KR102021537B1 - A rapid diagnosis kit for diagnosis of yellow fever virus infection and a yellow fever virus detection method using thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 황열 바이러스 감염 진단용 신속진단키트 및 이를 이용한 황열 바이러스 검출방법에 관한 것으로, 구체적으로 황열 바이러스의 NS1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체; 상기 단일클론항체를 포함하는 황열 바이러스 감염 진단용 조성물; 상기 단일클론항체를 생산하는 융합 세포주; 상기 단일클론항체를 포함하는 황열 바이러스 감염 진단용 키트; 상기 단일클론항체를 이용하여 황열 바이러스 감염 진단용 키트를 제작하는 방법; 상기 키트를 이용하여 황열 바이러스 감염 여부를 진단하는 방법; 및 상기 키트를 이용하여 황열 바이러스를 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 황열 바이러스 NS1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 상기 NS1 단백질에 민감도 및 특이도가 우수하므로 황열 바이러스의 감염 여부를 신속하게 진단하는 키트 등에 활용될 수 있다. 또한, 상기 단일클론항체는 뎅기, 지카, 치쿤쿠니아 또는 마이야로 등 다른 유사 바이러스와 교차반응이 일어나지 않아, 진단 키트의 민감도와 정확도를 획기적으로 높일 수 있다.The present invention relates to a rapid diagnostic kit for yellow fever virus infection diagnosis and a yellow fever virus detection method using the same, specifically a monoclonal antibody specifically binding to NS1 protein of yellow fever virus; Yellow fever virus infection diagnostic composition comprising the monoclonal antibody; A fusion cell line producing the monoclonal antibody; Yellow fever virus infection diagnostic kit comprising the monoclonal antibody; A method for preparing a yellow fever virus infection diagnosis kit using the monoclonal antibody; A method for diagnosing yellow fever virus infection using the kit; And a method for detecting a yellow fever virus using the kit.
The monoclonal antibody specifically binding to the yellow fever virus NS1 protein of the present invention can be used for kits for rapidly diagnosing yellow fever virus infection because of its excellent sensitivity and specificity. In addition, the monoclonal antibody does not cross-react with other similar viruses such as Dengue, Zika, Chikunkunia or Mayaro, thereby dramatically increasing the sensitivity and accuracy of the diagnostic kit.
Description
본 발명은 황열 바이러스 감염 진단용 신속진단키트 및 이를 이용한 황열 바이러스 검출방법에 관한 것으로, 구체적으로 황열 바이러스의 NS1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체; 상기 단일클론항체를 포함하는 황열 바이러스 감염 진단용 조성물; 상기 단일클론항체를 생산하는 융합 세포주; 상기 단일클론항체를 포함하는 황열 바이러스 감염 진단용 키트; 상기 단일클론항체를 이용하여 황열 바이러스 감염 진단용 키트를 제작하는 방법; 상기 키트를 이용하여 황열 바이러스 감염 여부를 진단하는 방법; 및 상기 키트를 이용하여 황열 바이러스를 검출하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a rapid diagnostic kit for yellow fever virus infection diagnosis and a yellow fever virus detection method using the same, specifically a monoclonal antibody specifically binding to NS1 protein of yellow fever virus; Yellow fever virus infection diagnostic composition comprising the monoclonal antibody; A fusion cell line producing the monoclonal antibody; Yellow fever virus infection diagnostic kit comprising the monoclonal antibody; A method for preparing a yellow fever virus infection diagnosis kit using the monoclonal antibody; A method for diagnosing yellow fever virus infection using the kit; And a method for detecting a yellow fever virus using the kit.
황열 바이러스(yellow fever virus, YFV)는 플라비바이러스 속에 속하는 바이러스로 주로 모기에 의해서 전파되며, 인간뿐만 아니라 마우스, 기니픽 및 원숭이 등에 모두 감염력을 갖는다. 황열 바이러스의 잠복기는 3~6일로 알려져 있으며, 이에 감염되는 경우 무증상이나 가벼운 증상을 나타낼 수도 있으나, 감염자의 20~50%가 발병 후 7∼10일 이내에 사망에 이른다. 따라서, 감염이 의심되는 경우 빠른 진단 및 치료가 중요하다.Yellow fever virus (YFV) is a flavivirus belonging to the genus, mainly transmitted by mosquitoes, and infects not only humans, but also mice, guinea pigs and monkeys. The incubation period of yellow fever virus is known to be 3 to 6 days, and if infected, it may show asymptomatic or mild symptoms, but 20 to 50% of infected people die within 7 to 10 days after onset. Therefore, early diagnosis and treatment are important if infection is suspected.
황열 바이러스 감염 여부를 확인하는 방법으로는 혈액에서 황열 바이러스의 유전자를 검출하는 방법, 혈청에서 황열 바이러스에 대한 항체를 검출하는 방법 등이 있다. 상기 유전자 검출 검사는 진단 결과가 정확하다는 장점이 있으나, 숙련된 실험자가 필요하며, 고가의 장비가 요구된다는 단점이 있다. As a method of identifying yellow fever virus infection, there is a method of detecting a gene of yellow fever virus in blood, and a method of detecting an antibody against yellow fever virus in serum. The gene detection test has the advantage that the diagnosis result is accurate, but there is a disadvantage that requires a skilled experimenter, expensive equipment is required.
따라서, 혈구응집억제시험법, 보체결합시험법, 중화항체역가측정시험법, 면역형광항체시법, IgM-포획효소면역측정법, IgG ELISA 등 조작이 비교적 간단한 혈청학적인 진단 방법의 개발이 활발히 이루어지고 있다. 관련하여, 면역형광항체법을 이용하여 황열바이러스, 일본뇌염바이러스 등을 동시에 검출할 수 있는 항원슬라이드(한국등록특허 제10-0968063호) 등이 개발된바 있다. 그러나, 상술한 방법들은 진단에 시간이 오래 걸린다는 단점(수 시간 정도)이 있어 일반적인 진단법으로 사용하기는 어려운 실정이었다.Therefore, the development of relatively simple serological diagnostic methods such as hemagglutination inhibition assay, complement binding assay, neutralizing antibody titer assay, immunofluorescent antibody assay, IgM-capture enzyme immunoassay, IgG ELISA, etc. have. In relation to this, antigen slides (Korean Patent No. 10-0968063) which can simultaneously detect yellow fever virus, Japanese encephalitis virus, etc. using immunofluorescent antibody method have been developed. However, the above-described methods are difficult to use as a general diagnostic method due to the disadvantage that the diagnosis takes a long time (about a few hours).
이러한 배경하에, 본 발명자들은 수 분 이내에 황열 바이러스를 신속 진단하는 방법을 개발하고자 예의 노력 연구한 결과, 황열 바이러스의 NS1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제조하였고, 이를 활용한 진단 키트는 높은 민감도 및 특이도로 교차 반응 없이 황열 바이러스의 감염 여부를 빠르게 진단할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.Against this background, the present inventors have made diligent efforts to develop a method for rapidly diagnosing yellow fever virus within a few minutes. As a result, we have prepared a monoclonal antibody that specifically binds to NS1 protein of yellow fever virus. With high sensitivity and specificity, it was confirmed that the infection of yellow fever virus can be diagnosed quickly without cross reaction, thereby completing the present invention.
본 발명의 하나의 목적은 황열 바이러스의 NS1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공하는 것이다.One object of the present invention is to provide a monoclonal antibody that specifically binds to NS1 protein of yellow fever virus.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 단일클론항체를 포함하는 황열 바이러스 감염 진단용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing yellow fever virus infection comprising the monoclonal antibody.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 단일클론항체를 생산하는 융합 세포주를 제공하는 것이다.Yet another object of the present invention is to provide a fusion cell line producing the monoclonal antibody.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 단일클론항체를 포함하는 황열 바이러스 감염 진단용 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention to provide a kit for diagnosing yellow fever virus infection comprising the monoclonal antibody.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 단일클론항체를 이용하여 황열 바이러스 감염 진단용 키트를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention to provide a method for producing a yellow fever virus infection diagnostic kit using the monoclonal antibody.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 키트를 이용하여 황열 바이러스 감염 여부를 판단하기 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.Yet another object of the present invention is to provide a method of providing information for determining yellow fever virus infection using the kit.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 키트를 이용하여 황열 바이러스 감염 여부를 진단하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention to provide a method for diagnosing yellow fever virus infection using the kit.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 키트를 이용하여 황열 바이러스를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.Yet another object of the present invention is to provide a method for detecting yellow fever virus using the kit.
본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.Each description and embodiment disclosed in the present invention may be applied to each other description and embodiment. That is, all combinations of the various elements disclosed in the present invention fall within the scope of the present invention. In addition, the scope of the present invention is not to be limited by the specific description described below.
본 발명의 하나의 양태는 황열 바이러스의 NS1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공한다.One aspect of the invention provides monoclonal antibodies that specifically bind to NS1 protein of yellow fever virus.
본 발명의 용어, "황열 바이러스"(yellow fever virus, YFV)는 플라비바이러스(Flavivirus) 속에 속하는 바이러스로서, 직경은 18~25 ㎚이며, 유전자는 비분절 단일가닥 (+)RNA로 크기는 약 11 kb 정도로 알려져 있다. 다른 플라비바이러스 속의 바이러스와 마찬가지로 5'과 3' 말단에 각각 약 100개의 염기와 약 600개 염기의 비암호화 부위(noncoding region, NCR)를 가지고 있다. The term “yellow fever virus” (YFV) is a virus belonging to the genus Flavivirus, whose diameter is 18-25 nm, and the gene is a non-segmented single stranded (+) RNA. It is known as about 11 kb. Like other flaviviruses, it has a noncoding region (NCR) of about 100 bases and about 600 bases at the 5 'and 3' ends, respectively.
본 발명의 용어, "황열 바이러스의 NS1 단백질"은 황열 바이러스가 발현하는 비구조 단백질을 의미한다. 황열 바이러스는 3개의 구조 단백질(capsid(C), pre-membrane(prM), envelope(E))과 7개의 비구조 단백질(NS1, N2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5)을 만들며, NS1, NS3, NS5 등 일부 단백질을 제외하고는 단백질의 특성이 자세히 밝혀져 있지 않다. NS1 단백질은 약 50 kDa의 당단백질(glycoprotein)로 바이러스 RNA의 복제(replication)와 관련 있는 것으로 알려져 있다. NS1 단백질은 감염된 세포에서 세포 밖으로 분비되는 형태이며, 바이러스 감염 환자의 혈액에서 관찰될 정도로 높은 농도로 분비된다. 감염 후 9일 까지도 혈액에서 관찰되기 때문에 황열 바이러스의 감염을 진단하기 위한 좋은 후보물질로 알려져 있다.As used herein, the term “NS1 protein of yellow fever virus” refers to a nonstructural protein expressed by yellow fever virus. Yellow fever virus produces three structural proteins (capsid (C), pre-membrane (prM), envelope (E)) and seven nonstructural proteins (NS1, N2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5), NS1 Except for some proteins, such as NS3 and NS5, the properties of the protein are not detailed. The NS1 protein is a glycoprotein of about 50 kDa and is known to be involved in the replication of viral RNA. NS1 protein is a form secreted out of cells in infected cells and secreted at a concentration high enough to be observed in the blood of virus infected patients. Since it is observed in the blood up to 9 days after infection, it is a good candidate for diagnosing yellow fever infection.
본 발명에서, 상기 황열 바이러스의 NS1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.In the present invention, the NS1 protein of the yellow fever virus may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
본 발명에서 이용되는 서열은, 생물학적으로 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기 용어, '실질적인 동일성'은 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 더욱 구체적으로 70%의 상동성, 더더욱 구체적으로 80%의 상동성, 가장 구체적으로 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.The sequences used in the present invention are to be construed to include sequences that exhibit substantial identity with the sequences listed in the Sequence Listing, in view of variations that are biologically equivalent. The term 'substantial identity' means that if the alignment of the sequence of the present invention with any other sequence is maximally matched, the aligned sequence is analyzed using algorithms commonly used in the art. By 60% homology, more specifically 70% homology, even more specifically 80% homology, most specifically 90% homology.
