetic kinetics data, each constant can be measured by the following Michaelis-Menten equation.
촉매 활성 분석 결과, Fe3O4 NPs에 Pt를 7중량% 도입한 경우에 비하여 15 중량% 및 30 중량%를 도입한 경우에 촉매 활성이 우수한 것을 확인할 수 있었다.As a result of the catalytic activity analysis, it was confirmed that the catalyst activity was excellent when 15 wt% and 30 wt% were introduced as compared with the case where 7 wt% of Pt was introduced into Fe 3 O 4 NPs.
2. 2. 면연분석Area analysis 칩( chip( LFILFI chip)의 제조 chip manufacturing
기존에 상용화된 임신진단테스트 LFI 칩(BioCard, 일양바이오)을 변형하여 사용하였다. Previously used pregnancy diagnosis test LFI chip (BioCard, Ilyang Bio) was used.
먼저, 상용화된 임신진단테스트 LFI 칩(BioCard, 일양바이오)의 접합 패드(conjugation pad)를 조심스럽게 제거한 후 깨끗하게 씻어서 골드 나노 입자를 없애 준 후, 데시케이터에서 24시간 동안 보관하여 완전히 건조하고, 다시 접합패드를 스트립(strip)의 시료 패드(sample pad)와 실험 패드(test pad, 멤브레인) 사이에 장착시킨 후, 패드 사이가 잘 이어질 수 있도록 고정시켜 준 다음 측방유동 분석을 시도할 수 있다. First, carefully remove the conjugation pad of the commercialized pregnancy test LFI chip (BioCard, Ilyang Bio) and wash it clean to remove the gold nanoparticles, and then store it in a desiccator for 24 hours to dry it completely. The bonding pad may be mounted between the sample pad of the strip and the test pad (membrane), and then fixed to allow the pads to be connected well before the lateral flow analysis may be attempted.
다만, 본 실험은 상용화된 임신진단테스트를 이용하기 위해 접합 패드를 세척하여 사용하였으나, 본 발명이 적용될 수 있는 면연분석 칩은 도 2에 도식적으로 나타낸 바와 같이, 접합 패드가 생략될 수 있다. However, this experiment was used to wash the bonding pad in order to use a commercial pregnancy test, the surface analysis chip to which the present invention can be applied, as shown schematically in FIG. 2, the bonding pad may be omitted.
3. 자성 나노입자-백금 코어-쉘 3. Magnetic Nanoparticles-Platinum Core-Shell 복합체을Complex 이용한 면역분석에서의 신호 증폭 효과 확인 Confirmation of signal amplification effect in immunoassay using
(1) MPt/CS NPs 표면에 hCG 항체(Ab) 고정(1) Fixation of hCG antibody (Ab) on the surface of MPt / CS NPs
1.(2)에 의해 합성된 후 분산된 7wt%, 15wt% 및 30wt%의 백금이 코팅된 MPt/CS-7 NPs, MPt/CS-15 NPs 및 MPt/CS-30 NPs에 화학적 결합이 아닌 물리적 결합 (physical adsorption)을 이용하여 단순히 나노 입자와 항체를 섞어주는 과정만으로 고정화를 완성하였다.1. No chemical bonding to 7 wt%, 15 wt% and 30 wt% platinum coated MPt / CS-7 NPs, MPt / CS-15 NPs and MPt / CS-30 NPs synthesized by (2) Immobilization was accomplished by simply mixing nanoparticles with antibodies using physical adsorption.
보다 상세하게, 1.(2)에 의해 최종적으로 합성된 뒤 물 (deionized water)에 분산된 MPt/CS NPs (7.0mg/ml)에 검출 항체인 β-hCG 단일 항체 (5mg/ml) 를 넣어서 잘 섞어 준 후 24시간 동안 4 ℃에서 로테이터에 장착하여 반응시켰다. More specifically, MPt / CS NPs (7.0 mg / ml), which is finally synthesized by 1. (2), and then dispersed in deionized water, were added with β-hCG single antibody (5 mg / ml) as a detection antibody. After mixing well, the reaction mixture was mounted on a rotator at 4 ° C. for 24 hours.
