KR102059624B1 - Probiotic lactic acid bacteria with outstanding immune-modulatory activity, intestinal attachment ability, and baking quality - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 프로바이오틱 유산균에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 면역 조절 활성, 장 부착능 및 제빵 적성이 우수한 프로바이오틱 유산균에 관한 것이다.The present invention relates to probiotic lactic acid bacteria, and more particularly, to probiotic lactic acid bacteria excellent in immunomodulatory activity, intestinal adhesion and baking aptitude.
유산균은 발효 식품에서 흔히 찾아볼 수 있는 균사체로, 발효 식품인 요구르트, 김치, 낫토 등에 많이 포함되어 있으며, 젖산균이라고도 한다. 대표적인 유산균으로는 락토바실러스 카제이(Lb. casei), 락토바실러스 애시도필러스(Lb.acidophilus), 락토바실러스 불가리쿠스(Lb. bulgaricus), 비피도박테리움 롱검(B.longum), 비피도박테리움 비피덤(B.bifidum) 등이 있다. Lactobacillus is a mycelia commonly found in fermented foods, it is contained in a lot of fermented foods such as yogurt, kimchi, natto, also known as lactic acid bacteria. Representative lactic acid bacteria include Lb. casei , Lb.acidophilus , Lb. bulgaricus , Bifidobacterium longgum , Bifidobacte Leeum B. bifidum.
프로바이오틱스 유산균의 주된 건강기능 중 한가지는 면역조절기능이며 장내에서 유산균이 생성한 초산(acetic acid), 프로피온산(propionic acid), 부틸산(butylic acid)과 같은 단쇄지방산에 의한 면역시스템의 활성화와 유산균 균체의 세포벽 성분인 다당체에 의한 장내 상피조직의 수지상세포 자극에 의한 기작이 알려졌다. 특히 세포벽 다당체에 의한 면역조절 기능은 생균(live cells)뿐만 아니라 사균(dead cells)에서도 유사한 수준으로 나타나는 것으로 알려져, 사균 섭취에 의한 면역조절기능은 잠재적으로 중요한 건강 유지 수단으로 간주되고 있다. 국내에서는 유산균 사균체의 항균활성을 바탕으로 설사치료를 위한 원료의약품으로 사용되고 있고 일본에서는 꽃가루 알러지 등 면역 관련 효능으로 사균체 제품이 개발되었다. 그 예로 일본에서 출시된 “FK-23”제품은 유산균을 열처리한 사균체로 구성되며 면역활성 기능으로 C형 간염 치료제이고, “acidophilus L-92”균주의 사균체도 면역 조절 활성을 제공하는 제품으로 개발되었다. One of the main health functions of probiotics lactic acid bacteria is immunomodulatory function and activation of immune system and short-chain fatty acids such as acetic acid, propionic acid and butylic acid produced by lactic acid bacteria in the intestine The mechanism by which dendritic cell stimulation of intestinal epithelial tissue is induced by polysaccharide, a cell wall component of, has been known. In particular, the immunomodulatory function by cell wall polysaccharides is known to appear at similar levels in dead cells as well as live cells, and immunoregulatory function by ingesting dead cells is considered as a potentially important health maintenance means. Based on the antimicrobial activity of Lactobacillus microorganisms, it is used as a raw material for diarrhea treatment. In Japan, microbial products have been developed for immune-related effects such as pollen allergy. For example, the "FK-23" product released in Japan is composed of microorganisms heat-treated with lactic acid bacteria, and hepatitis C treatment as an immune-activating function, and the microorganisms of the "acidophilus L-92" strain also provide immune regulation Was developed.
면역 반응은 크게 선천성 면역(innate immunity)과 적응면역(adaptive immunity)으로 구분한다. 선천성 면역은 대식세포(macrophages)와 수지상세포(dendritic cells)가 관여하여 항원을 비특이적으로 인식 후 제거하는 과정인 반면, T-세포와 B-세포로 대표되는 적응면역 세포는 특이적으로 항원과 반응한다. 항원제시세포(antigen-presenting cells)로는 B-세포, 대식세포, 수지상 세포가 있는데, 이들은 항원을 포획 후 분해하여 주조직적합성 복합체(major histocompatibility complex, MHC)를 통해 세포표면에 항원 펩티드를 제시하고, T-세포의 수용체에 구조정보를 전달한다. 항원을 포획 후 활성화된 항원제시세포는 CD80, CD86, CD40과 같은 분자들의 발현을 유도하고, 이들은 다시 T-세포의 활성화와 항원제시세포의 활성에 작용한다. Immune responses are largely divided into innate immunity and adaptive immunity. Innate immunity is a process in which macrophages and dendritic cells are involved in non-specific recognition and removal of antigens, whereas adaptive immune cells, represented by T- and B-cells, specifically react with antigens. do. Antigen-presenting cells include B-cells, macrophages, and dendritic cells, which capture and degrade antigens to present antigenic peptides on the cell surface through major histocompatibility complex (MHC). It delivers structural information to T-cell receptors. After capturing the antigen, the activated antigen presenting cells induce the expression of molecules such as CD80, CD86, and CD40, which in turn act on the activation of T-cells and the activity of antigen presenting cells.
예를 들어 B-세포와 활성화된 보조 T-세포 사이에 있는 CD40/CD40 결합을 통해 B-세포는 항체 IgM을 생성하다가 IgA, IgG, IgE로 생성반응이 변경될 수 있다. 활성화된 보조 T-세포는 존재하는 사이토카인에 따라서 Th1과 Th2 세포로 분화된다. 대식세포와 수지상세포가 미생물을 인식하고 사이토카인인 IL-12, IL-6, TNF-α을 분비하면 활성화된 보조 T-세포는 Th1 세포로 분화하고 IFN-γ:IL-4의 분비비율이 증가한다. 반대로 미생물에 의한 자극이 없으면 사이토카인은 활성화된 보조 T-세포를 Th2 세포로 분화되도록 유도하고, IFN-γ:IL-4의 분비비율은 감소하게 되어 결과적으로 B세포가 IgE를 생성하도록 유도한다. 이렇게 Th2 세포로 분화되는 경로는 IL-12 자극 신호가 없을 경우에 기본적으로 진행되는 것으로 알려졌다. For example, through CD40 / CD40 binding between B-cells and activated helper T-cells, B-cells produce antibody IgM, which can be altered by IgA, IgG, or IgE. Activated helper T-cells differentiate into Th1 and Th2 cells depending on the cytokines present. When macrophages and dendritic cells recognize microorganisms and secrete the cytokines IL-12, IL-6, and TNF-α, activated adjuvant T-cells differentiate into Th1 cells and the secretion ratio of IFN-γ: IL-4 Increases. Conversely, without microbial stimulation, cytokines induce activated adjuvant T-cells to differentiate into Th2 cells, and the secretion rate of IFN-γ: IL-4 decreases, resulting in B cells producing IgE. . This differentiation pathway to Th2 cells is known to proceed basically in the absence of IL-12 stimulation signals.
IgE 항체는 외부생물 감염시 꼭 필요한 방어수단이나 과도한 분비는 점막층에서 비만세포가 염증성 매개체를 분비하여 아토피, 비염, 가래 등과 같은 알러지 증상을 일으킨다. 잘 알려진 ‘위생이론(hygiene theory)’에 의하면 적절한 미생물의 자극이 없으면 IL-12를 생성하는 선천성 면역 세포의 활성이 떨어지고 Th2 세포가 과도하게 활성화되어, IgE 생성이 촉진되고 알러지 증상이 증가하는 것으로 관찰된다. 결과적으로, Th1과 Th2 세포는 서로 길항 작용을 일으키기 때문에, Th2 세포의 과도한 면역 반응에 의해 유발되는 알러지의 치료를 위하여, Th1 세포에 의한 면역 반응을 유발하는 치료법이 개발되고 있다.IgE antibodies are a necessary defense against external organism infection, but excessive secretion causes allergic symptoms such as atopy, rhinitis and sputum by mast cells secreting inflammatory mediators from the mucosal layer. According to the well-known hygiene theory, without proper microbial stimulation, the innate immune cells that produce IL-12 are reduced and Th2 cells are excessively activated, which promotes IgE production and increases allergic symptoms. Is observed. As a result, since Th1 and Th2 cells antagonize each other, for the treatment of allergy caused by an excessive immune response of Th2 cells, a treatment for inducing an immune response by Th1 cells has been developed.