따라서, 상기 서열번호 1로 표시되는 서열과 높은 상동성을 갖는 아미노산 서열, 예를 들면 그 상동성이 70% 이상, 구체적으로 80% 이상, 더욱 구체적으로 90% 이상의 높은 상동성을 갖는 아미노산 서열도 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.Therefore, an amino acid sequence having high homology with the sequence represented by SEQ ID NO: 1, for example, an amino acid sequence having a high homology of 70% or more, specifically 80% or more, more specifically 90% or more. It should be construed as being included in the scope of the present invention.
본 발명의 용어, "황열 바이러스의 NS1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체"는 상기 NS1 단백질에 특이적으로 결합함으로써 결국 황열 바이러스에 결합하여 이를 검출할 수 있는 항체를 의미한다. As used herein, the term “monoclonal antibody that specifically binds to NS1 protein of yellow fever virus” refers to an antibody that specifically binds to the NS1 protein and eventually binds to and detects yellow fever virus.
상기 단일클론항체를 생산하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당업계에 알려진 일반적인 방법으로 제조될 수 있다. 일 예로서, 화학적 펩티드 합성방법으로 제조될 수 있고, 상기 단일클론 항체를 코딩하는 유전자를 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝하여 발현시켜서 제조될 수도 있으며, 상기 단일클론 항체의 면역원을 동물에 주사하여 얻어진 림프구로부터 유래된 하이브리도마 세포주를 사용하여 제조될 수도 있고, 다른 예로서, 상기 단일클론항체가 특이적으로 결합하는 미분화된 치수줄기세포로부터 유래된 단백질을 면역원으로 동물에 접종하고, 상기 동물로부터 얻어진 림프구를 사용하여 제작된 하이브리도마 세포주를 사용하여 제조될 수도 있다.The method for producing the monoclonal antibody is not particularly limited and may be prepared by general methods known in the art. As an example, the peptide may be prepared by a chemical peptide synthesis method, or may be prepared by amplifying a gene encoding the monoclonal antibody by PCR (polymerase chain reaction) or by synthesizing by a known method, followed by cloning into an expression vector. It may be prepared using a hybridoma cell line derived from lymphocytes obtained by injecting an immunogen of the monoclonal antibody into the animal, and as another example, from undifferentiated pulp stem cells to which the monoclonal antibody specifically binds The derived protein may be inoculated into an animal with an immunogen and prepared using a hybridoma cell line constructed using lymphocytes obtained from the animal.
구체적으로, 본 발명의 방법에 의하여 제조된 단일클론항체는 통상적인 단일클론항체와 마찬가지로, 2개의 전체 길이의 중쇄 및 2개의 전체 길이의 경쇄로 구성될 수 있다. 이때, 상기 중쇄 및 경쇄는 특별히 제한되지 않는다. Specifically, monoclonal antibodies prepared by the method of the present invention may be composed of two full length heavy chains and two full length light chains, similar to conventional monoclonal antibodies. At this time, the heavy and light chains are not particularly limited.
또한, 상기 단일클론항체를 구성하는 일부 아미노산 서열이 변이된 형태가 될 수 있다. 단백질 및 폴리펩티드에서, 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이며, 이러한 교환에 의하여 본 발명에서 제공하는 단일클론항체의 아미노산 서열로부터 변이된 서열의 단일클론항체가 본 발명의 범주에 포함될 수 있다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 상기 단일클론항체의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 항체 활성이 증가한 변이된 단일클론항체 역시 본 발명의 범주에 포함될 수 있다. In addition, some amino acid sequences constituting the monoclonal antibody may be in a modified form. In proteins and polypeptides, amino acid exchanges that do not alter the activity of the molecule as a whole are known in the art. The most commonly occurring exchanges are amino acid residues Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Thy / Phe, Ala / It is an exchange between Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / Ile, Leu / Val, Ala / Glu, Asp / Gly, and by such exchange a single sequence of sequences mutated from the amino acid sequence of the monoclonal antibody provided herein Clonal antibodies can be included within the scope of the present invention. In addition, a mutated monoclonal antibody in which the structural stability to the heat, pH, etc. of the monoclonal antibody is increased or the antibody activity is increased by a mutation or modification on the amino acid sequence may also be included in the scope of the present invention.
본 발명의 용어, "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 다클론항체, 단일클론항체, 전체(whole) 항체 및 항체 단편을 모두 포함한다. As used herein, the term “antibody” refers to a protein molecule that acts as a receptor that specifically recognizes an antigen, including an immunoglobulin molecule that is immunologically reactive with a specific antigen, including polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, It includes both whole antibodies and antibody fragments.
또한, 상기 항체는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이가(bivalent) 또는 이중특이성 분자(예를 들어, 이중특이성 항체), 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 포함한다. 추가로, FcRn에 대한 결합 기능을 보유한 단쇄 항체, 스캡, 항체 불변영역의 유사체 및 단백질 스캐폴드에 기초한 인공 항체를 포함한다. The antibodies also include chimeric antibodies (eg, humanized murine antibodies) and bivalent or bispecific molecules (eg, bispecific antibodies), diabodies, triabodies, and tetrabodies. In addition, single-chain antibodies with a binding function to FcRn, caps, analogs of antibody constant regions, and artificial antibodies based on protein scaffolds.
상기 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 구체적으로, 본 발명의 항체는 IgG1 또는 IgG2a의 면역글로불린 아이소타입일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The total antibody has a structure having two full length light chains and two full length heavy chains, and each light chain is linked by a heavy chain and a disulfide bond. The total antibody includes IgA, IgD, IgE, IgM and IgG, and IgG is a subtype, including IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4. Specifically, the antibody of the present invention may be an immunoglobulin isotype of IgG1 or IgG2a, but is not limited thereto.
또한, 상기 경쇄 및 중쇄는 불변 영역 및 가변 영역(상기 부위는 도메인으로 또한 알려져 있음)을 포함하며, 상기 가변 영역은 상보성 결정 영역(complementarity-determining region, 이하 "CDR"이라 함)이라 불리우는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 구조 영역(framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프(epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 불리우고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.In addition, the light and heavy chains comprise a constant region and a variable region (wherein the region is also known as a domain), wherein the variable region is referred to as a complementarity-determining region (hereinafter referred to as "CDR"). It includes a variable region and four framework regions. The CDRs mainly serve to bind epitopes of antigens. The CDRs of each chain are typically called CDR1, CDR2, CDR3, starting sequentially from the N-terminus and also identified by the chain in which the particular CDR is located.
상기 항체 단편은 항원결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fd, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 상기 Fd는 Fab 단편에 포함되어 있는 중쇄 부분을 의미한다. 상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1 도메인)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv(variable fragment)는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각을 의미한다. 이중디설파이드 Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. The antibody fragment refers to a fragment having an antigen binding function, and includes Fd, Fab, Fab ', F (ab') 2 and Fv. Fd means the heavy chain portion included in the Fab fragment. The Fab has one antigen binding site in a structure having a variable region of the light and heavy chains, a constant region of the light chain, and a first constant region of the heavy chain (CH1 domain). Fab 'differs from Fab in that it has a hinge region comprising at least one cysteine residue at the C terminus of the heavy chain CH1 domain. F (ab ') 2 antibodies are produced when the cysteine residues of the hinge region of Fab' form disulfide bonds. Fv (variable fragment) means a minimum antibody fragment having only the heavy chain variable region and light chain variable region. Double disulfide Fv (dsFv) is a disulfide bond is linked to a heavy chain variable region and a light chain variable region, and short chain Fv (scFv) is a covalent linkage between the variable region of the heavy chain and the light chain through a peptide linker.
구체적으로, 본 발명의 항체는 단일클론항체일 수 있으며, IgG1 또는 IgG2a의 면역글로불린 아이소타입일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Specifically, the antibody of the present invention may be a monoclonal antibody, and may be an immunoglobulin isotype of IgG1 or IgG2a, but is not limited thereto.
또한, 상기 단일클론항체는, 본 명세서에서 'C06M', 'C07M', 'C08M', 'C09M', 'C10M', 'C11M', 'C12M' 등으로 명명될 수 있다. 본 발명의 목적상, 상기 단일클론항체 중 황열 바이러스 NS1 단백질에 대한 결합 친화도가 특히 높은 것은 C08M 또는 C09M일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In addition, the monoclonal antibody may be named herein as 'C06M', 'C07M', 'C08M', 'C09M', 'C10M', 'C11M', 'C12M' and the like. For the purposes of the present invention, the binding affinity for the yellow fever virus NS1 protein among the monoclonal antibodies may be particularly high, but may be C08M or C09M, but is not limited thereto.
더욱 구체적으로, 상기 C08M은 IgG1, 상기 C09M는 IgG2a일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.More specifically, the C08M may be IgG1, the C09M may be IgG2a, but is not limited thereto.
본 발명에서, 상기 단일클론항체는 기탁번호 KCTC 13461BP 또는 기탁번호 KCTC 13462BP의 융합 세포주에서 생산되는 것일 수 있다.In the present invention, the monoclonal antibody may be produced in a fusion cell line of Accession No. KCTC 13461BP or Accession No. KCTC 13462BP.
본 발명의 용어, "융합 세포주"는 2개의 다른 종류의 세포를 인공적으로 융합시켜 만든 세포로, 폴리에틸렌글리콜 등 세포융합을 일으키게 하는 물질이나 어떤 종의 바이러스를 사용하여 둘 이상의 동종 세포나 이종 세포가 융합되어, 각기 다른 세포가 갖는 다른 기능을 하나의 세포 속에 통합시킨 세포 또는 세포주를 의미한다. 특히, 골수종 세포(myeloma cell)와 비장이나 림프절에 들어 있는 림프구 가운데 항체 생성세포의 선구세포인 B세포를 융합시킨 잡종세포는 단일클론항체를 만들어내므로 연구와 임상에 널리 응용된다. 그 밖에 림포카인(생리활성물질)을 만들어내는 T세포와 그 종양세포인 하이브리드마 등도 실용화되고 있다. As used herein, the term "fusion cell line" refers to a cell made by artificially fusion of two different cell types, wherein two or more homologous or heterologous cells are formed by using a substance or a virus that causes cell fusion, such as polyethylene glycol. By fusion, a cell or cell line incorporating different functions of different cells into one cell. In particular, hybrid cells in which myeloma cells and B cells, which are precursor cells of antibody-producing cells, are fused among myeloma cells and lymphocytes in the spleen or lymph nodes, are widely used in research and clinical practice. In addition, T cells producing lymphokines (physiologically active substances) and hybrid horses, which are tumor cells thereof, have been put into practical use.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 황열 바이러스로 면역화된 마우스의 비장 세포와 골수종 세포를 혼합하여 배양함으로써 융합 세포주를 제조하였고, 이를 마우스의 복수액에서 배양함으로써 단일클론항체를 대량 생산하였다. 또한, 상기 융합 세포주 중에서, 황열 바이러스 NS1 단백질에 대한 결합 친화도가 높은 단일클론항체 C08M을 분비하는 융합 세포주를 수탁번호 KCTC 13461BP로, 단일클론항체 C09M을 분비하는 융합 세포주를 수탁번호 KCTC 13462BP로서 2018년 1월 18일자로 수탁기관인 한국생명공학연구원에 기탁하였다(실시예 1 및 2). In a specific embodiment of the present invention, a fusion cell line was prepared by mixing and culturing splenocytes and myeloma cells of mice immunized with yellow fever virus, and mass-producing monoclonal antibodies by culturing them in ascites fluid of mice. Also, among the fusion cell lines, a fusion cell line secreting monoclonal antibody C08M having a high affinity for yellow fever virus NS1 protein under accession number KCTC 13461BP, and a fusion cell line secreting monoclonal antibody C09M as accession number KCTC 13462BP 2018. It was deposited on January 18, 18, at the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (Examples 1 and 2).
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 단일클론항체를 포함하는 황열 바이러스 감염 진단용 조성물을 제공한다.Another aspect of the invention provides a composition for diagnosing yellow fever virus infection comprising the monoclonal antibody.
이때, 상기 "단일클론항체" 및 "황열 바이러스"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.At this time, the description of the "monoclonal antibody" and "yellow fever virus" is as described above.
