KR102052988B1 - Carbon-Dot-Based Ratiometric Fluorescence Glucose Biosensor - Google Patents

Carbon-Dot-Based Ratiometric Fluorescence Glucose Biosensor Download PDF

Info

Publication number
KR102052988B1
KR102052988B1 KR1020180094645A KR20180094645A KR102052988B1 KR 102052988 B1 KR102052988 B1 KR 102052988B1 KR 1020180094645 A KR1020180094645 A KR 1020180094645A KR 20180094645 A KR20180094645 A KR 20180094645A KR 102052988 B1 KR102052988 B1 KR 102052988B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
dye
fluorescent
glucose
carbon dot
glucose sensor
Prior art date
Application number
KR1020180094645A
Other languages
Korean (ko)
Inventor
박수영
조문진
Original Assignee
경북대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 경북대학교 산학협력단 filed Critical 경북대학교 산학협력단
Priority to KR1020180094645A priority Critical patent/KR102052988B1/en
Application granted granted Critical
Publication of KR102052988B1 publication Critical patent/KR102052988B1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/54—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving glucose or galactose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/03—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with a oxygen as acceptor (1.1.3)
    • C12Y101/03004—Glucose oxidase (1.1.3.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y111/00—Oxidoreductases acting on a peroxide as acceptor (1.11)
    • C12Y111/01—Peroxidases (1.11.1)
    • C12Y111/01007—Peroxidase (1.11.1.7), i.e. horseradish-peroxidase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/66—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood sugars, e.g. galactose

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

The present invention discloses a colorimetric fluorescent glucose sensor using a carbon dot and an organic dye and a method of manufacturing the same. A solid biosensor according to the present invention is a sensor having a characteristic that a fluorescent color changes in proportion to a glucose concentration. The fluorescent glucose sensor has a similar proportion of fluorescence color change, sensitivity and good selectivity as a solution state. The ratiometric biosensor visually increase the visibility of the glucose sensor compared to simple turn-on or turn-off modes. Thus, a convenient and effective method of detecting glucose enables a wide range of applications of carbon dots to biosensors.

Description

카본닷을 이용한 비색계 형광 글루코스 센서{Carbon-Dot-Based Ratiometric Fluorescence Glucose Biosensor}Carbon-Dot-Based Ratiometric Fluorescence Glucose Biosensor using Carbon Dots

본 발명은 카본닷을 이용한 비색계 형광 글루코스 센서에 관한 것으로 보다 상세하게는 글루코오스 농도에 반응하는 카본닷과 지시약을 필름에 고정화시킨 안정한 고체 바이오센서 필름에 관한 것이다. The present invention relates to a colorimetric fluorescent glucose sensor using carbon dots, and more particularly, to a stable solid biosensor film in which carbon dots and indicators reacting with glucose concentration are immobilized on a film.

당뇨병은 인슐린의 생성 혹은 이용 과정의 이상으로 혈당이 증가하고 그에 따른 다양한 급성, 만성 합병증을 동반하는 심각한 질환이다. 미국의 경우, 20 세 이상 인구의 9.6% (2000만 명 이상)가 당뇨를 가지고 있고, 발병 위험이 높은 당뇨 전단계(pre-diabetes) 환자가 5000만 명 이상으로 추정 된다(2005년 미국 national diabetes fact sheet). 2002년 직접, 간접적인 의료비용으로 1320억 달러가 당뇨와 관련되어 지출되었다.Diabetes is a serious disease with increased blood sugar due to abnormalities in the production or use of insulin and accompanying various acute and chronic complications. In the United States, it is estimated that 9.6% (20 million or more) of the population over 20 years of age have diabetes, and that there are more than 50 million pre-diabetes at high risk of developing the disease (US national diabetes facts, 2005). sheet). In 2002, $ 132 billion was spent on diabetes in direct and indirect medical expenses.

우리나라의 경우, 2005년 질병관리본부에서 시행한 국민건강영양조사에 따르면 30세 이상 남자의 9.0%, 여자의 7.2% 가 당뇨병 환자로 나타났다. 대한 당뇨병학회가 발간한 2007년 한국인 당뇨병 연구보고서'에 따르면, 당뇨의 유병률은 약 8%이고 매년 10%의 새로운 환자가 발생하고 있으며 당뇨 관련 의료비가 건강보험 비용의 약 20%(약 3조원)를 차지한다. 현재 400 ~ 500만 명으로 추산되는 당뇨 환자 수의 최근의 빠른 증가 속도를 고려할 때 10 ~ 20년 후 1000만 명에 이를 수 있다.In Korea, according to the National Health and Nutrition Survey conducted by the Centers for Disease Control and Prevention in 2005, 9.0% of men over 30 and 7.2% of women were diabetic. According to the 2007 Korean Diabetes Research Report published by the Korean Diabetes Association, the prevalence of diabetes is about 8%, and 10% of new patients occur each year.The cost of diabetes-related medical expenses is about 20% (about 3 trillion won). Occupies. Given the recent rapid growth in the number of diabetics currently estimated at 4-5 million, it could reach 10 million in 10-20 years.

이와 같이, 세계적으로 문제가 되고 있는 당뇨병은 노령인구의 증가 및 생활환경적인 요인 등으로 그 유병율이 더욱 증가할 것으로 예측되어 있기 때문에， 그에 따른 사회적，경제적 문제가 심각하게 대두되고 있다. 환자들의 증가로 혈당치의 추적관찰에 주로 사용되는 자가혈당 측정기의 수요가 증가하고，사용 빈도도 점차 증가하고 있는 실정이므로, 고감도의 사용이 간편한 혈당 센서의 개발이 요구되고 있다.As such, diabetes, which is a global problem, is expected to increase in prevalence due to an increase in elderly population and living environment factors, and thus social and economic problems are seriously raised. As the number of patients increases, the demand for self-glucometers, which are mainly used for the follow-up of blood glucose levels, is increasing, and the frequency of use is gradually increasing. Therefore, there is a need for the development of high sensitivity and easy to use blood glucose sensors.

형광 현미경, 레이저 기술 및 나노 기술 분야에서 세포 이미징(cellular imaging)이 가능한 생체학적 표지 (biological label)에 대한 관심이 증가하고 있다 생체학적 표지는 질병 진단과 치료에 있어서 세포내 수송과 생화학적 현상을 추적하는데 유용하다.There is a growing interest in biological labels capable of cellular imaging in fluorescence microscopy, laser technology, and nanotechnology. Biological labels are designed to improve intracellular transport and biochemical phenomena in disease diagnosis and treatment. Useful for tracking.

발광성 생체학적 표지로서는 형광 유기염료 및 유전자 조작된 단백질이 현재 널리 사용되고 있으나, 최근 반도체 나노입자, 즉 양자점(quantum dot)이 우수한 발광성 및 안정성 같은 물리학적/화학적 특성 외에도 광물리학적 특성을 조정할 수 있다는 점에서 주목을 받고 있다(X Michaletetal, Science 2005, 307, 538 참조).Fluorescent organic dyes and genetically engineered proteins are currently widely used as luminescent biomarkers, but recently, semiconductor nanoparticles, quantum dots, can be used to modulate photophysical properties in addition to physical and chemical properties such as good luminescence and stability. Attention is gained in this respect (see X Michaletetal, Science 2005, 307, 538).

이러한 장점에도 불구하고, 양자점에 함유된 중금속에 의한 독성과 환경적 문제로 인해, 양자점을 임상에 적용하는 것은 여전히 제한되고 있다(R Hardman, Environ Health Perspect 2006, 114, 165 참조).Despite these advantages, due to the toxicity and environmental issues caused by the heavy metals contained in quantum dots, the application of quantum dots to clinical applications is still limited (see R Hardman, Environ Health Perspect 2006, 114, 165).

이에 적절한 대안을 찾기 위한 많은 연구가 행해졌으며, 최근에는 양자점의 우수한 광물리학적 특성을 보유하면서도 생체적합성, 무독성, 제조성 및 안정성 면에서 우수한 탄소 나노입자, 즉 탄소점(carbon dot, C-dot, CD또는 카본닷)이 새로운 생체표지(biolabel)로서 연구되고 있다(S N Baker et al, Angew Chem Int EdMany studies have been conducted to find a suitable alternative. Recently, the carbon nanoparticles (carbon dots, C-dots) have excellent photophysical properties of quantum dots and are excellent in terms of biocompatibility, nontoxicity, manufacturability and stability. , CD or carbon dot) is being studied as a new biolabel (SN Baker et al, Angew Chem Int Ed).

2010, 49, 6726 참조). 2010, 49, 6726).

이러한 카본닷은 일반적으로 산소-함유 작용기를 갖는 컨주게이션(conjugation)된 탄소군의 형태로 sp2 및 sp3 혼성화된 탄소 나노구조의 혼합상으로 이루어진다(S C Ray et al, J Phys ChemC 2009, 113, 18546 ).Such carbon dots generally consist of a mixed phase of sp2 and sp3 hybridized carbon nanostructures in the form of conjugated carbon groups with oxygen-containing functional groups (SC Ray et al, J Phys ChemC 2009, 113, 18546). ).

카본닷은 높은 형광 성질 이외에도 이의 독특한 화학적 구조로 인하여 sp2 탄소 골격내에 치료제 분자들이 결합될 수 있고, 이의 표면에는 생체친화성 리간드 같은 분자들이 추가로 컨주게이션될 수 있다 이와 같은 특성들로 인해, CD는 진단과 치료가 동시에 가능한 진단치료학(theranostics) 분야에 이상적인 물질로서 개인맞춤 의료(personalized medicine)를 실현할 수 있다. 이에, 본 발명자들은 카본닷으로 제조된 바이오센서 필름을 통해 편리하고 효율적으로 글루코스를 감지하는 바이오센서를 개발하였다. 형광 계통 센서는 고감도, 숙주 시스템에 거의 손상이없는 것과 같은 뚜렷한 장점, 시간 분해 형광을 사용하는 능력 및 다양한 방법으로 생체 분자의 구조와 분포를 조사 할 수있는 능력과 같은 뚜렷한 장점으로 인해 주목 받고있다. In addition to its high fluorescence properties, carbon dots can bind therapeutic molecules within the sp2 carbon backbone due to their unique chemical structure and additionally conjugate molecules such as biocompatible ligands to their surfaces. Is an ideal material for the therapeutic therapies, where both diagnosis and treatment are possible, enabling personalized medicine. Thus, the present inventors have developed a biosensor for detecting glucose conveniently and efficiently through a biosensor film made of carbon dots. Fluorescent line sensors are attracting attention due to their distinct advantages, such as high sensitivity, distinct advantages such as little damage to the host system, the ability to use time resolved fluorescence, and the ability to investigate the structure and distribution of biomolecules in various ways. .