한편, 발효빵의 재료인 사워도우 스타터(sourdough starter)에는 살아있는 효모와 박테리아가 가득 차있고, 이를 스타터로 이용한 자연발효법은 제빵법의 기법으로 사용되고 있다. 자연발효법에 의하여 제빵할 경우 다양한 미생물이 혼재하므로 풍부한 향을 기대할 수 있으나, 다른 미생물의 오염에 의한 문제가 있을 수 있으며, 적용된 미생물의 농도가 낮을 경우 발효시간이 연장되어야 하는 등 일정한 품질의 제품을 생산하는데 어려움이 있다. 현재 보편적으로 적용되는 발효빵의 제조방법은 반죽시에 인위적으로 효모(yeast)를 첨가하여 이를 스타터로 사용하는 방법이다. 소규모 베이커리에서는 15 내지 24시간의 발효과정인 1 단계(one-stage) 사워도우 프로세스를 선호하고 있고, 대규모 베이커리에서는 2 단계(two-stage) 사워도우 프로세스를 선호하고 있다. 그러나 일반적으로 효모를 단독으로 사용한 발효빵은 저장성이 낮고 향이 빈약한 문제가 존재한다.Meanwhile, the sourdough starter, which is a fermented bread material, is filled with live yeast and bacteria, and a natural fermentation method using the starter is used as a baking method. When baking by natural fermentation method, various microorganisms are mixed, so rich flavor can be expected, but there may be a problem due to contamination of other microorganisms, and if the concentration of applied microorganism is low, fermentation time should be extended. Difficult to produce Currently, the method of manufacturing fermented bread commonly applied is a method of artificially adding yeast (yeast) at the time of kneading and using it as a starter. Small bakeries prefer a one-stage sourdough process, which is a 15 to 24 hour fermentation process, and large bakeries prefer a two-stage sourdough process. However, in general, fermented bread using yeast alone has a low shelf life and poor fragrance.
이러한 사워도우(Sourdough) 발효기술은 산성반죽 발효기술이라고도 하며 일반적으로 밀가루, 물, 호밀가루를 섞어 제조하는데, 효모와 유산균이 각각 알코올과 젖산을 생성하여 빵에 풍미를 부여하고 기호성을 향상시킨다. 사워도우 발효와 관련된 유산균으로는 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 속, 페디오코쿠스(Pediococcus) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 바이셀라(Weissella) 속 등이 알려져 있다. 한편, 자연 발효법에 의존하는 전통적인 사워도우 빵(sourdough bread)은 작업 환경에서 유래하는 다양한 종류의 세균이 오염되어 풍미가 나빠지거나 산패취 등이 발생하는 문제점이 발생한다. 또한, 공간과 시간적 차이에 의해 균등한 품질의 제품을 재현하는데 어려움이 있다. 따라서, 자연 발효빵의 오염 기회 회피와 균등한 품질을 확보하고자 기능성과 안전성이 확보된 유산균 스타터(starter)를 반죽에 첨가하는 것이 필요하다. 이미 일부 국내 제빵 업체에서는 이를 위해 수입한 스타터(starter)를 사용하고 있으나 강한 산미를 제공하여 국내 소비자의 제빵 기호도에 적합하지 않거나, 계대 배양 도중 균주 특성이 쉽게 변화하는 문제점이 관찰된다. 따라서, 한국인의 기호도에 적합하면서 제빵현장에 안정적으로 사용할 수 있는 스타터의 개발이 필요한 실정이다. 더불어, 사균(dead cells)으로 섭취 후 장내에서 면역조절활성을 보이는 유산균을 스타터로 사용한다면 제빵 적성과 건강 기능성을 동시에 제공할 수 있다.This sourdough fermentation technology, also known as acid kneading fermentation technology, is generally manufactured by mixing flour, water, and rye flour. Yeast and lactic acid bacteria produce alcohol and lactic acid, respectively, to flavor bread and improve palatability. Lactic acid bacteria related to sourdough fermentation are known as Streptococcus genus, Pediococcus genus, Lactobacillus genus, Leuconostoc genus and Weissella genus. On the other hand, traditional sourdough bread (depending on the natural fermentation method) has a problem that the various kinds of bacteria derived from the working environment is contaminated, resulting in poor flavor or rancid odor. In addition, there is a difficulty in reproducing an equal quality product due to space and time difference. Therefore, it is necessary to add lactic acid bacteria starter (starter) secured functionality and safety to the dough in order to avoid the opportunity of contamination of natural fermented bread and to ensure the equivalent quality. Some domestic bakery companies are using imported starters for this purpose, but strong acidity is provided so that it is not suitable for the baking preference of domestic consumers, or strain characteristics are easily changed during subculture. Therefore, it is necessary to develop a starter that is suitable for Korean taste and can be used stably at a baking site. In addition, lactic acid bacteria showing immunomodulatory activity in the intestine after ingestion into dead cells can be used to provide both baking aptitude and health functionality.
본 발명은 면역 조절 활성, 장 부착능 및 제빵 적성이 우수한 프로바이오틱 유산균을 발굴하여 제공하고자 한다.The present invention is to discover and provide probiotic lactic acid bacteria excellent in immunomodulatory activity, intestinal adhesion and baking aptitude.
본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) SPC-SNU 72-2 (KCTC13315BP)를 제공한다.The present invention provides Lactobacillus plantarum SPC-SNU 72-2 (KCTC13315BP).
한편, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) SPC-SNU 72-2 (KCTC13315BP)를 밀가루에 첨가한 후 발효시켜 제조된 것을 특징으로 하는 제빵용 반죽물을 제공한다.On the other hand, the present invention provides a dough for baking, characterized in that the Lactobacillus plantarum ( Lactobacillus plantarum ) SPC-SNU 72-2 (KCTC13315BP) is added to the flour and then fermented.
한편, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) SPC-SNU 72-2 (KCTC13315BP)를 밀가루에 첨가한 후 발효시키고, 베이킹(baking)하여 제조된 것을 특징으로 하는 빵을 제공한다.Meanwhile, the present invention provides Lactobacillus plantarum SPC-SNU 72-2 (KCTC13315BP) to flour, followed by fermentation and baking.
본 발명의 프로바이오틱 유산균은 면역 조절 활성 및 장 부착능이 특히 우수하다. 본 발명의 프로바이오틱 유산균을 제빵효모와 함께 반죽 발효시, 빵의 물성, 향미, 유통기간을 개선하고, 사균으로 면역 활성을 가지는 빵을 제조할 수 있다.The probiotic lactic acid bacteria of the present invention are particularly excellent in immunomodulatory activity and intestinal adhesion. When the probiotic lactobacillus of the present invention and the dough fermentation with baker's yeast, improve the physical properties, flavor, shelf life of the bread, it can be produced bread having immunity to the bacterium.
도 1은 김치로부터 분리한 균주들의 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) specific PCR을 수행한 결과이다.
도 2는 본 발명 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) SPC-SNU 72-2 및 공시균주 2종에 대해 바이오제닉아민 생성능이 있는지 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명 락토바실러스 플란타룸 SPC-SNU 72-2 및 공시균주(Lb. reuteri KCCM40717)의 용혈현상을 측정한 결과이다.
도 4는 본 발명 락토바실러스 플란타룸 SPC-SNU 72-2의 pH에 따른 산 내성을 비교한 결과이다.
도 5는 본 발명 락토바실러스 플란타룸 SPC-SNU 72-2의 담즙 농도에 따른 유산균의 담즙내성을 비교한 결과이다.
도 6은 대장 상피세포인 Caco-2 세포를 이용해 장내 부착능을 평가한 결과이다.
도 7은 말토오스 배지에서 본 발명 락토바실러스 플란타룸 SPC-SNU 72-2의 배양학적 특성을 나타낸 결과이다.
도 8은 본 발명 락토바실러스 플란타룸 SPC-SNU 72-2의 말토오스 이용능을 확인한 결과이다.
도 9는 공시균주로 사용한 락토바실러스 플란타룸 KACC11451가 적용된 빵, 락토바실러스 플란타룸의 상업균주인 Lallemand L73이 적용된 빵, 본 발명 락토바실러스 플란타룸 SPC-SNU 72-2가 적용된 빵의 사진이다.
도 10은 본 발명 락토바실러스 플란타룸 SPC-SNU 72-2, 상업균주인 Lallemand L73, 공시균주로 사용한 락토바실러스 플란타룸 KACC11451가 각각 적용된 본종의 가스 발생력을 확인한 결과이다.
도 11은 본 발명 락토바실러스 플란타룸 SPC-SNU 72-2가 적용된 빵의 노화 속도를 측정한 결과이다.
도 12는 본 발명 락토바실러스 플란타룸 SPC-SNU 72-2가 적용된 빵 (시료) 1g당 검출된 휘발성 향기성분 (alcohol, aldehyde, ketone, acid 류 등)의 전체적인 정량적 수치를 비교한 결과이다.1 is a result of performing the Lactobacillus plantarum specific PCR of the strains isolated from kimchi.
Figure 2 shows the results of confirming that the present invention Lactobacillus plantarum ( Lactobacillus plantarum ) SPC-SNU 72-2 and biogenic amine production ability for two strains.
Figure 3 is the result of measuring the hemolysis of the Lactobacillus plantarum SPC-SNU 72-2 and the test strain ( Lb. reuteri KCCM40717) of the present invention.
Figure 4 is a result of comparing the acid resistance according to the pH of the present invention Lactobacillus plantarum SPC-SNU 72-2.
5 is a result of comparing the bile resistance of lactic acid bacteria according to the bile concentration of the present invention Lactobacillus plantarum SPC-SNU 72-2.
6 is a result of evaluating intestinal adhesion capacity using Caco-2 cells, which are colonic epithelial cells.
Figure 7 is a result showing the culture characteristics of the present invention Lactobacillus plantarum SPC-SNU 72-2 in maltose medium.