그 후 PBS에 희석된 0.1 wt% tween20 및 3 wt% BSA로 항체가 고정되지 않은 부분을 BSA로 블록킹(blocking)시켰다. 필요에 따라 1일 4 ℃에서 로테이터에 장착한 후 후속 반응을 수행할 수 있다. 그 후, PBS에 희석된 0.1 wt% tween20 및 3 wt% BSA로 3번 씻어 주고 (14,000rpm, 30분, 4 ℃) 7.0mg/ml의 농도로 보관하였다.Thereafter, the portion of the antibody that was not immobilized with 0.1 wt% tween20 and 3 wt% BSA diluted in PBS was blocked with BSA. If necessary, the reaction may be carried out after mounting on a rotator at 4 ° C. per day. Then, washed three times with 0.1 wt% tween20 and 3 wt% BSA diluted in PBS (14,000rpm, 30 minutes, 4 ℃) and stored at a concentration of 7.0mg / ml.
각 나노 입자(Particle) 당 고정된 hCG 항체 고정량을 상용키트인 Bradford assay 을 이용하여 분석한 결과를 도 6에 나타내었다. The fixed amount of fixed hCG antibody per nanoparticle (Particle) was analyzed by using a commercial kit Bradford assay is shown in FIG.
그 결과 각 나노 입자에 항원이 고정량된 것을 확인할 수 있었으며, Fe3O4 NPs는 다수의 항원을 잡지 못하여 고정량이 적은 것을 확인할 수 있었다. As a result, it was confirmed that the fixed amount of antigen in each nanoparticle, Fe 3 O 4 NPs was able to confirm that the fixed amount is small because it does not hold a number of antigens.
(2) Fe3O4 나노 입자의 포화 자화도를 이용한 항원의 포집 및 농축(2) Capture and Concentration of Antigen Using Saturation Magnetization of Fe 3 O 4 Nanoparticles
상기 3.(1)에 의해 β-hCG 단일 항체가 고정된 MPt/CS NPs을 15ml 에 희석되어 있는 hCG (1, 0.3, 0.1, 0.03, 0.01, 0 ng/ml)에 각각 15 μl 씩 넣어 준 후 2시간 동안 충분히 셰이킹(shaking) 인큐베이터로 반응시켜, MPt/CS NPs에 고정된 단일 항체가 hCG 단백질을 잡을 수 있게 해주었다. MPt / CS NPs to which β-hCG single antibody was immobilized by 3. (1) were added to 15 μl of hCG (1, 0.3, 0.1, 0.03, 0.01, 0 ng / ml) diluted in 15 ml. The reaction was then sufficiently shaken in the incubator for 2 hours, allowing a single antibody immobilized on MPt / CS NPs to capture hCG protein.
그 후 항원-항체-MPt/CS NPs 복합체를 포집 및 농축하기 위해 예를 들어 도 7과 같이 자석을 바이알(vial) 한쪽에 위치시켜 20분 동안 반응시켰다. 도 8은 시간에 따른 상층액 내 흡광도(absorbance)의 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다. Thereafter, to collect and concentrate the antigen-antibody-MPt / CS NPs complex, the magnet was placed on one side of a vial as shown in FIG. 7 and allowed to react for 20 minutes. Figure 8 shows the results of confirming the change in absorbance (absorbance) in the supernatant with time.
그 후 상층액은 모두 버리고 항원-항체-MPt/CS NPs 복합체를 10 wt% 수크로오스(sucrose), 0.1wt % tween20, 3wt % BSA를 포함하는 PBS 50μl 에 현탁(suspension)시켜 놓았다. All supernatants were then discarded and the antigen-antibody-MPt / CS NPs complex was suspended in 50 μl of PBS containing 10 wt% sucrose, 0.1 wt% tween20, 3 wt% BSA.
(3) 측방유동 분석(Lateral flow assay) (3) Lateral flow assay
10 wt% 수크로오스(sucrose), 0.1 wt % tween20, 3 wt % BSA를 포함하는 PBS 50μl 에 현탁되어 있는 항원-항체-MPt/CS NPs 복합체를 LFI 칩의 시료 패드에 떨어뜨려 흘려주고 5분간 검출 반응이 일어날 수 있도록 해주었다. The antigen-antibody-MPt / CS NPs complex suspended in 50 μl of PBS containing 10 wt% sucrose, 0.1 wt% tween20 and 3 wt% BSA was dropped on the sample pad of the LFI chip and detected for 5 minutes. This made it happen.