본 발명의 황열 바이러스 감염 진단용 조성물은 황열 바이러스의 NS1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하므로, NS1 단백질의 발현 여부나 발현 정도로 확인할 수 있는 황열 바이러스 감염의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.Yellow fever virus infection diagnostic composition of the present invention includes an antibody that specifically binds to NS1 protein of yellow fever virus, it can be usefully used for the diagnosis of yellow fever virus infection that can be confirmed whether or not the expression of NS1 protein.
본 발명의 용어, "황열 바이러스 감염"은 황열 바이러스에 감염되거나, 감염되어 이상 증상을 나타내는 상태를 의미하며, "황열", "황열병", "황열 바이러스 감염병" 등과 호용되어 사용될 수 있다. 황열 바이러스 감염은 주로 모기(Aedes agypti, Aedes sp., Haemogogus sp. 등)에 의해서 전파된다. 황열 바이러스의 잠복기는 3~6일로 알려져 있으며, 임상증세는 무증상 또는 가볍게 지나는 경우에서부터 중증으로 발전하는 경우까지 다양하게 나타난다. 중증으로 발전하는 환자는 약 3일 정도 발열, 오한, 두통 및 오심, 구토 등의 증세를 보이다가 발병 후 4일 정도가 지나면 발열과 맥박이 100 이상으로 빨라지며 구토가 잦아지고 이로 인한 탈수가 생기면서 황달이 나타난다. 이 시기 환자의 경우 뚜렷한 단백뇨와 출혈 증상이 나타나며 구토물은 파괴된 혈액으로 인해 검게 변색되고 림프구 감소도 보이며 20~50%가 발병 후 7~10일 이내에 사망에 이른다. 다만, 회복되는 경우 증상의 경중에 관계없이 후유증은 없는 것으로 알려져 있다.As used herein, the term "yellow fever virus infection" refers to a condition in which a yellow fever virus is infected or infected to exhibit abnormal symptoms, and may be used interchangeably with "yellow fever", "yellow fever", "yellow fever virus infection", and the like. Yellow fever virus infection is mainly transmitted by mosquitoes ( Aedes agypti , Aedes sp ., Haemogogus sp ., Etc.). The incubation period of yellow fever virus is known to be 3 to 6 days, and clinical symptoms range from asymptomatic or mild to severe to severe. Patients who develop severely develop symptoms such as fever, chills, headache, nausea and vomiting for about 3 days, and after 4 days of onset, fever and pulse become more than 100, vomiting becomes frequent, and dehydration is caused. Jaundice appears. Patients at this time show pronounced proteinuria and bleeding symptoms, vomiting is blackened due to destroyed blood, lymphocytes are reduced, and 20-50% die within 7-10 days of onset. However, it is known that there is no sequelae, regardless of the severity of symptoms.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 단일클론항체를 생산하는 융합 세포주를 제공한다.Another embodiment of the present invention provides a fusion cell line producing the monoclonal antibody.
이때, 상기 "단일클론항체" 및 "융합 세포주"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.At this time, the description of the "monoclonal antibody" and "fusion cell line" is as described above.
구체적으로, 상기 융합 세포주는 기탁번호 KCTC 13461BP 또는 기탁번호 KCTC 13462BP로 기탁된 것일 수 있다. 상기 융합 세포주는 시험관 내 또는 생체 내에서 대량으로 배양할 수 있다. Specifically, the fusion cell line may be deposited with accession number KCTC 13461BP or accession number KCTC 13462BP. The fusion cell line may be cultured in large quantities in vitro or in vivo.
또한, 상기의 융합 세포주가 생산하는 단일클론항체는 정제하지 않고 사용할 수 있으며, 당업계에 잘 알려져 있는 방법에 따라 고순도(예컨대, 95% 이상)로 정제하여 사용할 수도 있다. 이러한 정제 기술로는, 예를 들어 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 크로마토그래피 등의 정제 방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액(ascites fluid)으로부터 분리될 수 있다.In addition, the monoclonal antibodies produced by the above fusion cell line can be used without purification, and can be purified and used in high purity (eg, 95% or more) according to methods well known in the art. Such purification techniques can be separated from the culture medium or ascites fluid using purification methods such as, for example, gel electrophoresis, dialysis, salt precipitation, chromatography.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 단일클론항체를 포함하는 황열 바이러스 감염 진단용 키트를 제공한다.Another aspect of the invention provides a kit for diagnosing yellow fever virus infection comprising the monoclonal antibody.
이때, 상기 "단일클론항체" 및 "황열 바이러스 감염"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.At this time, the description of the "monoclonal antibody" and "yellow fever virus infection" is as described above.
구체적인 실시 양태로서, 상기 키트는 (a) 상기 단일클론항체 및 대조군 항체가 고정화된 멤브레인; (b) 상기 단일클론항체 및 금이 결합된 접합체를 포함하는 축합 패드; (c) 완충용액을 포함하는 버퍼 패드; 및 (d) 흡수 패드를 포함할 수 있다. In a specific embodiment, the kit comprises: (a) a membrane to which the monoclonal antibody and a control antibody are immobilized; (b) a condensation pad comprising the conjugate to which said monoclonal antibody and gold are bound; (c) a buffer pad containing a buffer solution; And (d) absorbent pads.
구체적으로, 상기 멤브레인은 본 발명의 단일클론항체 및 대조군 항체를 고정화하도록 구성될 수 있다.Specifically, the membrane may be configured to immobilize monoclonal and control antibodies of the invention.
본 발명의 목적상, 상기 단일클론항체는 키트를 이용한 진단 시 시료 내에 포함되어 있을 수 있는 황열 바이러스의 NS1 단백질에 결합하는 역할을 한다. 즉, 상기 단일클론항체는 상기 NS1 단백질에 결합함으로써 황열 바이러스의 존재 여부를 확인하는데 사용된다. 한편, 상기 대조군 항체는 상기 NS1 단백질과는 결합하지 않는다.For the purposes of the present invention, the monoclonal antibody binds to the NS1 protein of yellow fever virus, which may be included in the sample when diagnosed using the kit. That is, the monoclonal antibody is used to confirm the presence of yellow fever virus by binding to the NS1 protein. On the other hand, the control antibody does not bind to the NS1 protein.
아울러, 상기 멤브레인은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 항체가 결합될 수 있는 니트로셀룰로오스 멤브레인, PVDF(polyvinylidene fluoride) 멤브레인 등이 될 수 있다.In addition, the membrane is not particularly limited thereto, but may preferably be a nitrocellulose membrane, a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane, or the like to which an antibody may be bound.
다음으로, 상기 축합 패드는 본 발명의 단일클론항체가 금과 결합된 형태의 접합체를 포함하도록 구성될 수 있다. 이때, 상기 금은 금 입자일 수 있다.Next, the condensation pad may be configured such that the monoclonal antibody of the present invention comprises a conjugate of gold. In this case, the gold may be gold particles.
본 발명의 키트에서, 상기 단일클론항체에 결합된 금은 본 발명의 단일클론항체의 위치를 표시하는 표지물질로서 사용되며, 최종적으로 시료에 포함된 항원(황열 바이러스)의 존재 여부를 확인하기 위한 수단으로 사용된다. In the kit of the present invention, the gold bound to the monoclonal antibody is used as a label indicating the position of the monoclonal antibody of the present invention, and finally to determine the presence of the antigen (yellow fever virus) contained in the sample Used as a means.
따라서, 상기 금 및 단일클론항체가 결합된 접합체는, 멤브레인에 고정된 단일클론항체에 결합할 수 있는 황열 바이러스와 결합하므로 항원의 존재 여부를 확인하는데 이용될 수 있고, 또한 멤브레인에 고정화된 상기 대조군 항체에 직접 결합하므로 시료가 키트에 제대로 적용되었는지 확인하는데 이용될 수 있다. Therefore, the conjugated gold and monoclonal antibody is combined with a yellow fever virus capable of binding to a monoclonal antibody immobilized on the membrane, and thus can be used to confirm the presence of an antigen. Because it binds directly to the antibody, it can be used to verify that the sample is properly applied to the kit.
다음으로, 상기 버퍼 패드는 본 발명의 키트를 사용할 때 상기 키트 내에서 시료의 전달을 보조하고, 항원-항체 반응을 보조하기 위한 완충용액이 포함된 검체 전개액을 포함할 수 있는 다공성 재질로 구성되며, 상기 축합 패드와 연결되어 키트의 말단에 위치하도록 구성될 수 있다. 상기 다공성 재질은 상기 검체 패드에서 정의한 바와 동일하다.Next, the buffer pad is composed of a porous material that may include a sample developing solution containing a buffer solution to assist the delivery of the sample in the kit and to support the antigen-antibody reaction when using the kit of the present invention It may be configured to be connected to the condensation pad and positioned at the end of the kit. The porous material is the same as defined in the sample pad.
상기 검체 전개액은 상기 버퍼 패드에 포함된 상태로 존재할 수도 있고, 본 발명의 키트에 시료를 가한 후에 검체 전개액을 버퍼 패드에 가할 수도 있는데, 바람직하게는 본 발명의 키트에 시료를 가한 후에 검체 전개액을 버퍼 패드에 가할 수 있다. The sample developing solution may be present in the buffer pad, or the sample developing solution may be added to the buffer pad after the sample is added to the kit of the present invention. Preferably, the sample is added to the kit according to the present invention. The developing solution can be added to the buffer pad.
상기 검체 전개액에 포함된 완충용액은 시료 전달 및 항원-항체반응을 보조하는 효과를 나타내는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 붕산염 완충용액, 트리스 완충용액, 인산염 완충용액 등이 사용될 수 있다. 또한, 상기 검체 전개액은 비특이반응(non-specific reaction)을 억제할 수 있는 Triton X-100, Tween 20, 카제인 등을 포함할 수 있고, 보존제로서 아지드화나트륨 등을 포함할 수 있다.The buffer solution contained in the sample development solution is not particularly limited as long as it has an effect of assisting sample delivery and antigen-antibody reaction, but a borate buffer solution, a tris buffer solution, a phosphate buffer solution, and the like may be used. In addition, the sample developing solution may include Triton X-100, Tween 20, casein, and the like, which may inhibit non-specific reactions, and may include sodium azide as a preservative.
다음으로, 상기 흡수 패드는 과량의 검체 또는 완충액을 흡수할 수 있는 재질로 구성될 수 있다. 상기 흡수 패드는 과량의 검체 또는 검체 전개액을 흡수하여 제거함으로써, 본 발명에서 제공하는 키트의 검사 결과를 교란시키지 않도록 하는 역할을 수행한다. 상기 흡수 패드의 재질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 면, 액체 흡수성 겔 등을 사용할 수 있다.Next, the absorbent pad may be made of a material capable of absorbing excess sample or buffer. The absorbent pad absorbs and removes an excess of the sample or the sample developing solution, thereby preventing the test result of the kit provided by the present invention from being disturbed. The material of the absorbent pad is not particularly limited, but preferably cotton, a liquid absorbent gel, or the like can be used.
한편, 본 발명의 키트는 검체 패드를 추가로 포함할 수 있다.On the other hand, the kit of the present invention may further comprise a sample pad.
상기 검체 패드는 시료가 본 발명의 키트에 직접적으로 투입되는 투입구의 역할을 수행한다. 또한, 상기 시료에 포함된 고체 성분을 여과하고, 액상 성분만을 상기 멤브레인으로 전달하는 역할을 수행할 수 있다. The sample pad serves as an inlet through which the sample is directly added to the kit of the present invention. In addition, the solid component included in the sample may be filtered and serve to deliver only the liquid component to the membrane.