Fluorescent Carbon Nanoparticles: Synthesis, Characterization, and Bioimaging Application(S C Ray et al, J Phys ChemC 2009, 113, 18546 )Fluorescent Carbon Nanoparticles: Synthesis, Characterization, and Bioimaging Application (S C Ray et al, J Phys ChemC 2009, 113, 18546) Luminescent carbon nanodots: emergent nanolights.(S N Baker et al, Angew Chem Int Ed 2010, 49, 6726 )Luminescent carbon nanodots: emergent nanolights. (S N Baker et al, Angew Chem Int Ed 2010, 49, 6726)

이러한 형광 계통의 글루코오스 감지 바이오 센서를 구현하기 위해 해결하고자 하는 과제는 다음과 같다.Problems to be solved to implement the glucose-sensing biosensor of the fluorescent system is as follows.

기존의 용액에서만 이루어진 카본닷 센서는 불안정성(응집, 효소 변성 등)의 문제점이 있기 때문에 이를 보완한 고형화 센서를 제공하는 것을 목적으로 한다. The carbon dot sensor made only in the existing solution has a problem of instability (aggregation, enzyme denaturation, etc.), and thus aims to provide a solidification sensor that compensates for this.

따라서 본 발명에서는 형광색의 변화로 글루코스를 감지하는 카본닷 기반 고체 바이오센서 필름을 제공하는 것을 그 해결과제로 한다.Therefore, the present invention is to provide a carbon dot-based solid biosensor film for detecting glucose by the change of the fluorescence color.

따라서 본 발명에서는 육안으로 글루코스 센서의 가시성을 증가시키기 위해 글루코스 농도에 따라 비례적인 색상 변화를 보이는 고체 바이오센서 필름을 제공하는 것을 또다른 해결과제로 한다. Therefore, another object of the present invention is to provide a solid biosensor film showing a color change proportional to the glucose concentration in order to increase the visibility of the glucose sensor with the naked eye.

상기의 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 일 양태로서,가교결합제를 포함하는 카본닷(CD); 상기 카본닷(CD)이 결합된 하이드로겔 필름; 상기 하이드로겔 필름에 형광염료 및 GOx/HRP멀티효소 복합체;가 고정된 비색계 형광 글루코스 센서를 제공한다. In order to solve the above problems, the present invention in one aspect, a carbon dot containing a cross-linking agent (CD); A hydrogel film to which the carbon dot (CD) is bonded; It provides a colorimetric fluorescent glucose sensor is fixed; fluorescent dye and GOx / HRP multi-enzyme complex on the hydrogel film.

또한 바람직하게는, 상기 형광염료는 아크리딘 염료(Acridine dye), 시아닌 염료(Cyanine dye), 플루오론 염료(Fluorone dye), 옥사진 염료(Oxazin dye), 페난쓰리딘 염료(Phenanthridine dye) 및 로다민 염료(Rhodamine dye)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 한다.Also preferably, the fluorescent dye may be acridine dye, cyanine dye, fluoron dye, fluorine dye, oxazine dye, phenanthridine dye, and Rhodamine dye is characterized in that it comprises any one selected from the group consisting of.

더욱 바람직하게는, 상기 하이드로겔은 폴리아크릴산 (polyacrylic acid) 계열, 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 콜라겐, 피브린 및 히알루론산으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 주 사슬로 하는 것을 특징으로 한다.More preferably, the hydrogel is characterized in that the main chain is any one selected from the group consisting of polyacrylic acid series, polyvinyl alcohol, collagen, fibrin and hyaluronic acid.

본 발명의 다른 양태로서, (a) 카본닷(CD) 고정화를 위해 가교결합제를 추가하는 단계; (b) 상기 가교결합제가 추가된 카본닷(CD)을 하이드로겔 필름에 고정하는 단계; (c) 상기 하이드로겔 필름에 형광물질, 및 GOx/HRP멀티효소 복합체를 가교결합 하는 단계; 로 구성되는 비색계 형광 글루코스 센서의 제조방법을 제공한다.In another aspect of the present invention, there is provided a method for preparing a carbon dot, comprising the steps of: (a) adding a crosslinker for carbon dot (CD) immobilization; (b) fixing the carbon dot (CD) added with the crosslinking agent to the hydrogel film; (c) crosslinking the fluorescent material and GOx / HRP multiase complex on the hydrogel film; It provides a method of manufacturing a colorimetric fluorescent glucose sensor consisting of.

또한 바람직하게는, 상기 카본닷(CD)은 바텀업(bottom-up) 방식에 의해 합성되는 것을 특징으로 한다.Also preferably, the carbon dot (CD) is characterized in that synthesized by a bottom-up (bottom-up) method.

더욱 바람직하게는, 상기 바텀업(bottom-up) 방식은 습식산화(wet oxidation) 마이크로웨이브(microwave) 고열 주입(hot-injection) 및 수열합성(hydrothermal)중의 어느 한 가지 방법을 통해 이루어지는 것을 특징으로 한다.More preferably, the bottom-up method is performed by any one of wet oxidation microwave hot-injection and hydrothermal synthesis. do.

더욱 바람직하게는, 상기 (b) 단계는 자외선(UV) 자외선(UV), EDC, NHS, 탈수열건조법(dehydrothermal method) 및 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 한 가지 방법으로 가교결합을 통해 고정화되는 비색계 형광 글루코스 센서 제조방법을 제공한다.More preferably, step (b) is crosslinked by at least one method selected from the group consisting of ultraviolet (UV) ultraviolet (UV), EDC, NHS, dehydrothermal method and glutaraldehyde. It provides a method for manufacturing a colorimetric fluorescent glucose sensor that is immobilized through.

더욱 바람직하게는, 상기 가교결합제는 이소시아네이트계(Isocyanate) 화합물, 카르보디라이트계(Carbodilite) 화합물, 아지리딘계(Aziridine) 화합물, 아크릴계(Acrylice) 화합물 또는 멜라민계(Melamine) 화합물인 것을 특징으로 한다.More preferably, the crosslinking agent is an isocyanate compound, a carbodilite compound, an aziridine compound, an acrylic compound, or a melamine compound.

본 발명의 또 다른 양태로서, 비례적인 형광변화는, GOx/HRP멀티효소 복합체와 글루코스와의 이중 효소 반응에 의한 카본닷의 소광과, 글루코스에 비활성인 형광염료로부터 실현되는 것을 특징으로 하는 비색계 형광 글루코스 센서의 분석방법을 제공한다.As another embodiment of the present invention, the proportional fluorescence change is realized by color quenching of a carbon dot by a double enzyme reaction between GOx / HRP multienzyme complex and glucose, and a fluorescent dye inert to glucose. A method for analyzing a glucose sensor is provided.

본 발명에 따른 카본닷과 유기 염료를 이용한 비색계 형광 글루코스 센서는 최적화된 카본닷(CD)/로다민 6G(Rh6G)/GOx/HRP 지시약은 인간 혈액의 주요 성분에 대해 선택성이 뛰어나며 인간 혈청과 함께 사용할 수 있다. 또한, 기존의 용액에서만 이루어진 카본닷 센서는 불안정성(응집, 효소 변성 등)의 문제점이 있기 때문에 이를 고형화 센서로서 보완하였다. 이 고체 필름은 용액 상태와 비슷한 비율의 형광 색상 변화, 감도 및 우수한 선택성을 가진다.Colorimetric fluorescent glucose sensor using carbon dot and organic dye according to the present invention is optimized carbon dot (CD) / rhodamine 6G (Rh6G) / GOx / HRP indicator is excellent in selectivity for the major components of human blood and with human serum Can be used. In addition, the carbon dot sensor made only in the conventional solution has a problem of instability (aggregation, enzyme denaturation, etc.), and thus, it was supplemented with a solidification sensor. This solid film has a ratio of fluorescence color change, sensitivity and good selectivity similar to the solution state.

이러한 비율 측정 바이오 센서는 간단한 Turn-on 또는 Turn-off mode에 비해 육안으로 글루코스 센서의 가시성을 증가시킨다. 따라서 본 실험을 통해 보다 편리하고 효과적인 글루코스 검출 방법으로 바이오 센서에 카본닷의 광범위한 적용을 가능하게 한다.These ratiometric biosensors visually increase the visibility of glucose sensors compared to simple turn-on or turn-off modes. Therefore, this experiment enables a wider application of carbon dots to biosensors as a more convenient and effective method for detecting glucose.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 CD, A-CD 및 바이오센서 필름 제조를 위한 개략도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 GOx/HRP멀티효소 시스템의 소광 메커니즘이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 형광 측정을 위한 필름 샘플 홀더 모식도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 상이한 Cgs를 갖는 글루코스 수용액 (2.9 mL)을 첨가 한 후 DAPEG/AA/A-CD/Rh6G/GOx/HRP 필름에 대한 상응하는 형광 이미지이다. 1 is a schematic diagram for manufacturing a CD, A-CD and a biosensor film according to an embodiment of the present invention.
Figure 2 is a quenching mechanism of the GOx / HRP multi-enzyme system according to an embodiment of the present invention.
3 is a schematic view of a film sample holder for fluorescence measurement according to an embodiment of the present invention.
4 is a corresponding fluorescence image for DAPEG / AA / A-CD / Rh6G / GOx / HRP film after addition of aqueous glucose solution (2.9 mL) with different Cgs according to one embodiment of the present invention.

이하, 본 발명을 도면을 참조하여 더욱 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the drawings.

본 발명은, 가교결합제가 달린 카본닷(CD); 상기 카본닷(CD)이 결합된 하이드로겔 필름; 상기 하이드로겔 필름에 고정된 형광염료 및 GOx/HRP멀티효소 복합체를 포함하는 비색계 형광 글루코스 센서를 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다.The present invention, a carbon dot (CD) having a crosslinking agent; A hydrogel film to which the carbon dot (CD) is bonded; The solution to the above problems was sought by providing a colorimetric fluorescent glucose sensor comprising a fluorescent dye fixed to the hydrogel film and a GOx / HRP multienzyme complex.