8 is a result confirming the maltose capacity of the present invention Lactobacillus plantarum SPC-SNU 72-2.
9 is a bread to which the Lactobacillus plantarum KACC11451 is applied as a test strain, a bread to which Lallemand L73 is applied as a commercial strain of Lactobacillus plantarum, and a bread to which the present invention Lactobacillus plantarum SPC-SNU 72-2 is applied. to be.
10 is a result of confirming the gas generating power of the present species to which the present invention Lactobacillus plantarum SPC-SNU 72-2, commercial strain Lallemand L73, lactobacillus plantarum KACC11451 used as the test strain.
11 is a result of measuring the aging rate of the bread to which the present invention Lactobacillus plantarum SPC-SNU 72-2 is applied.
12 is a result of comparing the quantitative value of the volatile aroma components (alcohol, aldehyde, ketone, acid, etc.) detected per 1g of bread (sample) to which the present invention Lactobacillus plantarum SPC-SNU 72-2 is applied.
본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) SPC-SNU 72-2 (KCTC13315BP)를 제공한다. 상기 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) SPC-SNU 72-2 (KCTC13315BP)는 김치로부터 분리한 유산균으로서, 장 부착능이 특히 우수하고, 그 외에 면역 조절 활성이 우수한 특징이 있다. 또한, 제빵에 적용시 제빵 적성 또한 우수한 것으로 나타났다. The present invention provides Lactobacillus plantarum SPC-SNU 72-2 (KCTC13315BP). The Lactobacillus plantarum ( Lactobacillus plantarum ) SPC-SNU 72-2 (KCTC13315BP) is a lactic acid bacterium isolated from kimchi, and is particularly excellent in intestinal adhesion, and in addition, it has excellent immunomodulatory activity. In addition, baking aptitude was also excellent when applied to baking.
한편, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) SPC-SNU 72-2 (KCTC13315BP)를 밀가루에 첨가한 후 발효시켜 제조된 것을 특징으로 하는 제빵용 반죽물을 제공한다. 김치로부터 분리한 신규 유산균인 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) SPC-SNU 72-2 (KCTC13315BP)가 첨가된 밀가루 반죽은 초기 가스 발생력이 대조구보다 현저히 우수하여 제빵용으로 적합하다.On the other hand, the present invention provides a dough for baking, characterized in that the Lactobacillus plantarum ( Lactobacillus plantarum ) SPC-SNU 72-2 (KCTC13315BP) is added to the flour and then fermented. Flour dough containing Lactobacillus plantarum SPC-SNU 72-2 (KCTC13315BP), which is a new lactic acid bacterium isolated from kimchi, is superior to the control group and is suitable for baking.
한편, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) SPC-SNU 72-2 (KCTC13315BP)를 밀가루에 첨가한 후 발효시키고, 베이킹(baking)하여 제조된 것을 특징으로 하는 빵을 제공하는데, 상기 베이킹(baking)은 굽는 것을 의미한다. 상기와 같이 제조된 빵은 상업 이스트로 제조된 빵보다 빵의 식감이 부드럽고, 경도가 낮으며, 노화속도가 느려 저장성이 우수하다. 또한, 기호도가 우수한 향기 성분을 발산하여 풍미가 좋다.On the other hand, the present invention provides Lactobacillus plantarum ( Lactobacillus plantarum ) SPC-SNU 72-2 (KCTC13315BP) is added to the flour and then fermented and baked to provide a bread, characterized in that the baking, Baking means baking. The bread prepared as described above has a softer texture, a lower hardness, and a slower aging rate than the bread manufactured with commercial yeast, and thus has excellent shelf life. Moreover, the flavor is good by releasing the fragrance component excellent in preference.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 또는 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 또 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.Hereinafter, the content of the present invention will be described in more detail through the following examples or experimental examples. However, the scope of the present invention is not limited only to the following Examples and Experimental Examples, but includes modifications of equivalent technical ideas.
<< 실시예Example 1: One: 본 발명 The present invention 프로바이오틱Probiotic 유산균의 분리 및 동정> Isolation and Identification of Lactic Acid Bacteria>
(1)(One) 유산균 분리Lactic acid bacteria isolated
김치 10g, 0.85% NaCl 90㎖를 여과포(filter bag)에 담아 스토마커(stomacher)를 이용해 3분간 균질화하였다. 이를 다시 0.85% NaCl로 단계적 희석을 통해 적절한 농도로 희석한 후, 0.01% 사이클로헥사미드(cycloheximide), BPB(Bromophenol blue)가 첨가된 MRS(de Man Rogosa and Sharpe, Difco) 고체배지에 도말하여 분리하였다. 유산균이 생성하는 산에 의하여 콜로니 색이 변하는 특성을 이용하여 균주를 선택적으로 선발하기 위하여, 기존의 MRS 배지에 브로모페놀블루(Bromophenol-blue)를, 진균 억제를 위하여 사이클로헥사미드(cycloheximide)를 첨가하였다. 배양조건은 30℃에서 48시간 동안 혐기 배양하였고, 가운데 진한 파란색원을 가진 흰색 콜로니를 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)후보 균주로 간주하고 순수분리 배양을 하였다.10 g of kimchi and 90 ml of 0.85% NaCl were placed in a filter bag and homogenized for 3 minutes using a stomacher. Dilution was carried out in steps of 0.85% NaCl to the appropriate concentration, followed by plating on MRS (de Man Rogosa and Sharpe, Difco) solid medium containing 0.01% cycloheximide and BPB (Bromophenol blue). It was. In order to selectively select strains using the characteristic of colony color change by the acid produced by lactic acid bacteria, bromophenol-blue was added to the existing MRS medium, and cycloheximide was used to suppress fungi. Added. Culture conditions were anaerobic culture for 48 hours at 30 ℃, the white colony with a dark blue circle was considered to be Lactobacillus plantarum candidate strain and purely isolated culture.
(2)(2) 락토바실러스Lactobacillus 플란타룸Planta Room 동정 Sympathy
락토바실러스 플란타룸에 특이적인 프라이머는 나오키 카토 박사의 논문(Naoki Kato, 2000, Rapid identification of 11 human intestinal Lactobacillus species by multiplex PCR assays using group- and species-specific primers derived from the 16S 23S rRNA intergenic spacer region and its flanking 23S rRNA)을 참조하여 디자인된 LplanF(5'-ATTCATAGTCTAGTTGGAGGT-3'), LplanR(5'- CCTGAACTGAGAGAATTTGA-3')을 이용하였으며, 증폭사이즈는 248bp이고, 95℃에서 3분간 프리-디네튜어레이션(pre-denaturation), 95℃에서 30초간, 60℃에서 30초간, 72℃에서 30초간 진행하는 것을 1사이클로 하여, 30사이클을 진행하고, 최종 신장을 위하여 72℃에서 5분간 PCR을 수행한 후, 전기영동하여 PCR 결과를 확인하였다 (도 1). 도 1은 김치로부터 분리한 균주들의 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) specific PCR을 수행한 결과이다. 실험 결과, 36종의 균주에서 248bp의 밴드가 형성되었고, 16S rRNA 서열 분석 결과 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)으로 동정되었다. 이렇게 분리한 균주를 SPC-SNU 72-2이라 명명하였고, 한국생명공학연구원에 기탁하여 2017년 8월 24일자로 기탁번호 'KCTC13315BP'을 부여받았다. Primers specific for Lactobacillus plantarum can be found in Dr. Naoki Kato, 2000, Rapid identification of 11 human intestinal Lactobacillus species by multiplex PCR assays using group- and species-specific primers derived from the 16S 23S rRNA intergenic spacer region. LplanF (5'-ATTCATAGTCTAGTTGGAGGT-3 ') and LplanR (5'- CCTGAACTGAGAGAATTATTGA-3') designed with reference to its flanking 23S rRNA) were used and the amplification size was 248 bp, pre-dine at 95 ° C for 3 minutes. 30 cycles of pre-denaturation, 30 seconds at 95 ° C., 30 seconds at 60 ° C., and 30 seconds at 72 ° C., followed by 30 cycles, and PCR was performed at 72 ° C. for 5 minutes for final elongation. After the electrophoresis, the PCR result was confirmed (FIG. 1). Figure 1 shows the results of performing the Lactobacillus plantarum specific PCR of the strains isolated from kimchi. As a result, bands of 248 bp were formed in 36 strains, and 16S rRNA sequencing was identified as Lactobacillus plantarum . The isolated strain was named SPC-SNU 72-2, and was deposited with the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology and received the accession number 'KCTC13315BP' on August 24, 2017.
(3)(3) 락토바실러스Lactobacillus 플란타룸의Plantarum 생화학적 특성 Biochemical properties
상기에서 분리한 분리균주(SPC-SNU 72-2), 공시균주(KACC11451), 상업균주(Lallemand L73)의 당 이용 특성을 API50CH와 API 50CHL 키트(Biomerieux사)를 이용하여 분석하였고, 하기 표 1에 나타내었다. 실험 결과, 분리균주(SPC-SNU 72-2)는 공시균주 및 상업균주와 비교할 때, 엘-아라비노스(L-arabinose) 및 디-튜라노스(D-turanose)대사에서 차이를 보이는 신규균주로 판명되었다.The sugar use characteristics of the isolated strain (SPC-SNU 72-2), the strain (KACC11451), and the commercial strain (Lallemand L73) were analyzed using API50CH and API 50CHL kit (Biomerieux). Shown in As a result, the isolated strain (SPC-SNU 72-2) is a new strain showing difference in L-arabinose and D-turanose metabolism when compared to the public strain and the commercial strain. It turned out.