이때, 상기 검체 패드는 다공성 재질로 구성될 수 있다. 상기 다공성 재질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 고체 성분(예로서, 혈구 등)을 통과시키지 않을 정도의 공극을 포함하는 다공성 알루미나, 다공성 실리케이트, 다공성 합성수지 등이 될 수 있다. 또한, 상기 검체 패드는 고체 성분을 분리하는 역할을 수행하기 때문에 다공성 재질 이외에도 고체 성분을 흡착시킬 수 있는 재질로 구성될 수도 있는데, 특별히 이에 제한되지 않으나, 니트로셀룰로오스 멤브레인, PVDF(polyvinylidene fluoride) 멤브레인 등이 될 수 있다.In this case, the sample pad may be made of a porous material. The porous material is not particularly limited thereto, but may be porous alumina, porous silicate, porous synthetic resin, or the like including pores of a degree that does not pass through a solid component (eg, blood cells, etc.). In addition, the sample pad may be composed of a material capable of adsorbing the solid component in addition to the porous material because it serves to separate the solid component, but is not particularly limited thereto, nitrocellulose membrane, PVDF (polyvinylidene fluoride) membrane, etc. This can be
본 발명에서, 키트에 사용하기 위한 검정 시스템은 이에 한정되는 것은 아니나, ELISA 플레이트, 딥-스틱디바이스, 면역크로마토그래피법 및 방사 분할 면역검정 디바이스 및 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스 등을 포함한다. 바람직하게는 면역크로마토그래피법(immunochromatographic assay: ICA)을 이용한 스트립 형태 또는 디바이스 형태의 진단 키트를 이용할 수 있다. In the present invention, assay systems for use in kits include, but are not limited to, ELISA plates, dip-stick devices, immunochromatography and radiation split immunoassay devices, flow-through devices, and the like. do. Preferably, a diagnostic kit in the form of a strip or a device using an immunochromatographic assay (ICA) may be used.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 황열 바이러스 NS1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체와 금이 결합된 접합체를 제조하여 멤브레인에 고정하고, 상기 멤브레인을 포함하여 버퍼 패드, 축합 채드, 흡수 패드 등으로 구성된 면역크로마토그래피 진단 키트를 제작하였다(도 3). 상기 키트는 황열 바이러스에 대하여 높은 특이도 및 민감도를 나타내고, 황열 바이러스 이외의 바이러스에 대해서는 반응하지 않으며, 시료에 황열 바이러스 항원이 매우 낮은 농도로 포함되어 있어도 이를 검출할 수 있음을 확인하였다(도 4 내지 6, 및 표 2 내지 4).In a specific embodiment of the present invention, a monoclonal antibody specifically binding to the yellow fever virus NS1 protein and gold is conjugated to prepare a conjugated and fixed to the membrane, including the membrane buffer pad, condensation chad, absorption pad, etc. An immunochromatography diagnostic kit was constructed (FIG. 3). The kit shows high specificity and sensitivity to yellow fever virus, it does not respond to viruses other than yellow fever virus, and it was confirmed that the sample can be detected even if the yellow fever virus antigen is contained at a very low concentration (FIG. 4). To 6, and Tables 2 to 4).
이는, 상기 단일클론항체를 포함하는 본 발명의 키트는 황열 바이러스의 감염 진단에 매우 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.This suggests that the kit of the present invention comprising the monoclonal antibody can be very useful for diagnosing infection of yellow fever virus.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 단일클론항체를 이용하여 황열 바이러스 감염 진단용 키트를 제조하는 방법을 제공한다.Another embodiment of the present invention provides a method for producing a kit for diagnosing yellow fever virus infection using the monoclonal antibody.
구체적인 실시 양태로서, (a) 상기 단일클론항체 및 대조군 항체가 고정화된 멤브레인; (b) 상기 단일클론항체 및 금이 결합된 접합체를 포함하는 축합 패드; (c) 완충용액을 포함하는 버퍼 패드; 및 (d) 흡수 패드를 조립하는 단계를 포함하는, 황열 바이러스 감염 진단용 키트의 제조방법을 제공한다.As a specific embodiment, (a) the membrane to which the monoclonal antibody and the control antibody is immobilized; (b) a condensation pad comprising the conjugate to which said monoclonal antibody and gold are bound; (c) a buffer pad containing a buffer solution; And (d) provides a method for producing a yellow fever virus infection diagnostic kit comprising the step of assembling the absorbent pad.
이때, 상기 "단일클론항체", "멤브레인", "축합 패드", "버퍼 패드", "흡수 패드", 및 "황열 바이러스 감염"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.In this case, the description of the "monoclonal antibody", "membrane", "condensation pad", "buffer pad", "absorption pad", and "yellow fever virus infection" is as described above.
구체적으로, 상기 조립은, 상기 멤브레인; 축합 패드; 버퍼 패드; 및 흡수 패드를 서로 부착하여 스트립을 제조하는 단계; 및 상기 스트립을 카세트에 장착하는 단계를 통해 수행될 수 있다.Specifically, the assembly, the membrane; Condensation pads; Buffer pads; And attaching the absorbent pads to each other to produce a strip; And mounting the strip to a cassette.
이때, 상기 카세트는 스트립의 보관, 운반, 사용 등을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있으며, 당업계에서 통상적으로 이용되는 것을 사용할 수 있다. 구체적으로, 플라스틱으로 제조된 것을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.At this time, the cassette can be used to facilitate storage, transport, use, etc. of the strip, it can be used that is commonly used in the art. Specifically, one made of plastic may be used, but is not limited thereto.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 키트를 이용하여 황열 바이러스 감염 여부를 판단하기 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.Another aspect of the present invention provides a method of providing information for determining whether a yellow fever virus is infected using the kit.
이때, 상기 '키트'에 대한 설명은 전술한 바와 같다.In this case, the description of the 'kit' is as described above.
본 발명에서, 황열 바이러스 감염 여부를 판단하기 위한 정보의 제공 방법은 황열 바이러스 감염 여부를 판단하는 방법 또는 황열 바이러스 감염 여부를 진단하는 방법일 수 있다.In the present invention, the method of providing information for determining whether yellow fever virus is infected may be a method of determining whether yellow fever virus is infected or a method of diagnosing yellow fever virus infection.
구체적으로, 상기 정보의 제공 방법은,Specifically, the method of providing the information,
(a) 환자에게서 분리한 생물학적 시료를 황열 바이러스의 NS1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체와 접촉시키는 단계; 및(a) contacting a biological sample isolated from a patient with a monoclonal antibody that specifically binds to NS1 protein of yellow fever virus; And
(b) 상기 항체의 황열 바이러스와의 결합을 검출하는 단계를 포함한다.(b) detecting the binding of the antibody to the yellow fever virus.
상기 단계 (a)는, 생물학적 시료를 키트에 적용하는 단계이다. Step (a) is the step of applying a biological sample to the kit.
본 발명의 용어, "생물학적 시료"는 조직액, 세포액, 전혈, 혈청, 혈장, 또는 세포 배양 상등액 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 황열 바이러스의 감염이 의심되는 환자 또는 감염된 환자에서 분리한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명의 키트에 적용하여 황열 바이러스 감염 여부를 확인할 수 있다.As used herein, the term "biological sample" includes, but is not limited to, tissue fluid, cell fluid, whole blood, serum, plasma, or cell culture supernatant. In addition, the infection may be isolated from a patient suspected of being infected with yellow fever virus or an infected patient, but is not limited thereto. These biological samples can be applied to the kit of the present invention with or without manipulation to identify yellow fever virus infection.
또한, 상기 단계 (b)는, 상기 항체의 황열 바이러스와의 결합을 검출하는 단계로서, 본 발명의 단일클론항체와 황열 바이러스의 항원-항체 복합체 형성 여부를 확인하는 과정이다.In addition, the step (b) is a step of detecting the binding of the antibody to the yellow fever virus, is a process of confirming whether the monoclonal antibody and the yellow fever virus of the antigen-antibody complex formation.
본 발명의 진단 키트에서, 상기 항원-항체 복합체는 색채입자 결합법으로 검출할 수 있으며, 색채입자로는 예를 들어 콜로이드성 금 입자 또는 칼라 유리 또는 플라스틱(예: 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드(bead)를 포함한다. 본 발명에서는 바람직하게 금 콜로이드를 이용한다.In the diagnostic kit of the present invention, the antigen-antibody complex may be detected by color particle binding methods, and the color particles may be, for example, colloidal gold particles or color glass or plastic (eg, polystyrene, polypropylene, latex, etc.). And beads. In the present invention, gold colloids are preferably used.
구체적으로, (1) 상기 생물학적 시료에 황열 바이러스가 존재하는 경우,Specifically, (1) when a yellow fever virus is present in the biological sample,
상기 생물학적 시료를 키트에 투입 또는 주입하여 적용하면, 본 발명의 단일클론항체는 황열 바이러스의 NS1 단백질에 결합하므로, 본 발명의 단일클론항체 및 금이 결합된 접합체는 상기 시료에 존재하는 황열 바이러스와 반응하여 '황열 바이러스-단일클론항체-금'의 복합체를 형성하게 된다. 이후, 상기 복합체는 모세관 현상에 의해 멤브레인의 미세구멍을 통해 이동하면서 멤브레인에 고정되어 있는 본 발명의 단일클론항체(검사선에 위치)와 황열 바이러스를 통해 결합하게 되며, 금 입자로 인하여 발색반응이 나타남에 따라 검사선에서 발색 띠(band)가 형성된다. When the biological sample is applied to the kit or injected and applied, the monoclonal antibody of the present invention binds to the NS1 protein of the yellow fever virus, and thus, the conjugate of the monoclonal antibody and the gold conjugated with the yellow fever virus present in the sample Reacts to form a complex of 'yellow fever virus-monoclonal antibody-gold'. Thereafter, the complex is coupled to the monoclonal antibody of the present invention (located at the inspection line) and the yellow fever virus, which are fixed to the membrane while moving through the micropores of the membrane by capillary action, and the color reaction is caused by the gold particles. As it appears, a color band is formed on the inspection line.
반면, (2) 상기 생물학적 시료에 황열 바이러스가 존재하지 않는 경우,On the other hand, (2) when the yellow fever virus is not present in the biological sample,
상기 생물학적 시료를 키트에 투입 또는 주입하여 적용하면, 본 발명의 단일클론항체 및 금이 결합된 접합체는 그 상태로 모세관 현상에 의해 멤브레인의 미세구멍을 통해 이동하면서 멤브레인에 고정되어 있는 본 발명의 단일클론항체(검사선에 위치)와 결합하지 않고 이를 지나치게 된다. 따라서, 검사선에서는 발색 띠가 형성되지 않는다.When the biological sample is added or injected into the kit, the monoclonal antibody and the gold-conjugated conjugate of the present invention are fixed to the membrane while being moved through the micropores of the membrane by capillary action. It does not bind to the cloned antibody (located on the test line) and it goes too far. Therefore, no colored band is formed in the inspection line.
한편, 대조선에 위치하는 대조군 항체는 본 발명의 단일클론항체와 결합할 수 있으므로, 상기의 단일클론항체 및 금이 결합된 접합체 또는 황열 바이러스-단일클론항체-금의 복합체 모두와 결합할 수 있다. 따라서, 대조선에는 생물학적 시료의 황열 바이러스 존재 여부와 상관 없이 생물학적 시료가 적용되면 발색 띠가 항상 형성된다. On the other hand, the control antibody located in the control line can bind to the monoclonal antibody of the present invention, and thus can bind to both the monoclonal antibody and the gold conjugated conjugate or the yellow fever virus-monoclonal antibody-gold complex. Therefore, in the control line, a color band is always formed when a biological sample is applied, regardless of whether the biological sample has a yellow fever virus.
따라서, 본 발명의 진단 키트의 대조선 및 검사선이 모두 양성인 경우 황열 바이러스에 감염되었다고 판단할 수 있고, 대조선이 양성이고 검사선이 음성인 경우 황열 바이러스에 감염되지 않았다고 판단할 수 있다. 반면, 대조선 및 검사선이 모두 음성인 경우 키트에 시료가 적절히 적용되지 않은 것으로 판단할 수 있다.Therefore, when both the control line and the test line of the diagnostic kit of the present invention is positive, it can be determined that the yellow fever virus is infected, and when the control line is positive and the test line is negative, it can be determined that the yellow fever virus is not infected. On the other hand, if both the control line and the test line is negative, it can be determined that the sample is not properly applied to the kit.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 키트를 이용하여 음성 검체를 진단한 결과 키트의 대조선에서만 발색 띠가 나타나는 음성 반응이 나타남을 확인하였고(도 4), 황열 바이러스의 NS1 재조합 단백질 또는 황열 바이러스의 배양액을 진단한 결과 키트의 대조선 및 검사선 모두에서 발색 띠가 나타나는 양성 반응이 나타남을 확인하였으며(도 6), 황열 바이러스의 감염이 의심되는 검체를 진단한 결과 감염이 확실시 되는 검체에서 양성 반응이 나타남을 확인하였다(표 3).In a specific embodiment of the present invention, a negative sample was diagnosed using the kit of the present invention, and it was confirmed that a negative response in which a colored band appeared only in the control line of the kit (FIG. 4) was detected. As a result of diagnosing the culture of the virus, it was confirmed that a positive reaction with a color band appeared in both the control line and the test line of the kit (FIG. 6). It was confirmed that the reaction appeared (Table 3).