도 1은 본 발명의 일구현예에 따른 비색계 바이오 센서 제조 방법 개략도이다. 이에 대해 설명하면, 구연산(CA)와 에틸렌디아민(EDA)를 Bench top 반응기에서 160℃ 온도에서 5시간 수열합성 반응을 통해 표면의 다수의 작용기가 존재하는 카본닷(CD)을 생성한다. 상기 카본닷(CD)은 글리시딜 메타크릴레이트(GMA)와 60℃ 온도에서 6시간 반응을 하여 아크릴화된 카본닷(A-CD);를 생성한다. 다음으로 아크릴산(AA)과 디아크릴레이트화 폴리 에틸렌글리콜(DAPEG)를 이용하여 제조된 하이드로겔 필름에 표면 아크릴 그룹이 달린 카본닷(A-CD), 형광염료 및 GOx/HRP멀티효소 복합체를 EDC:NHS 시스템을 이용한 가교결합으로 고정화시켜 안정한 고체 바이오 센서를 제조하는 과정에 대한 내용이다. 1 is a schematic view of a colorimetric biosensor manufacturing method according to an embodiment of the present invention. In this regard, citric acid (CA) and ethylenediamine (EDA) are subjected to hydrothermal synthesis for 5 hours at 160 ° C. in a bench top reactor to produce carbon dots (CD) having a plurality of functional groups on the surface. The carbon dot (CD) is reacted with glycidyl methacrylate (GMA) at 60 ° C. for 6 hours to produce acrylated carbon dot (A-CD). Next, the hydrogel film prepared by using acrylic acid (AA) and diacrylated polyethylene glycol (DAPEG) was subjected to surface-acryl group carbon dot (A-CD), fluorescent dye and GOx / HRP multienzyme complex. : The process of manufacturing stable solid biosensor by immobilization by crosslinking using NHS system.

먼저, 상기 카본닷(CD)을 설명한다. 일반적으로 자외선을 받아 파란색에서 초록색 사이의 빛을 방출하며 이러한 발광 현상에는 내부의 탄소 이중결합에 의한 π-π* 오비탈과 표면에 존재하는 다양한 화학기능기가 중요한 역할을 담당한다. 기능성 작용기가 도입된 카본닷(CD)은 산 처리에 의하여 개질된 탄소나노튜브 표면의 카르복실기와 옥시란기를 갖는 단량체를 반응시켜 제조되는 제품으로, 그 표면에 기능성 작용기인 이중결합을 갖는 물질이 도입된 것을 특징으로 한다. 상기 표면에 기능성 작용기가 도입된 탄소나노튜브에 대한 기술은 특허출원 제10-2007-0141638호에 개시되어 있기에 이에 대한 구체적인 설명은 생략한다.First, the carbon dot CD will be described. In general, it receives ultraviolet rays and emits light between blue and green. In this light emission phenomenon, π-π * orbitals caused by carbon double bonds inside and various chemical functional groups present on the surface play an important role. Carbon dot (CD) into which functional functional groups are introduced is a product manufactured by reacting a monomer having an oxirane group with a carboxyl group on the surface of a carbon nanotube modified by acid treatment, and a substance having a double bond as a functional functional group is introduced on the surface thereof. It is characterized by. Since the technology for carbon nanotubes into which functional functional groups are introduced on the surface is disclosed in Patent Application No. 10-2007-0141638, a detailed description thereof will be omitted.

상기 형광 물질로는 다양한 형광 염료계열 중 아크리딘 염료(Acridine dye), 시아닌 염료(Cyanine dye), 플루오론 염료(Fluorone dye), 옥사진 염료(Oxazin dye), 페난쓰리딘 염료(Phenanthridine dye), 로다민 염료(Rhodamine dye) 등이 있으며, 바람직하게는 로다민 염료(Rhodamine dye) 계열인 로다민 6G(rhodamine 6G)를 사용할 수 있으나, 반드시 이에 한정되지는 않는다. 형광 물질로 로다민6G(rhodamine 6G)를 사용하는 경우 수용성 및 유기 용매에 잘 분산이 될 뿐만 아니라, 다양한 형광 염료계열 중 형광이 가장 밝게 측정되는 등의 장점이 있다.The fluorescent materials include acridine dye, cyanine dye, fluoron dye, oxazine dye, phenanthridine dye among various fluorescent dyes. , Rhodamine dye (Rhodamine dye) and the like, preferably Rhodamine dye-based Rhodamine 6G (rhodamine 6G) can be used, but is not necessarily limited thereto. When Rhodamine 6G is used as a fluorescent material, it is well dispersed in water-soluble and organic solvents, and has the advantage that fluorescence is measured brightest among various fluorescent dyes.

다음, 하이드로겔 필름에 대해 설명한다.Next, the hydrogel film will be described.

본 발명에서 사용된 하이드로겔(hydrogel)은, 친수성 고분자의 네트워크로 이루어진 삼차원 구조체이며, 구성요소 중 90% 이상이 수분으로 이루어져 있다. 하이드로겔 합성시, 폴리아크릴산 (polyacrylic acid) 계열의 고분자나 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol) 등과 같은 합성화합물을 이용하면 생체 적합성은 떨어지나 화학적 변형이 쉬워 공학적 응용이 매우 용이하다. 반면 천연화합물, 특히 세포외기질(extracellular matrix; ECM) 성분인 콜라겐, 피브린 및 히알루론산 등을 주사슬로 이용하면 변형이 쉽지 않아 공학적 조작이 어렵지만 생체 유래 성분이므로 이식 시 면역, 염증반응 등의 부작용이 적어 임상적 적용에 적합하다는 장점이 있다. Hydrogel used in the present invention is a three-dimensional structure consisting of a network of hydrophilic polymers, 90% or more of the components are made of water. When synthesizing hydrogels, synthetic compounds such as polyacrylic acid-based polymers or polyvinyl alcohols are poor in biocompatibility, but easy to modify chemically, and thus are easily engineered. On the other hand, if natural compounds, especially extracellular matrix (ECM) components such as collagen, fibrin, and hyaluronic acid are used as main chains, they are difficult to modify because they are difficult to engineer. There is a merit that it is suitable for clinical application.

본 발명에서는 DAPEG (Diacrylated 폴리에틸렌글리콜) 과 AA(아크릴산)을 이용해 하이드로겔 필름을 제조하였다. DAPEG / AA / CD 필름은 유리 슬라이드 사이에 200μm 두께의 실리콘 시트가 스페이서가 있는 형태이다. 본 발명의 일구현예는 실시예에서 다루도록 한다. In the present invention, a hydrogel film was prepared using DAPEG (Diacrylated polyethylene glycol) and AA (acrylic acid). DAPEG / AA / CD film is a 200μm thick silicon sheet with a spacer between the glass slides. One embodiment of the present invention will be dealt with in the Examples.

다음, GOx/HRP멀티효소 복합체에 대해 설명한다.Next, the GOx / HRP multiase complex will be described.

본 발명과 같이, 2가지 이상의 효소가 복합적으로 작용하는 연속 반응 시스템이 요구될 때, 각각의 효소 반응뿐만 아니라 반응하는 효소들의 상호 영향 또한 고려 되어야 한다. 이러한 멀티효소 복합체 시스템의 예로써 글루코스 옥시다제(GOx)와 홍당무 퍼옥시다아제(HRP)를 사용하여 멀티효소 복합체 시스템을 구축하였다. 상기 글루코스 옥시다제(GOx)는 글루코스(β-D-glucose)을 산소로 산화시켜 글루콘산(D-gluconic acid)을 생성하는 효소로서, 통상적으로 판매 및/또는 합성할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 페니킬리움 노타툼(Penicillium notatum) 등의 곰팡이나 벌꿀에서 발견된 것을 포함할 수 있다.As with the present invention, when a continuous reaction system is required in which two or more enzymes work in combination, not only each enzyme reaction but also the mutual influence of the enzymes to be reacted should be considered. As an example of such a multienzyme complex system, a multienzyme complex system was constructed using glucose oxidase (GOx) and blush peroxidase (HRP). The glucose oxidase (GOx) is an enzyme that produces gluconic acid by oxidizing glucose (β-D-glucose) with oxygen and is not particularly limited as long as it can be commonly sold and / or synthesized. For example, it may include those found in mold or honey, such as Penicillium notatum.

글루코스 옥시다제를 포함하는 것이라면 그 함량을 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 액정공중합체 100 중량부에 대하여 200 ~ 30,000 중량부의 글루코스 옥시다제를 포함할 수 있다. 만약, 액정공중합체 혼합물 100 중량부에 대하여 200 중량부 미만의 글루코스 옥시다제를 포함할 경우, 글루코스 옥시다제의 양이 너무 적어 글루코스와 글루코스 옥시다제의 반응이 느려 센서부의 반응이 느려지는 문제가 발생할 수 있으며, 만약, 액정공중합체 100 중량부에 대하여 30,000 중량부를 초과하는 글루코스 옥시다제를 포함할 경우, 초과 포함된 글루코스 옥시다제가 글루코스와의 반응에 사용되지 않아 소재가 낭비되는 문제가 발생할 수 있다.The content of the glucose oxidase is not particularly limited as long as it includes glucose oxidase, but preferably 200 to 30,000 parts by weight of glucose oxidase based on 100 parts by weight of the liquid crystal copolymer. If less than 200 parts by weight of glucose oxidase is included with respect to 100 parts by weight of the liquid crystal copolymer mixture, the amount of glucose oxidase is too small and the reaction between the glucose and the glucose oxidase is slow, resulting in a slow response of the sensor part. If, when more than 30,000 parts by weight of glucose oxidase is included with respect to 100 parts by weight of the liquid crystal copolymer, the excess contained glucose oxidase is not used in the reaction with glucose may cause a problem that the material is wasted .