LallemandLallemand
L73 L73
<< 실험예Experimental Example 1: One: 본 발명 The present invention 프로바이오틱Probiotic 유산균의 인체 장내 안전성 분석> Human Intestinal Safety Analysis of Lactic Acid Bacteria>
(1)(One) 바이오제닉아민Biogenic amine 생성능Generating ability 확인 Confirm
바이오제닉 아민(Biogenic amines)은 발효식품에서 미생물에 의해 생성되며 식중독을 유발하는데, 이에 대한 안전성을 검증하기 위해 엠마누엘 코튼(Emmanuel Coton)의 논문(Multiplex PCR for colony direct detection of Gram-positive histamine- and tyramine-producing bacteria)을 참고하여, HDC3 (5'-GATGGTATTGTTTCKTATGA-3') and HDC4 (5'-CAAACACCAGCATCTTC-3'), TD2 (5'-ACATAGTCAACCATRTTGAA-3') and TD5 (5'-CAAATGGAAGAAGAAGTAGG-3')을 사용하였고, 각각 증폭사이즈는 1182bp, 436bp이며, 95℃에서 3분간 프리-디네튜어레이션(pre-denaturation), 95℃에서 30초간, 52℃에서 30초간, 72℃에서 90초간 진행하는 것을 1 사이클로 하여, 30 사이클을 진행하고, 최종 신장을 위하여 72℃에서 5분간 multiplex PCR을 수행한 후, 전기영동하여 PCR 결과를 확인하였다 (도 2). 도 2는 본 발명 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) SPC-SNU 72-2 및 공시균주 2종에 대해 바이오제닉아민 생성능이 있는지 확인한 결과이다. 실험 결과, 분리한 락토바실러스 플란타룸 SPC-SNU 72-2의 경우 바이오제닉 아민에 속하는 2종(tyramine, histamine)을 생성하는 유전자를 갖고 있지 않는 것으로 확인되었다.Biogenic amines are produced by microorganisms in fermented foods and induce food poisoning.To verify their safety, Multiplex PCR for colony direct detection of Gram-positive histamine- and tycamine-producing bacteria), HDC3 (5'-GATGGTATTGTTTCKTATGA-3 ') and HDC4 (5'-CAAACACCAGCATCTTC-3'), TD2 (5'-ACATAGTCAACCATRTTGAA-3 ') and TD5 (5'-CAAATGGAAGAAGAAGTAGG-3 '), And the amplification size is 1182bp, 436bp, respectively, pre-denaturation for 3 minutes at 95 ℃, 30 seconds at 95 ℃, 30 seconds at 52 ℃, 90 seconds at 72 ℃ 1 cycle, 30 cycles, multiplex PCR for 5 minutes at 72 ℃ for final elongation, electrophoresis was confirmed by the PCR results (Fig. 2). Figure 2 shows the results of confirming that the present invention Lactobacillus plantarum ( Lactobacillus plantarum ) SPC-SNU 72-2 and biogenic amine production ability for two strains. As a result, it was confirmed that the isolated Lactobacillus plantarum SPC-SNU 72-2 does not have a gene for generating two kinds (tyramine, histamine) belonging to the biogenic amine.
(2)(2) 용혈현상측정Hemolysis
유산균은 일반적으로 안전하다고 알려졌으나, 병원성이 있는 유산균이 보고되고 있어 신규 유산균들에 대한 안전성 검증이 요구되고 있다. 안전성을 검증하기 위해 한국바이오벤처협회 단체표준(유산균의 용혈 현상 측정 방법)을 참고하여 5% 면양혈액을 첨가한 TSA(Tryptic Soy Agar) 또는 BHI(Brain Heart Infusion) 배지에 측정대상 유산균을 접종하여, 30℃에서 48시간 배양한 후 배지 상에 나타나는 용혈현상을 확인하였다 (도 3). 도 3은 본 발명 락토바실러스 플란타룸 SPC-SNU 72-2 및 공시균주(Lb. reuteri KCCM40717)의 용혈현상을 측정한 결과이다.Lactic acid bacteria are generally known to be safe, but pathogenic lactic acid bacteria have been reported, so the safety verification of new lactic acid bacteria is required. To verify the safety, refer to the Korea Bio Venture Association's group standard (Method for measuring hemolysis of lactobacillus) and inoculate the Lactobacillus to be measured on TSA (Tryptic Soy Agar) or BHI (Brain Heart Infusion) medium containing 5% cotton blood , Hemolysis phenomenon appeared on the medium after incubation at 30 ℃ for 48 hours (Fig. 3). Figure 3 is the result of measuring the hemolysis of the Lactobacillus plantarum SPC-SNU 72-2 and the test strain ( Lb. reuteri KCCM40717) of the present invention.
실험 결과, 락토바실러스 플란타룸 SPC-SNU 72-2 및 공시균주(Lb. reuteri KCCM40717) 모두에서 용혈현상이 나타나지 않았고, 배지의 색깔 변화도 없어 비병원성인 γ용혈(무색)로 판단되었다.As a result, hemolysis was not observed in both Lactobacillus plantarum SPC-SNU 72-2 and the strain ( Lb. reuteri KCCM40717), and there was no change in the color of the medium.
<< 실험예Experimental Example 2: 2: 본 발명 The present invention 프로바이오틱Probiotic 유산균의 인체 장내 안정성 분석> Human Intestinal Stability Analysis of Lactic Acid Bacteria>
(1)(One) 내산성Acid resistance ·· 내담즙성Bile resistance 평가 evaluation
가)end) 위산·담즙 재현을 위한 버퍼 제조 Buffer preparation for gastric and bile reproduction
유산균이 장내로 도달하기 전 위산과 담즙산에 의해 많은 수의 유산균이 사멸되는 점을 고려하여, 기능성 연구에 앞서 유산균의 장내 생존력을 관찰하고자 하였다. 장내 pH를 맞추기 위해 먼저, PBS 버퍼(1ℓ 기준, Sodium chloride 8g, Potassium chloride 0.2g, Sodium phosphate 1.44g, Potassium phosphate 0.24g, pH7.4)를 제조하여 오토클레이브(autoclave) 후, HCL을 첨가하여 위산 (pH 2.0~3.0) 환경을 만들고, 담즙염(bile salt)을 첨가하여 담즙산(0.3-0.4%) 환경을 만들어 하기 실험에 사용하였다.In view of the fact that a large number of lactic acid bacteria are killed by gastric acid and bile acids before the lactic acid bacteria enter the intestine, the intestinal viability of the lactic acid bacteria was examined prior to the functional studies. To adjust the intestinal pH, first, PBS buffer (based on 1 L, Sodium chloride 8g, Potassium chloride 0.2g, Sodium phosphate 1.44g, Potassium phosphate 0.24g, pH7.4) was prepared and autoclave, and then HCL was added. Gastric acid (pH 2.0 ~ 3.0) environment was made, bile salt (bile salt) was added to create a bile acid (0.3-0.4%) environment was used in the following experiment.
나)I) 내산성Acid resistance ·· 내담즙성Bile resistance 측정 Measure
본 실험에 앞서 균주를 2회 활성화(activation)하여 1.5㎖ 튜브에 1㎖를 담아 12,000 rpm, 4℃에서 5분간 원심 분리하였다. 상층액을 제거하여 균체를 회수한 후, 0.85% NaCl로 2회 세척하여 남아있는 배지를 제거하였다. pH 2.0과 3.0의 PBS 버퍼용액 및 0.3%와 0.4% 담즙염 용액을 각각 초기 배양액(1㎖)과 동량 첨가하여 재부유하였다. 음식물이 유입되어 위를 통과하는 시간이 2~4시간임을 고려하여 0, 90, 180분으로 반응시간을 설정해 시간별로 100㎕씩 샘플링하였다. 샘플링 용액(100㎕)은 900㎕의 버퍼로 pH를 회복한 뒤, 샘플로 사용하였다. 0.85% NaCl로 단계별로 희석하여 4등분 한 MRS 배지에 20㎕씩 스프레딩(spreading)하고, 24시간 후, 세포 계수(cell counting)하여 Log CFU/㎖값을 구하였다.Prior to this experiment, the strains were activated twice and placed in 1 ml in a 1.5 ml tube and centrifuged at 12,000 rpm and 4 ° C. for 5 minutes. The supernatant was removed to recover the cells, and then washed twice with 0.85% NaCl to remove the remaining medium. PBS buffer solutions at pH 2.0 and 3.0 and 0.3% and 0.4% bile salt solutions were resuspended in the same amount as the initial culture (1 ml), respectively. Considering that food is introduced and passing through the stomach is 2 to 4 hours, the reaction time was set to 0, 90, and 180 minutes, and sampled by 100 μl for each hour. The sampling solution (100 μl) was used as a sample after the pH was restored to 900 μl of buffer. Diluted with 0.85% NaCl step by step, spread 20µl each in quartered MRS medium, and after 24 hours, the cell count (cell counting) to obtain the Log CFU / ㎖ value.