이는, 상기 단일클론항체를 포함하는 본 발명의 키트를 사용하는 경우 황열 바이러스의 감염 여부를 정확하고 신속하게 간편히 진단할 수 있음을 시사하는 것이다This suggests that when using the kit of the present invention comprising the monoclonal antibody, it is possible to easily and quickly diagnose whether yellow fever virus is infected.
또한, 본 발명의 진단 키트는 황열 바이러스 이외의 다른 바이러스에 대하여 교차반응을 일으키지 않는 특징을 갖는다. In addition, the diagnostic kit of the present invention has a feature that does not cause cross-reaction with viruses other than yellow fever virus.
본 발명의 용어, "교차반응"은 항체가 다른 항원물질에서 동일한 항원결정기(eptope)가 있으면 그것에 대응할 수 있는 것을 의미하며, 상기 용어는 '교차면역' 또는 '교차방어면역'과 혼용되어 사용될 수 있다. 하나의 항원물질에서도 복수인 다수의 항원결정기가 존재하는 경우가 대부분이며, 이는 다중 면역반응을 자극한다. 교차반응은, 일반적으로 진단 테스트를 포함한 의료 테스트에서 결과에 혼동을 유발하지만, 도움이 되는 경우도 있다. 예를 들어, 관심 항원이 아닌 다른 항원과 반응이 일어날 때 양성 반응의 오류를 산출하는 교란을 일으키기도 하며, 다른 항원을 위한 항체를 사용하여 다른 바이러스를 탐지하는데 도움을 주기도 한다.As used herein, the term "cross-reaction" means that the antibody may correspond to the same epitope in another antigen, and the term may be used interchangeably with "cross-immune" or "cross-immune immunity." have. In many cases, a plurality of epitopes exist even in a single antigen, which stimulates multiple immune responses. Cross-reactions generally cause confusion in results in medical tests, including diagnostic tests, but in some cases may be helpful. For example, when a reaction occurs with an antigen other than the antigen of interest, it may cause disturbances that yield a false positive reaction, or may help to detect other viruses using antibodies for other antigens.
본 발명의 목적상, 상기 교차반응은 황열 바이러스의 진단 시 관심 항원이 아닌 다른 항원과의 반응에 의해 황열, 뎅기, 지카, 치쿤쿠니아 또는 마이야로 바이러스 중 어떠한 바이러스에 감염되었는지 확인할 수 없게 되는 것을 의미한다. 즉, 황열, 뎅기, 지카 또는 마이야로 바이러스는 모기 매개 바이러스에 속하는 것으로 그 서열이 유사하여 진단시 교차반응이 일어날 수 있으며, 양성반응의 오류를 일으킬 수 있다. 그러나, 본 발명의 단일클론항체는 황열 바이러스 감염 진단 시 교차반응을 일으키지 않고 황열 바이러스에만 특이적으로 반응하는 것을 특징으로 한다.For the purposes of the present invention, the cross-reaction may not be able to identify which virus among yellow fever, dengue, zika, chikuncuni or mayauro virus by reaction with an antigen other than the antigen of interest when the yellow fever virus is diagnosed. it means. In other words, yellow fever, dengue, Zika or Mayaro virus belongs to the mosquito-borne virus, its sequence is similar, cross-reaction can occur when diagnosed, and may cause a positive reaction error. However, the monoclonal antibody of the present invention is characterized in that it specifically reacts only to yellow fever virus without causing a cross reaction when diagnosing yellow fever virus infection.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 본 발명의 키트는 뎅기타입2, 뎅기타입3, 뎅기타입4, 지카, 치쿤구니아, 마이야로 바이러스 배양액에 대해서는 모두 음성 반응을 나타냄을 확인하였다(도 5).In a specific embodiment of the present invention, the kit of the present invention was confirmed that all of the
이는, 상기 단일클론항체를 포함하는 본 발명의 키트는 황열 바이러스 이외의 다른 바이러스와는 교차반응을 일으키지 않는바, 황열 바이러스의 감염 여부만을 정확하고 신속하게 진단할 수 있음을 시사하는 것이다. This suggests that the kit of the present invention containing the monoclonal antibody does not cross-react with other viruses other than yellow fever virus, and thus it is possible to accurately and quickly diagnose only yellow fever virus infection.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 키트를 이용하여 황열 바이러스 감염 여부를 진단하는 방법을 제공한다.Another aspect of the invention provides a method for diagnosing yellow fever virus infection using the kit.
이때, 상기 "키트" 및 "황열 바이러스 감염"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.At this time, the description of the "kit" and "yellow fever virus infection" is as described above.
구체적으로, 상기 진단 방법은,Specifically, the diagnostic method,
(a) 환자에게서 분리한 생물학적 시료를 황열 바이러스의 NS1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체와 접촉시키는 단계; 및(a) contacting a biological sample isolated from a patient with a monoclonal antibody that specifically binds to NS1 protein of yellow fever virus; And
(b) 상기 항체의 황열 바이러스와의 결합을 검출하는 단계를 포함한다.(b) detecting the binding of the antibody to the yellow fever virus.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 키트를 이용하여 황열 바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.Another aspect of the invention provides a method for detecting yellow fever virus using the kit.
이때, 상기 "키트"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.In this case, the description of the "kit" is as described above.
본 발명에서, 상기 황열 바이러스를 검출하는 방법은 황열 바이러스 감염 여부를 판단하는 방법 또는 황열 바이러스의 감염 여부를 진단하는 방법일 수 있다.In the present invention, the method for detecting the yellow fever virus may be a method for determining whether the yellow fever virus is infected or a method for diagnosing the yellow fever virus.
구체적으로, 상기 방법은 황열 바이러스의 NS1 단백질을 검출하는 방법일 수 있다.Specifically, the method may be a method of detecting NS1 protein of yellow fever virus.
또한, 상기 황열 바이러스를 검출하는 방법은,In addition, the method for detecting the yellow fever virus,
(a) 환자에게서 분리한 생물학적 시료를 황열 바이러스의 NS1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체와 접촉시키는 단계; 및(a) contacting a biological sample isolated from a patient with a monoclonal antibody that specifically binds to NS1 protein of yellow fever virus; And
(b) 상기 항체의 황열 바이러스와의 결합을 검출하는 단계를 포함한다.(b) detecting the binding of the antibody to the yellow fever virus.
본 발명의 황열 바이러스 NS1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 상기 NS1 단백질에 민감도 및 특이도가 우수하므로 황열 바이러스의 감염 여부를 신속하게 진단하는 키트 등에 활용될 수 있다. 또한, 상기 단일클론항체는 뎅기, 지카, 치쿤쿠니아 또는 마이야로 등 다른 유사 바이러스와 교차반응이 일어나지 않아, 진단 키트의 민감도와 정확도를 획기적으로 높일 수 있다.The monoclonal antibody specifically binding to the yellow fever virus NS1 protein of the present invention can be used for kits for rapidly diagnosing yellow fever virus infection because of its excellent sensitivity and specificity. In addition, the monoclonal antibody does not cross-react with other similar viruses such as Dengue, Zika, Chikunkunia or Mayaro, thereby dramatically increasing the sensitivity and accuracy of the diagnostic kit.
도 1은 황열 바이러스를 분리하는 과정 및 결과를 보여주는 도이다. A는 수크로스 농도(15%~60%)에 따른 원심분리 결과, B는 상기 수크로스 분획의 웨스턴블롯 결과에 관한 것이다. 이때, E, C 및 M은 각각 황열 바이러스의 구조단백질인 엔벨로프(envelope), 캡시드(capsid), 멤브레인(membrane)을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 황열 바이러스에 대한 단일클론항체의 아이소타입을 확인한 결과에 관한 도이다.
도 3은 본 발명의 황열 바이러스 감염 진단용 키트를 도식화한 것이다.
도 4는 상기 키트를 이용하여 황열 바이러스 음성 검체의 시료를 진단한 결과에 관한 도이다.
도 5는 상기 키트를 이용하여 뎅기(DV2, DV3. DV4), 지카(ZV), 치쿤쿠니아(CHIKV) 또는 마이야로(MAYV) 바이러스의 양성 검체를 진단한 결과에 관한 도이다.
도 6은 상기 키트를 이용하여 시료(황열 바이러스 NS1 재조합 단백질(rYF NS1) 또는 황열 바이러스 배양액(YF virus culture media)의 농도에 따른 진단 결과에 관한 도이다.1 is a view showing a process and results for separating yellow fever virus. A is the result of centrifugation according to sucrose concentration (15% to 60%), and B is the result of Western blot of the sucrose fraction. In this case, E, C and M represent envelope, capsid, and membrane, which are structural proteins of yellow fever virus, respectively.
Figure 2 is a view showing the result of confirming the isotype of the monoclonal antibody to the yellow fever virus of the present invention.
Figure 3 is a schematic diagram of the yellow fever virus infection diagnostic kit of the present invention.
4 is a diagram showing a result of diagnosing a sample of a yellow fever virus negative sample using the kit.
FIG. 5 is a diagram illustrating a result of diagnosing a positive sample of dengue (DV2, DV3.DV4), Zika (ZV), Chikunkunia (CHIKV) or MAYAV virus using the kit. FIG.
6 is a diagram illustrating a diagnosis result according to the concentration of a sample (yellow fever virus NS1 recombinant protein (rYF NS1) or yellow fever virus culture medium (YF virus culture media) using the kit.
이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 하기 예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by the following examples. However, the following examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited by the following examples.
실시예 1. 황열 바이러스의 배양 및 정제 방법Example 1.Culturing and Purification of Yellow Fever Virus
먼저, 황열 바이러스의 배양은 원숭이 신장 유래 세포주인 베로 세포(Vero, ATCC CCL81)를 이용하여 수행하였다. 베로 세포를 배양하기 위하여 항생제가 첨가된 D-MEM 용액(Dulbecco's Medium)을 사용하였으며, 증식 배지에는 10% FBS, 유지 배지에는 2% FBS를 첨가하였다. 베로 세포가 배양접시 바닥에 단층으로 80% 정도 자랐을 때 황열 바이러스를 접종하여 37℃에서 1시간 동안 흡착시켰다. 이후, 접종액을 제거하고 유지 배지를 첨가하여 37℃, CO2 배양기에서 5일간 배양하면서 세포변형(cyto-pathogenic effect, CPE) 여부를 관찰하였다. 접종 5일 후 세포배양 상층액만을 회수하여 새로운 베로 세포에서 동일한 방법으로 계대 배양을 반복 실시하였다. 반복 계대는 세포단층에서 세포변형이 완전히 형성될 때까지 반복하였고, 계대가 최종 완료된 후 바이러스 배양액을 소분하여 실험에 사용하였다.First, the culture of yellow fever virus was performed using Vero cells (Vero, ATCC CCL81), a monkey kidney-derived cell line. To culture Vero cells, D-MEM solution (Dulbecco's Medium) with antibiotics was used. 10% FBS was added to the growth medium and 2% FBS was added to the maintenance medium. When Vero cells were grown to 80% as a monolayer on the bottom of the culture plate, yellow fever virus was inoculated and adsorbed at 37 ° C for 1 hour. Thereafter, the inoculum was removed and a maintenance medium was added thereto, followed by culturing for 5 days at 37 ° C. in a CO 2 incubator, and then observed whether the cells were deformed (cyto-pathogenic effect, CPE). Five days after the inoculation, only the cell culture supernatant was recovered, and passage culture was repeated in the same manner with new Vero cells. Repeat passage was repeated until complete cell deformity was formed in the cell monolayer. After passage was finally completed, subculture of virus culture was used for experiment.