그 후 소듐 아세테이트(sodium acetate) 60 μl 로 씻어준 후 기질이 포함되어 있는 AEC용액 (AEC, 0.03% H2O2, 50mM sodium acetate buffer, pH 4.5) 50 μl 를 실험 패드(test pad, 멤브레인)에 떨어 뜨려 Pt NPs 와 AEC 간의 효소-기질 반응이 일어날 수 있도록 5분 동안 진행하였다. 그 결과는 스마트폰 (Galaxy S4 SHV-E00S, Samsung)으로 이미징 후 이미지 프로그램 (Image J, NIH)으로 정량 분석하였다.After washing with 60 μl of sodium acetate, 50 μl of AEC solution (AEC, 0.03% H2O2, 50 mM sodium acetate buffer, pH 4.5) containing the substrate was dropped on a test pad (membrane). The enzyme-substrate reaction between Pt NPs and AEC was allowed to proceed for 5 minutes. The results were quantitatively analyzed with an image program (Image J, NIH) after imaging with a smartphone (Galaxy S4 SHV-E00S, Samsung).
MPt/CS-15 NPs 을 이용하여 LFIA를 진행한 결과 도 9에서 확인할 수 있는 바와 같이0.1ng/ml까지 육안으로 확인 가능하였고, 이미징 프로그램으로 분석 결과 도 10에서 확인할 수 있는 바와 같이 20 pg/ml의 검출 한계를 갖는 것을 확인할 수 있었다.As a result of LFIA using MPt / CS-15 NPs, it was possible to visually check up to 0.1 ng / ml as shown in FIG. 9, and 20 pg / ml as shown in FIG. It was confirmed that the detection limit of.
한편, MPt/CS-7 NPs 을 이용하여 LFIA를 진행, 이미징 프로그램으로 분석 결과 40 pg/ml의 검출 한계를 갖는 것을 확인 할 수 있었다. 또한, MPt/CS-30 NPs 을 이용하여 LFIA를 진행, 이미징 프로그램으로 분석 결과 40 pg/ml의 검출 한계를 갖는 것을 확인할 수 있었다. 이들 결과는 도 10에 함께 나타내었다.On the other hand, LFIA was progressed using MPt / CS-7 NPs, and the analysis program showed that the detection limit was 40 pg / ml. In addition, LFIA was progressed using MPt / CS-30 NPs, and an analysis program showed that the detection limit was 40 pg / ml. These results are shown together in FIG. 10.
이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.Although the embodiments of the present invention have been described in detail above, the scope of the present invention is not limited thereto, and various modifications and variations can be made without departing from the technical spirit of the present invention described in the claims. It will be obvious to those of ordinary skill in the field.
10 : 시료 패드 11 : 접합 패드
12 : 멤브레인 13 : 탐지부
14 : 컨트롤부 15 : 흡수 패드10
12
14
Claims (14)
상기 코어의 표면에 위치하고, 백금(Pt) 나노입자를 포함하는 쉘(shell)로 이루어지며, 백금이 7 중량% 초과 내지 30 중량% 미만의 양으로 포함된, 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체에, 분석물(analyte)의 제 1 에피토프 또는 제 1 결합부위에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항체 또는 제 1 특이적 결합물질을 고정하는 단계;
제 1 항체 또는 제 1 특이적 결합물질이 고정된 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체와 분석물을 결합하는 단계;
분석물이 결합된 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체를 자성분리하여 농축하는 단계;
농축된 분석물이 결합된 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체를, 분석물의 제 2 에피토프 또는 제 2 결합부위에 특이적으로 결합하는 제 2 항체 또는 제 2 특이적 결합물질이 고정화 된 탐지부(detection site)를 구비하는 측방유동 (Lateral flow) 면역 크로마토그래피에 적용하는 단계; 및
농축된 분석물이 결합된 자성 나노입자-백금 코어쉘 복합체가 탐지부(detection site)에 결합된 후 발색 기질을 탐지부에 가하는 단계
를 포함하는, 측방유동 (Lateral flow) 분석에서의 신호 증폭 방법.
A core comprising magnetic nanoparticles; And
Located on the surface of the core, consisting of a shell containing platinum (Pt) nanoparticles (shell), the magnetic nanoparticles-platinum core shell composite, containing platinum in an amount of more than 7% to less than 30% by weight Fixing a first antibody or first specific binding agent capable of specifically binding to a first epitope or first binding site of the analyte;
Binding the analyte with the magnetic nanoparticle-platinum coreshell complex immobilized with the first antibody or first specific binding material;
Magnetically separating and concentrating the magnetic nanoparticle-platinum coreshell complex to which the analyte is bound;
Detection of magnetic nanoparticle-platinum coreshell complexes to which the concentrated analyte is bound is immobilized with a second antibody or second specific binding agent that specifically binds to the second epitope or second binding site of the analyte. applying to Lateral flow immunochromatography having a site); And
After the magnetic nanoparticle-platinum core-shell complex with the concentrated analyte is bound to the detection site, a coloring substrate is added to the detection site.