락토바실러스 플란타룸 SPC-SNU 72-2(Lb. plantarum SPC-SNU 72-2)를 각각 pH 2, 3 버퍼용액에 0, 90, 180분간 반응시킨 후 생균수를 측정한 결과, pH 2.0에서는 반응시간별 균수가 대폭 감소하는 경향을 보였다. 반면에, pH 3.0에서는 균수에 큰 변화가 없고, 90% 이상 생존력을 나타냈었다. 이러한 결과에 따라 락토바실러스 플란타룸 SPC-SNU 72-2는 대조구로 사용한 LGG (Lb. rhamnosus GG)균주보다 높은 생존율을 보여, 강한 산의 환경에서도 내성을 가짐을 확인할 수 있었다 (도 4). 도 4는 본 발명 락토바실러스 플란타룸 SPC-SNU 72-2의 pH에 따른 산 내성을 비교한 결과이다.The Lactobacillus plantarum SPC-SNU 72-2 ( Lb. plantarum SPC-SNU 72-2) was reacted with
한편, 락토바실러스 플란타룸 SPC-SNU 72-2를 각각 담즙염 0.3%, 0.4% 용액에 0, 90, 180분간 반응시킨 후 생균수를 측정한 결과, 두 농도의 담즙에서 모두 90분 반응시 균수가 감소하였으나, 그 후에 변화없이 유지되었다. 이러한 결과에 따라, 락토바실러스 플란타룸 SPC-SNU 72-2는 대조구로 사용한 LGG균주보다 높은 생존율을 보여 담즙의 환경에서도 내성을 가짐을 확인할 수 있었다 (도 5). 도 5는 본 발명 락토바실러스 플란타룸 SPC-SNU 72-2의 담즙 농도에 따른 유산균의 담즙내성을 비교한 결과이다.Meanwhile, Lactobacillus plantarum SPC-SNU 72-2 was reacted with 0.3% and 0.4% bile salts for 0, 90 and 180 minutes, respectively, and the number of viable cells was measured. The bacterial counts decreased, but then remained unchanged. According to these results, Lactobacillus plantarum SPC-SNU 72-2 showed a higher survival rate than the LGG strain used as a control it was confirmed that the resistance in the environment of bile (Fig. 5). 5 is a result of comparing the bile resistance of lactic acid bacteria according to the bile concentration of the present invention Lactobacillus plantarum SPC-SNU 72-2.
(2)(2) 장내 정착성Intestinal fixability
폴리스틸렌 막(polystylene membrane)은, 막 상에서 세포를 배양하면 자동적으로 분화하여 사람의 소장 상피세포와 형태학적, 생화학적으로 유사해짐으로써, 소장관 흡수 연구에 많이 이용되는 모델로, 인간 대장암에서 유래한 세포주인 Caco-2 세포를 사용하여 락토바실러스 플란타룸 SPC-SNU 72-2의 장관 내 부착능을 측정하였다 (도 6). 도 6은 대장 상피세포인 Caco-2 세포를 이용해 장내 부착능을 평가한 결과이다. Polystylene membrane is a model widely used in small intestine absorption studies because it automatically differentiates when cells are cultured on the membrane and becomes morphologically and biochemically similar to human small intestinal epithelial cells. Intestinal adhesion of Lactobacillus plantarum SPC-SNU 72-2 was measured using one cell line, Caco-2 cells (FIG. 6). 6 is a result of evaluating intestinal adhesion capacity using Caco-2 cells, which are colonic epithelial cells.
대장 상피세포인 Caco-2 세포를 이용하여 장내 락토바실러스 플란타룸 SPC-SNU 72-2 균주의 정착능을 평가한 결과, Caco-2 100개의 세포 당 약 800개가 부착되는 것을 관찰하였다. 결과적으로, 락토바실러스 플란타룸 SPC-SNU 72-2 균주가 대조군으로 사용한 LGG (Lb. rhamnosus GG)보다 대장 상피세포에서 높은 부착능을 보여, 장내 정착능이 매우 우수한 것으로 확인되었다.As a result of evaluating the fixation ability of the intestinal Lactobacillus plantarum SPC-SNU 72-2 strain using Caco-2 cells, which are colonic epithelial cells, it was observed that about 800 cells were attached per 100 cells of Caco-2. As a result, Lactobacillus plantarum SPC-SNU 72-2 strain showed higher adhesion in colon epithelial cells than LGG ( Lb. rhamnosus GG) used as a control, it was confirmed that the intestinal fixation ability is very excellent.
<< 실험예Experimental Example 3: 3: 건강기능성 분석>Health Functional Analysis>
(1)(One) 면역체계 강화 Immune system
가)end) 대식세포 분리 및 배양Macrophage Isolation and Culture
Balb/c 7주령 마우스 복강에 3.5% 타이오글리콜레이트 배지(Thioglycollate media; BD, Sparks, MD, USA) 2㎖를 주사하고 나서 4일 후에 마우스를 경추탈골한 후, 1% FBS(fetal bovine serum: Hyclone, Utah, USA), 1% 페니실린-스트렙토마이신(p/s)이 함유된 DMEM (Hyclone) 8㎖을 주입하여 대식세포를 수집하였다. 1000 rpm에 10분간 원심분리 후 대식세포를 DMEM 10% FBS, 1% p/s이 함유된 배지로 부유한 후, 세포수를 CountessⅡFL Automated Cell Counter (Life Technologies)를 이용하여 측정하였다. 실험에 필요한 대식세포는 37℃, 5% CO2조건의 인큐베이터에 overnight 배양하였다. 바닥에 붙지 않은 대식세포는 제거하고 각 균을 농도별로 24시간 동안 처리한 후 상등액의 배지를 회수하였다.Balb / c 7-week-old mouse intraperitoneally injected with 2 ml of 3.5% thioglycollate media (BD, Sparks, MD, USA) 4 days after the cervical distal bone, 1% FBS (fetal bovine serum) : Hyclone, Utah, USA), 8 ml of DMEM (Hyclone) containing 1% penicillin-streptomycin (p / s) was injected to collect macrophages. After centrifugation at 1000 rpm for 10 minutes, macrophages were suspended in a medium containing 10% FBS, 1% p / s of DMEM, and the number of cells was measured using a Countess IIFL Automated Cell Counter (Life Technologies). Macrophages required for the experiment was incubated overnight in an incubator at 37 ℃, 5% CO 2 conditions. Macrophages that did not adhere to the bottom were removed and each cell was treated for 24 hours by concentration, and then the supernatant was recovered.
나)I) 유산균 배양 및 사균체 제조Lactic Acid Bacteria Cultivation
유산균은 MRS broth 배지에 접종하여 최적온도인 30℃ 또는 37℃ 조건하에서 24시간 동안 shaking 배양하였다. 원심분리를 통해 상등액을 제거하고 0.85% NaCl로 2~3회 세척 후 pellet만을 모았다. 이를 항온수조(water bath)를 사용하여 100℃ 조건으로 5분간 열처리하여 사균화 한 후 동결건조를 진행하였다. 만들어진 동결건조체를 실험 농도별로 희석하여 시료로 사용하였다. Lactobacillus was inoculated in MRS broth medium and shaken for 24 hours under the optimum temperature of 30 ℃ or 37 ℃ conditions. The supernatant was removed by centrifugation and washed only 2-3 times with 0.85% NaCl to collect only pellets. This was quenched by heat treatment at 100 ° C. for 5 minutes using a water bath and then lyophilized. The lyophilisate produced was diluted by experimental concentration and used as a sample.
다)All) 사이토카인 측정Cytokine measurement
사이토카인 함량은 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) 방법을 이용하여 측정하였다. TNF-α, IL-6 Duoset (R&D Systems, USA), 1L-12 OptEIA set(BD, USA)을 사용하였으며 제조사의 프로토콜을 따라 ELISA를 수행하였다.Cytokine content was measured using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method. TNF-α, IL-6 Duoset (R & D Systems, USA) and 1L-12 OptEIA set (BD, USA) were used and ELISA was performed according to the manufacturer's protocol.