이후, 상기의 황열 바이러스 배양액에서 황열바이러스를 정제하기 위하여, 다음과 같은 방법을 수행하였다. 상기 배양액에 황산 암모늄(ammonium sulfate)을 50%의 농도로 첨가하여 30분간 혼합한 후, 8,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 상층액은 버리고 침전물을 20 mM 인산완충용액(phosphate buffer, pH 7.0)에 현탁시켰다. 이후, 15% 수크로스 쿠션(sucrose cusion)을 위해 원심분리(280,000×g, 2hrs, 4℃, Beckman)를 실시한 후 10~40%의 농도경사로 수크로스 구배 원심분리(280,000×g, 2hrs, 4℃, Beckman)를 실시하였다.Then, in order to purify the yellow fever virus in the yellow fever virus culture, the following method was performed. Ammonium sulfate was added to the culture solution at a concentration of 50%, mixed for 30 minutes, centrifuged at 8,000 rpm for 30 minutes, the supernatant was discarded, and the precipitate was dissolved in 20 mM phosphate buffer (pH 7.0). Suspended. Subsequently, centrifugation (280,000 × g, 2hrs, 4 ° C, Beckman) was performed for 15% sucrose cusion and then sucrose gradient centrifugation (280,000 × g, 2hrs, 4) at a gradient of 10-40%. ℃, Beckman).
마지막으로, 회수한 상기 분획에 대하여 SDS-PAGE 및 웨스턴블롯을 수행한 결과, 황열 바이러스는 순수 분리 정제됨을 확인하였고(도 1), 이를 동물의 면역접종과 면역분석의 항원으로 사용하였다.Finally, SDS-PAGE and Western blot of the recovered fractions confirmed that the yellow fever virus was purified and purified purely (FIG. 1), which was used as an antigen for animal immunization and immunoassay.
실시예 2. 단일클론항체의 제작 방법Example 2. Preparation of Monoclonal Antibody
실시예 2-1. 융합 세포주의 제조 및 배양 방법Example 2-1. Method of Preparation and Culture of Fusion Cell Lines
황열 바이러스에 특이적인 단일클론항체를 제작하기 위하여, 먼저 면역화된 마우스의 비장세포 및 골수종 세포를 이용하여 융합 세포주를 제조하였다.In order to prepare monoclonal antibodies specific for yellow fever virus, first, fusion cell lines were prepared using splenocytes and myeloma cells of immunized mice.
구체적으로, 상기 실시예 1에서 준비한 황열 바이러스 100 ㎍이 들어 있는 용액; 및 상기 용액과 동일한 부피의 컴플리트 프레운즈 아주번트(complete Freund's adjuvant)가 혼합된 현탁액을 제조하였고, 이를 생후 6주령 암컷 생쥐(BALB/C, 대한바이오링크(주), 한국)의 복강 내에 주사하여 면역화하였다. 2주 후에 인컴플리트 프레운즈 아주번트(incomplete Freund's adjuvant)를 사용하여 같은 요령으로 한 번 더 주사(면역화)하고, 다시 2주 후에 같은 요령으로 한 번 더 주사(면역화)하였다. 마지막 면역처리 후 2일 뒤에 꼬리에서 채혈하여 혈청을 얻은 뒤 인산염 완충액에 1/1,000으로 희석하여 효소면역측정법(ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay) 방법으로 항체의 역가를 결정하였다. 역가가 낮은 경우, 2주 후에 다시 면역화시켰다.Specifically, the solution containing 100 ㎍ yellow fever virus prepared in Example 1; And a suspension containing a complete Freund's adjuvant in the same volume as the solution, and injected into the abdominal cavity of 6-week-old female mice (BALB / C, Daehan Biolink Co., Korea). Immunized. Two weeks later, incomplete Freund's adjuvant was used to inject once more (immunized) with the same trick, and again two weeks later, another injection (immunized) with the same trick. Two days after the last immunization, blood was collected from the tail and serum was obtained. The antibody titer was determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) by diluting to 1 / 1,000 in phosphate buffer. If the titer was low, it was immunized again after 2 weeks.
그 후, 상기 면역화된 마우스의 비장을 조직분쇄기로 분쇄한 후, 용기에 담고 원심 분리하여 비장 세포를 회수하였다. 또한, 골수종 세포도 세포배양용 플라스크로 회수하였다. 이후, 1×107개의 골수종 세포와 1×108개의 비장세포를 하나의 50 ㎖ 용기에 넣고 RPMI1640 배지를 적당량 첨가한 후 200×g로 5분간 원심 분리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포를 현탁시켜 RPMI1640 배지에 천천히 흔들어 주면서 1 ㎖의 PEG(50% polyethylene glycol) 용액을 1분 동안 가하였다. 5분 후에 1 ㎖의 RPMI1640 배지를 30초에 걸쳐 천천히 첨가하고, 다시 3 ㎖의 RPMI1640 배양액을 30 초에 걸쳐 첨가하였다. 다시 17 ㎖의 RPMI1640 배양액을 1분에 걸쳐 넣은 다음 20 ㎖의 RPMI1640 배양액을 더 넣어주고 5분 동안 반응시켰고, 200×g로 5분간 원심분리하여 배지를 제거하였다. 다시 상기 원심분리된 세포를 50 ㎖의 1% HAT(hypoxathine-aminopterinthymidine)을 함유하는 RPMI1640 배양액에 주의하여 현탁한 후, 피더 세포(feeder cell)가 들어있는 96웰 세포배양용 플레이트에 웰당 100 ㎕씩 세포를 넣어준 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다.Thereafter, the spleens of the immunized mice were crushed by a tissue mill, and then placed in a container and centrifuged to recover the spleen cells. In addition, myeloma cells were also recovered in a cell culture flask. Thereafter, 1 × 10 7 myeloma cells and 1 × 10 8 splenocytes were placed in one 50 ml container, and an appropriate amount of RPMI1640 medium was added thereto, followed by centrifugation at 200 × g for 5 minutes to recover the cells. The recovered cells were suspended and slowly shaken in RPMI1640 medium, and 1 ml of PEG (50% polyethylene glycol) solution was added for 1 minute. After 5 minutes, 1 ml of RPMI1640 medium was added slowly over 30 seconds and again 3 ml of RPMI1640 culture was added over 30 seconds. Again, 17 ml of RPMI1640 culture was added over 1 minute, followed by further addition of 20 ml of RPMI1640 culture and allowed to react for 5 minutes, followed by centrifugation at 200 × g for 5 minutes to remove the medium. Again, the centrifuged cells were carefully suspended in 50 ml of RPMI1640 culture medium containing 1% HAT (hypoxathine-aminopterinthymidine), and then 100 μl per well in a 96-well cell culture plate containing feeder cells. Cells were added and then cultured in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator.
마지막으로, 상기의 융합 세포를 10일 간 배양한 결과 군락을 형성하면서 자라는 것을 확인하였고, 배양액 약 100 ㎕을 취하여 황열 바이러스 비구조단백질1(NS1)이 코팅(coating)된 플레이트와 반응시킴으로써 특이 항체를 생산하는 융합 세포를 스크리닝하였다. 상기 융합 세포를 회수하여 24웰 세포배양용 용기에서 배양한 후, 안정한 융합 세포주가 얻어질 때까지 복제를 계속하였다. 복제가 완료되었을 때 티 플라스크(T flask)로 옮겨 대량으로 배양하였다. Finally, the fusion cells were cultured for 10 days to confirm that they grew while forming colonies. About 100 μl of the culture solution was taken and reacted with a plate coated with yellow fever virus non-structural protein 1 (NS1) to coat specific antibodies. Producing fusion cells were screened. The fusion cells were harvested and incubated in a 24-well cell culture vessel, and replication continued until a stable fusion cell line was obtained. When replication was complete, transfer to a T flask and incubate in large quantities.
실시예 2-2. 융합 세포주를 이용한 항체 생산Example 2-2. Antibody Production Using Fusion Cell Lines
상기 실시예 2-1에서 제조한 융합 세포주를 이용하여 황열 바이러스에 특이적인 항체를 생산하였다. Antibodies specific to yellow fever virus were produced using the fusion cell line prepared in Example 2-1.
구체적으로, 생후 6-8주령 생쥐(BALB/C)의 복강에 인컴플리트 프레운즈 아주번트(incomplete Freund's adjuvant) 0.5 ㎖을 주사하였다. 주사 후 1주일째 되는 날, 마우스 한 마리당 1.5×106개의 세포를 0.5 ㎖ 인산염 완충액에 현탁한 후 복강에 주사하였다. 1-2주 후 주사기를 이용하여 복수(ascitic fluid)를 채취하였고, 상기 복수에 포함된 단일클론항체의 아형(isotype), 면역 친화도(K), 및 분리한 황열 바이러스와의 반응성 여부를 조사하여 하기 표 1에 나타내었다.Specifically, 0.5 ml of incomplete Freund's adjuvant was injected into the abdominal cavity of 6-8 week old mice (BALB / C). One week after injection, 1.5 × 10 6 cells per mouse were suspended in 0.5 ml phosphate buffer and injected intraperitoneally. 1-2 weeks later, asctic fluid was collected using a syringe, and the isotype, immune affinity (K), and reactivity of the isolated yellow fever virus were examined. It is shown in Table 1 below.
상기의 단일클론항체 중에서도, ELISA와 웨스턴블롯 분석 결과, C06M, C07M, C08M, C09M, C10M, C11M 및 C12M 항체는 뎅기에는 반응하지 않고 황열에만 반응하는 것을 확인하였다.Among the above monoclonal antibodies, ELISA and Western blot analysis revealed that the C06M, C07M, C08M, C09M, C10M, C11M and C12M antibodies responded only to yellow fever, not to dengue.
나아가, C08M 및 C09M 항체는 다른 항체들에 비하여 결합 친화도가 더 높음을 확인하였다.Furthermore, C08M and C09M antibodies were found to have higher binding affinity than other antibodies.
한편, 상기 C08M 및 C09M 항체를 생산하는 융합 세포주는 2018년 1월 18일자로 기탁기관인 한국생명공학연구원(KCTC)에 국제 기탁하여 각각 KCTC 13461BP 및 KCTC 13462BP로 기탁번호를 부여받았다.Meanwhile, on January 18, 2018, the fusion cell lines producing the C08M and C09M antibodies were internationally deposited with the Korea Research Institute of Biotechnology (KCTC), which is a depository institution, and were assigned the accession numbers of KCTC 13461BP and KCTC 13462BP, respectively.
실시예 2-3. 단일클론항체의 정제 방법Example 2-3. Purification of Monoclonal Antibodies
상기 실시예 2-2를 통해 C06M, C07M, C08M, C09M, C10M, C11M 및 C12M 단일클론항체가 뎅기에는 반응하지 않고 황열에만 반응하는 것을 확인한바, 마우스의 복수에서 상기 항체만을 정제하고자 하였다.In Example 2-2, it was confirmed that C06M, C07M, C08M, C09M, C10M, C11M and C12M monoclonal antibodies responded only to yellow fever, not to dengue.
구체적으로, 마우스의 복수에 황산 암모늄(ammonium sulfate)을 20%의 농도로 첨가하여 30분간 혼합한 후, 8,000 rpm에서 30분간 원심분리하고 상층액을 취하였다. 상기 상층액에 황산 암모늄을 50%의 농도로 첨가한 후 4℃에서 30분간 방치하였고, 다시 8,000 rpm에서 30분간 원심 분리하여 상층액은 버리고 침전물을 20 mM 인산완충용액(phosphate buffer, pH 7.0)에 현탁시켰다. 상기 현탁액을 20 mM 인산완충용액에서 18시간 이상 투석한 후, 상기 투석액을 20 mM 인산완충용액(pH 7.0)으로 평형화된 단백질 G-결합 컬럼(Protein G-coupled column)에 주입하고, 모두 주입되고 난 후 인산완충용액을 이용하여 흡착하지 않은 물질들을 제거하였다. Specifically, ammonium sulfate (ammonium sulfate) was added to a plurality of mice at a concentration of 20% and mixed for 30 minutes, followed by centrifugation at 8,000 rpm for 30 minutes, and the supernatant was taken. Ammonium sulfate was added to the supernatant at a concentration of 50% and left at 4 ° C. for 30 minutes, followed by centrifugation at 8,000 rpm for 30 minutes to discard the supernatant, and to precipitate 20 mM phosphate buffer (phosphate buffer, pH 7.0). Suspended in. After the suspension was dialyzed in 20 mM phosphate buffer solution for 18 hours or more, the dialysate was injected into a Protein G-coupled column equilibrated with 20 mM phosphate buffer solution (pH 7.0), and all were injected. After phosphate buffer solution was used to remove the non-adsorbed material.