상기 HRP는 서양고추냉이(horseradish)에서 발견되는 퍼옥시다아제의 일종으로, 분자량은 약 44,000으로 1분자에 1개의 작용기 프로토헤민을 함유한다. 이 효소의 흡수스펙트럼은 640, 500, 402nm에 흡수극대를 갖는다. H2O2(또는 CH3OOH)를 첨가하면 흡수스펙트럼에 변화가 생긴다. 이것은 과산화수소가 효소인 프로토헤마틴의 Fe3＋과 결합하여 효소-기질결합물을 형성하기 때문이다. 레분자의 화학적 구조는 원자의 배열과 각 해당 원자들 간의 화학결합으로 결정된다. The HRP is a kind of peroxidase found in horseradish, and has a molecular weight of about 44,000 and contains one functional group protohemin per molecule. The absorption spectrum of this enzyme has an absorption maximum at 640, 500, and 402 nm. The addition of H2O2 (or CH3OOH) changes the absorption spectrum. This is because hydrogen peroxide combines with Fe3 + of the enzyme protohetin to form an enzyme-substrate bond. The chemical structure of the remolecule is determined by the arrangement of the atoms and the chemical bonds between the corresponding atoms.

다음, 본 발명에 있어서 (a) 카본닷(CD) 고정화를 위해 가교결합제를 추가하는 단계;를 설명한다. 가교결합제는 이소시아네이트계(Isocyanate) 화합물, 카르보디라이트계(Carbodilite) 화합물, 아지리딘계(Aziridine) 화합물 또는 멜라민계(Melamine) 화합물일 수 있고, 더욱 바람직하게는 아크릴기(Acrylic)를 포함할 수 있으며, 이에 한정하지 않는다.  Next, in the present invention (a) adding a crosslinking agent for carbon dot (CD) immobilization; will be described. The crosslinking agent may be an isocyanate compound, a carbodilite compound, an aziridine compound, or a melamine compound, more preferably an acrylic group. It is not limited to this.

다음, 본 발명에 있어서 (b) 상기 가교결합제가 추가된 카본닷(CD)을 하이드로겔 필름에 고정하는 단계; 를 설명한다. 고정을 위해 본 발명에서는 가교결합을 사용하였다. 분자와 분자간에 공유 결합이나 이온 결합처럼 완전한 화학 결합이 형성된 것을 가교 결합이라고 한다. 상기 카본닷(CD)과 멀티효소 복합체, 형광염료의 고정화는, 자외선(UV), EDC, NHS, 탈수열건조법(dehydrothermal method) 및 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 한 가지 방법으로 지지체를 가교결합하는 단계를 포함할 수 있고, 이에 한정하지는 않는다.Next, in the present invention (b) fixing the carbon dot (CD) added with the crosslinking agent to the hydrogel film; Explain. Crosslinking was used in the present invention for fixation. The formation of complete chemical bonds, such as covalent or ionic bonds, between molecules is called crosslinking. Immobilization of the carbon dot (CD), the multienzyme complex and the fluorescent dye is at least one method selected from the group consisting of ultraviolet (UV), EDC, NHS, dehydrothermal method and glutaraldehyde. And cross-linking the support, but are not limited thereto.

다음, 본 발명에 있어서 상기 카본닷(CD)의 제조방법에 대해 설명한다. 이때, 상기 카본닷(CD)의 제조방법은 특별히 한정되지 않으나, 합성법은 크게 탑다운(top-down)과 바텀업(bottom-up) 방식으로 나뉜다. 탑다운 방식은 흑연 등의 탄소 덩어리를 물리, 화학적으로 잘게 부수어 나온 조각들 중 탄소 양자점을 분류해 사용하며 대표적으로 아크방전(arc discharge) 레이저박리(laser ablation) 전기화학 산화(electrochemical oxidation) 등의 방법이 있다. 바텀업 방식은 글루코스, 유기산 등의 탄수화물에 열을 가해 탄화 반응을 일으켜 탄소 양자점을 형성하며 대표적으로 습식산화(wet oxidation) 마이크로웨이브(microwave) 고열 주입(hot-injection) 수열합성(hydrothermal) 등의 방법이 널리 쓰이고 있다.Next, the manufacturing method of the said carbon dot (CD) in this invention is demonstrated. At this time, the manufacturing method of the carbon dot (CD) is not particularly limited, but the synthesis method is largely divided into a top-down and a bottom-up method. The top-down method uses carbon quantum dots in pieces that are physically and chemically broken into pieces of carbon such as graphite, and is typically used for arc discharge, laser ablation, electrochemical oxidation, etc. There is a way. The bottom-up method heats carbohydrates such as glucose and organic acids to carbonize to form carbon quantum dots, typically wet oxidation microwave hot-injection hydrothermal, etc. The method is widely used.

다음, 본 발명에 있어서 비색계 형광 글루코스 센서의 비례적인 색 변화는, GOx/HRP멀티효소 복합체와 글루코스와의 이중 효소 반응에 의한 카본닷의 소광과, 글루코스에 비활성인 형광염료로부터 실현되는 것을 특징으로 하는 비색계 형광 글루코스 센서의 분석방법을 설명한다. Next, the proportional color change of the colorimetric fluorescent glucose sensor according to the present invention is realized from the quenching of carbon dots by a double enzyme reaction between GOx / HRP multienzyme complex and glucose, and a fluorescent dye inert to glucose. An analysis method of a colorimetric fluorescent glucose sensor is described.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 GOx/HRP멀티효소 시스템의 소광 메커니즘을 나타낸다. 글루코스 옥시다제(GOx)에 의한 촉매 반응을 통해 형성되는 과산화수소는 두 번째 반응에서 HRP에 의해 7-dihydroxyphenoxazine (Amplex Red)에 의한 형광 반응이 유도될 수 있으며 이를 통해 레졸루핀(resolufin)과 관련된 다양한 형광 반응에 응용될 수 있다. 이 글루코오스 바이오 센서는 효소 민감성 및 안정성, 재사용성이 용이하고 선택적인 글루코스 검출의 특징을 가지며, 이는 글루코오스를 검출하는 새로운 방법을 제공 할수있다. 글루코스에 비활성인 형광염료는 GOx와 HRP의 글루코오스와의 이중 효소 반응에 불활성인 반면, 청색 발광 CD는 형광 소광을 나타내어, 수성 및 고체 상태 모두에서 글루코오스 농도가 증가함에 따라 청색에서 녹색으로 연속 형광색 변화를 보임으로써 비색계 형광 분석방법을 실현하게 된다.Figure 2 shows the quenching mechanism of the GOx / HRP multi-enzyme system according to an embodiment of the present invention. Hydrogen peroxide formed through the catalytic reaction with glucose oxidase (GOx) can induce a fluorescence reaction with 7-dihydroxyphenoxazine (Amplex Red) by HRP in the second reaction, through which various fluorescence associated with resolufin It can be applied to the reaction. This glucose biosensor is characterized by enzyme sensitivity, stability, reusability and selective glucose detection, which can provide a new method of detecting glucose. Fluorescent dyes that are inactive to glucose are inactive to the double enzymatic reaction of GOx with HRP glucose, whereas blue luminescent CD exhibits fluorescence quenching, resulting in continuous fluorescence changes from blue to green with increasing glucose concentration in both aqueous and solid states. By showing the colorimetric fluorescence analysis method is realized.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하지만, 하기 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the following Examples are not intended to limit the scope of the present invention, which will be construed as to help the understanding of the present invention.

여기서 소개되는 실시 예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 따라서, 이하의 실시 예들에 의하여 본 발명이 제한되어서는 안 된다.The embodiments introduced herein are provided so that the disclosure may be made thorough and complete, and the spirit of the present invention may be sufficiently delivered to those skilled in the art. Therefore, the present invention should not be limited by the following embodiments.

실시예Example

본 발명의 용어를 설명한다.The terms of the present invention are explained.

본 발명에서 사용된 "비색계(ratiometric)"는 시료 용액 및 표준용액에 발색시약을 가하여 나타나는 색깔의 농도와 색조를 비교하여 특정 성분의 농도를 정량하는 방법을 의미한다."Ratiometric" used in the present invention means a method of quantifying the concentration of a specific component by comparing the color concentration and the color tone appearing by adding a coloring reagent to the sample solution and the standard solution.

약어 설명Acronym Description

CD (카본닷)CD (carbon dot)

A-CD (아크릴화 카본닷CD)A-CD (Acrylate Carbon Dot CD)

Rh6G (로다민6G)Rh6G (Rhodamine 6G)

GOx (글루코스 산화효소)GOx (glucose oxidase)

HRP (홍당무 퍼옥시다아제)HRP (Blush Peroxidase)

PAA (폴리아크릴산)PAA (polyacrylic acid)

DAPEG (디아크릴레이트 폴리에틸렌 글리콜)DAPEG (Diacrylate Polyethylene Glycol)

CA (구연산)CA (citric acid)

EDA (에틸렌 디아민)EDA (ethylene diamine)

GMA (글리시딜 메틸메타크릴레이트)GMA (Glycidyl Methyl Methacrylate)

EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드)EDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide)

NHS (N-히드록시숙신이미드)NHS (N-hydroxysuccinimide)

Chol (콜레스테롤)Chol (cholesterol)

AA (L-아스코르빈 산)AA (L-ascorbic acid)

CCD / CRh6G / Cg (CD, Rh6G, 글루코스의 농도)CCD / CRh6G / Cg (concentrations of CD, Rh6G, glucose)

Qf ((F0-F) / F0) (소광도)Qf ((F0-F) / F0) (Extinction)

재료material

DAPEG (중량 평균 분자량 (MW) = 400 g/mol) 를 Polysciences, USA로부터 구매. 아크릴산 (AA, Junsei, Japan) 구매. DAPEG (weight average molecular weight (M W ) = 400 g / mol) was purchased from Polysciences, USA. Purchase acrylic acid (AA, Junsei, Japan).

시트르산 (CA, 99.5 %), 홍당무 과산화 효소 (HRP), N- 히드록시석신이미드 (NHS), Rh6G, 2- 히드록시 -2- 메틸프로피오논, 트리클로로 (1H, 1H, 2H, 2H- 퍼플 루오로 옥틸) 실릴글리시딜 메틸 메타 크릴 레이트 GMA), D - (+) - 글루코스, 우레아, 요산, L - 아스코르빈산, 락토스, 인간 혈청 및 벤조일 (MWCO = 2000 Da) 막을 Sigma-Aldrich, USA으로부터 구매. Citric acid (CA, 99.5%), Blush Peroxidase (HRP), N-hydroxysuccinimide (NHS), Rh6G, 2-hydroxy-2-methylpropionone, trichloro (1H, 1H, 2H, 2H -Fluorooctyl) silylglycidyl methyl methacrylate GMA), D-(+)-glucose, urea, uric acid, L-ascorbic acid, lactose, human serum and benzoyl (MWCO = 2000 Da) membranes Sigma- Buy from Aldrich, USA.