①① TNFTNF -α, IL-6 -α, IL-6 DuosetDuoset (R&D Systems, USA) (R & D Systems, USA)
96웰 이뮤노플레이트(immunoplate)에 각각의 포획 항체(capture antibody)를 PBS에 희석하여 0.1㎖씩 분주한 후, 상온에서 overnight 반응하였다. 세척버퍼 (0.5% Tween/PBS)로 각 웰을 3번 세척한 후, 블록킹 버퍼 (blocking buffer; 1% BSA in PBS) 0.3㎖를 각 웰에 넣고 1시간 동안 반응하였다. 이후, 각 웰을 세척 버퍼로 3번 세척하고, 스탠다드(standard)와 샘플(sample)을 희석하여 0.1㎖씩 분주한 후에 2시간 동안 반응시켰다. 그 후, 세척 버퍼로 각 웰을 세척한 후 블록킹 버퍼에 바이오틴(biotin)이 결합된 2차 항체를 희석하여 각 웰 당 0.1㎖씩 분주하고 2시간 동안 상온에서 반응하였다. 이후, 세척 버퍼로 웰을 3번 세척한 후, 블록킹 버퍼에 Streptavidin-HRP 용액을 희석하여 0.1㎖씩 분주하고, 상온에서 20분간 반응시켰다. 그 후, 각 웰을 세척 버퍼로 세척한 후, TMB(BD pharmingen) 용액을 웰당 0.1㎖씩 처리한 뒤, 상온에서 30분간 반응시키고, 2N H2SO4 용액을 0.05㎖씩 각 웰에 첨가하여 완료하였다. 96웰 microplate reader를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. Each capture antibody was diluted in PBS and dispensed by 0.1 ml in 96-well immunoplate, and then reacted overnight at room temperature. After washing each well three times with a washing buffer (0.5% Tween / PBS), 0.3 ml of blocking buffer (1% BSA in PBS) was added to each well and reacted for 1 hour. Thereafter, each well was washed three times with a wash buffer, and the standard and the sample were diluted and dispensed 0.1 ml each, followed by reaction for 2 hours. Thereafter, each well was washed with a washing buffer, followed by diluting a secondary antibody conjugated with biotin in a blocking buffer, dispensing 0.1 ml of each well, and reacting at room temperature for 2 hours. Thereafter, the wells were washed three times with a washing buffer, and then diluted 0.1 ml of the Streptavidin-HRP solution in the blocking buffer, followed by reaction at room temperature for 20 minutes. Thereafter, each well was washed with a washing buffer, and then treated with 0.1 ml of TMB (BD pharmingen) solution per well, followed by reaction at room temperature for 30 minutes, and 2N H 2 SO 4 solution was added to each well by 0.05 ml. Completed. Absorbance was measured at 450 nm using a 96 well microplate reader.
② IL-12 ② IL-12 OptEIAOptEIA set ( set ( BDBD , USA), USA)
96웰 이뮤노플레이드(immunoplate)에 각각의 포획 항체(capture antibody)를 PBS에 희석하여 0.1㎖씩 분주한 후, 냉장에서 overnight 반응하였다. 세척 버퍼 (0.5% Tween/PBS)로 각 웰을 3번 세척한 후 블록킹 버퍼(10% FBS, Welgene, Korea) 0.2㎖를 각 웰에 넣고 1시간 동안 반응하였다. 각 웰을 세척 버퍼로 3번 세척하고, 스탠다드(standard)와 샘플(sample)을 희석하여 0.1㎖씩 분주한 후 2시간 반응시켰다. 세척 버퍼로 각 웰을 세척한 후 블록킹 버퍼에 바이오틴(biotin)이 결합된 2차 항체와 Streptavidin-HRP 용액을 희석하여 0.1㎖씩 분주하고, 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 각 웰을 세척 버퍼로 세척한 TMB(BD pharmingen) 용액을 웰당 0.1㎖씩 처리한 후, 상온에서 30분간 반응시키고 2N H2SO4 용액을 0.05㎖씩 각 웰에 첨가하여 반응을 완료하였다. 96 well microplate reader를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.Each capture antibody was diluted in PBS and dispensed by 0.1 ml in 96-well immunoplate, and then reacted overnight in refrigeration. After washing each well three times with washing buffer (0.5% Tween / PBS), 0.2 ml of blocking buffer (10% FBS, Welgene, Korea) was added to each well and reacted for 1 hour. Each well was washed three times with a wash buffer, and the standard and samples were diluted and dispensed by 0.1 ml, followed by reaction for 2 hours. After washing each well with a washing buffer, diluting the biotin-bound secondary antibody and Streptavidin-HRP solution in the blocking buffer and dispensing 0.1 ml each, and reacting for 1 hour at room temperature. Each well was treated with 0.1 ml / well TMB (BD pharmingen) solution washed with washing buffer, and then reacted at room temperature for 30 minutes, and 2N H 2 SO 4 solution was added to each well by 0.05 ml to complete the reaction. Absorbance was measured at 450 nm using a 96 well microplate reader.
샘플이 면역세포의 일종인 대식세포의 PAMP(pathogen-associated molecular pattern)를 자극하여 면역 관련 사이토카인의 분비를 유도하는지 확인한 결과, 락토바실러스 플란타룸 SPC-SNU 72-2균주의 TNF-α, IL-6의 분비는 균의 농도에 따라 증가하는 경향이 나타났으나, IL-12는 다른 사이토카인과 달리 최고 농도인 100㎍/㎖보다 4-20㎍/㎖의 균을 처리하였을 때, 유도능이 더욱 높게 나타나는 경향을 보였다. 결과적으로 체외(in vitro) 조건에서 세 가지의 사이토카인 (TNF-α, IL-6, IL-12) 유도능 측정 결과, 락토바실러스 플란타룸 SPC-SNU 72-2는 대조구로 사용한 LGG보다 높은 사이토카인 유도능이 확인되어 면역조절 활성을 낼 것으로 판단된다. 이를 하기 표 2 내지 4에 나타내었다.As a result of confirming that the sample stimulates the pathogen-associated molecular pattern (PAMP) of macrophages, which are a kind of immune cells, to induce the secretion of immune-related cytokines, TNF-α, Lactobacillus plantarum SPC-SNU 72-2 strain, The secretion of IL-6 tended to increase with the concentration of bacteria, but unlike other cytokines, IL-12 was induced when 4-20 µg / ml bacteria were treated than the highest concentration of 100 µg / ml. The ability tended to be higher. As a result, three cytokine (TNF-α, IL-6, IL-12) inducing ability measurement in vitro conditions, Lactobacillus plantarum SPC-SNU 72-2 was higher than the control LGG The cytokine inducing ability has been confirmed, and is expected to produce immunomodulatory activity. This is shown in Tables 2 to 4 below.
((
μgμg
/ml)/ ml)
((
μgμg
/ml)/ ml)
((
μgμg
/ml)/ ml)
<< 실험예Experimental Example 4: 제빵적성 평가> 4: Bakery Aptitude Evaluation>
(1)(One) 락토바실러스Lactobacillus 플란타룸의Plantarum 말토오스 maltose 이용능Utilization 확인 Confirm
가)end) 생장곡선(growth curve)Growth curve
하기 표 5와 같은 조성을 가지는 2% 말토오스 함유 MRS 배지(broth medium)를 만든 후 72-2 분리균주, 공시균주(KACC11451), 상업균주(Lallemand L73)를 각각 10%(w/v)씩 접종하고 10시간 배양한 후, 600nm에서 흡광도를 측정하여 생장 곡선(growth curve)을 작성하였다 (도 7). 도 7은 말토오스 배지에서 본 발명 락토바실러스 플란타룸 SPC-SNU 72-2의 배양학적 특성을 나타낸 결과이다. 실험 결과, 72-2 분리균주가 공시균주 및 상업균주보다 말토오스(maltose) 배지에서의 생육 속도가 빠름을 확인할 수 있었다.To make a 2% maltose-containing MRS medium (broth medium) having the composition shown in Table 5, and then inoculated by 10% (w / v) 72-2 isolated strain, test strain (KACC11451), commercial strain (Lallemand L73), respectively After incubation for 10 hours, the absorbance was measured at 600 nm to generate a growth curve (FIG. 7). Figure 7 is a result showing the culture characteristics of the present invention Lactobacillus plantarum SPC-SNU 72-2 in maltose medium. As a result, it was confirmed that the 72-2 isolate strain was faster in the maltose medium than the test strain and the commercial strain.
나)I) 잔당분석(maltose)Maltose Analysis
말토오스 함유 MRS 배지에 72-2 분리균주, 공시균주(KACC11451), 상업균주(Lallemand L73)를 각각 10%씩 접종하고 10시간 배양한 후, 2시간 간격으로 시료를 채취하여 상등액을 잔당(maltose)분석에 이용하였다. 당분석은 HPLC(SHISEIDO NANOSPACE S1-2)를 이용하여 수행하였다. HPLC 조건으로는 이동상은 80% ACN을 유속 1㎖/min으로 흘려주었고, 35℃로 가열된 당분석용 컬럼(Waters carbohydrate High performance 4㎛)과 RI detector를 이용하였다 (도 8). 도 8은 본 발명 락토바실러스 플란타룸 SPC-SNU 72-2의 말토오스 이용능을 확인한 결과이다. 실험 결과, 72-2 분리균주가 공시균주 및 상업균주보다 말토오스 이용능이 우수함을 확인할 수 있었다.Inoculate 72% isolated strain, strain (KACC11451) and commercial strain (Lallemand L73) in maltose-containing MRS medium at 10% each and incubated for 10 hours. Used for analysis. Sugar analysis was performed using HPLC (SHISEIDO NANOSPACE S1-2). As HPLC conditions, the mobile phase flowed 80% ACN at a flow rate of 1 ml / min, and a sugar analysis column heated at 35 ° C. (Waters carbohydrate
(2)(2) 락토바실러스Lactobacillus 플란타룸Planta Room (Lactobacillus (Lactobacillus plantarumplantarum )의 제빵적용 Baking application of
본 실험에서는 김치에서 분리한 락토바실러스 플란타룸과 공시균주(KACC11451), 상업균주(Lallemand L73)를 각각 제빵에 적용하고, 그 특성을 확인하고자 하였다.In this experiment, Lactobacillus plantarum, test strain (KACC11451), and commercial strain (Lallemand L73) isolated from kimchi were applied to baking, and their characteristics were examined.