이후, 컬럼에 결합된 항체는 10 mM 글리신용액(glycine solution, pH 2.8) 용액으로 용출(elution)하였다. 이때, 1 M 트리스(Tris, pH 9.0) 용액을 용출액의 1/10 부피로 첨가하여 pH가 7.0~7.5가 되도록 보정하였다. 용출된 항체액을 농축한 후, 인산완충용액(phosphate buffered saline, PBS)에서 투석하고, 브래드포드법(Bradford assay)을 이용하여 항체의 양을 확인하였으며, 사용 전까지 냉동 보관하였다.Thereafter, the antibody bound to the column was eluted with a 10 mM glycine solution (pH 2.8) solution. At this time, 1 M Tris (pH 9.0) solution was added to 1/10 volume of the eluate to calibrate to pH 7.0-7.5. The eluted antibody solution was concentrated, dialyzed in phosphate buffered saline (PBS), and the amount of the antibody was confirmed by Bradford assay, and stored frozen until use.
한편, 단일클론항체의 아이소타입(isotype, 아형)을 확인한 결과, C06M, C07M, C08M, C11M 및 C12M는 IgG1이고, C09M 및 C10M은 IgG2a임을 확인하였다(도 2).On the other hand, as a result of confirming the isotype (isotype, subtype) of the monoclonal antibody, it was confirmed that C06M, C07M, C08M, C11M and C12M is IgG1, C09M and C10M are IgG2a (Fig. 2).
실시예 3. 황열 바이러스 검출용 키트의 제작방법Example 3. Fabrication method of yellow fever virus detection kit
실시예 3-1. 단일클론항체와 금의 접합체 및 축합 패드의 제조방법Example 3-1. Manufacturing method of monoclonal antibody and gold conjugate and condensation pad
상기 실시예 1 및 2를 통해 제작한 황열 바이러스에 특이적인 단일클론항체를 이용하여 황열 바이러스를 검출하는 키트를 제작하기 위해, 먼저 상기 단일클론항체와 금의 접합체를 제조하였고, 상기 접합체가 부착된 축합 패드를 제조하였다.In order to manufacture a kit for detecting a yellow fever virus using a monoclonal antibody specific to the yellow fever virus prepared in Examples 1 and 2, first, a conjugate of the monoclonal antibody and gold was prepared, and the conjugate was attached. Condensation pads were prepared.
구체적으로, 0.02% HAuCl4 용액을 교반 및 가열하였고, 끓기 시작할 때 0.2% 구연산나트륨(Sodium citrate) 용액을 첨가하여 용액을 환원시킴으로써 금 입자(gold particle)을 제작하였다. 상기 금 입자에 단일클론항체 C09M을 금 입자 용액 100 ㎖ 당 1 mg을 첨가하여 축합시켰다. 상기 축합된 단일클론항체-금 접합체를 10,000g에서 원심분리하여 침전시키고 0.1% BSA를 함유하는 생리식염수(PBS)로 용해하여 OD450 값이 10이 되도록 제조하였다. Specifically, gold particles were prepared by stirring and heating a 0.02% HAuCl 4 solution and reducing the solution by adding 0.2% sodium citrate solution at the time of boiling. Monoclonal antibody C09M was condensed to the gold particles by adding 1 mg per 100 ml of the gold particle solution. The condensed monoclonal antibody-gold conjugate was precipitated by centrifugation at 10,000 g and dissolved in physiological saline (PBS) containing 0.1% BSA to prepare an OD450 value of 10.
이후, 상기 단일클론항체-금 접합체가 포함된 용액을 0.05% 트윈-20이 전처리된 폴리에스테르 또는 유리패드에 처리하고, 건조시켜서 축합 패드를 완성하였다.Thereafter, the solution containing the monoclonal antibody-gold conjugate was treated with 0.05% Tween-20 pretreated polyester or glass pad and dried to complete the condensation pad.
실시예 3-2. 멤브레인의 제조방법Example 3-2. Manufacturing method of membrane
이후, 황열 바이러스에 특이적인 단일클론항체를 이용하여 멤브레인을 제조하였다. Thereafter, membranes were prepared using monoclonal antibodies specific for yellow fever virus.
구체적으로, 나이트로셀룰로스 멤브레인의 특정위치에 각 항체를 코팅하였다. 즉, 검사선(test, T) 위치에는 마우스 항-황열 바이러스 단클론 항체 C08M을 1.0 ㎎/㎖의 농도로 코팅하였고, 대조선(control, C) 위치에는 산양 항-마우스 IgG 항체를 0.75 ㎎/㎖의 농도로 코팅하였다. 또한, 상기 대조선 위치에는 산양 항-마우스 IgG 다클론 항체(Arista Biologicals Inc., 미국)를 1.0 mg/㎖의 농도로 분주하였다.Specifically, each antibody was coated at a specific position of the nitrocellulose membrane. That is, the test (T) position was coated with a mouse anti-yellow fever virus monoclonal antibody C08M at a concentration of 1.0 mg / ml, and the control (C) position was coated with a goat anti-mouse IgG antibody of 0.75 mg / ml. Coating at concentration. In addition, at the control position, a goat anti-mouse IgG polyclonal antibody (Arista Biologicals Inc., USA) was dispensed at a concentration of 1.0 mg / ml.
실시예 3-3. 신속 면역크로마토그래피 진단 키트의 제작Example 3-3. Construction of Rapid Immunochromatography Diagnostic Kit
상기 실시예 3-1 및 3-2에서 제조한 축합패드와 멤브레인을 이용하여, 진단 키트를 제조하였다.Diagnostic kits were prepared using the condensation pads and membranes prepared in Examples 3-1 and 3-2.
구체적으로, 키트의 모습은 도 3에 나타내었다. 키트는 스트립과 카세트로 구성하였다. 스트립은 하단부터 완충용액이 처리된 버퍼 패드, 단일클론항체-금 접합체가 부착된 축합 패드, 검사선 및 대조선이 순서대로 부착 및 분주되어 있는 멤브레인을 순차적으로 부착시키고, 상단에는 흡수 패드를 부착시켜서 제작하였다. 상기 제작된 스트립을 플라스틱 카세트에 장착하고 조립하여 신속 면역크로마토그래피 진단 키트를 제작하였다.Specifically, the appearance of the kit is shown in FIG. The kit consisted of a strip and a cassette. The strip is sequentially attached with a buffer pad treated with a buffer solution, a condensation pad with a monoclonal antibody-gold conjugate, a membrane with a test line and a control line attached in sequence, and an absorbent pad at the top. Produced. The prepared strip was mounted on a plastic cassette and assembled to produce a rapid immunochromatography diagnostic kit.
실시예 4. 신속 면역크로마토그래피 진단 키트의 효과 검증Example 4. Effect Verification of Rapid Immunochromatography Diagnostic Kit
실시예 4-1. 특이도 확인Example 4-1. Specificity check
상기 실시예 1 내지 3을 통해 제작한 황열 바이러스의 신속 면역크로마토그래피 진단 키트의 특이도를 확인하였다.The specificity of the rapid immunochromatography diagnostic kit of yellow fever virus prepared in Examples 1 to 3 was confirmed.
한편, 상기 키트는 다음과 같은 원리로 황열 바이러스를 검출한다. 황열 바이러스 항원이 존재하는 검액을 검체 주입구에 넣으면 상기 항원이 항-황열 바이러스 단일클론항체-금 접합체와 반응하고, 이후에도 계속 멤브레인으로 이동하여 고정화되어 있는 항-황열 바이러스 단일클론항체와 반응한다. 따라서, '항-황열 바이러스 단일클론항체+금 접합체+검액 내 황열 바이러스 항원+항-황열 바이러스 단일클론항체'와 같은 형태로 반응하여 색 띠를 형성하게 된다. 반응하지 않은 단일클론항체-금 접합체는 대조선 부위에 부착되어 있는 항-마우스 면역글로블린 G와 반응을 하여 색띠를 나타나게 된다.On the other hand, the kit detects yellow fever virus in the following principle. When a sample solution containing a yellow fever virus antigen is placed in a sample inlet, the antigen reacts with an anti-yellow fever virus monoclonal antibody-gold conjugate, and then continues to move to the membrane to react with an immobilized anti-yellow fever virus monoclonal antibody. Therefore, the anti-yellow fever virus monoclonal antibody + gold conjugate + yellow fever virus antigen + anti-yellow fever virus monoclonal antibody in the form of a reaction to form a color band. Unreacted monoclonal antibody-gold conjugates react with anti-mouse immunoglobulin G attached to the control site, resulting in colored bands.
구체적으로, 상기 키트로 황열 바이러스 음성 검체 100건을 확인한 결과, 키트는 모두 음성 반응을 나타냄을 확인하였다(도 4).Specifically, as a result of confirming 100 yellow fever virus negative samples with the kit, it was confirmed that all the kits showed a negative reaction (FIG. 4).
상기 결과를 통해, 본 발명의 키트는 황열 바이러스에 대하여 높은 특이도를 나타냄을 알 수 있었다.Through the above results, it can be seen that the kit of the present invention exhibits high specificity for yellow fever virus.
실시예 4-2. 교차반응 확인Example 4-2. Cross Reaction Check
상기 실시예 1 내지 3을 통해 제작한 황열 바이러스의 신속 면역크로마토그래피 진단 키트의 교차반응을 확인하였다.The cross-reaction of the rapid immunochromatography diagnostic kit of yellow fever virus prepared in Examples 1 to 3 was confirmed.
구체적으로, 뎅기타입2(DV2), 뎅기타입3(DV3), 뎅기타입4(DV4), 지카(ZV), 치쿤구니아(CHIKV), 마이야로 바이러스(MAYV)의 배양액을 상기 키트에 적용하였다. Specifically, dengue type 2 (DV2), dengue type 3 (DV3), dengue type 4 (DV4), Zika (ZV), chikungunia (CHIKV), the culture solution of the Maya virus (MAYV) kit Applied to.
그 결과, 뎅기타입2, 뎅기타입3, 뎅기타입4, 지카, 치쿤구니아, 마이야로 바이러스 배양액에 대해서는 모두 음성 반응을 나타냄을 확인하였다(도 5).As a result, it was confirmed that all of the
상기 결과를 통해, 본 발명의 키트는 황열 바이러스 이외의 다른 바이러스에 대하여 교차반응을 보이지 않음을 알 수 있었다. Through the above results, it can be seen that the kit of the present invention does not show a cross reaction against other viruses other than yellow fever virus.
실시예 4-3. 검출 한계 확인Example 4-3. Detection limit check
상기 실시예 1 내지 3을 통해 제작한 황열 바이러스의 신속 면역크로마토그래피 진단 키트의 검출 한계를 확인하였다.The detection limit of the rapid immunochromatography diagnostic kit of yellow fever virus prepared in Examples 1 to 3 was confirmed.
그 결과, 재조합 단백질(NS1)로는 약 0.5 ng/㎖까지 검출하며, 바이러스 배양액으로는 5×10 PFU/㎖까지 검출할 수 있음을 확인하였다(도 6).As a result, it was confirmed that up to about 0.5 ng / ml with recombinant protein (NS1) and up to 5 × 10 PFU / ml with virus culture (FIG. 6).
상기 결과를 통해, 본 발명의 키트는 시료에 항원이 매우 낮은 농도로 포함되어 있어도 검출이 가능함을 알 수 있었다. Through the above results, it can be seen that the kit of the present invention can be detected even if the antigen is contained in a very low concentration.