Including, signal amplification method in the lateral flow (Lateral flow) analysis.
The method of claim 1, wherein the magnetic nanoparticles are iron oxide selected from Fe 2 O 3 and Fe 3 O 4 ; And at least one member selected from the group consisting of ferrites selected from CoFe 2 O 4 and MnFe 2 O 4 .
The method of claim 1, wherein the magnetic nanoparticles have an average diameter of 0.1 to 5 nm.
(a) 자성 나노입자를 제조하는 단계;
(b) 상기 자성 나노입자를 분산 용매에 분산시켜 자성 나노입자가 분산된 용액을 제조하는 단계; 및
(c) 단계 (b)에서 제조된 용액에 백금(Pt)염과, 안정제의 기능을 동시에 수행하는 환원제를 Pt와 자성 나노입자의 몰비가 Pt 1몰 기준으로 자성 나노입자 1몰 초과 내지 10몰 미만이 되도록 첨가하는 단계에 의해 획득되는, 측방유동 (Lateral flow) 분석에서의 신호 증폭 방법.
The method of claim 1, wherein the magnetic nanoparticle-platinum core shell composite,
(a) preparing magnetic nanoparticles;
(b) dispersing the magnetic nanoparticles in a dispersion solvent to prepare a solution in which the magnetic nanoparticles are dispersed; And
(c) A solution prepared in step (b) is a platinum (Pt) salt and a reducing agent which simultaneously performs the function of a stabilizer, wherein the molar ratio of Pt and magnetic nanoparticles is greater than 1 to 10 mol of magnetic nanoparticles based on 1 mol of Pt. A method of signal amplification in Lateral flow analysis, obtained by adding to less than.
The method according to claim 4, wherein the salt of the magnetic metal is at least one selected from FeCl 3 and FeCl 2 , signal amplification method in the lateral flow (Lateral flow) analysis.
The lateral flow of claim 4, wherein the dispersion solvent comprises at least one selected from hydroxylamine hydrochloride (NH 2 OH.HCl) and tetramethyl ammonium hydroxide (TMAOH). ) Signal amplification method in the analysis.
The method according to claim 4, wherein the platinum salt is at least one selected from H 2 PtCl 6 · 6H 2 O and K 2 PtCl 4 .
The method of claim 4, wherein the reducing agent is at least one selected from sodium citrate and ascorbic acid.
The method of claim 1, wherein applying the lateral flow immunochromatography is performed by applying a magnetic nanoparticle-platinum coreshell complex having a concentrated analyte bound together with a liquid sample. Signal amplification method.
The method of claim 1, wherein the binding site is at least one selected from the group consisting of a protein ligand (Ligand), DNA sequence and RNA sequence, the specific binding material is a protein that can specifically bind to the binding site , Viral phage, nucleic acid molecule aptamer and hapten (hapten (DNP)), characterized in that at least one selected from the group consisting of, signal amplification method in Lateral flow (Lateral flow) analysis.
The method of claim 1, wherein the analyte is selected from the group consisting of DNA, environmental hormones, and antigenic proteins.
The method of claim 1, wherein the chromogenic substrate is selected from the group consisting of AEC (3-amino-9-ethylcarbazole), DAB (3,3'-Diaminobenzidine) and TMB (3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidine) At least one method of signal amplification in Lateral flow analysis.
분석물을 포함하는 액체 시료가 가해지는 샘플 패드;
상기 샘플 패드에 접촉하며, 상기 분석물의 제 2 에피토프 또는 제 2 결합부위에 특이적으로 결합하는 제 2 항체 또는 제 2 특이적 결합물질이 고정화 된 탐지부(detection site) 및 컨트롤부를 포함하는 멤브레인; 및
상기 멤브레인의 하류에 설치되어 액체 시료를 모세관 현상에 의해 흡수할 수 있는 흡수 패드
를 포함하는, 측방유동 (Lateral flow) 분석에서의 신호 증폭 방법.
The method of claim 1, wherein the lateral flow immunochromatography,
A sample pad to which a liquid sample containing the analyte is applied;
A membrane in contact with the sample pad and including a detection site and a control unit to which a second antibody or second specific binding agent that specifically binds to a second epitope or a second binding site of the analyte is immobilized; And
Absorption pads installed downstream of the membrane to absorb liquid samples by capillary action
Including, signal amplification method in the lateral flow (Lateral flow) analysis.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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