가)end) 유산균 발효 반죽의 제조 및 분석Preparation and Analysis of Lactic Acid Bacteria Fermented Dough
강력분 100g, 유산균수 2x1010 cfu/g, 가열냉각수 100g을 혼합한 후, 30℃의 발효기에서 발효시켜 유산균 발효 반죽을 제조하되, 반죽의 pH가 pH 4.0±0.2에 도달하였을 때, 냉각한 후 유산균 발효 반죽의 pH, TTA 및 균수를 측정하였다. 한편, 본 실험에서 사용한 유산균은 MRS 배지에서 30℃, 22±2시간 동안 배양한 후, 원심분리하여 균체회수 후, 균체를 생리식염수로 수회 세척 후 이용하였고, 최초 균 접종량은 반죽 1g당 1×108이 될 수 있도록 접종하였다.Lactic acid bacteria 100g, lactic acid bacteria number 2x10 10 cfu / g, heated cooling water 100g mixed and fermented in a fermenter at 30 ℃ to prepare a lactic acid bacteria fermented dough, when the pH of the dough reaches pH 4.0 ± 0.2, after cooling the lactic acid bacteria The pH, TTA and bacterial count of the fermented dough were measured. On the other hand, the lactic acid bacteria used in this experiment was incubated in MRS medium for 30 ℃, 22 ± 2 hours, centrifuged and recovered the cells, the cells were washed with physiological saline several times, the first inoculation amount was 1 × 1g per dough Inoculated to be 10 8 .
실험 결과는 하기 표 6에 나타내었다. 실험 결과, 분리균주, 공시균주를 적용한 반죽 모두 pH 4.0±0.2 도달까지 4시간이 소요됐으며, 냉각 후 균수 분석 결과 또한 비슷한 것으로 나타났다.The experimental results are shown in Table 6 below. As a result, it took 4 hours to reach pH 4.0 ± 0.2 for both the strains and the pastes applied with the strains.
(Lb. plantarum KCTC13315BP)
적용 반죽SPC-SNU 72-2
( Lb. plantarum KCTC13315BP)
Apply dough
Acetic acid 0.041%Lactic acid 0.32%
Acetic acid 0.041%
적용 반죽 Commercial strain (Lb. plantarum Lallemand l73)
Apply dough
Acetic acid 0.051%Lactic acid 0.35%
Acetic acid 0.051%
적용 반죽 Test strain (Lb. plantarum KACC 11451)
Apply dough
Acetic acid 0.076%Lactic acid 0.76%
Acetic acid 0.076%
나)I) 빵 제조Bread manufacturing
식빵 제조방법은 스펀지(Sponge)법에 의해 진행되었다.Bread manufacturing method was carried out by the sponge (Sponge) method.
①① 배합공정(중종) 및 1차 발효Compounding process (medium seed) and primary fermentation
하기 표 7에 제시한 바와 같은 성분을 믹서(제품명: SK101S MIXER : 일본)에 투입하고, 2단에서 2분, 3단에서 1분 동안 반죽하고, 반죽의 최종온도가 25℃가 되도록 혼합한 후, 27℃ 발효기에 넣어 4시간 동안 1차 발효시켰다.The ingredients as shown in Table 7 were added to a mixer (product name: SK101S MIXER: Japan), kneaded in two stages for two minutes and three stages for one minute, and mixed so that the final temperature of the dough was 25 ° C. In the fermentor, 27 ℃ primary fermentation for 4 hours.
((
KCTC13314BKCTC13314B
))
적용 빵Applied bread
Lb. Lb.
plantarumplantarum
Lallemand Lallemand
L73 L73
적용 빵Applied bread
Lb. Lb.
plantarumplantarum
((
KACCKACC
11451) 11451)
적용 빵Applied bread
SPC 70-1 Sac. cerevisiae
SPC 70-1
발효종Lactobacillus
Fermented species
②② 배합공정(Compounding process ( 본종Main species ) 및 2차 발효) And secondary fermentation
상기 표 7에 제시한 바와 같은 성분으로 1차 발효된 반죽물과 밀가루, 정백당, 정제염, 전지분유, 이스트, 정제수를 믹서에 투입하여 1단에서 1분간 반죽하고, 상기 중종 공정에서 제조된 발효물을 넣고 2단에서 3분 3단에서 2분간 혼합하였다. 다음으로, 버터를 첨가하고 2단에서 3분, 3단에서 3분간 반죽하여, 반죽 조성물의 최종 온도가 27℃가 되도록 하였다. 반죽을 성형한 이후 팬닝한 다음 38℃, 상대습도 85%에서 100분간 2차 발효를 하였다.The first fermented dough and flour, white sugar, refined salt, whole milk powder, yeast, purified water with the ingredients as shown in Table 7 and kneaded in the first stage for 1 minute, the fermented product prepared in the middle seed process The mixture was added in 2 stages and mixed for 3 minutes and 3 stages for 2 minutes. Next, butter was added and kneaded in two stages for three minutes and three stages for three minutes, so that the final temperature of the dough composition was 27 ° C. After molding, the pan was panned and then subjected to secondary fermentation for 100 minutes at 38 ° C. and a relative humidity of 85%.
③③ 소성 및 냉각공정Firing and Cooling Process
2차 발효공정을 거친 반죽을 윗불 210℃, 아랫불 250℃의 테크오븐에 37분간 구운 후, 빵틀에서 꺼내어 실온에서 내부온도가 32℃로 될 때까지 냉각하였다 (도 9). 도 9는 공시균주로 사용한 락토바실러스 플란타룸 KACC11451가 적용된 빵, 락토바실러스 플란타룸의 상업균주인 Lallemand L73이 적용된 빵, 본 발명 락토바실러스 플란타룸 SPC-SNU 72-2가 적용된 빵의 사진이다.The dough after the second fermentation process was baked for 37 minutes in a tech oven of 210 ° C. and 250 ° C. of a lower fire, and then taken out of a breadboard and cooled to an internal temperature of 32 ° C. at room temperature (FIG. 9). 9 is a bread to which the Lactobacillus plantarum KACC11451 is applied as a test strain, a bread to which Lallemand L73 is applied as a commercial strain of Lactobacillus plantarum, and a bread to which the present invention Lactobacillus plantarum SPC-SNU 72-2 is applied. to be.
(3)(3) 관능 평가 및 빵의 물성 측정Sensory evaluation and measurement of bread properties
가)end) 빵의 물성 측정Measurement of the physical properties of bread
대조구(상업적 이스트만 적용된 빵), 분리균주가 적용된 빵, 상업균주(Lallemand L73)가 적용된 빵, 공시균주(Lb. plantarum KACC11451)가 적용된 빵의 물성(pH, 총 적정산도, 색도)을 측정하고자 하였다. pH 측정은 250㎖ 비이커에 증류수 100㎖, 시료 15g을 넣고 균질화한 후, pH 미터(pH meter)로 측정하였다. 총적정 산도(total titrable acid; TTA)는 0.1 N NaOH 용액으로 적정하여 pH 6.6과 pH 8.5에 이를 때까지의 NaOH 용액 소비량(㎖)으로 정의하였다. 색도 측정은 빵을 약 20㎜ 두께로 잘라낸 시료를 색도계 (CR-400, KONIKA MINOLTA사)를 이용하여 측정하였고, 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다. 실험 결과, 대조구와 유산균 첨가구의 빵의 물성은 전반적으로 유사한 것을 확인할 수 있었다.We tried to measure the physical properties (pH, total titratable acidity, chromaticity) of control (bread with commercial yeast only), bread with separate strain, bread with commercial strain (Lallemand L73), and bread with public strain (Lb. plantarum KACC11451). . The pH was measured by homogenizing 100 ml of distilled water and 15 g of a sample in a 250 ml beaker, followed by homogenization. Total titrable acid (TTA) was defined as the amount of NaOH solution consumed (ml) until titrated with 0.1 N NaOH solution to pH 6.6 and pH 8.5. Color measurement was measured by using a colorimeter (CR-400, KONIKA MINOLTA Co., Ltd.) of the bread cut to a thickness of about 20 mm, the results are shown in Table 8 below. As a result, the physical properties of the bread of the control and the addition of lactic acid bacteria were confirmed to be generally similar.