실시예 4-4. 검출 민감도 확인Example 4-4. Detection sensitivity check
상기 실시예 1 내지 3을 통해 제작한 황열 바이러스의 신속 면역크로마토그래피 진단 키트의 검출 민감도를 확인하였다. 황열에 감염된 원숭이의 조직액(RT-PCR을 통하여 검증됨)을 검체로 사용하여 검출능을 확인하였다. The detection sensitivity of the rapid immunochromatography diagnostic kit of yellow fever virus prepared in Examples 1 to 3 was confirmed. Tissue fluid of monkeys infected with yellow fever (validated through RT-PCR) was used as a sample to confirm the detectability.
그 결과, 상기 표 2에 나타낸 것과 같이, 상기 키트는 91.6%의 민감도, 100%의 특이도를 나타냄을 확인하였다.As a result, as shown in Table 2, the kit was confirmed to exhibit a sensitivity of 91.6%, specificity of 100%.
상기 결과를 통해, 본 발명의 키트는 민감도가 높으므로 시료에 항원이 극히 소량으로 포함되어 있어도 검출이 가능하며, 특이도가 매우 높으므로 황열 바이러스만을 특이적으로 진단할 수 있음을 알 수 있었다. Through the above results, the kit of the present invention has a high sensitivity, so it can be detected even if the antigen is contained in a very small amount, and it can be seen that only yellow fever virus can be specifically diagnosed because the specificity is very high.
실시예 4-5. 의심 검체를 이용한 진단 효과 확인Example 4-5. Confirmation of diagnosis effect using suspicious samples
황열 바이러스의 감염이 의심되는 사람의 혈액 검체를 이용하여, 상기 키트의 황열 바이러스 감염 여부에 대한 진단 효과를 확인하였다.Blood samples of persons suspected of being infected with yellow fever virus were used to confirm the diagnostic effect of the yellow fever virus infection of the kit.
그 결과, 상기 표 3에 나타낸 것과 같이, 상기 키트를 이용한 진단 결과는 RT-PCR을 통해 확인한 진단 결과와 매우 유사한 결과를 나타냄을 확인하였다.As a result, as shown in Table 3, it was confirmed that the diagnostic results using the kit shows a result very similar to the diagnostic results confirmed through the RT-PCR.
상기 결과를 통해, 본 발명의 키트는 가장 확실한 바이러스 진단 방법이라고 간주되는 RT-PCR 방법과 유사한 결과를 나타내므로, 상기 키트는 황열 바이러스의 진단에 매우 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.From the above results, the kit of the present invention shows a similar result to the RT-PCR method which is considered the most reliable virus diagnostic method, it can be seen that the kit can be very useful for the diagnosis of yellow fever virus.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, those skilled in the art will appreciate that the present application can be implemented in other specific forms without changing the technical spirit or essential features. In this regard, it should be understood that the embodiments described above are exemplary in all respects and not limiting. The scope of the present application should be construed that all changes or modifications derived from the meaning and scope of the following claims and equivalent concepts rather than the detailed description are included in the scope of the present application.
<110> GENBODY INC. <120> A rapid diagnosis kit for diagnosis of yellow fever virus infection and a yellow fever virus detection method using thereof <130> KPA171465-KR <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 350 <212> PRT <213> Flavivirus sp. <400> 1 Asp Gln Gly Cys Ala Ile Asn Phe Gly Lys Arg Glu Leu Lys Cys Gly 1 5 10 15 Asp Gly Ile Phe Ile Phe Arg Asp Ser Asp Asp Trp Leu Asn Lys Tyr 20 25 30 Ser Tyr Tyr Pro Glu Asp Pro Val Lys Leu Ala Ser Ile Val Lys Ala 35 40 45 Ser Phe Glu Glu Gly Lys Cys Gly Leu Asn Ser Val Asp Ser Leu Glu 50 55 60 His Glu Met Trp Arg Ser Arg Ala Asp Glu Ile Asn Ala Ile Phe Glu 65 70 75 80 Glu Asn Glu Val Asp Ile Ser Val Val Val Gln Asp Pro Lys Asn Val 85 90 95 Tyr Gln Arg Gly Thr His Pro Phe Ser Arg Ile Arg Asp Gly Leu Gln 100 105 110 Tyr Gly Trp Lys Thr Trp Gly Lys Asn Leu Val Phe Ser Pro Gly Arg 115 120 125 Lys Asn Gly Ser Phe Ile Ile Asp Gly Lys Ser Arg Lys Glu Cys Pro 130 135 140 Phe Ser Asn Arg Val Trp Asn Ser Phe Gln Ile Glu Glu Phe Gly Thr 145 150 155 160 Gly Val Phe Thr Thr Arg Val Tyr Met Asp Ala Val Phe Glu Tyr Thr 165 170 175 Ile Asp Cys Asp Gly Ser Ile Leu Gly Ala Ala Val Asn Gly Lys Lys 180 185 190 Ser Ala His Gly Ser Pro Thr Phe Trp Met Gly Ser His Glu Val Asn 195 200 205 Gly Thr Trp Met Ile His Thr Leu Glu Ala Leu Asp Tyr Lys Glu Cys 210 215 220 Glu Trp Pro Leu Thr His Thr Ile Gly Thr Ser Val Glu Glu Ser Glu 225 230 235 240 Met Phe Met Pro Arg Ser Ile Gly Gly Pro Val Ser Ser His Asn His 245 250 255 Ile Pro Gly Tyr Lys Val Gln Thr Asn Gly Pro Trp Met Gln Val Pro 260 265 270 Leu Glu Val Lys Arg Glu Ala Cys Pro Gly Thr Ser Val Ile Ile Asp 275 280 285 Gly Asn Cys Asp Gly Arg Gly Lys Ser Thr Arg Ser Thr Thr Asp Ser 290 295 300 Gly Lys Val Ile Pro Glu Trp Cys Cys Arg Ser Cys Thr Met Pro Pro 305 310 315 320 Val Ser Phe His Gly Ser Asp Gly Cys Trp Tyr Pro Met Glu Ile Arg 325 330 335 Pro Arg Lys Thr His Glu Ser His Leu Val Arg Ser Trp Val 340 345 350 <110> GENBODY INC. <120> A rapid diagnosis kit for diagnosis of yellow fever virus infection and a yellow fever virus detection method using pretty <130> KPA171465-KR <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 350 <212> PRT <213> Flavivirus sp. <400> 1 Asp Gln Gly Cys Ala Ile Asn Phe Gly Lys Arg Glu Leu Lys Cys Gly 1 5 10 15 Asp Gly Ile Phe Ile Phe Arg Asp Ser Asp Asp Trp Leu Asn Lys Tyr 20 25 30 Ser Tyr Tyr Pro Glu Asp Pro Val Lys Leu Ala Ser Ile Val Lys Ala 35 40 45 Ser Phe Glu Glu Gly Lys Cys Gly Leu Asn Ser Val Asp Ser Leu Glu 50 55 60 His Glu Met Trp Arg Ser Arg Ala Asp Glu Ile Asn Ala Ile Phe Glu 65 70 75 80 Glu Asn Glu Val Asp Ile Ser Val Val Val Gln Asp Pro Lys Asn Val 85 90 95 Tyr Gln Arg Gly Thr His Pro Phe Ser Arg Ile Arg Asp Gly Leu Gln 100 105 110 Tyr Gly Trp Lys Thr Trp Gly Lys Asn Leu Val Phe Ser Pro Gly Arg 115 120 125 Lys Asn Gly Ser Phe Ile Ile Asp Gly Lys Ser Arg Lys Glu Cys Pro 130 135 140 Phe Ser Asn Arg Val Trp Asn Ser Phe Gln Ile Glu Glu Phe Gly Thr 145 150 155 160 Gly Val Phe Thr Thr Arg Val Tyr Met Asp Ala Val Phe Glu Tyr Thr 165 170 175 Ile Asp Cys Asp Gly Ser Ile Leu Gly Ala Ala Val Asn Gly Lys Lys 180 185 190 Ser Ala His Gly Ser Pro Thr Phe Trp Met Gly Ser His Glu Val Asn 195 200 205 Gly Thr Trp Met Ile His Thr Leu Glu Ala Leu Asp Tyr Lys Glu Cys 210 215 220 Glu Trp Pro Leu Thr His Thr Ile Gly Thr Ser Val Glu Glu Ser Glu 225 230 235 240 Met Phe Met Pro Arg Ser Ile Gly Gly Pro Val Ser Ser His Asn His 245 250 255 Ile Pro Gly Tyr Lys Val Gln Thr Asn Gly Pro Trp Met Gln Val Pro 260 265 270 Leu Glu Val Lys Arg Glu Ala Cys Pro Gly Thr Ser Val Ile Ile Asp 275 280 285 Gly Asn Cys Asp Gly Arg Gly Lys Ser Thr Arg Ser Thr Thr Asp Ser 290 295 300 Gly Lys Val Ile Pro Glu Trp Cys Cys Arg Ser Cys Thr Met Pro Pro 305 310 315 320 Val Ser Phe His Gly Ser Asp Gly Cys Trp Tyr Pro Met Glu Ile Arg 325 330 335 Pro Arg Lys Thr His Glu Ser His Leu Val Arg Ser Trp Val 340 345 350
Claims (17)
상기 단일클론항체는 기탁번호 KCTC13461BP 또는 기탁번호 KCTC13462BP의 융합 세포주에서 생산되는 것인, 단일클론항체.
As a monoclonal antibody that specifically binds to NS1 protein of yellow fever virus,
The monoclonal antibody is produced in a fusion cell line of Accession No. KCTC13461BP or Accession No. KCTC13462BP, monoclonal antibody.
The monoclonal antibody of claim 1, wherein the NS1 protein consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
The monoclonal antibody of claim 1, wherein the monoclonal antibody is an immunoglobulin isotype of IgG1 or IgG2a.
A yellow fever virus infection diagnostic composition comprising the monoclonal antibody of any one of claims 1, 2 and 4.
A fusion cell line producing the monoclonal antibody of claim 1, which is deposited with Accession No. KCTC13461BP or Accession No. KCTC13462BP.
A kit for diagnosing a yellow fever virus infection, comprising the monoclonal antibody of any one of claims 1, 2 and 4.
The kit of claim 8, wherein the kit is in the form of a strip using immunochromatography.
The kit of claim 8, wherein the kit comprises: (a) a membrane to which the monoclonal antibody and a control antibody are immobilized; (b) a condensation pad comprising the conjugate to which said monoclonal antibody and gold are bound; (c) a buffer pad containing a buffer solution; And (d) an absorbent pad.
The kit according to claim 10, wherein the monoclonal antibody is a monoclonal antibody that targets the NS1 protein of yellow fever virus represented by SEQ ID NO: 1 and is produced in a fusion cell of Accession No. KCTC13461BP or Accession No. KCTC13462BP.
(a) a membrane to which the monoclonal antibody and the control antibody of any one of claims 1, 2 and 4 are immobilized; (b) a condensation pad comprising the conjugate to which said monoclonal antibody and gold are bound; (c) a buffer pad containing a buffer solution; And (d) assembling the absorbent pad, the yellow fever virus infection diagnosis kit.
Method of providing information for determining whether yellow fever virus infection using the kit of claim 8.
(a) 환자에게서 분리한 생물학적 시료를 황열 바이러스의 NS1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체와 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 항체의 황열 바이러스와의 결합을 검출하는 단계.
The method of claim 13, wherein the method comprises the following steps:
(a) contacting a biological sample isolated from a patient with a monoclonal antibody that specifically binds to NS1 protein of yellow fever virus; And
(b) detecting the binding of the antibody to the yellow fever virus.
A method of detecting a yellow fever virus using the kit of claim 8.
(a) 환자에게서 분리한 생물학적 시료를 황열 바이러스의 NS1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체와 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 항체의 황열 바이러스와의 결합을 검출하는 단계.The method of claim 16, wherein the method comprises the following steps:
(a) contacting a biological sample isolated from a patient with a monoclonal antibody that specifically binds to NS1 protein of yellow fever virus; And
(b) detecting the binding of the antibody to the yellow fever virus.
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