NaCl, CaCl2 및 EDA의 금속염 (99.5 %) 한국 '덕산' 에서 수령. Metal salts of NaCl, CaCl2 and EDA (99.5%) received in Deoksan, Korea.

1-(3-디 에틸 아미노프로필) -3- 에틸 카르보디이미드 염산염 (EDC · HCl) Tokyo Chemical Industry (TCI), Japan으로부터 구매. 1- (3-Diethyl aminopropyl) -3-ethyl carbodiimide hydrochloride (EDCHCl) purchased from Tokyo Chemical Industry (TCI), Japan.

증류수(DI)는 역 오스모시스 시스템(PureRO, Romax, South Korea)으로 정화된 다음 모든 실험에 사용한다.Distilled water (DI) is purified by an inverse osmosis system (PureRO, Romax, South Korea) and used for all experiments.

장치Device

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 형광 측정을 위한 필름 샘플 홀더 모식도를 나타낸다. UV-vis, PL, 및 푸리에 변환 적외선 (FT-IR) 스펙트럼은 UV-2401 PC 분광광도계 (Shimadzu, Japan), an RF-5301 PC (Shimadzu, Japan), 및 Jasco FT/IR-620 spectrometer (ATR method, Jasco, Japan),에 각기 기록한다. Figure 3 shows a film sample holder schematic diagram for fluorescence measurement according to an embodiment of the present invention. UV-vis, PL, and Fourier transform infrared (FT-IR) spectra are available from the UV-2401 PC spectrophotometer (Shimadzu, Japan), an RF-5301 PC (Shimadzu, Japan), and the Jasco FT / IR-620 spectrometer (ATR method, Jasco, Japan), respectively.

CD 수용액 및 DAPEG/AA/CD 필름의 사진은 스마트폰 카메라 (SM-G950S, 삼성, 한국)로 촬영한다. Pictures of the aqueous CD solution and DAPEG / AA / CD film are taken with a smartphone camera (SM-G950S, Samsung, Korea).

PL 측정 중 고체 필름용 샘플 홀더는 입사 광선에 대해 45°의 법선으로 지면에 평행하게 정렬한다. 수용액의 PL 스펙트럼은 달리 언급하지 않는 한 360 nm pH 7.4에서 기록하였다. 모든 고체 상태 시료의 형광 측정은 용액 상태 시료의 경우와 동일한 여기 파장으로 건조한 상태에서 수행한다.  The sample holder for the solid film during PL measurement is aligned parallel to the ground with a normal of 45 ° to the incident light. PL spectra of aqueous solutions were recorded at 360 nm pH 7.4 unless otherwise noted. Fluorescence measurements of all solid state samples are carried out in a dry state with the same excitation wavelength as that of the solution state sample.

<< 제조예Production Example 1> CDs 및 A- 1> CDs and A- CDs 의Of CDs 제조 Produce

CD는 미니 bench-top 반응기 (Parr series 4560, Parr Instrument Co., USA)를 사용하여 약간 수정하여 이전에 보고된 방법에 따라 합성한다. CA (0.4 g, 0.002 M) 및 EDA (270 μL, 0.004 M)를 DI 물(80 mL)에 용해 시킨다. 용액이 균일 할 때, 혼합물을 탁상용 반응기로 옮기고 160 ℃에서 5 시간 동안 가열한다. 반응 후, 반응기는 공기 중에서 실온 (24 ℃)으로 냉각시킨다. 생성된 CD 용액은 갈적색이며 투명하다. 투석 튜브(MWCO = 2000 Da)를 사용하여 물로 투석하여 순수한 CD를 얻는다. 아크릴화 된 CD (A-CD)를 얻기 위해 GMA를 CD 표면의 작용기와 반응시킨다. 먼저 5 mL의 CD 수용액 (5.8 mg / mL)과 0.3 mL의 GMA를 30 ° C에서 24 시간 동안 교반한다. 반응 후, 오일 및 물을 상 분리시킨다. 오일 상을 제거하고 수상을 헥산으로 여러 번 세척하여 소량의 미 반응 GMA 분자를 제거한다. 모든 고체 상태 시료의 형광 측정은 용액 상태 시료의 경우와 동일한 여기 파장으로 건조한 상태에서 수행된다.CD is synthesized according to the previously reported method with a slight modification using a mini bench-top reactor (Parr series 4560, Parr Instrument Co., USA). CA (0.4 g, 0.002 M) and EDA (270 μL, 0.004 M) are dissolved in DI water (80 mL). When the solution is homogeneous, the mixture is transferred to a tabletop reactor and heated at 160 ° C for 5 hours. After the reaction, the reactor is cooled to room temperature (24 ° C.) in air. The resulting CD solution is brownish red and transparent. Dialysis with water using a dialysis tube (MWCO = 2000 Da) gives pure CD. GMA is reacted with a functional group on the surface of the CD to obtain acrylated CD (A-CD). First, 5 mL of aqueous CD solution (5.8 mg / mL) and 0.3 mL of GMA are stirred at 30 ° C for 24 hours. After the reaction, the oil and water are phase separated. The oil phase is removed and the aqueous phase is washed several times with hexane to remove small amounts of unreacted GMA molecules. Fluorescence measurements of all solid state samples are carried out in a dry state with the same excitation wavelength as that of the solution state sample.

<< 제조예Production Example 2>  2> 하이드로겔Hydrogel 필름의 제조 Manufacture of film

The DAPEG/AA/CD 필름은 다음과 같이 제조된다. DAPEG/AA/CD 필름은 유리 슬라이드 사이에 200μm 두께의 실리콘 시트가 스페이서가 있는 형태이다. 하단 유리 슬라이드는 UV 경화 후 유리에서 필름 제거를 용이하게 하기 위해 60 ℃에서 30 분 동안 밀봉된 페트리 디쉬 (130 x 130 x 15 mm 3)에서 트리클로로 (1H, 1H, 2H, 2H- 퍼플루오로옥틸) 실란 (0.2 mL) 증기 분산에 의해 코팅된다. The DAPEG / AA / CD film is made as follows. DAPEG / AA / CD films have a spacer of 200 μm thick silicon sheets between glass slides. The bottom glass slide is trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoro) in a sealed Petri dish (130 x 130 x 15 mm 3) at 60 ° C. for 30 minutes to facilitate film removal from the glass after UV curing. Octyl) silane (0.2 mL) coated by vapor dispersion.

광 가교 개시제로서 A-CD (5.2 × 10-5 중량 %), DAPEG (70 중량 %), AA (30 중량 %) 및 2- 하이록시 -2- 메틸프로피오폰 (0.01mL)의 혼합물을 하단 유리 슬라이드에 적용하고, 상단 유리슬라이드로 덮는다. 유리 슬라이드 사이의 혼합물은 샘플로부터 12cm의 거리에서 60 초 동안 UV 조사에 의해 경화된다. 경화 후, 가교 결합 된 DAPEG / AA / A-CD 필름을 DI 수에 1 시간 동안 두어 미반응 단량체를 제거한다.A mixture of A-CD (5.2 × 10-5% by weight), DAPEG (70% by weight), AA (30% by weight) and 2-hydroxy-2-methylpropiophone (0.01 mL) as the photocrosslinking initiator was bottomed Apply to glass slide and cover with top glass slide. The mixture between the glass slides is cured by UV irradiation for 60 seconds at a distance of 12 cm from the sample. After curing, cross-linked DAPEG / AA / A-CD films are placed in DI water for 1 hour to remove unreacted monomers.

<< 제조예Production Example 3>  3> 가교결합을Crosslinking 통한 고정화  Immobilization

DAPEG로 가교결합 된 PAA 필름을 글루코스 바이오 센서용 매트릭스 필름으로 제조한다. 10 중량 % 미만의 DAPEG를 갖는 PAA 필름은 낮은 가교 결합으로 인해 점착성이 있다. 대조적으로, 20 중량 % 이상의 DAPEG를 갖는 PAA 필름은 우수한 필름 형성 및 CD, GOx 및 HRP의 우수한 고정화를 나타낸다. 그러나, DAPEG가 20 중량 % 인 필름은 글루코스 수용액이 적하 될 때 다소 끈적 거리고 구겨진다. 따라서, 글루코스 센서 필름을 제조하기 위해 30 중량 %의 DAPEG로 가교 결합 된 PAA 필름을 사용한다.PAA films crosslinked with DAPEG are prepared as matrix films for glucose biosensors. PAA films with less than 10% by weight of DAPEG are tacky due to low crosslinking. In contrast, PAA films with at least 20% by weight of DAPEG exhibit good film formation and good immobilization of CD, GOx and HRP. However, a film with a DAPEG of 20% by weight is somewhat sticky and crumpled when an aqueous solution of glucose is added. Thus, a PAA film crosslinked with 30% by weight DAPEG is used to prepare the glucose sensor film.

PAA 필름에 CD를 통합하기 위해 UV 중합 중에 A-CD를 사용한다. 2919, 1687, 1584 및 1195 cm-1 에서의 CD의 FT-IR 스펙트럼의 피크는 각각 C-H 신축, C = O 신축, N-H 신축 및 C-O 신축에 상응한다. A-CD의 FT-IR 스펙트럼은 C = C 신축 및 C-O 신축 (에스테르)에 의한 1628 및 1293 cm-1 에서 추가 피크를 각각 보여 주며 반응성 아크릴 그룹이 GMA 반응에 의해 도입된다. A-CD (5.2 × 10-5 중량 %)와 AA / DAPEG (7:3, w/w)의 혼합물을 0.2mm의 갭을 갖는 샌드위치 된 유리 슬라이드 사이에서 UV 경화시켜 우수한 안정성을 갖는 균일한 필름을 생성시킨다. A-CD is used during UV polymerization to incorporate CD into the PAA film. The peaks in the FT-IR spectrum of the CD at 2919, 1687, 1584 and 1195 cm −1 correspond to CH stretch, C = O stretch, NH stretch and CO stretch, respectively. The FT-IR spectra of A-CD show additional peaks at 1628 and 1293 cm −1 by C = C stretch and CO stretch (ester), respectively, with reactive acrylic groups introduced by the GMA reaction. Uniform film with excellent stability by UV curing between A-CD (5.2 × 10-5 weight%) and AA / DAPEG (7: 3, w / w) between sandwiched glass slides with a gap of 0.2 mm Creates.