SPC-SNU 72-2SPC-SNU 72-2
적용 빵Applied bread
적용 빵Applied bread
Lb.plantarum (KACC11451)Lb.plantarum (KACC11451)
적용 빵Applied bread
Acetic acid 0.037%Lactic acid 0.015%
Acetic acid 0.037%
Acetic acid 0.040%Lactic acid 0.150%
Acetic acid 0.040%
Acetic acid 0.043%Lactic acid 0.152%
Acetic acid 0.043%
Acetic acid 0.040%Lactic acid 0.154%
Acetic acid 0.040%
color valuesHunter lab
color values
* 1:매우 나쁨, 9:매우 우수* 1: Very bad, 9: Very good
나)I) 반죽의 가스 Gas of dough 발생력Generating force 확인 Confirm
대조구(상업적 이스트만 적용된 본종), 상업균주(Lallemand L73)가 적용된 본종, 공시균주(KACC11451)가 적용된 본종, 분리균주가 적용된 본종의 가스 발생력을 비교하고자 하였다. 가스발생력 측정은 배합공정(본종)의 반죽조성물을 25g을 취하여 가스발생력측정기(Fermometer)를 통해 30℃ 온도조건에서 10시간의 측정값을 기재하였다 (도 10). 도 10은 본 발명 락토바실러스 플란타룸 SPC-SNU 72-2, 상업균주인 Lallemand L73, 공시균주로 사용한 락토바실러스 플란타룸 KACC11451가 각각 적용된 본종의 가스 발생력을 확인한 결과이다. 실험 결과, 대조구와 유산균 첨가구의 가스발생력은 전반적으로 유사하나 유산균 첨가구의 초기 가스발생력이 다소 높음을 확인할 수 있었다.This study was designed to compare the gas generating powers of the control group (primary strains with commercial yeast), the strains with commercial strain (Lallemand L73), the strains with strain (KACC11451), and the strains with separate strain. Gas generation force measurement was measured 25g of the dough composition of the mixing process (main species) and measured for 10 hours at 30 ℃ temperature conditions through a gas generator (Fermometer) (Fig. 10). 10 is a result of confirming the gas generating force of the present species to which the present invention Lactobacillus plantarum SPC-SNU 72-2, commercial strain Lallemand L73, the lactobacillus plantarum KACC11451 used as the test strain. As a result, the gas generating powers of the control and the addition of lactic acid bacteria were generally similar, but the initial gas generating power of the lactic acid bacteria added group was found to be rather high.
다)All) 빵의 노화도 측정Determination of Aging in Bread
상기와 같이 제조된 빵 중 실험구와 대조구의 시간 변화에 따른 노화 속도를 측정하고자, 빵을 상온에서 3시간 동안 식힌 후 약 20mm 두께로 잘라낸 시료의 노화도(hardness)를 물성측정기(Texture analyser, Stable Micro Systems사)를 이용하여 측정하였으며, 경도에 대한 값은 하기 표 9에 나타내었다 (도 11). 도 11은 본 발명 락토바실러스 플란타룸 SPC-SNU 72-2가 적용된 빵의 노화 속도를 측정한 결과이다. 제품 보관에 따른 경도(Hardness) 비교 결과, 유산균을 사용한 경우 전반적으로 경도가 적어 부드러움이 우수한 것을 알 수가 있었으며, 전반적으로 대조구보다 노화속도는 느린 것을 확인할 수 있었다.In order to measure the aging rate according to the time change of the test and control of the bread prepared as described above, the hardness of the sample cut to about 20mm thickness after cooling the bread for 3 hours at room temperature (Texture analyser, Stable Micro Systems), and the values for hardness are shown in Table 9 below (FIG. 11). 11 is a result of measuring the aging rate of the bread to which the present invention Lactobacillus plantarum SPC-SNU 72-2 is applied. As a result of the hardness (Hardness) comparison according to the product storage, when the lactic acid bacteria were used, the overall hardness was low and the softness was excellent, and the overall aging rate was slower than the control.
발효종적용 Lb. plantarum (KACC 11451)
Fermented seed application
라)la) 유산균주Lactobacillus 적용 반죽 향기 성분 분석 Application dough fragrance ingredient analysis
대조구 대비 유산균 발효반죽을 이용한 제빵의 제조 시, 풍미 성분 발현을 비교하기 위하여, GC/MS 시스템을 이용하여 분석하였다. 시료 1g에 관한 분석을 수행하였고, GC/MS 분석 조건은 하기 표 10과 같았다. GC/MS 분석 후, 알코올(alcohol), 알데하이드(aldehyde), 케톤(ketone), 산(acid)류에 대한 전체적인 정량적 수치를 비교하고 (도 12), 하기 표 11에 대표적 향기 성분 19종에 대하여 각 성분의 상대적 비율을 백분율로 나타내었다. 도 12는 본 발명 락토바실러스 플란타룸 SPC-SNU 72-2가 적용된 빵 (시료) 1g당 검출된 휘발성 향기성분 (alcohol, aldehyde, ketone, acid 류 등)의 전체적인 정량적 수치를 비교한 결과이다.In the manufacture of bakery using lactic acid bacteria fermented dough compared to the control, in order to compare the expression of flavor components, it was analyzed using GC / MS system. Analysis of 1g of samples was performed, and GC / MS analysis conditions were as shown in Table 10 below. After GC / MS analysis, the overall quantitative values for alcohols, aldehydes, ketones, and acids were compared (FIG. 12), and in Table 11, for the 19 representative fragrance components, The relative proportions of each component are expressed as percentages. 12 is a result of comparing the quantitative value of the volatile aroma components (alcohol, aldehyde, ketone, acid, etc.) detected per 1g of bread (sample) to which the present invention Lactobacillus plantarum SPC-SNU 72-2 is applied.
실험 결과, Lallemand L73 대비 실험구에서 향기성분 함량 높게 나타났고, 분리균주는 알코올과 케톤류 함량이 높았다. 또한, Lallemand L73은 풋내를 일으키는 헥사날(hexanal)의 함량이 높았고, 향긋한 꽃향의 1-헵탄올(1-heptanol)의 함량은 72-2 분리균주에서 높게 나타났다.As a result, the content of aroma component was higher in the experimental group compared to Lallemand L73, and the isolates were higher in alcohol and ketones . In addition, Lallemand L73 had a high content of hexanal, which causes greening, and the content of aromatic flower flavored 1-heptanol was high in 72-2 isolates.
Inlet temperature : 230℃
Column : DB-WAX (60 m X 250 um X 0.25 uM)
Carrier gas : helium
Flow rate : 1 ㎖/min
Oven temperature program : from 40℃ (5 min) → 8℃/min → 230℃ (10min)
MS detector : Agilent 5975C MSD (EI mode)GC Model name: Agilent 7890A
Inlet temperature: 230 ℃
Column: DB-WAX (60 m
Carrier gas: helium
Flow rate: 1 ml / min
Oven temperature program: from 40 ℃ (5 min) → 8 ℃ / min → 230 ℃ (10min)
MS detector: Agilent 5975C MSD (EI mode)
Sample equilibration time
- incubation temp. 85℃
- incubation time 30 minFiber: DVB / Carboxen / PSME (Supelco Co.)
Sample equilibration time
incubation temp. 85 ℃
-incubation time 30 min
* 대표적 향기 성분 19종 [Alcohol (8종), Aldehyde (5종), Ketone (4종), Acid (1종), 기타 (1종)] 에 대해서 각 성분의 상대적 비율을 백분율로 나타냈다.* Relative proportions of each component were shown as percentages for 19 representative fragrance components [Alcohol (8), Aldehyde (5), Ketone (4), Acid (1), and others (1).
마) 관능 평가E) sensory evaluation
대조구(상업적 이스트만 적용된 빵), 분리균주가 적용된 빵, 상업균주(Lallemand L73)가 적용된 빵, 공시균주(Lb. plantarum KACC11451)가 적용된 빵의 관능 평가 결과, 유산균을 적용한 실험구에서는 대조구에 비해 부드러운 식감과 풍미면에서 우수한 평가를 받았다. 유산균을 첨가한 실험구에서의 비교평가에서는 큰 차이를 보이지는 않았지만 전반적인 평가에서는 분리균주 SPC-SNU 72-2를 적용한 빵이 가장 높은 평가를 받았다.Sensory evaluation of control (bread with commercial yeast only), bread with separate strain, bread with commercial strain (Lallemand L73), and bread with test strain ( Lb. plantarum KACC11451) showed that the experimental group with lactic acid bacteria was softer than the control. Excellent evaluation in terms of texture and flavor. The comparative evaluation in the experimental groups containing lactic acid bacteria did not show a big difference, but in the overall evaluation, the bread applied with the isolate strain SPC-SNU 72-2 received the highest rating.
기탁기관명 : 한국생명공학연구원Depositary: Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology
수탁번호 : KCTC13315BPAccession number: KCTC13315BP
수탁일자 : 2017824Trust Date: 2017824
Claims (3)
Lactobacillus plantarum SPC-SNU 72-2 (KCTC13315BP) exhibiting acid resistance even at pH 3.0.
Claim 1 Lactobacillus plantarum Lactobacillus plantarum SPC-SNU 72-2 (KCTC13315BP) The dough for baking, characterized in that prepared by adding to the flour and then fermented.
Claim 1 Lactobacillus plantarum ( Lactobacillus plantarum ) SPC-SNU 72-2 (KCTC13315BP) is added to flour, fermented, and then bread.
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KR1020180164288A KR102059624B1 (en) | 2018-12-18 | 2018-12-18 | Probiotic lactic acid bacteria with outstanding immune-modulatory activity, intestinal attachment ability, and baking quality |
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Date | Code | Title | Description |
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GRNT | Written decision to grant |