GOx 및 HRP로 기능화하기 위해, 필름을 EDC : NHS로 활성화시킨 후 GOx 및 HRP를 필름에 고정한다.To functionalize with GOx and HRP, the film is activated with EDC: NHS and then GOx and HRP are fixed to the film.

GOx와 HRP가 필름 내에 공유 적으로 고정화되었는지를 확인하기 위해, 필름에 물을 삽입하는 시험을 진행하였다. HRP / GOx 혼합물의 UV 스펙트럼은 390 및 480nm에서 피크를 나타내지만, 제조된 필름이 침지된 물은 피크를 나타내지 않아 효소가 필름에 단단히 고정되어 있음을 나타낸다. 따라서 최적의 바이오 센서 필름은 DAPEG / AA (3:7, w/w) / A-CD (5.2x10-5 wt %) / Rh6G (1.6x10-4) / GOx / HRP (3 : 1 몰비, 0.16 중량 %)일때 나타난다. DAPEG와 AA의 조성 및 CD, Rh6G, GOx 및 HRP의 농도는 변경되지 않으며, 괄호 안에 농도가 없는 DAPEG/AA/A-CD/Rh6G/GOx/HRP의 사용은 이 필름을 가리킨다.To verify that GOx and HRP were covalently immobilized in the film, a test was conducted to insert water into the film. The UV spectrum of the HRP / GOx mixture shows peaks at 390 and 480 nm, but the water immersed in the produced film shows no peak, indicating that the enzyme is firmly fixed to the film. Therefore, the optimal biosensor film is DAPEG / AA (3: 7, w / w) / A-CD (5.2x10-5 wt%) / Rh6G (1.6x10-4) / GOx / HRP (3: 1 molar ratio, 0.16 Weight%). The composition of DAPEG and AA and the concentrations of CD, Rh6G, GOx and HRP do not change, and the use of DAPEG / AA / A-CD / Rh6G / GOx / HRP without concentrations in parentheses indicates this film.

<< 실시예Example 1> 글루코오스 바이오 센서에 사용되기 위한 CD /  1> CD / for use in glucose biosensors GOxGOx /  Of Rh6GRh6G 수용액 테스트 Aqueous solution test

CD, Rh6G 및 CD / Rh6G의 형광 특성을 조사하여 준비된 CD 및 Rh6G가 비율 계량법적인 형광색 변화를 나타낼 수 있는지 여부를 확인한다. PL 스펙트럼은 ~ 440 nm에서 최대를 나타낸다. 최대 강도는 UV-vis 스펙트럼에서 CD의 p-p* 전이와 일치하는 λexc = 360 nm에서 관찰된다. 다른 Rh6G 수용액 (0.001 mg / mL)의 PL 스펙트럼 λexcs은 ~ 550 nm에서 최대값을 나타낸다. 강도는 λexc가 증가함에 따라 지속적으로 증가한다. 440nm 및 550 nm에서 CD 및 Rh6G의 형광 피크는 각각 λexc에 관계없이 잘 분리되어 있다. 따라서 CD가 최대 강도를 나타내는 λexc = 360 nm를 사용하여 추가 실험을 수행하였다. Examine the fluorescence properties of CD, Rh6G and CD / Rh6G to determine whether the prepared CD and Rh6G can exhibit ratiometric fluorescence changes. The PL spectrum shows the maximum at 440 nm. Maximum intensity is observed at λ exc = 360 nm consistent with the pp * transition of the CD in the UV-vis spectrum. The PL spectrum λ exc s of another aqueous Rh6G solution (0.001 mg / mL) shows a maximum at 550 nm. The intensity continues to increase as λ exc increases. The fluorescence peaks of CD and Rh6G at 440 nm and 550 nm are well separated regardless of λ exc , respectively. Therefore, additional experiments were performed using λ exc = 360 nm, where CD exhibited the maximum intensity.

CD 및 Rh6G의 PL 스펙트럼은 440 및 550nm에서 최대 강도를 나타내지만, 혼합물의 스펙트럼은 440 및 550nm에서 잘 분리 된 피크를 나타낸다. 440 및 550nm에 해당하는 색상은 각각 파란색과 녹색이며, The PL spectra of CD and Rh6G show maximum intensities at 440 and 550 nm, but the spectrum of the mixture shows well separated peaks at 440 and 550 nm. The colors corresponding to 440 and 550 nm are blue and green, respectively.

이는 이러한 피크의 상대적 강도를 변경하여 비율 측정 색상을 조정할 수 있음을 나타낸다. 테스트 한 각 용액에 대해 550 nm에서의 최대 PL은 글루코스 첨가에 영향을 받지 않으며 Rh6G의 형광 방출은 글루코스과의 효소 반응에 영향을 받지 않음을 나타낸다. 그러나 CD에 해당하는 450 nm의 피크는 효소 반응에 크게 영향을 받는다. 글루코오스와 GOx / HRP의 혼합물은 CD의 강도를 급격히 감소시키며, 생성된 OH 라디칼이 주요 소광인자임을 나타낸다. This indicates that the ratio measurement color can be adjusted by changing the relative intensity of these peaks. For each solution tested, the maximum PL at 550 nm was not affected by glucose addition and the fluorescence emission of Rh6G was not affected by the enzymatic reaction with glucose. However, the 450 nm peak corresponding to CD is greatly affected by the enzymatic reaction. The mixture of glucose and GOx / HRP drastically reduces the strength of the CD, indicating that the resulting OH radicals are the main quenching factor.

GOx만으로는 CD의 PL 강도를 소멸시키지는 않지만, HRP는 CD의 PL 강도를 소량으로 억제한다. 따라서 CD / Rh6G 수용액에서 GOx / HRP의 이중효소 시스템을 사용하여 계량적 색상 조절이 가능하다.GOx alone does not destroy the PL strength of the CD, but HRP suppresses the PL strength of the CD in small amounts. Therefore, quantitative color control is possible using the dual enzyme system of GOx / HRP in aqueous CD / Rh6G solution.

<< 실시예Example 2>  2> 글루코스와With glucose 인간 혈청 테스트 Human serum test

글루코스 검출을 위해, CD (0.174 mg / mL), Rh6G (0.04 mg / mL), GOx (27 μM) 및 HRP (18 μM)로 구성된 수성 지시약 용액을 제조하였다. 그런 다음, 농도가 다른 글루코스 용액을 지표 용액에 첨가하였다. 글루코오스 검출의 선택성을 조사하기 위해, 50 μM의 동일한 최종 농도에서 지시약 용액에 생체화물 (유당, 아스코르브 산, 우레아, Ca2 + 및 Na +)의 다양한 수용액을 첨가했다. DAPEG / AA / A-CD / Rh6G / GOx / HRP 바이오 센서 고체 필름의 선택도는 모든 생물학적 용액의 농도가 100μM 인 것을 제외하고 수성 지시약 용액에 대해 기재된 방법에 따라 결정되었다. 모든 실험은 24 ℃에서 3번 반복되었다.For glucose detection, an aqueous indicator solution consisting of CD (0.174 mg / mL), Rh6G (0.04 mg / mL), GOx (27 μM) and HRP (18 μM) was prepared. Then, glucose solutions of different concentrations were added to the indicator solution. To investigate the selectivity of glucose detection, various aqueous solutions of biohydrates (lactose, ascorbic acid, urea, Ca 2+ and Na +) were added to the indicator solution at the same final concentration of 50 μM. The selectivity of the DAPEG / AA / A-CD / Rh6G / GOx / HRP biosensor solid film was determined according to the method described for aqueous indicator solution except that the concentration of all biological solutions was 100 μM. All experiments were repeated three times at 24 ° C.

실제 인간 혈액 테스트에서는, 혈장 (Sigma-Aldrich)을 5000 rpm에서 10 분간 원심 분리하여 큰 분자를 제거한 다음 DI 물에 용해 (x40 희석)하였다. 원심 분리된 인간 혈장에서 글루코스 검출은 CD / Rh6G / GOx / HRP 용액과 DAPEG / AA / A-CD / Rh6G / GOx / HRP 필름을 사용하여 시험하였다. 또한, 인간 혈청의 글루코스 레벨은 고속 액체 크로마토 그래피 (HPLC)에 의해 결정되었다. In a real human blood test, plasma (Sigma-Aldrich) was centrifuged at 5000 rpm for 10 minutes to remove large molecules and then dissolved in DI water (x40 dilution). Glucose detection in centrifuged human plasma was tested using CD / Rh6G / GOx / HRP solutions and DAPEG / AA / A-CD / Rh6G / GOx / HRP films. In addition, glucose levels in human serum were determined by high performance liquid chromatography (HPLC).

<< 실시예Example 3> CD /  3> CD / GOxGOx /  Of Rh6GRh6G 수용액의 기능 확인 Check the function of the aqueous solution

감도 테스트는 CD / GOx / HRP 수용액과 비교된 CD / Rh6G / GOx / HRP 수용액으로 실현되었다. CD / GOx / HRP 수용액의 경우, 450 nm에서 피크의 강도는 형광 퀸칭으로 인해 연속적으로 감소하여 단색의 청색 형광색의 강도가 감소한다. CD / Rh6G / GOx / HRP 수용액의 경우, 앞서 언급 한 바와 같이 CD 퀸칭 만이 존재하기 때문에 450nm 피크가 감소하고 550nm 피크가 Cg 증가에 따라 변하지 않는다.The sensitivity test was realized with a CD / Rh6G / GOx / HRP aqueous solution compared to a CD / GOx / HRP aqueous solution. For aqueous CD / GOx / HRP solutions, the intensity of the peak at 450 nm is continuously reduced due to fluorescence quenching, which reduces the intensity of the monochromatic blue fluorescent color. For CD / Rh6G / GOx / HRP aqueous solutions, as mentioned earlier, only CD quenching is present, so the 450nm peak decreases and the 550nm peak does not change with increasing Cg.

따라서 형광색은 Cg가 증가함에 따라 청색에서 녹색으로 연속적으로 변화하며, 글루코스의 존재는 차단 모드 (동일한 색상의 강도 감소) 대신 색상 변화에 의해 결정될 수 있음을 나타낸다. 형광 강도는 검출 한계 (LOD) 및 선형 범위를 계산하기 위해 분석하였다. 용액의 퀸칭은 CD / GOx / HRP 및 CD / Rh6G / GOx / LOD에 대해 LOD가 0.04 μM 및 LOD가 0.06 μM 인 선형 범위가 0.1 ~ 500 μM이되도록 Cg가 500 μM에 도달 할 때까지 선형으로 증가한다. HRP 수용액. Meng et al.은 Fe2 +의 존재하에 H2O2에 의해 퀸칭된 CD로 글루코오스 바이오 센서에 대한 논문을 보고하였으며, 우리의 데이터와 유사한 0.05 μM의 LOD로 0.05에서 500 μM의 선형 범위를 다룬다. The fluorescent color thus changes continuously from blue to green as Cg increases, indicating that the presence of glucose can be determined by color change instead of blocking mode (decrease in intensity of the same color). Fluorescence intensity was analyzed to calculate the limit of detection (LOD) and linear range. The quenching of the solution increases linearly until the Cg reaches 500 μM so that the linear range of 0.14 to 500 μM with LOD of 0.04 μM and LOD of 0.06 μM for CD / GOx / HRP and CD / Rh6G / GOx / LOD do. HRP aqueous solution. Meng et al. Reported a paper on glucose biosensors with CD quenched by H2O2 in the presence of Fe2 + and covers a linear range of 0.05 to 500 μM with a LOD of 0.05 μM similar to our data.

CD/Rh6G를 사용할 때의 장점 중 하나인GOx/HRP 수용액은 글루코오스 바이오 센서로서 550 nm의 불활성 피크를 기준 피크로 사용할 수 있다는 것이다. Qf 대신에 I450 / I550을 사용할 수 있으므로 글루코스 용액을 첨가하기 전의 초기 측정은 필요하지 않다. CD/Rh6G/GOx/HRP 수용액의 선택성은 혈액의 주요 성분을 사용하여 시험한다.One of the advantages of using CD / Rh6G, an aqueous solution of GOx / HRP, is a glucose biosensor that can use an inert peak of 550 nm as a reference peak. Since I450 / I550 can be used instead of Qf, no initial measurement before adding glucose solution is necessary. Selectivity of aqueous CD / Rh6G / GOx / HRP solutions is tested using the main components of blood.

글루코스를 첨가할 때를 제외하고는 거의 형광 퀀칭이 일어나지 않는다. AA와 유당은 심지어 형광 강도를 약간 증가시킨다. 이 결과는 CD/Rh6G/GOx/HRP 수용액이 글루코스에 대해 선택적임을 나타낸다.Almost no fluorescence quenching occurs except when glucose is added. AA and lactose even slightly increase fluorescence intensity. This result indicates that aqueous CD / Rh6G / GOx / HRP solution is selective for glucose.

<< 실시예Example 4>  4> 글루코스Glucose 바이오 센서 고체 필름의 성능 테스트 Performance test of biosensor solid film

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 상이한 Cgs를 갖는 글루코스 수용액 (2.9 mL)을 첨가 한 후 DAPEG/AA/A-CD/Rh6G/GOx/HRP 필름에 대한 상응하는 형광 이미지이다. 최적화된 DAPEG/AA/A-CD/Rh6G/GOx/HRP 필름으로 민감도 및 비율적 형광 색상 변화를 관찰했다. CD/Rh6G/GOx/HRP 수용액의 거동과 유사한 색 변화로 글루코스의 존재가 결정될 수 있음을 나타내는 Cg가 증가함에 따라 형광색이 청색에서 녹색으로 연속적으로 변화한다. 4 is a corresponding fluorescence image for DAPEG / AA / A-CD / Rh6G / GOx / HRP film after addition of aqueous glucose solution (2.9 mL) with different Cgs according to one embodiment of the present invention. Sensitivity and proportional fluorescence color changes were observed with optimized DAPEG / AA / A-CD / Rh6G / GOx / HRP films. Fluorescent color changes continuously from blue to green as Cg increases, indicating that the presence of glucose can be determined by color changes similar to the behavior of aqueous CD / Rh6G / GOx / HRP solutions.

형광 강도를 분석하여 LOD 및 선형 범위를 계산한다. Cg가 500μM에 도달 할 때까지 LOD 0.08 0.5-500μM의 선형 범위에 상응하여 μM에서 소광이 선형적으로 증가한다. 수용액에 대한 데이터와 유사하게, 글루코오스가 존재하는 경우를 제외하고는 거의 형광 소멸이 일어나지 않는다. 이 결과는 DAPEG / AA / A-CD / GOx / HRP 필름이 글루코스에 대해서도 선택성이 있음을 보여준다.Fluorescence intensity is analyzed to calculate LOD and linear range. The extinction increases linearly at μM, corresponding to the linear range of LOD 0.08 0.5-500μM until Cg reaches 500μM. Similar to the data for aqueous solutions, little fluorescence disappears except in the presence of glucose. This result shows that DAPEG / AA / A-CD / GOx / HRP films are also selective for glucose.

마지막으로, CD/Rh6G/GOx/HRP 수용액과 DAPEG/AA/A-CD/Rh6G/GOx/HRP 필름이 희석된 인간 혈장 혈청 (x40 의DI 물)에서 글루코스을 검출하는 능력을 테스트 하였다. 희석되지 않은 시료에서 글루코스의 원래 양은 HPLC로 측정했을 때 5.32 mM이었다. 따라서 큰 분자를 제거하기 위해 원심 분리 후 혈청 시료에 알려진 양의 글루코스을 첨가한다.Finally, the ability to detect glucose in diluted human plasma serum (x40 DI water) was tested with a CD / Rh6G / GOx / HRP aqueous solution and DAPEG / AA / A-CD / Rh6G / GOx / HRP film. The original amount of glucose in the undiluted sample was 5.32 mM as measured by HPLC. Therefore, a known amount of glucose is added to the serum sample after centrifugation to remove large molecules.

표 1은 인간 혈청 내 글루코스의 첨가 및 측정 된 양을 나타낸다. Table 1 shows the addition and measured amounts of glucose in human serum.

CD/Rh6G/GOx/HRP를 수용액을 사용한 Cg (첨가 글루코스) = 40 및 300 μM에서 혈청 샘플에 대해 109.36 % 및 104.73 %의 회수율 (측정 된 양 - 원래 양) / 첨가 된 양으로 결정됨)을 보인다. 글루코오스 바이오 센서는 실제 인간의 혈액 샘플할 경우 DAPEG/AA/A-CD/Rh6G/GOx/HRP 필름을 사용하여, Cg = 40 및 300 μM에서 각각 120.83 % 및 107.26 %의 회수율이 얻어졌다. 인간 혈청 내의 다른 생체 물질로부터의 간섭을 반영하여 100%의 편차가 관찰되었지만, 이러한 편차는 상대적으로 작다.CD / Rh6G / GOx / HRP shows recovery (determined amount-original amount) / added amount of 109.36% and 104.73% for serum samples at Cg (added glucose) = 40 and 300 μM with aqueous solution . The glucose biosensor used DAPEG / AA / A-CD / Rh6G / GOx / HRP films for real human blood samples, yielding 120.83% and 107.26% at Cg = 40 and 300 μM, respectively. Although a deviation of 100% was observed to reflect interference from other biomaterials in human serum, this deviation is relatively small.

SamplesSamples glucose
(μM)glucose
(μM) Recovery b (%)Recovery b (%) RSD c
(n=3, %)RSD c
(n = 3,%) Original a Original a AddedAdded MeasuredMeasured 1. (solution)1. (solution) 133133 4040 176.7176.7 102.1102.1 4.104.10 2. (solution)2. (solution) 133133 300300 447.2447.2 103.3103.3 2.712.71 3. (film)3. (film) 133133 4040 181.3181.3 104.8104.8 7.887.88 4. (film)4. (film) 133133 300300 454.8454.8 105.0105.0 4.164.16

CD/Rh6G/GOx/HRP 수용액 및 DAPEG/AA/A-CD/Rh6G/GOx/HRP 필름으로 측정한 인간 혈장 내의 글루코스량.Amount of glucose in human plasma as measured by CD / Rh6G / GOx / HRP aqueous solution and DAPEG / AA / A-CD / Rh6G / GOx / HRP film.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.So far, the present invention has been described based on the preferred embodiments. Those skilled in the art will understand that the present invention can be implemented in a modified form without departing from the essential characteristics of the present invention. Could be. Therefore, the disclosed embodiments should be considered in descriptive sense only and not for purposes of limitation. The scope of the present invention is shown in the claims rather than the foregoing description, and all differences within the scope will be construed as being included in the present invention.

Claims (10)

아크릴기를 포함하는 가교결합제를 포함하는 카본닷(CD);
상기 카본닷(CD)이 결합된 하이드로겔 필름;
상기 하이드로겔 필름에 상기 카본닷과 상이한 형광피크를 가지는 형광염료 및 GOx/HRP멀티효소 복합체;가 고정된 비색계 형광 글루코스 센서
Carbon dot (CD) including a crosslinking agent containing an acrylic group;
A hydrogel film to which the carbon dot (CD) is bonded;
Colorimetric fluorescent glucose sensor fixed; fluorescent dye and GOx / HRP multi-enzyme complex having a different fluorescent peak than the carbon dot on the hydrogel film
삭제delete 제 1항에 있어서, 상기 하이드로겔은 폴리아크릴산 (polyacrylic acid) 계열, 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 콜라겐, 피브린 및 히알루론산으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 주 사슬로 하는 것을 특징으로 하는 비색계 형광 글루코스 센서According to claim 1, wherein the hydrogel is a color-based fluorescent, characterized in that the main chain is any one selected from the group consisting of polyacrylic acid series, polyvinyl alcohol, collagen, fibrin and hyaluronic acid Glucose sensor 제 1항에 있어서, 상기 형광염료는 아크리딘 염료(Acridine dye), 시아닌 염료(Cyanine dye), 플루오론 염료(Fluorone dye), 옥사진 염료(Oxazin dye), 페난쓰리딘 염료(Phenanthridine dye) 및 로다민 염료(Rhodamine dye)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 비색계 형광 글루코스 센서The method of claim 1, wherein the fluorescent dye is acridine dye (Acridine dye), Cyanine dye (Cyanine dye), Fluorone dye (Fluorone dye), Oxazin dye (Oxazin dye), Phenanthridine dye (Phenanthridine dye) And a colorimetric fluorescent glucose sensor comprising any one selected from the group consisting of rhodamine dyes. (a) 카본닷(CD) 고정화를 위해 아크릴기를 포함하는 가교결합제를 추가하는 단계;
(b) 상기 가교결합제가 추가된 카본닷(CD)을 하이드로겔 필름에 고정하는 단계;
(c) 상기 하이드로겔 필름에 상기 카본닷과 상이한 형광 피크를 가지는 형광염료, 및 GOx/HRP멀티효소 복합체를 가교결합 하는 단계; 로 구성되는 비색계 형광 글루코스 센서의 제조방법(a) adding a crosslinking agent comprising an acrylic group for carbon dot (CD) immobilization;
(b) fixing the carbon dot (CD) added with the crosslinking agent to the hydrogel film;
(c) crosslinking a fluorescent dye having a different fluorescence peak from the carbon dot, and a GOx / HRP multienzyme complex on the hydrogel film; Method for manufacturing a colorimetric fluorescent glucose sensor composed of 제 5항에 있어서, 상기 카본닷(CD)은 바텀업(bottom-up) 방식에 의해 합성되는 것을 특징으로 하는 비색계 형광 글루코스 센서의 제조방법The method of manufacturing a colorimetric fluorescent glucose sensor according to claim 5, wherein the carbon dot is synthesized by a bottom-up method. 제 6항에 있어서, 상기 바텀업(bottom-up) 방식은 습식산화(wet oxidation) 마이크로웨이브(microwave) 고열 주입(hot-injection) 및 수열합성(hydrothermal)중의 어느 한 가지 방법을 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는 비색계 형광 글루코스 센서의 제조방법7. The bottom-up method according to claim 6, wherein the bottom-up method is performed by any one of wet oxidation microwave hot-injection and hydrothermal synthesis. Method for manufacturing a colorimetric fluorescent glucose sensor 삭제delete 제 5항에 있어서, 상기 가교결합은 자외선(UV) 자외선(UV), EDC, NHS, 탈수열건조법(dehydrothermal method) 및 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 한 가지 방법을 통해 고정화되는 비색계 형광 글루코스 센서 제조방법The method of claim 5, wherein the crosslinking is immobilized by at least one method selected from the group consisting of ultraviolet (UV) ultraviolet (UV), EDC, NHS, dehydrothermal method, and glutaraldehyde. Manufacturing method of colorimetric fluorescent glucose sensor 비례적인 형광변화를 갖는 비색계 형광 글루코스 센서의 분석방법에 있어서, 상기 비례적인 형광변화는, GOx/HRP멀티효소 복합체와 글루코스와의 이중효소 반응에 의한 카본닷(CD)의 소광과, 글루코스에 비활성이며 상기 카본닷과 상이한 형광 피크를 가지는 형광염료로부터 실현되는 것을 특징으로 하는 비색계 형광 글루코스 센서의 분석방법In the method for analyzing a colorimetric fluorescent glucose sensor having a proportional fluorescence change, the proportional fluorescence change is quenched by a carbon dot (CD) by a double enzyme reaction between GOx / HRP multienzyme complex and glucose and inactive to glucose. And a colorimetric fluorescent glucose sensor characterized in that it is realized from a fluorescent dye having a different fluorescence peak than the carbon dot.
KR1020180094645A 2018-08-13 2018-08-13 Carbon-Dot-Based Ratiometric Fluorescence Glucose Biosensor KR102052988B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180094645A KR102052988B1 (en) 2018-08-13 2018-08-13 Carbon-Dot-Based Ratiometric Fluorescence Glucose Biosensor

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180094645A KR102052988B1 (en) 2018-08-13 2018-08-13 Carbon-Dot-Based Ratiometric Fluorescence Glucose Biosensor

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR102052988B1 true KR102052988B1 (en) 2019-12-06

Family

ID=68837056

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180094645A KR102052988B1 (en) 2018-08-13 2018-08-13 Carbon-Dot-Based Ratiometric Fluorescence Glucose Biosensor

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102052988B1 (en)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113249426A (en) * 2021-05-11 2021-08-13 四川大学 Preparation method of collagen-based glucose fluorescent sensitive membrane
CN113640258A (en) * 2021-06-29 2021-11-12 北京农业信息技术研究中心 Thin film type fluorescence sensor and preparation method and application thereof
CN114441489A (en) * 2021-12-24 2022-05-06 郑州大学 Preparation method of ratio-type fluorescent biological probe based on fluorescent microspheres and carbon dots and application of ratio-type fluorescent biological probe in concanavalin A detection
CN115057428A (en) * 2022-06-02 2022-09-16 中国科学院合肥物质科学研究院 Hydrophobic near-infrared emission carbon quantum dot and preparation method and application thereof
CN115818623A (en) * 2022-12-09 2023-03-21 山东大学 Folic acid-iron porphyrin carbonized polymer dot and preparation method and application thereof
CN116285976A (en) * 2023-03-28 2023-06-23 云南大学 Material for detecting glucose and dual-mode signal detection method
CN117070213A (en) * 2023-08-21 2023-11-17 扬州大学 Gold amine O response type ratio type fluorescent probe based on fluorescent carbon dots and visual test strip and application thereof

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ACS Appl. Mater. Interfaces, Vol. 9, pp. 24169-24178 (2017.06.27.) *
Anal. Methods, Vol. 6, pp. 1922-1927 (2014.) *
Biosensors and Bioelectronics, Vol. 86, pp. 530-535 (2016.07.09.) *
Fluorescent Carbon Nanoparticles: Synthesis, Characterization, and Bioimaging Application(S C Ray et al, J Phys ChemC 2009, 113, 18546 )
J. Phys. Chem. C, Vol. 119, pp. 7865-7872 (2015.03.18.) *
Luminescent carbon nanodots: emergent nanolights.(S N Baker et al, Angew Chem Int Ed 2010, 49, 6726 )

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113249426A (en) * 2021-05-11 2021-08-13 四川大学 Preparation method of collagen-based glucose fluorescent sensitive membrane
CN113640258A (en) * 2021-06-29 2021-11-12 北京农业信息技术研究中心 Thin film type fluorescence sensor and preparation method and application thereof
CN114441489A (en) * 2021-12-24 2022-05-06 郑州大学 Preparation method of ratio-type fluorescent biological probe based on fluorescent microspheres and carbon dots and application of ratio-type fluorescent biological probe in concanavalin A detection
CN115057428A (en) * 2022-06-02 2022-09-16 中国科学院合肥物质科学研究院 Hydrophobic near-infrared emission carbon quantum dot and preparation method and application thereof
CN115057428B (en) * 2022-06-02 2024-02-06 中国科学院合肥物质科学研究院 Hydrophobic near-infrared emission carbon quantum dot and preparation method and application thereof
CN115818623A (en) * 2022-12-09 2023-03-21 山东大学 Folic acid-iron porphyrin carbonized polymer dot and preparation method and application thereof
CN115818623B (en) * 2022-12-09 2024-02-23 山东大学 Folic acid-iron porphyrin carbonized polymer dot and preparation method and application thereof
CN116285976A (en) * 2023-03-28 2023-06-23 云南大学 Material for detecting glucose and dual-mode signal detection method
CN116285976B (en) * 2023-03-28 2024-03-26 云南大学 Material for detecting glucose and dual-mode signal detection method
CN117070213A (en) * 2023-08-21 2023-11-17 扬州大学 Gold amine O response type ratio type fluorescent probe based on fluorescent carbon dots and visual test strip and application thereof

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102052988B1 (en) Carbon-Dot-Based Ratiometric Fluorescence Glucose Biosensor
EP2292626B1 (en) Detection of analytes in aqueous environments
EP1960779B1 (en) Optical determination of glucose utilizing boronic acid adducts-ii
US7390462B2 (en) Ratiometric fluorescent pH sensor for non-invasive monitoring
Miyata Preparation of smart soft materials using molecular complexes
Hansen et al. Arylboronic acids: A diabetic eye on glucose sensing
US6485703B1 (en) Compositions and methods for analyte detection
CN111801425B (en) Biocompatible coating for continuous analyte measurement
Fortin et al. Glucose monitoring using a polymer brush modified polypropylene hollow fiber-based hydraulic flow sensor
KR101747812B1 (en) Carbon dot-hemoglobin complex for detecting cholesterol
Kim et al. d-Glucose recognition based on phenylboronic acid-functionalized polyoligomeric silsesquioxane fluorescent probe
Çubuk et al. Development of photopolymerized fluorescence sensor for glucose analysis
Chaudhary et al. Evaluation of glucose sensitive affinity binding assay entrapped in fluorescent dissolved‐core alginate microspheres
Dey et al. Surface engineered PLGA nanoparticle for threshold responsive glucose monitoring and “self-programmed” insulin delivery
US8389290B2 (en) Biosensor device for sensing amphipathic analytes
Badugu et al. A glucose-sensing contact lens: a new approach to noninvasive continuous physiological glucose monitoring
Unal et al. Novel fluorescence assay using µ-wells coated by BODIPY dye as an enzymatic sensing platform
US10400233B2 (en) High load enzyme immobilization by crosslinking
KR101782949B1 (en) Liquid crystal-based glucose biosensor functionalized with mixed PAA and QP4VP brushes
JP2023510365A (en) holographic sensor
Cote et al. Fluorescence‐based glucose biosensors
WO2018135535A1 (en) Fluorescent gel for glucose detection and continuous glucose monitoring method using same
Mincke Development and characterization of
Pick et al. Photopatternable hydrogel materials for reversible optical hydrogen peroxide and glucose sensors
Liao Particle sensors based on amplified quenching of conjugated polymers for biosensing applications

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant